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ES2771850T3 - Parvovirus porcino - Google Patents

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ES2771850T3
ES2771850T3 ES15717159T ES15717159T ES2771850T3 ES 2771850 T3 ES2771850 T3 ES 2771850T3 ES 15717159 T ES15717159 T ES 15717159T ES 15717159 T ES15717159 T ES 15717159T ES 2771850 T3 ES2771850 T3 ES 2771850T3
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parvovirus
shi
vaccine
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ES15717159T
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Lars Guelen
Ad Groof
Carla Christina Schrier
Martin Deijs
Van Der Cornelia Maria Hoek
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Intervet International BV
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Abstract

Una vacuna para combatir el parvovirus porcino asociado al SHI en cerdos, caracterizado por que dicha vacuna comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de una proteína de la cápside (CP) codificada por un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica la CP, en donde la secuencia de nucleótidos de dicho gen tiene un nivel de identidad de al menos el 80 % con la secuencia de nucleótidos del gen de la CP tal como se representa en la SEQ ID NO: 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

DESCRIPCIÓN
Parvovirus porcino
La presente invención se refiere a una vacuna basada en una proteína de un parvovirus porcino. La invención también se refiere a una prueba de diagnóstico para la detección del virus.
En las últimas décadas, en todo el mundo se observa un fuerte aumento en el consumo de carne de cerdo. Como consecuencia, se observa un aumento en el número y el tamaño de las granjas, con el fin de satisfacer las crecientes necesidades del mercado. Como se sabe por la cría de animales en general, un gran número de animales que viven juntos son vulnerables a todo tipo de enfermedades, incluso enfermedades apenas conocidas o vistas o incluso desconocidas antes de los días de la agricultura comercial a gran escala.
Una de las enfermedades en los cerdos que se conoce desde hace más de 60 años es el síndrome hemorrágico intestinal (SHI). Esta enfermedad se conoce como síndrome debido al hecho de que la causa de la enfermedad no está clara y la consistencia de los diversos signos clínicos no siempre está completamente clara.
El SHI es una enfermedad que ocurre en epidemias infrecuentes y explosivas. Los cerdos de rápido crecimiento de 4-6 meses de vida se ven afectados principalmente. En la mayoría de los casos, la enfermedad se observa en cerdos de engorde. Los cerdos mueren repentinamente sin evidencias de diarrea, aunque el grado de mortalidad varía (1-3). Los datos de autopsias suizas, basados en más de 16000 cerdos, mostraron una incidencia de SHI del 2,66 %. En Estados Unidos, se ha documentado que el SHI causa el 0,5 % - 7 % de todas las muertes durante la fase de crecimiento-finalización (3).
El síndrome hemorrágico del intestino no debe verse como una enfermedad única con una sola causa.
El síntoma más prominente del SHI son las hemorragias intestinales, a menudo acompañadas de vólvulo intestinal (torsiones del intestino). Sin embargo, estos síntomas también son una indicación de úlceras gástricas e ileítis, lo que complica el diagnóstico del SHI. Puede darse una rotación de todo el intestino, lo que provoca que la sangre se acumule y se estanque. El vólvulo intestinal puede observarse en hasta el 80 % de los casos de SHI(1'3). Otros síntomas frecuentes de la enfermedad son las paredes intestinales delgadas y el líquido sanguinolento en los intestinos.
La etiología precisa del SHI no está clara. Tal como se ha indicado anteriormente, en lugar de tener una sola causa, La etiología del síndrome es probablemente multifactorial. El estrés, varios aspectos ambientales y de gestión pueden desempeñar un papel. Los factores de predisposición pueden incluir ejercicio vigoroso, la manipulación, las peleas, el apilamiento o la alimentación irregular. No hay evidencia concluyente de que un agente infeccioso (bacteriano o vírico) pueda causar SHI(1,3), aunque Clostridium sp. y E. coli se han aislado de animales que padecen SHI. Los intentos de reproducir la enfermedad administrando contenido intestinal filtrado de animales que padecen SHI, por vía intravenosa u oral, a animales sanos fracasaron. Los intentos de reproducir la enfermedad por inoculación oral de E. coli y Clostridium perfringens tipo A aislados de cerdos infectados igualmente fracasaron. Por otro lado, se sabe que la frecuencia de la enfermedad se puede reducir en cierta medida mediante la administración de antibióticos en el alimento. Esto fortalece la idea de que la enfermedad es de hecho multifactorial: un efecto combinado de, por ejemplo, estrés y uno o más patógenos.
Es un objetivo de la presente invención proporcionar una vacuna para combatir el parvovirus porcino asociado al SHI. Además, es un objetivo de la presente invención proporcionar medios para detectar e identificar el agente infeccioso asociado a la enfermedad.
Recientemente, los cerdos diagnosticados de SHI fueron recolectados de varias granjas durante una epidemia de la enfermedad en México. Los cerdos afectados no tenían síntomas previos de enfermedad y murieron repentinamente, entre 2 y 6 horas después de los primeros síntomas de la enfermedad.
En la necropsia, los cerdos presentaron anomalías en el intestino delgado, entre otros, síntomas hemorrágicos, una pared intestinal delgada y fluidos con sangre en los intestinos. No se encontraron anomalías en otros órganos, a excepción de las observaciones de ganglios linfáticos rojos, agrandados e hinchados. La enfermedad se confirmó como SHI.
Se analizaron muestras de cerdos afectados necropsiados de varias granjas para detectar la presencia de virus y, sorprendentemente, se descubrió un nuevo virus en el 76 % de los animales. El hecho de que el virus no se detectase en todos los animales puede tener que ver con la cantidad de tiempo transcurrido entre la muerte de los animales y el momento en que fueron sometidos a la sección post mortem. Esto se puede concluir, entre otras cosas, del hecho de que las cantidades de virus encontradas por animal variaron en gran medida. Los inventores contemplan que en los cerdos en los que el virus aparentemente está ausente, esto probablemente se deba al hecho de que la cantidad de virus presente estaba en esos cerdos por debajo del nivel de detección en el momento del análisis. Además, el sitio de inicio de replicación del virus no se conoce para este nuevo virus y, por lo tanto, el sitio primario de replicación del virus después de la infección puede no haber sido muestreado.
Dado que el nuevo virus se detectó en estos cerdos diagnosticados con SHI, el virus se denominará además virus asociado a SHI. El síndrome hemorrágico de intestino ahora se puede caracterizar por la presencia del nuevo virus en algún momento durante la enfermedad en órganos de animales que padecen SHI, en combinación con los siguientes síntomas clínicos: hemorragias intestinales, a menudo acompañadas de vólvulo intestinal, paredes intestinales delgadas y líquidos sanguinolentos en los intestinos.
La secuencia del genoma vírico se analizó y reveló que el nuevo virus tiene algo, aunque un nivel relativamente bajo de semejanza con un género recientemente identificado de la subfamilia Parvovirinae dentro de Parvoviridae. Los parvovirus son virus de ADN monocatenario lineal no segmentado, con un tamaño promedio del genoma de 5000 nucleótidos y un tamaño en el intervalo de 18-26 nm de diámetro.
La secuencia de ADN casi completa de un representante del nuevo parvovirus porcino se presenta en la SEQ ID NO: 10.
El nuevo virus comprende dos grandes marcos de lectura abierta (ORF): el ORF1 que codifica la proteína no estructural 1 (NS1) que consta de 662 aminoácidos se encuentra en la posición 0134-2122 de la SEQ ID NO: 10 y ORF2 que codifica la proteína de la cápside (CP) que consta de 1189 aminoácidos se encuentra en la posición 2130-5699 de la SEQ ID NO: 10.
Un ejemplo de la secuencia de ADN del ORF2, el gen que codifica la proteína de la cápside, se representa en la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside.
Un ejemplo de la secuencia de ADN del ORF1 que codifica la proteína no estructural NS1 se representa en la SEQ ID NO: 3. La SEQ ID NO: 4 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína no estructural NS1.
La subfamilia de Parvovirinae comprende actualmente 7 géneros (15):
1) virus similar a PARV4
2) Erythrovirus
3) Bocavirus
4) Dependovirus
5) Amdovirus
6) Parvovirus
7) Un clado de parvo recientemente propuesto
En este momento, se han identificado seis parvovirus diferentes que infectan a los cerdos:
a) Parvovirus porcino clásico tipo 1 (PPV1), un miembro del género Parvovirus
b) Parvovirus porcino tipo 2 (PPV2), un miembro del género tipo virus PARV4
c) Parvovirus porcino tipo 3 (PPV3, también conocido como PARV4 porcino, hokovirus o partetravirus), también es miembro del género similar al virus PARV4
d) parvovirus porcino tipo 4 (PPV4), miembro del clado recientemente propuesto
e) parvovirus porcino tipo 5 (PPV5), también miembro del clado recientemente propuesto
f) bocavirus porcino (PBoV), un miembro del género Bocavirus
Se sabe que PPV1 es el agente causal de SMEDI, un síndrome relacionado con la muerte fetal, momificación, muerte embrionaria e infertilidad. (4,5)
No se sabe que PPV2 cause enfermedad como tal, pero se sugiere que sea un cofactor en el desarrollo de la enfermedad asociada al circovirus porcino (PCVAD) (6,7).
PPV3 tampoco se sabe que cause la enfermedad como tal, pero posiblemente también sea un cofactor en el desarrollo de la enfermedad asociada al circovirus porcino (PCvAd ) (8- 1).
PPV4 se aisló originalmente del tejido pulmonar de los cerdos. El tejido parecía estar coinfectado con circovirus porcino. No se sabe que causa enfermedad y tampoco se ha asociado de manera convincente con una enfermedad causada por otro patógeno (12'14).
Tampoco se sabe que PPV5 cause síntomas o lesiones y no está asociado con una enfermedad causada por otro patógeno (15'16).
El bocavirus porcino es un tipo relativamente nuevo de parvovirus porcino para el que la importancia clínica y la epidemiología aún no han sido exploradas (17).
Las secuencias de aminoácidos de ORF1 y ORF2 del nuevo virus se usaron para hacer árboles filogenéticos basados en el método de máxima verosimilitud, el modelo de corrección de Poisson y el análisis bootstrap (500 repeticiones).
Estos árboles se hicieron usando el programa MEGA, versión 5, utilizando la configuración estándar. (MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Koichiro Tamura, Daniel Peterson, Nicholas Peterson, Glen Stecher, Masatoshi Nei y Sudhir Kumar. Mol. Biol. Evol. 28(10): 2731-2739. 2011 doi: 10.1093/molbev/msr121 Publicación de acceso anticipado 4 de mayo de 2011).
El árbol filogenético de ORF1 se presenta en la figura 1, el de ORF2 en la figura 2. El porcentaje de soporte de bootstrap se especifica en los nodos. Las barras de distancia indican el número de sustituciones de nucleótidos por sitio.
Como se desprende de estos árboles filogenéticos, el nuevo parvovirus porcino está más relacionado con el parvovirus porcino 5 (PPV5) y el parvovirus porcino 4 (PPV4) que con el PPV1, 2 o 3, o los Bocavirus. Se descubrió que tanto la secuencia de codificación NS1 como la secuencia de codificación de la proteína de la cápside muestran un cierto ajuste en esa parte del árbol filogenético de Parvovirinae que también comprende los virus no relacionados PPV4 y PPV5.
Por esta razón, los inventores decidieron colocar tentativamente el nuevo virus en el grupo de los virus del nuevo clado. Sin embargo, la identidad de secuencia con los parvovirus porcinos existentes, incluso dentro del grupo de los virus del nuevo clado, es relativamente baja. Por esta razón, incluso es concebible que el nuevo virus pertenezca a un nuevo género dentro de la familia Parvovirinae.
Las SEQ ID NO: 1 y 3 muestran ejemplos típicos de la secuencia de nucleótidos de los genes que codifican la proteína de la cápside y la proteína no estructural NS1 del virus.
Se entenderá que para estas proteínas pueden existir variaciones naturales entre representantes individuales del virus asociado al s Hi. Existen variaciones genéticas que llevan a cambios menores en, por ejemplo, la secuencia de la proteína de la cápside. Esto es igualmente cierto para el gen NS1. En primer lugar, existe el llamado "bamboleo en la segunda y tercera base" que explica que pueden ocurrir cambios de nucleótidos que pasan desapercibidos en la secuencia de aminoácidos que codifican: por ejemplo, todos los tripletes TTA, tTg TCA, TCT, TCG y TCC codifican leucina. Además, pueden verse pequeñas variaciones entre los representantes del nuevo parvovirus porcino en la secuencia de aminoácidos. Estas variaciones pueden reflejarse por (una) diferencia(s) de aminoácidos en la secuencia general o por deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de (un) aminoácido(s) en dicha secuencia. Las sustituciones de aminoácidos que no alteran esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas, se han descrito, por ejemplo, por Neurath et al en "The Proteins" Academic Press Nueva York (1979). Las sustituciones de aminoácidos entre aminoácidos relacionados o las sustituciones que han tenido lugar con frecuencia en la evolución son, entre otros, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (véase Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, supl. 3). Otras sustituciones de aminoácidos incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val y Ala/Glu. Basándose en esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para la comparación rápida y sensible de proteínas (Science 227, 1435-1441, 1985) y para determinar la similitud funcional entre proteínas homólogas. Dichas sustituciones de aminoácidos de las realizaciones a modo de ejemplo de la presente invención están dentro del alcance de la invención.
Esto explica por qué la proteína de la cápside y la proteína no estructural NS1, cuando se aísla de diferentes representantes de un parvovirus porcino, pueden tener niveles de homología significativamente inferiores al 100 %, mientras sigue representando la proteína de la cápside y la proteína no estructural NS1 del parvovirus porcino. Esto se refleja claramente, por ejemplo, en el árbol filogenético en la figura 1 de un artículo de Xiao et al.(6) donde se muestra que incluso dentro de un solo género, el género de virus similar a PARV4 que consiste en parvovirus altamente relacionados tiene sin embargo secuencias de nucleótidos genómicas globales significativamente diferentes, así como secuencias de nucleótidos del gen NS1 significativamente diferentes.
Por lo tanto, se describe el virus, entre otros, como un virus aislado que es miembro de la subfamilia Parvovirinae de la familia de los Parvoviridae, siendo dicho virus
a) un virus asociado al SHI y
b) el virus tiene un genoma vírico que comprende un gen que codifica una proteína de la cápside (CP), en donde la secuencia de nucleótidos del gen de CP tiene un nivel de identidad de al menos el 80 % con respecto a la secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 1.
Para los fines de la presente descripción, un nivel de identidad debe entenderse como el nivel de identidad de la secuencia de SEQ ID NO: 1 y la región correspondiente que codifica la proteína de la cápside de un parvovirus porcino del cual debe determinarse el nivel de identidad.
Un programa adecuado para la determinación de un nivel de identidad es el programa blast de nucleótidos (blastn) de la herramienta de búsqueda de alineación local básica del NCBI, utilizando la opción "Alinear dos o más secuencias" y la configuración estándar (http: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
A efectos de la presente invención, aislado significa: liberado del tejido con el que el virus está asociado en la naturaleza. Un ejemplo de un virus aislado es el virus presente en el cultivo celular.
Por el presente documento, se describe un virus que tiene un gen de la proteína de la cápside que tiene un nivel de identidad de al menos el 82 %, más preferentemente el 84 %, 86 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99 % o incluso el 100 %, en ese orden de preferencia, con la secuencia de nucleótidos de la proteína de la cápside tal como se representa en la SEQ ID NO: 1.
Una forma alternativa de describir el virus se relaciona con la secuencia del gen NS1 del virus.
La SEQ ID NO: 3 muestra un ejemplo típico de la secuencia de nucleótidos del gen NS1 del virus. Como se ha explicado anteriormente, sin embargo, se encuentran variaciones naturales que llevan a cambios menores en la secuencia de NS1.
Por lo tanto, el virus también se puede describir como un virus aislado que es miembro de la subfamilia Parvovirinae de la familia de los Parvoviridae, siendo dicho virus
a) un virus asociado al SHI y
b) el virus tiene un genoma vírico que comprende un gen que codifica una proteína no estructural 1 (NS1), en el que la secuencia de nucleótidos del gen NSl tiene un nivel de identidad de al menos el 80 % de la secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 3.
También se describe un virus que tiene un gen NS1 que tiene un nivel de identidad de al menos el 82 %, más preferentemente el 84 %, 86 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso el 100 %, en ese orden de preferencia, con la secuencia de nucleótidos del gen NS1 tal como se representa en la SEQ ID NO: 3.
Por lo tanto, en resumen, el virus es un virus aislado que es miembro de la subfamilia Parvovirinae de la familia de los Parvoviridae, siendo dicho virus
a) un virus asociado al SHI y
b) el virus tiene un genoma vírico que comprende un gen que codifica una proteína de la cápside (CP) y un gen que codifica una proteína no estructural 1 (NS1), en donde la secuencia de nucleótidos del gen de la CP tiene un nivel de identidad de al menos el 80 % con la secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos del gen NS1 tiene un nivel de identidad de al menos el 80 % con la secuencia de nucleótidos tal como se representa en la SEQ ID NO: 3.
También se describe un virus aislado que es miembro de la subfamilia Parvovirinae de la familia de los Parvoviridae, siendo dicho virus
a) un virus asociado al SHI y
b) el virus tiene un genoma vírico que comprende un gen que codifica una proteína de la cápside (CP) y un gen que codifica una proteína no estructural 1 (NS1), en donde la secuencia de nucleótidos del gen de la CP tiene un nivel de identidad de al menos el 80 % con la secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de nucleótidos del gen NS1 tiene un nivel de identidad de al menos el 80 % con respecto a la secuencia de nucleótidos tal como se representa en la SEQ ID NO: 3.
Otra forma alternativa más de caracterizar el virus depende de una prueba de PCR utilizando conjuntos de cebadores específicos para la secuencia del gen de la proteína de la cápside o la secuencia del gen NS1 de un virus. Se eligieron dos conjuntos de cebadores diferentes de los cuales la secuencia se representa en las SEQ ID NO: 5-6 y SEQ ID NO: 7-8 por su especificidad para el virus. La prueba de PCR que usa el primer conjunto de cebadores (SEQ ID NO: 5-6) que reacciona específicamente con el gen de la proteína de la cápside del virus usa los dos cebadores Bowl_Q_ORF2_FW: CTACATCTGCGCCTGAC y Bowl_Q_ORF2_REV: GTGGTGAGAAGGCAAGAC,
Para experimentos con PCR cuantitativa (Q), la sonda de PCR Bowl_Q_ORF2_PROBE: 6FAM-CACGAGCTAGAGCGT- GCTAAACAG-BHQ1 como se representa en la SEQ ID NO.: 9 se usa además de estos dos cebadores.
La prueba de PCR que usa el segundo conjunto de cebadores (SEQ ID NO: 7-8) reacciona específicamente con el gen NS1 del virus y usa los dos cebadores Bowl_ORF1_774_F: TGTTGAGTGTGGTGGATTGG y Bowl_ORF1_1626_R: AAG- GAAGCTGGACCGAGAG.
Las pruebas, que se describen con más detalle en la sección de Ejemplos, son pruebas de PCR estándar.
Si un miembro de la subfamilia Parvovirinae dentro de Parvoviridae se analiza utilizando los conjuntos de cebadores descritos anteriormente, se puede decir lo siguiente: si un análisis del producto de PCR del primer conjunto de cebadores revela un producto de PCR de aproximadamente 140 pares de bases o si el análisis del producto de PCR del segundo conjunto de cebadores revela un producto de PCR de aproximadamente 853 pares de bases, esto demuestra inequívocamente que el virus analizado pertenece al virus que se describe en el presente documento. Simplemente como un ejemplo: un producto de PCR de aproximadamente 853 pares de bases es un producto de PCR con una longitud de entre 853 10 y 853 -10 pares de bases. Un producto de PCR de aproximadamente 140 pares de bases es un producto de PCR con una longitud de entre 140 10 y 140 -10 pares de bases. También se describe un virus aislado que es miembro de la subfamilia Parvovirinae dentro de Parvoviridae, en donde:
a) el virus es un virus asociado al SHI y
b) el ADN genómico vírico reacciona en una reacción de PCR con un conjunto de cebadores tal como se muestra en la SEQ ID NO: 5 y 6 para dar un producto de PCR de 140 /-10 pares de bases o reacciona en una reacción de PCR con un conjunto de cebadores como se representa en la SEQ ID NO: 7 y 8 para dar un producto de PCR de 853 /- 10 pares de bases.
También se describe un virus en el que el ADN genómico vírico reacciona en una reacción de PCR con un conjunto de cebadores como se representa en las SEQ ID NO: 5 y 6 para dar un producto de PCR de 140 /- 10 pares de bases y reacciona en una reacción de PCR con un conjunto de cebadores tal como se representa en las SEQ ID NO: 7 y 8 para dar un producto de PCR de 853 /- 10 pares de bases.
También se describe un virus en el que el virus tiene un genoma vírico que comprende un gen que codifica una proteína de la cápside (CP) y un gen que codifica una proteína no estructural 1 (NS 1), en el que la secuencia de nucleótidos del gen de la CP tiene un nivel de identidad de al menos el 80 % con la secuencia de nucleótidos tal como se representa en la SEC ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos del gen NS1 tiene un nivel de identidad de al menos el 80 % con la secuencia de nucleótidos tal como se representa en la SEQ ID NO: 3 y en donde el ADN genómico vírico reacciona en una reacción de PCR con un conjunto de cebadores tal como se muestra en la SEQ ID NO: 5 y 6 para dar un producto de PCR de 140 /- 10 pares de bases y reacciona en una reacción de PCR con un conjunto de cebadores como se representa en la SEQ ID NO: 7 y 8 para dar un producto de PCR de 853 /- 10 pares de bases.
El virus puede estar en forma viva, atenuada o inactivada.
Tal como se ha indicado anteriormente, ahora se han caracterizado las secuencias de ADN de los genes que codifican la CP y la NS1 del virus. La identificación de estos genes es muy útil, dado que ahora se puede usar, entre otros, como base para vacunas de ADN, para su uso en la preparación de vacunas de subunidades basándose en estas proteínas o con fines de diagnóstico, tal como se explicará ampliamente a continuación.
Se describe un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica una proteína de la cápside, caracterizado porque ese gen tiene un nivel de identidad de al menos el 80 % con la secuencia de nucleótidos del gen de la CP tal como se representa en la SEQ ID NO: 1.
Tal fragmento de ADN puede comprender un gen que tiene un nivel de identidad de al menos el 82 %, más preferentemente el 84 %, 86 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso el 100 %, en ese orden de preferencia, con la secuencia de nucleótidos de la CP tal como se representa en la SEQ ID NO: 1.
Se describe un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica una NS1 en donde el gen tiene un nivel de identidad de al menos el 80 % con respecto a la secuencia de nucleótidos del gen NS1 tal como se representa en la SEQ ID NO: 3.
Tal fragmento de ADN puede comprender un gen que tiene un nivel de identidad de al menos el 82 %, más preferentemente el 84 %, 86 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso el 100 %, en ese orden de preferencia, con la secuencia de nucleótidos del NS1 tal como se representa en la SEQ ID NO: 3.
También se describe una CP en donde esta CP está codificada por un fragmento de ADN que codifica una CP. Tales CP del virus son muy adecuadas porque son adecuadas para su uso en vacunas, más específicamente en vacunas de subunidades, se pueden usar para generar anticuerpos y hacen posibles las pruebas de diagnóstico, tal como se explica a continuación.
Se describe una CP que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se representa en la SEQ ID NO: 2.
También se describe una NS 1, en donde la NS 1 está codificada por un fragmento de ADN que codifica una NS 1. Tales NS1 del virus son altamente adecuadas, entre otras cosas porque hacen posibles las pruebas de diagnóstico, tal como se explica a continuación.
se describe una NS1 que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se representa en la SEQ ID NO: 4.
Uno de los méritos de la presente invención es que ahora es posible por primera vez seguir el trascurso de una infección vírica y analizar la presencia o ausencia del nuevo virus en los diversos órganos y fluidos corporales de los cerdos que padecen SHI. Esto ayudó a obtener más información sobre el desarrollo de la enfermedad.
Se sabe que en las semanas o incluso días antes de que un cerdo individual muestre síntomas clínicos completos del SHI, no se encuentran anomalías. El tiempo promedio entre los primeros síntomas y la muerte de los animales es de aproximadamente 2-6 horas. Poco antes de la muerte, los animales parecen sufrir distensión abdominal y algunos de ellos gritan antes de morir. Los animales en las granjas que desarrollaron signos clínicos fueron sacrificados antes de morir de la enfermedad.
En las diversas granjas mexicanas de las que se recolectaron cerdos con SHI, la incidencia del SHI varió entre el 1-2 %.
Se analizó un total de 33 animales diagnosticados con SHI sacrificados recolectados de diferentes granjas, un grupo de 17 semanas de edad entre 18-27 semanas (Ejemplo 1) y un grupo de 16 semanas de edad entre 12-26 semanas (Ejemplo 2). Las reacciones de PCR con los conjuntos de cebadores tal como se describieron anteriormente revelaron que en el grupo 1, 5 de 14 sueros (faltaban 3 sueros de la colección) resultaron positivos para el virus y un frotis rectal resultó positivo. Un total de 8 muestras de sangre completas resultaron ser positivas, y 12 de 15 ganglios linfáticos resultaron ser positivos. En el grupo 2, 5 de 16 sueros fueron positivos para el virus y un frotis rectal fue positivo. A partir de un animal representativo de cada grupo (animal 2, grupo 1, animal 10, grupo 2), se analizó la presencia del virus en los órganos. Se descubrió que todos los órganos muestreados, incluidos los ganglios linfáticos, el pulmón, el bazo, el intestino, el riñón y el hígado, así como las heces dieron positivo para el virus.
Se describe para infectar cerdos sanos con el nuevo virus y para examinar la vía de la infección vírica. Con este objetivo, el material de los órganos y las heces de los animales con SHI se homogeneizaron en medio de cultivo tisular. Los homogeneizados se congelaron y descongelaron una vez (-70 °C), se centrifugaron y se filtraron en filtros de 5 |jm, 0,45 jm y 0,22 jm para eliminar el material tisular restante.
Se hizo un inóculo A del siguiente material de un animal representativo: heces, ganglios linfáticos, pulmón, bazo e intestino del animal 10 del grupo 2.
Se hizo un inóculo B del siguiente material de otro animal representativo: heces, ganglios linfáticos, pulmón, riñón e hígado del animal 2 del grupo 1. Los detalles completos de estos experimentos se dan en la sección de Ejemplos a continuación (Ejemplo 3).
Los inóculos (A o B) se administraron como una dosis IM de 4 x 2 ml y una dosis oral de 20 ml a un total de 4 verracos y 8 cerdas (Landrace / alto estado de salud / SPF) de 12-14 semanas de vida a tiempo de inoculación de la siguiente manera:
Grupo 1: cinco animales, de los cuales tres animales recibieron el inóculo A, dos sirvieron como controles de contacto.
Grupo 2: cuatro animales, de los cuales tres animales recibieron el inóculo B, uno sirvió como control de contacto.
Grupo 3: tres animales, todos los cuales recibieron inóculo B. Un animal (macho) fue sacrificado antes de la inoculación y sirvió como control negativo. Los animales fueron examinados para detectar la presencia del nuevo virus en suero, heces, frotis nasales y frotis oculares antes de la inoculación.
Se tomaron muestras de sangre, frotis nasal/rectal/ocular en varios puntos temporales. Los detalles completos de los experimentos con animales se dan en la sección de Ejemplos a continuación.
Se descubrió que en 6 de los 6 animales inoculados, el virus podía detectarse en el suero y en frotis rectal, nasal y ocular a los 7 días después de la inoculación. En los 3 animales no inoculados, los controles, el virus pudo detectarse en el suero 14 días después de la inoculación de los otros animales. Los frotis rectales/nasales y oculares de todos los animales de control fueron positivos en el día 7 después de la inoculación (Ejemplo 3, grupos 1,2). En 3 de 3 sueros de animales inoculados el día 3 después de la inoculación, se detectó el virus (Ejemplo 3, grupo 3). Por lo tanto, aunque es cierto que se informa de que la incidencia del SHI es relativamente baja, dada la naturaleza altamente contagiosa del virus en combinación con su alta velocidad de infección, cabe esperar que, con mucho, la mayoría, si no en todos, los cerdos en granjas donde se produce el SHI experimentarán una infección con el virus. Por lo tanto, es muy recomendable vacunar a todos los animales en granjas donde se produce el SHI, contra la infección con el parvovirus porcino asociado al SHI. Dicha vacunación erradicaría al menos un componente vírico del síndrome multifactorial. Y esto a su vez evitaría o al menos disminuiría la gravedad de la enfermedad.
También es uno de los méritos de la presente invención que, dado que el nuevo parvovirus porcino ahora se ha aislado y asociado con el SHI, la subunidad protectora del virus puede utilizarse como material de partida para fines de vacunación.
Por lo tanto, también se describen vacunas para combatir el SHI en cerdos, en donde tales vacunas comprenden el virus y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para su uso en una vacuna según la invención son agua estéril, solución salina, tampones acuosos tales como PBS y similares. Además, una vacuna según la invención puede comprender otros aditivos tales como adyuvantes, estabilizantes, antioxidantes y otros, tal como se describe a continuación.
La lucha a este respecto debe interpretarse en un sentido amplio: se considera que la lucha contra el SHI comprende la vacunación para prevenir los síntomas de la enfermedad, así como la vacunación para disminuir los síntomas de la enfermedad tal como se describe anteriormente.
La vacunación terapéutica una vez que se diagnostica el virus en un animal infectado que aún no padece el síndrome es, por supuesto, igualmente eficaz. La vacunación terapéutica después de que se diagnostique el síndrome parecería no eficaz, dado el muy corto tiempo entre los primeros síntomas clínicos y la muerte.
Una vacuna tal como se describe puede comprender el virus en forma viva atenuada o inactivada.
Las vacunas de virus vivos atenuados, es decir, las vacunas que comprenden el virus en una forma viva atenuada, tienen la ventaja sobre las vacunas inactivadas de que imitan mejor la forma natural de infección. Además, sus capacidades de replicación permiten la vacunación con bajas cantidades de virus; su número aumentará automáticamente hasta que alcance el nivel de activación del sistema inmunitario. A partir de ese momento, el sistema inmunitario se activará y finalmente eliminará los virus.
Un virus vivo atenuado es un virus que tiene un nivel de virulencia reducido en comparación con el virus aislado del campo. Un virus que tiene un nivel de virulencia reducido se considera un virus que, incluso en combinación con otros factores involucrados en el SHI, no induce mortalidad en los cerdos.
Por lo tanto, se describe una vacuna que comprende un virus en el que dicho virus está en una forma viva atenuada. Los virus atenuados pueden obtenerse, por ejemplo, haciendo crecer los virus en presencia de un agente mutagénico, seguido de una selección de virus que muestra una disminución en el nivel de progenie y/o en la velocidad de replicación. Muchos de estos agentes se conocen en la materia.
Otro método muy utilizado es el traspaso seriado in vitro. Los virus luego se adaptan a la línea celular utilizada para el traspaso seriado, para que se comporten atenuados cuando se transfieran al hospedador natural nuevamente como una vacuna. Otra forma más de obtener virus atenuados es someterlos al crecimiento a temperaturas que se desvían de la temperatura de su hábitat natural. Los métodos de selección para mutantes sensibles a la temperatura (mutantes Ts) son bien conocidos en la técnica. Dichos métodos comprenden el crecimiento de virus en presencia de un mutágeno seguido de crecimiento a una temperatura subóptima y a la temperatura óptima, la titulación del virus de la progenie en las capas celulares y selección visual de aquellas placas que crecen más lentamente a la temperatura óptima. Dichas placas pequeñas comprenden virus vivos atenuados de crecimiento lento y, por lo tanto, deseados.
Se han descrito vacunas vivas atenuadas para combatir el parvovirus porcino tipo PPV, entre otros, por Paul y Mengeling (32), por Paul y Mengeling (33) y por Fujisaki y Murakami (34).
Sin embargo, una posible desventaja del uso de virus vivos atenuados podría ser que inherentemente queda un cierto nivel de virulencia. Esto no es una desventaja real siempre que el nivel de virulencia sea aceptable, es decir, mientras la vacuna al menos evite que los cerdos mueran. Por supuesto, cuanto menor es la virulencia en reposo de la vacuna de virus vivo atenuado, menos influencia tiene la vacuna sobre el aumento de peso durante/después de la vacunación.
Las vacunas inactivadas son, en contraste con sus homólogos de vivos atenuados, inherentemente seguras, porque no queda virulencia. A pesar de que generalmente comprenden una dosis algo más alta de virus en comparación con las vacunas de virus vivos atenuados, pueden ser, por ejemplo, la forma preferida de vacuna en cerdos que ya padecen otras enfermedades. Cerdos que se mantienen en condiciones subóptimas, tales como una nutrición incompleta o un enjaulado subóptimo también se beneficiarían de las vacunas inactivadas.
Por lo tanto, también se describe una vacuna que comprende un virus en el que dicho virus está en forma inactiva. Se sabe que los parvovirus inactivados enteros en general, ya sea parvovirus porcinos o caninos, son una base muy eficaz y segura para las vacunas. Simplemente como un ejemplo: MSD AH (Boxmeer, Países Bajos) produce una vacuna PPV de tipo parvovirus porcino inactivado disponible comercialmente: Porcilis Parvo. Hipra (España) también produce una vacuna PPV de tipo parvovirus porcino inactivado disponible comercialmente: pArVOSUIN® MR/AD. Zoetis produce una vacuna de parvovirus canino inactivado: PARVAC y una vacuna de parvovirus porcino inactivado de tipo PPV: Porcine PARVAC. Novartis proporciona métodos para la inactivación de parvovirus en la patente de EE.UU. US4193991.
Dichas vacunas de virus completos inactivados pueden prepararse igualmente para el nuevo parvovirus porcino. Como es el caso de las vacunas contra el parvovirus conocidas, la producción comprende básicamente las etapas de desarrollar el nuevo parvovirus en células porcinas susceptibles, recolectar el virus, inactivar el virus y mezclar el virus inactivado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La forma estándar de inactivación es un tratamiento clásico con formaldehído. Otros métodos bien conocidos en la técnica para la inactivación son la radiación UV, la radiación gamma, el tratamiento con etilenimina binaria, timerosal y similares. La persona experta sabe cómo aplicar estos métodos. Preferentemente, el virus se inactiva con p-propiolactona, glutaraldehído, etilenimina o formaldehído. No hace falta decir que también se describen en el presente documento otras formas de inactivar el virus.
Tal como se ha indicado anteriormente, el virus puede crecer en cultivo celular en células porcinas susceptibles o líneas celulares.
Por lo tanto, también se describe un cultivo celular que comprende un parvovirus porcino asociado al SHI. Los ejemplos de células y líneas celulares son SK6, PK15, células renales porcinas primarias o inmortalizadas, macrófagos pulmonares alveolares porcinos primarios o inmortalizados.
Prácticamente se ha determinado todo el genoma vírico del nuevo parvovirus porcino y la secuencia de ADN de un representante del nuevo virus se presenta en la SEQ ID NO: 10. Las repeticiones terminales invertidas (RTI) del genoma no se presentan en el presente documento. Dado que los parvovirus, por definición, pertenecen a los virus más pequeños conocidos, todo el ADN monocatenario que codifica el parvovirus se puede generar fácilmente de forma sintética. Por este motivo, el parvovirus se puede generar fácilmente in vivo utilizando el ADN vírico como material de partida. Las repeticiones terminales invertidas (RTI) del genoma de otro parvovirus conocido, tal como, entre otros, el descrito por Qiu et al. (37) y por Wang et al. (38) se puede usar para completar el genoma vírico tal como se presenta en la SEQ ID NO: 10. Las RTI simplemente desempeñan un papel en la replicación del genoma vírico y, como tales, no son relevantes desde el punto de vista inmunológico. Por lo tanto, con el fin de producir un virus, las RTI son intercambiables.
La clonación de ADN parvovírico de longitud completa en un plásmido tal como, por ejemplo, Bluescript II SK, y la generación posterior de parvovirus completo a través de la transfección de células porcinas con un plásmido de expresión que codifica el nuevo parvovirus porcino, entre otros, se describe por Qiu et al. (37) y por Wang et al. (38). Una línea celular permisiva como SK6, PK15, células renales porcinas primarias o inmortalizadas, los macrófagos pulmonares alveolares porcinos primarios o inmortalizados serían la línea celular preferida para este propósito. No obstante, si se desea, también se pueden usar líneas celulares no permisivas: el genoma del nuevo parvovirus se guede replicar en células no permisivas con la ayuda de genes de adenovirus tal como se describe por Guan et al.
Aunque los parvovirus inactivados completos proporcionan una buena base para las vacunas, su producción puede ser costosa, en función, entre otros, del tipo de células hospedadoras utilizadas, del sustrato y del medio de cultivo celular utilizado. En el caso específico de parvovirus, una alternativa atractiva para el uso de virus completos es el uso de subunidades de CP de parvovirus, más preferentemente, subunidades en forma de las llamadas cápsides vacías.
Dichas cápsides vacías son básicamente partículas similares a virus que, sin embargo, no comprenden el genoma parvovírico. Como consecuencia, las partículas de cápside vacías parvovíricas no tienen que ser inactivadas antes de su uso en una vacuna, y por lo tanto tienen la ventaja adicional de que son intrínsecamente seguras.
Las cápsides vacías se pueden obtener por la simple expresión de ORF2 que codifica la proteína de la cápside, en un sistema de expresión adecuado. La proteína de la cápside así formada se autoensambla en partículas de virus vacías.
Las cápsides vacías parvovíricas se pueden preparar fácilmente en grandes cantidades y son altamente inmunogénicas.
Con mucho, la mayoría de los sistemas de expresión actualmente en uso para hacer cápsides vacías parvovíricas son sistemas de expresión basados en baculovirus.
Los métodos para la producción de cápsides vacías de parvovirus altamente inmunogénicas en sistemas de expresión basados en baculovirus se han descrito, por ejemplo, para el parvovirus porcino tipo PPV por Martinez (18), Casal (19), Zhou et al. (20) y por Hao Feng (21). Para otros parvovirus, tales métodos se han descrito, por ejemplo, por Saliki (22) y por Brown (3). Además, los sistemas de expresión de baculovirus y los vectores de expresión de baculovirus en general se han descrito ampliamente en libros de texto como O'Reilly et al. (24) y Murhammer (25). Los sistemas de expresión basados en baculovirus también están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California 92008, EE. UU.
Una alternativa para los sistemas de expresión basados en Baculovirus son los sistemas de expresión basados en levaduras. Los sistemas de expresión en levadura están descritos, por ejemplo, por Gellissen et al. (29).
Los sistemas de expresión listos para usar están disponibles comercialmente de Research Corp. Technologies, 5210 East Williams Circle, Suite 240, Tucson, AZ 85711-4410 EE. UU. Los sistemas de expresión en células de levadura e insecto también están disponibles, por ejemplo, en Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto, California 94303-4607, EE. UU.
Por supuesto, la expresión de la proteína de la cápside también es posible en sistemas de expresión basados en células de mamífero tal como se conoce en la técnica, pero estos sistemas probablemente serían más caros de usar, en comparación con los sistemas de expresión basados en baculovirus.
Así, la invención se refiere a una vacuna para combatir el parvovirus porcino asociado a SHI en cerdos, caracterizado porque dicha vacuna comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de una proteína de la cápside y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una forma preferida de esta realización se refiere a una vacuna para combatir el parvovirus porcino asociado al SHI en cerdos, caracterizado porque dicha vacuna comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de una proteína de la cápside en forma de cápsides vacías.
La cantidad de cápsides vacías en una vacuna y la vía de administración serían comparables con las partículas de virus enteros inactivados, ya que en términos de inmunogenicidad y similitud de la cápside, son comparables a las partículas de virus enteros inactivados.
Normalmente, una cantidad de entre 1 y 100 |jg de las nuevas cápsides vacías de parvovirus sería muy adecuada como dosis de vacuna. Desde el punto de vista del coste, una cantidad preferida estaría en el intervalo de 1-50 jg de cápsides vacías, más preferentemente en el intervalo de 1-25 jg.
Casal (19) describe que tanto las dosis de parvovirus canino como la de parvovirus porcino tan bajas como 1-3 jg en presencia de adyuvantes convencionales confieren protección total al hospedador correspondiente contra la enfermedad.
Una vacuna según la invención basada en cápsides vacías comprende preferentemente un adyuvante. Los adyuvantes convencionales, bien conocidos en la materia son, por ejemplo, el adyuvante completo e incompleto de Freund, vitamina E, polímeros de bloque no iónicos, dipéptidos de muramilo, Quill A(R), aceite mineral por ejemplo Bayol(R) o Markol(R), aceite vegetal y Carbopol(R) (un homopolímero) o Diluvac(R) Forte. La vacuna también puede comprender un denominado "vehículo". Un vehículo es un compuesto al que se adhiere el polipéptido, sin estar covalentemente ligado a ello. Los compuestos de vehículos usados con frecuencia son, por ejemplo, hidróxido de aluminio, -fosfato u -óxido, sílice, caolín y bentonita.
Casal (19) usó con éxito el hidróxido de aluminio y Quill A en sus vacunas contra el parvovirus.
En principio, una vacuna según la invención puede administrarse solo una vez. Sin embargo, especialmente en el caso de vacunas de cápside vacías, preferentemente también se administra una primera y posiblemente una segunda vacuna de refuerzo. Un primer refuerzo generalmente se administraría al menos dos semanas después de la primera vacuna. Un momento muy adecuado para una vacuna de refuerzo es entre 3 y 16 semanas después de la primera vacunación. Un segundo refuerzo, si fuese necesario, generalmente se administraría entre 4 y 50 semanas después del primer refuerzo.
Una alternativa al enfoque de vacuna de virus completo inactivado y al enfoque de vacuna de cápside vacía es el uso de vectores no de parvovirus recombinantes vivos que tienen a los cerdos como su animal hospedador, como vehículos del nuevo gen de la proteína de la cápside parvovírica porcina.
Entre los vectores no de parvovirus recombinantes adecuados que tienen a los cerdos como su animal hospedador, dos vectores son especialmente adecuados como vehículos: el virus de la pseudorrabia (PRV) y el virus de la peste porcina clásica (CSFV).
El uso de tales virus recombinantes en vacunas tiene la ventaja adicional de que los animales vacunados se vacunan al mismo tiempo contra PRV y PPV o CSFV y PPV.
Chen y col. (27) describen la construcción y el uso de un vector recombinante de PRV atenuado vivo que expresa una proteína de la cápside de PPV de tipo parvovirus porcino. Este PRV recombinante se administró a lechones de ocho días de vida en una cantidad de 5x105 de DICT50 y esta cantidad de vacuna demostró ser segura y proporcionó una excelente inmunidad contra el PRV y el PPV.
Los vectores de CSFV vivos atenuados también son muy adecuados como vectores recombinantes vivos. Simplemente como ejemplo; el CSFV atenuado vivo del cual se ha delecionado el gen NPra, se ha descrito por Mayer et al.(28). Tal virus vivo atenuado permite, entre otros, en el sitio de deleción del gen NPra, para la inserción del gen que codifica la proteína de la cápside. Tal vector de CSFV recombinante vivo forma igualmente un vehículo adecuado para el nuevo gen de proteína de cápside del parvovirus porcino.
La expresión del gen de la proteína de la cápside se puede poner bajo el control de cualquier promotor heterólogo adecuado que sea funcional en una célula de mamífero (véase más adelante). Un promotor heterólogo es un promotor que no es el promotor responsable de la transcripción del gen de la CP en la forma de tipo silvestre del nuevo parvovirus porcino. Puede ser un promotor parvovírico responsable de la transcripción de una CP o de una NS1 de otro parvovirus, que no pertenece al parvovirus como se describe o puede ser un promotor no parvovírico. Por lo tanto, también se describe un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica una CP, en donde dicho gen está bajo el control de un promotor heterólogo funcional.
Chen et al.(27) hizo uso del promotor del CMV para impulsar la expresión del gen de la proteína de la cápside, pero otros promotores adecuados que son funcionales en una célula de mamífero son conocidos en la técnica. Un promotor que es funcional en una célula de mamífero es un promotor que es capaz de dirigir la transcripción de un gen que se encuentra aguas abajo del promotor en una célula de mamífero.
Los ejemplos de promotores adecuados que son funcionales en una célula de mamífero incluyen promotores clásicos tales como el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (humano) (Seed, B. et al., Nature 329, 840­ 842, 1987; Fynan, E.F. et al., PNAS 90, 11478-11482,1993; Ulmer, J.B. et al., Science 259, 1745-1748, 1993), la RTL del virus del sarcoma de Rous (RSV, Gorman, C.M. et al., PNAS 79, 6777-6781, 1982; Fynan et al., citado anteriormente; Ulmer et al., citado anteriormente), la Rtl del MPSV (Stacey et al., J. Virology 50, 725-732, 1984), promotor temprano inmediato de SV40 (Sprague J. et al., J. Virology 45, 773, 1983), el promotor de SV-40 (Berman, P.W. et al., Science, 222, 524-527, 1983), el promotor de metalotioneína (Brinster, R.L. et al., Nature 296, 39-42, 1982), el promotor de choque térmico (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985), el promotor tardío principal de Ad2 y el promotor de p-actina (Tang et al., Nature 356, 152-154, 1992). Las secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias terminadoras y de poliadenilación. Entre las secuencias que se pueden usar están la conocida secuencia de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina, la secuencia de poliadenilación del SV40, el terminador del citomegalovirus humano (hCMV) y las secuencias de poliadenilación.
Por lo tanto, también se describe una vacuna para combatir el parvovirus porcino asociado al SHI en cerdos, en donde dicha vacuna comprende un vector no de parvovirus vivo recombinante que comprende un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica una Cp bajo el control de un promotor funcional y un vehículo farmacéuticamente aceptable. No hace falta decir que el vector no de parvovirus vivo recombinante debería expresar una cantidad inmunogénicamente eficaz de la proteína de la cápside.
Una alternativa para la vacunación con una vacuna de virus completo inactivado, una vacuna de cápside vacía o un vector no de parvovirus vivo recombinante, es el uso de la vacuna de ADN.
Dicha vacuna de ADN se basa en la introducción de un fragmento de ADN que porta el gen que codifica la proteína de la cápside bajo el control de un promotor adecuado, en el animal hospedador. Una vez que el ADN es absorbido por las células del hospedador, el gen que codifica la proteína de la cápside se transcribe y el tránscrito se traduce en proteína de la cápside en las células del hospedador. Esto imita de cerca el proceso de infección natural del parvovirus. Los promotores adecuados son promotores que son funcionales en células de mamífero, como se ha ejemplificado anteriormente.
Un fragmento de ADN que porta el gen que codifica la proteína de la cápside bajo el control de un promotor adecuado podría ser, por ejemplo, un plásmido. Este plásmido puede estar en forma circular o lineal.
Los ejemplos de vacunación exitosa con ADN de cerdos son, entre otros, la vacunación exitosa contra la enfermedad de Aujeszky como se describe en Gerdts et al. (30), Journal of General Virology 78: 2139-2146 (1997). Describen una vacuna de ADN en la que se usa un fragmento de ADN que transporta la glucoproteína C bajo el control del principal promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano. La vacunación se realizó cuatro veces con intervalos de dos semanas con una cantidad de 50 |jg de ADN. Los animales vacunados desarrollaron anticuerpos séricos que reconocieron el antígeno respectivo en una inmunotransferencia y que exhibieron actividad neutralizante.
Otro ejemplo de vacunación exitosa de ADN de cerdos se da por Gorres et al. (31). Describieron la vacunación exitosa de ADN de cerdos contra la gripe porcina pandémica clásica H1N1. Se vacunaron con una vacuna principal y 2 refuerzos homólogos a las 3 y 6 semanas después del cebado, de una vacuna de ADN que comprende el gen hA de gripe H1N1 bajo el control de un promotor funcional.
Por lo tanto, también se describe una vacuna para combatir el parvovirus porcino asociado al SHI en cerdos, en donde dicha vacuna comprende un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica una proteína de la cápside bajo el control de un promotor funcional y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
No hace falta decir que el fragmento de ADN que comprende un gen que codifica una proteína de la cápside debería expresar una cantidad inmunogénicamente eficaz de la proteína de la cápside.
Lo que constituye una "cantidad inmunogénicamente eficaz" para una vacuna según la invención que se basa en una cápside vacía depende del efecto deseado y del organismo diana.
La expresión "cantidad inmunogénicamente eficaz" tal como se usa en el presente documento se refiere a la cantidad de parvovirus, cápside vacía, vacuna de ADN o vector recombinante de virus vivo que es necesaria para inducir una respuesta inmunológica en cerdos en la medida en que disminuya los efectos patológicos causados por la infección con un parvovirus porcino de tipo silvestre asociado al SHI, en comparación con los efectos patológicos causados por la infección con un parvovirus porcino de tipo silvestre asociado al SHI en cerdos no inmunizados. Está dentro de la capacidad del experto en la materia el determinar si un tratamiento es "inmunológicamente eficaz", por ejemplo, administrando una infección de exposición experimental a animales vacunados y luego determinando los síntomas clínicos de enfermedad o los parámetros serológicos de un animal diana o midiendo el nuevo aislamiento del patógeno, seguido de la comparación de estos hallazgos con los observados en cerdos infectados en el campo.
La cantidad de virus administrada dependerá de la vía de administración, de la presencia de un adyuvante y del momento de la administración.
Una cantidad preferida de una vacuna viva que comprende virus se expresa, por ejemplo, como la dosis infecciosa de cultivo tisular (DICT50). Por ejemplo, para un virus vivo, un intervalo de dosis entre 10 y 109 DICT50 por dosis animal se puede usar ventajosamente, dependiendo del resto de virulencia del virus. Preferentemente, se usa un intervalo de entre 102 y 106 DICT50.
Se pueden aplicar muchas formas de administración, todas conocidas en la materia. Las vacunas según la invención se administran preferentemente al animal mediante inyección (intramuscular o vía intraperitoneal) o por vía oral. El protocolo para la administración se puede optimizar de acuerdo con la práctica estándar de vacunación. En todos los casos, La administración a través de un inyector intradérmico (IDAL) es una forma preferida de administración. Si una vacuna comprende cápsides vacías, la dosis también se expresaría como el número de partículas a administrar. La dosis generalmente sería algo más alta en comparación con la administración de partículas de virus vivos, porque las partículas de virus vivos se replican hasta cierto punto en el animal diana, antes de que sean eliminados por el sistema inmunitario. Para las vacunas basadas en virus inactivados, una cantidad de partículas de virus en el intervalo de aproximadamente 104 a 109 partículas generalmente sería adecuada, dependiendo del adyuvante utilizado.
Si una vacuna comprende subunidades, por ejemplo, la CP, la dosis también podría expresarse en microgramos de proteína. Para las vacunas basadas en subunidades, una dosis adecuada generalmente estaría en el intervalo entre 5 y 500 microgramos de proteína, nuevamente dependiendo del adyuvante utilizado.
Si una vacuna comprende un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica la proteína de la cápside, la dosis se expresaría en microgramos de ADN. Para las vacunas basadas en subunidades, una dosis adecuada generalmente estaría en el intervalo entre 5 y 500 microgramos de ADN, dependiendo, entre otros, de la eficacia del plásmido de expresión utilizado. En muchos casos, una cantidad de entre 20 y 50 microgramos de plásmido por animal sería suficiente para una vacunación eficaz.
Una vacuna de acuerdo con la invención puede tomar cualquier forma que sea adecuada para la administración en el contexto de la cría de cerdos, y que coincida con la ruta de aplicación deseada y el efecto deseado. La preparación de una vacuna según la invención se lleva a cabo por medios convencionales para el experto.
Se prefieren las vías orales cuando se trata de facilitar la administración de la vacuna.
Para la administración oral, la vacuna se mezcla preferentemente con un vehículo adecuado para la administración oral, es decir, celulosa, alimentos o una sustancia metabolizable como alfa-celulosa o diferentes aceites de origen vegetal o animal.
En la práctica, los cerdos se vacunan contra una serie de virus o microorganismos patógenos.
Por lo tanto, es muy atractivo, tanto por razones prácticas como económicas, combinar una vacuna según la invención para cerdos con, por ejemplo, un inmunógeno adicional de un virus o microorganismo patógeno para cerdos, o información genética que codifique un inmunógeno de dicho virus o microorganismo.
Por lo tanto, también se describe una vacuna, en donde esa vacuna comprende al menos otro microorganismo patógeno porcino o virus patógeno porcino y/o al menos otro componente inmunógeno y/o material genético que codifica dicho otro componente inmunógeno, de dicho microorganismo patógeno porcino o virus patógeno porcino. Un componente inmunógeno o inmunogénico es un compuesto que induce una respuesta inmunológica en un animal. Puede ser, por ejemplo, un virus o una bacteria completa, o una proteína o un resto de azúcar de ese virus o bacteria.
Los virus y microorganismos patógenos más comunes que son patógenos para los cerdos son Brachyspira hyodysenteriae, el virus de la peste porcina africana, virus Nipah, circovirus porcino, Torque Teno virus porcino, virus de la pseudorrabia, virus de la gripe porcina, parvovirus porcino, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), virus de la fiebre aftosa, virus de gastroenteritis transmisible, rotavirus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae.
Por lo tanto, también se describe una vacuna, en donde el virus o el microorganismo patógeno para los cerdos se selecciona del grupo de Brachyspira hyodysenteriae, el virus de la peste porcina africana, virus Nipah, circovirus porcino, Torque Teno virus porcino, virus de la pseudorrabia, virus de la gripe porcina, parvovirus porcino, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), virus de la fiebre aftosa, virus de gastroenteritis transmisible, rotavirus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae.
También se describe un método para la preparación de una vacuna, en donde el método comprende la mezcla de un virus y/o de una cápside vacía y/o de una CP y/o de un fragmento de ADN que codifica una CP y/o de un vector no de parvovirus vivo recombinante que codifica una CP, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De nuevo, también se describe un virus y/o una cápside vacía y/o una CP y/o un fragmento de ADN que codifica una CP y/o un vector no de parvovirus vivo recombinante que codifica una CP, para uso en una vacuna.
Como se ha mencionado anteriormente, el síndrome hemorrágico del intestino es un síndrome multifactorial. Es una compilación de factores que eventualmente desencadenan en el SHI. Esto significa que es importante saber si el parvovirus porcino asociado al SHI está presente en una determinada población de cerdos mucho antes de que se manifiesten los primeros síntomas clínicos. Por lo tanto, para una protección eficaz contra la enfermedad, es importante una detección rápida y correcta de la presencia del parvovirus porcino asociado al SHI.
Por lo tanto, otro objetivo de la presente invención es proporcionar herramientas de diagnóstico adecuadas para la detección de parvovirus porcino asociado al SHI.
Estas herramientas dependen en parte de la disponibilidad de anticuerpos contra el virus. Dichos anticuerpos se pueden usar, por ejemplo, en pruebas de diagnóstico para el parvovirus porcino asociado al SHI.
Los anticuerpos o antisueros que comprenden anticuerpos contra el parvovirus porcino asociado al SHI se pueden obtener rápida y fácilmente mediante la vacunación de, por ejemplo, cerdos, aves de corral o, por ejemplo, conejos con el virus seguido, después de unas cuatro semanas, por sangrado, centrifugación de la sangre coagulada y decantación de los sueros. Tales métodos son bien conocidos en la materia.
Otros métodos para la preparación de anticuerpos producidos contra el parvovirus porcino asociado al SHI, que puede ser policlonal, monoespecífico o monoclonal (o derivados de los mismos) también son bien conocidos en la técnica. Si se desean anticuerpos policlonales, las técnicas para producir y procesar sueros policlonales son bien conocidas en la técnica durante décadas, véase, por ejemplo, Mayer y Walter .
Los anticuerpos monoclonales, reactivos contra el virus se pueden preparar inmunizando ratones consanguíneos mediante técnicas también conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, Kohler y Milstein (36).
Por lo tanto, también se describen anticuerpos o antisueros que son reactivos con el virus.
Un kit de prueba de diagnóstico basado en la detección de un virus o material antigénico de ese virus y, por lo tanto, adecuado para la detección de infección por parvovirus porcino asociado al SHI puede comprender, por ejemplo, una prueba ELISA convencional. En un ejemplo de tal prueba, las paredes de los pocillos de una placa de ELISA están recubiertas con anticuerpos dirigidos contra el virus. Después de la incubación con el material a analizar, los anticuerpos marcados reactivos con el virus se agregan a los pocillos. Si el material a analizar realmente comprende el nuevo parvovirus porcino, este virus se uniría a los anticuerpos recubiertos en los pocillos del ELISA. Los anticuerpos marcados reactivos con el virus que posteriormente se agregarían a los pocillos a su vez se unirían al virus y una reacción de color revelaría la presencia de material antigénico del virus.
Por lo tanto, también se describen kits de prueba de diagnóstico para la detección de un virus o material antigénico del virus, que comprenden anticuerpos reactivos con un virus o con material antigénico del mismo. El material antigénico del virus debe interpretarse en un sentido amplio. Puede ser, por ejemplo, el virus en forma desintegrada, o material de la envoltura del virus que comprende proteínas de membrana externa del virus. Mientras el material del virus reaccione con el antisuero producido contra el virus, el material se considera un material antigénico.
Un kit de prueba de diagnóstico basado en la detección en suero de anticuerpos reactivos con el virus o material antigénico del virus y, por lo tanto, adecuado para la detección de infección por parvovirus porcino asociado al SHI también puede comprender, por ejemplo, una prueba ELISA convencional. En dicha prueba, las paredes de los pocillos de una placa ELISA pueden recubrirse, por ejemplo, con el virus o material antigénico del mismo después de la incubación con el material a analizar, por ejemplo, suero de un animal sospechoso de estar infectado con el nuevo parvovirus porcino, los anticuerpos marcados reactivos con el virus se agregan a los pocillos. Si los anticuerpos antiparvovirus porcino asociados al SHI estuvieran presentes en el suero analizado, estos anticuerpos se unirán a los virus recubiertos en los pocillos del ELISA. Como consecuencia, los anticuerpos marcados añadidos posteriormente que reaccionan con el virus no se unirían y no se encontraría ninguna reacción de color. La falta de reacción de color revelaría la presencia de anticuerpos reactivos con el virus.
Por lo tanto, también se describen kits de prueba de diagnóstico para la detección de anticuerpos reactivos con el virus o con material antigénico del virus que comprende el virus o material antigénico del mismo.
El diseño del inmunoensayo puede variar. Por ejemplo, el inmunoensayo puede basarse en la competencia o reacción directa. Además, los protocolos pueden usar soportes sólidos o pueden usar material celular. La detección del complejo anticuerpo-antígeno puede implicar el uso de anticuerpos marcados; los marcadores pueden ser, por ejemplo, enzimas, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o colorantes.
Los métodos adecuados para la detección de anticuerpos reactivos con un virus en la muestra incluyen, además del ELISA mencionado anteriormente, el ensayo inmunofluorescencia (EIF) y análisis por transferencia de Western. Una prueba de diagnóstico alternativa pero rápida y fácil para diagnosticar la presencia o ausencia de un virus es una prueba de PCR como se mencionó anteriormente, que comprende un conjunto de cebadores de PCR reactivo con una región específica del gen de la CP o de la NS1 de parvovirus porcino asociado al SHI. Específico en este contexto significa único para, por ejemplo, el gen de la CP o de la NS1 del parvovirus porcino asociado al SHI, es decir, no está presente en otros miembros de la familia Parvoviridae.
Tal prueba usaría el conjunto de cebadores (SEQ ID NO: 5-6) que reacciona específicamente con la proteína de la cápside del virus o el conjunto de cebadores (SEQ ID NO: 7-8) específicamente reactivos con la NS1 del virus. No hace falta decir, que se pueden usar más cebadores que los cebadores identificados anteriormente. La presente invención proporciona por primera vez la secuencia única del gen de la CP y de la NS1 del parvovirus porcino asociado al SHI. Esto permite que el experto en la materia seleccione, sin ningún esfuerzo adicional, otros cebadores selectivos. Mediante un simple análisis computacional de la secuencia génica de la CP o de la NS1 del parvovirus porcino asociado al SHI proporcionada por la presente invención con él, conocido, den de la CP o de la NS1 de otros miembros de la familia del parvovirus porcino Parvoviridae no asociados al SHI, el experto en la materia puede desarrollar otros cebadores de PCR específicos para pruebas de diagnóstico para la detección de un parvovirus porcino asociado al SHI y/o la discriminación entre un parvovirus porcino asociado al SHI y otros patógenos víricos (porcinos).
Se entiende que los cebadores de PCR que reaccionan específicamente con el ge de la CP o el gen de la NS1 del parvovirus porcino asociado al SHI son aquellos cebadores que reaccionan solo con el gen de la CP o el gen de la NS1 del parvovirus porcino asociado al SHI y no con el gen de la CP o el gen de la NS1 otro virus patógeno (porcino), o del grupo de virus patógenos (porcino).
Por lo tanto, también se describe un kit de prueba de diagnóstico para la detección de un virus, en donde dicho kit de prueba comprende un conjunto de cebadores de PCR que es específicamente reactivo con una región del gen de la CP o el gen de la NS1 del parvovirus porcino asociado al SHI.
La invención se refiere a un kit de prueba de diagnóstico para la detección de un virus, caracterizado porque dicha prueba comprende el conjunto de cebadores como se representa en la SEQ ID NO: 5-6 o el conjunto de cebadores como se representa en la SEQ ID NO: 7-8.
Ejemplos
Ejemplo 1: Análisis del conjunto de muestras 1 de animales enfermos.
Descripción del conjunto de muestras 1
Conjunto de muestras 1: 17 animales, 16 cerdos machos / 1 hembra, de 18-27 semanas de edad. 7 granjas. Recibido el 31 de julio de 2013. Síntomas clínicos: Los animales de repente desarrollaron distensión abdominal, algunos gritaron antes de morir. No se observaron síntomas durante las semanas previas a la muerte. El tiempo entre la observación de los primeros síntomas y la muerte fue de 2-6 horas. Después del inicio de los síntomas, los animales fueron sacrificados por electrocución y se les realizó una necropsia.
Síntomas de los órganos: Anomalías en el intestino delgado. Síntomas hemorrágicos, pared intestinal delgada, líquido sanguinolento en los intestinos. No hay anomalías en otros órganos, salvo los ganglios linfáticos agrandados, edémicos y de aspecto rojo. Véase la figura 3.
Los órganos se congelaron a -70 °C. El suero se preparó a partir de sangre coagulada mediante centrifugación a 3000 xg y posterior almacenamiento a -70 °C.
Protocolos de PCR:
El ADN aislado se cribó por PCR usando cebadores derivados de las secuencias víricas (tabla 1). Las PCR se realizaron utilizando métodos estándar con una temperatura de hibridación de 58 °C para el conjunto de cebadores Bowl_ORF1_774_F / 1626R, y de 52 °C para el conjunto de cebadores Bowl_Q_ORF2_FW / REV. Se diseñó una sonda para la Q-PCR (tabla 1). La Q-PCR se realizó utilizando un método estándar con una temperatura de hibridación de 50 °C. Los datos de Q-PCR se analizaron utilizando Bio-Rad CFX Manager 2.0.
Tabla 1: Secuencias del cebador Bowl
Figure imgf000014_0001
continuación
Figure imgf000015_0003
Resultados del análisis de PCR:
Los resultados del análisis por PCR se representan en la Tabla 2. En total, el 76 % de las muestras resultó ser positivo.
Tabla 2: Análisis de resultados de muestras del conjunto 1. (+): positivo para el parvovirus nuevo. (-) negativo para el parvovirus nuevo
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0002
Ejemplo 2: Análisis del conjunto de muestras 2 de animales enfermos.
Descripción del conjunto de muestras 2
16 animales, 13 cerdos machos / 3 hembra, de 12-26 semanas de edad. 7 granjas, 4 granjas adicionales en comparación con el conjunto de muestras 1 (total de 11 granjas en el conjunto de muestras 1 2). Recibido el 22 de agosto de 2013.
Síntomas clínicos: Los animales de repente desarrollaron distensión abdominal, algunos gritaron antes de morir. No se observaron síntomas durante las semanas previas a la muerte. El tiempo entre la observación de los primeros síntomas y la muerte fue de 2-6 horas. Después del inicio de los síntomas, los animales fueron sacrificados por electrocución previa y se les realizó una necropsia.
Síntomas de los órganos: Anomalías en el intestino delgado. Síntomas hemorrágicos, pared intestinal delgada, líquido sanguinolento en los intestinos. No hay anomalías en otros órganos, salvo los ganglios linfáticos agrandados, edémicos y de aspecto rojo. Véase la figura 3. No se analizaron todos los ganglios linfáticos y muestras de sangre. Los órganos se congelaron a -70 °C. El suero se preparó a partir de sangre coagulada mediante centrifugación a 3000 xg y posterior almacenamiento a -70 °C.
Protocolos de PCR:
El ADN aislado se cribó por PCR usando cebadores derivados de las secuencias víricas (tabla 1). Las PCR se realizaron utilizando métodos estándar con una temperatura de hibridación de 58 °C para el conjunto de cebadores Bowl_ORF1_774_F / 1626R, y de 52 °C para el conjunto de cebadores Bowl_Q_ORF2_FW / REV. Se diseñó una sonda para la Q-PCR (tabla 1). La Q-PCR se realizó utilizando un método estándar con una temperatura de hibridación de 50 °C. Los datos de Q-PCR se analizaron utilizando Bio-Rad CFX Manager 2.0.
Resultados del análisis de PCR:
Los resultados del análisis por PCR se representan en la Tabla 3. En total, el 25 % de las muestras resultó ser positivo. La sangre no fue analizada. Solo se analizaron dos ganglios linfáticos.
Tabla 3: Análisis de resultados de muestras del conjunto 2. (+): positivo para el parvovirus nuevo. (-) negativo para el parvovirus nuevo
Figure imgf000016_0001
Ejemplo 3: Replicación de nuevos parvovirus en cerdos
Preparación del material animal:
El material de órganos y las heces congeladas de los conjuntos de muestras 1 y 2 se almacenaron a -70 °C antes del análisis. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en hielo. Los órganos se descongelaron y posteriormente se homogeneizaron (10 % p/v) en medio de cultivo de tejidos. El homogeneizado se congeló y descongeló una vez (­ 70 °C). Posteriormente, homogeneizado se centrifugó y se filtró en filtros de 5 pm, 0,45 pm y 0,22 pm para eliminar el material tisular restante. El homogeneizado filtrado se almacenó a -70 °C hasta la inoculación.
Los inóculos (A o B) se administraron como una dosis IM de 4 x 2 ml (4 órganos diferentes, cuello izquierdo, cuello derecho, pierna izquierda, pierna derecha) y una dosis oral de 20 ml (homogeneizado de 10 heces 4 x 2,5 ml de homogeneizado de diferentes órganos). Los inóculos se administraron a temperatura ambiente.
Inóculo A: Conjunto de muestras 2 de animal 10 (véase el Ejemplo 2)
Heces, ganglios linfáticos, pulmón, bazo, intestino
Inóculo B: Conjunto de muestras 1 de animal 2 (véase el Ejemplo 1)
Heces, ganglios linfáticos, pulmón, riñón, hígado
Animales
Se criaron y cebaron trece cerdos (5 verracos / 8 cerdas / raza local / alto estado de salud / SPF / 12-14 semanas de vida al momento de la inoculación) en la granja de MSD en Stevensbeek, en los Países Bajos y enjaulados de acuerdo con directrices institucionales. Los animales fueron examinados para detectar la presencia del nuevo parvovirus en suero, heces, frotis nasales y frotis oculares antes de la inoculación tal como se describe en el Ejemplo 1. Un animal macho fue sacrificado como animal control (no infectado). Los otros doce cerdos fueron enjaulados en 3 grupos separados.
Tratamiento
Grupo 1: Cinco animales
Tres animales recibieron el inóculo A, dos sirvieron como controles de contacto
Grupo 2: Cuatro animales
Tres animales recibieron el inóculo B, dos sirvieron como controles de contacto
Grupo 3: Tres animales
Tres animales recibieron el inóculo B
Muestreo y necropsia
Grupo 1, 2:
Muestras de sangre, frotis rectales/nasales/oculares los días -3, 0, 7, 14, 21, 28 después de la inoculación (si no se sacrificaron) Frotis rectales/nasales/oculares los días 3, 10, 17, 24 después de la inoculación (si no se sacrificaron) Grupo 3:
Muestras de sangre, Frotis rectales/nasales/oculares el día -4, 0, 3, 6 después de la inoculación (si no se sacrifica) Según los resultados de la PCR, los animales fueron programados para necropsia:
Grupo 1:
Inoculado: día 10 p.i.; día 25 p.i.; día 31 p.i.
Control: día 18 p.i.; día 31 p.i.
Grupo 2:
Inoculado: día 14 p.i.; día 29 p.i. (2 animales)
Control: día 22 p.i.
Grupo 3:
Inoculado: día 4 p.i. (1 animal); día 7 p.i. (2 animales).
Resultados
PCR
Conjunto de muestras 2 del Animal 10 utilizado para el inóculo:
Todos los órganos dieron positivo para el nuevo parvovirus: Heces, ganglios linfáticos, pulmón, bazo, intestino, riñón, hígado
Conjunto de muestras 1 del Animal 2 utilizado para el inóculo:
Todos los órganos dieron positivo para el nuevo parvovirus: Heces, ganglios linfáticos, pulmón, riñón, hígado Experimento animal
Resultado de la PCR en frotis/sueros: Tabla 4A-BC
Se tomaron muestras de órganos para histología, para análisis de PCR y para aislamiento del virus. Los órganos para el aislamiento del virus se almacenaron a -70 ° C. Los ganglios linfáticos hepáticos (homogeneizados al 10 %) se analizaron mediante PCR.
Grupo 1: suero de todos los animales inoculados (positivo) el día 7
Suero del control -(negativo) el día 7
Frotis: véase la Tabla 4A
Grupo 2: suero de todos los animales inoculados el día 7
Suero de control - el día 7
Frotis: véase la Tabla 4B
Grupo 3: suero de todos los animales inoculados el día 4
Frotis: véase la Tabla 4C
Resultados de PCR
Órgano necropsiado d. 10 p.i. (inóculo A. grupo 1) d. 14 p.i. (inóculo B. grupo 2) Suero positivo positivo
Bazo positivo positivo
Ganglios linfáticos
mesentéricos positivo positivo
Ganglio linfático hepático positivo positivo
Ganglio linfático inguinal positivo positivo
Pulmón positivo positivo
Amígdala positivo positivo
Riñón positivo positivo
Mucosa nasal positivo positivo
Intestino grueso positivo positivo
hígado positivo positivo
Intestino delgado positivo positivo
Estómago positivo positivo
(continuación)
Órgano necropsiado d. 10 p.i. (inóculo A. grupo 1) d. 14 p.i. (inóculo B. grupo 2)
Cerebro positivo positivo
Bilis débilmente positivo débilmente positivo
50 % de contenido de
intestino delgado no detectado no detectado
25 % de contenido de
intestino grueso no detectado no detectado
Orina no detectado no detectado
Resultados de ganglios linfáticos
Los ganglios linfáticos hepáticos de los 13 animales recolectados en el momento de la necropsia se homogeneizaron al 10 % (p/v) en medio de cultivo. El ADN se aisló del homogeneizado y la presencia de virus se analizó por PCR. El ganglio linfático de control fue negativo para el nuevo parvovirus, los 12 cerdos inoculados o de control fueron positivos para virus.
Conclusión:
Basándose en los datos presentados anteriormente, se puede concluir que el nuevo parvovirus se replica en los cerdos.
La vía de transmisión más probable es oral/nasal a través del contacto directo, pero la transmisión oral/fecal y la transmisión a través del aire no pueden excluirse. Sin embargo, la excreción fecal es limitada.
El virus se encuentra en múltiples órganos.
Basándose en los resultados combinados en el Ejemplo 1-3, se espera que en un subconjunto de animales; en aproximadamente el 1-2 % del total de animales infectados, la infección con el nuevo parvovirus causa la enfermedad en el momento de la aparición del virus en la sangre (viremia). La excreción en las heces es mínima, pero el virus permanece presente en la sangre > 30 días después de la infección. También los frotis nasales y oculares siguen siendo positivos para PCR > 30 días después de la infección.
En los cerdos infectados, tal como se describe en el Ejemplo 3, no se observó síndrome hemorrágico intestinal, pero esto era de esperar, basándose en una baja incidencia de la enfermedad; el 1-2% en la población general y en el hecho de que los animales utilizados en el Ejemplo 3 eran relativamente jóvenes y en excelentes condiciones. Además de los cerdos en una granja comercial, no tenían factores de riesgo predisponentes.
Tabla 4A: Resultados del ru o 1: 3 animales infectados 2 controles Inóculo A
Figure imgf000018_0001
El nuevo parvovirus porcino se conoce como "BOWL".
R: frotis rectal
N: frotis nasal
O: frotis ocular
S: suero
n/a: no analizado (no muestreado)
T l 4B: R l l r 2: nim l inf 1 nrl In l B
Figure imgf000019_0001
El nuevo parvovirus porcino se conoce como "BOWL".
R: frotis rectal
N: frotis nasal
O: frotis ocular
S: suero
n/a: no analizado (no muestreado)
Tabla 4C: Resultados ru o 3: 3 animales infectados Inóculo B
Figure imgf000019_0002
El nuevo parvovirus porcino se conoce como "BOWL".
R: frotis rectal
N: frotis nasal
O: frotis ocular
S: suero
n/a: no analizado (no muestreado)

Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Una vacuna para combatir el parvovirus porcino asociado al SHI en cerdos, caracterizado por que dicha vacuna comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de una proteína de la cápside (CP) codificada por un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica la CP, en donde la secuencia de nucleótidos de dicho gen tiene un nivel de identidad de al menos el 80 % con la secuencia de nucleótidos del gen de la CP tal como se representa en la SEQ ID NO: 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
2. Un kit de prueba de diagnóstico, caracterizado por que dicho kit de prueba comprende un conjunto de cebadores de PCR tal como se representa en las SEQ ID NO: 5 y 6 que es específicamente reactivo con una región del gen de la proteína de la cápside del parvovirus porcino asociado al SHI o un conjunto de cebadores tal como se representa en las SEQ ID NO: 7 y 8 que es específicamente reactivo con una región del gen de la NS1 del parvovirus porcino asociado al SHI.
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