[go: up one dir, main page]

ES2765573T3 - Tratamiento y diagnóstico de melanoma - Google Patents

Tratamiento y diagnóstico de melanoma Download PDF

Info

Publication number
ES2765573T3
ES2765573T3 ES13829165T ES13829165T ES2765573T3 ES 2765573 T3 ES2765573 T3 ES 2765573T3 ES 13829165 T ES13829165 T ES 13829165T ES 13829165 T ES13829165 T ES 13829165T ES 2765573 T3 ES2765573 T3 ES 2765573T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
alkyl
cells
cancer
mir
melanoma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13829165T
Other languages
English (en)
Inventor
Sohail Tavazoie
Nora G Pencheva
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rockefeller University
Original Assignee
Rockefeller University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rockefeller University filed Critical Rockefeller University
Application granted granted Critical
Publication of ES2765573T3 publication Critical patent/ES2765573T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/136—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline having the amino group directly attached to the aromatic ring, e.g. benzeneamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/265—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carbonic, thiocarbonic, or thiocarboxylic acids, e.g. thioacetic acid, xanthogenic acid, trithiocarbonic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/4155—1,2-Diazoles non condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/416—1,2-Diazoles condensed with carbocyclic ring systems, e.g. indazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4174—Arylalkylimidazoles, e.g. oxymetazolin, naphazoline, miconazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C217/54—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and amino groups bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/64—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms, e.g. histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6503—Five-membered rings
    • C07F9/6506—Five-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Abstract

Un agonista de LXRβ, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de un cáncer metastásico en un sujeto que lo necesita mediante el incremento del nivel de expresión o el nivel de actividad de ApoE, en donde el cáncer metastásico es resistente a un antiproliferativo de la Tabla 2 y el agonista de LXRβ es: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento y diagnóstico de melanoma
Campo de la invención
Esta invención se refiere al diagnóstico y tratamiento de cánceres migratorios y melanoma.
Antecedentes de la invención
El melanoma, un tumor maligno, se desarrolla a partir de melanocitos anormales en la epidermis inferior y puede metastatizar en sitios distantes del cuerpo a través de los sistemas sanguíneo y linfático. Aunque representa menos del 5 % de los casos de cáncer de piel, el melanoma es mucho más peligroso y es responsable de una gran mayoría de las muertes asociadas con el cáncer de piel. En todo el mundo, la incidencia del melanoma se ha incrementado a una velocidad alarmante, con un riesgo vital de desarrollar melanoma tan alto como 1/58 para los hombres en los EE.UU. (Jemal et al., 2008, CA: Cancer J. Clin. 58:71-96). La tasa de mortalidad del melanoma maligno también continúa creciendo dramáticamente a lo largo del mundo. Según un informe de la OMS de 2006, se producen aproximadamente 48.000 muertes relacionadas con melanoma en todo el mundo por año (Lucas et al. (2006) Environmental Burden of Disease Series. 13. World Health Organization. ISBN 92-4-159440-3). En los Estados Unidos, se estimó que casi 70.000 personas fueron diagnosticadas con melanoma durante 2010 y se espera que aproximadamente 9.000 personas mueran como consecuencia de la enfermedad (American Cancer Society; www.cancer.org).
WO 2010/138598 describe compuestos, sales, isómeros, o profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos, que son útiles como moduladores de la actividad de los receptores X hepáticos (LXR). También se describen composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos y métodos para usar los compuestos.
WO 2007/002563 describe compuestos y sales, isómeros, o profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos, que son útiles como moduladores de la actividad de los receptores X hepáticos. También se describen composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos y métodos para usar los compuestos.
Pencheva et al. (2013) Nature Cell Biology, 15(6): 54-554, describe el control de la progresión metastásica por redes de reguladoras de microARN.
Zhang et al. (2014) Cancer Cell Int, 14:16, describe cómo la activación del receptor X hepático induce la apoptosis de células de melanoma a través de la ruta de la caspasa.
Pencheva et al. (2014) Cell, 156(5): 986-1001, describe la supresión terapéutica de amplio espectro de melanoma metastásico a través de la activación de los receptores de hormonas nucleares.
Chuu et al. (2007) J Biomed Sci, 14: 543-553, describe la modulación de la señalización del receptor X hepático como una nueva terapia para el cáncer de próstata.
Aunque algunas terapias de cáncer convencionales se han usado para tratar melanoma metastásico, estas no son efectivas. El melanoma metastásico permanece, por lo tanto, como uno de los cánceres más difíciles de tratar y uno de los neoplasmas más temidos. De acuerdo con esto, existe una necesidad de nuevos agentes y métodos para el diagnóstico y tratamiento del melanoma.
Resumen de la invención
Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un agonista de LXRp, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un cáncer metastásico en un sujeto que lo necesita según la reivindicación 1 de la presente memoria.
Esta descripción aborda la necesidad mencionada anteriormente proporcionando agentes y métodos para el diagnóstico y tratamiento del melanoma. La descripción se basa, al menos en parte, en un descubrimiento inesperado de una red cooperativa de ARNmi-proteína desrregulada en el melanoma metastásico. Esta red incluye varios factores supresores de metástasis y factores promotores de metástasis.
Esta descripción presenta un método para tratar cáncer, que incluye administrar a un sujeto que lo necesita, un agonista de LXR, en donde el agonista de LXR se administra en una cantidad suficiente como para incrementar el nivel de expresión o actividad de ApoE hasta un nivel suficiente como para ralentizar la diseminación de las metástasis del cáncer.
Esta descripción también presenta un método para tratar cáncer, que incluye administrar a un sujeto que lo necesita, un polipéptido ApoE en una cantidad suficiente como para tratar el cáncer.
En otro aspecto, esta descripción también presenta un método para ralentizar la diseminación de un cáncer migratorio, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita, un agonista de LXR o un polipéptido ApoE.
En determinadas realizaciones, el agonista de LXR incrementa el nivel de expresión de ApoE al menos 2,5 veces in vitro. En determinadas realizaciones, el agonista de LXRp es selectivo para LXRp sobre LXRa. En otras realizaciones, el agonista de LXRp tiene actividad para LXRp que es al menos 2,5 veces mayor que la actividad de dicho agonista para LXRa. En algunas realizaciones, el agonista de LXRp tiene actividad para LXRp que es al menos 10 veces mayor que la actividad de dicho agonista para LXRa. En realizaciones adicionales, el agonista de LXRp tiene actividad para LXRp que es al menos 100 veces mayor que la actividad de dicho agonista para LXRa. En determinadas realizaciones, el agonista de LXR tiene actividad para LXRp que está al menos en 2,5 veces la actividad de dicho agonista para LXRa.
En algunas realizaciones, el cáncer migratorio es cáncer metastásico. El cáncer metastásico puede incluir células que presentan migración y/o invasión de células migratorias y/o incluir células que presentan reclutamiento endotelial y/o angiogénesis. En otras realizaciones, el cáncer migratorio es un cáncer con migración celular. En otras realizaciones adicionales, el cáncer con migración celular es un cáncer con migración celular no metastásico.
El cáncer migratorio puede ser un cáncer que se disemina a través de la siembra de la superficie de los espacios peritoneal, pleural, pericárdico, o subaracnoideo. Alternativamente, el cáncer migratorio puede ser un cáncer que se disemina a través del sistema linfático, o un cáncer que se disemina hematogéneamente.
En realizaciones particulares, el cáncer migratorio es un cáncer con migración celular que es un cáncer con migración celular no metastásico, tal como cáncer de ovario, mesotelioma, o cáncer de pulmón primario.
Esta descripción también proporciona un método para inhibir o reducir las metástasis del cáncer que comprende administrar un agonista de LXR o un polipéptido ApoE.
Esta descripción también proporciona un método para inhibir la proliferación o crecimiento de células madre del cáncer o células iniciadoras del cáncer, que incluye poner en contacto la célula con un agonista de LXR o un polipéptido ApoE en una cantidad suficiente como para inhibir la proliferación o crecimiento de dicha célula.
Esta descripción también proporciona un método para reducir la tasa de siembra tumoral de un cáncer que incluye administrar a un sujeto que lo necesita un agonista de LXR o un polipéptido ApoE en una cantidad suficiente como para reducir la siembra tumoral.
Esta descripción también proporciona un método para reducir o tratar la formación de nódulos metastásicos del cáncer que incluye administrar a un sujeto que lo necesita un agonista de LXR o un polipéptido ApoE en una cantidad suficiente como para tratar dicha formación de nódulos metastásicos del cáncer.
En otras realizaciones, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de células renales, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer esofágico, cáncer de próstata, sarcoma, o melanoma. En algunas realizaciones, el cáncer es melanoma. En otras realizaciones, el cáncer es cáncer de mama. En determinadas realizaciones, el cáncer es cáncer de células renales. En realizaciones adicionales, el cáncer es cáncer pancreático. En otras realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de colon. En realizaciones adicionales, el cáncer es cáncer de ovario.
En otras realizaciones, el cáncer es un cáncer resistente a fármacos. En realizaciones adicionales, el cáncer es resistente a vemurafenib, dacarbazina, un inhibidor de CTLA4, un inhibidor de PD1, o un inhibidor de PDL1.
En algunas realizaciones, el método comprende administrar un agonista de LXR seleccionado de la lista que consiste en un compuesto de una cualquiera de las Fórmulas I-IV o cualquiera de los números de compuesto 1-39, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En algunas realizaciones, el agonista de LXR es el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otras realizaciones, el agonista de LXR es el compuesto 2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En determinadas realizaciones, el agonista de LXR es el compuesto 3 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En realizaciones adicionales, el agonista de LXR es el compuesto 12 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el agonista de LXR es el compuesto 25 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otras realizaciones, el agonista de LXR es el compuesto 38 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En realizaciones adicionales, el agonista de LXR es el compuesto 39 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El método puede incluir además administrar un antiproliferativo, en donde dicho agonista de LXR y dicho antiproliferativo se administran en una cantidad que, conjuntamente, es suficiente como para ralentizar la progresión del cáncer migratorio. Por ejemplo, el antiproliferativo y el agonista de LXR pueden administrarse en 28 días de separación (p. ej., en 21, 14, 1o, 7, 5, 4, 3, 2, o 1 días) o en 24 horas (p. ej., 12, 6, 3, 2, o 1 horas; o concomitantemente) de separación en cantidades que, conjuntamente, son efectivas para tratar al sujeto.
En algunas realizaciones, el método comprende administrar un polipéptido ApoE. El fragmento del polipéptido ApoE puede incrementar el nivel de actividad o el nivel de expresión de LRP1 o LRP8, y/o el polipéptido ApoE puede unirse a LRP1 o LRP8, el polipéptido ApoE puede ser la región de unión al receptor (RBR) de ApoE. El método puede incluir además administrar un antiproliferativo, en donde dicho polipéptido ApoE y dicho antiproliferativo se administran en una cantidad que, conjuntamente, es suficiente como para ralentizar la progresión del cáncer migratorio. Por ejemplo, el antiproliferativo y el polipéptido ApoE pueden administrarse en 28 días de separación (p. ej., en 21, 14, 10, 7, 5, 4, 3, 2, o 1 días) o en 24 horas (p. ej., 12, 6, 3, 2, o 1 horas; o concomitantemente) de separación en cantidades que, conjuntamente, son efectivas para tratar al sujeto.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede comprender además un compuesto adicional que tiene actividad antiproliferativa. El compuesto adicional que tiene actividad antiproliferativa puede seleccionarse del grupo de compuestos tales como agentes quimioterapéuticos y citotóxicos, agentes inductores de la diferenciación (p. ej., ácido retinoico, vitamina D, citoquinas), agentes hormonales, agentes inmunológicos y agentes anti-angiogénicos. Los agentes quimioterapéuticos y citotóxicos incluyen, pero no están limitados a, agentes alquilantes, antibióticos citotóxicos, antimetabolitos, alcaloides de vinca, etopósidos, y otros (p. ej., paclitaxel, taxol, docetaxel, taxotere, cisplatino). Una lista de compuestos adicionales que tienen actividad antiproliferativa puede encontrarse en L. Brunton, B. Chabner y B. Knollman (eds). Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Duodécima Edición, 2011, McGraw Hill Companies, Nueva York, NY.
El método puede incluir además administrar un compuesto antiproliferativo seleccionado del grupo que consiste en agentes alquilantes, agentes de platino, antimetabolitos, inhibidores de topoisomerasa, antibióticos antitumorales, agentes antimitóticos, inhibidores de aromatasa, inhibidores de la timidilato sintasa, antagonistas de ADN, inhibidores de farnesiltransferasa, inhibidores de bombas, inhibidores de histona acetiltransferasa, inhibidores de metaloproteinasa, inhibidores de ribonucleósido reductasa, agonistas/antagonistas de TNF alfa, antagonista del receptor de endotelina A, agonistas del receptor del ácido retinoico, inmunomoduladores, agentes hormonales y antihormonales, agentes fotodinámicos, inhibidores de tirosina quinasa, compuestos antisentido, corticosteroides, inhibidores de HSP90, inhibidores de proteosoma (por ejemplo, NPI-0052), inhibidores de CD40, anticuerpos anti-CSI, inhibidores de FGFR3, inhibidores de VEGF, inhibidores de MEK, inhibidores de ciclina D1, inhibidores de NF-kB, antraciclinas, histona desacetilasas, inhibidores de quinesina, inhibidores de fosfatasa, inhibidores de COX2, inhibidores de mTOR, antagonistas de calcineurina, IMiD, u otros agentes usados para tratar enfermedades proliferativas. Los ejemplos de dichos compuestos se proporcionan en las Tablas 1.
Esta descripción también presenta un método para tratar melanoma (p. ej., melanoma metastásico) en un sujeto que lo necesita. El método incluye (a) incrementar en el sujeto el nivel de expresión o el nivel de actividad de un factor supresor de metástasis seleccionado del grupo que consiste en DNAJA4, Apolipoproteína E (ApoE), LRP1, LRP8, Receptor X Hepático (LXR, p. ej., tanto LXR-alfa como LXR-beta), y miR-7 o (b) disminuir en el sujeto el nivel de expresión o el nivel de actividad de un factor promotor de metástasis seleccionado del grupo que consiste en miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, y CTGF.
En el método, la etapa de incremento puede llevarse a cabo mediante la administración al sujeto de uno o más de los siguientes: (i) un polipéptido que tiene una secuencia de DNAJA4, ApoE o un fragmento de ApoE, LRP1, LRP8, o LXR; (ii) un ácido nucleico que tiene una secuencia que codifica DNAJA4, ApoE, LRP1, LRP8, o LXR; (iii) un ligando para LRP1, LRP8, o LXR; y (iv) un agente ARNi que codifica miR-7. Los ejemplos del ligando de LRP1 o LRP8 incluyen la parte de unión al receptor de ApoE, anticuerpos anti-LRP1 o anti-LRP8, y ligandos que son moléculas pequeñas. En un ejemplo, el incremento del nivel de expresión de ApoE puede llevarse a cabo mediante el incremento del nivel de actividad o el nivel de expresión de LXR. El incremento del nivel de expresión de DNAJA4 también puede llevarse a cabo mediante el incremento del nivel de actividad o el nivel de expresión de LXR. El nivel de actividad de LXR puede incrementarse mediante la administración al sujeto de un ligando de LXR, tales como los compuestos de Fórmula I-IV como se describe más adelante. La etapa de incremento también puede llevarse a cabo mediante la disminución del nivel de expresión o el nivel de actividad de un microARN seleccionado del grupo que consiste en miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908. Para este fin, se pueden usar varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, la tecnología miR-Zip, Ácido Nucleico Bloqueado (LNA), y tecnología antagomir como se describe en los ejemplos más adelante.
Esta descripción también proporciona un método para determinar si un sujeto tiene, o está en riesgo de tener, melanoma metastásico. El método incluye obtener del sujeto una muestra; medir en la muestra (i) un primer nivel de expresión de un factor promotor de metástasis seleccionado del grupo que consiste en miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, y CTGF, o (ii) un segundo nivel de expresión de un factor supresor de metástasis seleccionado del grupo que consiste en DNAJA4, ApoE, LRP1, LRP8, LXR, y miR-7; y comparar el primer nivel de expresión con un primer valor de referencia predeterminado, o el segundo nivel de expresión con un segundo valor de referencia predeterminado. Se determina que el sujeto tiene, o que está en riesgo de tener, melanoma metastásico si (a) el primer nivel de expresión está por encima de un primer valor de referencia predeterminado o (b) el segundo nivel de expresión está por debajo de un segundo valor de referencia predeterminado. El primer y segundo valores de referencia predeterminados pueden obtenerse a partir de un sujeto control que no tiene melanoma metastásico. En una realización, la etapa de medición incluye medir tanto el primer nivel de expresión como el segundo nivel de expresión. La muestra puede ser una muestra de fluido corporal, una muestra de tumor, una muestra de nevo, o una muestra de piel humana.
Esta descripción también proporciona una matriz que tiene un soporte que tiene una pluralidad de localizaciones únicas, y cualquier combinación de (i) al menos un ácido nucleico que tiene una secuencia que es complementaria a un ácido nucleico que codifica un factor promotor de metástasis seleccionado del grupo que consiste en miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, y CTGF o un complemento del mismo, o (ii) al menos un ácido nucleico que tiene una secuencia que es complementaria a un ácido nucleico que codifica un factor supresor de metástasis seleccionado del grupo que consiste en DNAJA4, ApoE, LRP1, LRP8, LXR, y miR-7 o un complemento del mismo. Preferiblemente, cada ácido nucleico se inmoviliza en una localización única del soporte. Esta matriz puede usarse para el diagnóstico y pronóstico del melanoma metastásico.
De acuerdo con esto, la descripción también proporciona un kit para el diagnóstico de un potencial metastásico de melanoma en un sujeto. El kit incluye un primer reactivo que se une específicamente a un producto de expresión de un gen supresor de metástasis seleccionado del grupo que consiste en DNAJA4, ApoE, LRP1, LRP8, LXR, y miR-7; o un segundo reactivo que se une específicamente a un producto de expresión de un gen promotor de metástasis seleccionado del grupo que consiste en miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, y CTGF. El segundo agente puede ser una sonda que tiene una secuencia complementaria al gen supresor o promotor o un complemento del mismo. El kit puede contener además reactivos para realizar un inmunoensayo, ensayo de hibridación, o un ensayo de PCR. En una realización, el kit contenía la matriz mencionada anteriormente.
Esta descripción también proporciona un método para identificar un compuesto útil para tratar melanoma o para inhibir el reclutamiento endotelial, invasión celular, o angiogénesis metastásica. El método incluye (i) obtener una célula de ensayo que expresa un gen informador codificado por un ácido nucleico unido de forma operativa a un promotor de un gen marcador seleccionado del grupo que consiste en miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, y CTGF; (ii) exponer la célula de ensayo a un compuesto de ensayo; (iii) medir el nivel de expresión del gen informador en la célula de ensayo; (iv) comparar el nivel de expresión con un nivel control; y (v) seleccionar el compuesto de ensayo como un candidato útil para tratar melanoma o para inhibir el reclutamiento endotelial, invasión de células cancerosas, o angiogénesis metastásica, si la comparación indica que el nivel de expresión es menor que el nivel control.
La descripción proporciona otro método para identificar un compuesto útil para tratar melanoma o para inhibir el reclutamiento endotelial, invasión celular, o angiogénesis metastásica. El método incluye (i) obtener una célula de ensayo que expresa un gen informador codificado por un ácido nucleico unido de forma operativa a un promotor de un gen marcador seleccionado del grupo que consiste en DNAJA4, ApoE, LRP1, LRP8, LXR, y miR-7; (ii) exponer la célula de ensayo a un compuesto de ensayo; (iii) medir el nivel de expresión del gen informador en la célula de ensayo; (iv) comparar el nivel de expresión con un nivel control; y (v) seleccionar el compuesto de ensayo como un candidato útil para tratar melanoma o para inhibir el reclutamiento endotelial, invasión de células cancerosas, o angiogénesis metastásica, si la comparación indica que el nivel de expresión es mayor que el nivel control.
En los métodos de identificación mencionados anteriormente, el gen informador puede ser un gen informador estándar (tal como gen de LaxZ, GFP, o luciferasa, o semejantes), conocido en la técnica, o uno de los genes supresores de metástasis o genes promotores de metástasis mencionados anteriormente. En los métodos, el nivel control puede obtenerse a partir de una célula control que es la misma que la célula de ensayo excepto porque la célula control no se ha expuesto al compuesto de ensayo.
Esta descripción también proporciona un método para inhibir el reclutamiento endotelial, inhibir la invasión de células tumorales, o tratar cáncer metastásico en un sujeto que lo necesita, mediante la administración al sujeto de un agente que inhibe la expresión o actividad de CTGF. El sujeto puede ser uno que tiene un trastorno caracterizado por angiogénesis patológica, incluyendo, pero no limitado a, cáncer (p. ej., melanoma metastásico), un trastorno ocular, y un trastorno inflamatorio. Un ejemplo de la célula tumoral es una célula de melanoma metastásico. Los ejemplos del agente incluyen un anticuerpo, un ácido nucleico, un polipéptido, y un compuesto que es una molécula pequeña. En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
Esta descripción también proporciona un método para inhibir el reclutamiento endotelial, inhibir la invasión de células tumorales, o tratar cáncer metastásico en un sujeto que lo necesita, mediante la administración al sujeto de un agente que incrementa la expresión o actividad de miR-7. Un ejemplo de la célula tumoral es una célula de melanoma metastásico. Los ejemplos del agente incluyen un anticuerpo, un ácido nucleico, un polipéptido, y un compuesto que es una molécula pequeña. En un ejemplo, el agente tiene actividad miR-7. El ácido nucleico puede ser un oligonucleótido. Y, el oligonucleótido puede incluir una secuencia seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID No. 36-38.
Tal y como se usa en la presente memoria, "cáncer migratorio" se refiere a un cáncer en el que las células cancerosas que forman el tumor migran y posteriormente crecen como implantes malignos en un sitio distinto al sitio del tumor original. Las células cancerosas migran a través de la siembra de la superficie de los espacios peritoneal, pleural, pericárdico, o subaracnoideo para diseminarse en las cavidades corporales; mediante la invasión del sistema linfático a través de la invasión de células linfáticas y transporte a nódulos linfáticos regionales y distantes y después a otras partes del cuerpo; mediante la diseminación hematógena a través de la invasión de células sanguíneas; o a través de la invasión del tejido circundante. Los cánceres migratorios incluyen tumores metastásicos y cánceres con migración celular, tales como cáncer de ovario, mesotelioma, y cáncer de pulmón primario, cada uno de los cuales se caracteriza por la migración celular.
Tal y como se usa en la presente memoria, "ralentizar la diseminación de cáncer migratorio" se refiere a reducir o parar la formación de nuevos loci; o reducir, parar, o revertir la carga tumoral.
Tal y como se usa en la presente memoria, "tumor metastásico" se refiere a un tumor o cáncer en el que las células cancerosas que forman el tumor tienen un alto potencial para o han empezado a, metastatizar, o diseminarse desde una localización a otra localización o localizaciones en un sujeto, a través del sistema linfático o a través de una diseminación hematógena, por ejemplo, creando tumores secundarios en el sujeto. Dicho comportamiento metastásico puede ser indicativo de tumores malignos. En algunos casos, el comportamiento metastásico puede estar asociado con un incremento en la migración celular y/o comportamiento invasivo de las células tumorales.
Tal y como se usa en la presente memoria, "ralentizar la diseminación de metástasis" se refiere a reducir o parar la formación de nuevos loci; o reducir, parar, revertir la carga tumoral.
El término "cáncer" se refiere a cualquier cáncer causado por la proliferación de células neoplásicas malignas, tales como tumores, neoplasmas, carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas, y semejantes.
Tal y como se usa en la presente memoria, "cáncer resistente a fármacos" se refiere a cualquier cáncer que es resistente a un antiproliferativo de la Tabla 2.
Los ejemplos de cánceres que pueden definirse como metastásicos incluyen, pero no están limitados a, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro incluyendo glioblastomas y meduloblastomas, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer gástrico, neoplasmas hematológicos, mieloma múltiple, leucemia, neoplasmas intraepiteliales, cáncer de hígado, linfomas, neuroblastomas, cáncer oral, cáncer pancreático, cáncer de próstata, sarcoma, cáncer de piel incluyendo melanoma, cáncer basocelular, cáncer de células escamosas, cáncer testicular, tumores estromales, tumores de células germinales, cáncer de tiroides, y cáncer renal.
"Proliferación", tal y como se usa en esta solicitud, implica la reproducción o multiplicación de formas similares (células) debido a elementos constituyentes (celulares).
"Migración celular", tal y como se usa en esta solicitud, implica la invasión por las células cancerosas en el tejido circundante y el cruce de la pared del vaso para salir de la vasculatura a órganos distales de la célula cancerosa.
Por "cánceres con migración celular" se quiere decir cánceres que migran por la invasión por las células cancerosas en el tejido circundante y el cruce de la pared del vaso para salir de la vasculatura a órganos distales de la célula cancerosa.
"Cáncer con migración celular no metastásico", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cánceres que no migran a través del sistema linfático o a través de la diseminación hematógena.
Tal y como se usa en la presente memoria, "adhesión célula a célula" se refiere a la adhesión entre al menos dos células a través de una interacción entre una molécula de selectina y un ligando específico de selectina. La adhesión célula a célula incluye la migración celular.
Un "trastorno relacionado con la adhesión celular" se define en la presente memoria como cualquier enfermedad o trastorno que resulta de o está relacionado con la adhesión célula a célula o la migración. Un trastorno de adhesión celular también incluye cualquier enfermedad o trastorno que resulta de la activación inapropiada, aberrante, o anormal del sistema inmune o del sistema inflamatorio. Dichas enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, infarto de miocardio, infección bacteriana o viral, afecciones metastásicas, p. ej., cáncer. La descripción presenta además métodos para tratar un trastorno de adhesión celular mediante la administración de un agonista de LXR o polipéptido ApoE.
Tal y como se usa en la presente memoria, "células madre del cáncer" o "células iniciadoras del cáncer" se refiere a células cancerosas que poseen características asociadas con células madre normales, específicamente la capacidad de dar lugar a todos los tipos celulares encontrados en una muestra de cáncer particular. Las células madre del cáncer son, por lo tanto, tumorogénicas o formadoras de tumores, quizá a diferencia de otras células cancerosas no tumorogénicas. Las células madre del cáncer pueden persistir en los tumores como una población distinta y causar la recurrencia y metástasis del cáncer dando lugar a nuevos tumores.
Tal y como se usa en la presente memoria, "siembra tumoral" se refiere al escape de agrupaciones de células tumorales y su crecimiento posterior como implantes malignos en un sitio distinto del sitio del tumor original.
Tal y como se usa en la presente memoria, "nódulo metastásico" se refiere a una agregación de células tumorales en el cuerpo en un sitio distinto del sitio del tumor original.
Los detalles de una o más realizaciones de la descripción se muestran en la descripción más adelante. Otras características, objetos, y ventajas de la descripción serán evidentes a partir de la descripción y a partir de las reivindicaciones.
Descripción breve de los dibujos
Figura 1. Identificación sistemática de miR-1908, miR-199a-3p, y miR-199a-5p como promotores endógenos de metástasis de melanoma humano (A) Mapa de calor que ilustra los valores de expresión de micromatrices normalizados por varianza de miARN regulados al alza en derivados metastásicos MeWo y A375 independientes respecto a sus células parentales respectivas. Los cambios en la desviación estándar desde la media de cada fila del mapa de calor se indican por el mapa de color. (B) Los miARN que se ha encontrado que están regulados al alza por hibridación en micromatriz se validaron por qRT-PCR en derivados metastásicos MeWo-LM2. n=3. (C) Representación de la imaginería bioluminiscente de la colonización metastásica de pulmón después de la inyección intravenosa de 4 x 104 células MeWo parentales que sobreexpresan los precursores para miR-199a, miR-1908, miR-214, o una horquilla control. Los pulmones se extrajeron 63 días después de la inyección y se tiñeron con H y E. n=5. (D) Representación de la imaginería bioluminiscente y pulmones teñidos con H y E correspondientes a metástasis pulmonares después de la inyección intravenosa de 4 x 104 células LM2 que expresan una horquilla corta (miR-Zip) que inhibe miR-1908 (m1908 KD), miR-199a-3p (m199a3p KD), miR-199a-5p (m199a5p KD), o una secuencia control (CTRLsh). Los pulmones se extrajeron y se tiñeron con H y E 49 días después de la inyección n=5-8. (E) La colonización pulmonar por 2 x 105 derivados metastásicos A375-LM3 con silenciamiento inducido por miR-Zip de miR-1908, miR-199a-3p, miR-199a-5p, o una secuencia control se cuantificó en el día 42 por imaginería bioluminiscente. n=5-8 (F) Los niveles de expresión de miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 se determinaron de una manera ciega por qRT-PCR en una cohorte de lesiones cutáneas de melanoma primario no metastásicas (n=38) y metastásicas (n=33) de pacientes del MSKCC. n=71. Todos los datos se representan como media ± SEM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Véase también la Figura 12.
Figura 2. MiR-1908, miR-199a-3p, y miR-199a-5p presentan papeles duales autónomos de células/no autónomos de células en la regulación de la progresión metastásica de melanoma (A) Se inyectaron subcutáneamente 1 x 106 células MeWo parentales que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control en ratones inmunodeficientes, y se monitorizó el volumen tumoral primario con el tiempo. n=4-6. (B) Se dejó que 1 x 105 células MeWo parentales que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control invadieran a través de un inserto recubierto con matrigel trans-well durante 24 horas, y se cuantificó el número de células invasoras en el lado basal de cada inserto. n=7. (C­ D) Se sometieron 1 x 105 células MeWo-LM2 (C) y A375-LM3 (D) altamente metastásicas con inhibición inducida por miR-Zip de miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, o una secuencia control al ensayo de invasión celular. n=6-8. (E) Se sembraron 5 x 104 células MeWo que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control en el fondo de un pocillo, y se dejó que 1 x 105 células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) migraran hacia las células cancerosas durante 16 horas a través de un inserto trans-well. Se midió la capacidad de reclutamiento endotelial cuantificando el número de HUVEC que migraron al lado basal de cada inserto. n=7. (F-G) Reclutamiento endotelial por 5 x 104 células MeWo-LM2 (F) y A375-LM3 (G) inhibido para miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, o una secuencia control. n=6-10. (H) Representación de la fracción acumulativa del porcentaje de la distribución de la densidad de vasos sanguíneos para nódulos metastásicos formados después de la inyección intravenosa de 2 x 105 células MeWo-LM2 altamente metastásicas deplecionadas de miR-199-3p, miR-199a-5p, miR-1908, o una secuencia control. Las secciones de pulmón se tiñeron doblemente inmunohistoquímicamente para vimentina humana (azul) y MECA-32 (rojo), y se cuantificó el porcentaje de área positiva para MECA-32 en cada nódulo metastásico, demarcada sobre la base de la tinción con vimentina. n=211 nódulos (KD control); n=60 nódulos (KD m199a3p); n=138 nódulos (KD m199a5p); n=39 nódulos (KD m1908). Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 100 |jm. Véase también la Figura 13.
Figura 3. Identificación de ApoE y DNAJA4 como genes diana comunes de miR-199a y miR-1908 (A) Mapa de calor que representa los niveles de ARNm de ApoE y DNAJA4, medidos por qRT-PCR, en células MeWo poco metastásicas que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control y en células MeWo-LM2 altamente metastásicas. El mapa de color ilustra los cambios en la desviación estándar desde la media de cada columna de mapa de calor. (B) Ensayos del informador luciferasa heterólogo que miden la estabilidad de fusiones de 3'UTR/CDS de ApoE y DNAJA4 de tipo salvaje con luciferasa o fusiones de 3'UTR/CDS de ApoE y DNAJA4 mutante del sitio diana de miARN en células MeWo parentales que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control. n=3-4. (C) Estabilidad de las fusiones de 3'UTR/CDS de ApoE y DNAJA4 de tipo salvaje con luciferasa en células MeWo-LM2 con expresión silenciada de miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, o una secuencia control. n=4. (D) Esquema del modelo derivado experimentalmente de 3'UTR/CDS de ApoE y DNAJA4 diana de miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908. (E) Actividad luciferasa de fusiones de 3'UTR/CDS de ApoE y DNAJA4 de tipo salvaje con luciferasa y mutante del sitio diana de miARN en derivados MeWo-LM2 altamente metastásicos y su línea celular parental poco metastásica. n=4. (F) Capacidad de invasión en matrigel por 1 x 105 células MeWo-LM2 que expresan un vector control o que sobreexpresan ApoE o DNAJA4. n=4. (G) Capacidad de reclutamiento endotelial por 5 x 104 células MeWo-LM2 transducidas con un vector control o un vector con sobreexpresión para ApoE o DNAJA4. n=6. (H-I) Se evaluaron células MeWo parentales poco metastásicas transducidas con horquillas cortas lentivirales dirigidas a ApoE, DNAJA4, o una secuencia control para determinar su capacidad de invasión de matrigel (H) y su capacidad de reclutar células endoteliales (I). n=6-8. Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 100 jm . Véase también la Figura 14.
Figura 4. La toma como diana directa de ApoE y DNAJA4 por miR-199a y miR-1908 promueve la invasión metastásica, reclutamiento endotelial, y colonización (A-D) Se sometieron células LM2 altamente metastásicas que expresan un ARNsh control o ARNsh dirigidos a ApoE o DNAJA4 en el contexto de la inhibición de miR-1908 (KD m1908; A, B) o inhibición de miR-199a-5p (KD m199a5p; C, D) a ensayos de invasión celular (A, C) y reclutamiento endotelial (B, D).
n=6-8. (E-F) Representación de imaginería bioluminiscente y tinción con H y E de pulmones representativos de metástasis pulmonar después de la inyección intravenosa de 1 x 105 células LM2 que expresan una horquilla control u horquillas dirigidas a ApoE, DNAJA4, o una secuencia control en el entorno del silenciamiento de miR-1908 (E) o silenciamiento de miR-199a-5p (F). n=5. (G-H) Se analizaron células MeWo parentales que sobreexpresan ApoE o DNAJA4 o que expresan un vector control en el contexto de la sobreexpresión de miR-1908 para determinar los fenotipos de invasión de matrigel (G) y reclutamiento endotelial (H). (I-J) Se transdujeron derivados A375-LM3 que expresan un ARNsh control o ARNsh dirigidos a ApoE y DNAJA4 con una mezcla de LNA dirigidos a miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 o un LNA control y se analizaron en los ensayos de invasión de matrigel (I) y reclutamiento endotelial (J). n=4. (K) Distribución de la densidad de los vasos sanguíneos, representada en un gráfico de fracción acumulativa, para nódulos metastásicos formados por células MeWo-LM2 inhibidas para miR-1908 y transducidas con ARNsh dirigidos a ApoE, DNAJA4, o una secuencia control. Las secciones pulmonares de la Figura 4E se tiñeron doblemente inmunocitoquímicamente para vimentina humana (azul) y el marcador endotelial MECA-32 (rojo). Se cuantificó el porcentaje de área positiva para MECA-32 en cada nódulo positivo para vimentina. n=39 nódulos (CTRLsh); n=97 (APOEsh1); n=38 (APOEsh2); n=200 (DNAJA4sh1); n=19 (DNAJA4sh2). Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 100 pm. Véase también la Figura 15.
Figura 5. La ApoE secretada por células de melanoma inhibe la invasión de melanoma y el reclutamiento endotelial, mientras la deleción genética de ApoE acelera la metástasis (A-B) Niveles de ApoE extracelular cuantificados por ELISA en medio condicionado de derivados MeWo-LM2 metastásicos y sus células parentales (A) y células LM2 silenciadas para miR-199a-5p, miR-1908, o una secuencia control (B). n=3. (C) Se añadió anticuerpo neutralizante de ApoE 1D7 (10-40 pg/mL) o IgG (40 pg/mL) al medio celular, y se evaluó la invasión de matrigel por las células MeWo parentales. n=4-6. (D) Reclutamiento endotelial por células MeWo parentales en presencia de 1D7 (40 pg/mL) o un anticuerpo IgG control (40 pg/mL). n=4. (E) Los fenotipos de invasión de matrigel y reclutamiento endotelial se evaluaron en células LM2 en presencia de albúmina de suero bovino (BSA) (100 pM) o ApoE3 recombinante (100 pM) añadidos al medio celular. n=7-10. (F-G) Se examinaron células LM2 con expresión silenciada de miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, o una secuencia control para determinar su capacidad de invasión de matrigel (F) y capacidad de reclutamiento endotelial (G) en presencia de anticuerpos IgG o neutralizante de ApoE 1D7 (40 pg/mL). n=5-6. (H) Niveles de ApoE cuantificados por ELISA en medio condicionado de células MeWo parentales transducidas con ARNsh dirigidos a DNAJA4 o una secuencia control. n=3. (I-J) Se analizaron células MeWo parentales con silenciamiento inducido por ARNsh de DNAJA4 para determinar los fenotipos de invasión de matrigel (I) y reclutamiento endotelial (J) en presencia bien de BSA (100 pM) o ApoE3 recombinante (100 pM). n=4. (K) Niveles de expresión de ApoE basados en matriz en muestras de nevi (n=9), melanomas primarios (n=6), y metástasis de melanoma distantes (n=19). (L) Se incubaron células MeWo-LM2 altamente metastásicas en presencia de ApoE3 recombinante o BSA a 100 pg/mL. Después de 24 horas, se inyectaron intravenosamente 4 x 104 células en ratones NOD-SCID, y se monitorizó la colonización pulmonar por imaginería bioluminiscente. n=6. (M) Metástasis pulmonares por 5 x 104 células de melanoma de ratón B16F10 inyectadas intravenosamente en ratones C57BL/6 con anulación genética de ApoE o sus compañeros de camada control de tipo salvaje. La cuantificación de la bioluminiscencia pulmonar y los pulmones teñidos con H y E representativos corresponden a 19 días después de la inyección. n=8-18. Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 100 pm.
Figura 6. Identificación de receptores de células de melanoma y endoteliales distintos que median los efectos de ApoE en la invasión y el reclutamiento endotelial del melanoma (A) Se examinó la capacidad de invasión de matrigel en 1 x 105 células LM2 transducidas con ARNsi dirigidos a LDLR, VLDLR, LRP8, LRP1, o una secuencia control en presencia bien de BSA (100 pM) o ApoE3 recombinante (100 pM). n=4-7. (B) Se transfectaron 1 x 105 células MeWo-LM2 transducidas con horquillas cortas dirigidas a miR-1908 o una secuencia control con ARNsi dirigidos a LRP1 o un ARNsi control y se sometieron al ensayo de invasión de matrigel. n=4. (C) Imaginería bioluminiscente de colonización pulmonar por 1 x 105 células LM2 transducidas con ARNsi dirigidos a LRP1 o una secuencia control en el entorno de la inhibición de miR-1908. n=5. (D) Se analizaron 1 x 105 células endoteliales preincubadas con BSA (100 pM) o ApoE3 recombinante (100 pM) durante 24 horas para determinar el fenotipo de reclutamiento endotelial por 5 x 105 células LM2. n=3-4. (E) Se transdujeron 1 x 105 células endoteliales con ARNsi dirigidos a LDLR, VLDLR, Lr P1, LRP8, o una secuencia control y se dejó que migraran en un sistema trans-well hacia células LM2 inhibidas para miR-1908 o una secuencia control. n=4-12. (F) Migración trans-well por 1 x 105 células endoteliales en presencia de anticuerpos IgG (40 pg/mL) o 1D7 (40 pg/mL) añadidos al medio celular. n=6-8. (G) Migración trans-well por 1 x 105 células endoteliales transducidas con ARNsi dirigidos a LRP8 o una secuencia control en presencia de BSA (100 pM) o ApoE3 recombinante (100 pM). n=6-7. (H) Se transdujeron 1 x 105 células endoteliales con ARNsi dirigidos a LRP8 o una secuencia control, y se evaluó la migración quimiotáctica trans-well a lo largo de un gradiente de ApoE. n=6-8. (I) Reclutamiento endotelial en tapones de matrigel, implantados subcutáneamente por encima del flanco ventral de ratones, que contenían BSA (10 pg/mL), VEGF (400 ng/mL) BSA (10 pg/mL), o VEGF (400 ng/mL) ApoE3 recombinante (10 pg/mL). n=3-6. (J) Densidad de los vasos sanguíneos en nódulos metastásicos pulmonares formados después de la inyección intravenosa de 5 x 104 células de melanoma de ratón B16F10 en ratones de tipo salvaje o anulados genéticamente para ApoE. Las secciones pulmonares de la Figura 5M se tiñeron inmunohistoquímicamente para MECA-32, y se cuantificó el porcentaje del área positiva para MECA- 32 en cada nódulo metastásico, indicado sobre la base de la pigmentación celular. n= 17-20. Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 100 pm.
Figura 7. Cooperatividad clínica y terapéutica entre miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 en metástasis de melanoma (A-D). Curvas de Kaplan-Meier para la cohorte de MSKCC (N=71) que representa la supervivencia sin metástasis de pacientes como una función de sus niveles de expresión de miR-199a-3p (A), miR-199a-5p (B), miR-1908 (C), o agregado de tres miARN de lesiones de melanoma primario (D). Los pacientes cuyos niveles de expresión de miARN o expresión de miARN agregado (suma de los valores de expresión de miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908) en los tumores primarios fueron mayores de la mediana para la población se clasificaron como positivos para la expresión de miARN (rojo), mientras aquellos cuyos tumores primarios expresaban los miARN dados a un nivel por debajo de la mediana se clasificaron como negativos para la expresión de miARN (azul). (E) Metástasis pulmonares por células LM2 altamente metastásicas transfectadas con LNA dirigidos individualmente a cada miR-1908, miR-199a-3p, o miR-199a-5p, una combinación de LNA dirigida a todos los tres miARN, o un LNA control. 48 horas después de la transfección, se inyectaron intravenosamente 1 x 105 células en ratones inmunodeficientes. n=5-6. (F) Metástasis sistémicas por 1 x 105 células MeWo-LM2 transfectadas con un LNA control (LNA-CTRL) o una mezcla de LNA dirigida a miR-1908, miR-199a-3p, miR-199a-5p (miARN LNA-3) 48 horas antes de la inyección intracardiaca en ratones desnudos atímicos. n=5. (G) Número de foci metastásicos sistémicos que surgen de células LM2 con miARN de LNA-CTRL y LNA-3 en el día 28 después de la inyección intracardiaca. n=5. (H-I) Cuantificación de la señal de bioluminiscencia de metástasis óseas (H) y metástasis cerebrales (I) en el día 28 después de la inyección intracardiaca de células LM2 con miARN de LNA-c Tr L y LNA-3. n=5. (J) Se inyectaron en la vena de la cola 4 x 104 células MeWo-LM2 altamente metastásicas en ratones inmunocomprometidos, y los ratones se trataron intravenosamente con una mezcla de LNA optimizados in vivo dirigidos a miR-1908, miR-199a-3p, y miR-199a-5p a una dosis total de 12,5 mg/kg o un control de PBS simulado en una base bisemanal durante cuatro semanas. La colonización pulmonar se evaluó por imaginería bioluminiscente, y se muestran los pulmones teñidos con H y E representativos extraídos en el día 56. n=5-6. (K) Modelo de regulación dependiente de miARN de invasión metastásica, reclutamiento endotelial, y colonización en melanoma a través del direccionamiento de la señalización del receptor LRP1 de células de melanoma y LRP8 de células endoteliales mediada por ApoE.
Figura 8. La toma como diana de la señalización de ApoE/LRP1 dependiente de miARN promueve la invasión de células cancerosas y el reclutamiento endotelial a través de la inducción de CTGF. (A) Un mapa de calor de los niveles de expresión de CTGF normalizado por varianza, determinado por análisis por qRT-PCR, en (1) células MeWo parentales y células MeWo-LM2, (2) células MeWo parentales que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control, y (3) células MeWo parentales transducidas con horquillas cortas dirigidas a ApoE o una secuencia control. El mapa de color indica el cambio de las desviaciones estándar de la media. (B) Niveles de CTGF en medio condicionado de células MeWo parentales con inactivación de ApoE determinados por ELISA. n=6; valores p basados en un ensayo de la t de student de una vía. (C) Niveles de CTGF, cuantificados por ELISA, en medio condicionado de células MeWo-LM2 altamente metastásicas tratadas con ApoE recombinante en el entorno de inactivación de LRP1 o un control de inactivación. n=3-4; valores p basados en un ensayo de la t de student de una vía. (D-E) Las células MeWo parentales con inactivación de ApoE inducida por ARNsh se (1) transfectaron con ARNsi independientes dirigidos a CTGF o una secuencia control o (2) incubaron en presencia de un anticuerpo neutralizante de CTGF (20 |jg/mL) o un anticuerpo IgG control (20 jg/mL), y las células se sometieron a ensayos de invasión celular (D) y reclutamiento endotelial (E). n=6-8; valores p basados en un ensayo de la t de student de una vía; la barra de escala indica 100 jM . Todos los datos se representan como media SEM.
Figura 9. CTGF media la invasión metastásica, reclutamiento endotelial, y colonización dependiente de miARN. (A) Se sometieron 1 x 105 células MeWo parentales que expresan una horquilla control o que sobreexpresan miR-199a o miR-1908 a un ensayo de invasión celular trans-well en presencia de un anticuerpo bloqueante dirigido a CTGF (20 jg/mL) o un anticuerpo IgG control (20 jg/mL) como se indica en la figura. n=4-10; valores p basados en un ensayo de la t de student de una vía. Todos los datos se representan como media ± SEM. (B) Reclutamiento endotelial por células MeWo parentales que expresan una horquilla control o que sobreexpresan miR-199a o miR-1908. Al comienzo del ensayo, se añadieron un anticuerpo neutralizante dirigido a CTGF (20 jg/mL) o un anticuerpo IgG control (20 jg/mL) a las células endoteliales como se indica, y se dejó que 1 x 105 células endoteliales migraran hacia 5 x 104 células cancerosas en un ensayo de migración trans-well. n=3-8; valores p basados en un ensayo de la t de student de una vía. (C) Imaginería bioluminiscente de metástasis pulmonares por 5 x 104 células MeWo parentales inactivadas para CTGF en el entorno de sobreexpresión de miR-199a o miR-1908. n=5-6; valores p obtenidos usando un ensayo de la t de Mann-Whitney de una vía. Todos los datos se representan como media ± SEM.
Figura 10. El tratamiento con el agonista de LXR GW3965 eleva los niveles de ApoE de las células de melanoma y suprime la invasión de células cancerosas, el reclutamiento endotelial, y la colonización metastásica. (A-B) Se incubaron células MeWo parentales en presencia de DMSO o GW3965 a las concentraciones indicadas. Después de 48 horas, se extrajo el a Rn total, y se determinaron los niveles de ApoE (A) y DNAJA4 (B) por qRT-PCR. n=3. (C) Invasión celular por 1 x 105 células MeWo parentales pretratadas con GW3965 o DMSO durante 48 horas. n=6-7. valores p basados en un ensayo de la t de student de una vía. Todos los datos se representan como media ± SEM. (D) Reclutamiento endotelial por 5 x 104 células MeWo parentales pretratadas con GW3965 o DMSO durante 48 horas. n=6-7. valores p basados en un ensayo de la t de student de una vía. (E) Los ratones se alimentaron con dieta de pienso basado en grano que contenía GW3965 (20mg/kg) o una dieta control. Después de 10 días, se inyectaron 4 x 104 células MeWo parentales en la vena de la cola en ratones, y los ratones se alimentaron continuamente con pienso que contenía GW3965 o una dieta control durante todo el experimento. Se evaluó la colonización pulmonar por imaginería bioluminiscente. n=5-6; valores p obtenidos usando un ensayo de la t de Mann-Whitney de una vía Todos los datos se representan como media ± SEM.
Figura 11. Identificación de miR-7 como un supresor endógeno de metástasis de melanoma. (A) Gráfico de imaginería bioluminiscente de colonización metastásica pulmonar después de la inyección intravenosa de 4 x 104 células MeWo parentales que expresan una horquilla corta (miR-Zip) que inhibe miR-7 (miR-7 KD). Los pulmones se extrajeron 63 días después de la inyección y se tiñeron con H y E. n=5. (B). Metástasis pulmonar por 4 x 104 células LM2 que sobreexpresan el precursor para miR-7 o una horquilla control. La colonización pulmonar se monitorizó semanalmente por imaginería bioluminiscente, y los pulmones se extrajeron en el día 77 después de la inyección. n=5. Todos los datos se representan como media ± SEM; los valores p se determinaron usando un ensayo de la t de Mann-Whitney de una vía. *p<0.05, **p<0.01.
Figura 12. Selección in vivo de derivados de líneas celulares de melanoma humano altamente metastásicas e identificación de miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 como miARN promotores de metástasis (A-B) Imaginería bioluminiscente de metástasis pulmonares e imágenes representativas de pulmones teñidos con H y E correspondientes a derivados metastásicos MeWo-LM2 (A) y A375-LM3 (B) y sus líneas celulares parentales representativas. Se inyectaron intravenosamente 4 x 104 células MeWo-Par/MeWo-LM2 y 1 x 105 células A375-Par/A375-LM3 en ratones NOD-SCID, y se extrajeron los pulmones y se tiñeron con H y E en el día 72 y día 49, respectivamente. n=4-5. (C) Se determinaron los niveles de expresión de miR-199a-5p, miR-199a-3p, miR-1908, y miR-214 por qRT-PCR en derivados metastásicos A375-LM3 y sus células parentales. n=3. (D) Se transdujeron células MeWo parentales con retrovirus que expresan una horquilla control o una construcción de horquilla de pre-miARN dando lugar a miR-199a (ambos miR-199a-3p y miR-199a-5p), miR-1908, o miR-214. Se determinaron los niveles de expresión de los miARN diana por qRT-PCR. n=3. (E) Se analizaron secciones de pulmón teñidas con H y E de la Figura 1C para determinar el número de nódulos metastásicos que resultan de células MeWo parentales que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control. n=3. (F) Se analizó el número de nódulos metastásicos formados por células LM2 con expresión silenciada de miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, o una secuencia control en secciones de pulmones teñidas con H y E de la Figura 1D. n=3. Todos los datos se representan como media ± SEM.
Figura 13. MiR-199a y miR-1908 inhiben la proliferación in vitro y promueven selectivamente la invasión celular y el reclutamiento endotelial (A) Se sembraron 2,5 x 104 células MeWo que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control en triplicado, y se contaron las células viables después de 5 días. n=3. (B) Se compararon 1 x 105 células MeWo parentales poco metastásicas y células LM2 altamente metastásicas para determinar su capacidad de invadir a través de matrigel en un ensayo trans-well. n=3-4. (C) Se sembraron 1 x 105 células endoteliales en una placa de 6 pocillos y se dejó que formaran una monocapa. Se sembraron 2 x 105 células MeWo parentales que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control en la parte superior de la monocapa endotelial y se incubó durante 30 minutos. Cada monocapa se sometió posteriormente a imaginería, y se cuantificó el número de células cancerosas que se adhirieron a las células endoteliales. n=3. (D) Se sembraron 1 x 106 células MeWo parentales que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control en placas con baja adherencia que contenían medio celular suplementado con metilcelulosa al 0,2 %. Después de 48 horas en suspensión, se cuantificaron los números de células muertas y viables. n=3. (E) Se sembraron 5 x 105 células MeWo parentales que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control en una placa de 6 pocillos y se incubó en medio con bajo contenido en suero durante 48 horas, después de lo cual se cuantificó el número de células viables. n=4. (F) Formación de colonias por células MeWo parentales que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control. Se sembraron 50 células en una placa de 6 cm, y se cuantificó el número de colonias formadas 2 semanas después. n=4. (G) Se sembraron 5 x 104 células MeWo parentales y LM2 en la parte inferior de un pocillo y se evaluó su capacidad de reclutar células endoteliales. n=6-8. (H) Porcentaje de densidad de vasos sanguíneos, mostrado como una representación de fracción acumulativa, para nódulos metastásicos formados por células MeWo parentales que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control. Las secciones pulmonares de la Figura 1C se tiñeron doblemente inmunohistoquímicamente para vimentina humana y MECA-32, y se cuantificó el área positiva para MECA-32 respecto al área total del nódulo, proporcionada por la tinción con vimentina humana, usando ImageJ. n=43 nódulos (control); n=117 nódulos (miR-199a OE); n=55 nódulos (miR-1908 OE). Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 100 pm.
Figura 14. MiR-199a y miR-1908 de manera convergente y cooperativa toman como diana ApoE y DNAJA4 (A) Diagrama Venn que muestra la estrategia experimental integradora que da lugar a la identificación de genes diana potenciales comunes para miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908. El perfilado transcriptómico de genes regulados a la baja más de 1,5 veces después de la sobreexpresión de cada miARN se superpuso con genes regulados al alza más de 1,5 veces después del silenciamiento de cada miARN y con genes regulados a la baja más 1,5 veces en células LM2 metastásicas respecto a su línea celular parental. (B-D) Niveles de expresión de ApoE y DNAJA4 medidos por qRT-PCR en células MeWo parentales que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control (B), en células MeWo parentales y su línea celular derivada LM2 altamente metastásica (C), y en células MeWo-LM2 con silenciamiento basado en miR-Zip de miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, o una secuencia control (D). n=3. (E) Ensayos de informador luciferasa heterólogo que miden la estabilidad de fusiones de 3'UTR/CDS de ApoE y DNAJA4 mutante en el sitio diana de miR-199a-3p, miR-199a-5p, o miR-1908 con luciferasa en células LM2 altamente metastásicas con inhibición de miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, o una secuencia control. n=3-4. (F) Se transdujeron células MeWo-LM2 con retrovirus que expresan un vector control o un vector de sobreexpresión dando lugar a ApoE o DNAJA4. Se determinaron los niveles de expresión de los genes diana por qRT-PCR. (G) Los niveles de expresión de ApoE y DNAJA4, determinados por qRT-PCR, en células MeWo parentales se transdujeron con ARNsh lentivirales dirigidos a ApoE, DNAJA4, o una secuencia control. Todos los datos se representan como media ± SEM.
Figura 15. Interacciones epistáticas entre miR-199a/miR-1908 y ApoE/DNAJA4 (A-D). Se transdujeron células MeWo-LM2 con ARNsh lentivirales dirigidos a ApoE (A, C), DNAJA4 (B, D), o un ARNsh control en el entorno de silenciamiento inducido por miR-Zip de miR-1908 (A, B), miR-199a-5p (C, D), o una secuencia control. Los niveles de los genes diana se analizaron por qRT-PCR. (E) Imaginería bioluminiscente de metástasis pulmonares por 1 x 105 células LM2 que expresan una horquilla control o ARNsh (independientes de los ARNsh usados en la Figura 4E) dirigidos a ApoE, DNAJA4, o una secuencia control en el entorno de la inhibición de miR-1908. Imágenes bioluminiscentes representativas y pulmones teñidos con H y E correspondientes al día 42 después de la inyección. n=5. (F-G) Los niveles de expresión de ApoE y DNAJA4 se analizaron por qRT-PCR en células MeWo parentales transducidas con retrovirus que expresan un vector control o un vector de sobreexpresión para ApoE o DNAJA4 en el entorno de la sobreexpresión de miR-1908 (F) o miR-199a (G). (H-I). Se examinaron células MeWo parentales que sobreexpresan ApoE o DNAJA4 o que expresan un vector control en el entorno de la sobreexpresión de miR-199a para determinar los fenotipos de invasión (H) y reclutamiento endotelial (I). n=7-8. (J) Imaginería bioluminiscente de metástasis pulmonares por 4 x 104 células MeWo parentales que sobreexpresan ApoE o DNAJA4 o que expresan un vector control en el entorno de la sobreexpresión de miR-1908. Imágenes bioluminiscentes representativas y pulmones teñidos con H y E correspondientes al día 56 después de la inyección n=4-8. (K). Niveles de expresión de ApoE y DNAJA4, determinados por qRT-PCR, en derivados A375-LM3 altamente metastásicos transducidos con lentivirus que expresan construcciones de ARNsh dirigidas a ApoE y DNAJA4 o una secuencia control. Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 100 pm.
Figura 16. La ApoE extracelular inhibe los fenotipos de invasión y reclutamiento endotelial de melanoma independientemente de cualquier efecto en la proliferación y supervivencia de las células cancerosas o endoteliales (A) Se midieron los niveles extracelulares de ApoE por ELISA en medio condicionado de células MeWo que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control. n=3. (B-C) Se cultivaron 3104 células MeWo-LM2 (B) o células endoteliales (C) en presencia de BSA (100 pM) o APOE (100 pM), y se monitorizó la proliferación celular con el tiempo mediante el recuento del número de células viables en cada punto de tiempo indicado. n=3. (D-E) Supervivencia de células MeWo-LM2 (D) o células endoteliales (E) en el contexto de privación de suero en presencia de BSA (100 pM) o APOE (100 pM). n=3. (F-G) Se evaluaron los niveles de expresión de ARNm de ApoE en células MeWo parentales transducidas con lentivirus que expresa una horquilla control o construcciones de horquilla corta dirigidas a DNAJA4 (F) y en células LM2 transducidas con retrovirus que expresan un vector control o un vector de sobreexpresión para DNAJA4 (G). n=3. (H-I) Se evaluaron las células LM2 transducidas con retrovirus que expresa un vector control o un vector de sobreexpresión para DNAJA4 para determinar su capacidad de invadir a través de matrigel (H; n=6-8) y reclutar células endoteliales en un ensayo trans-well (I; n=4) en presencia de anticuerpos IgG (40 pg/mL) o neutralizante de ApoE 1D7 (40 pg/mL). Todos los datos se representan como media ± SEM.
Figura 17. ApoE inhibe la invasión celular y el reclutamiento endotelial por la toma como diana de los receptores LRP1 de células de melanoma y LRP8 de células endoteliales (A) Se analizaron 1 x 105 células LM2 transducidas con ARNsi frente a LRP1 o una secuencia control para determinar su capacidad de invadir a través de matrigel. n=9-12. (B) Se transfectaron 1 x 105 células MeWo-LM2 inhibidas para miR-199a-5p o una secuencia control con ARNsi dirigidos a LRP1 o un ARNsi control y se examinaron para determinar su capacidad de invasión de matrigel. n=4. (C) Pulmones teñidos con H y E representativos extraídos en el día 56 de ratones NOD-SCID a los que se inyectó células MeWo-LM2 miR-1908 KD transducidas con un ARNsi control o ARNsi dirigidos a LRP1 (Véase la Figura 6C). (D-E) Se transfectaron 1 x 105 células endoteliales con ARNsi dirigidos a LRP8 o una secuencia control y se dejó que migraran en trans-well hacia 5 x 104 células MeWo-LM2 que expresan una horquilla corta control (D; n=8) o 5 x 104 células MeWo-LM2 inhibidas para miR-199a-5p o una secuencia control (E; n=4). Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 100 pm.
Figura 18. La inhibición basada en LNA de miR-199a y miR-1908 suprime las metástasis de melanoma (A) Proliferación celular in vitro de 2,5 x 104 células MeWo-LM2 transducidas con un LNA control o una mezcla de LNA dirigidos a miR-199a-3p, miR199a-5p y miR-1908. Se cuantificó el número de células viables después de cinco días. n=3. (B) Colonización pulmonar por derivados A375-LM3 altamente metastásicos transfectados con un LNA control o una mezcla de LNA dirigidos a miR-199a-3p, miR199a-5p, y miR-1908. 48 horas después de la transfección, se inyectaron intravenosamente 5 x 105 células en ratones NOD-SCiD, y se determinó la colonización pulmonar mediante la medición de bioluminiscencia 35 días después. n=5-6. (C) El peso de los ratones tratados con una mezcla de LNA dirigidos a los tres miARN o un tratamiento control con PBS simulado (Figura 7J) se monitorizó bisemanalmente. n=5-6. Todos los datos se representan como media ± SEM.
Figura 19. La activación de la señalización de LXRp suprime la invasión celular y reclutamiento endotelial del melanoma. (A) Mapa de calor que representa los niveles de expresión basados en micromatriz de las isoformas LXR y RXR en la colección de líneas celulares de melanoma NCI-60. El mapa de calor para estos genes se extrae del mapa de calor mayor de la familia de receptores de hormonas nucleares (Figura 20). La clave del mapa de color indica el cambio en las desviaciones estándar para el valor de la expresión de cada receptor respecto al valor de expresión promedio de todos los genes perfilados en la micromatriz (> 39.000 variantes de transcritos) en cada línea celular. (B) Invasión celular por las células de melanoma humano 1 x 105 MeWo, 5 x 104 HT-144, 5 x 105 SK-Mel-2, y 5 x 104 SK-Mel-334.2. Las células se trataron con DMSO, GW3965, T0901317, o Bexaroteno a 1 pM durante 72 horas y se sometieron a un ensayo de invasión de matrigel en trans-well. n=4-8. (C) Se ensayaron las células de melanoma humano 5 x 104 MeWo, HT-144, SK-Mel-2, y SK- Mel-334.2 para determinar su capacidad de reclutar 1 x 105 células endoteliales en un ensayo de migración trans-well, después del tratamiento de las células de melanoma con DMSO, GW3965, T0901317, o Bexaroteno a 1 pM durante 72 horas. n=4-8. (D-E) Se sometieron las células de melanoma 1 x 105 MeWo (D) y 1 x 105 HT-144 (E) que expresan un ARNsh control o ARNsh dirigidos a LXRa o LXRp al ensayo de invasión celular después del tratamiento de las células con DMSO, GW3965, o T0901317 a 1 pM durante 72 horas. n=4-12. (F-G) Se trataron las células 5 x 104 MeWo (F) y 5 104 HT-144 (G), transducidas con ARNsh lentivirales dirigidos a LXRa o LXRp o un ARNsh control, con DMSO, GW3965, o T0901317 a 1 pM durante 72 horas y se ensayaron para determinar su capacidad de reclutar 1 x 105 células endoteliales en un ensayo de migración transwell. n=7-8. Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 50 pm. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.
Figura 20. Análisis de la expresión de receptores hormonales nucleares en melanoma y efectos de agonistas de LXR y RXR en el crecimiento celular in vitro, relacionado con la Figura 19(A-G). (A) Mapa de calor que muestra los niveles de expresión basados en micromatriz de todos los miembros de la familia de receptores hormonales nucleares a lo largo de la colección NCI-60 de líneas de melanoma. Los niveles de expresión de cada receptor se presentan como el número de desviaciones estándar por debajo o por encima de los niveles de expresión promedio de todos los genes (> 39.000 variantes de transcritos) detectados por la micromatriz en cada línea celular respectiva. (B) Se sembraron las células de melanoma humano 2,5 x 104 MeWo, HT-144, o SK-Mel-334.2 en placas de 6 pocillos y se cultivaron en presencia de DMSO, GW3965, T0901317, o Bexaroteno a 1 pM. Las células viables se contaron en el día 5 posterior a la siembra. n=3-6. (C) Se sembraron en placas 2,5 x 104 células MeWo, HT-144, o SK-Mel-334.2 en triplicado y se incubaron en medio que contenía DMSO, GW3965, T0901317, o Bexaroteno a 1 pM durante 5 días, después de lo cual se cuantificó el número de células muertas usando la tinción de células muertas de azul de tripán. n=3. (D-G) Expresión relativa de LXRa y LXRp, determinada por qRT-PCR, en células de melanoma humano MeWo (D, E) y HT-144 (F, G) que expresan un ARNsh control o ARNsh dirigidos a LXRa o LXRp. Todos los datos se representan como media ± SEM.
Figura 21. La activación terapéutica de LXR inhibe el crecimiento tumoral del melanoma. (A-B) Crecimiento tumoral primario por 5 x 104 células de melanoma de ratón B16F10 inyectadas subcutáneamente en ratones C57BL/6-WT. Después del crecimiento tumoral hasta un volumen de 5-10 mm3, los ratones se alimentaron continuamente con un pienso control o un pienso suplementado con GW3965 (20 mg/kg/día o 100 mg/kg/día) (A) o T0901317 (20 mg/kg/día) (B). Las imágenes tumorales representativas mostradas corresponden a tumores extraídos en el día final (d12). n=10-18 (A), 8-10 (B). (C-E) Crecimiento tumoral primario por las células de melanoma humano 1 x 106 MeWo (C), 7,5 x 105 SK-Mel-334.2 (D), y 2 x 106 SK-Mel-2 (E) inyectadas subcutáneamente en ratones inmunocomprometidos. Después del crecimiento tumoral hasta un volumen de 5-10 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (20 mg/kg o 100 mg/kg, según se indica). Las imágenes tumorales mostradas corresponden al último día de mediciones. n=6-34 (C), 8 (D), 5 (E). (F) Se inyectaron subcutáneamente 5 x 104 células B16F10 en ratones C57BL/6-WT. Después del crecimiento tumoral hasta 150 mm3, los ratones se alimentaron continuamente con un pienso control o un pienso que contenía GW3965 (150 mg/kg), y el crecimiento tumoral se midió diariamente. n=6-13. (G-I) Supervivencia global de los ratones después del injerto subcutáneo de las células 5 x 104 B16F10 (G), 1 x 106 MeWo (H), y 7,5 x 105 SK-Mel-334.2 (I) en ratones a los que se administró un pienso normal o un pienso suplementado con GW3965 (100 mg/kg) después de la formación de los tumores que tenían un volumen de 5­ 10 mm3. n=6-9 (F), 4-7(H), 3-6 (I). (J-L) Densidad de las células endoteliales tumorales, determinada por tinción inmunohistoquímica para el antígeno de células endoteliales de ratón MECA-32 (J), proliferación de las células tumorales, determinada por tinción para el marcador proliferativo Ki-67 (K), y apoptosis de las células tumorales, determinada por tinción para caspasa-3 escindida (L), en tumores de melanoma subcutáneos formados por 1 x 106 células de melanoma humano MeWo en respuesta al tratamiento de los ratones con una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (20 mg/kg) durante 35 días. n=5. El volumen tumoral se calculó como (diámetro pequeño)2 x (diámetro grande)/2. Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escalas, 5 mm (A-D), 50 pm (J, K), 25 pm (L).
Figura 22. El agonismo de LXRp suprime el crecimiento tumoral de melanoma, relacionado con la Figura 21(A-E). (A) Mediciones de peso de ratones alimentados con una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (20 mg/kg/día o 100 mg/kg/día) o T0901317 (20 mg/kg) durante 65 días. n=5-6.
Figura 23. El agonismo de LXR suprime las metástasis de melanoma al pulmón y cerebro. (A) Se pretrataron células MeWo con DMSO o GW3965 (1 pM) durante 48 horas y se inyectaron intravenosamente 4 x 104 células a través de la vena de la cola en ratones NOD Scid. La colonización pulmonar se monitorizó por imaginería bioluminiscente semanalmente. Se muestran los pulmones teñidos con H y E representativos que corresponden al día final (d70). n=4-5. (B-C) Imaginería bioluminiscente de metástasis pulmonares por 4 x 104 células MeWo inyectadas intravenosamente en ratones NOD Scid que se alimentaron con un pienso control o un pienso que contenía GW3965 (20 mg/kg) o T0901317 (20 mg/kg) empezando 10 días antes de la inyección de las células cancerosas. Los pulmones teñidos con H y E representativos corresponden al día final de imaginería n=5-6. (B-C) Imaginería bioluminiscente de metástasis pulmonares por 4 x 104 células MeWo inyectadas intravenosamente en ratones NOD Scid que se alimentaron con un pienso control o un pienso que contenía GW3965 (20 mg/kg) o T0901317 (20 mg/kg) empezando 10 días antes de la inyección de las células cancerosas. Los pulmones teñidos con H y E representativos corresponden al día final de imaginería n=5-6. (F) Flujo fotónico sistémico y cerebral después de la inyección intracardiaca de 1 x 105 células derivadas de metástasis cerebral MeWo en ratones desnudos atímicos que se alimentaron con una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg) empezando el día 0 después de la inyección. n=7. (G) Esquema del modelo de metástasis ortotópica experimental usado para evaluar la capacidad del tratamiento con GW3965 de suprimir las metástasis pulmonares después de la escisión del tumor. (H) Flujo fotónico pulmonar ex vivo, determinado por imaginería bioluminiscente, en ratones NOD Scid a los que se administró un pienso control o un pienso que contenía GW3965 (100 mg/kg) durante 1 mes después de la escisión de tumores de melanoma subcutáneos con tamaño concordante (~300 mm3 de volumen) formados por 1 x 106 células de melanoma MeWo. También se muestran los pulmones representativos teñidos para vimentina humana. n=7-9. (I) Se inyectaron intravenosamente 4 x 104 células MeWo en ratones NOD Scid. Después del inicio de las metástasis, detectadas por imaginería bioluminiscente en d42, se administró a los ratones una dieta control o una dieta con GW3965 (100 mg/kg) como se indica, y se midió semanalmente la progresión de la colonización pulmonar. n=6. (J) Número de nódulos metastásicos macroscópicos en pulmones teñidos con H y E extraídos en el día final (d77) de ratones NOD Scid a los que se administró una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg), como se indica en (I). n=4-5. (K) Supervivencia global de los ratones después de la inyección intravenosa de 4 x 104 células MeWo en ratones NOD-Scid que se alimentaron continuamente con un pienso control o un pienso suplementado con GW3965 (20 mg/kg) empezando 10 días antes de la inyección de las células cancerosas. n=5-6. Todos los datos se representan como media ± SEM.
Figura 24. Supresión de la progresión de melanoma dirigida genéticamente por terapia de activación de LXR. (A) Supervivencia global de ratones C57BL/6 Tyr::CreER; BrafV600E/+; Ptenlox/+ después de la inducción de melanoma general por la administración intraperitoneal de 4-HT (25 mg/kg) en tres días consecutivos. Después de la primera inyección de 4-HT, los ratones se asignaron aleatoriamente a una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg). n=10-11. (B) Carga de tumor de melanoma, expresada como el porcentaje de área de la piel dorsal, medida en el día 35 en ratones Tyr::CreER; BrafV600E/+; ptenlox/lox a los que se administró un pienso control o un pienso suplementado con GW3965 (100 mg/kg) después de la inducción del melanoma como se describe en (A). n=4-5. (C) Número de nódulos metastásicos macroscópicos en los nódulos linfáticos de la glándula salivar detectados postmortem en ratones Tyr::CreER; BrafV600E/+; ptenlox/lox que se alimentaron con un pienso control o un pienso que contenía GW3965 (100 mg/kg) después de la inducción global de la progresión del melanoma como se describe en (A). n=7-8. (D) Crecimiento tumoral después de la inyección subcutánea de 1 x 105 células de melanoma primario BrafV600E/+; Pten-/-; CDKN2A-/- en ratones C57BL/6-WT singénicos. Después del crecimiento tumoral hasta un volumen de 5-10 mm3, los ratones se alimentaron con un pienso control o un pienso suplementado con GW3965 (100 mg/kg). n=16-18. (E) Supervivencia global de ratones C57BL/6-WT a los que se inyectaron subcutáneamente 1 x 105 células de melanoma BrafV600E/+; Pten-/-; CDKN2A-/- y se trataron con una dieta con GW3965 (100 mg/kg) o una dieta control después del crecimiento tumoral hasta un volumen de 5-10 mm3. n=7-8. (F) Colonización pulmonar por 1 x 105 células de melanoma primario BrafV600E/+; Pten-/-; CDKN2A-/- inyectadas intravenosamente en ratones C57BL/6-WT. Inmediatamente después de la inyección de las células cancerosas, los ratones se asignaron aleatoriamente a una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg) para el resto del experimento. n= 14-15. Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 2 mm (B), 5 mm (D).
Figura 25. Supresión mediada por LXR de la progresión del melanoma en un modelo de melanoma en ratón dirigido genéticamente, relacionado con la Figura 24 (A-C). (A) Supervivencia global de ratones C57BL/6 Tyr::CreER; BrafV600E/+; ptenlox/lox después de la inducción de melanoma general por administración intraperitoneal de 4-HT (25 mg/kg) en tres días consecutivos. Después de la primera inyección de 4-HT, los ratones se asignaron aleatoriamente a una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg). n=7. (B) Imágenes representativas de ratones C57BL/6 Tyr::CreER; BrafV600E/+; ptenlox/lox alimentados con una dieta control o dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg) tomada 43 días después de la inducción del melanoma por administración intraperitoneal de 4-HT.
Figura 26. Una lista de los 50 genes más regulados al alza en células de melanoma humano MeWo en respuesta al tratamiento con GW3965.
Figura 27. La activación de LXRp induce la expresión de ApoE en células de melanoma; ApoE media la supresión dependiente de LXRp de los fenotipos de la progresión del melanoma in vitro. (A- C) Se trataron células de melanoma humano MeWo (A), HT-144 (B), y WM-266-4 (C) con GW3965 o T0901317 a las concentraciones indicadas durante 48 horas, y los niveles de expresión de ApoE se analizaron por qRT-PCR. n=3. (D) Niveles extracelulares de proteína ApoE, cuantificados por ELISA, en medio condicionado sin suero recogido de células de melanoma humano HT-144 tratadas con DMSO, GW3965, o T0901317 a 1 pM durante 72 horas. n=3-4. (E-F) Se ensayaron 5 x 104 células HT-144, tratadas con DMSO, GW3965, o T0901317 a 1 pM durante 72 horas, para determinar los fenotipos de invasión celular (E) y reclutamiento endotelial (F) en presencia de un anticuerpo neutralizante de ApoE (1D7) o un anticuerpo IgG control añadidos a 40 pg/mL a cada trans-well al inicio del ensayo. n=4. (G-H) Invasión celular (G) y reclutamiento endotelial (F) por 1 x 105 y 5 x 104 células MeWo, respectivamente, que expresan un ARNsh control o un ARNsh dirigido a ApoE y tratadas con DMSO o GW3965 a 1 pM durante 72 horas antes de cada ensayo. n=7-8. (I-J) Expresión relativa de ApoE, cuantificada por qRT- PCR, en células MeWo (I) y HT-144 (J) transducidas con un ARNsh control o un ARNsh dirigido a LXRa o LXRp y tratadas posteriormente con DMSO, GW3965, o T0901317 a 1 pM durante 48 horas. n=3-9. (K) Niveles extracelulares de la proteína ApoE, medidos por ELISA, en medio condicionado sin suero recogido de células HT-144 transducidas con un ARNsh control o un ARNsh dirigido a LXRa o LXRp y tratadas con DMSO o GW3965 a 1 |jM durante 72 horas. n=3. Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 50 jm .
Figura 28. La activación de LXRp suprime la invasión y el reclutamiento endotelial del melanoma mediante el aumento transcripcional de la expresión de ApoE en las células de melanoma. (A) La actividad luciferasa accionada por el promotor de ApoE fusionado en 3' de las secuencias del elemento multipotenciador 1 (ME. 1) o del elemento multipotenciador 2 (ME.2) y transfectado en células MeWo tratadas con DMs O, GW3965, o T0901317 a 1 j M durante 24 horas. n= 4-8. (B) Los niveles extracelulares de la proteína ApoE se cuantificaron por ELISA en medio condicionado sin suero recogido de células MeWo tratadas con d Ms O, GW3965, o T0901317 a 1 j M durante 72 horas. n=3-4. (C) Invasión celular por 1 x 105 células MeWo pretratadas con DMSO, GW3965, o T0901317 a 1 j M durante 72 horas. Al inicio del ensayo, se añadió un anticuerpo neutralizante de ApoE (1D7) o un anticuerpo IgG control a 40 jg/m L a cada trans-well, como se indica. n=7-8. (D) Se ensayaron 5 x104 células MeWo, pretratadas con DMSO, GW3965, o T0901317 a 1 j M durante 72 horas, para determinar su capacidad de reclutar 1 x 105 células endoteliales en presencia de los anticuerpos 1D7 o IgG a 40 jg/mL. n=6-8. (E) Niveles extracelulares de la proteína ApoE, cuantificados por ELISA, en medio condicionado sin suero de células de melanoma primario humano SK-Mel-334.2 tratadas con DMSO o GW3965 a 1 j M durante 72 horas. n=4. (F-G) Se sometieron 5 x 104 células SK-Mel-334.2, pretratadas con GW3965 a 1 j M durante 72 horas, a los ensayos de invasión celular (F) y reclutamiento endotelial (G) en presencia de anticuerpos 1D7 o IgG a 40 jg/mL. n=7-8. (H) Se determinó la actividad del promotor de ApoE fusionado con los elementos potenciadores ME.1 o ME.2 a través de la medición de la actividad del informador luciferasa en células MeWo que expresan un ARNsh control o ARNsh dirigidos a LXRa o LXRp en presencia de DMSO o GW3965 (1 j M) durante 24 horas. n=3-8. (I) Los niveles extracelulares de la proteína ApoE, cuantificados por ELISA, se evaluaron en medio condicionado sin suero recogido de células de melanoma humano MeWo que expresan un ARNsh control o ARNsh dirigidos a LXRa o LXRp en respuesta al tratamiento con GW3965 o T0901317 (1 j M) durante 72 horas. n=3-8. Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 50 jm .
Figura 29. La administración terapéutica de agonistas de LXR regula al alza la expresión de ApoE derivada de melanoma y sistémica. (A-B) Niveles de expresión de ApoE, cuantificados por qRT-PCR, en tumores subcutáneos formados por células de melanoma de ratón B16F10 inyectadas en ratones C57BL/6. Después de la formación de tumores de 5 mm3, los ratones se alimentaron con una dieta control o una dieta que contenía GW3965 (20 mg/kg) (A) o T0901317 (20 mg/kg) (B) durante 7 días. n=3-4. (C-E) Expresión del transcrito de ApoE en tumores primarios (C), metástasis pulmonares (D), y metástasis cerebrales (E) formadas por células de melanoma humano MeWo injertadas en ratones NOD Scid a los que se administró pienso control o pienso suplementado con GW3965 (20 mg/kg). Se evaluaron los niveles de ApoE en el día 35 (C), día 153 (D), y día 34 (E) después de la inyección de las células cancerosas. n=3-5. (F) Los niveles de expresión relativa de LXRa, LXRp, y ApoE se determinaron por qRT- PCR en células de melanoma de ratón B16F10 que expresan una horquilla control o un ARNsh dirigido a LXRa (sh_mLXRa), LXRp de ratón (sh_mLXRp), o ApoE de ratón (sh_mApoE). (G-H) Niveles de ARNm de ApoE (G) y ABCA1 (h ), medidos por qRT-PCR, en células B16F10 que expresan un ARNsh control o ARNsh dirigidos a LXRp de ratón o ApoE de ratón. Las células se trataron con DMSO o GW3965 a 5 j M durante 48 horas. n=3. (I) Niveles de ARNm de ABCA1, medidos por qRT-PCR, en células sanguíneas blancas sistémicas extraídas de ratones LXRa -/- o LXRp -/­ alimentados con una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (20 mg/kg) durante 10 días. n=3-4. (J) Se determinó la expresión relativa del ARNm de ApoE, expresada como la frecuencia de etiquetas SAGE, en los tejidos de piel y pulmón de los ratones usando la base de datos pública de Matriz de Expresión de mSAGE disponible en el Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) con fondos del NCI. (K) Expresión relativa del ARNm de ApoE, determinada por qRT-PCR, en células de melanoma MeWo disociadas de nódulos metastásicos pulmonares (LM2) o tumores primarios respecto a células parentales MeWo control no seleccionadas. n=3.
Figura 30. El agonismo de LXRp suprime el crecimiento tumoral y metástasis del melanoma mediante la inducción de la expresión de ApoE derivada de melanoma y sistémica. (A) Mediciones por transferencia Western de los niveles de la proteína ApoE en lisados de tejido adiposo, pulmonar, y cerebral extraídos de ratones de tipo salvaje alimentados con un pienso control o un pienso suplementado con GW3965 (20 mg/kg) o T0901317 (20 mg/kg) durante 10 días. (B) Cuantificación de la expresión de la proteína ApoE sobre la base de las transferencias western mostradas en (A). Se usó tubulina total como un control endógeno para la normalización. n=3-5. (C) Niveles de expresión de ApoE, determinados por qRT-PCR, en células sanguíneas blancas sistémicas de ratones alimentados con una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 o T0901317 a 20 mg/kg durante 10 días. n=3-6. (D) Se inyectaron subcutáneamente células control B16F10 o células B16F10 que expresan ARNsh dirigidos a LXRa de ratón (sh m_LXRa) o LXRp de ratón (sh_mLXRp) en ratones C57BL/6-WT, LXRa -/- o LXRp -/-. Una vez los tumores alcanzaron un volumen de 5-10 mm3, los ratones se alimentaron con una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (20 mg/kg) durante 7 días, después de lo cual se midió el volumen tumoral final. Las imágenes tumorales representativas extraídas en el punto final se muestran en el panel derecho. n=6-18. (E) Niveles del transcrito de ApoE, cuantificados por qRT-PCR, en células sanguíneas blancas sistémicas extraídas de ratones LXRa -/- o LXRp -/­ alimentados con una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (20 mg/kg) durante 10 días. n=3-5. (F) Crecimiento tumoral subcutáneo por 5 x 104 células control B16F10 o células B16F10 que expresan un ARNsh dirigido a ApoE de ratón (sh_mApoE) en ratones C57BL/6-WT o ApoE-/-. Después de la formación de tumores con un volumen de 5-10 mm3, los ratones se alimentaron con una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (20 mg/kg) durante 7 días, y se cuantificó el volumen tumoral final. Las imágenes representativas de los tumores extraídos en el día final de la medición (d12) se muestran a la derecha. n=8-18. (G) Colonización pulmonar por 5 x 104 células B16F10 transducidas con un ARNsh control o sh_mApoE e inyectadas intravenosamente en ratones C57BL/6-WT o ApoE-/-. Empezando a los 10 días antes de la inyección de las células cancerosas, los ratones se asignaron a un tratamiento con una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (20 mg/kg). Se cuantificaron las metástasis pulmonares en d22 por imaginería bioluminiscente. Los pulmones representativos extraídos en el punto final (d22) se muestran en el panel derecho. n=5-10. (H) Expresión de la proteína ApoE, determinada por análisis de inmunohistoquímica ciegos, en muestras de lesiones cutáneas de melanoma primario no metastásico (n=39) y metastásico (n=34) obtenidas de pacientes en MSKCC. La fracción del área celular teñida positivamente para ApoE se cuantificó como un porcentaje del área tumoral total. (I) Curvas de Kaplan-Meier para la cohorte de MSKCC (n=71) que representan la supervivencia sin metástasis de pacientes como una función de la expresión de la proteína ApoE en las lesiones de melanoma primario de los pacientes. Los melanomas que tenían niveles de ApoE por encima de la mediana de la población se clasificaron como positivos para ApoE (pos), mientras que los tumores con una expresión de ApoE por debajo de la mediana se clasificaron como negativos para ApoE (neg). Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 5 mm (D y F), 100 pm (H).
Figura 31. La activación de LXRp suprime el crecimiento in vivo de líneas de melanoma resistentes a dacarbazina y vemurafenib. (A) Crecimiento celular in vitro por 2,5 x 104 células parentales B16F10 y células B16F10 resistentes a DTIC derivadas in vitro en respuesta a varias dosis de dacarbazina (DTIC) añadida al medio celular durante 4 días. n=3. (B-D) Crecimiento tumoral por 5 x 104 células parentales B16F10 sensibles a DTIC (B) o 5 x 104 células B16F10 resistentes a DTIC (C) inyectadas subcutáneamente en ratones C57BL/6-WT. Después del crecimiento tumoral hasta un volumen de 5-10 mm3, los ratones se trataron con dacarbazina (50 mg/kg, i.p., diariamente) o un vehículo control y se asignaron aleatoriamente a pienso regular o un pienso suplementado con GW3965 (100 mg/kg). Las mediciones del volumen tumoral en el día final se muestran en (D). n=8-16 (B), 7-8 (C). (E-F) Crecimiento tumoral por células parentales MeWo sensibles a DTIC y células de melanoma humano MeWo resistentes a DTIC derivadas in vitro en respuesta a tratamientos con DTIC o GW3965. Se inyectaron subcutáneamente 5 x 105 células en ratones NOD Scid gamma. Después de la formación de tumores con un volumen de 5-10 mm3, los ratones se asignaron de forma ciega a un tratamiento control, un tratamiento con DTIC (50 mg/kg, administrado i.p., diariamente en ciclos de 5 días con intervalos sin tratamiento de 2 días), o un tratamiento con una dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg). Las mediciones de los tumores en el día final se muestran en (F). n=6-8. (G) Crecimiento tumoral por 2 x 106 células SK-Mel-239 de clon resistente a vemurafenib inyectadas subcutáneamente en ratones NOD Scid gamma que se asignaron a una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg) posteriormente al crecimiento de los tumores hasta un volumen de 5-10 mm3. n=7-8. (H) Supervivencia global de los ratones después del injerto de 2 x 106 células SK-Mel-239 resistentes a vemurafenib. Después del crecimiento de los tumores hasta un volumen de 5-10 mm3, los ratones se alimentaron continuamente con una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg). n=7. (I) Modelo derivado experimentalmente que representa la activación de ApoE sistémica y autónoma de melanoma por la terapia de activación de LXRp en la mediación de la supresión de los fenotipos de progresión de melanoma. La ApoE extracelular suprime las metástasis de melanoma mediante la inhibición coordinada de la invasión celular del melanoma y el reclutamiento endotelial no autónomo de células a través de la toma como diana de los receptores LRP1 de células de melanoma y LRP8 de células endoteliales, respectivamente. Todos los datos se representan como media ± SEM. Barra de escala, 5 mm.
Figura 32. Supresión inducida por dacarbazina del crecimiento tumoral por células de melanoma humano. (A) Crecimiento tumoral por 5 x 105 células parentales MeWo sensibles a DTIC inyectadas subcutáneamente en ratones Nod SCID gamma. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 5-10 mm3, los ratones se trataron con un vehículo control o DTIC (50 mg/kg, administrado i.p., diariamente en ciclos de 5 días con intervalos sin tratamiento de 2 días), y se midió el volumen tumoral dos veces a la semana. n=6.
Figura 33. Supresión mediada por ApoE de la invasión celular en múltiples tipos de cáncer. Se ensayaron (A-B) 5 x 104 células de melanoma uveal humano MUM2B y OCM1, (C-E) 5 x 104 células de cáncer de mama triple negativo humano MDA-231, MDA-468, y BT 549, (F-G) 5 x 104 células de cáncer pancreático humano PANC1 y bX p C-3, y (H-I) 5 x 104 células de cáncer renal humano 786-00 y RCC4 para determinar su capacidad de invasión a través de insertos trans-well recubiertos con matrigel in vitro. Se añadieron BSA o ApoE recombinante al medio celular a 100 pg/mL al inicio del ensayo. n=4. Todos los datos se representan como media ± SEM; *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Figura 34. Efectos de los agonistas de LXR LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO- 2010-0138598 Ej. 9, y SB742881 en la expresión de ApoE en células de melanoma humano. (A-D) Se trataron células MeWo de melanoma humano con DMSO o los agonistas de LXR LXR-623 (A), WO-2007-002563 (B), WO-2010-0138598 (C), o SB742881 (D) a 500 nM, 1 pM, o 2 pM durante 48 horas. Los niveles de expresión de ApoE se cuantificaron posteriormente por qRT-PCR. n=3. Todos los datos se representan como media ± SEM. *p<0,05, **p<0,01.
Figura 35. El tratamiento con el agonista de LXR GW3965 inhibe la invasión in vitro de células tumorales de cáncer renal, cáncer pancreático, y cáncer de pulmón. (A-C) Invasión de matrigel trans-well por 5 x 104 células de cáncer renal humano RCC (A), 5 x 104 células de cáncer pancreático humano PANC1 (B), y 5 x 104 células de cáncer de pulmón humano H460 (C) que se trataron con DMSO o GW3965 a 1 pM durante 72 horas antes del ensayo. n=4. Todos los datos se representan como media ± SEM. *p<0,05, **p<0,01.
Figura 36. El tratamiento con el agonista de LXR GW3965 inhibe el crecimiento tumoral del cáncer de mama in vivo. Crecimiento tumoral primario por 2 x 106 células de cáncer de mama humano MDA-468 inyectadas en los panículos adiposos mamarios de ratones NOD Scid gamma. Dos días antes de la inyección de las células cancerosas, los ratones se asignaron a un tratamiento con una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (75 mg/kg) y se mantuvieron en la dieta correspondiente a lo largo del experimento. n=8. Todos los datos se representan como media ± SEM. ***p<0,001.
Figura 37. Efectos de los agonistas de LXR LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO-2010-0138598 Ej. 9, y SB742881 en los fenotipos de progresión de melanoma in vitro. (A) Invasión celular por 1 x 105 células de melanoma humano MeWo pretratadas con DMSO, LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO-2010-0138598 Ej. 9, o SB742881 a 1 pM cada uno durante 72 horas. Se cuantificó el número de células que invadieron el lado basal de los insertos trans-well recubiertos con matrigel. n=5. (B) Reclutamiento endotelial por 5 x 104 células MeWo pretratadas con DMSO, LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO-2010-0138598 Ej.9, o SB742881 a 1 pM cada uno durante 72 horas. Las células cancerosas se sembraron en la parte inferior de una placa de 24 pocillos. Las células endoteliales se sembraron en un inserto trans-well ajustado en cada pocillo y se dejó que migraran hacia las células cancerosas. Se cuantificó el número de células endoteliales que migraban hacia el lado basal de cada inserto trans-well. n=4-5. Todos los datos se representan como media ± SEM. *p<0,05, **p<0,01.
Figura 38. Efectos de los agonistas de LXR LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO- 2010-0138598 Ej. 9, y SB742881 en el crecimiento tumoral in vivo. (A-D) Crecimiento tumoral por 5 x 104 células de melanoma de ratón B16F10 inyectadas subcutáneamente en ratones C57BL/6 de 7 semanas de edad. Después de que los tumores alcanzaran un volumen de 5-10 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a un tratamiento con una dieta control, un tratamiento con una dieta suplementada con LXR-623 a 20 mg/kg/día (A) un tratamiento con una dieta suplementada con WO-2007-002563 Ej. 19 a 100 mg/kg/día (B), un tratamiento con una dieta suplementada con WO-2010-0138598 Ej. 19 a 10 mg/kg/día o 100 mg/kg/día (C), o un tratamiento con una dieta suplementada con SB742881 a 100 mg/kg/día (D). n=8-10. Todos los datos se representan como media ± SEM.
Descripción detallada de la invención
La presente descripción presenta métodos para prevenir o reducir la proliferación, diferenciación, o supervivencia aberrante de células. Por ejemplo, los compuestos de la descripción pueden ser útiles para reducir el riesgo de, o prevenir, el incremento del tamaño de tumores o que alcancen un estado metastásico. Los compuestos objeto pueden administrarse para parar la progresión o avance del cáncer. Además, la descripción incluye el uso de los compuestos objeto para reducir el riesgo de, o prevenir, una recurrencia del cáncer.
La progresión metastásica requiere que conjuntos de proteínas efectoras implicadas en los fenotipos celulares comunes se expresen de forma coherente (Gupta y Massagué, 2006 Cell 127, 679-695; Hanahan y Weinberg, 2011 Cell 144, 646-674; Talmadge y Fidler, 2010 Cancer Res. 70, 5649-5669; Hynes, 2003 Cell 113, 821-823). Dichos estados de expresión concertada son aparentes en perfiles de expresión génica de cánceres de mama primarios que metastatizan (Wang et al., 2005 Lancet 365, 671-679), así como en perfiles de clones de células cancerosas humanas que presentan una actividad metastásica aumentada (Kang et al., 2003 Cancer Cell 3, 537-549; Minn et al., 2005 Nature 436, 518-524). En los últimos años, la regulación posterior a la transcripción ha emergido como un modo generalizado y robusto de un estado de expresión concertada y control del nivel fenotípico. La clase más estudiada de reguladores posteriores a la transcripción con actividad reguladora metastásica son ARN no codificadores pequeños (miARN) (Bartel, 2009 Cell 136, 215-233; Fabian et al, 2010 Annu. Inv. Biochem, 79, 351-379; Filipowicz et al, 2008 Nat. Inv. Genet. 9, 102-114). Los miARN promotores de la metástasis (Ma et al, 2007 Nature 449, 682-688; Huang et al, 2008 Nat. Cell Biol. 10, 202-210) y los miARN supresores de la metástasis (Tavazoie et al, 2008 Nature 451, 147-152) se descubrieron originariamente en el cáncer de mama. Los estudios posteriores revelaron muchos más miARN con papeles reguladores en la tumorogénesis y metástasis de otros tipos de cáncer (Hatziapostolou et al, 2011 Cell 147, 1233-1247; Hurst et al, 2009 Cancer Res. 69, 7495-7498; Olson et al, 2009 Genes Dev. 23, 2152-2165; Zhang et al, 2010 Oncogene 29, 937-948). En muchos casos, los niveles de expresión de estos miARN en las muestras de cáncer humano han apoyado sus papeles experimentales en la metástasis. Así, la expresión desrregulada de miARN (Garzon et al, 2010 Nat. Rev. Drug Discov. 9, 775-789; Lujambio y Lowe, 2012 Nature 482, 347-355) y, más recientemente, la expresión desrregulada de ARN no codificadores largos (Calin et al, 2007 Nat. Rev. Cancer 6, 857­ 866; Gupta et al, 2010 Nature 464, 1071-1076; Guttman et al, 2009 Nature 458, 223-227; Huarte et al, 2010 Cell 142, 409-419; Loewer et al, 2010 Nat. Genet. 42, 1113-1117), así como pseudogenes no codificadores que compiten con la unión de miARN endógenos (Poliseno et al, 2010 Nature 465, 1033-1038) parece que son características generalizadas del cáncer humano. Las claves respecto al control robusto ejercido por miARN específicos en la progresión metastásica provienen de un trabajo temprano que muestra que la toma como diana concertada de múltiples genes de metástasis por un único miARN supresor de metástasis era responsable de los efectos dramáticos en la supresión de la metástasis (Tavazoie et al, 2008 Nature 451, 147-152). Dicha toma de diana de genes divergente por miARN ha surgido como una característica definitoria de estos reguladores.
A un nivel conceptual, la necesidad de una regulación divergente de la expresión génica en el cáncer se entiende fácilmente. Un miARN podría ejercer una supresión metastásica robusta gracias a su capacidad de tomar como diana múltiples genes requeridos para la metástasis. El silenciamiento por los miARN a través de mecanismos genéticos o epigenéticos promovería fácilmente la progresión del cáncer mediante la desrrepresión de múltiples promotores de la metástasis (Png et al., 2011 Nature 481, 190-194). Es más sutil un papel para la regulación convergente de un único gen por múltiples miARN reguladores de la metástasis. Este escenario emergería si existiera un gen clave que actuara como un supresor robusto de la progresión metastásica. La toma como diana convergente y cooperativa de este gen por múltiples miARN podría conseguir un silenciamiento máximo de dicho gen clave supresor de la metástasis. Este escenario, a diferencia de la deleción genética, puede observarse en casos en los que una pérdida completa de un gen diana no podría ser tolerada por la célula, y el gen se requiriera a niveles bajos para mediar acciones metabólicas, por ejemplo. Dada esta posibilidad, una búsqueda de miARN promotores de la metástasis cooperativos puede descubrir nuevos genes que son cruciales para la supresión de la metástasis y puede proporcionar información terapéutica para dar lugar a tratamientos más efectivos para la prevención de la metástasis.
Como se describe en la presente memoria, a través de una estrategia sistemática basada en la selección in vivo, se identificó que un conjunto de miARN estaba desrregulado en múltiples líneas metastásicas independientes derivadas de múltiples pacientes con melanoma - un cáncer altamente prevalente con una incidencia creciente (Garbe y Leiter, 2009 Clin. Dermatol. 27, 3-9). Como se describe en la presente memoria, miR-1908, miR-199a-3p, y miR-199a-5p actúan como promotores endógenos robustos de la metástasis del melanoma a través de la toma como diana convergente del gen metabólico de ApoE y la proteína de choque por calor DNAJA4. A través de análisis de pérdida de función, ganancia de función, y epistáticos, se delinea una red de miARN cooperativos que silencia de forma máxima la señalización de ApoE. La ApoE secretada por las células cancerosas inhibe la invasión metastásica y el reclutamiento endotelial, que está mediado a través de sus acciones en distintos receptores en células de melanoma y endoteliales. Estos miARN presentan una capacidad de pronóstico significativa para identificar pacientes que desarrollan una recidiva metastásica de melanoma, mientras la administración terapéutica de LNA dirigidos a estos miARN inhibe significativamente las metástasis de melanoma. La falta actual de terapias efectivas para la prevención de metástasis de melanoma después de la resección quirúrgica (Garbe et al., 2011 Oncologist 16, 5-24) requiere una comprensión molecular y mecanísitica mejorada acerca de la progresión metastásica del melanoma. Para este fin, los descubrimientos descritos en la presente memoria revelan varios genes nuevos no codificadores y codificadores clave implicados en la progresión del melanoma y ofrecen una nueva posibilidad tanto para identificar a pacientes con alto riesgo de metástasis de melanoma como para tratarlos.
A continuación, se listan secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de los miembros de la red mencionada anteriormente y varias otras secuencias.
APOE - Secuencia de ARN (SEQ ID NO: 1)
Figure imgf000017_0001
APOE - Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2)
mkvlwaallv tflagcqakv eqavctcpcp clrqqtcwqs gqrwclalgr fvvdylrwvqt lscqvqccll ssqvtqclra Imdctmkelk ayksclccql tpvacetrar Iskelqaaqa rlgadmedvc grlvqyrgcv qamlgqstce Irvrlashlr klrkrllrda ddlqkrlavy qagaregaer glsairerlg plveqgrvra atvgslagqp Iqeraqawge rlrarmecmg srtrdrldcv keqvacvrak lccqaqqirl qacafqarlk swfcplvcdm qrqwaglvck vqaavgtsaa pvpsdnh
(Los residuos 136-150 subrayados representan el dominio de unión a LRP de Apo E)
DNAJA4 isoforma 1 - Secuencia de ARN (SEQ ID NO: 3)
Figure imgf000018_0001
DNAJA4 isoforma 1 - Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4)
18
marggsqsws sgesdgqpke qtpekprhkm vketqyydil gvkpsaspee ikkayrklal kyhpdknpde gckfklisqa ycvlsdpkkr dvydqggcqa ¡kcggsgsps fsspmdifdm ffggggrmar crrgknv\hq Isvtlcdlyn g\lkklalqk nvicckccgv ggkkgsvckc plckgrgmqi hiqqigpgmv qqiqtvcicc kgqgcrinpk drccscsgak virckkiicv hvckgmkdgq kilfhgcgdq cpclcpgdvi ivldqkdhsv fqrrghdlim kmkiqlscal cgfkktiktl dnrilvitsk agcvikhgdl rcvrdcgmpi ykaplckgil iiqflvifpc khwlsleklp qleallpprq kvritddmdq velkefcpne qnwrqhrcay ccdedgpqag
vqcqta
DNAJA4 isoforma 2 - Secuencia de ARN (SEQ ID NO: 5)
Figure imgf000020_0001
DNAJA4 isoforma 2 - Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6)
m vkctqyydi Igvkpsaspe cikkayrkla lkyhpdknpd cgcktklisq aycvlsdpkk rdvydqggcq aikcggsgsp sfsspmdifd m ffggggrm a rcrrgknvvh qlsvtledly ngvtkklalq knvicckccg vggkkgsvek cplckgrgmq ihiqqigpgm vqqiqtvcie ckgqgerinp kdrcescsga kvirckkiie vhvckgmkdg qkilfhgcgd qcpclcpgdv iivldqkdhs vfqrrghdli mkmkiqlsca Icgfkktikt Idnrilvits kagcvikhgd Ircvrdcgmp ¡ykaplckgi liiqflvifp ckhwlslckl pqlcallppr qkvritddmd qvclkcfcpn cqnwrqhrca yccdcdgpqa gvqcqta
DNAJA4 isoforma 3 - Secuencia de ARN (SEQ ID NO: 7) acauuucagcaagcuggcuaaagacaugugggaaagccugacccuggauucaggucaaaucucagcacucacaagau
Figure imgf000021_0001
DNAJA4 isoforma 3 - Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8)
mwesltldsg qisaltrfkl isqayevlsd pkkrdvydqg geqaikeggs gspsfsspmd ifdmíTgggg rmarcrrgkn whqlsvtlc dlyngvtkkl alqknvicck ccgvggkkgs vckcplckgr gmqihiqqig pgmvqqiqtv cicckgqgcr inpkdrccsc sgakvirckk iicvhvckgm kdgqkilfhg cgdqcpclcp gdviivldqk dhsvfqrrgh dlimkmkiql scalcgfkki iktldnrilv itskagcvik hgdlrcvrdc gmpiykaple kgiliiqflv ifpekhwlsl eklpqleall pprqkvrild dmdqvelkcf cpneqnwrqh reayeedcdg pqagvqcqta
LRP1 - Secuencia de ARN (SEQ ID NO: 9)
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
ccaaaccccagccccaacuccaggggcaccuaugagauggccaugcucaaccccccucccagacaggcccucccuguc uccagggcccccaccgagguucccagggcuggagacuiiccucugguaaacauuccuccagccuccccuccccugggg acgccaaggaggugggccacacccaggaagggaaagcgggcagccccguuuuggggacgugaacguuuuaauaauu uuugcugaauuccuuuacaacuaaauaacacagauauuguuauaaauaaaauuguaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
LRP1 - Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10)
mltpplllll pllsalvaaa idapktcspk qfacrdqitc iskgwrcdgc rdcpdgsdca pcicpqskaq rcqpnchncl gtclcvpmsr Icngvqdcmd gsdegphcrc Iqgncsrlgc qhhcvptldg ptcycnssfq Iqadgktckd fdccsvygtc sqlctntdgs ficgcvegyl lqpdnrscka kncpvdrppv lliansqnil atylsgaqvs titptstrqt tamdfsyane tvcwvhvgds aaqtqlkcar mpglkgfvdc htinislslh hvcqmaidwl tgnfyfvddi ddrifvcnm gdtcvtlldl clynpkgial dpamgkvflft dygqipkvcr cdmdgqnrtk Ivdskivfph gitldlvsrl vywadayldy icvvdycgkg rqtiiqgili chlygltvfc nylyatnsdn anaqqktsvi rvnrfnstcy qwtrvdkgg alhiyhqrrq prvrshaccn dqygkpggcs dicllanshk artcrcrsgf slgsdgksck kpchclflvy gkgrpgiirg mdmgakvpdc hmipicnlmn praldfhact gfiyfadtts yligrqkidg tcrctilkdg ihnvcgvavd wmgdnlywtd dgpkktisva rlckaaqtrk tliegkmthp raiwdplng wmywtdwccd pkdsrrgrlc rawmdgshrd ¡fvtsktvlw pnglsldipa grlywvdafy drictillng tdrkivycgp clnhafglch hgnylfwtcy rsgsvyrler gvggapptvt llrserppif eirmydaqqq qvgtnkcrvn nggcsslcla tpgsrqcaca edqvldadgv tclanpsyvp ppqcqpgcfa cansrciqcr wkcdgdndcl dnsdcapalc hqhtcpsdrf kccnnrcipn rwlcdgdndc gnscdcsnat csartcppnq fscasgrcip ¡swtcdlddd cgdrsdcsas cayptcfplt qftcnngrci ninwrcdndn dcgdnsdeag cshscsstqf kcnsgrcipc hwtcdgdndc gdysdclhan ctnqatrppg gchtdcfqcr ldglciplrw rcdgdtdcmd ssdekscegv thvcdpsvkf gckdsarcis kawvcdgdnd ccdnsdccnc cslacrppsh pcanntsvcl ppdklcdgnd dcgdgsdegc Icdqcslnng gcshncsvap gcgivcscpl gmclgpdnht cqiqsycakh Ikcsqkcdqn kfsvkcscyc gwvlcpdgcs crsldpfkpf iifsnrheir ridlhkgdys vlvpglmti aldfhlsqsa lywtdv\ edk iyrgklldng altsfevviq yglatpcgla vdwiagniyw' vcsnldqicv akldgtlrtt llagdichpr aialdprdgi Ifwtdwdasl pricaasmsg agrrtvhrcl gsgg^-pnglt vdylckrilw idarsdaiys arydgsghmc vlrghcflsh pfavtlyggc vywtdwrtnt lakankwtgh nvtwqrtnt qpfdlqvyhp srqpmapnpc canggqgpcs hlclinynrt vscacphlmk Ihkdnttcyc fkkfllyarq meirgvdlda pyynyiisft vpd¡dnvt\'l dydarcqr\'y> wsdvrtqaik rafingtgvc tv'vsadlpna hglavdwAsr nifwtsydtn kkqinvarld gsfknawqg Icqphglv'vh plrgklywtd gdnií>manmd gsnrtllfsg qkgpvglaid fpcsklywis sgnhtinrcn Idgsglcvid amrsqlgkat alaimgdklw wadqvsckmg tcskadgsgs vvlmsttlv mhmkvydcsi qldhkgtnpc svnngdcsql clptsetlrs cmctagyslr sgqqacegvg sfllysvheg irgipldpnd ksdalvpvsg tslavgidfli aendtiywvd mglstisrak rdqtwrcdw tngigr\rcgi avdwiagniy wtdqgfdvic varlngsfry vvisqgldkp raitvhpckg ylfwtewgqy pricrsrldg terwlvnvs iswpngisvd yqdgklyvvcd artdkicrid Ictgcnrcw Issnnmdmfs vsvfedfiyw sdrthangsi krgskdnatd svplrtgigv qlkdikvfnr drqkgtnvca vanggcqqlc lyrgrgqrac acahgmlaed gascreyagy llysertilk sihlsdcrnl napvqpfcdp chmknviala fdyragtspg tpnriffsdi hfgniqqind dgsrritivc nvgsvcglay hrgwdtlywt syttstitrh tvdqtrpgaf eretvitmsg ddhprafvld ecqnlmfwtn wneqhpsimr aalsganvlt lickdirtpn glaidlirack lyfsdatldk icrccydgsh ryvilkscpv hpfglavy'gc hifwtdwvrr avqrankhvg snmkllrvdi pqqpmgiiav andtnsccls pcrinnggcq dlcllthqgh vncscrggri Iqddltcrav nsscraqdcf ecangecinf sltcdgvphc kdksdckpsy cnsrrckktf rqcsngrcvs nmlwcngadd cgdgsdeipc nktacgvgef rcrdgtcign ssrcnqfvdc cdasdcmncs atdcssyfrl gvkgvlfqpc ertslcyaps wvcdgandcg dysdcrdcpg vkrprcplny facpsgrcip mswtcdkcdd cchgcdcthc nkfcscaqfc cqnhrciskq wlcdgsddcg dgsdcaahcc gktcgpssfs cpgthvcvpc rwlcdgdkdc adgadcsiaa gclynstcdd refmcqnrqc ipkhfvcdhd rdcadgsdcs peceyptcgp scfrcangrc lssrqwecdg cndchdqsdc apknphctsq chkcnassqf Icssgrcvac allcngqddc gd.ssdcrgch incclsrkls gcsqdccdlk igfkcrcrpg frlkddgrtc advdccsttf pcsqrcinth gsykcicvcg yaprggdphs ckavtdccpf lifanryylr klnldgsnyt llkqglnnav aldfdyrcqm iywtdvttqg smirrmhlng snvqvlhrtg Isnpdglavd wvggnlywcd kgrdticvsk Ingayrtvlv ssglrcpral vvdvqngyly wtdwgdhsli grigmdgssr svivdtkitw pngltldyvt criywadare dyicfasldg snrhwlsqd iphifaltlf cdyvywtdwe tksinrahkt tgtnktllis tlhrpmdlhv flialrqpdvp nhpckvnngg csnlcllspg gghkcacptn fylgsdgrtc vsnctasqfv ckndkcipfw wkcdtcddcg dhsdcppdcp cfkcrpgqfq cstgictnpa ficdgdndcq dn.sdcancdi hvclpsqfkc tntnrcipgi frcngqdncg dgcdcrdcpe vtcapnqfqc sitkrciprv wvcdrdndcv dgsdcpanct qmtcgvdcfr ckdsgrcipa n\ kcdgcddc gdgsdcpkcc cdcrtccpyq frcknnrcvp grwqcdydnd cgdnsdccsc tpqpcscscf scangrciag rwkcdgdhdc adgsdckdct prcdmdqfqc ksghciplrw rcdadadcmd gsdeeacgtg vrtcpldefq cnntlckpla wkcdgeddcg dnsdcnpeec arfvcppnrp frckndrvcl wigrqcdgtd ncgdgtdccd ccpptahtth ckdkkcflcr nqrclssslr cnmfddcgdg sdccdcsidp kltscatnas ¡cgdcarcvr tckaaycacr sgfhtvpgqp gcqdincclr fgtcsqlcnn tkgghlesea rnfmkthntc kacgscyqvl yiaddneirs Ifpghphsay cqafqgdcsv ridamdvhvk agrvywtnwh tgtisyrslp paappttsnr hrrqidrgvt hlnisglkmp rgiaidwvag nvywldsgrd vievaqmkge nrktlisgmi dcphaivvdp Irgtmywsdw gnhpkictaa mdgtlrctlv qdniqwptgl avdyhncrly w adaklsvig sirlngtdpi vaadskrgls hpfsidvfcd yiygvtyinn rv fkihkfgh splvnltggl shasdwlyh qhkqpcvtnp cdrkkccwlc llspsgpvct cpngkrldng tcvpvpsptp ppdaprpgtc nlqcfnggsc flnarrqpkc rcqprytgdk celdqcwehc mggtcaasp sgmptcrcpl gftgpkctqq vcagycanns tctvnqgnqp qcrclpgflg drcqyrqcsg yccnfgtcqm aadgsrqcrc tayfegsrcc vnkesreleg acvvnkqsgd vtcnctdgrv apscltcvgh csnggsctmn skmmpccqcp phmtgprcec hvfsqqqpgh iasiliplll Ullvlvagv vfwykrrvqg akgfqhqrmt ngamnveign ptykmyegge pddvggllda dfaldpdkpt nftnpvyatl ymgghgsrhs la.stdekrel Igrgpedeig dpla
LRP8 isoforma 1 - Secuencia de ARN (SEQ ID NO: 11)
Figure imgf000028_0001
Ċ
Figure imgf000029_0001
LRP8 isoforma 1 - Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12)
mglpcpgplr Ualllllll llllqlqhla aaaadpllgg qgpakdcckd qfqcrncrci psvwrcdedd dcldhsdodd cpkktcadsd ftcdnghcih erwkcdgccc cpdgsdcsca tctkqvcpac klscgptshk cvpaswrcdg ckdccggadc agcatlcaph cfqcgnrscl aavfvcdgdd dcgdgsdcrg cadpacgpre frcggdggga cipcrwvcdr qfdcedrsdc aaelcgrpgp gatsapaaca tasqfacrsg ecvhlgwrcd gdrdckdksd cadcplgtcr gdcfqcgdgt cvlaikhcnq cqdcpdgsdc agclqglnec Ihnnggcshi etdlkigfec tcpagfqlld qktcgdidcc kdpdacsqic vnykgyfkcc cypgyemdll tknckaaagk spsliftnrh cvrridlvkr nysrlipmlk nvvaldveva tnriywcdls yrkiysaymd kasdpkeqev lidcqlhspe glavdwvhkh iywtdsgnkt ¡svatvdggr rrtlfsrnls cpraiavdpl rgfmywsdwg dqakicksgl ngvdrqtlvs dnicwpngit ldllsqrlyw vdsklhqlss idfsggnrkt lisstdflsh pfgiavfcdk vfwtdlcnea ifsanrlngl cisilacnln nphdivifhc Ikqprapdac clsvqpnggc cylclpapqi sshspkylca cpdtmwlgpd mkrc>Tapqs tstttlastm trtvpattra pgttvhrsty qnhstctpsl taavpssvsv prapsispst Ispatsnhsq hyancdskmg stvtaavigi ivpiv'viall cmsgyliwm wkrkntksmn fdnp\7rktt cccdcdclhi grtaqighvy paaissfdrp Iwacpclgct rcpcdpapal kclfvlpgcp rsqlhqlpkn plsclpvvks krvalsledd glp
LRP8 isoforma 2 - Secuencia de ARN (SEQ ID NO: 13)
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
LRP8 isoforma 2 - Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14)
mglpcpgplr llalllllll llllqlqhla aaaadpllgg qgpakdcckd qfqcmcrci psvwrcdedd dcldhsdcdd cpkktcadsd ftcdnghcih crwkcdgeee cpdgsdcsca tctkqvcpac klscgptshk cvpaswrcdg ckdccggadc agcatwlncc Ihnnggcshi ctdlkigfcc tcpagfqlld qktcgdidcc kdpdacsqic vnykgyfkcc cypgycmdll tknckaaagk spsliñnrh cvrridlvkr nysrlipmlk nwaldvcva tnriywcdls yrkiysaymd kasdpkcqcv lidcqlhspc glavdwvhkh iywtdsgnkt isvatvdggr rrtlfsmls cpraiavdpl rgfinywsdwg dqakicksgl ngvdrqtlvs dnicwpngit Idllsqrlyw vdsklhqlss, ¡dfsggnrkt lisstdflsh pfgiavfedk vfwldlenea ifsanrlngl eisilaenln nphdivifhe Ikqprapdac clsvqpnggc eylclpapqi sshspkytca cpdtmwlgpd mkrcyrapqs tstttlastm trtvpattra pgttvhrsty qnhstctpsl taavpssvsv prapsispst Ispatsnhsq hyancdskmg stvtaavigi ivpivviall cmsgyliv\ m wkrkntksmn fdnpvyrktt cccdcdclhi grtaqighvy paaissfdrp Iwacpclgct rcpedpapal kelfvlpgep rsqlhqlpkn plselpwks krvalslcdd glp
LRP8 isoforma 3 - Secuencia de ARN (SEQ ID NO: 15)
Figure imgf000032_0002
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
LRP8 isoforma 3 - Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16)
mglpepgplr llalllllll llllqlqhla aaaadpllgg qgpakdcekd qfqcmerci psvwrcdedd dcldhsdedd cpkktcadsd ftcdnghcih erwkcdgecc cpdgsdcsea tctkqvcpac klscgptshk cvpa.swrcdg ckdccggadc agcatslgtc rgdcfqcgdg tcvlaikhcn qcqdcpdgsd cagclqglnc clhnnggcsh ictdlkigfc ctcpagfqll dqktcgdidc ckdpdacsqi cvnykgyfkc ccypgycmdl Itknckaaag kspsliftnr hcvrridlvk mysrlipml knwaldvev atnriywcdl syrkiysaym dkasdpkcqc vlidcqlhsp eglavdwvhk hiywtdsgnk tisvatvdgg rrrtlfsml sepraiavdp lrgfmywsdw gdqakieksg Ingvdrqtlv sdniewpngi tldllsqrly wvdsklhqls sidfsggnrk tlisstdfls hpfgiavfcd kvfwtdlcnc aifsanrlng Icisilacnl nnphdivifh clkqprapda cclsvqpngg ccylclpapq is.shspkytc acpdtmwlgp dmkrcyrdan edskmgstvt aavigiivpi vviallcmsg yliwmwkrk ntksmnfdnp vyrktteeed cdclhigrta qighvyparv alslcddglp
LRP8 isoforma 4 - Secuencia de ARN (SEQ ID NO: 17)
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
auguugugucacacuaacugainjcugcucuuuuugucuugucauucaaguuccguuagcuucuguacgcggugccc uuugcagucuggugucucuuccagaggcgagggggcugaggauggggugcugcaucucacuagcuauacuggcauc
aaaaaaaa
LRP8 isoforma 4 - Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 18)
mglpepgplr llalllllll llllqlqhla aaaadpllgg qgpakdcckd qfqcmcrci psvwrcdedd dcldhsdcdd cpkktcadsd ftcdnghcih ci'wkcdgece cpdgsdesea tctkqvcpae klscgptshk cvpaswrcdg ckdccggadc agcatlcaph cfqcgnrscl aavfvcdgdd dcgdgsdcrg cadpacgprc frcggdggga cipcrwvcdr qfdccdrsdc aaclcgrpgp gatsapaaca tasqfacrsg ccvhlgwrcd gdrdckdksd cadcplgtcr gdcfqcgdgt cvlaikhcnq cqdcpdgsdc agclqglncc Ihnnggcshi ctdlkigfcc tcpagfqlld qktcgdidcc kdpdacsqic vnykgyfkcc cypgycmdll tknckaaagk spsliftnrh cvrridlvkr nysrlipmlk nwaldveva tnriywcdls yrkiysaymd kasdpkcqcv lidcqlhspc glavdwvhkh iywtdsgnkt isvatvdggr rrtlfsmls cpraiavdpl rgfmywsdwg dqakicksgl ngvdrqtlvs dnicwpngit Idllsqrlyw vdsklhqlss idfsggnrkt lisstdflsh pfgiavfcdk vfwtdlenca ifsanrlngl eisilaenln nphdivifhc Ikqprapdac elsvqpnggc eylclpapqi sshspkytca cpdtmwlgpd mkrcyrapqs tstttlastm trtvpattra pgttvhrsty qnhstctpsl taavpssvsv prapsispst lspatsnhsq hyancdskmg stvtaavigi ivpivviall cmsgyliwm wkrkntksmn fdnpvyrkti cccdcdclhi grtaqighvy parvalsled dglp
CTGF - Secuencia de ARN (SEQ ID NO: 19)
Figure imgf000037_0001
gucaaaacagauuguuugcaaaggggaggcaucaguguccuuggcaggcugauuucuagguaggaaaugugguagc cucacuuuuaaugaacaaauggccuuuauuaaaaacugagugacucuauauagcugaucaguuuuuucaccuggaag cauuuguuucuacuuugauaugacuguuuuucggacaguuuauuuguugagagugugaccaaaaguuacauguuu gcaccuuucuaguugaaaauaaaguguauauuuuuucuauaaaaaaaaaaaaaaaaa
CTGF - Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20)
mtaasmgpvr vafvvllalc srpavgqncs gpcrcpdcpa prcpagvslv Idgcgccrvc akqlgelcte rdpcdphkgl fcdfgspanr kigvctakdg apcifggtvy rsgcsfqssc kyqctcldga vgcmplcsmd vrlpspdcpf prrvklpgkc cccwvcdcpk dqtwgpala ayrlcdtfgp dptmirancl vqttcwsacs ktcgmgistr vtndnascrl ekqsrlcmvr pccadlccni kkgkkcirtp kiskpikfcl sgctsmktyr akfcgvctdg rcctphrttt Ipvcfkcpdg cvmkknmmfi ktcachyncp gdndifcsly yrkmygdma
LXR-a isoforma 1: secuencia de ARN (SEQ ID NO: 21)
Figure imgf000038_0001
LXR-a (NR1H3) isoforma 1: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22)
mslwlgapvp dippdsavcl wkpgaqdass qaqggsscil rccarmphsa ggtagvglca acptalltra cppscptcir pqkrkkgpap kmlgnclcsv cgdkasgfhy nvLsccgckg ffrrsvikga hyichsgghc pmdtymrrkc qccrlrkcrq agmrcccvls ccqirlkklk rqcceqahat slpprasspp qilpqlspcq Igmicklvaa qqqcnrrsfs drlrvtpwpm apdphsrcar qqrfahftel aivsvqcivd fakqlpgflq Isrcdqiall ktsaicvmll ctsrrynpgs csitflkdfs ynrcdfakag lqvcfinpif cfsramnclq Indacfalli aisifsadrp nvqdqlqver Iqhtyvealh ayvsihhphd rlmfprmlmk Ivslrtlssv hseqvfalrl qdkklpplls eiwdvhe
LXR-a (NR1H3) isoforma 2: secuencia de ARN (SEQ ID NO: 23)
Figure imgf000039_0001
LXR-a (NR1H3) isoforma 2: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24)
mslwlgapvp dippdsavcl wkpgaqdass qaqggsscil rccarmphsa ggtagvglca acptalltra cppscptcir pqkrkkgpap kmlgnclcsv cgdkasgfhy nvlsccgckg ffrrsvikga hyichsgghc pnidtymrrkc qecrlrkcrq agmreecvls eeqirlkklk rqeecqahat slpprasspp qilpqlspeq lgmicklvaa qqqcnrrsfs drlrvlvmll ctsrrynpgs csitflkdfs ynrcdfakag lqvcfmpif cfsramnclq lndacfalli aisifsadrp nvqdqlqver Iqhtyvealh ayvsihhphd rlmfprmlmk Ivslrtlssv hseqvfalrl qdkklpplls eiwdvhe
LXR-a (NR1H3) isoforma 3: secuencia de ARN (SEQ ID NO: 25)
Figure imgf000040_0001
LXR-a (NR1H3) isoforma 3: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 26)
mphsaggtag vglcaaepta lltracppsc ptcirpqkrk kgpapkmlgn clcsvcgdka sgfhynvlsc egckgfTrrs vikgahyich sgglicpmdty mrrkcqccrl rkcrqagmre ecvlseeqir Ikklkrqeee qahatslppr assppqilpq Ispcqlgmic klvaaqqqcn rrsfsdrlrv tpwpmapdph srcarqqrfa hftclaivsv qcivdfakql pgflqlsrcd qiallktsai cvmllctsrr ynpgscsitf Ikdfsynrcd fakaglqvcf inpifcfsra mnclqlndae falliaisif sadrpnvqdq Iqverlqhty vealhayvsi hhphdrlmfp rmlmklvslr tlssvhseqv falrlqdkkl ppllsciwdv he
LXR-a (NR1H3) isoforma 4: secuencia de ARN (SEQ ID NO: 27)
Figure imgf000040_0002
cuccagagcccugcccauccugccuccaccacuuccuguuuuucccacagggccccaagaaaaauucuccacugucaa aaaaaaa
LXR-a (NR1H3) isoforma 4: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 28)
mqqtswnplg gtckqppgrt hsavelwkpg aqdassqaqg gsscilrcea rmphsaggta gvgleaaept alltracpps cptcirpqkr kkgpapkmlg nclcsvcgdk asgfhynvls ccgckgffrr svikgahyic hsgghcpmdt ymrrkcqccr Irkcrqagmr cccvlsecqi rlkklkrqcc cqahatslpp rassppqilp qlspeqlgmi eklvaaqqqc nrrsfsdrlr vtpwpmapdp hsrearqqrf ahftclaivs vqcivdfakq Ipgflqlsre dqiallktsa ¡cvmllctsr rynpgscsit flkdfsynrc dfakaglqvc finpifcfsr amnclqlnda cfalliaisi fsadrpnvqd qlqvcrlqht yvcalhayvs ihhphdrlmf prmlmklvsl rtlssvhscq vfalrlqdkk Ippllsciwd vhc
LXR-b (NR1H2) isoforma 1: secuencia de ARN (SEQ ID NO: 29)
Figure imgf000041_0001
LXR-b (NR1H2) isoforma 1: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 30)
msspttssld tplpgngppq pgapsssptv kccgpcpw pg gpdpdvpgtd cassacstdw vipdpcccpc rkrkkgpapk m lghelcrvc gdkasgfhyn v lsccg ck g f frrsvvrgga rryacrgggt cqmdafmrrk cqqcrlrkck eagmreqcvl seeqirkkki rkqqqqesqs qsqspvgpqg ssssasgpga spggseagsq gsgcgcgvql taaqclmiqq lvaaqlqcnk rsfsdqpkvt pwplgadpqs rdarqqrtah ftclaiisvq eivdfakqvp gflqlgredq iallkastie imlletarry nhetecitfl kdftyskddf hraglqvefi npifefsram rrlglddacy alliainifs adrpnvqcpg rvcalqqpyv calIsytrik rpqdqlrfpr mlmklvslrt Issvhseqvf alrlqdkklp pllsciwdvh c
LXR-b (NR1H2) isoforma 2: secuencia de ARN (SEQ ID NO: 31)
Figure imgf000042_0001
LXR-b (NR1H2) isoforma 2: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 32)
msspttssld tplpgngppq pgapsssptv kccgpepwpg gpdpdvpgtd cassacstdw gvlsccqirk kkirkqqqqc sqsqsqspvg pqgssssasg pgaspggsca gsqgsgcgcg vqltaaqelm iqqlvaaqlq cnkrsfsdqp kvtpwplgad pqsrdarqqr fahftelaii svqeivdfak qvpgflqlgr cdqiallkas ticimlleta rrynhetcci tflkdftysk ddfhraglqv cfinpifcfs ramrrlgldd acyalliain ifsadtpnvq cpgrvcalqq pyvcallsyt rikrpqdqlr fprmlmklvs Irtlssvhsc qvfalrlqdk klppllseiw dvhc
Secuencia de has-miR-199a-1 (SEQ ID NO: 33)
G CCA ACC CA G U G U U CA G A CU A CC U G U U C AG G A G G CU CU CA A U G U G U AC AG U AG U CU G CA CALU G G U U A G G C
Secuencia de has-miR-199a-2 (SEQ ID NO: 34)
AG G AAG CU U CU G GAGAU CCU G CU CCGU CG CCCCAG U G U U CAG ACU ACCU GU U C AG G ACAALG CCG U U G U ACAG U AG U CL’G CACAU U G GU U AG ACU G GG CAAG G G A G A G C A
Secuencia de has-miR-1908 (SEQ ID NO: 35)
CG GG AAU G CCG CG GCGG GG ACG G CGAU U GG U CCGL'AU G U G U G GU GCCACCG G CC G C C G G C U C C G C C C C G G C C C C C G C C C C
Secuencia de has-miR-7-1 (SEQ ID NO: 36)
UU GGAU GU UGGCCUAGUUCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUUUU A G A U A A C U A A A U C G A C A A C A A A U C A C A G U C U G C C A U A U G G C A C A G G C C A U G CCU CU ACAG
Secuencia de has-miR-7-2 (SEQ ID NO: 37)
c u g g a u a c a g a g u g g a c c g g c u g g c c c c a u c u g g a a g a c u a g u g a u u u u g u U G U U G U CU U ACU G CG CU CAACAACAAAU CCCAG U CU ACCU AAU G G U G CCAG CCAU CG CA
Secuencia de has-miR-7-3 (SEQ ID NO: 38)
AGAU U AG AG U GGCU GU GGU CU AGU GCU GU GU GGAAGACU AGU GAU U U U GU U G U U C U G A U G U A C U A C G A C A A C A A G U C A C A G C C G G C C U C A U A G C G C A G A C U CCCU U CG AC
Secuencia de miR-Zip 199a-3p (SEQ ID NO: 39)
G A T C C G A C A G TA G C C TG C A C A TT A G TC A C TTC C TG TC A G TA A C C A A TG TG C A G ACT ACTGTTTTTTG AATT
Secuencia de miR-Zip 199a-5p (SEQ ID NO: 40)
G A T C C G C C C A G T G C T C A G A C T A C C C G T G C C T T C C T G T C A G G A A C A G G T A G T C T GA A C A C TG G G TTTTTG A A TT
Secuencia de miR-Zip 1908 (SEQ ID NO: 41)
G A TC C G C G G CG G G A A CG G CG ATC G G CCCTTCCTG TCA G G AC CA ATCG CC G TCC CCG CCG TTTTTG AATT
Secuencia de miR-Zip 7 (SEQ ID NO: 42)
G A T C C G T G G A A G A T T A G T G A G T T T A T T A T C T T C C T G T C A G A C A A C A A A A T C A C TA G TCTTCC ATTTTTG A A T T
Los miembros de esta red pueden usarse como dianas para tratar melanoma metastásico. Además, los miembros pueden usarse como biomarcadores para determinar si un sujeto tiene, o está en riesgo de tener, un melanoma metastásico o para determinar un pronóstico o seguimiento del paciente que tiene el trastorno. De acuerdo con esto, la presente descripción engloba métodos para tratar melanoma metastásico por la toma como diana de uno o más de los miembros, métodos para determinar la eficacia de los regímenes terapéuticos para inhibir el cáncer, y métodos para identificar un agente anticancerosos. También se proporcionan métodos para diagnosticar si un sujeto tiene, o está en riesgo de tener, melanoma metastásico, y métodos para cribar sujetos que se piensa que están en riesgo de desarrollar el trastorno. La descripción también engloba varios kits adecuados para llevar a cabo los métodos mencionados anteriormente.
Polipéptidos ApoE
El término "polipéptido o péptido", tal y como se usa en la presente memoria, incluye versiones de fusión o quiméricas producidas recombinantemente o sintéticamente de cualquiera de los supresores de metástasis mencionados anteriormente, que tienen los dominios o partes particulares que están implicados en la red. El término también engloba un análogo, fragmento, elongación o derivado del péptido (p. ej., que tienen una metionina añadida en el amino terminal, útil para la expresión en células procariotas).
"Polipéptido de apolipoproteína o polipéptido ApoE", tal y como se usa en la presente memoria, significa un péptido, fármaco, o compuesto que mimetiza una función de la apolipoproteína nativa bien in vivo o in vitro incluyendo análogos, fragmentos, elongaciones o derivados de la apolipoproteína que son un péptido con una longitud de entre 10 y 200 residuos de aminoácidos, dichos péptidos pueden contener aminoácidos bien naturales, o no naturales, que contienen enlaces amida. Los fragmentos de péptidos de apolipoproteína pueden modificarse para mejorar su estabilidad o biodisponibilidad in vivo como se conoce en la técnica y pueden contener compuestos orgánicos unidos a las cadenas laterales de los aminoácidos a través de una variedad de enlaces.
En un aspecto, la descripción es un método para usar un péptido apoEp1.B aislado que tiene la secuencia de aminoácidos TQQIRLQa EiFQAR (murino) (SEQ. ID. No. 43) o a Qq IRlQa EAFQAR (humano) (SEQ. ID. No. 44) o un análogo, fragmento, elongación o derivado del péptido. La descripción también incluye una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido apoEpI.B, o un análogo, fragmento, elongación o derivado del mismo.
El término "análogo" incluye cualquier péptido que tiene una secuencia de residuos de aminoácidos sustancialmente idéntica al péptido nativo en la que uno o más residuos se han sustituido conservativamente con un residuo con una funcionalidad similar y que presenta la capacidad de mimetizar al péptido nativo. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrofóbico) tal como alanina, isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la sustitución de un residuo básico tal como lisina, arginina o histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro.
La expresión "sustitución conservativa" también incluye el uso de un residuo derivatizado químicamente en lugar de un residuo no derivatizado, siempre que dicho polipéptido presente la actividad requerida. Los análogos de los péptidos incluyen péptidos que tienen las siguientes secuencias: TAQIRLQAEIFQAR (SEQ.ID.NO.:45); TQAIRLQAEiFq AR (SEQ.ID.NO.:46); TQQARLQAEIFQAR (SEQ.ID.NO.:47) y TQQIALQAEIFQAR (SEQ.ID.NO.:48).
"Derivado" se refiere a un péptido que tiene uno o más residuos derivatizados químicamente por la reacción de un grupo lateral funcional. Dichas moléculas derivatizadas incluyen, por ejemplo, aquellas moléculas en las que los grupos amino libres se han derivatizado para formar hidrocloruros de amina, grupos p-toluenosulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, ésteres de metilo y etilo u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno de imidazol de la histidina puede derivatizarse para formar N-im-bencilhistidina. También se incluyen como derivados los péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar. Para ejemplos: la 4-hidroxiprolina puede sustituirse con prolina; la 5-hidroxilisina puede sustituirse con lisina; la 3-metilhistidina puede sustituirse con histidina; la homoserina puede sustituirse con serina; y la ornitina puede sustituirse con lisina. Los polipéptidos de la presente descripción también incluyen cualquier polipéptido que tiene una o más adiciones y/o deleciones o residuos respecto a la secuencia de un polipéptido cuya secuencia se muestra en la presente memoria, siempre que se mantenga la actividad requerida.
El término "fragmento" se refiere a cualquier péptido objeto que tiene una secuencia de residuos de aminoácidos más corta que la de un péptido cuya secuencia de residuos de aminoácidos se muestra en la presente memoria.
El término "elongación" se refiere a cualquier péptido objeto que tiene una secuencia de aminoácidos más larga por uno o más aminoácidos (bien en el extremo carboxi o amino terminal) que la de un péptido de la presente descripción. Preferiblemente, la elongación se produce en el extremo amino terminal. Los fragmentos y elongaciones de los péptidos incluyen péptidos que tienen las siguientes secuencias: QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ.ID.NO.:49) y QQIRLQAEIFQAR (SEQ.ID.NO.:50).
Los polipéptidos ApoE y los métodos para su preparación se describen en la patente de EE.UU. No. 6.652.860.
Agonistas de LXR (Solo la materia abarcada por el alcance de las reivindicaciones forma parte de la invención).
Los métodos de la descripción pueden incluir administrar un agonista de LXR para la prevención y tratamiento de metástasis. El agonista de LXR puede ser un compuesto según la Fórmula I, II, III, o IV mostradas a continuación.
La Fórmula I se proporciona a continuación:
Figure imgf000044_0001
Fórmula I
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en donde
Ar es un grupo arilo;
R1 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en
-OH, -CO2 H, -O-alquilo(C1-C7), -OC(O)- , -alquilo(C1-C7), -O-heteroalquilo(CrC7), -OC(O)-heteroalquilo(C1-C7), -NH2 , -NHalquilo(C1-C7), -N(alquilo(C1-C7))2 y -NH-S(O)2alquilo(CrC5);
R2 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en
alquilo(C1-C7 ), heteroalquilo(C1-C7 ), arilo y arilalquilo(C1-C7 );
X1, X2, X3, X4, X5 y X6 son cada uno independientemente un miembro seleccionado del grupo que consiste en:
H, alquilo(C1-C5), heteroalquilo(C1-C5), F y CI, con la condición de que no más de tres de X1 a X6 son H, alquilo(C1-C5), heteroalquilo(C1-C5); e
Y es un grupo conector divalente seleccionado del grupo que consiste en:
-N(R12)S(O)m-, -N(R12)S(O)mN(R13)-, -N(R12)C(O)-, -N(R12)C(O)N(R13)-, - N(R12)C(S)-y -N(R12)C(O)O-;
en donde R12 y R13 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en:
H, alquilo(C1-C7 ), heteroalquilo(C1-C7), arilo y arilalquilo(C1-C7 ), y opcionalmente cuando Y es -N(R12)S(O)m- o -N(R12)S(O)mN(R13)-, R12 forma un anillo de cinco o seis miembros fusionado a A ro a R 2a través de la unión covalente a Ar o a R2 , respectivamente; y el subíndice m es un número entero de 1 a 2;
con la condición de que cuando R1 es OH, e -Y-R2 es -N(R12)S(O)m-R2 o -N(R12)C(O)N(R13)-R2 y está unido a una posición para respecto al carbono cuaternario unido a Ar, y cuando R2 es fenilo, bencilo, o benzoilo, entonces i) al menos uno de R12 o R13 es distinto de hidrógeno y contiene un sustituyente aceptor de electrones, o ii) R2 está sustituido con un resto distinto de amino, acetamido, dialquil(C1-C7 )amino, alquil(C1-C7 )amino, halógeno, hidroxi, nitro, o alquilo(C1-C7 ), o iii) la parte de anillo benceno de R2 está sustituida con al menos tres grupos seleccionados independientemente además del grupo Y o punto de unión a Y.
En algunas realizaciones, Y es -N(R12)S(O)2- y R1 es OH.
De acuerdo con esto, los compuestos de Fórmula I incluyen, pero no están limitados a, el compuesto con la estructura mostrada a continuación:
Figure imgf000045_0001
Los compuestos de Fórmula I pueden sintetizarse como se describe en la patente de EE.UU. No. 6.316.503.
La Fórmula II se proporciona a continuación:
Figure imgf000045_0002
en donde:
R1 es -H;
X1 es un enlace, alquilo C
-CR8(OC(O)R9)-, -C=NOR
Figure imgf000046_0001
R2 es H, alquilo C1 a Ca, alquenilo C2 a Ca, alquinilo C2 a Ce, cicloalquilo C3 a Ce, -CH2OH, arilalquilo C7 a C11 , fenilo, naftilo, perfluoroalquilo Ci a C3 , CN, C(O)NH2 , CO2 R12 o fenilo sustituido independientemente con uno o más de los grupos seleccionados independientemente de alquilo Ci a C3 , alquenilo C2 a C4 , alquinilo C2 a C4 , alcoxi Ci a C3 , perfluoroalquilo Ci a C3 , halógeno, -NO2 , -NR8R9, -CN, -OH, y alquilo Ci a C3 sustituido con 1 a 5 flúor, o R2 es un heterociclo seleccionado del grupo que consiste en piridina, tiofeno, bencisoxazol, benzotiofeno, oxadiazol, pirrol, pirazol, imidazol, y furano, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente con uno a tres grupos seleccionados independientemente de alquilo Ci a C3 , alcoxi Ci a C3 , perfluoroalquilo Ci a C3 , halógeno, -NO2 , -NR8R9, -CN, y alquilo Ci a C3 sustituido con i a 5 flúor;
X2 es un enlace o -CH2-;
R3 es fenilo, naftilo, o fenilo o naftilo sustituido independientemente con uno a cuatro grupos seleccionados independientemente de alquilo Ci a C3 , hidroxi, fenilo, acilo, halógeno, - NH2 , -CN, -NO2 , alcoxi Ci a C3 , perfluoroalquilo Ci a C3 , alquilo Ci a C3 sustituido con i a 5 flúor, NRi4Ri5, -C(O)Ri0, -C(O)NRi0Ri i , -C(O)NRi i A, -CeCR8, -CH=CHR8, -WA, -CECA, -CH=CHA, -WYA, - WYNRi i -A, -WYRi0, -WY(CH2)jA, -WCHRi i (CH2)jA, -W(CH2)jA, -W(CH2)jRi0, - CHRi iW(CH2)jRi0, -CHRi iW(CH2 )jA, -CHRi i NRi2YA, -CHRi i NRi2YRi0, pirrol, - W(CH2 )jA(CH2 )kD(CH2 )pZ, -W(CRi8Ri9)A(CH2)kD(CH2)pZ, -(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ, -CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ, -CECA(CH2)kD(CH2)pZ, -W(CH2)jCECA(CH2)kD(CH2)pZ, y -W(CH2 )jZ, o R3 es un heterociclo seleccionado de pirimidina, tiofeno, furano, benzotiofeno, indol, benzofurano, bencimidazol, benzotiazol, benzoxazol, y quinolina, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente con uno a tres grupos seleccionados independientemente de alquilo Ci a C3 , alcoxi Ci a C3 , hidroxi, fenilo, acilo, halógeno, -NH2 , -CN, -NO2 , perfluoroalquilo Ci a C3 , alquilo Ci a C3 sustituido con i a 5 flúor, -C(O)Ri0, -C(O) NRi0Ri i , -C(O)NRi i A, -CeCR8, -CH=CHR8, -WA, -CECA, -CH=CHA, -WYA, -WYRi0, - WY(CH2)jA, -W(CH2)jA, -W(CH2)jRi0 , -CHRi iW(CH2)jRi0, -CHRi iW(CH2)jA, -CHRi i NRi2YA, -CHRi i NRi2YRi0, -WCHRi i (CH2)jA, -W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ, -W(CRi8Ri9)A(CH2)kD(CH2)pZ, -(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ, -CH=CHA(CH2 )kD(CH2 )pZ, -CECA(CH2 )kD(CH2 )pZ, -W(CH2 )jCECA(CH2 )kD(CH2 )pZ, y -W(CH2 )jZ;
W es un enlace, -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NR11-, o -N(CORi2)-;
Y es -CO-, -S(O)2-, -CONR13,-CONR13CO-, -CONR13SO2-, -C(NCN)-, -CSNR13, - C(NH)NR13, o -C(O)O-;
j es 0 a 3;
k es 0 a 3;
t es 0 a 2;
D es un enlace, -CH=CH-, -CEC-, -C=,-C(O)-, fenilo, -O-, -NH-, -S-, -CHR14-, - CR14R15-, -OCHR14, -OCR14R15-, o -CH(OH)CH(OH)-;
p es 0 a 3;
Z es -CO2 R11 , -CONR10R11, -C(NR10)NR11R12, -CONH2 NH2 , -CN, -CH2OH, -NRiaR17, fenilo, CONHCH(R20)COR12, ftalamida, pirrolidina-2,5-diona, tiazolidina-2,4-diona, tetrazolilo, pirrol, indol, oxazol, 2-tioxo-1,3-tiazolinin-4-ona, aminas Ci a C7 , aminas cíclicas C3 a C7 , o alquilo Ci a C3 sustituido con uno a dos grupos OH; en donde dicho pirrol está sustituido opcionalmente con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en -CO2 CH3 , -CO2 H, -COCH3 , -CONH2 , y -CN;
en donde dichas aminas Ci a C7 están sustituidas opcionalmente con uno a dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en -OH, halógeno, -OCH3 , y -CeCH;
en donde dicho fenilo está sustituido opcionalmente con CO2 R11 , y en donde dichas aminas cíclicas C3 a C7 están sustituidas opcionalmente con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en -OH, -CH2 OH, alquilo Ci a C3 , -CH2OCH3 , -CO2 CH3 , y -CONH2 , y en donde dicho oxazol está sustituido opcionalmente con CH2 CO2 R11 ;
A es fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indano o bifenilo, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente con uno a cuatro grupos seleccionados independientemente de halógeno, alquilo Ci a C3 , alquenilo C2 a C4 , alquinilo C2 a C4 , acilo, hidroxi, halógeno, -CN, -NO2 , -CO2 R11 , - CH2 CO2 R11 , fenilo, perfluoroalcoxi Ci a C3 , perfluoroalquilo Ci a C3 , -NR10R11, - CH2 NR10R11, -SR11, alquilo Ci a Ce sustituido con 1 a 5 flúor, alquilo Ci a C3 sustituido con 1 a 2 grupos -OH, alcoxi Ci a Ce sustituido opcionalmente con 1 a 5 flúor, o fenoxi sustituido opcionalmente con 1 a 2 grupos CF3 ; o
A es un heterociclo seleccionado de pirrol, piridina, piridina-N-óxido, pirimidina, pirazol, tiofeno, furano, quinolina, oxazol, tiazol, imidazol, isoxazol, indol, benzo[1,3]-dioxol, benzo[1,2,5]-oxadiazol, isocromen-1-ona, benzotiofeno, benzofurano, 2,3-di- 5 hidrobenzo[1,4]-dioxina, biteinilo, quinazolin-2,4-9[3H]diona, y 3-H-isobenzofuran-1-ona, cada
uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente con uno a tres grupos seleccionados independientemente de halógeno, alquilo ¿ 1 a C3 , acilo, hidroxi, -CN, -NO2 , perfluoroalquilo C1 a C3 , -NR10R11, -CH2 NR10R11, -SR11, alquilo C1 a C3 sustituido con 1 a 5 flúor, y alcoxi Ci a C3 sustituido opcionalmente con 1 a 5 flúor;
R4, R5, y R6 son cada uno, independientemente, -H o -F;
R7 es alquilo C1 a C4 , perfluoroalquilo C1 a C4 , halógeno, -NO2 , -CN, fenilo o fenilo sustituido con uno o dos grupos seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1 a C2 y OH;
con la condición de que si X 1 R2 forma hidrógeno, entonces R3 se selecciona de:
(a) fenilo sustituido con -W(CH2 )jA(CH2 )kD(CH2 )pZ, -W(CR18R19)A(CH2 )kD(CH2 )pZ, -(CH2 )jWA(CH2 )kD(CH2 )pZ, -CH=CHA(CH2 )kD(CH2 )pZ, -CECA(CH2 )kD(CH2 )pZ, o - W(CH2 )jC=CA(CH2 )kD(CH2 )pZ, en donde el resto fenilo está además sustituido opcionalmente con uno o dos grupos seleccionados independientemente de alquilo C1 a C2 , perfluoroalquilo C1 a C2 , halógeno, y CN; y
(b) un heterociclo seleccionado de pirimidina, tiofeno, y furano, cada uno de los cuales está sustituido con uno de -W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ, -W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ, -(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ, -CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ, -CECA(CH2 )kD(CH2 )pZ, o -W(CH2 )jC=CA(CH2 )kD(CH2 )pZ;
cada R8 es independientemente -H, o alquilo C1 a C3 ;
cada R9 es independientemente- H, o alquilo C1 a C3 ;
cada R10 es independientemente -H, -CH, alcoxi C1 a C3 , alquilo C1 a C7 , alquenilo C3 a C7 , alquinilo C3 a C7 , cicloalquilo
C3 a C7 , -CH2 CH2OCH3 , 2-metil-tetrahidro-furano, 2-metil-tetrahidro-pirano, 4-metil-piperidina, morfolina, pirrolidina, o
fenilo sustituido opcionalmente con uno o dos grupos alcoxi C1 a C3 , en donde dicho alquilo C1 a C7 está sustituido opcionalmente con 1, 2 o 3 grupos seleccionados independientemente de alcoxi C1 a C3 , tioalcoxi C1 a C3 , y CN;
cada R11 es independientemente -H, alquilo C1 a C3 o R22; o R10 y R11, cuando están unidos al mismo átomo, forman
junto con dicho átomo:
un anillo saturado de 5 a 7 miembros, sustituido opcionalmente con 1 a 2 grupos seleccionados independientemente
de alquilo C1 a C3 , OH y alcoxi C1-C3 ; o un anillo de 5 a 7 miembros que contiene 1 o 2 heteroátomos,
sustituido opcionalmente con 1 a 2 grupos seleccionados independientemente de alquilo C1 a C3 , OH y alcoxi C1-C3 ;
cada R12 es independientemente -H, o alquilo C1 a C3 ;
cada R13 es independientemente -H, o alquilo C1 a C3 ;
cada R14 y R15 es, independientemente, alquilo C1 a C7 , cicloalquilo C3 a C8, alquenilo C2 a C7 , alquinilo C2 a C7 , -CH,
-F, arilalquilo C7 a C14 , donde dicho arilalquilo está sustituido opcionalmente con 1 a 3 grupos seleccionados independientemente de NO2 , alquilo C1 a C6, perhaloalquilo C1 a C3 , halógeno, CH2 CO2 R11 , fenilo y alcoxi C1 a C3 , o
R12 y R15 junto con el átomo al que están unidos pueden formar un anillo saturado de 3 a 7 miembros;
cada R16 y R17 es, independientemente, hidrógeno, alquilo C1 a C3 , alquenilo C1 a C3 , alquinilo C1 a C3 , o cicloalquilo C3 a C8, en donde dicho alquilo C1 a C3 está sustituido opcionalmente con un grupo OH, y en donde
dicho bencilo está sustituido opcionalmente con 1 a 3 grupos seleccionados de alquilo C1 a C3 y alcoxi C1 a C3 ; o R16 y R17, junto con el átomo al que están unidos, pueden formar un heterociclo de 3 a 8 miembros que está sustituido opcionalmente con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo C1 a
C3 , -OH, CH2 OH, -CH2OCH3,-CO2CH3, y -CONH2 ;
cada R18 y R19 es, independientemente, alquilo C1 a C3 ;
cada R20 es independientemente H, fenilo, o la cadena lateral de un alfa aminoácido natural;
cada R22 es independientemente arilalquilo sustituido opcionalmente con CH2 COOH; y
cada R23 es fenilo;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los compuestos de Fórmula II pueden sintetizarse como se describe en la patente de EE.UU. No. 7.576.215. El compuesto de fórmula II puede ser cualquiera de los compuestos 26-32, o una sal farmacéuticamente aceptable de
los mismos.
Figure imgf000048_0001
La Fórmula III se proporciona a continuación:
Figure imgf000049_0001
Fórmula III
en donde:
X se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-C8 , halo, -OR10, -NR10R11, nitro, ciano, -COOR10, o -COR10.
Z es CH, CR3 o N, en donde cuando Z es CH o CR3, k es 0-4 y t es 0 o 1, y cuando Z es N, k es 0-3 y t es 0;
Y se selecciona de -O-, -S-, -N(R12)-, y -C(R4)(R5)-;
W 1 se selecciona de alquilo C1-C6 , alquilo Co-C6, cicloalquilo C3-C6 , arilo y Het, en donde dicho alquilo C1-C8 , cicloalquilo C3-C8 , Ar y Het están opcionalmente no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos seleccionados independientemente de halo, ciano, nitro, alquilo C1-C6 , alquenilo C3-C6 , alquinilo C3-C6 ,-alquilo C0-C6-CO2 R12 , -alquilo C0-C6-C(O)SR12, -alquilo C0-C6-CONR13R14, -alquilo C0-C6-COR15 , -alquilo C0 -C6-NR13R14, -alquilo C0-C6-SR12 , -alquilo C0-C6-OR12 , -alquilo C0-C6-SO3 H, -alquilo C0-C6-SO2 NR13R14, -alquilo C0-C6-SO2 R12 , -alquilo C0 -C6-SOR15 , -alquilo C0-C6-OCOR15, -alquilo C0 -C6-OC(O)NR13R14, -alquilo C0-C6-OC(O)OR15, -alquilo C0-C6-NR13C(O)OR15, -alquilo C0-C6-NR13C(O)NR13R14, y -alquilo C0 -C6-NR13Co R15, donde dicho alquilo C1-C6 , está opcionalmente no sustituido o sustituido con uno o más sustituyentes halo;
W2 se selecciona de H, halo, alquilo C1-C6 , alquenilo C2-C6 , alquinilo C2-C6 , -alquilo C0-C6 -NR13R14, -alquilo C0-C6-SR12, -alquilo C0-C6-OR12, -alquilo C0-C6-CO2 R12, -alquilo C0-C6-C(O)SR12, -alquilo C0-C6-CONR13R14, -alquilo C0-C6-COR15, -alquilo C0-C6-OCOR15 , -alquilo C0-C6-OCONR13R14, -alquilo C0-C6-NR13CONR13R14, -alquilo C0-C6-NR13COR15, -alquilo C0-C6-Het, -alquilo C0-C6-A ry -alquilo C0-C6 -cicloalquilo C3-C7 , en donde dicho alquilo C1-C6 está opcionalmente no sustituido o sustituido con uno o más sustituyentes halo, y en donde los restos cicloalquilo C3-C7 , Ar y Het de dicho -alquilo C0-C6-Het, -alquilo C0-C6 -Ar y -alquilo C0-C6-cicloalquilo C3-C7 están opcionalmente no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos seleccionados independientemente de halo, ciano, nitro, alquilo C 1-C6 , alquenilo C3-C6 , alquinilo C3-C6 , -alquilo C0-C6-CO2 R12, -alquilo C0-C6-C(O)SR12 , -alquilo C0-C6-CONR13R14, -alquilo C0-C6-COR15, -alquilo C0-C6-NR13R14, -alquilo C0-C6-SR12 , -alquilo C0-C6-OR12, -alquilo C0-C6-SO3 H, -alquilo C0-C6-SO2 NR13R14, -alquilo C0-C6-SO2 R12, -alquilo C0-C6 -SOR15, -alquilo C0-C6-OCOR15, -alquilo C0-C6-OC(O)NR13R14, -alquilo C0-C6-OC(O)OR15, -alquilo C0-C6-NR13C(O)OR15, -alquilo C0 -C6-NR13C(O)NR13R14, y -alquilo C0-C6-NR13COR15, donde dicho alquilo C1-C6 , está opcionalmente no sustituido o sustituido con uno o más sustituyentes halo;
W3 se selecciona del grupo que consiste en: H, halo, alquilo C1-C6 , -alquilo C0-C6-NR13R14, -alquilo C0-C6-SR12, -alquilo C0-C6-OR12 , -alquilo C0-C6-CO2 R12 , -alquilo C0-C6-C(O)SR12, -alquilo C0-C6-CONR13R14, -alquilo C0 -C6-COR15 , -alquilo C0-C6 -OCOR15, -alquilo C0-C6-OCONR13R14, -alquilo C0-C6 -NR13CONR13R14, -alquilo C0-C6-NR13COR15, -alquilo C0-C6-Het, -alquilo C1-C6-Ar y -alquilo C1-C6-cicloalquilo C3-C7 , en donde dicho alquilo C1-C6 está opcionalmente no sustituido o sustituido con uno o más sustituyentes halo;
Q se selecciona de cicloalquilo C3 -C8 , Ar y Het; en donde dicho cicloalquilo C3-C8 , Ar y Het están opcionalmente no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos seleccionados independientemente de halo, ciano, nitro, alquilo C 1-C6 , alquenilo C3-C6 , alquinilo C3 -C6 , -alquilo C0-C6-CO2 R12, -alquilo C0-C6 -C(O)SR12, -alquilo C0-C6-CONR13R14, -alquilo C0-C6-COR15, -alquilo C0-C6-n R13R14, -alquilo C0-C6-SR12 , -alquilo C0-C6-OR12, -alquilo C0-C6-SO3 H, -alquilo C0-C6-SO2 NR13R14, -alquilo C0-C6-SO2 R12, -alquilo C0-C6 -SOR15, -alquilo C0-C6-OCOR15, -alquilo C0-C6-OC(O)NR13R14, -alquilo C0-C6-OC(O)OR15, -alquilo C0-C6-NR13C(O)OR15, -alquilo C0 -C6-NR13C(O)NR13R14, y -alquilo C0-C6-NR13COR15, donde dicho alquilo C1-C6 está opcionalmente no sustituido o sustituido con uno o más sustituyentes halo; p es 0-8;
n es 2-8;
m es 0 o 1;
q es 0 o 1;
t es 0 o 1;
cada R1 y R2 se seleccionan independientemente de H, halo, alquilo C1-C6 , alquenilo C3-C6 , alquinilo C3-C6 , -alquilo Co-C6-n R13R14, -alquilo C0-C6-OR12 , -alquilo C0-C6-SR12 , -alquilo C1-C6-Het, -alquilo C1-Ca-Ar y -alquilo C1-Cacicloalquilo C3 -C7 , o R1 y R2 junto con el carbono al que están unidos forman un anillo carbocíclico o heterocíclico de 3-5 miembros, en donde dicho anillo heterocíclico contiene uno, o más heteroátomos seleccionados de N, O, y S, donde cualquiera de dicho alquilo C1-C6 está opcionalmente no sustituido o sustituido con uno o más sustituyentes halo;
cada R3 es el mismo o diferente y se selecciona independientemente de halo, ciano, nitro, alquilo C1-C6 , alquenilo C3-Ca, alquinilo C3-C6 , -alquilo Co-C6-Ar, -alquilo Co-C6-Het, -alquilo Co-C6-cicloalquilo C3-C7 , -alquilo Co-C6-CO2R12, -alquilo Co-Ca-C(O)SR12, -alquilo Co-Ca-CONR13R14, -alquilo Co-Ca-COR15, -alquilo Co-Ca-NR13R14, -alquilo Co-Ca-SR12, -alquilo Co-Ca-OR12, -alquilo Co-Ca-SO3 H, -alquilo Co-Ca-SO2 NR13R14, -alquilo Co-Ca-SO2 R12, -alquilo Co-Ca-SOR15, -alquilo Co-Ca-OCOR15, -alquilo Co-Ca-OC(O)NR13R14, -alquilo Co-Ca-OC(O)OR15, -alquilo Co-Ca-NR13C(O)OR15, -alquilo Co-Ca-NR13C(O)NR13R14, y -alquilo Co-Ca-NR13COR15, en donde dicho alquilo C1-Caestá opcionalmente no sustituido o sustituido con uno o más sustituyentes halo;
cada R4 y R5 se selecciona independientemente de H, halo, alquilo C1-Ca, -alquilo Co-Ca-Het, -alquilo Co-Ca-Ar y -alquilo Co-Ca-cicloalquilo C3-C7 ;
Ra y R7 se seleccionan cada uno independientemente de H, halo, alquilo C1-Ca, -alquilo Co-Ca-Het, -alquilo Co-Ca-Ary -alquilo Co-Ca-cicloalquilo C3-C7 ;
R8 y R9 se seleccionan cada uno independientemente de H, halo, alquilo C1-Ca, -alquilo Co-Ca-Het, -alquilo Co-Ca-Ar y -alquilo Co-Ca-cicloalquilo C3-C7 ;
R10 y R11 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo C1-C12 , alquenilo C3-C12 , alquinilo C3 -C12 , -alquilo Co-C8-Ar, -alquilo Co-C8-Het, -alquilo Co-C8-cicloalquilo C3-C7 , -alquilo Co-C8-O-Ar, -alquilo Co-C8-O-Het, -alquilo C0-C8-O-cicloalquilo C3-C7 , -alquilo Co-C8-S(O)x-alquilo Co-Ca, -alquilo Co-C8-S(O)x-Ar, -alquilo Co-C8-S(O)x-Het, -alquilo Co-C8-S(O)x-cicloalquilo C3-C7 , -alquilo Co-C8-NH-Ar, -alquilo Co-C8-NH-Het, -alquilo Co-C8-NH-cicloalquilo C3-C7 , -alquilo Co-C8-N(alquilo C1-C4 )-Ar, -alquilo Co-C8-N(alquilo C1-C4 )-Het, -alquilo Co-C8-N(alquilo C1-C4-cicloalquilo C3-C7 , -alquilo Co-C8-Ar, -alquilo Co-C8-Het y -alquilo Co-C8-cicloalquilo C3-C7 , donde x es 0, 1, o 2, o R10 y R11, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico de 4-7 miembros que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados de N, O, y S, en donde dicho alquilo C1-C12 , alquenilo C3-C12 , o alquinilo C3-C12 está sustituido opcionalmente con uno o más de los sustituyentes seleccionados independientemente del grupo halo,-OH, -SH, -NH2 , -NH(alquilo C1-Ca no sustituido), -N(alquilo C1-Ca no sustituido)(alquilo C1-Ca no sustituido), -Oalquilo C1-Cano sustituido, -CO2 H, -CO2(alquilo C1-Ca no sustituido), -CONH2 , -CONH(alquilo C1-Ca no sustituido), - CON(alquilo C1-Ca no sustituido)(alquilo C1-Ca no sustituido), -SO3 H, -SO2 NH2 , -SO2 NH(alquilo C1-Ca no sustituido) y -SO2 N(alquilo C1-Cano sustituido)(alquilo C1-Ca no sustituido);
R12 se selecciona de H, alquilo C1-Ca, alquenilo C3-Ca, alquinilo C3-Ca, -alquilo Co-Ca-Ar, -alquilo Co-Ca-Het y -alquilo Co-Ca-cicloalquilo C3-C7 ;
cada R13 y cada R14 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-Ca, alquenilo C3 -Ca, alquinilo C3-Ca, -alquilo Co-Ca-Ar, -alquilo Co-Ca-Het y -alquilo Co-Ca-cicloalquilo C3-C7 , o R13 y R14 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-7 miembros que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados de N, O, y S;
y R15 se selecciona de alquilo C1-Ca, alquenilo C3-Ca, alquinilo C3-Ca, -alquilo Co-Ca-Ar, -alquilo Co-Ca-Het y -alquilo Co-Ca-cicloalquilo C3-C7 ;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, X es hidrógeno, p es 0, t es 0, Z es CH, e Y es -O-.
En realizaciones adicionales, X es hidrógeno, p es 0, t es 0, Z es CH, e Y es -O-, W 1 y W2 son fenilo, W3 es hidrógeno, q es 1, y R8 y R9 son hidrógeno.
En otras realizaciones, X es hidrógeno, p es 0, t es 0, Z es CH, e Y es -O-, W 1 y W2 son fenilo, W3 es hidrógeno, q es 1, R8 y R9 son hidrógeno, y Q es Ar.
De acuerdo con esto, los compuestos de Fórmula III incluyen, pero no están limitados a, los compuestos con las estructuras mostradas a continuación GW39a52 y SB742881 25:
Figure imgf000051_0001
Los compuestos de Formula III pueden sintetizarse como se describe en la patente de EE.UU. No. 7.365.085 y 7.560.586 incorporadas en la presente memoria por referencia.
La Fórmula IV se muestra a continuación:
Figure imgf000051_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en donde:
J11 es-N= y J21 es -CR300-, o J11 es -CR200- y J21 es =N-;
R00 es G1 , G21 , o RN;
R200 es G 1 , G21 o Rc;
R300 y R400 son independientemente Rc o Q, con la condición de que uno y solo uno de R300 , R400 , y R500 sea Q;
Q es cicloalquilo C3 -6 , heteroarilo o heterociclilo, cada uno sustituido opcionalmente con 1 a 4 RQ, o Q es -X- Y-Z; en donde cada RQ es independientemente ariloxi, aralquiloxi, ariloxialquilo, arilalquilo C0-C6 carboxi, C(R110)=C(R110)-COOH, oxo, =S, -Z, - Y ’-Z, o -X- Y-Z, en donde cada RQ está sustituido opcionalmente con 1 a 4 R80 ;
G21 , Q, o Rc; con la condición de que solo uno de
Figure imgf000051_0003
sea G 1 y solo uno de R00 , N= y
G21 es -J0-Ko, en donde J0 y K0 son independientemente arilo o heteroarilo, cada uno sustituido opcionalmente con uno a cuatro grupos RK; cada RK es independientemente hidrógeno, halógeno, CR110=CR110COOR110 , nitro, -Z, -Y-Z, o -X-Y-Z;
G 1 es -L10- R, en donde L10 - es un enlace, L50 , L60 , -L50-L60 -L50 -, o -L60-L50-L50-, en donde
cada L50 es independientemente -[C(R150)2]m-;
cada L60 es independientemente -CS-, -CO-, -SO2 -, -O-, -CON(R110)-, -CONR110N(R110)-, - C(=NR110)-, -C( NOR11)-,
-C(=N-N(R110)2 )-, -cicloalquilo C3-C8 -, o -heterociclilo-, en donde el cicloalquilo o heterociclilo está sustituido opcionalmente con uno a 4 grupos R140; o cada L60 es independientemente alidiilo C2-C6 , en donde la cadena de alidiilo está interrumpida opcionalmente por -C(R100)2-, -C(R110)2 C(R110)z-, -C(R11)C (R110)-, -C(R110^ O-, -C(R110)zNR110-, -C-,
-O-, - S-, -N(RO)CO-, -N(R100)CO2 -, -CON(R110)-, -CO-, -CO2-, -OC(=O)-, -OC(=O)N(R100)-, - SO2 -, -N(R100)SO2-, o -SO2N(R100);
R es arilo, heterociclilo, heteroarilo o -cicloalquilo (C3-C6 ), en donde R está sustituido opcionalmente con 1 a4 RA, en donde cada RA es independientemente halógeno, nitro, heterociclilo, alquilo C1-C6 , alquenilo C2-C6 , alquinilo C2-C6 , cicloalquilo C3 -C8 , (cicloalquilo C3-C8 )-alquilo C 1-C6 -, (cicloalquenilo C3-C8 )-alquilo C1-C6 -, (cicloalquilo C3-C8 )-alquenilo
C1-C6 -, arilalquilo, ariloxi, arilalcoxi C1-6 , haloalquilo C1-C6 , SO2 R110 , OR110, SR110, N3 , SOR110, COR110, SO2 N(R110)2 , SO2NR110COR110, CeN, C(O)OR110, CON(R110)2, -CON(R110)OR110, OCON(R110)2, -NR110COR110, NR110CON(R110)2, NR110COOR110, -C(=N-OH)R110, -C(=S)N(R110)2, -S(=O)N(R110)2, -S(=O)O110, -N(R110)S(=O)2R110, -C(=O)N(R110)N(R110)2 , -OC(=O)-R110, -OC(=O)-OR110 o N(R11)2 , en donde cada RA está sustituido opcionalmente con 1 a 4 grupos que son independientemente -halógeno, -alquilo C1-C6 , ariloxi, alquilo C0-6 SO2 R110 , alquilo C0-6 COOR110 , alcoxi C1-6 arilo, haloalquilo C1-C6 , -SO2 R110 , -OR110, -SR110, -N3 , -SO2 R110 , -COR110, -SO2 N(R110)2 , -SO2 NR110COR110, -C=N, -C(O)OR110, -CON(R110)2, -CON(R110)OR110, -OCON(R110)2 -NR110COR110, -NR110CON(R110)2, - NR110COOR110, o -N(R110)2 ;
Rw es -L31-R60, en donde L31 es un enlace, -X3(CHz)n-X3-, -(CH2)m-X3-(CH2)n- o - (CH2 )1+w, -Y3-(CH2 )w -, en donde cada w es independientemente 0-5: y cada X3 es independientemente un enlace, -C(R110)2-, -C(R110)2 C(R110)2 -, -C(R110)=C(R110)-, -C=C-, -CO-, -CS-, -CONR100-, -C(=N)(R100)-, -C(=N-OR110)-, -C[=N-N(R110)2 ], -CO2-, -SO2 -, o -SO2 N(R110)-; e
Y3 es -O-, -S-, -NR70-, -N(R100)CO-, -N(R110)CO2-, -OCO-, -OC(=O)N(R100)-, -NR100CONR100-, -N(R110)SO2-, o -NR100CSNR100-;
o L31 es una cadena alidilo C2-6 en donde la cadena alidilo está interrumpida opcionalmente por -C(R110)2-, -C(R110)2C(R110)2-, -C(R110)=C(R110)-, -C(R110)2O-, -C(R110)2NR110-, -C=C-, -O-, -S-, -N(R100)CO-, -N(R100)CO2-, -CON(R100)-, -CO-, -CO2-, -OC(=O)-, -OC(=O)N(R110)-, -SO2-, - N(R100)SO2-, o -SO2 N(R100); y
R60 es alquilo C1-C6 , haloalquilo C1-C6 , arilo, cicloalquilo C3 -C8 , heteroarilo, heterociclilo, -CN, -C(=O)R110, -C(=O)OR110, -C(=O)N(R110)2 , -N(R110)2 , -SO2 R110 , -S(=O)2 N(R110)2 , -C(=O)N(R110)N(R110)2 , o -C(=O)N(R11)(OR110), en donde el arilo, heteroarilo, cicloalquilo, o heterociclilo está sustituido opcionalmente con 1 a 4 R60a, en donde
cada R60a es independientemente -Z, -Y'-Z, o-X-Y-Z;
cada Rc es independientemente -L30-R70, en donde
cada L30 es independientemente un enlace o-(CH2 )m-V10-(CH2 )n-, en donde
V10 es -C(R110)2-, -C(R110)2 C(R110)2 , -C(R110)=C(R110)-, -C(R110)2O-, -C(R110)2 NR110-, -C=C-, -O-, -S-, -NR10-, -N(R100)CO-, -N(R100)CO2-, -OCO-, -CO-, -CS-, -CONR100-, -C(=N-R110)-, - C(=N-OR110)-, -C[=N-N(R110)2], -CO2-, -OC(=O)-, -OC(=O)N(R100)-, SO2-, -N(R100)SO2-, -SO2 N(R100)-, -NR100CONR100-, -NR100CSNR100-, cicloalquilo C3-C6 , o ciclohaloalquilo C3-C6 ; o cada L30 es independientemente alidiilo C2-C6 , en donde la cadena alidiilo está interrumpida opcionalmente por -C(R110)2-, -C(R110)2 C(R110)2-, -C(R110)C(R110)-, -C(R110)2O-, -C(R110)2 NR110-, -C=C-, -O-, - S-, -N(R100)CO-, -N(R100)CO2-, -NR110-, -CON(R100)-, -CO-, -CO2-, -O(C=O)-, -O(C=O)N(R100)-, -SO2-, - N(R100)SO2 -, o -SO2N(R100)-;
cada R70 es independientemente hidrógeno, halógeno, nitro, arilo, heteroarilo, heterociclilo, -Z, -Y-Z, o-X-YZ,
en donde el arilo, heteroarilo, y heterociclilo, están cada uno sustituido opcionalmente con 1 a 4 R70a en donde cada R70a es independientemente ariloxi, aralquiloxi, ariloxialquilo, arilalquil C0-C6 carboxi, C(R110)=C(R110)COOH, oxo, -Z, - Y'-Z, o -X-Y-Z, en donde cada R70a está sustituido opcionalmente con 1 a 4 R80, y en donde cada R80 es independientemente halógeno, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C8 , haloalquilo C1-C8 (OR110), alquilo C0-C6OR110, alquilo C0-C6 CON(R110)2 , alquilo C0-C6 COR110 , alquilo C0-C6 COOR110 , o alquilo C0-C6 SO2 R110 ;
cada R100 es independientemente -R110, -C(=O)R110, -CO2 R110 , o -SO2 R110 ;
cada R110 es independientemente -hidrógeno, -alquilo C1-C6 , alquenilo C2-C6 , alquinilo C1-C6 , -haloalquilo C1-C6 , o -N(R12)2 , en donde cualquier R110 está sustituido opcionalmente con 1 a 4 radicales de R120;
cada R120 es independientemente halógeno, ciano, nitro, oxo, -B(OR130), alquilo Co-C6 N(R13)2 , haloalquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , (alquilo C0-C6 )C=O(OR130), alquilo C0-C6OR130, alquilo C0 -C6 COR130, alquilo C0-C6 SO2 R130, alquilo C0 -C6 CON(R13)2 , alquilo C0-C6 CONR130OR130, alquilo C0-C6 SO2 N(R130)2 , alquilo C0-C6 SR130, haloalquilo C0-C6OR130, alquilo C0-C6 CN, - alquilo C0-C6 N(R13)2 , -NR13SO2 R13, u -Oalquilo C0-6 COOR130 ;
cada R130 es independientemente hidrógeno, alquilo C1-C6 , alquenilo C2-C6 , o alquinilo C2-C6 ;
cada R140 es independientemente alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , halógeno, haloalquilo C1-C6 , alquilo C0-C6 CON(R110)o, alquilo C0-C6 CONR110R10, alquilo C0-C6OR110 , o alquilo C0-C6COOR110 ; y
cada R150 es independientemente hidrógeno, halógeno, OR130, alquilo(C1- C6) o haloalquilo(C1- C6), en donde
cada alquilo está sustituido opcionalmente con al menos un grupo que es cada uno independientemente halógeno, ciano, nitro, azido, OR130, C(O)R130, C(O)OR13C(O)N(R130)2 , N(R130)2 , N(R130)C(O)R130, N(R130)S(O)2 R130, -OC(O)OR130, OC(O)N(R130)2 , N(R130)C(O)OR130, N(R130)C(O)N(R130), SR130, S(O)R130, S(O)2 R', o S(O)2 N(R130)2 ; o dos R150 (unidos al mismo átomo o a átomos diferentes) pueden tomarse conjuntamente para formar un cicloalquilo C3-C6;
cada X es independientemente -O-, -S-, o -N(R100)-;
cada Y es independientemente -[C(R150)2 ]p-, o -alquenilo C2-C6 , en donde p es 1, 2, 3, 4, 5, o 6;
cada Y' es independientemente -[C(R150)2 ]p-, -alquenilo C2-C6 cicloalquilo C3-C8 , o heterociclilo, en donde el cicloalquilo o heterociclilo está sustituido opcionalmente con 1 a 3 grupos Z;
cada Z es independientemente -H, halógeno, -OR110, -SR110, -C(=O)R110, -C(=O)OR110, -C(=O)N(R110)2 , -N(R100)2 , -N3 , -NO2 , -C(=N-OH)R110, -C(=S)N(R110)2 , -CN, -S(=O)R110, -S(=O)N(R110)2 , - S(=O)OR110, -S(=O)2 R110, S(=O)2 N(R110)2 , -NR110COR110, -N(R110)C(=O)N(R110)2, -N(R110)COOR110, -N(R110)S(=O)2R110, -C(=O)N(R110)N(R110)2, -C(=O)N(R110)(OR110), -OC(=O)-R110, - OC(=O)-OR110, o -OC(=O)-N(R110)2 ; y
cada m y n es independientemente 0, 1,2, 3, 4, 5, o 6.
En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula IV tiene una estructura de Fórmula V o VI:
Figure imgf000053_0001
En otras realizaciones, el compuesto de Fórmula VI tiene una estructura de Fórmula VII:
Figure imgf000053_0002
En otras realizaciones más, el compuesto de Fórmula VI tiene una estructura de Fórmula VIII:
Figure imgf000053_0003
En más realizaciones adicionales, el compuesto de Fórmula VI tiene una estructura de Fórmula IX:
Figure imgf000054_0001
De acuerdo con esto, los compuestos de Fórmula IV que pueden ser útiles en los métodos de la descripción incluyen, pero no están limitados a, los compuestos que tienen las estructuras mostradas a continuación, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos:
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
33 2-(1-(3doro-3'-fluoro-4'-(hidroximetN)-5'-(metNsulfonN)bifenN-4-N)-2-(2-(2,6didorofenN) propan-2-il)-1H-imidazol-4-il)propan-2-ol; 34 2-(2-(2(2-cloro-3-fluorofenil)propan-2-M)-1-(3'-fiuoro-4'-(hidroximetil)-5'(metilsulfonil)bifenil-4-M)-1H-imidazol-4-il)propan-2-ol; 35 2-(2-(2(2,6-diclorofenil)propan-2-il)-1-(3'-fluoro-4'-(hidroximetil)-5'(metilsulfonil)bifenil-4-il)-1H-imidazol-4-il)propan-2-ol; 36 2-(2-(2(2,6-didorofenN)propan-2-N)-1-(3,3'-difluoro-4'-(hidroximetN)-5'(metilsulfonil)bifenil-4-il)-1H-imidazol-4-il)propan-2-ol; y 37 2-(2-[1 (2,6-diclorofenil)etil]-1-[3,3'-difluoro-4'-(hidroximetil)-5'(metilsulfonil)bifenil-4-il]-1H-imidazol-4-il)propan-2-ol. El compuesto 12 también se conoce como WO20100138598 Ej. 9. El compuesto 38 también se conoce como WO2007 002563 Ej. 19. El compuesto 39 también se conoce como WO20120135082.
Los compuestos de Fórmula IV pueden sintetizarse como se describe en la publicación PCT No. US2010/0069367 y WO2010/138598 incorporadas en la presente memoria por referencia.
El agonista de LXR que puede usarse para el tratamiento y/o prevención de metástasis puede ser el compuesto 24, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000057_0002
En realizaciones adicionales, los compuestos que pueden usarse para el tratamiento y/o prevención de metástasis pueden encontrarse en las publicaciones PCT de la lista que consiste en:
WO2006/094034, WO2008/049047, WO2009/020683, WO2009/086138, WO2009/086123, WO2009/086130, WO2009/086129, WO2007/002559, WO2007/002563, WO2007/081335, WO2006/017055, WO2006/102067, WO2009/024550, US2006/0074115, US2006/0135601, WO2009/021868, WO2009/040289, WO2007/047991, WO2007/050425, WO2006/073363, WO2006/073364, WO2006/073365, WO2006/073366, WO2006/073367, US2009/0030082, WO2008/065754, JP2008/179562, WO2007/092065, US2010/0069367, US7998995, US7247748, WO2010/138598, US7365085, US75776215, US63136503, US2004/0072868, US2005/0107444, US2005/0113580, US2005/0131014, US2005/0282908, US2009/0286780.
LXRa y LXRp, descubiertos inicialmente por múltiples grupos aproximadamente al mismo tiempo (Apfel et al, 1994; Willy et al, 1995; Song et al, 1994; Shinar et al, 1994; Teboul et al, 1995), pertenecen a una familia de receptores hormonales nucleares que se activan endógenamente por el colesterol y sus derivados oxidados para mediar la transcripción de genes implicados en el mantenimiento del metabolismo de la glucosa, colesterol, y ácidos grasos (Janowski et al., 1996; Calkin y Tontonoz, 2012). Dado el vínculo intrincado entre el metabolismo de los lípidos y el crecimiento de las células cancerosas (Cairns et al., 2011), no es probable que la expresión ubicua de ¡LXRp en el melanoma sea coincidente, permitiendo a las células de melanoma sintetizar partículas de lípidos y lipoproteínas para sostener su crecimiento. Al mismo tiempo, sin embargo, dichos niveles estables de expresión basal hacen de LXRp una diana terapéutica ideal, como se ejemplifica por la capacidad de respuesta de amplio rango de las células de melanoma a la terapia de activación de LXRp.
Se ha mostrado que los compuestos tienen selectividad para LXRp o LXRa. Esta selectividad puede permitir una actividad incrementada y/o disminuida de los efectos en la diana. Los ejemplos de compuestos con selectividad hacia LXRp o LXRa se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Valores de CE50 para compuestos seleccionados frente a LXRa y LXRp
Figure imgf000058_0001
Tal y como se usa en la presente memoria, la referencia a la actividad de un agonista de LXR en LXRa y LXRp se refiere a la actividad como se mide usando el ensayo de detección de ligando (LiSA) descrito en Spencer et al. Journal of Medicinal Chemistry 2001,44, 886-897. En algunas realizaciones, el agonista de LXR tiene una CE50 de menos de 1|jM en el ensayo de detección de ligando (p. ej., 0,5 nm a 500 nM, 10 nM a 100 nM). Por ejemplo, los métodos de la descripción pueden realizarse usando un agonista de LXRp que tiene actividad para LXRp que es al menos 3 veces mayor que la actividad del agonista para LXRa, o que tiene actividad para LXRp que es al menos 10 veces mayor que la actividad del agonista para LXRa, o que tiene actividad para LXRp que es al menos 100 veces mayor que la actividad de dicho agonista para LXRa, o que tiene actividad para LXRp que es al menos 3 veces la actividad del agonista para LXRa. El término "mayor actividad" en el ensayo LiSA se refiere a una menor CE50. Por ejemplo, GW39652 tiene una actividad aproximadamente 6 veces mayor para LXRp (CE50= 30) comparado con LXRa (CE50 = 190).
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "incrementa el nivel de la expresión de ApoE in vitro" se refiere a determinados agonistas de LXR capaces de incrementar el nivel de la expresión de ApoE 2,5 veces en el ensayo de qPCR del Ejemplo 21 a una concentración de menos de 5 jM (p. ej., a una concentración de 100 nM a 2 jM , a una concentración de menos de o igual a 1jM). Los agonistas de LXR que presentan este efecto in vitro pueden ser altamente eficaces para su uso en los métodos de la descripción.
El término "alquilo", usado en la presente solicitud, se refiere a un sustituyente univalente alifático saturado ramificado o no ramificado. El sustituyente alquilo tiene 1 a 100 átomos de carbono, (p. ej., 1 a 22 átomos de carbono, 1 a 10 átomos de carbono 1 a 6 átomos de carbono, 1 a 3 átomos de carbono). De acuerdo con esto, los ejemplos del sustituyente alquilo incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, tere-butilo, n-pentilo y n-hexilo.
El término "alcoxi" representa un sustituyente químico de fórmula -OR, donde R es un grupo alquilo C1-C6 sustituido opcionalmente, a no ser que se especifique otra cosa. En algunas realizaciones, el grupo alquilo puede estar sustituido, p. ej., el grupo alcoxi puede tener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 grupos sustituyentes como se define en la presente memoria.
El término "alcoxialquilo" representa un grupo heteroalquilo, como se define en la presente memoria, que se describe como un grupo alquilo que está sustituido con un grupo alcoxi. Los grupos alcoxialquilo no sustituidos ejemplares incluyen entre 2 a 12 carbonos. En algunas realizaciones, el alquilo y el alcoxi pueden estar cada uno sustituidos además con 1,2, 3, o 4 grupos sustituyentes como se define en la presente memoria para el grupo respectivo.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "cicloalquilo" se refiere a un sustituyente monocíclico, bicíclico, o tricíclico, que puede ser saturado o parcialmente saturado, es decir, poseer uno o más dobles enlaces. Los sustituyentes monocíclicos se ejemplifican por un grupo hidrocarburo cíclico saturado que contiene de 3 a 8 átomos de carbono. Los ejemplos de sustituyentes cicloalquilo monocíclico incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Los sustituyentes cicloalquilo bicíclicos fusionados se ejemplifican por un anillo cicloalquilo fusionado con otro anillo cicloalquilo. Los ejemplos de sustituyentes cicloalquilo bicíclicos incluyen, pero no están limitados a, decalina, 1,2,3,7,8,8a-hexahidro-naftaleno, y semejantes. Los sustituyentes cicloalquilo tricíclicos se ejemplifican por un anillo cicloalquilo bicíclico fusionado con un sustituyente cicloalquilo adicional.
El término "alquileno", usado en la presente solicitud, se refiere a un sustituyente bivalente alifático saturado ramificado o no ramificado (p. ej., el sustituyente alquileno tiene 1 a 6 átomos de carbono, 1 a 3 átomos de carbono). De acuerdo con esto, los ejemplos del sustituyente alquileno incluyen metileno, etileno, trimetileno, propileno, tetrametileno, isopropilideno, pentametileno y hexametileno.
El término "alquenileno o alquenilo", tal y como se usa en la presente solicitud, es un sustituyente bivalente alifático insaturado ramificado o no ramificado que tiene un doble enlace entre dos átomos de carbono adyacentes (p. ej., el sustituyente alquenileno tiene 2 a 6 átomos de carbono, 2 a 4 átomos de carbono). De acuerdo con esto, los ejemplos del sustituyente alquenileno incluyen, pero no están limitados a, vinileno, 1-propenileno, 2-propenileno, metilvinileno, 1- butenileno, 2-butenileno, 3-butenileno, 2-metil-1-propenileno, 2-metil-2-propenileno, 2- pentenileno, 2-hexenileno.
El término "alquinileno o alquinilo", tal y como se usa en la presente solicitud, es un sustituyente bivalente alifático insaturado ramificado o no ramificado que tiene un triple enlace entre dos átomos de carbono adyacentes (p. ej., el sustituyente alquinileno tiene 2 a 6 átomos de carbono 2 a 4 átomos de carbono). Los ejemplos del sustituyente alquinileno incluyen, pero no están limitados a, etinileno, 1 -propinileno, 1-butinileno, 2-butinileno, 1-pentinileno, 2-pentinileno, 3-pentinileno y 2-hexinileno.
El término "alcadienileno", tal y como se usa en la presente solicitud, es un sustituyente bivalente alifático insaturado ramificado o no ramificado que tiene dos dobles enlaces entre dos átomos de carbono adyacentes (p. ej., el sustituyente alcadienileno tiene 4 a 10 átomos de carbono). De acuerdo con esto, los ejemplos del sustituyente alcadienileno incluyen, pero no están limitados a, los sustituyentes 2,4-pentadienileno, 2,4-hexadienileno, 4-metil-2,4-pentadienileno, 2,4-heptadienileno, 2,6-heptadienileno, 3-metil-2,4-hexadienileno, 2,6-octadienileno, 3-metil-2,6-heptadienileno, 2-metil-2,4-heptadienileno, 2,8-nonadienileno, 3-metil-2,6-octadienileno, 2,6-decadienileno, 2,9-decadienileno y 3,7-dimetil-2,6-octadienileno.
El término "sustituyente heteroalifático o heteroalquilo", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un sustituyente monovalente o bivalente, en el que uno o más átomos de carbono han sido sustituidos con un heteroátomo, por ejemplo, con un átomo de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio, en donde los átomos de nitrógeno y de azufre pueden estar oxidados opcionalmente, y el heteroátomo de nitrógeno puede estar cuaternizado opcionalmente. El o los heteroátomos de O, N y S pueden estar localizados en cualquier posición interior del sustituyente heteroalifático. Los ejemplos incluyen -CH2-CH2-O-CH3 , -CH2-CH2-NH-CH3 , -CH2-CH2 -N(CH3 )-CH3 , -CH2 -S-CH2-CH3 , -S(O)-CH3, - CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -CH2-CH=N-OCH3, y -CH=CH-N(CH3)-CH3. Un sustituyente heteroalifático puede ser lineal o ramificado, y saturado o insaturado.
En una realización, el sustituyente heteroalifático tiene 1 a 100, (p. ej., 1 a 42 átomos de carbono). En otra realización más, el sustituyente heteroalifático es un residuo de polietilen glicol.
Tal y como se usa en la presente memoria, "sustituyente aromático o arilo" se pretende que signifique cualquier anillo carbonado estable monocíclico, bicíclico o policíclico de hasta 10 átomos en cada anillo, en donde al menos un anillo es aromático, y puede no estar sustituido o estar sustituido. Los ejemplos de dichos sustituyentes aromáticos incluyen fenilo, p-toluenilo (4-metilfenilo), naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, bifenilo, fenantrilo, antrilo o acenaftilo. En los casos en los que el sustituyente aromático es bicíclico y un anillo no es aromático, se entiende que la unión es a través del anillo aromático.
El término "sustituyentes alquilarilo o arilalquilo" se refiere a sustituyentes alquilo como se ha descrito anteriormente en donde uno o más enlaces con hidrógeno contenidos en ellos se reemplazan por un enlace con un sustituyente arilo como se ha descrito anteriormente. Se entiende que un sustituyente arilalquilo está conectado al grupo carbonilo si el compuesto de la descripción a través de un enlace del sustituyente alquilo. Los ejemplos de sustituyentes arilalquilo incluyen, pero no están limitados a, bencilo (fenilmetilo), p-trifluorometilbencilo (4-trifluorometilfenilmetilo), 1-feniletilo, 2- feniletilo, 3-fenilpropilo, 2-fenilpropilo y semejantes.
El término "sustituyente heteroaromático o heteroarilo", tal y como se usa en la presente memoria, representa un anillo estable monocíclico, bicíclico o policíclico de hasta 10 átomos en cada anillo, en donde al menos un anillo es aromático y contiene de 1 a 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S. Los sustituyentes heteroaromáticos bicíclicos incluyen anillos fenilo, piridina, pirimidina o piridizina que están
a) fusionados con un anillo heterocíclico aromático de 6 miembros (insaturado) que tiene un átomo de nitrógeno;
b) fusionados con un anillo heterocíclico aromático de 5 o 6 miembros (insaturado) que tiene dos átomos de nitrógeno;
c) fusionados con un anillo heterocíclico aromático de 5 miembros (insaturado) que tiene un átomo de nitrógeno junto con un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; o
d) fusionados con un anillo heterocíclico aromático de 5 miembros (insaturado) que tiene un heteroátomo seleccionado de O, N o S.
Los grupos heteroarilo en el alcance de esta definición incluyen, pero no están limitados a: benzoimidazolilo, benzofuranilo, benzofurazanilo, benzopirazolilo, benzotriazolilo, benzotiofenilo, benzoxazolilo, carbazolilo, carbolinilo, cinolinilo, furanilo, indolinilo, indolilo, indolazinilo, indazolilo, isobenzofuranilo, isoindolilo, isoquinolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, naftpiridinilo, oxadiazolilo, oxazolilo, oxazolina, isoxazolina, oxetanilo, piranilo, pirazinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridopiridinilo, piridazinilo, piridilo, pirimidilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolilo, quinoxalinilo, tetrazolilo, tetrazolopiridilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, triazolilo, azetidinilo, aziridinilo, 1,4-dioxanilo, hexahidroazepinilo, dihidrobenzoimidazolilo, dihidrobenzofuranilo, dihidrobenzotiofenilo, dihidrobenzoxazolilo, dihidrofuranilo, dihidroimidazolilo, dihidroindolilo, dihidroisooxazolilo, dihidroisotiazolilo, dihidrooxadiazolilo, dihidrooxazolilo, dihidropirazinilo, dihidropirazolilo, dihidropiridinilo, dihidropirimidinilo, dihidropirrolilo, dihidroquinolinilo, dihidrotetrazolilo, dihidrotiadiazolilo, dihidrotiazolilo, dihidrotienilo, dihidrotriazolilo, dihidroazetidinilo, metilendioxibenzoilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotienilo, acridinilo, carbazolilo, cinolinilo, quinoxalinilo, pirrazolilo, indolilo, benzotriazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, furanilo, tienilo, benzotienilo, benzofuranilo, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo, isoxazolilo, indolilo, pirazinilo, piridazinilo, piridinilo, pirimidinilo, pirrolilo, tetrahidroquinolina. En los casos en los que el sustituyente heteroarilo es bicíclico y un anillo no es aromático o no contiene heteroátomos, se entiende que la unión es a través del anillo aromático o a través del anillo que contiene el heteroátomo, respectivamente. Si el heteroarilo contiene átomos de nitrógeno, se entiende que los N-óxidos correspondientes del mismo también están englobados por esta definición.
Los sustituyentes alifáticos, heteroalifáticos, aromáticos y heteroaromáticos pueden estar sustituidos opcionalmente una o más veces, de la misma manera o de manera diferente con uno cualquiera o más de los siguientes sustituyentes incluyendo, pero no limitado a: sustituyentes alifáticos, heteroalifáticos, aromáticos y heteroaromáticos, arilo, heteroarilo; alquilarilo; heteroalquilarilo; alquilheteroarilo; heteroalquilheteroarilo; alcoxi; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; F; CI; Br; I; -OH; -NO2 ; -CN; -CF3 ; - CH2 CF3 ; -CHCh; -CH2OH; -CH2 CH2 OH; -CH2 NH2 ; -CH2 SO2 CH3 ; -C(O)Rx; -CO2(Rx); - CON(Rx)2; -OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2 ; -S(O)Rx; -S(O)2 Rx; -NRx(CO)Rx en donde cada aparición de Rx independientemente incluye, pero no está limitado a, alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, aromático, heteroaromático, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroalquilarilo o heteroalquilheteroarilo, en donde cualquiera de los sustituyentes alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, alquilarilo, o alquilheteroarilo descritos anteriormente y en la presente memoria pueden estar sustituidos o no sustituidos, ser ramificados o no ramificados, saturados o insaturados, y en donde cualquiera de los sustituyentes aromático, heteroaromático, arilo, heteroarilo, (alquil)arilo o (alquil)heteroarilo descritos anteriormente y en la presente memoria pueden estar sustituidos o no sustituidos. Adicionalmente, se apreciará que cualesquiera dos sustituyentes adyacentes tomados conjuntamente pueden representar un sustituyente alicíclico o heterocíclico de 4, 5, 6, o 7 miembros sustituido o no sustituido. Los ejemplos adicionales de sustituyentes aplicables generalmente se ilustran por las realizaciones específicas mostradas a continuación.
Los términos "halo" y "halógeno" se refieren a un átomo de halógeno seleccionado del grupo que consiste en F, CI, Br e I.
El término "sustituyente alquilo halogenado, haloalquilo" se refiere a un sustituyente alquilo como se ha definido anteriormente que está sustituido con al menos un átomo de halógeno. En una realización, el sustituyente alquilo halogenado está perhalogenado. En otra realización, perfluoroalquilo se refiere a que el sustituyente alquilo halogenado es un sustituyente perfluorado univalente de fórmula CnF2 n+ 1. Por ejemplo, el sustituyente alquilo halogenado puede tener 1 a 6 átomos de carbono, (p. ej., 1 a 3 átomos de carbono). De acuerdo con esto, los ejemplos del grupo alquilo incluyen trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, n-perfluoropropilo, n-perfluorobutilo y n-perfluoropentilo.
El término "amino", tal y como se usa en la presente memoria, representa -N(RN 1)2 , en donde cada RN1 es, independientemente, H, OH, NO2 , N(RN 2 )2 , SO2Or N 2 , SO2 RN 2 , SORN 2 , un grupo protector de N, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, arilo, alquilarilo, cicloalquilo, alquilcloalquilo, heterociclilo (p. ej., heteroarilo), alquilheterociclilo (p. ej., alquilheteroarilo), o dos RN1 se combinan para formar un heterociclilo o un grupo protector de N, y en donde cada RN 2 es, independientemente, H, alquilo, o arilo. En una realización preferida, amino es -NH2 , o -NHRN 1 , en donde RN1 es, independientemente, OH, NO2 , NH2 , NRN 22 , SO2ORN 2 , SO2 RN 2 , SORN 2 , alquilo, o arilo, y cada RN 2 puede ser H, alquilo, o arilo. El término "aminoalquilo", tal y como se usa en la presente memoria, representa un grupo heteroalquilo, como se define en la presente memoria, que se describe como un grupo alquilo, como se define en la presente memoria, sustituido con un grupo amino, como se define en la presente memoria. El alquilo y amino pueden estar sustituidos además cada uno con 1, 2, 3, o 4 grupos sustituyentes como se describe en la presente memoria para el grupo respectivo. Por ejemplo, el resto alquilo puede comprender un sustituyente oxo (=O).
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "ariloxi" se refiere a sistemas aromáticos o heteroaromáticos que están acoplados a otro residuo a través de un átomo de oxígeno. Un ejemplo típico de un O-arilo es fenoxi. De forma similar, "arilalquilo" se refiere a sistemas aromáticos y heteroaromáticos que están acoplados a otro residuo a través de una cadena de carbono, saturada o insaturada, típicamente C1-C8, C1-C6, o más particularmente C1-C4 o C1-C3 cuando está saturada o C2-C8, C2-C6, C2-C4, o C2-C3 cuando está insaturada, incluyendo las heteroformas de la misma. Para mayor claridad, arilalquilo incluye así un grupo arilo o heteroarilo como se ha definido anteriormente conectado a un resto alquilo, heteroalquilo, alquenilo, heteroalquenilo, alquinilo o heteroalquinilo también como se ha definido anteriormente. Los arilalquilos típicos serían un aril(C6-C12)alquilo(C1-C8), aril(C6- C12)alquenilo(C2-C8), o aril(C6-C12)alquinilo(C2-C8), más las heteroformas. Un ejemplo típico es fenilmetilo, referido comúnmente como bencilo.
Los sustituyentes opcionales típicos en grupos aromáticos o heteroaromáticos incluyen independientemente halo, CN, NO2 , CF3 , OCF3 , COOR', CONR'2 , OR', SR', SOR', SO2 R', NR'2 , NR'(CO)R', NR'C(O)OR', NR'C(O)NR'2 , NR'SO2 NR'2 , o NR'SO2 R', en donde cada R' es independientemente H o un grupo sustituido opcionalmente seleccionado de alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo, heteroarilo, y arilo (todos como se han definido anteriormente); o el sustituyente puede ser un grupo sustituido opcionalmente seleccionado de alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo, arilo, heteroarilo, O-arilo, O- heteroarilo y arilalquilo.
Los sustituyentes opcionales en un grupo no aromático (p. ej., grupos alquilo, alquenilo, y alquinilo), se seleccionan típicamente de la misma lista de sustituyentes adecuados para los grupos aromáticos o heteroaromáticos, excepto como se indica de otra manera en la presente memoria. Un grupo no aromático también puede incluir un sustituyente seleccionado de =O y =NOR' donde R' es H o un grupo sustituido opcionalmente seleccionado de alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo, heteroarilo, y arilo (todos como se han definido anteriormente).
En general, un grupo sustituyente (p. ej., alquilo, alquenilo, alquinilo, o arilo (incluyendo todas las heteroformas definidas anteriormente) puede en sí mismo estar sustituido opcionalmente con sustituyentes adicionales. La naturaleza de estos sustituyentes es similar a los indicados respecto a los sustituyentes en las estructuras básicas anteriormente. Así, cuando una realización de un sustituyente es alquilo, este alquilo puede estar sustituido opcionalmente con los sustituyentes restantes indicados como sustituyentes cuando esto tenga sentido químico, y cuando esto no disminuya el límite de tamaño del alquilo per se; p. ej., un alquilo sustituido con alquilo o con alquenilo extendería simplemente el límite superior de los átomos de carbono para estas realizaciones, y no se incluye. Sin embargo, un alquilo sustituido con arilo, amino, halo y semejantes estaría incluido. Por ejemplo, cuando un grupo está sustituido, el grupo puede estar sustituido con 1, 2, 3, 4, 5, o 6 sustituyentes. Los sustituyentes opcionales incluyen, pero no están limitados a: alquilo C1-C6 o heteroarilo, alquenilo C2-C6 o heteroalquenilo, alquinilo C2-C6 o heteroalquinilo, halógeno; arilo, heteroarilo, azido(-N3 ), nitro (-NO2 ), ciano (-CN), aciloxi(-OC(=O)R'), acilo (-C(=O)R'), alcoxi (-Or '), amido (-NR'C(=O)R" o - C(=O)n Rr '), amino (-n Rr '), ácido carboxílico (-CO2 H), éster carboxílico (-CO2 R'), carbamoilo (-OC(=O)NR'R" o -NRC(=O)OR'), hidroxi (-OH), isociano (-NC), sulfonato (-S(=O)2OR), sulfonamida (-S(=O)2 Nr R' o -NRS(=O)2 R'), o sulfonilo (-S(=O)2 R), donde cada R o R' se selecciona, independientemente, de H, alquilo C1-C6 o heteroarilo, alquenilo C2-C6 o heteroalquenilo, alquinilo 2C-6C o heteroalquinilo, arilo, o heteroarilo. Un grupo sustituido puede tener, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 sustituyentes.
El término "heterociclilo, heterocíclico, o Het", tal y como se usa en la presente memoria, representa heteroalquilo o heteroalquenilo cíclico que es un anillo de, p. ej., 3, 4, 5, 6 o 7 miembros, a no ser que se especifique otra cosa, que contiene uno, dos, tres o cuatro heteroátomos seleccionados independientemente del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno, y azufre. El anillo de 5 miembros tiene cero a dos dobles enlaces, y los anillos de 6 y 7 miembros tienen cero a tres dobles enlaces. El término "heterociclilo" también representa un compuesto heterocíclico que tiene una estructura multicíclica con puente en la que uno o más carbonos y/o heteroátomos hace de puente de dos miembros no adyacentes de un anillo monocíclico, p. ej., un grupo quinuclidinilo. El término "heterociclilo" incluye grupos bicíclicos, tricíclicos, y tetracíclicos en los que cualquiera de los anillos heterocíclicos anteriores está fusionado con uno, dos, o tres anillos carbocíclicos, p. ej., un anillo arilo, un anillo ciclohexano, un anillo ciclohexeno, un anillo ciclopentano, un anillo ciclopenteno, u otro anillo monocíclico heterocíclico, tal como indolilo, quinolilo, isoquinolilo, tetrahidroquinolilo, benzofurilo, benzotienilo y semejantes.
Algunos de los compuestos de la presente descripción pueden comprender uno o más centros estereogénicos, y así pueden existir en varias formas isoméricas, p. ej., estereoisómeros y/o diastereómeros. Así, los compuestos de la descripción y las composiciones farmacéuticas de los mismos pueden estar en la forma de un enantiómero, diastereómero o isómero geométrico individual, o pueden estar en la forma de una mezcla de estereoisómeros. En determinadas realizaciones, los compuestos de la descripción son compuestos enantiopuros. En determinadas otras realizaciones, se proporcionan mezclas de estereoisómeros o diastereómeros. Además, cuando los compuestos de la descripción existen en formas tautoméricas, cada tautómero está englobado en la presente memoria.
Además, determinados compuestos, como se describe en la presente memoria, pueden tener uno o más dobles enlaces que pueden existir bien como el isómero Z o E, a no ser que se indique otra cosa. La descripción engloba adicionalmente los compuestos como isómeros individuales que carecen sustancialmente de otros isómeros y alternativamente, como mezclas de varios isómeros, p. ej., mezclas racémicas de estereoisómeros. Además de los compuestos mencionados anteriormente per se, esta descripción también engloba derivados farmacéuticamente aceptables de estos compuestos y composiciones que comprenden uno o más compuestos de la descripción y uno o más excipientes o aditivos farmacéuticamente aceptables.
Métodos de tratamiento
Como se describe en la presente memoria, miR-1908, miR-199a-3p, miR-199a-5p, y CTGF se identificaron como promotores endógenos de metástasis de la invasión metastásica, reclutamiento endotelial, y colonización en melanoma mientras DNAJA4, ApoE, LRP1, LRP8, LXR, y miR7 funcionan como supresores o inhibidores de la metástasis del mismo proceso. Además, se encontró que estos miARN toman como diana de forma convergente a ApoE y el factor de choque térmico DNAJA4. La ApoE secretada por el cáncer suprime la invasión y el reclutamiento endotelial mediante la activación de los receptores LRP1 de células de melanoma y LRP8 de células endoteliales, respectivamente. DNAJA4, a su vez, induce la expresión de ApoE. Estos miARN predicen fuertemente los resultados metastásicos humanos. El pretratamiento con ácidos nucleicos bloqueantes (LNA) dirigidos a miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 inhibe la metástasis a múltiples órganos, mientras la administración terapéutica de estos LNA suprime significativamente las metástasis de células de melanoma humanas en un modelo de ratón.
De acuerdo con esto, esta descripción proporciona métodos para tratar el melanoma mediante el incremento en el sujeto del nivel de expresión o del nivel de actividad de uno de los supresores de la metástasis. Este incremento puede conseguirse, entre otros, mediante la expresión forzada de uno o más supresores de la metástasis DNAJA4, ApoE, LRP1, y LRP8, o disminuyendo el nivel de expresión o el nivel de actividad de uno o más de miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908. Además, el tratamiento puede conseguirse disminuyendo el nivel de expresión o el nivel de actividad de uno o más de los promotores de la metástasis.
La descripción también proporciona métodos para tratar en un sujeto un trastorno angiogénico o un trastorno de angiogénesis. Los términos "trastorno angiogénico", "trastorno de angiogénesis", y "trastorno de angiogénesis" se usan indistintamente en la presente memoria, y se refieren a un trastorno caracterizado por angiogénesis patológica. Un trastorno caracterizado por angiogénesis patológica se refiere a un trastorno donde la angiogénesis anormal o aberrante, sola o en combinación con otros, contribuye a la causalidad, origen, o síntoma del trastorno. Los ejemplos de este trastorno incluyen varios cánceres (p. ej., tumores vascularizados), trastornos oculares, trastornos inflamatorios, y otros.
Los tumores vascularizados típicos que pueden tratarse con el método incluyen tumores sólidos, particularmente carcinomas, que requieren un componente vascular para el suministro de oxígeno y nutrientes. Los tumores sólidos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, carcinomas del pulmón, mama, hueso, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótida, tracto biliar, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, riñón, vejiga, próstata, tiroides, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, carcinomas de células pequeñas, melanomas, gliomas, glioblastomas, neuroblastomas, sarcoma de Kaposi, y sarcomas.
Varios trastornos o afecciones, aparte del cáncer, también pueden tratarse con el método descrito anteriormente. Los ejemplos incluyen artritis, artritis reumatoide, psoriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Grave, restenosis vascular (incluyendo restenosis después de angioplastia), malformaciones arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, glaucoma neovascular, enfermedad renal crónica, nefropatía diabética, enfermedad renal poliquística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, hepatitis autoinmune, enfermedad hepática inflamatoria crónica, cirrosis hepática, linfoma de células T cutáneo, rosácea, y carcinoma de células basales.
Otras dianas del tratamiento incluyen las descritas, p. ej., en las Solicitudes de EE.UU. 2009004297, 20090175791, y 20070161553, tales como angiofibroma, placas ateroscleróticas, neovascularización de injerto corneal, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, síndrome de Osler-Weber, fibroplasia retrolental de granuloma piogénico, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, varias otras enfermedades y trastornos inflamatorios, y endometriosis.
Expresión forzada de supresores de la metástasis
Tanto los polipéptidos de los supresores de la metástasis mencionados anteriormente (p. ej., DNAJA4, ApoE, LRP1, LRP8, y LXR) como el ácido nucleico que codifica los polipéptidos pueden usarse para llevar a la práctica la descripción. Aunque pueden usarse muchas preparaciones de polipéptidos, se prefiere un polipéptido altamente purificado o aislado. Los términos "péptido", "polipéptido", y "proteína" se usan en la presente memoria indistintamente para describir la organización de residuos de aminoácidos en un polímero. Un péptido, polipéptido, o proteína puede estar compuesto por los 20 aminoácidos naturales estándar, además de aminoácidos raros y análogos de aminoácidos sintéticos. Pueden ser cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o modificación posterior a la traducción (p. ej., glicosilación o fosforilación).
El polipéptido "de esta descripción" incluye versiones de fusión o quiméricas producidas recombinantemente o sintéticamente de cualquiera de los supresores de la metástasis mencionados anteriormente, que tienen los dominios o partes particulares que están implicados en la red. El término también engloba polipéptidos que tienen una metionina amino-terminal añadida (útil para la expresión en células procariotas).
Dentro del alcance de esta descripción están proteínas de fusión que contienen una o más de las secuencias mencionadas anteriormente y una secuencia heteróloga. Una "quimera" o "fusión" se refiere a la combinación de secuencias de aminoácidos de diferente origen en una cadena de polipéptido por la combinación en marco de sus secuencias de nucleótidos codificadoras. El término engloba explícitamente fusiones internas, es decir, la inserción de secuencias de diferente origen en una cadena de polipéptido, además de la fusión a uno de sus extremos. Un polipéptido, ácido nucleico, o gen heterólogo es uno que se origina a partir de una especie extraña, o, si es a partir de la misma especie, se modifica sustancialmente respecto a su forma original. Dos dominios o secuencias fusionados son heterólogos entre sí si no están adyacentes entre sí en una proteína o ácido nucleico natural.
Un polipéptido "aislado" o "purificado" se refiere a un polipéptido que se ha separado de otras proteínas, lípidos y ácidos nucleicos con los que está asociado naturalmente. El polipéptido puede constituir al menos el 10% (es decir, cualquier porcentaje entre el 10% y el 100%, p. ej., el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80%, 85%, 90%, 95%, y 99%) en peso seco de la preparación purificada. La pureza puede medirse por cualquier método estándar apropiado, por ejemplo, por análisis de cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o HPLC. Un polipéptido aislado descrito en la descripción puede purificarse a partir de una fuente natural, producirse por técnicas de ADN recombinante, o por métodos químicos.
Un polipéptido "recombinante" se refiere a un polipéptido producido por técnicas de ADN recombinante; es decir, producido a partir de células transformadas con una construcción de ADN exógeno que codifica el polipéptido deseado. Un polipéptido "sintético" se refiere a un polipéptido preparado por síntesis química. El término "recombinante" cuando se usa en referencia, p. ej., a una célula, ácido nucleico, proteína, o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogo o por la alteración de un ácido nucleico o proteína nativo, o que la célula deriva de una célula modificada de esta manera.
"Sobreexpresión" se refiere a la expresión de un ARN o polipéptido codificado por un ácido nucleico introducido en una célula huésped, en donde el a Rn o polipéptido o proteína no está normalmente presente en la célula huésped, o en donde el ARN o polipéptido está presente en dicha célula huésped a un nivel mayor que el normalmente expresado a partir del gen endógeno que codifica el ARN o polipéptido.
La composición de aminoácidos de cada uno de los polipéptidos mencionados anteriormente puede variar sin alterar sus funciones - la capacidad de regular al alza la red mencionada anteriormente (p. ej., incrementar el nivel de activación de la ruta de señalización de ApoE/LRP), inhibiendo de esta manera la metástasis a múltiples órganos. Por ejemplo, puede contener una o más sustituciones conservativas de aminoácidos. Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación p (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en uno de los polipéptidos descritos anteriormente (p. ej., las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, y 18) se reemplaza preferiblemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Alternativamente, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de todo o parte de las secuencias, tales como mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden cribarse para determinar su capacidad de regular al alza la red mencionada anteriormente o ruta de señalización de ApoE/LRP, y desencadenar la respuesta celular respectiva para identificar mutantes que retienen la actividad como se describe más adelante en los ejemplos.
Un equivalente funcional de un polipéptido de esta descripción se refiere a un derivado del polipéptido, p. ej., una proteína que tiene una o más mutaciones puntuales, inserciones, deleciones, truncamientos, una proteína de fusión, o una combinación de los mismos. Retiene sustancialmente la actividad del polipéptido mencionado anteriormente. El polipéptido aislado de esta descripción puede contener la secuencia de una de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, y 18, o un equivalente o fragmento funcional del mismo. En general, el equivalente funcional es al menos un 75% (p. ej., cualquier número entre el 75% y 100%, inclusivo, p. ej., un 70 %, 80%, 85%, 90%, 95%, y 99%) idéntico a una de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, y 18.
Un polipéptido descrito en esta descripción puede obtenerse como un polipéptido recombinante. Para preparar un polipéptido recombinante, un ácido nucleico que lo codifica puede unirse a otro ácido nucleico que codifica una pareja de fusión, p. ej., glutatión-s-transferasa (GST), etiqueta de epítopo de 6x His, o proteína del Gen 3 M13. El ácido nucleico de fusión resultante expresa en células huésped adecuadas una proteína de fusión que puede aislarse por métodos conocidos en la técnica. La proteína de fusión aislada puede tratarse, además, p. ej., por digestión enzimática, para eliminar la pareja de fusión y obtener el polipéptido recombinante de esta descripción. Alternativamente, el polipéptido de la descripción puede sintetizarse químicamente (véase, p. ej., Creighton, "Proteins: Structures and Molecular Principies", W.H. Freeman & Co., NY, 1983). Para una guía adicional, los expertos pueden consultar Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3a Ed. 1987 y 1995), Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, n Y, 1989), y síntesis química Gait, M.J. Ed. (Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984).
Debido a sus funciones como proteína celular o proteína de membrana, DNAJA4, LRP1, LRP8, y LXR pueden estar asociadas con, p. ej., conjugadas o fusionadas a, una o más de una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de péptido de penetración celular (CPP), y semejantes. De esta manera, una composición de la descripción como se discute más adelante puede incluir un potenciador del transporte. Un péptido de penetración celular (CPP) consiste generalmente en menos de 30 aminoácidos y tiene una carga positiva neta. Los CPP se internalizan en células animales vivas de una manera endocitótica o independiente de receptor/energía. Hay varias clases de CPP con varios orígenes, de CPP totalmente derivados de proteínas a CPP quiméricos a CPP completamente sintéticos. Los ejemplos de CPP son conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., las Solicitudes de EE.UU. Nos. 20090099066 y 20100279918. Se sabe que los CPP pueden administrar una proteína exógena a varias células.
Todas las versiones naturales, versiones modificadas por ingeniería genética, y versiones sintetizadas químicamente de los polipéptidos mencionados anteriormente pueden usarse para llevar a la práctica la invención descrita en la presente memoria. Los polipéptidos obtenidos por tecnología de ADN recombinante pueden tener la misma secuencia de aminoácidos que una versión natural (p. ej., una de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, y 18) o un equivalente funcional del mismo. También incluyen versiones modificadas químicamente. Los ejemplos de polipéptidos modificados químicamente incluyen polipéptidos sometidos a cambio conformacional, adición o deleción de una cadena lateral, y aquellos a los que se ha unido un compuesto tal como polietilen glicol. Una vez purificados y ensayados por métodos estándar o según el método descrito en los ejemplos más adelante o u otros métodos conocidos en la técnica, los polipéptidos pueden incluirse en una composición adecuada.
Para expresar los factores mencionados anteriormente, la descripción proporciona un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente. Preferiblemente, las secuencias de nucleótidos se aíslan y/o purifican. Un ácido nucleico se refiere a una molécula de ADN (p. ej., pero no limitado a, un ADNc o ADN genómico), una molécula de ARN (p. ej., pero no limitado a, un ARNm), o un análogo de ADN o ARN. Un análogo de ADN o ARN puede sintetizarse a partir de análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria. Un "ácido nucleico aislado" es un ácido nucleico cuya estructura no es idéntica a la de cualquier ácido nucleico natural o a la de cualquier fragmento de un ácido nucleico genómico natural. El término abarca, por lo tanto, por ejemplo, (a) un ADN que tiene la secuencia de parte de una molécula de ADN genómico natural pero no está flanqueada por ambas de las secuencias codificadoras que flanquean esa parte de la molécula en el genoma del organismo en el que está naturalmente; (b) un ácido nucleico incorporado en un vector o en el ADN genómico de un procariota o eucariota de una manera tal que la molécula resultante no es idéntica a ningún vector o ADN genómico natural; (c) una molécula separada tal como un ADNc, un fragmento genómico, un fragmento producido por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o un fragmento de restricción; y (d) una secuencia de nucleótidos recombinante que es parte de un gen híbrido, es decir, un gen que codifica una proteína de fusión.
Los términos "ARN", "molécula de ARN", y "molécula de ácido ribonucleico" se usan indistintamente en la presente memoria, y se refieren a un polímero de ribonucleótidos. El término "ADN" o "molécula de ADN" o "molécula de ácido desoxirribonucleico" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos. El ADN y el ARN pueden sintetizarse naturalmente (p. ej., por replicación del ADN o transcripción del ADN, respectivamente). El ARN puede modificarse después de la transcripción. El ADN y el ARN también pueden sintetizarse químicamente. El ADN y el ARN pueden ser monocatenarios (es decir, ARNss y ADNss, respectivamente) o multicatenarios (p. ej., bicatenarios, es decir, ARNds y ADNds, respectivamente).
La presente descripción también proporciona construcciones recombinantes que tienen una o más de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria. Los ejemplos de las construcciones incluyen un vector, tal como un vector plasmídico o viral, en el que se ha insertado una secuencia de ácido nucleico de la descripción, en una orientación directa o inversa. En una realización preferida, la construcción incluye además secuencias reguladoras, incluyendo un promotor, unido de forma operativa a la secuencia. Los expertos en la técnica conocen muchos vectores y promotores adecuados, y están disponibles comercialmente. Los vectores de clonación y expresión apropiados para uso con huéspedes procariotas y eucariotas también se describen en Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press).
Los ejemplos de vectores de expresión incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, p. ej., derivados de un virus de simio 40 (SV40), plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de viruela aviar, y pseudorabia. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector siempre que sea replicable y viable en el huésped. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector por una variedad de procedimientos. En general, una secuencia de ácido nucleico que codifica uno de los polipéptidos descritos anteriormente puede insertarse en un sitio o sitios de endonucleasas de restricción apropiados por procedimientos conocidos en la técnica. Dichos procedimientos y procedimientos de subclonación relacionados están en el alcance de los expertos en la técnica.
La secuencia de ácido nucleico en el vector de expresión mencionado anteriormente está preferiblemente unida de forma operativa a una secuencia de control de la transcripción apropiada (promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Los ejemplos de dichos promotores incluyen: el promotor de la repetición terminal larga (LTR) retroviral o de SV40, el promotor de lac o trp de E. coli, el promotor de PL del fago lambda, y otros promotores que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o virus. El vector de expresión también puede contener un sitio de unión a ribosomas para el inicio de la traducción, y un terminador de la transcripción. El vector puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Además, el vector de expresión contiene preferiblemente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas tal como resistencia a dihidrofolato reductasa o neomicina para cultivos de células eucariotas, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.
El vector que contiene las secuencias de ácido nucleico apropiadas como se ha descrito anteriormente, así como un promotor o secuencia de control apropiada, puede emplearse para transformar un huésped apropiado para permitir que el huésped exprese los polipéptidos descritos anteriormente. Dichos vectores pueden usarse en terapia génica. Los ejemplos de huéspedes de expresión adecuados incluyen células bacterianas (p. ej., E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium), células fúngicas (levadura), células de insecto (p. ej., Drosophila y Spodoptera frugiperda (Sf9)), células animales (p. ej., CHO, COS, y HEK 293), adenovirus, y células de plantas. La selección de un huésped apropiado está en el alcance de los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para producir los polipéptidos mencionados anteriormente por transfección de una célula huésped con un vector de expresión que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica uno de los polipéptidos. Las células huésped se cultivan entonces en una condición adecuada, que permite la expresión del polipéptido.
Disminución del nivel de expresión o actividad de los promotores de la metástasis
Como se ha mencionado anteriormente, se puede usar un agente inhibidor que disminuya el nivel de expresión o actividad de miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, o CTGF para tratar melanoma. Un agente inhibidor (es decir, inhibidor) puede ser un ácido nucleico, un polipéptido, un anticuerpo, o un compuesto que es una molécula pequeña. En un ejemplo, el inhibidor funciona a un nivel de transcripción, estabilidad del ARNm, traducción, estabilidad/degradación de las proteínas, modificación de las proteínas, y unión de las proteínas.
Un inhibidor de ácido nucleico puede codificar un ARN de interferencia pequeño (p. ej., un agente ARNi) que está dirigido a uno o más de los genes mencionados anteriormente, p. ej., CTGF, e inhibe su expresión o actividad. El término "agente ARNi" se refiere a un ARN, o análogo del mismo, que tiene una complementariedad de secuencia suficiente con un ARN diana como para dirigir la interferencia del a Rn . Los ejemplos también incluyen un ADN que puede usarse para preparar el ARN. ARN de interferencia (ARNi) se refiere a un proceso específico o selectivo de secuencia mediante el cual una molécula diana (p. ej., un gen, proteína o ARN diana) se regula a la baja. Generalmente, un ARN de interferencia("ARNi") es un ARN de interferencia bicatenario corto (ARNsi), ARN de horquilla corta (ARNsh), o micro ARN monocatenario (miARN) que da lugar a la degradación catalítica de ARNm específicos, y también puede usarse para disminuir o inhibir la expresión génica.
El término "ARN de interferencia corto" o "ARNsi" (también conocido como "ARN de interferencia pequeño") se refiere a un agente de ARN, preferiblemente un agente bicatenario, de aproximadamente 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud, más preferiblemente aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, o 25 nucleótidos de longitud, teniendo las cadenas opcionalmente extremos protuberantes que comprenden, por ejemplo 1, 2 o 3 nucleótidos protuberantes (o análogos de nucleótidos), que es capaz de dirigir o mediar la interferencia de ARN. Los ARNsi naturales se generan a partir de moléculas de ARNds más largas (p. ej., >25 nucleótidos de longitud) por la maquinaría de ARNi de una célula (p. ej., Dicer o un homólogo del mismo).
El término "miARN" o "microARN" se refiere a un agente de ARN, preferiblemente un agente monocatenario, de aproximadamente 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud, más preferiblemente aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 nucleótidos de longitud, que es capaz de dirigir o mediar la interferencia de ARN. Los miARN naturales se generan a partir de ARN precursores tallobucle (es decir, pre-miARN) por Dicer. El término "Dicer", tal y como se usa en la presente memoria, incluye Dicer así como cualquier ortólogo u homólogo de Dicer capaz de procesar estructuras de ARNds en ARNsi, miARN, moléculas semejantes a ARNsi o semejantes a miARN. El término microARN (o "miARN") se usa indistintamente con el término "ARN temporal pequeño" (o "ARNst") sobre la base del hecho de que se ha encontrado que los microARN naturales (o "miARN") se expresan de una forma temporal (p. ej., durante el desarrollo).
El término "ARNsh", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un agente de ARN que tiene una estructura de tallo-bucle, que comprende una primera y segunda región de secuencia complementaria, siendo el grado de complementariedad y orientación de las regiones suficiente de manera que se produce el emparejamiento de bases entre las regiones, y estando unidas la primera y segunda regiones por una región de bucle, resultando el bucle de una ausencia de emparejamiento de bases entre nucleótidos (o análogos de nucleótidos) en la región del bucle.
En el alcance de esta descripción está la utilización de ARNi que producen la degradación de moléculas de ARN (p. ej., en una célula). La degradación está catalizada por un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) enzimático. Un agente de ARN que tiene una secuencia suficientemente complementaria a una secuencia de ARN diana (p. ej., el gen CTGF mencionado anteriormente) para dirigir el ARNi significa que el agente de ARN tiene una homología de al menos el 50%, (p. ej., el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, o 100% de homología) con la secuencia de ARN diana de manera que los dos son lo suficientemente complementarios entre sí como para hibridar y desencadenar la destrucción del a Rn diana por la maquinaría o proceso del ARNi (p. ej., el complejo RISC). Un agente de ARN que tiene una "secuencia suficientemente complementaria a una secuencia de ARN diana para dirigir ARNi" también significa que el agente de ARN tiene una secuencia suficiente como para desencadenar la inhibición de la traducción del ARN diana por la maquinaría o proceso del ARNi. Un agente de ARN también puede tener una secuencia suficientemente complementaria a un ARN diana codificado por la secuencia de ADN diana de manera que la secuencia de ADN diana se silencia cromáticamente. En otras palabras, el agente de ARN tiene una secuencia suficiente como para inducir el silenciamiento génico transcripcional, p. ej., para modular a la baja la expresión génica en o cerca de la secuencia de ADN diana, p. ej., mediante la inducción de cambios estructurales en la cromatina en o cerca de la secuencia de ADN diana.
Los polinucleótidos mencionados anteriormente pueden administrarse usando dispositivos de administración poliméricos, micropartículas o microcápsulas biodegradables conocidos en la técnica. Otra manera de conseguir la captación de los polinucleótidos es usando liposomas, preparados por métodos estándar. El polinucleótido puede incorporarse solo en estos vehículos de administración o coincorporarse con anticuerpos específicos de tejido. Alternativamente, se puede preparar un conjugado molecular compuesto por un plásmido u otro vector unido a poli-L-lisina por fuerzas electrostáticas o covalentes. La poli-L-lisina se une a un ligando que puede unirse a un receptor en las células diana (Cristiano, et al., 1995, J. Mol. Med. 73:479). Alternativamente, el direccionamiento específico de tejido puede conseguirse por el uso de elementos reguladores de la transcripción específicos de tejido que son conocidos en la técnica. La administración de ADN desnudo (es decir, sin un vehículo de administración) a un sitio intramuscular, intradérmico, o subcutáneo es otro medio para conseguir la expresión in vivo.
Las moléculas de ARNsi, miARN, y ARNas (ARN antisentido) pueden diseñarse por métodos muy conocidos en la técnica. Las moléculas de ARNsi, miARN, y ARNas con homología suficiente para proporcionar especificidad de secuencia requerida para degradar únicamente cualquier ARN pueden diseñarse usando programas conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, los mantenidos en los sitios de la red de AMBION, Inc. y DHARMACON, Inc. El ensayo sistemático de varias especies diseñadas para la optimización de la secuencia de ARNsi, miARN, y ARNas puede realizarse de forma rutinaria por los expertos en la técnica. Las consideraciones cuando se diseñan moléculas de ácido nucleico de interferencia cortas incluyen, pero no están limitadas a, consideraciones biofísicas, termodinámicas, y estructurales, preferencias de base en posiciones específicas en la cadena con sentido, y homología. Estas consideraciones son muy conocidas en la técnica y proporcionan guías para el diseño de las moléculas de ARN mencionadas anteriormente.
Un polinucleótido antisentido (preferiblemente ADN) de la presente descripción puede ser cualquier polinucleótido antisentido siempre que posea una complementariedad de secuencia de bases o sea sustancialmente complementaria con la del gen que codifica un componente de la red mencionada anteriormente. La secuencia de bases puede tener al menos aproximadamente un 70%, 80%, 90%, o 95% de homología con el complemento del gen que codifica el polipéptido. Estos ADN antisentido pueden sintetizarse usando un sintetizador de a Dn .
El ADN antisentido de la presente descripción puede contener azúcares, bases o uniones cambiadas o modificadas. El ADN antisentido, así como el agente de ARNi mencionado anteriormente, también puede proporcionarse en una forma especializada tal como liposomas, microesferas, o puede aplicarse a terapia génica, o puede proporcionarse en combinación con restos unidos. Dichos restos unidos incluyen policationes tales como polilisina que actúan como neutralizadores de carga del núcleo fosfato, o restos hidrofóbicos tales como lípidos (p. ej., fosfolípidos, colesteroles, etc.) que potencian la interacción con las membranas celulares o incrementan la captación del ácido nucleico. Los ejemplos preferidos de los lípidos que se van a unir son colesteroles o derivados de los mismos (p. ej., cloroformato de colesterilo, ácido cólico, etc.). Estos restos pueden estar unidos al ácido nucleico en el extremo 3' o 5' del mismo y también pueden estar unidos al mismo a través de una base, azúcar, o una unión de nucleósido intramolecular. Otros restos pueden ser grupos de recubrimiento específicamente situados en el extremo 3' o 5' del ácido nucleico para prevenir la degradación por nucleasas tales como exonucleasa, ARNasa, etc. Dichos grupos de recubrimiento incluyen, pero no están limitados a, grupos protectores de hidroxilo conocidos en la técnica, incluyendo glicoles tales como polietilen glicol, tetraetilen glicol y semejantes. La acción inhibidora del ADN antisentido puede examinarse usando un sistema de expresión génica basado en una línea celular o un animal de la presente descripción in vivo e in vitro.
Los ácidos nucleicos discutidos anteriormente que codifican uno o más de los polipéptidos o agentes de ARNi mencionados anteriormente pueden clonarse en un vector para administrarlo a células in vitro o in vivo. Para los usos in vivo, la administración puede tener como diana un tejido u órgano específico (p. ej., la piel). La administración dirigida implica el uso de vectores (p. ej., péptidos dirigidos a órganos) que están dirigidos a órganos o tejidos específicos después de la administración sistémica. Por ejemplo, el vector puede tener un conjugado covalente de avidina y un anticuerpo monoclonal frente a una proteína específica de hígado.
En determinadas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para la expresión in vivo de los supresores de metástasis mencionados anteriormente. Dicho método conseguiría su efecto terapéutico por la introducción de secuencias de ácido nucleico que codifican cualquiera de los factores en células o tejidos de un animal humano o no humano que necesita la inhibición del reclutamiento endotelial, invasión de células cancerosas, o angiogénesis metastásica. La administración de las secuencias de ácido nucleico puede conseguirse usando un vector de expresión recombinante tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. Para la administración terapéutica de secuencias de ácido nucleico se prefiere el uso de liposomas dirigidos.
Varios vectores virales que pueden utilizarse para la terapia génica descritos en la presente memoria incluyen, adenovirus, virus adeno-asociados (AAV), virus del herpes, vaccinia, o, preferiblemente, un virus con ARN tal como un retrovirus y un lentivirus. Preferiblemente, el vector retroviral es un lentivirus o un derivado de un retrovirus murino o aviar. Los ejemplos de vectores retrovirales en los que puede insertarse un único gen extraño incluyen, pero no están limitados a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamario murino (MuMTV), y virus del sarcoma de Rous (RSV). Varios vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes.
Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de manera que puedan identificarse y generarse las células transducidas. Los vectores retrovirales pueden hacerse específicos de diana mediante la unión, por ejemplo, de un azúcar, un glicolípido, o una proteína. El direccionamiento preferido se consigue usando un anticuerpo específico de diana u hormona que tiene un receptor en la diana. Los expertos en la técnica reconocerán que las secuencias de polinucleótidos específicas pueden insertarse en el genoma retroviral o unirse a una cubierta viral para permitir la administración específica de diana del vector retroviral.
Otro sistema de direccionamiento para la administración de ácidos nucleicos es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, lechos, y sistemas basados en lípidos incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas, y liposomas. El sistema de dispersión coloidal preferido de esta descripción es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de administración in vitro e in vivo. El ARN, ADN, y viriones intactos pueden encapsularse en el interior acuoso y administrarse a células en una forma biológicamente activa. Los métodos para la transferencia génica eficiente usando un vehículo de liposoma son conocidos en la técnica. La composición del liposoma es habitualmente una combinación de fosfolípidos, habitualmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También pueden usarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica, y la presencia de cationes divalentes.
Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos, y gangliósidos. Los fosfolípidos ejemplares incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina, y distearoilfosfatidilcolina. El direccionamiento de los liposomas también es posible sobre la base de, por ejemplo, especificidad de órgano, especificidad de célula, y especificidad de orgánulo y es conocido en la técnica.
Cuando se usa in vivo, es deseable usar un sistema de administración-expresión reversible. Para este fin, puede usarse el sistema Cre-loxP o FLP/FRT y otros sistemas similares para la administración-expresión reversible de uno o más de los ácidos nucleicos descritos anteriormente. Véanse, WO2005/112620, WO2005/039643, Solicitudes de EE.UU. 20050130919, 20030022375, 20020022018, 20030027335, y 20040216178. En particular, el sistema de administración-expresión reversible descrito en la Solicitud de EE.UU. NO 20100284990 puede usarse para proporcionar una interrupción selectiva o de emergencia.
En otro ejemplo, el agente inhibidor mencionado anteriormente puede ser un polipéptido o un complejo proteico, tal como un anticuerpo. El término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina o parte inmunológicamente activa de la misma, es decir, una parte de unión a antígeno. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, una proteína que tiene al menos una o dos, regiones variables (Vh) de cadena pesada (H), y al menos una o dos regiones variables (Vl) de cadena ligera (L). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariablidad, denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas "regiones marco" (FR). Tal y como se usa en la presente memoria, el término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina humanos reconocidos incluyen los genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), delta, épsilon y mu, así como la miríada de genes de la región variable de inmunoglobulina.
El término "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo (o "parte de anticuerpo") se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (p. ej., LRP1, LRP8, y CTGF). Se ha mostrado que la función de la unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados en el término "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Crn; (ii) un fragmento F(ab% un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1 (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341 :544-546), que consiste en un dominio Vh; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un conector sintético que permite prepararlos como una única cadena de proteína en la que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); véanse, p. ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). También se pretende que dichos anticuerpos de cadena única estén englobados en el término "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas para los expertos en la técnica, y los fragmentos se criban para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
Los anticuerpos que se unen específicamente a una de las proteínas diana mencionadas anteriormente (p. ej., CTGF) pueden prepararse usando métodos conocidos en la técnica. Este anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. En una realización, el anticuerpo puede producirse recombinantemente, p. ej., producirse por exposición en fago o por métodos combinatorios. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano (p. ej., un anticuerpo preparado en un ratón que se ha modificado por ingeniería genética para producir un anticuerpo a partir de una secuencia de inmunoglobulina humana), un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo no humano, por ejemplo, pero no limitado a, un anticuerpo de roedor (ratón o rata), cabra, primate (por ejemplo, pero no limitado a, mono), conejo, o camello. Los ejemplos de métodos para generar una versión humanizada de anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, injerto de Cd R (Queen et al, Pat. de EE.UU. No. 5.585.089; Riechmann et al, Nature 332:323 (1988)), intercambio de cadenas (Pat. de EE.UU. No. 5.565.332); y recubrimiento o modificación en superficie (EP 592.106; EP 519.596); Padlan, Molecular Immunology 28(415):489-498 (1991); Studnicka et al, Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al, PNAS 91: 969-973 (1994)). Los ejemplos de métodos para generar anticuerpos completamente humanos incluyen, pero no están limitados a, generación de anticuerpos a partir de ratones que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana y uso de la tecnología de la exposición en fagos para generar y cribar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana.
Un "anticuerpo aislado" se pretende que se refiera a un anticuerpo que carece sustancialmente de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (p. ej., un anticuerpo aislado que se une específicamente a CTGF carece sustancialmente de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de dicho antígeno). Además, un anticuerpo aislado puede carecer sustancialmente de otro material y/o compuestos químicos celulares.
Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", tal y como se usa en la presente memoria, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una única especificidad y afinidad de unión para un epítopo particular.
El término "anticuerpo humano", tal y como se usa en la presente memoria, se pretende que incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco como CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también deriva de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la descripción pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano", tal y como se usa en la presente memoria, no se pretende que incluya anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamíferos, tales como ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.
El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una única especificidad de unión que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco como CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, p. ej., un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana fusionado con una célula inmortalizada.
El término "anticuerpo humano recombinante", tal y como se usa en la presente memoria, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado de ellos (descrito adicionalmente más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, p. ej., de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinante, combinatoria, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones marco y CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y así las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de y están relacionadas con secuencias de Vh y Vl de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Tal y como se usa en la presente memoria, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (p. ej., IgM o IgG1) que está codificado por los genes de la región constante de la cadena pesada. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en la presente memoria con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". Tal y como se usa en la presente memoria, el término "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-7 M o menos, preferiblemente 10-8 M o menos, más preferiblemente 10-9 M o menos e incluso más preferiblemente 10-10 M o menos para un antígeno diana. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, unión de "alta afinidad" para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-7 M o menos, más preferiblemente 10-8 M o menos.
En un ejemplo, una composición contiene un anticuerpo monoclonal que neutraliza CTGF. En una realización, este anticuerpo puede ser un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo no humano, por ejemplo, pero no limitado a, un anticuerpo de roedor (ratón o rata), cabra, primate (por ejemplo, pero no limitado a, mono), conejo, o camello. En una realización, uno o más aminoácidos de este anticuerpo monoclonal pueden sustituirse con el fin de alterar sus propiedades físicas. Estas propiedades incluyen, pero no están limitadas a, especificidad de unión, afinidad de unión, inmunogenicidad, e isotipo del anticuerpo. Las composiciones farmacéuticas que contienen versiones completamente humanas o humanizadas de los anticuerpos descritos anteriormente pueden usarse para tratar melanoma o para inhibir el reclutamiento endotelial, invasión de células cancerosas, o angiogénesis metastásica.
Tal y como se usa en la presente memoria, un "sujeto" se refiere a un animal humano y no humano. Los ejemplos de un animal no humano incluyen todos los vertebrados, p. ej., mamíferos, tales como mamíferos no humanos, primates no humanos (particularmente primates superiores), perro, roedor (p. ej., ratón o rata), cobaya, gato, y conejo, y no mamíferos, tales como pájaros, anfibios, reptiles, etc. En una realización, el sujeto es un ser humano. En otra realización, el sujeto es un animal experimental o un animal adecuado como un modelo de enfermedad. Un sujeto que se va a tratar para un trastorno puede identificarse por técnicas de diagnóstico estándar para el trastorno. Opcionalmente, el sujeto puede examinarse para determinar mutación, nivel de expresión, o nivel de actividad de uno o más de miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, y CTGF mencionados anteriormente por métodos conocidos en la técnica o descritos anteriormente antes del tratamiento. Si el sujeto tiene una mutación particular en el gen, o si el nivel de expresión génica o el nivel de actividad es, por ejemplo, mayor en una muestra del sujeto que en una muestra de una persona normal, el sujeto es un candidato para el tratamiento de esta descripción.
Para confirmar la inhibición o tratamiento, se puede evaluar y/o verificar la inhibición del reclutamiento endotelial o la angiogénesis resultante usando tecnología conocida en la técnica antes y/o después de la etapa de administración. Las tecnologías ejemplares incluyen angiografía o arteriografía, una técnica de imaginería médica usada para visualizar el interior, o lumen, de los vasos sanguíneos y órganos del cuerpo, que puede hacerse generalmente mediante la inyección de un agente de contraste radio-opaco en el vaso sanguíneo y la formación de imágenes usando técnicas basadas en rayos X tales como fluoroscopía.
"Tratar" o "tratamiento", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a la administración de un compuesto o agente a un sujeto que tiene un trastorno con el propósito de curar, aliviar, atenuar, remediar, retrasar el inicio de, prevenir, o mejorar el trastorno, el síntoma de un trastorno, el estado de enfermedad secundario al trastorno, o la predisposición al trastorno. Una "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad del compuesto o agente que es capaz de producir un resultado médicamente deseable en un sujeto tratado. El método de tratamiento puede realizarse in vivo o ex vivo, solo o conjuntamente con otros fármacos o terapia. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede administrarse en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones y no se pretende que esté limitada a una formulación o ruta de administración particular.
La expresión "cantidad efectiva", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una cantidad suficiente del compuesto de la descripción para presentar el efecto terapéutico deseado. La cantidad exacta requerida variará entre sujetos, dependiendo de la especie, edad, y condición general del sujeto, el agente terapéutico particular y semejantes. Los compuestos de la descripción se formulan preferiblemente en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La expresión "forma de dosificación unitaria", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una unidad físicamente discreta apropiada de agente terapéutico para el paciente que se va a tratar. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente descripción lo decidirá el médico responsable en el alcance del criterio médico sólido. El nivel de la dosis terapéuticamente efectiva específica para cualquier paciente u organismo particular dependerá de una variedad de factores incluyendo el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad anticancerosa del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de la administración, ruta de administración, y tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o de forma coincidente con el compuesto específico empleado; y factores semejantes muy conocidos en las técnicas médicas.
Un agente terapéutico puede administrarse in vivo o ex vivo, solo o coadministrarse conjuntamente con otros fármacos o terapia, es decir, una terapia de mezcla. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "coadministración" o "coadministrado" se refiere a la administración de al menos dos agentes o terapias a un sujeto. Por ejemplo, en el tratamiento de tumores, particularmente tumores malignos vascularizados, los agentes pueden usarse solos o en combinación con, p. ej., agentes quimioterapéuticos, radioterapéuticos, apoptóticos, antiangiogénicos y/o inmunotoxinas o coaguligandos. En algunas realizaciones, la coadministración de dos o más agentes/terapias es concurrente. En otras realizaciones, se administra un primer agente/terapia antes de un segundo agente/terapia. Los expertos en la técnica entienden que las formulaciones y/o rutas de administración de los varios agentes/terapias usados pueden variar.
En una estrategia in vivo, un compuesto o agente se administra a un sujeto. Generalmente, el compuesto se suspende en un vehículo farmacéuticamente aceptable (tal como, por ejemplo, pero no limitado a, disolución salina fisiológica) y se administra oralmente o por infusión intravenosa, o se inyecta o implanta subcutáneamente, intramuscularmente, intratecalmente, intraperitonealmente, intrarrectalmente, intravaginalmente, intranasalmente, intragástricamente, intratraquealmente, o intrapulmonarmente.
La dosificación requerida depende de la elección de la ruta de administración; la naturaleza de la formulación; la naturaleza de la enfermedad del paciente; el tamaño, peso, área superficial, edad, y sexo del sujeto; otros fármacos que se están administrando; y el criterio del médico responsable. Las dosificaciones adecuadas están en el rango de 0,01-100 mg/kg. Se esperan variaciones en la dosificación necesaria a la vista de la variedad de compuestos disponibles y de las diferentes eficiencias de las distintas rutas de administración. Por ejemplo, se esperaría que la administración oral requiera mayores dosificaciones que la administración por inyección i.v. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas estándar para la optimización como se entiende bien en la técnica. La encapsulación del compuesto en un vehículo de administración adecuado (p. ej., micropartículas poliméricas o dispositivos implantables) puede incrementar la eficiencia de la administración, particularmente para la administración oral.
Composiciones
En el alcance de esta descripción está una composición que contiene un vehículo adecuado y uno o más de los agentes terapéuticos descritos anteriormente. La composición puede ser una composición farmacéutica que contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable, una composición dietética que contiene un vehículo dietéticamente aceptable adecuado, o una composición cosmética que contiene un vehículo cosméticamente aceptable.
El término "composición farmacéutica" se refiere a la combinación de un agente activo con un vehículo, inerte o activo, que hace que la composición sea especialmente adecuada para uso de diagnóstico o terapéutico in vivo o ex vivo. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable", después de ser administrado a o en un sujeto, no causa efectos fisiológicos indeseables. El vehículo en la composición farmacéutica debe ser "aceptable" también en el sentido de que sea compatible con el ingrediente activo y pueda ser capaz de estabilizarlo. Pueden utilizarse uno o más agentes solubilizantes como vehículos farmacéuticos para la administración de un compuesto activo. Los ejemplos de un vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen, pero no están limitados a, vehículos biocompatibles, adyuvantes, aditivos, y diluyentes para conseguir una composición usable como una forma de dosificación. Los ejemplos de otros vehículos incluyen óxido de silicio coloidal, estearato de magnesio, celulosa, lauril sulfato de sodio, y D&C Amarillo No. 10.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que son, en el alcance del criterio médico sólido, adecuadas para usarse en contacto con los tejidos de los seres humanos y animales inferiores sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y semejantes excesivos, y son proporcionales con una relación beneficio/riesgo razonable. Las sales farmacéuticamente aceptables de aminas, ácidos carboxílicos, y otros tipos de compuestos, son muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, S.M. Berge, et al. describen sales farmacéuticamente aceptables con detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977). Las sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento y purificación final de los compuestos de la descripción, o separadamente haciendo reaccionar una función de base libre o ácido libre con un reactivo adecuado, como se describe generalmente más adelante. Por ejemplo, una función de base libre puede hacerse reaccionar con un ácido adecuado. Además, cuando los compuestos de la descripción portan un resto ácido, las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas de los mismos pueden incluir sales metálicas tales como sales de metales alcalinos, p. ej., sales de sodio o potasio; y sales de metales alcalinotérreos, p. ej., sales de calcio o magnesio. Los ejemplos de sales de adición a ácido no tóxicas farmacéuticamente aceptables son sales de un grupo amino formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o usando otros métodos usados en la técnica tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables, incluyen sales adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, ptoluenosulfonato, undecanoato, valerato, y semejantes. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, y semejantes. Las sales farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen, cuando sea apropiado, amonio no tóxico, amonio cuaternario, y cationes de amina formados usando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquilo inferior y sulfonato de arilo.
Como se ha descrito anteriormente, las composiciones farmacéuticas de la presente descripción comprenden adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, que, tal y como se usa en la presente memoria, incluye cualquiera y todos los disolventes, diluyentes, u otro vehículo líquido, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y semejantes, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. Remington's Pharmaceutical Sciences, Decimosexta Edición, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) describe varios vehículos usados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de las mismas. Excepto en el caso en el que cualquier medio de vehículo convencional sea incompatible con los compuestos de la descripción, tal como por la producción de cualquier efecto biológico indeseable o la interacción de otra forma de una manera perjudicial con cualquier otro componente de la composición farmacéutica, se contempla que su uso está en el alcance de esta descripción. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetil celulosa de sodio, etil celulosa y acetato de celulosa; goma de tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón; aceite de alazor, aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles; tales como propilen glicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; fosfolípidos naturales y sintéticos, tales como fosfátidos de soja y de yema de huevo, lecitina, lecitina de soja hidrogenada, dimiristoil lecitina, dipalmitoil lecitina, distearoil lecitina, dioleoil lecitina, lecitina hidroxilada, lisofosfatidilcolina, cardiolipina, esfingomielina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, diastearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y sus ésteres pegilados, tales como DSPE-PEG750 y, DSPE-PEG2000, ácido fosfatídico, fosfatidilglicerol y fosfatidilserina. Los grados comerciales de lecitina que se prefieren incluyen aquellos que está disponibles con la marca comercial Phosal® o Phospholipon® e incluyen Phosal 53 MCT, Phosal 50 Pg , Phosal 75 SA, Phospholipon 90H, Phospholipon 90G y Phospholipon 90 NG; fosfatidilcolina de soja (SoyPC) y DSPE-PEG2000 se prefieren particularmente; agentes tamponadores tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua sin pirógenos; disolución salina isotónica; disolución de Ringer; alcohol etílico, y disoluciones de tampón fosfato, así como otros lubricantes no tóxicos compatibles tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saporíferos y perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, según el criterio del formulador.
La composición descrita anteriormente, en cualquiera de las formas descritas anteriormente, puede usarse para tratar melanoma, o cualquier otra enfermedad o afección descrita en la presente memoria. Una cantidad efectiva se refiere a la cantidad de un compuesto/agente activo que se requiere para conferir un efecto terapéutico en un sujeto tratado. Las dosis efectivas variarán, como reconocen los expertos en la técnica, dependiendo de los tipos de enfermedades tratadas, la ruta de administración, uso de excipientes, y la posibilidad de uso simultáneo con otro tratamiento terapéutico.
Una composición farmacéutica de esta descripción puede administrarse parenteralmente, oralmente, nasalmente, rectalmente, tópicamente, o bucalmente. El término "parenteral", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a inyección subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional, o intracraneal, así como a cualquier técnica de infusión.
Una composición inyectable estéril puede ser una disolución o suspensión en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable. Dichas disoluciones incluyen, pero no están limitados a, 1,3-butanodiol, manitol, agua, disolución de Ringer, y disolución de cloruro de sodio isotónica. Además, los aceites fijados se emplean convencionalmente como un medio disolvente o de suspensión (p. ej., mono o diglicéridos sintéticos). Los ácidos grasos, tales como, pero no limitado a, ácido oleico y sus derivados glicéridos, son útiles en la preparación de inyectables, como lo son los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como, pero no limitado a, aceite de oliva o aceite de ricino, versiones polioxietiladas de los mismos. Estas disoluciones o suspensiones de aceite también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga tal como, pero no limitado a, carboximetil celulosa, o agentes de dispersión similares. Otros tensioactivos usados comúnmente, tales como, pero no limitado a, Tweens o Spans u otros agentes emulsionantes similares o potenciadores de la biodisponibilidad, que se usan comúnmente en la fabricación de formas de dosificación sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables también pueden usarse para el propósito de la formulación.
Una composición para la administración oral puede ser una forma de dosificación oralmente aceptable incluyendo cápsulas, comprimidos, emulsiones y suspensiones, dispersiones, y disoluciones acuosas. En el caso de comprimidos, los vehículos usados comúnmente incluyen, pero no están limitados a, lactosa y almidón de maíz. También se añaden típicamente agentes lubricantes, tales como, pero no limitado a, estearato de magnesio. Para la administración oral en una forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen, pero no están limitados a, lactosa y almidón de maíz seco. Cuando las suspensiones o emulsiones acuosas se administran oralmente, el ingrediente activo puede suspenderse o disolverse en una fase de aceite combinado con agentes emulsionantes o de suspensión. Si se desea, pueden añadirse determinados agentes edulcorantes, saporíferos, o colorantes.
Las composiciones farmacéuticas para la administración tópica según la descripción pueden formularse como disoluciones, pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles, o aceites. Alternativamente, las formulaciones tópicas pueden estar en la forma de parches o vendajes impregnados con el ingrediente o los ingredientes activos, que pueden comprender opcionalmente uno o más excipientes o diluyentes. En algunas realizaciones preferidas, las formulaciones tópicas incluyen un material que potenciaría la absorción o penetración del o de los agentes activos a través de la piel u otras áreas afectadas.
Una composición tópica contiene una cantidad segura y efectiva de un vehículo dermatológicamente aceptable adecuado para la aplicación en la piel. Una composición o componente "cosméticamente aceptable" o "dermatológicamente aceptable" se refiere a una composición o componente que es adecuado para su uso en contacto con la piel humana, sin toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alérgica, y semejantes excesivos. El vehículo permite que un agente activo y componente opcional se administre en la piel a una concentración o concentraciones apropiadas. El vehículo puede actuar así como un diluyente, dispersante, disolvente, o semejantes para asegurar que los materiales activos se aplican en y se distribuyen uniformemente sobre la diana seleccionada a una concentración apropiada. El vehículo puede ser sólido, semisólido, o líquido. El vehículo puede estar en la forma de una loción, una crema, o un gel, en particular uno que tiene un espesor suficiente o punto de cedencia para prevenir que los materiales activos sedimenten. El vehículo puede ser inerte o poseer beneficios dermatológicos. También debería ser físicamente y químicamente compatible con los componentes activos descritos en la presente memoria, y no debería alterar excesivamente la estabilidad, eficacia, u otros beneficios del uso asociados con la composición.
Terapias de combinación
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede comprender además un compuesto adicional que tiene actividad antiproliferativa. El compuesto adicional que tiene actividad antiproliferativa puede seleccionarse de un grupo de agentes antiproliferativos incluyendo los mostrados en la Tabla 2.
También se apreciará que los compuestos y composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden formularse y emplearse en terapias de combinación, esto es, los compuestos y composiciones farmacéuticas pueden formularse con o administrarse concurrentemente con, antes de, o posteriormente a, uno o más de otros procedimientos terapéuticos o médicos deseados. La combinación particular de terapias (terapéuticos o procedimientos) para emplearse en un régimen de combinación tendrá en cuenta la compatibilidad de los terapéuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado que se quiere conseguir. También se apreciará que las terapias empleadas pueden conseguir un efecto deseado para el mismo trastorno, o pueden conseguir diferentes efectos (p. ej., el control de cualquier efecto adverso).
Por "agente antiproliferativo" se quiere decir cualquier agente antiproliferativo, incluyendo los agentes antiproliferativos listados en la Tabla 2, cualquiera de los cuales puede usarse en combinación con un agonista de LXR para tratar las afecciones médicas indicadas en la presente memoria. Los agentes antiproliferativos también incluyen derivados de órgano-platino, derivados de naftoquinona y benzoquinona, ácido crisofánico y derivados de antroquinona de los mismos.
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000079_0001
Métodos de diagnóstico y pronóstico
Los genes descritos anteriormente pueden usarse para determinar si un sujeto tiene, o está en riesgo de tener, melanoma metastásico. Alternativamente, pueden usarse para determinar un pronóstico de dicho trastorno en un sujeto.
Métodos de diagnóstico
En un aspecto, la descripción proporciona información cualitativa y cuantitativa para determinar si un sujeto tiene o está predispuesto a melanoma metastásico u otra enfermedad caracterizada por reclutamiento endotelial, invasión de células cancerosas, o angiogénesis metastásica. Un sujeto que tiene dicho trastorno o es propenso al mismo puede determinarse sobre la base de los niveles, patrones o perfiles de expresión de los genes descritos anteriormente o sus productos (ARNm, microARN, o polipéptidos) en una muestra de ensayo del sujeto. En otras palabras, los productos pueden usarse como marcadores para indicar la presencia o ausencia del trastorno. Los ensayos de diagnóstico y pronóstico de la descripción incluyen métodos para evaluar el nivel de expresión de los productos. Los métodos nos permiten detectar el trastorno. Por ejemplo, un incremento relativo del nivel de expresión de uno o más promotores (es decir, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, y CTGF) es indicativo de la presencia del trastorno. A la inversa, un nivel de expresión bajo o una ausencia de la expresión es indicativo de ausencia del trastorno.
La presencia, nivel, o ausencia de un producto de ARNm, microARN, o polipéptido en una muestra de ensayo puede evaluarse mediante la obtención de una muestra de ensayo de un sujeto de ensayo y la puesta en contacto de la muestra de ensayo con un compuesto o un agente capaz de detectar el ácido nucleico (p. ej., sonda de ARN o ADN) o polipéptido. La "muestra de ensayo" incluye tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes en un sujeto. El nivel de expresión de un gen o genes de interés puede medirse de varias maneras, incluyendo la medición del ARN codificado por el gen.
Las muestras de ARN expresado pueden aislarse de muestras biológicas usando varios procedimientos muy conocidos. Por ejemplo, las muestras biológicas pueden lisarse en un tampón de lisis basado en guanidinio, que contiene opcionalmente componentes adicionales para estabilizar el ARN. En algunas realizaciones, el tampón de lisis puede contener ARN purificados como controles para monitorizar la recuperación y estabilidad del ARN de cultivos celulares. Los ejemplos de dichos moldes de ARN purificado incluyen el ARN control positivo para kanamicina de PROMEGA (Madison, WI), y ARN con cola de poli(A) de 7,5 kb de LIFE TECHNOLOGIES (Rockville, MD). Los lisados pueden usarse inmediatamente o almacenarse congelados, p. ej., a -80 °C.
Opcionalmente, el ARN total puede purificarse de lisados celulares (u otros tipos de muestras) usando el aislamiento basado en sílice en un formato de 96 pocillos compatible con la automatización, tal como la plataforma de purificación RNEASY (QIAGEN, Inc., Valencia, CA). Se contemplan otros métodos de aislamiento de ARN, tales como extracción con lechos recubiertos de sílice o guanidinio. Un experto en la técnica puede concebir métodos adicionales para el aislamiento y preparación de los ARN.
Los métodos de la presente descripción pueden realizarse usando muestras crudas (p. ej., sangre, suero, plasma, o lisados celulares), eliminando la necesidad de aislar el ARN. Se añaden opcionalmente inhibidores de ARNasa a las muestras crudas. Cuando se usan lisados celulares crudos, debe indicarse que el ADN genómico puede proporcionar una o más copias de una secuencia diana, p. ej., un gen, dependiendo de la muestra. En situaciones en las que la secuencia diana deriva de uno o más genes altamente expresados, la señal que surge del ADN genómico puede no ser significativa. Pero para los genes expresados a bajos niveles, el fondo puede eliminarse tratando las muestras con ADNasa, o usando cebadores dirigidos a las uniones de corte y empalme para el cebado posterior de ADNc o los productos de la amplificación.
El nivel de ARN correspondiente a un gen en una célula puede determinarse tanto in situ como in vitro. El ARN aislado de una muestra de ensayo puede usarse en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen análisis Southern o Northern, análisis por PCR, y matrices de sondas. Un método de diagnóstico preferido para la detección de los niveles de ARN implica poner en contacto el ARN aislado con una sonda de ácido nucleico que puede hibridar con el ARN codificado por el gen. La sonda puede ser un ácido nucleico de longitud completa o una parte del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 10 nucleótidos de longitud y suficiente como para hibridar específicamente en condiciones astringentes con el ARN.
En un formato, el ARN (o ADNc preparado a partir de este) se inmoviliza en una superficie y se pone en contacto con las sondas, por ejemplo, corriendo el ARN aislado en un gel de agarosa y transfiriendo el ARN del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En otro formato, las sondas se inmovilizan en una superficie y el ARN (o ADNc) se pone en contacto con las sondas, por ejemplo, en una matriz de chip de genes. Un experto en la técnica puede adaptar métodos de detección de ARN conocidos para detectar el nivel de ARN.
El nivel de ARN (o ADNc preparado a partir de este) en una a muestra codificado por un gen que se va a examinar puede evaluarse con la amplificación de ácido nucleico, p. ej., por PCR estándar (Patente de EE.UU. No. 4.683.202), RT-PCR (Bustin S. J Mol Endocrinol. 25: 169-93, 2000), Pc R cuantitativa (Ong Y. et al., Hematology. 7:59-67, 2002), PCR en tiempo real (Ginzinger D. Exp Hematol. 30:503-12, 2002), y PCR in situ (Thaker V. Methods Mol Biol. 115:379-402, 1999), o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas conocidas en la técnica. En otra realización, los métodos de la descripción incluyen además poner en contacto una muestra control con un compuesto o agente capaz de detectar el ARN de un gen y comparar la presencia del ARN en la muestra control con la presencia del ARN en la muestra de ensayo.
Los métodos y marcadores descritos anteriormente pueden usarse para evaluar el riesgo de un sujeto para desarrollar melanoma. En particular, la descripción puede aplicarse a aquellos en cohorte de alto riesgo que ya tienen determinados riesgos de manera que se obtenga una información crítica en la detección temprana. Un cambio en los niveles de los productos génicos miR asociado con melanoma puede detectarse ante de, o en los estadios tempranos de, el desarrollo de fenotipos transformados o neoplásicos en células de un sujeto. La descripción, por lo tanto, proporciona también un método para cribar a un sujeto que está en riesgo de desarrollar melanoma, que comprende evaluar el nivel de al menos un producto génico, o una combinación de productos génicos, asociado con melanoma en una muestra biológica obtenida de la piel del sujeto. De acuerdo con esto, una alteración en el nivel del producto génico, o combinación de productos génicos, en la muestra biológica comparado con el nivel de un producto génico correspondiente en una muestra control, es indicativo de que el sujeto está en riesgo de desarrollar melanoma. La muestra biológica usada para dicho cribado puede incluir tejido de la piel que es bien normal o se sospecha que es canceroso. Los sujetos con un cambio en el nivel de uno o más productos génicos asociados con melanoma son candidatos para una monitorización y ensayo adicionales. Dicho ensayo adicional puede comprender un examen histológico de muestras de tejido, u otras técnicas dentro de la técnica.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "diagnóstico" significa detectar una enfermedad o trastorno o determinar el estadio o grado de una enfermedad o trastorno. Usualmente, un diagnóstico de una enfermedad o trastorno se basa en la evaluación de uno o más factores y/o síntomas que son indicativos de la enfermedad. Esto es, un diagnóstico puede hacerse sobre la base de la presencia, ausencia o cantidad de un factor que es indicativo de la presencia o ausencia de la enfermedad o afección. Cada factor o síntoma que se considera indicativo para el diagnóstico de una enfermedad particular no necesita estar relacionado exclusivamente con la enfermedad particular; es decir, puede haber diagnósticos diferenciales que pueden inferirse de un factor o síntoma del diagnóstico. Asimismo, puede haber casos en los que un factor o síntoma que es indicativo de una enfermedad particular está presente en un individuo que no tiene la enfermedad particular. Los métodos de diagnóstico pueden usarse independientemente, o en combinación con otros métodos de diagnóstico y/o estadificación conocidos en la técnica médica para una enfermedad o trastorno particular, p. ej., melanoma.
Métodos de pronóstico
Los métodos de diagnóstico descritos anteriormente pueden identificar a sujetos que tienen, o están en riesgo de desarrollar, un melanoma. Además, los cambios en los niveles de expresión y/o tendencias de los genes mencionados anteriormente en una muestra biológica, p. ej., muestras de sangre periférica, pueden proporcionar una indicación temprana de la recuperación o ausencia de la misma. Por ejemplo, un incremento adicional (o disminución) o niveles de expresión génica alterados persistentemente de los genes promotores (o genes inhibidores) indican un mal pronóstico, es decir, la ausencia de mejoría o deterioro de la salud. De acuerdo con esto, estos genes permiten evaluar la recuperación posterior al tratamiento de melanoma. El análisis de este grupo seleccionado de genes o de un subconjunto de los mismos indica los resultados de las afecciones.
Los ensayos de pronóstico descritos en la presente memoria pueden usarse para determinar si un sujeto es adecuado para la administración de un agente (p. ej., un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro fármaco candidato) para tratar melanoma u otro trastorno asociado con el reclutamiento endotelial, invasión de células cancerosas, o angiogénesis metastásica. Por ejemplo, dichos ensayos pueden usarse para determinar si puede administrarse a un sujeto un agente quimioterapéutico.
Así, esta descripción también proporciona un método para monitorizar un tratamiento para un trastorno de proliferación celular en un sujeto. Para este propósito, pueden determinarse los niveles de expresión génica de los genes descritos en la presente memoria para muestras de ensayo de un sujeto antes, durante, o después de someterse a tratamiento. Se evalúan entonces las magnitudes de los cambios en los niveles comparado con un nivel de línea base. Una disminución en la expresión de los genes promotores mencionados anteriormente (miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, y CTGF) después del tratamiento indica que el sujeto puede tratarse adicionalmente con el mismo tratamiento. De forma similar, un incremento en los inhibidores (DNAJA4, ApoE, LRP1, y LRP8) también indica que el sujeto puede tratarse adicionalmente con el mismo tratamiento. A la inversa, un incremento adicional o niveles de expresión persistentes altos de uno o más de los genes promotores es indicativo de ausencia de mejoría o deterioro de la salud.
La información obtenida de la práctica de los ensayos anteriores es útil en el pronóstico, identificación de la progresión de, y gestión clínica de enfermedades y otras afecciones perjudiciales que afectan el estado se salud de un sujeto individual. En realizaciones preferidas, los ensayos de diagnóstico anteriores proporcionan información útil en el pronóstico, identificación de la progresión de, y gestión clínica de melanoma y otras afecciones caracterizadas por el reclutamiento endotelial, invasión de células cancerosas, o angiogénesis metastásica. La información ayuda más específicamente al médico en el diseño de regímenes quimioterapéuticos u otros regímenes de tratamiento para erradicar dichas afecciones del cuerpo de un sujeto afectado, un ser humano.
El término "pronóstico", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una predicción del curso y resultado probable de una afección o enfermedad clínica. Un pronóstico se hace habitualmente mediante la evaluación de factores o síntomas de una enfermedad que son indicativos de un curso o resultado favorable o desfavorable de la enfermedad. La expresión "determinar el pronóstico", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere al proceso mediante el cual el experto en la técnica puede predecir el curso o resultado de una afección en un paciente. El término "pronóstico" no se refiere a la capacidad de predecir el curso o resultado de una afección con una exactitud del 100%, en lugar de esto, el experto en la técnica entenderá que el término "pronóstico" se refiere a una probabilidad incrementada de que se producirá un determinado curso o resultado; esto es, que es más probable que se produzca un curso o resultado en un paciente que presenta una afección dada, cuando se compara con aquellos individuos que no presentan la afección.
Los términos "pronóstico favorable" y "pronóstico positivo", o "pronóstico desfavorable" y "pronóstico negativo", tal y como se usan en la presente memoria, son términos relativos para la predicción del curso probable y/o resultado posible de una afección o una enfermedad. Un pronóstico favorable o positivo predice un mejor resultado para una afección que un pronóstico desfavorable o negativo. En un sentido general, un "pronóstico favorable" es un resultado que es relativamente mejor que muchos otros pronósticos posibles que podrían estar asociados con una afección particular, mientras un pronóstico desfavorable predice un resultado que es relativamente peor que muchos otros pronósticos posibles que podrían estar asociados con una afección particular. Los ejemplos típicos de un pronóstico favorable o positivo incluyen una tasa de cura mejor que el promedio, una menor propensión a metástasis, una esperanza de vida más larga de la esperada, la diferenciación de un proceso benigno de un proceso canceroso, y semejantes. Por ejemplo, un pronóstico positivo es uno en el que un paciente tiene una probabilidad del 50% de curarse de un cáncer particular después del tratamiento, mientras el paciente promedio con el mismo cáncer tiene solo una probabilidad del 25% de curarse.
Los términos "determinar", "medir", "evaluar", y "ensayar" se usan indistintamente e incluyen tanto la medición cuantitativa como cualitativa, e incluyen determinar si una característica, rasgo, o propiedad está o no presente. La evaluación puede ser relativa o absoluta. "Evaluar la presencia de" una diana incluye determinar la cantidad de la diana presente, así como determinar si está presente o ausente.
Matrices
En la descripción también se proporciona un biochip o matriz. El biochip/matriz puede contener un sustrato sólido o semisólido que tiene unida una sonda o pluralidad de sondas descritas en la presente memoria. Las sondas pueden ser capaces de hibridar con una secuencia diana en condiciones de hibridación astringentes. Las sondas pueden estar unidas en un sitio definido espacialmente en el sustrato. Puede usarse más de una sonda por secuencia diana, bien con sondas superpuestas o sondas para diferentes secciones de una secuencia diana particular. Las sondas pueden ser capaces de hibridar con secuencias diana asociadas con un único trastorno apreciado por los expertos en la técnica. Las sondas pueden bien sintetizarse en primer lugar, con la unión posterior al biochip, o pueden sintetizarse directamente en el biochip.
"Unido" o "inmovilizado", tal y como se usa en la presente memoria para hacer referencia a un ácido nucleico (p. ej., una sonda) y un soporte sólido puede significar que la unión entre la sonda y el soporte sólido es suficiente como para ser estable en las condiciones de unión, lavado, análisis, y retirada. La unión puede ser covalente o no covalente. Los enlaces covalentes pueden formarse directamente entre la sonda y el soporte sólido o pueden formarse por un entrecruzador o por la inclusión de un grupo reactivo específico bien en el soporte sólido o en la sonda o en ambas moléculas. La unión no covalente puede ser una o más de interacciones electrostáticas, hidrofílicas, e hidrofóbicas. En la unión no covalente se incluye la unión covalente de una molécula, tal como estreptavidina, al soporte y la unión no covalente de una sonda biotinilada a la estreptavidina. La inmovilización también puede implicar una combinación de interacciones covalentes y no covalentes.
El sustrato sólido puede ser un material que puede modificarse para contener sitios individuales discretos apropiados para la unión o asociación de las sondas y es susceptible para al menos un método de detección. Los ejemplos de dichos sustratos incluyen vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluyendo acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, TeflónJ, etc.), polisacáridos, nilón o nitrocelulosa, resinas, sílice o materiales basados en sílice incluyendo silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios y plásticos inorgánicos. Los sustratos pueden permitir la detección óptica sin emitir fluorescencia apreciablemente.
El sustrato puede ser plano, aunque también pueden usarse otras configuraciones de sustratos. Por ejemplo, las sondas pueden ponerse en la superficie interior de un tubo, para el análisis con flujo continuo de la muestra para minimizar el volumen de la muestra. De forma similar, el sustrato puede ser flexible, tal como espuma flexible, incluyendo espumas de células cerradas hechas de plásticos particulares.
La matriz/biochip y la sonda pueden derivatizarse con grupos químicos funcionales para la unión posterior de los dos. Por ejemplo, el biochip puede derivatizarse con un grupo químico funcional incluyendo, pero no limitado a, grupos amino, grupos carboxilo, grupos oxo o grupos tiol. Usando estos grupos funcionales, las sondas pueden unirse usando grupos funcionales en las sondas bien directamente o indirectamente usando un conector. Las sondas pueden unirse al soporte sólido bien por el extremo 5', el extremo 3', o a través de un nucleótido interno. La sonda también puede unirse al soporte sólido de forma no covalente. Por ejemplo, pueden prepararse oligonucleótidos biotinilados, que pueden unirse a superficies recubiertas covalentemente con estreptavidina, lo que da lugar a la unión. Alternativamente, las sondas pueden sintetizarse en la superficie usando técnicas tales como fotopolimerización y fotolitografía. Una discusión detallada de los métodos para unir ácidos nucleicos a un sustrato de soporte puede encontrarse, p. ej., en las Patentes de EE.UU. Nos. 5837832, 6087112, 5215882, 5707807, 5807522, 5958342, 5994076, 6004755, 6048695, 6060240, 6090556, y 6040138.
En algunas realizaciones, un transcrito expresado (p. ej., un transcrito de un gen de microARN descrito en la presente memoria) está representado en las matrices de ácido nucleico. En dichas realizaciones, un conjunto de sitios de unión puede incluir sondas con diferentes ácidos nucleicos que son complementarios diferentes segmentos de la secuencia del transcrito expresado. Los ejemplos de dichos ácidos nucleicos pueden tener una longitud de 15 a 200 bases, 20 a 100 bases, 25 a 50 bases, 40 a 60 bases. Cada secuencia de sonda también puede incluir una o más secuencias conectoras además de la secuencia que es complementaria a su secuencia diana. Una secuencia conectora es una secuencia entre la secuencia que es complementaria a su secuencia diana y la superficie del soporte. Por ejemplo, las matrices de ácido nucleico de la descripción pueden tener una sonda específica para cada gen de microARN diana. Sin embargo, si se desea, las matrices de ácido nucleico pueden contener al menos 2, 5, 10, 100, 200, 300, 400, 500 o más sondas específicas para algún transcrito expresado (p. ej., un transcrito de un gen de microARN descrito en la presente memoria).
Kits
La presente descripción también proporciona kits que incluyen los métodos, composiciones, y sistemas para el análisis de la expresión de los polipéptidos y microARN como se describe en la presente memoria. Dicho kit puede contener un ácido nucleico descrito en la presente memoria junto con cualquiera o todos de los siguientes: reactivos de ensayo, tampones, sondas y/o cebadores, y disolución salina estéril u otra base de emulsión o suspensión farmacéuticamente aceptable. Además, el kit puede incluir materiales de instrucción que contienen indicaciones (p. ej., protocolos) para llevar a la práctica los métodos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, el kit puede ser un kit para la amplificación, detección, identificación o cuantificación de una secuencia de ARNm o microARN diana. Para este fin, el kit puede contener un cebador adecuado (p. ej., cebadores de horquilla), un cebador directo, un cebador inverso, y una sonda.
En un ejemplo, un kit de la descripción incluye uno o más portaobjetos de micromatriz (o formato de micromatriz alternativo) en los que se ha depositado una pluralidad de diferentes ácidos nucleicos (cada uno correspondiente a uno de los genes mencionados anteriormente). El kit también puede incluir una pluralidad de sondas marcadas. Alternativamente, el kit puede incluir una pluralidad de secuencias de polinucleótidos adecuadas como sondas y una selección de marcadores adecuados para personalizar las secuencias de polinucleótidos incluidas, u otras secuencias de polinucleótidos a la discreción del médico. Comúnmente, al menos una secuencia de polinucleótido incluida corresponde a una secuencia control, p. ej., un gen de normalización o semejante. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no están limitados a, un fluoróforo, un tinte, un radiomarcador, una etiqueta enzimática, que está unido a un cebador de ácido nucleico.
En una realización, se proporcionan kits que son adecuados para amplificar ácido nucleico correspondiente a las muestras de ARN expresado. Dicho kit incluye reactivos y cebadores adecuados para uso en cualquiera de los métodos de amplificación descritos anteriormente. Alternativamente, o adicionalmente, los kits son adecuados para amplificar una señal correspondiente a una hibridación entre una sonda y una muestra de ácido nucleico diana (p. ej., depositada en una micromatriz).
Además, se incluyen opcionalmente en el kit uno o más materiales y/o reactivos requeridos para preparar una muestra biológica para el análisis de la expresión génica. Además, en los kits se incluyen opcionalmente una o más enzimas adecuadas para amplificar los ácidos nucleicos, incluyendo varias polimerasas (RT, Taq, etc.), uno o más desoxinucleótidos, y tampones para proporcionar la mezcla de reacción necesaria para la amplificación.
Típicamente, los kits se emplean para analizar patrones de expresión génica usando ARNm o microARN como el molde de partida. El molde de ARN puede presentarse bien como ARN celular total o ARN aislado; ambos tipos de muestra rinden resultados comparables. En otras realizaciones, los métodos y kits descritos en la presente descripción permiten la cuantificación de otros productos de la expresión génica, incluyendo ARNt, ARNr, o u otros productos de la transcripción.
Opcionalmente, los kits de la descripción incluyen además software para acelerar la generación, análisis y/o almacenamiento de datos, y para facilitar el acceso a bases de datos. El software incluye instrucciones lógicas, conjuntos de instrucciones, o programas informáticos adecuados que pueden usarse en la recogida, almacenamiento y/o análisis de los datos. El análisis comparativo y relacional de los datos es posible usando el software proporcionado.
Los kits contienen opcionalmente distintos contenedores para cada reactivo y/o componente enzimático individual. Cada componente generalmente será adecuado según está alicuotado en su contenedor respectivo. El contenedor de los kits incluye opcionalmente al menos un vial, ampolla, o tubo de ensayo. También son posibles frascos, botellas y otros mecanismos de contenedores en los que pueden ponerse y/o alicuotarse los reactivos. Los contenedores individuales del kit se mantienen preferiblemente en confinamiento cerrado para la venta comercial. Los contenedores más grandes adecuados pueden incluir contenedores de plástico moldeados por inyección o soplado en los que se retienen los viales deseados. Con el kit se proporcionan opcionalmente instrucciones, tales como indicaciones escritas o demostraciones en vídeo que detallan el uso de los kits de la presente descripción.
En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona el uso de cualquier composición o kit de la presente memoria, para llevar a la práctica cualquier método o ensayo de la presente memoria, y/o para el uso de cualquier aparato o kit para llevar a la práctica cualquier ensayo o método de la presente memoria.
Una "muestra de ensayo" o una "muestra biológica", tal y como se usa en la presente memoria, puede significar una muestra de tejido o fluido biológico que comprende ácidos nucleicos. Dichas muestras incluyen, pero no están limitadas a, tejido o fluido corporal aislado de animales. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos tales como muestras de biopsia y autopsia, secciones congeladas tomadas para propósitos histológicos, sangre, plasma, suero, esputo, heces, lágrimas, moco, orina, efusiones, fluido amniótico, fluido ascítico, pelo, y piel. Las muestras biológicas también incluyen explantes y cultivos celulares primarios y/o transformados derivados de tejidos de pacientes. Una muestra biológica puede proporcionarse retirando una muestra de células de un animal, pero también puede conseguirse usando células aisladas previamente (p. ej., aisladas por otra persona, en otro momento, y/o para otro propósito), o realizando los métodos descritos en la presente memoria in vivo. También pueden usarse tejidos de archivo, tales como aquellos que tienen un historial de tratamiento o resultado.
El término "fluido corporal" o "fluido del cuerpo" se refiere a cualquier fluido del cuerpo de un animal. Los ejemplos de fluidos corporales incluyen, pero no están limitados a, plasma, suero, sangre, fluido linfático, fluido cerebroespinal, fluido sinovial, orina, saliva, mucosa, flemas y esputo. Una muestra de fluido corporal puede recogerse por cualquier método adecuado. La muestra de fluido corporal puede usarse inmediatamente o puede almacenarse para un uso posterior. Puede usarse cualquier método de almacenamiento adecuado conocido en la técnica para almacenar la muestra de fluido corporal: por ejemplo, la muestra puede congelarse a aproximadamente -20 °C a aproximadamente -70 °C. Los fluidos corporales adecuados son fluidos acelulares. Los fluidos "acelulares" incluyen muestras de fluido corporal en las que las células están ausentes o están presentes en cantidades tan bajas que el nivel de miARN determinado refleja su nivel en la parte líquida de la muestra, en lugar de en la parte celular. Dichos fluidos corporales acelulares se producen generalmente mediante el procesamiento de un fluido corporal que contiene células, por ejemplo, por centrifugación o filtración, para eliminar las células. Típicamente, un fluido corporal acelular no contiene células intactas, sin embargo, algunos pueden contener fragmentos celulares o restos celulares. Los ejemplos de fluidos acelulares incluyen plasma o suero, o fluidos corporales de los que se han eliminado las células.
El término "gen" usado en la presente memoria se refiere a un gen natural (p. ej., genómico) o sintético que comprende secuencias reguladoras de la transcripción y/o traducción y/o una región codificadora y/o secuencias no traducidas (p. ej., intrones, secuencias no traducidas en 5' y 3'). La región codificadora de un gen puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos o un ARN funcional, tal como ARNt, ARNr, ARN catalítico, ARNsi, miARN o ARN antisentido. Un gen también puede ser un ARNm o ADNc correspondiente a las regiones codificadoras (p. ej., exones y miARN) que comprende opcionalmente secuencias no traducidas en 5' o 3' unidas al mismo. Un gen también puede ser una molécula de ácido nucleico amplificada producida in vitro que comprende todo o una parte de la región codificadora y/o secuencias no traducidas en 5' o 3' unidas al mismo. El término también incluye pseudogenes, que son derivados disfuncionales de genes conocidos que han perdido su capacidad de codificar proteínas o no se expresan ya en una célula.
"Perfil de expresión", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un perfil de expresión genómico, p. ej., un perfil de expresión de microARN. Los perfiles pueden generarse por cualquier medio conveniente para determinar un nivel de una secuencia de ácido nucleico p. ej., hibridación cuantitativa de microARN, ARNc, etc., PCR cuantitativa, ELISA para cuantificación, y semejantes, y permite el análisis de la expresión génica diferencial entre dos muestras.
Se ensaya una muestra de un sujeto o paciente, p. ej., células o una colección de las mismas, p. ej., tejidos. Las muestras se recogen por cualquier método conveniente, como se conoce en la técnica. Las secuencias de ácido nucleico de interés son secuencias de ácido nucleico que se encuentra que son predictivas, incluyendo las secuencias de ácido nucleico de las descritas en la presente memoria, en las que el perfil de expresión puede incluir datos de la expresión para 5, 10, 20, 25, 50, 100 o más de, incluyendo todas las secuencias de ácido nucleico listadas. El término "perfil de expresión" también puede significar la medición de la abundancia de las secuencias de ácido nucleico en las muestras medidas.
"Expresión diferencial" se refiere a diferencias cualitativas o cuantitativas en los patrones de la expresión génica temporal y/o celular en y entre células y tejido. Así, un gen expresado diferencialmente puede tener su expresión alterada cualitativamente, incluyendo una activación o inactivación, en, p. ej., tejido normal frente a enfermo. Los genes pueden activarse o desactivarse en un estado particular, respecto a otro estado, permitiendo así la comparación de dos o más estados. Un gen regulado cualitativamente presentará un patrón de expresión en un estado o tipo celular que puede ser detectable por técnicas estándar. Algunos genes se expresarán en un estado o tipo celular, pero no en ambos. Alternativamente, la diferencia en la expresión puede ser cuantitativa, p. ej., en que la expresión se modula, se regula al alza, dando lugar a una cantidad incrementada de transcrito, o se regula a la baja, dando lugar a una cantidad disminuida de transcrito. Solo es necesario que el grado mediante el que la expresión se diferencia sea lo suficientemente grande como para cuantificarlo mediante técnicas de caracterización estándar, tales como matrices de expresión, PCR cuantitativa con transcriptasa inversa, análisis Northern, y protección de ARNasa.
"Ácido nucleico" u "oligonucleótido" o "polinucleótido", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a al menos dos nucleótidos unidos covalentemente entre sí. La representación de una única cadena también define la secuencia de la cadena complementaria. Así, un ácido nucleico también engloba la cadena complementaria de una cadena única representada. Pueden usarse muchas variantes de un ácido nucleico para el mismo propósito que un ácido nucleico dado. Así, un ácido nucleico también engloba ácidos nucleicos sustancialmente idénticos y complementos de los mismos. Una única cadena proporciona una sonda que puede hibridar con una secuencia diana en condiciones de hibridación astringentes. Así, un ácido nucleico también engloba una sonda que hibrida en condiciones de hibridación astringentes.
Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, o pueden contener partes tanto de secuencia bicatenaria como monocatenaria. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN, o un híbrido, donde el ácido nucleico puede contener combinaciones de desoxirribo y ribonucleótidos, y combinaciones de bases incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Los ácidos nucleicos pueden obtenerse por métodos de síntesis química o por métodos recombinantes.
El término "cebador" se refiere a cualquier ácido nucleico que es capaz de hibridar en su extremo 3' con una molécula de ácido nucleico complementaria, y que proporciona un extremo hidroxilo libre en 3' que puede prolongarse por una polimerasa de ácido nucleico. Tal y como se usa en la presente memoria, los cebadores de amplificación son una pareja de moléculas de ácido nucleico que pueden hibridar con regiones 5' o 3' de un gen (cadenas más y menos, respectivamente, o viceversa) y contener una región corta entre ellas. En condiciones apropiadas y con reactivos apropiados, dichos cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores. Para los métodos in situ, una muestra de células o tejido puede prepararse e inmovilizarse en un soporte, tal como un portaobjetos de vidrio, y después ponerse en contacto con una sonda que puede hibridar con ARN. Los métodos alternativos para amplificar ácidos nucleicos correspondientes a muestras de ARN expresado incluyen los descritos, p. ej., en la Patente de EE.UU. No. 7.897.750.
El término "sonda", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un oligonucleótido capaz de unirse a un ácido nucleico diana con secuencia complementaria a través de uno o más tipos de enlaces químicos, habitualmente a través del emparejamiento de bases complementarias, habitualmente a través de la formación de enlaces de hidrógeno. Las sondas pueden unirse a secuencias diana que carecen de una complementariedad completa con la secuencia de la sonda dependiendo de la astringencia de las condiciones de hibridación. Puede haber cualquier número de faltas de concordancia en el emparejamiento de las bases que interferirán con la hibridación entre la secuencia diana y los ácidos nucleicos monocatenarios descritos en la presente memoria. Sin embargo, si el número de mutaciones es tan grande que no puede producirse hibridación incluso en las condiciones de hibridación menos astringentes, la secuencia no es una secuencia diana complementaria. Una sonda puede ser monocatenaria o parcialmente monocatenaria y parcialmente bicatenaria. La disposición de las cadenas de la sonda está dictada por la estructura, composición, y propiedades de la secuencia diana. Las sondas pueden estar marcadas directamente o marcadas indirectamente tal como con biotina a la que posteriormente puede unirse un complejo de estreptavidina.
"Complemento" o "complementario", tal y como se usa en la presente memoria para hacer referencia a un ácido nucleico puede significar el emparejamiento de bases de Watson-Crick (p. ej., A-T/U y C-G) o de Hoogsteen entre nucleótidos o análogos de nucleótido de moléculas de ácido nucleico. Un complemento completo o completamente complementario puede significar un 100% de emparejamiento de bases complementarias entre nucleótidos o análogos de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico.
"Condiciones de hibridación astringentes", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a condiciones en las cuales una primera secuencia de ácido nucleico (p. ej., sonda) hibrida con una segunda secuencia de ácido nucleico (p. ej., diana), tal como en una mezcla compleja de ácidos nucleicos. Las condiciones astringentes son dependientes de secuencia y son diferentes en diferentes circunstancias, y pueden seleccionarse adecuadamente por un experto en la técnica. Las condiciones astringentes pueden seleccionarse para ser aproximadamente 5-10 °C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm puede ser la temperatura (en una fuerza iónica, pH, y concentración de ácido nucleico definidas) a la que el 50% de las sondas complementarias con la diana hibridan con la secuencia diana en el equilibrio (como las secuencias diana están presentes en exceso, a la Tm, el 50% de las sondas están ocupadas en el equilibrio). Las condiciones astringentes pueden ser aquellas en las que la concentración de sal es menor de aproximadamente 1,0 M de ion sodio, tal como aproximadamente 0,01-1,0 M de concentración de ion sodio (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (p. ej., aproximadamente 10-50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (p. ej., mayores de aproximadamente 50 nucleótidos). Las condiciones astringentes también pueden conseguirse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva puede ser al menos 2 a 10 veces la hibridación de fondo. Las condiciones de hibridación astringentes ejemplares incluyen las siguientes: formamida al 50%, 5xSSC, y SDS al 1%, incubación a 42 °C, o, 5xSSC, SDS al 1%, incubación a 65 °C, con lavado en 0,2xSSC, y SDS al 0,1% a 65 °C. Sin embargo, varios factores distintos de la temperatura, tales como la concentración de sal, pueden influir en la astringencia de la hibridación y un experto en la técnica puede seleccionar adecuadamente los factores para conseguir una astringencia similar.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "valor de referencia" se refiere a un valor que se correlaciona estadísticamente con un resultado particular cuando se compara con el resultado de un ensayo. En realizaciones preferidas, el valor de referencia se determina a partir del análisis estadístico de estudios que comparan la expresión de microARN con resultados clínicos conocidos. El valor de referencia puede ser un valor de puntuación umbral o un valor de puntuación de corte. Típicamente, un valor de referencia será un umbral por encima (o por debajo) del cual es más probable un resultado y por debajo del cual es más probable un umbral alternativo.
En una realización, un nivel de referencia puede ser uno o más niveles de miARN circulante expresados como un promedio del nivel del miARN circulante de muestras tomadas de una población control de sujetos sanos (sin enfermedad). En otra realización, el nivel de referencia puede ser el nivel en el mismo sujeto en un momento diferente, p. ej., antes del presente ensayo, tal como el nivel determinado antes de que el sujeto desarrolle la enfermedad o antes de iniciar la terapia. En general, las muestras se normalizan por un factor común. Por ejemplo, las muestras de fluido corporal acelular se normalizan por el volumen de fluido corporal y las muestras que contienen células se normalizan por el contenido de proteínas o el recuento de células. Las muestras de ácido nucleico también pueden normalizarse respecto a un ácido nucleico interno control.
Como se describe en la presente memoria, la diferencia del nivel de uno o más polipéptidos o ARN (ARNm o microARN) es indicativa de una enfermedad o de un estadio de la misma. La expresión "diferencia del nivel" se refiere a diferencias en la cantidad de un marcador particular, tal como un ácido nucleico, en una muestra comparado con un nivel control o de referencia. Por ejemplo, la cantidad de un biomarcador particular puede estar presente en una cantidad elevada o en una cantidad disminuida en muestras de pacientes con una enfermedad neoplásica comparado con un nivel de referencia. En una realización, una "diferencia de un nivel" puede ser una diferencia entre la cantidad de un biomarcador particular presente en una muestra comparado con un control (p. ej., valor de referencia) de al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80% 100%, 150%, 200%, o más. En una realización, una "diferencia de un nivel" puede ser una diferencia estadísticamente significativa entre las cantidades de un biomarcador presente en una muestra comparado con un control. Por ejemplo, una diferencia puede ser estadísticamente significativa si el nivel medido del biomarcador se encuentra fuera de aproximadamente 1,0 desviación estándar, aproximadamente 1,5 desviaciones estándar, aproximadamente 2,0 desviaciones estándar, o aproximadamente 2,5 desviaciones estándar de la media de cualquier grupo control o de referencia. Con respecto a la medición de miARN, el nivel puede medirse a partir de PCR en tiempo real como el valor Ct, que puede normalizarse a un valor ACt como se describe en los Ejemplos más adelante.
Cribado de fármacos
La descripción proporciona un método para identificar un compuesto que es útil para tratar melanoma o para inhibir el reclutamiento endotelial, invasión celular, o angiogénesis metastásica.
Los compuestos candidatos que se van a cribar (p. ej., proteínas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, anticuerpos, moléculas pequeñas, u otros fármacos) pueden obtenerse usando cualquiera de las numerosas estrategias en métodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica. Dichas bibliotecas incluyen: bibliotecas de péptidos, bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen las funcionalidades de péptidos, pero con un nuevo núcleo no peptídico que es resistente a la degradación enzimática); bibliotecas en fase sólida o fase de disolución paralelas espacialmente abordables; bibliotecas sintéticas obtenidas por desconvolución o selección por cromatografía de afinidad; y las bibliotecas "un lecho un compuesto". Véanse, p. ej., Zuckermann etal. 1994, J. Med. Chem. 37:2678-2685; y Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12: 145. Los ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse, p. ej., en DeWitt et al, 1993, PNAS USA 90:6909; Erb et al, 1994, PNAS USA 91: 11422; Zuckermann et al, 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al, 1993, Science 261: 1303; Carrell et al, 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al, 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y Gallop et al, 1994 J. Med.
Chem. 37: 1233. Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en disolución (p. ej., Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421), o en lechos (Lam, 1991, Nature 354:82-84), chips (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), bacterias (Patente de EE.UU. No. 5.223.409), esporas (Patente de EE.UU. No. 5.223.409), plásmidos (Cull et al, 1992, PNAS USA 89: 1865-1869), o fagos (Scott y Smith 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, PNAS USA 87:6378-6382; Felici 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; y Patente de EE.UU. No.
5.223.409).
Para identificar un compuesto útil, se puede poner en contacto un compuesto de ensayo con un sistema que contiene células de ensayo que expresan un gen informador codificado por un ácido nucleico unido de forma operativa a un promotor de un gen marcador seleccionado de los promotores o supresores de metástasis mencionados anteriormente. El sistema puede ser un modelo de una línea celular in vitro o un modelo animal in vivo. Las células pueden expresar de forma natural el gen, o pueden modificarse para expresar un ácido nucleico recombinante. El ácido nucleico recombinante puede contener un ácido nucleico que codifica un polipéptido informador con un promotor heterólogo. Después, se mide el nivel de expresión del miARN, polipéptido, o polipéptido informador.
Para el polipéptido, el nivel de expresión puede determinarse bien a nivel de ARNm o a nivel de proteína. Los métodos para medir los niveles de ARNm en una célula, una muestra de tejido, o un fluido corporal son muy conocidos en la técnica. Para medir los niveles de ARNm, las células pueden lisarse y los niveles de ARNm en los lisados o en ARN purificado o semipurificado de los lisados pueden determinarse por, p. ej., ensayos de hibridación (usando sondas de ADN o ARN específicas de gen marcadas de forma detectable) y RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa (usando cebadores específicos de gen apropiados). Alternativamente, pueden llevarse a cabo ensayos cuantitativos o semicuantitativos de hibridación in situ usando secciones de tejido o suspensiones de células no lisadas, y sondas de ADN o ARN marcadas de forma detectable (p. ej., fluorescentes o enzimas). Los métodos adicionales de cuantificación de ARNm incluyen el ensayo de protección de ARN (RPA) y SAGE. Los métodos para medir los niveles de proteína en una muestra de células o tejido también son conocidos en la técnica.
Para determinar la efectividad de un compuesto candidato para tratar melanoma o inhibir el reclutamiento endotelial, invasión celular, o angiogénesis metastásica, se puede comparar el nivel obtenido de la manera descrita anteriormente con un nivel control (p. ej., uno obtenido en ausencia del compuesto candidato). El compuesto se identifica como efectivo si (i) el nivel de un supresor de la metástasis es menor que un valor control o de referencia o (ii) el nivel de un promotor de la metástasis es mayor que el valor control o de referencia. Se puede verificar adicionalmente la eficacia de un compuesto así identificado usando el modelo de cultivo celular in vitro o un modelo animal in vivo como se describe en el ejemplo más adelante.
Ejemplos (Solo la materia abarcada por el alcance de las reivindicaciones forma parte de la invención).
Ejemplo 1 Materiales y Métodos
Este ejemplo describe los materiales y métodos usados en los Ejemplos 2-11 más adelante.
Compuestos
Tabla 3 Nombres de los compuestos
Figure imgf000086_0001
Estudios en animales
Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en The Rockefeller University. Se usaron ratones de 6-8-semanas de edad con concordancia de edad y de sexo para los ensayos de crecimiento tumoral primario y metástasis como se ha descrito previamente (Minn et al, 2005; Tavazoie et al., 2008). Véanse los Procedimientos Experimentales Extendidos.
Cultivo celular
Todas las líneas celulares de cáncer se cultivaron como se ha descrito previamente (Tavazoie et al, 2008). Se mantuvieron células 293T y células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en condiciones estándar. En los Procedimientos Experimentales Extendidos se detallan los estudios de inactivación/sobreexpresión de miARN y génicos en líneas celulares y los ensayos funcionales in vitro.
Hibridación en micromatriz
Con el fin de identificar los miARN desrregulados en derivados altamente metastásicas, se enriquecieron ARN pequeños del ARN total derivado de las líneas celulares MeWo y A375 y se perfilaron por LC sciences. Con el fin de identificar dianas génicas potenciales de miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908, se marcó ARN total de líneas celulares MeWo y se hibridó en matrices de Expresión BeadChip Illumina HT-12 v3 por la instalación de genómica central de The Rockefeller University. Véanse los Procedimientos Experimentales Extendidos para los umbrales y criterios usados para llegar a las dianas miARN y ARNm.
Análisis de la expresión de miARN en lesiones cutáneas de melanoma humano
Todas las muestras clínicas humanas usadas en este estudio se obtuvieron, procesaron, y analizaron según las directrices de IRB. El ARN total se extrajo de secciones transversales incluidas en parafina de lesiones cutáneas de melanoma primario reseccionadas previamente de pacientes en MSKCC, y se analizaron los niveles de expresión de miARN específicos de una forma ciega usando ensayos de miARN TaqMan (Applied Biosystems). Se generaron curvas de Kaplan-Meier que representan los datos de supervivencia sin metástasis de cada paciente como una función de los valores de expresión de miARN en tumor primario usando el paquete de software GraphPad Prism.
Terapia con LNA in vivo
Después de la inyección en la vena de la cola de 4 x 104 células MeWo-LM2, los ratones NOD-SCID se trataron intravenosamente dos veces a la semana durante cuatro semanas con LNA antisentido optimizados in vivo (Exiqon) frente a miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 a una dosis combinatoria de 12,5 mg/kg administrada en 0,1 mL de PBS.
Histología
Para la visualización macroscópica gruesa de los nódulos metastásicos, se tiñeron con H y E secciones de tejido pulmonar con un grosor de 5 pm. Para el análisis in vivo del contenido endotelial, se tiñeron doblemente secciones pulmonares con anticuerpos frente a MECA-32 (Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of lowa, IA), que marca células endoteliales de ratón, y vimentina humana (Vector Laboratories), que marca células de melanoma humano. Véanse los Procedimientos Experimentales Extendidos.
Análisis de los datos
Todos los datos se representan como media ± SEM. Se usó el ensayo de Kolmogorov-Smirnov para determinar la significancia de las diferencias en las distribuciones acumulativas de densidad de vasos sanguíneos metastásicos. El poder de pronóstico de los miARN para predecir los resultados metastásicos se ensayó para determinar la significancia usando el ensayo de rango logarítmico de Mantel-Cox. Se usó el ensayo de la t de Mann- Whitney de una vía para determinar los valores de significancia para mediciones de bioluminiscencia no Gaussianas. Para todas las demás comparaciones, se usó el ensayo de la t de student de una vía. Los valores p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Ensayos in vivo de selección, metástasis experimental, y crecimiento tumoral primario
Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en The Rockefeller University. Para generar múltiples derivados metastásicos de dos líneas celulares de melanoma humano independientes, se realizó selección in vivo como se ha descrito previamente (Minn et al, 2005 Nature 436, 518-524; Pollacky Fidler, 1982 J. Natl. Cancer Inst. 69, 137-141). Brevemente, se resuspendieron 1 x 106 células parentales de melanoma pigmentadas MeWo o no pigmentadas A375 en 0,1 mL de PBS y se inyectaron intravenosamente en ratones NOD-SCID inmunocomprometidos de 6-8-semanas de edad. Después de la formación de metástasis pulmonares, se disociaron los nódulos y las células se propagaron in vitro, dando lugar a una primera generación de derivados metastásicos pulmonares (LM1). Las células LM1 se sometieron entonces a otra ronda de selección in vivo inyectando 2 x 105 células a través de la vena de la cola en ratones NOD-SCID, dando lugar a nódulos metastásicos, cuya disociación posterior rindió una segunda generación de derivados metastásicos pulmonares (LM2). Para la línea celular A375, se realizó una tercera ronda de selección in vivo, dando lugar a los derivados A375-LM3 altamente metastásicos.
Con el fin de monitorizar las metástasis in vivo a través de imaginería bioluminiscente, las células parentales A375 y MeWo y sus derivados metastásicos se transdujeron con una construcción retroviral que expresa un informador luciferasa (Ponomarev et al., 2004 Eur J Nucl Med Mol Imaging 31, 740-751). Para todos los experimentos de metástasis, se monitorizó la colonización pulmonar o sistémica con el tiempo y se cuantificó mediante imaginería bioluminiscente no invasiva como se ha descrito previamente (Minn et al., 2005). Para determinar si la selección in vivo se había conseguido, se resuspendieron 4 x 104 células parentales MeWo o células MeWo-LM2 y 1 x 105 células parentales A375 o células A375-LM3 en 0,1 mL de PBS y se inyectaron a través de la vena de la cola en ratones NOD-SCID de 6-8 semanas de edad. Para los ensayos de metástasis experimental que ensayan los efectos de los miARN posibles promotores en la colonización pulmonar, se resuspendieron 4 x 104 células parentales MeWo que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, miR-214, o una horquilla control, 4 x 104 células MeWo-LM2 con expresión silenciada de miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, o una secuencia control, y 2 x 105 células A375-LM3 inhibidas para miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908, o una secuencia control en 0,1 mL de PBS y se inyectaron en la vena de la cola de ratones NOD-SCID de 6-8 semanas de edad. Para los experimentos de epistasis, se inyectaron intravenosamente 1 x 105 células MeWo-LM2 que expresan un ARNsh dirigido a ApoE, DNAJA4, o una secuencia control o ARNsi que inhibe LRP1 o una secuencia control en el entorno de la inhibición de miARN en ratones NOD-SCID de 6-8 semanas de edad. Para los experimentos de pretratamiento de ApoE, se incubaron células MeWo-LM2 en presencia de ApoE o BSA a 100 pg/mL a 37 °C. Después de 24 horas, se inyectaron 4 x 104 células a través de la vena de la cola en ratones NOD-SCID de 7 semanas de edad. Para determinar el efecto de pretratar células de melanoma altamente metastásicas con LNA dirigidos a miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 en la metástasis, se transfectaron células MeWo-LM2 con cada LNA individualmente, una mezcla de l Na dirigidos a los tres miARN, o un LNA control. Después de 48 horas, se administraron intravenosamente 1 x 105 células, resuspendidas en 0,1 mL de PBS, en ratones NOD-SCID de 7 semanas de edad para los estudios de colonización metastásica de pulmón o a través de inyección intracardiaca en ratones desnudos atímicos de 7 semanas de edad para los ensayos de metástasis sistémica. Para determinar el efecto de la deleción genética de ApoE en la metástasis, se inyectó intravenosamente a ratones C57BL/6-WT o C57BL/6-ApoE-/- de 8 semanas de edad 5 x 104 células de melanoma de ratón B16F10. Para los estudios de crecimiento tumoral primario, se mezclaron 1 x 106 células parentales MeWo que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control 1:1 con matrigel y se inyectaron subcutáneamente en el flanco inferior derecho de ratones NOD-SCID inmunodeficientes de 6 semanas de edad. Los animales se palparon semanalmente para detectar la formación de tumores, después de lo cual se midieron los tumores mensurables dos veces a la semana. El volumen tumoral se calculó como (diámetro pequeño)2 x (diámetro grande)/2.
Inhibición del miARN lentiviral e inactivación génica
Se sembraron células 293T en una placa de 10 cm y se dejó que alcanzaran el 60% de confluencia. Antes de la transfección, el medio celular se reemplazó con medio DMEM fresco sin antibióticos suplementado con FBS al 10%. Se cotransfectaron 6 pg de vector A, 12 pg de vector K, y 12 pg del miR-Zip apropiado (System Biosciences, Mountain View, CA) o construcción de plásmido ARNsh (MSKCC HTS Core Facility, Nueva York, Ny ) usando 60 pL de reactivo de transfección TransIT-293 (MIR 2700, Minis Bio LLC, Madison, WI). Las células se incubaron a 37 °C durante 48 horas, y el virus se recogió por centrifugación del medio celular durante 10 minutos a 2.000g seguido de la filtración del virus a través de un filtro de 0,45 pm. Se transdujeron 1 x 105 células cancerosas con 2 mL del virus apropiado en presencia de 10 pg/mL de polibreno (TR-1003-G, Millipore, Billerica, MA) durante 6 hrs. Después de 48 horas, se añadieron 2 pg/mL de puromicina (P8833, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) al medio celular para la selección lentiviral. Las células se mantuvieron en selección de puromicina durante 72 horas. Se usaron las siguientes secuencias de miR-Zip:
miR-Zip-199a-3p: 5'-G ATCCG ACAG TA G CCTG CA CA TTA G TCA CTTCCTG TCA G TA A CCA A TG TGC AG ACT ACTGTTTTTTG A ATT-3 ’
miR-Zip-199a-5p: 5'-GATCCGCCCAGTGCTCAGACTACCCGTGCCTTCCTGTCAGGAACAGGTAG TCTG A A C ACTGGGTTTTTG A A TT -3 ’
miR-Zip-19085'-G ATCCGCGG CGG GAACGG CGATCGGCCCTTCCTGTCAGGACCAATCGCCGTCC CC GCCGTTTTTGAATT-3'
Se usaron las siguientes secuencias de ARNsh:
shAPOE1:
5CC G G G A A G G AG TTG A A G G C C TA C A A C TC G A G TTG TA G G C C TTC A A C T C C TTC shAPOE2:
5CC G G G C A G A C A C T G TC T G A G C A G G TC T C G A G A C C TG C T C A G A C A G TG T C TG C TTTTT.V
shDNAJA41:
5 ’CCGGGCGAGAAGTTT A AACTC AT ATCTCG AG AT ATG AGTTT AAACTTCTCGC T T TTT3 ’
shDNAJA42:
5’CCGGCCTCGACAGAAAGTGAGGATTCTCGAGAATCCTCACTTTCTGTCGAGG TTTTT3'
miARN retroviral y sobreexpresión génica
Se cotransfectaron 6 |jg de vector VSVG, 12 |jg de vector Gag-Pol, y 12 |jg de plásmido pBabe que contiene las secuencias codificadoras de ApoE humana, DNAJA4, o un vector vacío o miR-Vec que contiene la secuencia precursora de miR-199a, miR-214, miR-1908, o una horquilla control en células 293T confluentes al 60% usando 60 jL de reactivo de transfección TransIT-293. Las células se incubaron a 37 °C durante 48 horas, después de lo cual el virus se recogió y se transdujo en células cancerosas en presencia de 10 jig/mL de polibreno durante 6 horas. Después de 48 horas, se añadieron 2 jig/mL de puromicina o l0 jig/mL de blasticidina (15205, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) al medio celular para la selección retroviral. Las células se mantuvieron en selección de puromicina durante 72 horas o en selección de blasticidina durante 7 días. Se usaron los siguientes cebadores de clonación para la sobreexpresión de las secuencias codificadoras de ApoE y DNAJA4:
ApoE_CDS Dir ; 5 ’-TC A T G AGGAT CC ATG AAG G TT CTGT GGGCT-3 ’ ApoE CDSJnv : 5 ’-TAGCAGAATTCTCAGTGATTGTCGCTGGG-3 ’ DNAJA4 CDS Dir ; 51-ATCCCTGGATCCATG TG G G AAAG CCTG A C CC-3’ DNAJA4 CDS Inv : 51 -TA CCA TG TCG ACTCATG CCG TCTG G CACTGC-35
Inactivación de miARN basada en LNA
Se transfectaron LNA complementarios a miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-1908 maduros, o una secuencia control (426917-00, 426918-00, 426878-00, y 1990050, respectivamente; Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) a una concentración final de 50 nM en células MeWo-LM2 cancerosas confluentes al 50% cultivadas en medio sin antibióticos usando el reactivo de transfección lipofectamine™ 2000 (11668-09, Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 8 horas, el medio de transfección se reemplazó con medio fresco. Después de 48 horas, se inyectaron 1 x 105 células intravenosamente en ratones NOD-SCID para evaluar la colonización metastásica pulmonar o a través de inyección intracardiaca en ratones desnudos atímicos para evaluar la metástasis sistémica. Para los ensayos de invasión celular y reclutamiento endotelial in vitro, las células se usaron 96 horas después de la transfección.
Inactivación de ARNm basada en ARNsi
Se transfectaron ARNsi dirigidos a LRP1, LRP8, VLDLR, LDLR, o una secuencia control en células cancerosas o HUVEC a una concentración final de 100 nM usando el reactivo de transfección lipofectamine™ 2000. Después de 5 horas, el medio de transfección se reemplazó con medio fresco. Las células se sometieron a ensayos de invasión de matrigel y reclutamiento endotelial 96 horas después de la transfección. Las células transducidas con ARNsi dirigidos a LRP1 o una secuencia control en el entorno de inhibición de miARN se inyectaron a través de la vena de la cola para los ensayos de colonización pulmonar 72 horas después de la transfección. Los ARNsi control no dirigidos se obtuvieron de Dharmacon. Se usaron las siguientes secuencias diana de LRP1 y LRP8:
s i L R P l S’-C G A G G A C G A U G A C U G C U U A -S ';
siLRPl2: 5 M 3 C U A U G A G U U U A A G A A G U U -3 ’ ;
siLRPS1: 5 ’-C G A G G A C G A U G A C U G C U U A -31;
SÍLRP82: 5 -G A A C U A U U C A C G C C U C A U C -3 ’ .
Ensayo de proliferación celular
Para determinar los efectos de la sobreexpresión de miR-199a o miR-1908 y de la inhibición de miARN inducida por LNA combinatoria sobre la proliferación celular, se sembraron 2,5 x 104 células en triplicado en placas de 6 pocillos, y las células viables se contaron después de 5 días. Para evaluar los efectos de la adición de ApoE recombinante en la proliferación de células de melanoma o células endoteliales, se incubaron 3 x 104 células de melanoma MeWo-LM2 o células endoteliales en presencia de ApoE (100 j M) o BSA (100 j M). Las células viables se contaron después de 8, 24, 48, 72, y 120 horas.
Ensayo de invasión de matrigel
Se privaron de suero células cancerosas en medio basado en DMEM con FBS al 0,2% durante 12 horas. Se pre­ equilibraron cámaras de invasión trans-well (354480, BD Biosciences, Bedford, MA) antes de empezar el ensayo por la adición de 0,5 mL de medio de privación a las cámaras superior e inferior. Después de 30 minutos, el medio de la cámara superior se retiró, y se añadieron 0,5 mL de medio que contenía 1 x 105 células cancerosas a cada inserto recubierto con matrigel y se incubó a 37 °C durante 24 horas. Para los experimentos con anticuerpo neutralizante y/o proteína recombinante, se añadió anticuerpo/proteína recombinante a cada pocillo al inicio del ensayo a las siguientes concentraciones como se indica en las figuras: 5-40 jg/m L de anti-ApoE 1D7 (Heart Institute, University of Ottawa), 5-40 jg/mL de anti-IgG (AB-108-C, R&D Systems, Minneapolis, MN), ApoE3 humana recombinante 100 j M (4696, Bio Vision, Mountain View, CA), y BSA 100 j M (A2153, Sigma-Aldrich). Después de la compleción del ensayo, los insertos recubiertos con matrigel se lavaron con PBS, las células en el lado superior de cada inserto se rasparon, y los insertos se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 15 minutos. Los insertos se cortaron entonces y se montaron en portaobjetos usando medio de montaje VectaShield que contenía DAPI (H-1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se formaron imágenes del lado basal de cada inserto usando un microscopio de fluorescencia invertido (Zeiss Axiovert 40 CFL) a un aumento de 5X, tomando tres imágenes representativas para cada inserto. El número de células invadidas se cuantificó usando ImageJ (NIH).
Ensayo de reclutamiento endotelial
Se sembraron 5 x 104 células cancerosas en placas de 24 pocillos aproximadamente 24 horas antes del inicio del ensayo. Se crecieron HUVEC hasta el 80% de confluencia y se privaron de suero en medio EGM-2 suplementado con FBS al 0,2% durante 16 horas. Las HUVEC se pulsaron entonces con tinción Cell Tracker Red c Mt PX (C34552, Invitrogen) durante 45 minutos. Mientras tanto, las células cancerosas se lavaron con PBS, se añadieron 0,5 mL de medio EGM-2 con FBS al 0,2 % a cada pocillo, y un inserto de 3,0 jm HTS Fluoroblock (351151, BD Falcon, San José, CA) se puso en cada pocillo. Se sembraron 1 x 105 HUVEC, resuspendidas en 0,5 mL de medio de privación, en cada inserto trans-well, y se dejó que procediera el ensayo de reclutamiento durante 16-18 horas a 37 °C. Para los experimentos con anticuerpo neutralizante y/o proteína recombinante, se añadió anticuerpo/proteína a cada pocillo a la concentración apropiada como se indica en las figuras: 40 jg/mL de anti-ApoE 1D7, 40 jg/mL de anti-IgG, rhApoE3 100 |j M, y BSA 100 |j M. Después de la compleción del ensayo, los insertos se procesaron y se analizaron como se describe para el ensayo de invasión de matrigel anterior (Véase el Ensayo de Invasión de Matrigel).
Ensayo de migración endotelial
Se pulsaron HUVEC privadas de suero con tinción Cell Tracker Red CMTPX durante 45 minutos y se sembraron en insertos trans-well h Ts Fluoroblock a una concentración de 1 x 105 HUVEC en 0,5 mL de medio de privación para cada inserto. El ensayo se dejó proceder durante 16-18 horas a 37 °C, y los insertos se procesaron y se analizaron como se ha descrito anteriormente (Véase el Ensayo de Invasión de Matrigel).
Ensayo de quimiotaxis
Se privaron de suero HUVEC en medio EGM-2 con FBS al 0,2% durante 16 horas y se marcaron con tinción Cell Tracker Red CMTPX durante 45 minutos. Mientras tanto, se mezclaron las cantidades indicadas (1-5 jg ) de ApoE3 humana recombinante o BSA con 250 jL d e matrigel (356231, BD Biosciences) y se dejó que se solidificara en la parte inferior de una placa de 24 pocillos durante 30 min. Se añadieron entonces 250 jL de medio de HUVEC EGM-2 que contenía FBS al 0,2% a cada pocillo recubierto con matrigel, y se ajustaron insertos de 3,0 j M HTS Fluoroblock en cada pocillo. Se sembraron 1 x 105 HUVEC, resuspendidas en 0,5 mL de medio de privación, en cada inserto y se dejó que migraran a lo largo del gradiente de matrigel durante 16-18 horas a 37 °C. Después de la compleción del ensayo, los insertos se montaron en portaobjetos y se analizaron como se ha descrito anteriormente (Véase el Ensayo de Invasión de Matrigel).
Ensayo de adhesión endotelial
Se sembraron HUVEC en placas de 6 pocillos y se dejó que formaran monocapas. Las células cancerosas se privaron de suero en medio basado en DMEM con FBS al 0,2% durante 30 minutos y se pulsaron con tinción Cell Tracker Green CMFDA (C7025, Invitrogen) durante 45 minutos. Se sembraron 2 x 105 células cancerosas, resuspendidas en 0,5 mL de medio de privación, en cada monocapa endotelial. Se dejó que las células cancerosas se adhirieran a las monocapas de HUVEc durante 30 minutos a 37 °C. Las monocapas endoteliales se lavaron entonces suavemente con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 minutos. Cada pocillo se recubrió entonces con PBS, y se tomaron 8 imágenes para cada monocapa endotelial usando un microscopio de fluorescencia invertido (Zeiss Axiovert 40 CFL) a un aumento de 10X. El número de células cancerosas que se adhirieron a HUVEC se cuantificó usando ImageJ.
Ensayo de Anoikis
Se sembraron 1 x 106 células MeWo que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control en placas de baja adherencia que contenían medio celular suplementado con metilcelulosa al 0,2%. Después de 48 horas en suspensión, los números de células muertas y viables se contaron usando azul de tripán.
Ensayo de privación de suero
Para determinar los efectos de miR-199a y miR-1908 en la capacidad de privación de suero de células de melanoma, se sembraron 1 x 105 células parentales MeWo que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control en cuadruplicado en placas de 6 pocillos y se incubaron en medio basado en DMEM de privación con FBS al 0,2% durante 48 horas, después de lo cual el número de células viables se contó usando azul de tripán. Para determinar el efecto de la adición de ApoE3 recombinante en la supervivencia de células de melanoma o células endoteliales en condiciones de privación de suero, se incubaron 3 x 104 células MeWo-LM2 o células endoteliales en presencia de ApoE3 (100 j M) o BSA (100 j M) en condiciones de bajo contenido de suero (FBS al 0,2%). El número de células viables se contó después de 8, 16, y 24 horas.
Ensayo de formación de colonias
Se sembraron cincuenta células parentales MeWo que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control en cuadruplicado en placas de 6 cm. Después de dos semanas, las células se lavaron con PBS, se fijaron con glutaraldehído al 6%, y se tiñeron con cristal violeta al 0,5%. Se contó el número de colonias con tinción positiva.
Hibridación en micromatriz de miARN
Para la identificación de miARN que muestran una expresión desrregulada en derivados de líneas celulares de melanoma altamente metastásicos, el ARN total de múltiples derivados metastásicos independientes y de sus poblaciones de células parentales MeWo y A375 respectivas se usó para enriquecer para ARN pequeños que se marcaron entonces y se hibridaron en plataformas de micromatrices microfluidas personalizadas por LC sciences. Las matrices se diseñaron para detectar 894 miARN maduros correspondientes a los transcritos de miARN listados en Sanger miRBase Release 13.0. De todas las sondas analizadas, aquellas correspondientes a 169 miARN rindieron una señal por encima del umbral de fondo en las múltiples líneas celulares analizadas. Las intensidades de las señales brutas, correspondientes a la hibridación de la sonda, se normalizaron para la mediana para cada línea celular. Se usó un umbral de 2 veces o más de regulación al alza de los valores de expresión normalizados para la mediana con el fin de identificar miARN inducidos comúnmente en múltiples derivados metastásicos para dos líneas celulares de melanoma humano independientes.
Predicción de dianas génicas basada en micromatriz para miR-199a y miR-1908
Con el fin de identificar genes potenciales a los que están dirigidos miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908, se extrajo el ARN total de líneas celulares MeWo con pérdida o ganancia de función de cada miARN y se envió a la instalación central de genómica The Rockefeller University para hibridación en micromatrices de Expresión Illumina HT-12 v3 BeadChip. Las intensidades de las señales brutas, correspondientes a la hibridación de la sonda, se normalizaron para la mediana para cada muestra de la línea celular. Se generaron tres conjuntos de comparaciones de perfiles de micromatriz: (1) células control MeWo respecto a células MeWo que sobreexpresan miR-199a o miR-1908, (2) células control MeWo-LM2 respecto a células MeWo-LM2 que expresan una horquilla corta (miR-Zip) dirigida a miR-199a-3p, miR-199a-5p, o miR-1908, y (3) células parentales MeWo respecto a células MeWo-LM2. Sobre la base de los valores de expresión normalizados para la mediana de estas matrices, se usaron los siguientes criterios para llegar a posibles genes diana comunes para miR-199a y miR-1908: (1) Genes regulados a la baja más de 1,5 veces después de la sobreexpresión individual de cada miR-199a y miR-1908, (2) Genes regulados al alza más de 1,5 veces después de la inhibición bien de ambos de miR-199a-3p y miR-1908 o ambos de miR-199a-5p y miR-1908, y (3) genes regulados a la baja más de 1,5 veces en células LM2, que expresan niveles fisiológicamente mayores de los tres miARN, respecto a células parentales MeWo.
Análisis de la expresión de miARN y ARNm en líneas celulares
Se extrajo el ARN total de varias líneas celulares usando el kit miRvana (AM 1560, Applied Biosystems, Austin, TX). Los niveles de expresión de miARN maduros se cuantificaron usando el ensayo de expresión de miARN Taqman (4427975-0002228, Applied Biosystems). Se usó RNU44 como un control endógeno para la normalización. Para los análisis de la expresión de ARNm, se transcribieron de forma inversa 600 ng de ARN total usando el kit de Síntesis de Primera Cadena de ADNc (18080-051, Invitrogen), y se mezclaron entonces aproximadamente 200 ng del ADNc resultante con Mezcla Maestra de PCR SYBR verde (4309155, Applied Biosystems) y los cebadores apropiados. Cada reacción se realizó en cuadruplicado, y la expresión de ARNm se cuantificó realizando amplificación por PCR en tiempo real usando un Sistema de PCR en Tiempo Real ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). Se usó GAPDH como un control endógeno para la normalización. Se usaron los siguientes cebadores:
ApoE Dir : y-T G G G T C G C T T T T G G G A T T A C -3 ’
ApoE Inv : 5 ’-TTC A A C T C C T T C A T G G T C T C G -3 ’
DNAJA4_Dir : 5*-C C A G C T T C T C T T C A C C C A T G -3
DNAJA4 Inv S-GCC Ü A A T T T C T T C G TG A C T C C -3 '
G A P D H D ir : 5 '-A G C C A C A T C G C T C A G A C A C -3 '
GAPDH Inv : S’-G C C C A A T A C G A C C A A A T C C O *
LRPl Dir : 5 '-T T T A A C A G C A C C G A G T A C C A G -3 :
Í.RP1 Inv ; 5 ’ C A G G C A G A T G T C A G A G C A G -3 ’
LRPR Dir : 5 ’-G C T A C C C T G G C T A C G A G A T G -3 ’
LRP8 Inv : 5 :-G A T T A G G G A T G G G C T C T T G C -3'
ELISA
Se preparó medio condicionado de células cancerosas incubando las células en medio de privación basado en DMEM con FBS al 0,2% durante 24 horas. Los niveles de ApoE en el medio condicionado se determinaron usando el kit de ELISA para APOE (IRAPKT031, Innovative Research, Novi, Michigan).
Ensayos de informador con luciferasa
Los ensayos de informador con luciferasa heteróloga se realizaron como se ha descrito previamente (Tavazoie et al, 2008). Brevemente, se clonaron 3'UTR y CDS de ApoE y DNAJA4 de longitud completa en 3' de un informador de luciferasa de renilla en el vector informador de luciferasa dual psiCheck2 (C8021, Promega, Madison, WI). Se transfectaron 5 x 104 células MeWo parentales, células MeWo-LM2, células MeWo que sobreexpresan miR-199a, miR-1908, o una horquilla control, y células MeWo-LM2 que expresan una horquilla miR-Zip dirigida a miR-199a-3p, miR199a-5p, miR-1908, o una secuencia control con 100 ng de las construcciones de informador específico respectivas usando el reactivo de transfección TransiT-293. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se lisaron, y la relación de expresión de luciferasa de renilla a luciérnaga se determinó usando el ensayo de luciferasa dual (E1910, Promega). Se identificaron los posibles sitios de unión de miRNA en cada construcción diana por alineamiento con las secuencias de siembra de miARN complementarias (miR-199a-3p: 5-CAGUAGUC-3'; miR-199a-5p: 5'-CCAGUGUU-3'; miR-1908: 5'- GGCGGGGA-3'). Los sitios complementarios de miARN en cada construcción diana se mutaron usando el kit de Mutagénesis Dirigida a Múltiples Sitios QuickChange (200514, Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Sobre la base del análisis de la complementariedad de la secuencia de siembre de miARN, la CDS de ApoE se mutó en la posición 141 (CTG a ACT), la 3'UTR de ApoE se mutó en las posiciones 83 (GCC a ATA) y 98 (CTG a ACA), la CDS de DNAJA4 se mutó en las posiciones 373 (CGC a TAT) y 917 (CTG a a Ga ), y la 3'u TR de DNAJA4 se mutó en las posiciones 576 (CTG a ACA), 1096 (CTG a TCT), 1396 (CGC a TGT), y 1596 (CTG a TGT). Se usaron los siguientes cebadores para clonar las 3'UTR y CDS de ApoE y DNAJA4:
ApoE_CDS Dir : 5 A G T A C C T C G A G G GGATCCTTG A G TCC TAC TC-3 ’
APOE CD S Inv : 5 ’-T A A T T G C G G C C G CTCA G A C A G T G TCTGC A C C C A G -31
DNAJA4_CDS_Dir : 5 ’ -T A A T A T C T C G A G A T G T G G G A A A G C C T G A C C C -3’
DNAJA4 CDSJnv : S’-CAATTGCGG CCG CTC'ATGG CGTCTGG CArTGC'-.V
A P O E 3 ’ U T R D i r : 5-T T A G C C T C G A G A C G C C G A A G C C T G C A G C C A -3 ’
APOE 3 ‘ LJTRJiw : 5 ’-TTA C TG C G G C C G C TG C G TG A A A C TTG G TGA A T C T T -3 ’
DNAJA4 3’UTR Dir : S’-TA A TATC TC G A G C G T G G TG C G G G G C A G C G T-S?
DN AJ A4_3’UTRJnv : 5 ’-C A A T T G C G G C C G C T T A T C T C T C A T A C C A G C T C AAT-3 ’
Se usaron los siguientes cebadores para mutagenizar los sitios de unión de miARN en cada diana:
APOE CDS mut: 5'-GCCAG CG CTG G G AACTG G CAACTG G TCG CTTTTG G G ATTACCT-3’ APOE 3’UTR mutl: 5’-CAG CG G G AG ACCCTG TCCCCATACCAG CCG TCCTCCTG G G G TG -3’ APOE 3'UTR mut2: 5’-TCCCCG CCCCAG CCG TCCTCACAG G G TG G ACCCTAG TTTAATA-3' DNAJA4 C'DS mutl: 5'-GGG ATCGGTGG AG A A G T GCCTATTGT GC AAGGGGCGGGGG A T G-3 ’ DNAJA4 C'DS mut2: 5’-GTAGGGGGCGGGGAACGTGTTATCCGTGAAGAGGTGGCTAGGG-3’ DNAJA4 3’ UTR mutl: 5 ’-C AGGGCC AACTT AGTTCCT A A C ATTCTGTGCCCTTC AGT GG A T-3 ’ DNAJA4 3'UTR mut2: 5’-ACAGTTTG TATG G ACTACTATCTTAAATTATAG CTTG TTTG G A-3’ DNAJA4 3’ UTR mut3: 5’-TA ATT ATT GCT A A AG A AC'T AT GTTTTAGTT GGTA ATGGT GT A A-3 ’ DNAJA4 3'UTR mut4: 5 ’-CAG CTG CA CG G A CCA O CTTCCA TA A A A A CA TTG CCA G CTA G TG A G -3’
Análisis de la expresión de miARN en lesiones cutáneas de melanoma humano
Todas las muestras clínicas humanas usadas en este estudio se obtuvieron, se procesaron y se analizaron de acuerdo con las directrices institucionales de IRB. Se obtuvieron secciones transversales incluidas en parafina de lesiones cutáneas de melanoma humano primario de 71 pacientes humanos de MSKCC. Las muestras se desparafinaron por cinco lavados consecutivos con xileno (5 minutos cada uno). Después de la desparafinación, la región que contenía la malignidad se identificó por tinción con H y E, se diseccionó, y se extrajo de ella el ARN total usando el kit de Aislamiento de Ácido Nucleico Total RecoverAll (AM1975, Applied Biosystems). Los niveles de expresión de miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 maduro en cada muestra se cuantificaron de una forma ciega usando el ensayo de miARN Taqman. Se usó RNU44 como un control endógeno para la normalización. Los niveles de expresión de cada miARN se compararon entre melanomas primarios con propensión a metastatizar y melanomas primarios que no metastatizaban. Se representaron curvas de Kaplan-Meier usando los datos de supervivencia sin metástasis de los pacientes como una función de los niveles de expresión para cada miARN en el tumor de cada paciente. La recurrencia metastásica a sitios tales como pulmón, cerebro, hueso, y tejido blando se documentó previamente y se dejó para un análisis retrospectivo de la relación entre los niveles de expresión de los ARNmi identificados y la recurrencia metastásica.
Histología
Se perfundieron animales con PBS seguido de fijación con paraformaldehído al 4% infundido mediante inyección intracardiaca y posteriormente intratraqueal. Los pulmones se seccionaron, se incubaron en paraformaldehído al 4% a 4 °C toda la noche, se incluyeron en parafina, y se cortaron en incrementos de grosor de 5 pm. Para la visualización macroscópica gruesa de nódulos metastásicos, las secciones pulmonares se tiñeron con H y E. Para el análisis del contenido endotelial en nódulos metastásicos formados por células MeWo de melanoma humano en ratones, secciones de pulmón representativas se tiñeron doblemente con anticuerpos primarios frente a MECA-32 (Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of lowa, IA), que marca células endoteliales de ratón, y vimentina humana (VP-V684, Vector Laboratories), que marca células de melanoma humano. Se usaron varios anticuerpos secundarios conjugados con la tinción Alexa Flour para detectar los anticuerpos primarios. Para determinar la densidad de los vasos sanguíneos en los nódulos metastásicos, se midió la fluorescencia usando un microscopio confocal de barrido láser Zeiss (LSM 510), y la señal de MECA-32 en cada nódulo metastásico, indicada sobre la base de la cotinción con vimentina humana, se cuantificó de una forma ciega usando ImageJ (NIH). Para el análisis del contenido endotelial en los nódulos metastásicos formados por células B16F10 de melanoma de ratón en ratones de tipo salvaje y con inactivación genética de ApoE, se tiñeron secciones de pulmón representativas para MECA-32, y la señal de MECA-32 en cada nódulo, demarcada sobre la base de la pigmentación celular, se cuantificó de una forma ciega. El área de los vasos colectiva, dada como el porcentaje del área cubierta por vasos sanguíneos respecto al área total de cada nódulo metastásico, se obtuvo por sustracción del fondo (radio de bola rodante de 1 píxel) y por el uso de un umbral predeterminado como un punto de corte. Un nódulo metastásico se definió como cualquier región con un área total mayor de 2.000 pm2. Para nódulos grandes, se obtuvo un mínimo de cuatro imágenes representativas, y se calculó su densidad promedio de vasos sanguíneos.
Ensayo de tapón de matrigel in vivo
Se mezclaron 10 pg/mL de ApoE3 humana recombinante (4696, Bio Vision), 10 pg/mL de BSA (A2153, Sigma Aldrich), o 400 ng/ml de v Eg F con matrigel (356231, BD Biosciences) como se indica. Se inyectaron subcutáneamente 400 pL de matrigel que contenía las proteínas recombinantes indicadas justo por encima del flanco ventral de ratones NOD-SCID inmunocomprometidos. Los tapones se extrajeron en el día 3 después de la inyección y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 48 horas. Los tapones se incluyeron entonces en parafina y se seccionaron en incrementos de grosor de 5 pm. Las secciones transversales de los tapones se tiñeron inmunohistoquímicamente usando un anticuerpo primerio frente al antígeno endotelial de ratón MECA-32 (Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of lowa, IA), detectado por un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa, y visualizado posteriormente por oxidación con DAB. Para cuantificar el grado de invasión celular endotelial en cada tapón de matrigel, se contó el número de células endoteliales en 4-5 campos aleatorios para cada tapón, y se calculó el número promedio de células endoteliales por área de tapón dada.
Cultivo tisular
La línea de melanoma humano primario SK-Mel-334 se estableció a partir de una metástasis de tejido blando de un melanoma mutante Braf de un paciente en MSKCC. Después de una expansión mínima in vitro, las células se seleccionaron in vivo (Pollack y Fidler, 1982) para generar los derivados metastásicos en pulmón SK-Mel-334.2. El clon resistente a vemurafenib de SK-Mel-239 (Cl) fue un obsequio de Poulikos Poulikakos (Mount Sinai Medical School) y la línea celular de melanoma murino primario B-RafV600E/+; Pten-/-; CDKN2A-/- fue proporcionada generosamente por Marcus Rosenberg (Yale University). Todas las demás líneas celulares usadas se adquirieron en ATCC.
Elisa de ApoE
Los niveles extracelulares de ApoE en medio condicionado sin suero de células de melanoma tratadas con DMSO, GW3965, o T0901317 (1 pM cada uno) se cuantificaron usando el kit de ELISA de ApoE (Innovative Research) a las 72 horas después del tratamiento.
Transferencia Western
Se homogeneizaron muestras de tejido pulmonar y cerebral de ratón en hielo en tampón RIPA (Sigma-Aldrich) suplementado con inhibidores de proteasas (Roche). Se homogeneizó el tejido adiposo de ratón en hielo en tampón TNET (Tris 1,5 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 2mM, tritón al 1%, inhibidores de proteasas). El lisado de proteínas total (2 |jg) se separó por SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de PVDF, y se ensayó con anticuerpos anti-ApoE de ratón (ab20874, Abeam) y anti-tubulina a/p (2148, Cell Signaling).
Análisis de la expresión de ApoE en muestras clínicas de melanoma
La obtención, procesamiento, y análisis de todas las muestras clínicas se realizaron de acuerdo estrictamente con las directrices de IRB. Las lesiones cutáneas de melanoma primario se reseccionaron previamente de pacientes en MSKCC, se fijaron con formalina, se incluyeron en parafina, y se seccionaron en cortes con un grosor de 5 jm . La expresión de la proteína ApoE se evaluó por análisis doble ciego de inmunohistoquímica usando el anticuerpo D6E10 anti-ApoE (abl906, Abeam).
Histoquímica
Los animales se perfundieron intracardiacamente con PBS seguido de paraformaldehído al 4% (PFA). Los pulmones fijados se incluyeron en parafina y se seccionaron en incrementos de grosor de 5 jm . Los nódulos metastásicos pulmonares macroscópicos se visualizaron por tinción con H y E. Para el análisis del contenido, proliferación, y apoptosis de células endoteliales en el tumor, se tiñeron secciones incluidas en parafina de tumor primario con anticuerpos frente a MECA-32 (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of lowa), KI-67 (abl5580, Abeam), y caspasa-3 escindida (9661, Cell Signaling), respectivamente.
Ensayos de metástasis en la vena de la cola
Las células de melanoma usadas para los ensayos de metástasis in vivo fueron transducidas con una construcción retroviral expresada de forma estable que codifica un gen informador de luciferasa (Ponomarev et al, 2004), lo que nos permite monitorizar la progresión de células de melanoma in vivo mediante imaginería bioluminiscente. Se inyectaron intravenosamente a través de la vena de la cola los siguientes números de células de melanoma, resuspendidas en 100 pL de PBS: 4 x 104 células MeWo, 2,5 x 105 células HT-144, 2 x 105 células SK-Mel-334.2, 5 x 104 células B16F10, y 1 x 105 células YUMM. Las células MeWo, HT-144, y SK-Mel-334.2 se inyectaron en ratones NOD scid con sexo concordante de 6-8 semanas de edad, mientras las células B16F10 y YUMM se inyectaron en ratones C57BL/6 con sexo concordante de 6-8 semanas de edad. En todos los experimentos que evaluaban los efectos de GW3965 sobre la formación de metástasis, los ratones se pretrataron con una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (20 mg/kg) durante 10 días. Para evaluar el efecto del tratamiento con GW3965 sobre las metástasis cerebrales, se inyectaron intracardiacamente 1 x 105 derivados metastásicos cerebrales MeWo en ratones desnudos atímicos. Inmediatamente después de la inyección, los ratones se asignaron aleatoriamente a una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg). Para determinar si la administración oral de GW3965 puede inhibir la progresión de metástasis incipientes, se inyectaron intravenosamente a ratones NOD Scid 4 x 104 células MeWo y dejó que las células colonizaran los pulmones durante 42 días, después de lo cual los ratones se asignaron de manera ciega a una dieta control o una dieta suplementada con tratamiento con GW3965 (100 mg/kg).
Ensayos de metástasis ortotópicos
Para determinar el efecto del tratamiento con GW3965 en la colonización pulmonar por células de melanoma disociadas de un sitio ortotópico, se inyectaron subcutáneamente 1 x 106 células MeWo que expresan un informador de luciferasa en ambos flancos inferiores de ratones NOD Scid. Después de la formación de tumores que tenían un volumen de ~300 mm3, los tumores se escindieron y los ratones se asignaron aleatoriamente a una dieta control o una dieta suplementada con tratamiento con GW3965 (100 mg/kg). Un mes después de la escisión de los tumores, se extrajeron los pulmones y se midió la colonización pulmonar por imaginería bioluminiscente ex vivo. Para confirmar histológicamente el grado de colonización pulmonar del melanoma, los pulmones se fijaron entonces en PFA al 4% toda la noche, se incluyeron en parafina, se seccionaron en incrementos de 5 jm y se tiñeron para vimentina humana (VP-V684, Vector Laboratories).
Generación de células de melanoma resistentes a dacarbazina
Las células de melanoma de ratón B16F10 resistentes a dacarbazina se generaron por el cultivo continuo de las células en presencia de DTIC (D2390, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). En primer lugar, las células se trataron con 500 jg/m L de DTIC durante una semana. Después de este tratamiento inicial con DTIC, se dejó que el resto de las células viables (~10%) se recuperara durante una semana, después de lo cual se añadieron 750 jg/mL de DTIC al medio celular durante 5 días. Posteriormente a este tratamiento con alta dosis, se dejó que las células se recuperaran en presencia de una dosis baja de DTIC (100 jg/mL) durante una semana. Las células se cultivaron entonces continuamente en medio celular que contenía 200 jg/m L de DTIC durante al menos un mes antes de injertar las células en ratones. Se añadió DTIC al medio fresco de las células cancerosas cada 3 días. Para los experimentos de crecimiento tumoral, se inyectaron subcutáneamente 5 x 104 células B16F10 parentales y resistentes a DTIC en el flanco inferior de ratones C57BL/6 de 7 semanas de edad. Después de la formación de tumores pequeños con un volumen de 5-10 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos de tratamiento: (1) dieta control vehículo, i.p.; (2) dieta control DTIC i.p. (50 mg/kg); (3) dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg) vehículo i.p. El DTIC se disolvió en presencia de ácido cítrico (1:1 en peso) en agua y se administró diariamente por inyección intraperitoneal.
El clon de la línea celular de melanoma humano MeWo resistente a DTIC se generó después del tratamiento con DTIC de ratones que portaban tumores MeWo que tenían un volumen de 600-800 mm3. Después de un encogimiento inicial de los tumores en respuesta a la dosificación diaria de DTIC (50 mg/kg, i.p.) durante las primeras dos semanas, los tumores desarrollaron eventualmente resistencia y continuaron su crecimiento, punto en el cual las células tumorales se disociaron y se estableció la línea celular MeWo resistente a DTIC. Las células se expandieron in vitro en presencia de DTIC (200 pg/mL) durante una semana, después de lo cual se volvieron a inyectar 5 x 105 células MeWo resistentes a DTIC en ratones Nod SCID gamma de 8 semanas de edad. Después del crecimiento de los tumores hasta un volumen de 5-10 mm3, los ratones se asignaron de forma ciega a los siguientes grupos de tratamiento: (1) dieta control; (2) dieta control DTIC (50 mg/kg); (3) dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg). Para determinar el efecto de DTIC en el crecimiento tumoral por células MeWo parentales no seleccionadas, se inyectaron subcutáneamente 5 x 05 células MeWo en ratones Nod SCID gamma, y los ratones se trataron con un vehículo control o DTIC (50 mg/kg) posteriormente a la formación de tumores con un volumen de 5-10 mm3. También se administró DTIC diariamente, como se ha descrito anteriormente, en ciclos que consistían en 5 tratamientos diarios consecutivos intercalados con intervalos de 2 días sin tratamiento. El crecimiento tumoral se midió dos veces a la semana.
Modelo iniciado genéticamente de progresión de melanoma
El modelo condicional de progresión de melanoma Tyr::CreER; B-Rave00E/+: Ptenlox/+ / Tyr::CreER; B-RafVS00E/+; Ptenlox/lox se ha establecido y caracterizado previamente por Dankort et al. (2009). Brevemente, se indujo melanoma en estos ratones a las 6 semanas de edad por la inyección intraperitoneal de 4-HT (H6278, 70% de isómero, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) a 25 mg/kg administrado en aceite de cacahuete en tres días consecutivos. La disolución madre de 4-HT se preparó disolviéndolo en EtOH al 100% a 50 mg/mL calentando a 45 °C durante 5 min y mezclando. Una vez disuelto, la disolución madre de 4-HT se diluyó entonces 10 veces en aceite de cacahuete, rindiendo una disolución de trabajo de 5 mg/mL de 4-HT que se inyectó entonces en los ratones. Después de la primera inyección de 4-HT, los ratones se asignaron de forma ciega para recibir bien una dieta control o una dieta suplementada con GW3965 (100 mg/kg). Los ratones se examinaron tres veces a la semana para detectar la presencia y progresión de lesiones de melanoma. En el día 35, se recogieron muestras de piel dorsal de los ratones tratados control y tratados con GW3965, se fijaron en PFA al 4% y se fotografiaron a 10X. El porcentaje del área de lesión de melanoma pigmentada respecto al área de piel total se cuantificó usando ImageJ. Para los análisis de supervivencia, los ratones se monitorizaron diariamente para detectar la progresión de melanoma y se sometieron a eutanasia según una puntuación estándar de condición corporal, teniendo en cuenta los signos iniciales de estado moribundo y malestar asociados con la progresión de la carga de melanoma. Después de la muerte, se recogieron y se examinaron los pulmones, cerebros, y glándulas salivares para determinar la presencia de lesiones de melanoma macroscópicas.
Genotipado de los ratones
Todo el genotipado de los ratones se realizó usando condiciones estándar de PCR, según recomienda Jackson Labs. Se usaron los siguientes cebadores de genotipado para las respectivas reacciones de PCR:
Ratones Tyr::CreER; B-RafV600E/+; Ptenlox/+ y Tyr::CreER; B-RafV600E/+; Ptenlox/lox:
B-Raf Directo: 5'-TGA GTA TTT TTG TGG CAA CTG C-3'
B-Raf Inverso: 5'-CTC TGC TGG GAA AGC GGC-3'
Pten Directo: 5'-CAA GCA CTC TGC GAA CTG AG-3'
Pten Inverso: 5'-AAG TTT TTG AAG GCA AGA TGC-3'
Transgén Cre Directo: 5'-GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC-3'
Transgén Cre Inverso: 5'-GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT-3'
Control Positivo Interno Directo: 5'-CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT-3'
Control Positivo Interno Inverso: 5'-GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC C-3'
Ratones ApoE-/-:
Común Directo: 5'-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3'
Tipo salvaje Inverso: 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3'
Mutante Inverso: 5'-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3'
Ratones LXRa-/-:
Común Directo: 5'-TCA GTG GAG GGA AGG AAA TG-3'
Tipo salvaje Inverso: 5'-TTC CTG CCC TGG ACA CTT AC-3'
Mutante Inverso: 5'-TTG TGC CCA GTC ATA GCC GAA T-3'
Ratones LXRfi-/-:
Común Directo: 5'-CCT TTT CTC CCT GAC ACC G-3'
Tipo salvaje Inverso: 5'-GCA TCC ATC TGG CAG GTT C-3'
Mutante Inverso: 5'-AGG TGA GAT GAC AGG AGA TC-3'
Ensayo de proliferación y viabilidad celular:
Para determinar los efectos de GW3965, T0901317, y Bexaroteno en el crecimiento celular in vitro, se sembraron 2,5 x 104 células de melanoma en triplicado en placas de 6 pocillos y se cultivaron en presencia de DMSO, GW3965, T0901317, o Bexaroteno a 1 pM cada uno. Después de 5 días, se contó el número de células viables y muertas usando la tinción de azul de tripán (72-57-1, Sigma- Aldrich), que marca selectivamente las células muertas.
Ensayo de invasión celular
El ensayo de invasión celular se realizó como se ha descrito previamente con detalle (Pencheva et al., 2012) usando un sistema de cámara de invasión de matrigel trans-well (354480, BD Biosciences). Brevemente, varias células de melanoma se cultivaron en presencia de DMSO, GW3965, T0901317, o Bexaroteno a 1 pM durante 56 horas, después de lo cual las células de melanoma se cambiaron a medio de privación (FBS al 0,2%) durante 16 horas en presencia de cada fármaco. Después de la privación, las células se sembraron en insertos trans-well recubiertos con matrigel, y se dejó proceder el ensayo de invasión durante 24 horas a 37 °C. Para los experimentos con anticuerpos neutralizantes de ApoE, se añadieron 40 pg/mL de anticuerpo bloqueante anti-ApoE 1D7 (Heart Institute, University of Ottawa, Ottawa, Canadá) o 40 pg/mL de anticuerpo anti-IgG control (AB-108-C, R&D Systems, Minneapolis, MN) a cada inserto trans-well al inicio del ensayo.
Ensayo de reclutamiento endotelial
El ensayo de reclutamiento endotelial se llevó a cabo como se ha descrito previamente (Pencheva et al, 2012; Png et al, 2012). Las células de melanoma se trataron con DMSO, GW3965, T0901317, o Bexaroteno a 1 pM durante 56 horas, después de lo cual se sembraron 5 x 104 células en una placa de 24 pocillos en presencia de cada fármaco y se dejó que se unieran durante 16 horas antes de empezar el ensayo. Las células HUVEC se privaron de suero toda la noche en medio EGM-2 que contenía FBS al 0,2%. Al día siguiente, se sembraron 1 x 105 células HUVEC en un inserto de migración trans-well de 3,0 pm HTS Fluoroblock (351151, BD Falcon, San José, CA) ajustado en cada pocillo que contenía células cancerosas en la parte inferior. Se dejó que las células HUVEC migraran hacia las células cancerosas durante 20 horas a 37 °C, después de lo cual los insertos se procesaron como se ha descrito previamente (Pencheva et al., 2012). Para los experimentos de neutralización con anticuerpo de ApoE, se añadieron 40 pg/mL de anticuerpo bloqueante anti-ApoE 1D7 (Heart Institute, University of Ottawa, Ottawa, Canadá) o 40 pg/mL de anticuerpo anti-IgG control (AB-108-C, R&D Systems, Minneapolis, MN) a cada inserto trans-well al inicio del ensayo.
Inactivación génica basada en ARNsh lentiviral
Se integraron ARNsh en partículas lentivirales que se prepararon por transfección de 6 pg de vector A, 12 pg de vector K, y 12 pg de plásmido de ARNsh en células de empaquetamiento HEK-293T, como se ha descrito previamente (Pencheva et al, 2012; Png et al, 2012). La transducción con ARNsh lentivirales se realizó en presencia de 10 pg/mL de polibreno (TR-1003-G, Millipore, Billerica, MA) durante 6 horas, como se ha descrito previamente (Pencheva et al, 2012). Las células se expandieron durante 72 horas después de la transducción y se realizó la selección lentiviral cultivando las células en presencia de 2 pg/mL de puromicina (P8833, Sigma-Aldrich) durante 72 horas.
Se usaron las siguientes secuencias de ARNsh:
Humana:
sh iL X R a: 5 '- C C G G C C G ACTG A TG TTCCCA CG G A TCTC G A G A TCCG TG G G AA CA TCA G TCG G T TTTT-3’
sh2L X R a: 5'-C C G G G CA A CTCA A TG A TG CC G A G TT CTCG A G A A CTC G G CA TCA TTG A G TT G CT TTTT-3’
sh iLXRfi: 5'-CCG G AG AG TG TATCA CC TTCTTG AA CTC G A G TTC AA G A A G G TG A TA CAC TCTT
t t t t -3’
sh 2LXRfl: 5 ’-CCGGG A AGG C ATCC A C T ATCG AG A T CTCG AG ATCTCG A T AGT GG ATGCCTTCT TTTT-3'
sh A poE : 5 ’-CCG G G C'AG ACACTG TCTGAGCAG GTCTCGAG ACCTGCTCAGACAG TG TCTG CT TTTT-3'
Ratón:
sh m L X R a : 5 ’-CC G G G CA A CTCA A TG A TG C T G A G TTC TC G A G A A C TC A G C A T C A T TG A G TTG C T TTTT-3’
sh jm L X R fi: 5 ’-CC G G TG A G A TC A TG T TG C T A G A A A C C TC G A G G TTTC TA G C A A C A TG A TC TC A T TTTTG-3’
sh_nL 4 p o E : 5’-CC G G G A G G A C A CT A TG A C G G A A G TA CTC G A G TA CTT CCG TCA TA G TG TC CTCT TTTT-3’
Análisis de expresión génica por qRT-PCR:
Se extrajo ARN de lisados de células completas usando el kit de Purificación de ARN Total (17200, Norgen, Thorold, Canadá). Se transcribieron entonces de forma inversa 600 ng de ARN total en ADNc usando el kit de Síntesis de Primera Cadena de ADNc (18080-051, Invitrogen), y se realizó amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real como se ha descrito previamente (Pencheva et al., 2012) usando un Sistema de PCR en Tiempo Real ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Austin, TX). Cada reacción de PCR se llevó a cabo en cuadruplicado. La expresión génica se normalizó respecto a GAPDH, que se usó como un control endógeno. Se usaron los siguientes cebadores: Humano:
ApoE Directo: 5'-TGGGTCGCTTTTGGGATTAC-3'
ApoE Inverso: 5'-TTCAACTCCTTCATGGTCTCG-3'
GAPDH Directo: 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'
GAPDH Inverso: 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'
LXRa_Dir: 5'-GTTATAACCGGGAAGACTTTGC-3'
LXRa_Inv: 5'-AAACTCGGCATC ATTGAGTTG-3'
LXRS_Dir: 5'-TTTGAGGGTATTTGAGTAGCGG-3'
¿XRSJnv: 5'-CTCTCGCGGAGTGAACTAC-3'
Ratón:
ApoE Directo: 5'-GACCCTGGAGGCTAAGGACT-3'
ApoE Inverso: 5'-AGAGCCTTCATCTTCGCAAT-3'
GAPDH Directo: 5'-GCACAGTCAAGGCCGAGAAT-3'
GAPDH Inverso: 5'-GCCTTCTCC ATGGTGGTGAA-3'
LXRa Directo: 5'-GCGCTCAGCTCTTGTCACT-3'
LXRa Inverso: 5'-CTCCAGCCACAAGGACATCT-3'
LXRp Directo: 5' -GCTCTGCCTACATCGTGGTC-3'
LXRp Inverso: 5'-CTCATGGCCCAGCATCTT-3'
ABCA1 Directo: 5'-ATGGAGCAGGGAAGACCAC-3'
ABCA1 Inverso: 5'-GTAGGCCGTGCCAGAAGTT-3'
Ensayo de la actividad del promotor de ApoE
El promotor de ApoE, que consiste en una secuencia que abarca 980 pares de bases en 5' y 93 pares de bases en 3' del gen ApoE, se clonó en un vector pGL3-Basic (El 751, Promega Corporation, Madison, WI) en 5' del gen de la luciferasa de luciérnaga usando las enzimas de restricción Nhel y Sacl. Después, se clonaron elementos multipotenciadores 1 (ME.1) y 2 (ME.2) directamente en 5' del promotor de ApoE usando las enzimas de restricción Mlul y Sacl. Para evaluar la activación transcripcional dirigida por el promotor de ApoE y ME.1/ME.2 por los agonistas de LXR, se sembraron 5 x 104 células MeWo en una placa de 24 pocillos. Al día siguiente, se cotransfectaron 100 ng de la construcción pGL3-ME.1/ME.2-promotor de ApoE y 2 ng de la construcción pRL-CMV luciferasa de renilla (E2261, Promega) en células en presencia de DMSO, GW3965, o T0901317 a 1 j M, cada condición en cuadruplicado. Para evaluar la activación transcripcional por LXRa o LXRp, se sembraron 5 x 104 células MeWo que expresan un ARNsh control o ARNsh dirigido a LXRa o LXRp en una placa de 24 pocillos. Al día siguiente, se cotransfectaron 200 ng de la construcción pGL3-ME.1/ME.2-promotor de ApoE y 2 ng de pRL-CMV luciferasa de renilla en células en presencia de DMSO, GW3965, o T0901317 a 1 j M, cada condición en cuadruplicado. Después de 24 horas, las células se lisaron, y el lisado celular se analizó para determinar la actividad de luciferasa de luciérnaga y de renilla usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual (E1960, Promega) y un Lector de Microplacas Bio-Tek Synergy NEO. La señal de luciferasa de luciérnaga se normalizó respecto a la señal de luciferasa de renilla y todos los datos se expresan respecto a la relación de la actividad de luciferasa medida en las células control tratadas con DMSO. Se usaron los siguientes cebadores de clonación:
Promotor de ApoE Directo: 5'-TCA TAG CTA GCG CAG AGC CAG GAT TCA CGC CCT G-3'
Promotor de ApoE Inverso: 5'-TGG TCC TCG AGG AAC CTT CAT CTT CCT GCC TGT GA-3'
ME.1 Directo: 5'-TAG TTA CGC GTA GCC CCC ATC TTT GCC-3'
ME.1 Inverso: 5'-AAT CAG CTA GCC CCT CAG CTG CAA AGC TC-3'
ME.2 Directo: 5'-TAG TTA CGC GTA GCC CCC TCT TTG CC-3'
ME.2 Inverso: 5'-AAT CAG CTA GCC CTT CAG CTG CAA AGC TCT G-3'
Histoquímica tumoral
Los tumores se escindieron de los ratones y se fijaron en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 48 horas. Después, los tumores se incluyeron en parafina y se seccionaron en incrementos de grosor de 5 |jm. Para el análisis del contenido de células endoteliales en los tumores, se tiñeron secciones tumorales con un anticuerpo primario frente al marcador de células endoteliales de ratón MECA-32 (Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of lowa, IA) y se contratiñeron con la tinción nuclear DAPI. Para determinar la proliferación y apoptosis de las células tumorales, se tiñeron secciones tumorales con anticuerpos frente al marcador proliferativo Ki-67 (Abcam, abl5580, Cambridge, MA) y el marcador apoptótico caspasa-3 escindida (9661, Cell Signaling, Danvers, MA), respectivamente. Se usaron varios anticuerpos secundarios conjugados con la tinción Alexa Flour para detectar los anticuerpos primarios. La fluorescencia se midió usando un microscopio de fluorescencia invertido (Zeiss Axiovert 40 CFL) a un aumento de 5X para la tinción de MECA-32 y Ki-67 y un aumento de 10X para la tinción de caspasa-3 escindida. La densidad del contenido de células endoteliales y la tasa de proliferación tumoral se cuantificaron calculando el porcentaje promedio de área con tinción positiva para MECA-32 o Ki- 67 del área tumoral total. La apoptosis tumoral se midió contando el número de células que expresan caspasa-3 escindida por área tumoral dada.
Análisis de la expresión de ApoE en lesiones de melanoma primario
Se reseccionaron muestras cutáneas de melanoma primario humano de pacientes con melanoma en MSKCC, se fijaron en formalina, se incluyeron en parafina, y se seccionaron en incrementos de grosor de 5 jm . Para determinar la expresión de la proteína ApoE, las muestras se desparafinizaron en primer lugar por dos lavados consecutivos con xileno (5 minutos cada uno), y se rehidrataron en una serie de lavados con etanol (EtOH al 100%, 95%, 80%, y 70%). El antígeno ApoE se recuperó incubando las muestras en presencia de proteinasa K (5 pg/mL) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para inactivar la actividad peroxidasa endógena, los portaobjetos se incubaron en disolución de H2 O2 al 3%. Los portaobjetos se bloquearon entonces en tres disoluciones de bloqueo consecutivas de Avidina, Biotina, y suero de caballo durante l5 min cada una a temperatura ambiente (SP-2001, Vector Laboratories, Burlingame, CA). ApoE se detectó por tinción con anticuerpo anti-ApoE D6E10 (abl908, Abcam), que se usó a una dilución 1:100 en PBS a 4 °C toda la noche. El anticuerpo primario fue reconocido entonces incubando los portaobjetos con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (PK- 4002, Vector Laboratories) y se expusieron a reacción de oxidación de DAB (SK-4105, Vector Laboratories). Se tomaron imágenes de los portaobjetos a un aumento de 10X y se analizaron de una manera doble ciega. La expresión de ApoE se cuantificó contando el número de células positivas para DAB y midiendo el área de la tinción de ApoE extracelular. La señal de la tinción de ApoE total se expresó como el porcentaje de área teñida por área tumoral dada, determinada sobre la base de portaobjetos tenidos con H y E concordantes para cada muestra. Se generaron curvas de Kaplan-Meier que representaban los tiempos de supervivencia sin metástasis de los pacientes representando los datos de supervivencia sin recidiva de cada paciente como una función de la expresión de ApoE en la lesión de melanoma primario en ese paciente. Los pacientes cuyos tumores tenían niveles de ApoE menores que la expresión mediana de ApoE de la población se clasificaron como negativos para ApoE, mientras los pacientes cuyos melanomas expresaron ApoE por encima de la mediana se clasificaron como positivos para ApoE. El historial documentado previamente de los pacientes de recurrencia metastásica a sitios tales como pulmón, cerebro, hueso, tejidos blandos y subcutáneos, y piel nos permitió determinar retrospectivamente la relación entre la expresión de ApoE en el sitio de melanoma primario y la recidiva metastásica.
Ejemplo 2 Mir-1908, mir-199a-3p, y mir-199a-5p endógenos promueven la metástasis de melanoma humano
Con el fin de identificar miRNA reguladores de la metástasis de melanoma, se utilizó la selección in vivo (Pollack y Fidler, 1982) con líneas celulares de melanoma humano MeWo pigmentadas y A375 no pigmentadas para generar múltiples derivados metastásicos de pulmón de segunda (LM2) y tercera generación (LM3). La comparación del potencial metastásico de las líneas MeWo- LM2 y A375-LM3 mostró que estos derivados metastatizan de una manera significativamente más eficiente que sus poblaciones parentales respectivas en los ensayos de colonización pulmonar (Figuras 12A-B). El perfilado de ARN pequeños basado en hibridación de 894 miARN maduros seguido de PCR cuantitativa de tallo-bucle (qRT-PCR) reveló que cuatro miARN (miR-1908, miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-214) estaban regulados al alza más de dos veces en múltiples derivados metastásicos A375 y MeWo respecto a sus células parentales respectivas (Figuras 1A-B, 12C). La inducción significativa de miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-214, y miR-1908 en múltiples derivados metastásicos sugirió un papel promotor de metástasis para estos miARN. La transducción mediada por retrovirus y la sobreexpresión de los precursores para miR-199a-3p y miR-199a-5p (sobreexpresados concomitantemente como la horquilla miR-199a) y miR-1908 dieron lugar a un incremento robusto de la colonización pulmonar metastásica sobre la base tanto de la cuantificación de la señal de bioluminiscencia como de la histología pulmonar gruesa (Figura 1C, 12D; incremento de 9,64 veces, P = 0,016 para miR-1908; incremento de 8,62 veces, P = 0,028 para miR-199a), mientras la sobreexpresión de miR-214 no afectó significativamente la metástasis. De forma importante, la sobreexpresión de cada miR-199a y miR-1908 incrementó el número de nódulos metastásicos formados (Figura 12E), lo que es consistente con un papel para estos miARN en el inicio metastásico. Estos descubrimientos también revelaron que miR-199a y miR-1908 eran suficientes para una colonización metastásica aumentada.
A continuación, se llevaron a cabo ensayos para examinar si los niveles endógenos de estos miARN promueven la metástasis. Para este fin, se inhibieron miR-1908 y cada uno de los dos miARN que surgen de la horquilla miR-199a (miR-199a-3p y miR-199a-5p) en las células altamente metastásicas a través de tecnología miR-Zip. La inhibición individual de cada uno de estos miARN suprimió la colonización metastásica más de 7 veces (Figura 1D; P = 0,047 para la inhibición de miR-1908; P = 0,010 para la inhibición de miR-199a-3p; P = 0,015 para la inhibición de miR-199a-5p) y disminuyó dramáticamente el número de nódulos metastásicos formados (Figura 12F).
Para determinar si estos miARN también promueven la metástasis en una línea celular independente, su expresión se silenció en la línea celular derivada metastásica de A375. De hecho, la inhibición de miR-1908, miR-199a-3p, o miR-199a-5p redujo significativamente la capacidad de colonización pulmonar de células A375-LM3 metastásicas (Figura 1E), estableciendo que estos tres miARN son promotores endógenos de la metástasis por células de melanoma humano.
Dados los papeles funcionales robustos de miR-1908, miR-199a-3p, y miR-199a-5p en la promoción de metástasis de melanoma en un modelo en ratón de metástasis de células humanas, se llevaron a cabo ensayos adicionales para examinar si la expresión de estos miARN se correlaciona con la capacidad de las lesiones de melanoma primario humano de metastatizar. Para este fin, se analizaron 71 lesiones cutáneas de melanoma primario obtenidas de pacientes del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) de una forma ciega para determinar los niveles de expresión de miR-1908, miR-199a-3p, y miR-199a-5p mediante qRT-PCR. Consistente con los estudios funcionales anteriores, los tres miARN se indujeron significativamente en melanomas primarios que habían metastatizado respecto a aquellos que no lo habían hecho (Figura 1F; P = 0,037 para miR-1908; P = 0,0025 para miR-199a-3p; P = 0,0068 para miR-199a-5p), lo que sugiere que la expresión regulada al alza de estos miARN en lesiones primarias es un evento temprano predictivo de la progresión del cáncer de melanoma.
Ejemplo 3 Mir-1908, mir-199a-3p, y mir-199a-5p promueven la invasión celular y el reclutamiento endotelial
En este Ejemplo, se llevaron a cabo ensayos para determinar los mecanismos celulares por los que miR-1908, miR-199a-3p, y miR-199a-5p regulan la metástasis.
En primer lugar, se examinó si estos miARN promueven la metástasis mediante el aumento de la proliferación o crecimiento tumoral. Al contrario de esto, la sobreexpresión de cada miARN redujo la proliferación celular (Figura 13A). De forma más importante, la sobreexpresión de miR-1908 no incrementó el crecimiento tumoral primario, mientras la sobreexpresión de miR-199a dio lugar de hecho a una disminución significativa (35%; P < 0,001) en el volumen tumoral (Figura 2a ), lo que indica que los efectos prometastásicos de miR-1908y miR-199a no son secundarios a la promoción del crecimiento tumoral o proliferación celular aumentada.
A continuación, se examinó si estos miARN regulan la invasión celular, un fenotipo metastásico clave. Las células LM2 metastásicas, que expresan mayores niveles de estos miARN, presentaron una capacidad de invasión de matrigel significativamente incrementada respecto a su población parental menos metastásica (Figura 13B). De acuerdo con esto, la sobreexpresión de miR-199a y miR-1908 aumentó individualmente la capacidad de las células MeWo parentales de invadir a través de matrigel (Figura 2B; incremento de tres veces para miR-199; incremento de dos veces para miR-1908). A la inversa, la inhibición individual de miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 disminuyó significativamente la capacidad invasiva de los derivados de células metastásicas de melanoma MeWo-LM2 (Figura 2C) así como A375-LM3 (Figura 2D).
Dados los efectos robustos de estos miARN en la progresión metastásica, se llevaron a cabo análisis adicionales para examinar si pueden regular cualquier fenotipo prometastásico adicional. Aunque la sobreexpresión de miR-199a o miR-1908 no moduló la adhesión de células de melanoma a células endoteliales (Figura 13C), resistencia a anoikis (Figuras 13D), supervivencia en el entorno de privación de suero (Figura 13E), o formación de colonias (Figura 13F), cada miARN aumentó dramáticamente (un incremento de más de tres veces) la capacidad de las células MeWo parentales de reclutar células endoteliales en ensayos de reclutamiento endotelial trans-well (Figura 2E). Consistente con esto, las células Mewo-LM2 metastásicas, que sobreexpresan fisiológicamente miR-199a y miR-1908, fueron más eficientes para reclutar células endoteliales respecto a sus células parentales (Figura 13G). A la inversa, la inhibición de miR-199a-3p, miR-199a-5p, o miR-1908 en las células metastásicas MeWo-LM2 (Figura 2F) así como A375-LM3 (Figuras 2G) suprimió el reclutamiento endotelial, lo que es consistente con el requerimiento y suficiencia de estos miARN para una capacidad aumentada de reclutamiento endotelial de células metastásicas de melanoma.
Para determinar si miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 endógenos regulan el reclutamiento endotelial por las células metastásicas in vivo, se llevaron a cabo ensayos para examinar la densidad de los vasos sanguíneos metastásicos realizando una coinmunotinción para vimentina humana, que marca células de melanoma humano MeWo, y el antígeno de células endoteliales de ratón (MECA-32), que marca células endoteliales de ratón. De forma sorprendente, la inhibición de miR-199a-3p, miR-199a-5p, o miR-1908 individualmente dio lugar a disminuciones pronunciadas (un promedio de 3 veces para miR-199a-3p y miR-199a-5p y 4,7 veces para miR-1908) en la densidad de los vasos sanguíneos en los nódulos metastásicos (Figura 2H; P < 0,001 para miR-199a-3p; P < 0,001 para miR-199a-5p; y P < 0,001 para miR-1908), lo que revela un papel de estos miARN en la promoción del contenido endotelial metastásico y angiogénesis metastásica. A la inversa, la sobreexpresión de cada miARN en células de melanoma poco metastásicas incrementó dramáticamente la densidad de los vasos sanguíneos metastásicos (Figura 13H). Estos descubrimientos revelan que miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 son necesarios y suficientes para una invasión y reclutamiento endotelial aumentados durante la progresión del melanoma.
Ejemplo 4 Mir-1908, mir-199a-3p, y mir-199a-5p toman como diana de forma convergente y cooperativa a Apoe y DNAJA4
En este ejemplo, se empleó una estrategia sistemática y no sesgada para identificar las dianas moleculares directas de estos miARN.
Como miR-1908, miR-199a-3p, y miR-199a-5p median los mismos conjuntos de fenotipos in vitro e in vivo y miR-199a-5p y miR-199a-3p surgen de la misma horquilla precursora, se estableció la hipótesis de que los fenotipos prometastásicos de estos miARN pueden surgir a través del silenciamiento de genes diana comunes. Dado que los miARN de mamíferos actúan predominantemente desestabilizando los transcritos de ARNm diana (Guo et al., 2010 Nature 466, 835- 840), se realizó un perfilado transcriptómico de células de melanoma en el contexto tanto de pérdida como de ganancia de función para cada miARN. Esto reveló un pequeño conjunto de genes que estaban reprimidos tanto por miR-199a como por miR-1908 y que también presentaban niveles menores en los derivados LM2 metastásicos, que expresan niveles endógenos mayores de estos miARN (Figura 14A). La RT-PCR cuantitativa validó dos genes, el gen metabólico de la Apolipoproteína E (ApoE) y la proteína de choque térmico DNAJA4, como modulados significativamente por miR-199a y miR-1908 y silenciados dramáticamente en las células LM2 altamente metastásicas (Figuras 3Ay 14B-D).
Para determinar si ApoE y DNAJA4 son dianas directamente de miR-1908, miR-199a-3p, y miR-199a-5p, se examinaron los efectos de cada miARN en la estabilidad de sus posibles dianas a través de ensayos del informador luciferasa heterólogo. De forma interesante, la sobreexpresión de miR-199a reprimió la estabilidad de la región no traducida en 3' (UTR) y la secuencia codificadora (CDS) tanto de ApoE como de DNAJA4, mientras la sobreexpresión de miR-1908 desestabilizó la 3'UTR de ApoE y la 3'UTR y CDS de DNAJA4. Consistente con el direccionamiento directo, la mutación de las secuencias complementarias de miARN en cada diana suprimió la regulación mediada por miARN (Figura 3B). En un ensayo directo de direccionamiento endógeno, la inhibición de miARN individuales en células LM2 metastásicas dio lugar a una estabilidad incrementada de la diana (Figuras 3C) que se suprimió después de mutar los sitios diana de miARN (Figura 14E), lo que revela que ApoE es una diana directa de miR-1908 y miR-199a-5p y que DNAJA4 es una diana directa de los tres miARN (Figura 3D). De forma importante, las CDS y las 3'UTR de estos dos genes fueron menos estables en las células LM2 altamente metastásicas, que expresan niveles fisiológicamente mayores de los tres miARN reguladores, lo que indica que el direccionamiento endógeno hacia ApoE y DNAJA4 de estos miARN es relevante para la metástasis de melanoma (Figura 3E).
Dada la convergencia molecular de miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 en genes diana comunes, se examinó a continuación si estas dianas, ApoE y DNAJA4, podrían mediar los fenotipos metastásicos conferidos por estos miARN. La sobreexpresión de cada gen en las células LM2 metastásicas dio lugar a reducciones pronunciadas en los fenotipos de invasión celular y reclutamiento endotelial (Figuras 3F-G, 14F). A la inversa, la inactivación de ApoE o DAJA4 en las células poco metastásicas usando horquillas independentes aumentó significativamente la invasión celular y el reclutamiento endotelial (Figuras 3H-I, 14G), lo que revela que ApoE y DNAJA4 actúan como supresores endógenos de estos fenotipos prometastásicos - consistente con el hecho de ser dianas de los miARN promotores de metástasis mencionados anteriormente.
Ejemplo 5 ApoE y DNAJA4 median la invasión metastásica, reclutamiento endotelial, y colonización dependiente de miR-199a y miR-1908
Para determinar si ApoE y DNAJA4 son los efectores biológicos directos aguas abajo de miR-199a y miR-1908, se llevaron a cabo ensayos para examinar si estos dos genes diana interaccionan epistáticamente con cada miARN. Como se esperaba, el silenciamiento de los miARN redujo la capacidad de invasión y de reclutamiento endotelial de células de melanoma altamente metastásicas. De forma importante, la inactivación de ApoE o DNAJA4 en el entorno de la inhibición de miARN ocluyó significativamente la supresión de la invasión (Figuras 4A y 4C) y el reclutamiento endotelial (Figuras 4B y 4D) después del silenciamiento de cada miARN. De forma sorprendente, la inactivación de cualquiera de estos genes en células deplecionadas para miR-1908 o miR-199a-5p rescató completamente la supresión dramática de la colonización metastásica, que resulta de la inhibición de miARN (Figura 4E-F, 15E). A la inversa, la sobreexpresión de ApoE o DNAJA4 en células que sobreexpresan miR-1908 (Figura 4G-H, 15F) o miR-199a (Figura 15G-I) fue suficiente para suprimir la invasión celular y el reclutamiento endotelial. Adicionalmente, la sobreexpresión de ApoE o DNAJA4 fue suficiente para inhibir la colonización metastásica mediada por miARN (Figura 15J). De forma importante, ApoE y DNAJA4 también se requirieron para la invasión celular y el reclutamiento endotelial aumentados dependientes de miARN por las células A375-LM3 altamente metastásicas (Figuras 4 I-J, 15K).
Para determinar si ApoE y DNAJA4 también regulan el reclutamiento endotelial metastásico dependiente de miARN in vivo, se realizó la coinmunotinción de metástasis de melanoma (vimentina humana) y células endoteliales (MECA-32) en nódulos metastásicos pulmonares formados por células con inactivación para cada uno de estos genes en el contexto de la inhibición de miARN. Notablemente, la inactivación de ApoE o DNAJA4 dio lugar a un incremento significativo (>3,5 veces) de la densidad de los vasos sanguíneos metastásicos en metástasis que surgen de células con silenciamiento de miARN (Figura 4K, P < 0,01 para células con inactivación tanto de ApoE como de DNAJA4). Estos descubrimientos revelan que ApoE y DNAJA4 son efectores directos aguas abajo de los fenotipos de invasión metastásica, colonización, y reclutamiento endotelial dependientes de miARN inducidos por estos miARN prometastásicos en melanoma.
Ejemplo 6 La ApoE secretada por células de melanoma es un mediador tanto necesario como suficiente de la invasión y el reclutamiento endotelial, mientras la deleción genética de ApoE promueve la metástasis
ApoE es un factor secretado. Como tal, se examinó si la ApoE secretada por células de melanoma podría suprimir la invasión y el reclutamiento endotelial. De acuerdo con esto, los niveles de ApoE extracelulares, detectados por ELISA, fueron 3,5 veces menores en células LM2 metastásicas - que expresan niveles mayores de miR-199a y miR-1908 -que en sus células parentales menos metastásicas (Figura 5A). Los niveles de ApoE secretada también se suprimieron significativamente por miR-199a y miR-1908 endógenos (Figuras 5B y 16A).
A continuación, la inhibición de ApoE mediante el uso de un anticuerpo neutralizante (1D7) que reconoce el dominio de unión a receptor de ApoE aumentó tanto la invasión celular (Figura 5C; incremento de 1,68 veces) como el reclutamiento endotelial (Figura 5D; incremento de 1,84 veces) por las células MeWo parentales, que expresan altos niveles endógenos de ApoE (Figura 14C). A la inversa, la adición de ApoE humana recombinante suprimió significativamente la invasión y el reclutamiento endotelial por células LM2 metastásicas (Figura 5E), que presentan bajos niveles de ApoE endógena (Figura 14C). De forma importante, la adición de ApoE recombinante no afectó la proliferación de células de melanoma o células endoteliales in vitro (Figura 16B-C) o la supervivencia en condiciones de privación de suero (Figura 16D-E), lo que indica que la supresión de estos fenotipos por ApoE recombinante no es secundaria a una disminución de la proliferación o a una supervivencia alterada. Consistente con que ApoE esté epistáticamente aguas abajo de miR-199a y miR-1908, la neutralización de ApoE con el anticuerpo neutralizante de ApoE 1D7 suprimió significativamente los fenotipos suprimidos de invasión y reclutamiento endotelial observados con la inhibición de cada miARN (Figuras 5F-G). Los descubrimientos anteriores revelan que la ApoE secretada por células de melanoma es un supresor necesario y suficiente de los fenotipos de invasión y reclutamiento endotelial dependientes de miARN en melanoma.
Se llevaron a cabo ensayos adicionales para investigar el mecanismo por el cual DNAJA4, una proteína de choque térmico poco caracterizada, media el reclutamiento endotelial y la invasión. Dadas las características comunes fenotípicas presentadas por ApoE y DNAJA4, se estableció la hipótesis de que DNAJA4 puede jugar un papel regulador y aumentar los niveles de ApoE. De hecho, la inactivación de DNAJA4 redujo tanto los niveles de transcrito de ApoE (Figura 16F) como los niveles de ApoE secretada (Figura 5H), mientas la sobreexpresión de DNAJA4 elevó sustancialmente la expresión de ApoE (Figura 16G). Consistente con que DNAJA4 actúa aguas arriba de ApoE, la adición de ApoE recombinante suprimió los fenotipos aumentados de invasión celular y reclutamiento endotelial observados con la inactivación de DNAJA4 (Figura 5I-J). A la inversa, la supresión de los fenotipos de invasión y reclutamiento endotelial observados con la sobreexpresión de DNAJA4 se ocluyeron significativamente por la neutralización de ApoE con anticuerpo (Figuras 16H-I). Estos descubrimientos revelan que DNAJA4 suprime la invasión y el reclutamiento endotelial del melanoma a través de la regulación positiva de la expresión de ApoE y secreción resultante.
A la vista de la convergencia reguladora de los tres miARN promotores de la metástasis y el gen DNAJA4 en ApoE, se llevaron a cabo ensayos para determinar si la expresión de ApoE se correlaciona con la progresión de melanoma humano. Para este fin, se analizaron datos publicados de expresión basados en matrices para ApoE (Haqq et al, 2005 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102, 6092-6097) en lesiones nevi, primarias, y metastásicas. Consistente con un papel supresor de la metástasis, los niveles de ApoE fueron significativamente menores en metástasis en órganos distales respecto a lesiones primarias (P < 0,025) y nevi (P < 0,0003) (Figura 5K).
Dada su correlación significativa con la progresión del melanoma humano, a continuación se examinó si el incremento de la señalización de ApoE en células de melanoma podría tener una eficacia terapéutica en la supresión de las metástasis de melanoma. Más específicamente, las células MeWo-LM2 metastásicas se preincubaron con ApoE recombinante o BSA durante 24 horas antes de la inyección en ratones. De forma sorprendente, el pretratamiento de las células cancerosas con ApoE suprimió de forma robusta la colonización metastásica más de 300 veces (Figura 5L). Esta supresión dramática de las metástasis por preincubación con ApoE de células de melanoma refleja que los efectos de ApoE sobre las células de melanoma son cruciales para el inicio metastásico, ya que las células pretratadas con ApoE presentan una capacidad invasiva reducida, que es necesaria para iniciar los eventos metastásicos que dan lugar a la colonización pulmonar.
Dada la influencia robusta ejercida por ApoE en la metástasis y los fenotipos metastásicos, así como su fuerte asociación con la progresión del melanoma humano, se llevaron a cabo ensayos adicionales para investigar el impacto de la deleción genética de ApoE sistémica en la progresión del melanoma en un modelo de ratón inmunocompetente de metástasis de melanoma. Consistente con un papel supresor importante para ApoE extracelular en las metástasis, las células B16F10 de melanoma de ratón inyectadas en la circulación presentaron un incremento mayor de 7 veces en la colonización metastásica en ratones con ApoE genéticamente inactivada ratones comparado con sus compañeros de camada de tipo salvaje (Figura 5M). Estos descubrimientos establecen que ApoE sistémica y secretada por cáncer es un supresor robusto de las metástasis de melanoma humano y de ratón.
Ejemplo 7 La ApoE extracelular toma como diana de forma divergente los receptores LRP1 de células de melanoma y LRP8 de células endoteliales
En este ejemplo, se llevaron a cabo ensayos para investigar los mecanismos moleculares por los que ApoE suprime las metástasis.
Con el fin de identificar el o los receptores de ApoE que median la invasión, todos los cuatro receptores conocidos de ApoE, VLDLR, LRP1, LRP8, y LDLR (Hatters et al, 2006 Trends Biochem. Sci. 31, 445-454; Hauser et al, 2011 Prog. Lipid Res. 50, 62-74) se inactivaron en células de melanoma. De forma interesante, la inactivación de LRP1, pero no de los demás receptores de ApoE, suprimió el efecto de supresión de la invasión celular inducido por ApoE recombinante (Figura 6A). De forma importante, la inactivación de LRP1 en células LM2 metastásicas, que presentan bajos niveles de ApoE, solo incrementó de forma modesta la invasión celular (Figura 17A), lo que sugiere que los efectos de LRP1 están mediados por la ApoE endógena.
Para determinar si LRP1 también media los efectos dependientes de miARN en la invasión y colonización metastásica, se inactivó LRP1 en el contexto de inhibición de miARN. La inactivación de LRP1 en el entorno de silenciamiento de miARN rescató el fenotipo de invasión suprimido que surge de la inhibición de miARN (Figuras 6B, 17B). Consistente con estos resultados in vitro, la inactivación de l RP1 aumentó significativamente la colonización metastásica in vivo por células LM2 silenciadas para miR-1908 (Figura 6C, 17C). Estos descubrimientos revelan que LRP1 está epistáticamente aguas abajo de la invasión y colonización metastásica de melanoma dependiente de miARN/ApoE.
Aunque el fenotipo de invasión refleja los efectos autónomos de células de ApoE en células de melanoma, el fenotipo de reclutamiento endotelial sugiere un papel no autónomo de células de la ApoE expresada por cáncer directamente en las células endoteliales. Consistente con esto, el pretratamiento de células endoteliales con ApoE redujo significativamente su capacidad de migrar hacia células cancerosas altamente metastásicas (Figura 6D). Con el fin de identificar el o los receptores de ApoE en las células endoteliales que median el fenotipo de reclutamiento endotelial, los cuatro receptores de ApoE conocidos se inactivaron en células endoteliales. De forma interesante, a diferencia de la invasión de células cancerosas, la inactivación de LRP8 endotelial, pero no de cualquiera de los demás receptores, suprimió selectivamente y significativamente la inhibición del reclutamiento endotelial causada por el silenciamiento de miARN (Figuras 6E, 17D-E). Estos descubrimientos son consistentes con que el receptor l RP8 sea el mediador endotelial aguas abajo de los efectos en el reclutamiento endotelial dependientes de miARN/ApoE.
A continuación, se llevaron a cabo ensayos para examinar si la señalización de ApoE/LRP8 también podría regular la migración endotelial general en un sistema sin células cancerosas. De acuerdo con esto, la neutralización con anticuerpo de ApoE, que está presente en el medio de las células endoteliales, aumentó significativamente la migración endotelial (Figura 6F), mientras la ApoE recombinante fue suficiente para inhibir la migración endotelial en un ensayo trans-well (Figura 6G) y en un ensayo quimiotáctico basado en gradiente (Figura 6H) de una manera dependiente del receptor LRP8 de células endoteliales. De forma importante, la adición de ApoE dio lugar a una supresión dramática (mayor de 40 veces) del reclutamiento endotelial inducido por VEGF in vivo en tapones de matrigel subcutáneos (Figura 6I).
Dado el requerimiento y suficiencia de ApoE para mediar el reclutamiento endotelial, se llevaron a cabo ensayos adicionales para examinar si la ApoE sistémica podría regular la angiogénesis metastásica. Consistente con la supresión robusta del contenido endotelial metastásico por ApoE secretada por células de melanoma (Figura 4K), los ratones con inactivación genética de ApoE presentaron mayores densidades de vasos sanguíneos en sus nódulos metastásicos pulmonares formados por células B16F10 de melanoma de ratón comparado con sus compañeros de camada de tipo salvaje (Figura 6J; incremento de 2,41 veces, P = 0,0055). Tomados conjuntamente, los descubrimientos anteriores revelan papeles duales autónomos de células/no autónomos de células para ApoE en la supresión de la metástasis a través de una señalización divergente mediada por los receptores LRP1 de células de melanoma y LRP8 de células endoteliales.
Ejemplo 8 MiR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 como dianas robustas de pronóstico y terapéuticas en metástasis de melanoma
Para examinar si los miARN promotores de la metástasis descritos en la presente memoria podían servir como predictores clínicos de resultados metastásicos, se cuantificaron los niveles de expresión de miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 de una forma ciega por qRT-PCR en una cohorte de muestras de melanoma humano obtenidas de pacientes en MSKCC. Se determinó entonces la relación entre los niveles de estos miARN en lesiones de melanoma primarias y los resultados de recidiva metastásica.
De forma importante, los pacientes cuyas lesiones de melanoma primarias expresaban mayores (mayores que la mediana para la población) niveles de miR-199a-3p, miR-199a-5p, o miR-1908 eran más propensos a desarrollar metástasis distales y presentaron tiempos de supervivencia sin metástasis significativamente más cortos que los pacientes cuyos melanoma primarios expresaban niveles menores de estos miARN (Figuras 7A-C, P = 0,0032 para miR-199a-3p, P = 0,0034 para miR-199a- 5p, y P = 0,027 para miR-1908). De forma sorprendente, los niveles de expresión agregados de los tres miARN presentaron la capacidad de pronóstico más fuerte en la estratificación de pacientes en alto riesgo de aquellos con muy bajo riesgo para recidiva metastásica (Figura 7D, P < 0,0001). Estos descubrimientos clínicos son consistentes con la cooperatividad funcional entre estos miARN en la regulación de la progresión del cáncer y sugieren la utilidad de estas moléculas como biomarcadores del pronóstico clínico de las metástasis de melanoma.
A la vista de la ausencia actual de opciones de tratamiento efectivas para la prevención de las metástasis de melanoma y el fuerte valor de pronóstico de los tres miARN reguladores en las metástasis de melanoma, estos miARN se tomaron como diana terapéuticamente usando terapia de LNA antisentido (Elmer et al, 2008(a); Elmer et al, 2008(b)). Las células MeWo-LM2 altamente metastásicas pretratadas con oligonucleótidos LNA antisentido frente a miR-199a-3p, miR-199a-5p, o miR-1908 maduros presentaron aproximadamente una disminución de cuatro veces en la actividad metastásica. Dada la evidencia clínica de cooperatividad entre estos miARN, se examinó el impacto del silenciamiento de los tres miARN en la progresión metastásica. De forma importante, la cotransfección de LNA frente a los tres miARN suprimió la colonización metastásica más de setenta veces, lo que revela la sinergia y cooperatividad dramática entre los miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 endógenos (Figura 7E, P = 0,004). De forma importante, la inhibición de estos miARN con un pretratamiento con triple LNA no dio lugar a una disminución de la proliferación in vitro (Figura 18 A), lo que indica que el fenotipo de supresión dramática de la metástasis no es secundario a una proliferación alterada. El direccionamiento combinatorio de miARN mediado por LNA en la línea derivada metastásica de A375 independiente también inhibió significativamente la colonización pulmonar (Figura 18B).
A continuación, se examinó si la inhibición combinatoria de miARN inducida por LNA podía suprimir la metástasis de melanoma sistémica a múltiples órganos distantes. De hecho, la inyección intracardiaca de células de melanoma altamente metastásicas pretratadas con una mezcla de LNA dirigidos a los tres miARN reguladores reveló que los miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 endógenos promueven la metástasis de melanoma sistémico (Figura 7f ). La inhibición mediada por LNA combinatoria de los tres miARN dio lugar a una reducción en el número de focos metastásicos sistémicos (Figura 7G) en sitios distales tales como el cerebro y los huesos (Figuras 7H-I).
Se llevaron a cabo ensayos adicionales para examinar la eficacia terapéutica de LNA optimizados in vivo administrados sistémicamente en la prevención de la metástasis del melanoma. Para este fin, se inyectaron células MeWo-LM2 altamente metastásicas en ratones. Al día siguiente, los ratones se trataron intravenosamente con LNA dirigidos a miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 a una dosis baja total de (12,5 mg/kg) en una base bisemanal durante cuatro semanas. Notablemente, un tratamiento con LNA combinatorio redujo la colonización pulmonar 9 veces (Figura 7J, P = 0,031) sin ningún signo aparente de toxicidad (Figura 18C). Tomados conjuntamente, los descubrimientos anteriores revelan una nueva red reguladora dependiente de miARN que converge en la señalización de ApoE para controlar las características autónomas de células y no autónomas de células de la progresión metastásica del melanoma (Figura 7K). Los estudios básicos anteriores han identificado un conjunto de miARN con un potencial poderoso de pronóstico y terapéutico en la gestión clínica del melanoma.
Ejemplo 9 La toma como diana dependiente de miARN de la señalización de ApoE/LRP1 promueve la invasión de células cancerosas y el reclutamiento endotelial a través de la inducción de CTGF
En este ejemplo, se identificó al Factor de Crecimiento del Tejido Conectivo (CTGF) como un mediador aguas abajo de la señalización de ApoE/LRP1 en la invasión de células cancerosas y el reclutamiento endotelial. El nivel de expresión de CTGF, como se determina por análisis de qRT-PCR y ELISA, está mediado por la señalización de ApoE/LRP1 (Figura 8A, 8B, y 8C). Adicionalmente, la invasión de células cancerosas y el reclutamiento endotelial regulados por ApoE/LRP1 están mediados por CTGF (Figura 8D, 8E).
Ejemplo 10 CTGF media la invasión metastásica, el reclutamiento endotelial, y la colonización dependientes de miARN
En este Ejemplo, se llevaron a cabo ensayos para investigar si CTGF media la invasión y el reclutamiento endotelial dependientes de miARN. Brevemente, se realizaron ensayos de invasión celular trans-well y reclutamiento endotelial en células MeWo parentales que sobreexpresan miR-199a o miR-1908 en presencia de un anticuerpo bloqueante dirigido a CTGF. De hecho, se encontró que la invasión metastásica y el reclutamiento endotelial dependientes de mir-199a y mir-1908 están mediados por CTGF (Figura 9A y 9B). Con el fin de investigar si la metástasis de melanoma in vivo (colonización metastásica) está mediada por CTGF, se realizó imaginería bioluminiscente en metástasis pulmonares por 5 x 104 células MeWo parentales con inactivación de CTGF en el entorno de la sobreexpresión de miR-199a o miR-1908. La inactivación de CTGF en este entorno dio lugar a una reducción significativa de las metástasis de melanoma in vivo (Figura 9C).
Ejemplo 11 El tratamiento con el agonista de LXR GW3965 eleva los niveles de ApoE y DNAJA4 en células de melanoma y suprime la invasión de células cancerosas, el reclutamiento endotelial, y la colonización metastásica
Se ha mostrado previamente que agonistas del Receptor X Hepático (LXR) que son moléculas pequeñas incrementan los niveles de ApoE. Para investigar si el incremento de los niveles de Apo-E a través de la activación de LXR daba lugar a un beneficio terapéutico, se llevaron a cabo ensayos para evaluar el efecto del agonista de LXR GW3965 [nombre químico: hidrocloruro del ácido 3-[3-[N-(2-Cloro-3-trifluorometilbencil)-(2,2-difeniletil)amino]propiloxi] fenilacético) sobre los niveles de Apo-E, invasión de células tumorales, reclutamiento endotelial, y metástasis de melanoma in vivo (Figura 10). La incubación de células MeWo parentales en presencia de concentraciones terapéuticas de GW3965 incrementó la expresión de ApoE y DNAJA4 (Figura 10Ay 10B). El pretratamiento de células MeWO con GW3965 disminuyó la invasión de células tumorales (Figura 10C) y el reclutamiento endotelial (Figura 10D). Para ensayar si GW3965 podía inhibir la metástasis in vivo, se administró a los ratones una dieta de pienso basado en grano que contenía GW3965 (20mg/kg) o una dieta control, y se ensayaron las metástasis pulmonares usando bioluminiscencia después de la inyección a través de la vena de la cola de 4 x 104 células MeWo parentales en los ratones (Figura 10E). La administración oral de GW3965 a los ratones de esta manera dio lugar a una reducción significativa de las metástasis de melanoma in vivo (Figura 10E).
Ejemplo 12 Identificación de mir-7 como un supresor endógeno de metástasis de melanoma
En este ejemplo, se identificó a miR-7 como un supresor endógeno de metástasis de melanoma (Figura 11). Para ensayar si miR-7 suprime las metástasis de melanoma in vivo, se inactivó su expresión en células MeWo parentales usando la tecnología miR-Zip (Figura 11A). La representación de imaginería bioluminiscente de la colonización metastásica pulmonar después de la inyección intravenosa de 4 x 104 células MeWo parentales que expresaban un inhibidor de horquilla corta (miR-Zip) de miR-7 (miR-7 KD) incrementó significativamente las metástasis pulmonares in vivo (Figura 11A). A la inversa, la sobreexpresión de miR-7 en células LM2 redujo significativamente las metástasis pulmonares in vivo (Figura 11B).
La complejidad del cáncer requiere la aplicación de análisis sistemáticos (Pe'er y Hacohen, 2011). A través de una estrategia sistemática global, se descubrió una red cooperativa de miARN. Los miARN i) están regulados al alza en células de melanoma humano altamente metastásicas, ii) se requieren y son suficientes para la colonización y angiogénesis metastásicas en melanoma, y iii) son predictores patológicos robustos de la recidiva metastásica de melanoma humano. A través de una estrategia de identificación de dianas con base transcriptómica y guiada biológicamente, se encontró que miR-1908, miR-199a-3p, y miR-199a-5p tenían como diana de manera convergente el factor de choque térmico DNAJA4 y el gen metabólico ApoE. El requerimiento de cada miARN individual para la metástasis indica que estos tres miARN convergentes no son redundantes en la promoción de las metástasis de melanoma, mientras la supresión de metástasis robusta sinérgica conseguida por la inhibición de miARN combinatoria revela una cooperatividad funcional entre estos miARN, conseguida presumiblemente a través del silenciamiento máximo de ApoE y DNAJA4. La identificación de ApoE como un gen regulado negativamente por tres miARN promotores de metástasis, regulados positivamente por un gen supresor de metástasis (DNAJA4), y silenciado en muestras clínicas de metástasis resalta la significancia de este gen como un supresor de la progresión del melanoma.
Ejemplo 13 Identificación de la señalización de LXRp como una nueva diana terapéutica en melanoma
Para identificarlos receptores de hormonas nucleares que muestran una amplia expresión en melanoma, examinamos los niveles de expresión de todos los miembros de la familia de receptores de hormonas nucleares en la colección NCI-60 de líneas celulares de melanoma humano. Varios receptores presentaron una expresión estable en las múltiples líneas de melanoma, lo que sugiere que podían representar nuevas dianas potenciales en melanoma (Figuras 19A y 20A). Notablemente, de estos, se ha mostrado previamente que los receptores X hepáticos (LXR) aumentan la transcripción de ApoE en adipocitos y macrófagos (Laffitte et al., 2001), mientras que se encontró que la activación farmacológica de los RXR dirigía la expresión de ApoE en modelos de Alzheimer preclínicos (Cramer et al., 2012).
Dado el papel supresor de metástasis recientemente descubierto de ApoE en melanoma (Pencheva et al., 2012), la expresión basal ubicua de LXRp y RXRa en melanoma, y la disponibilidad de agentes farmacológicos para activar terapéuticamente los LXR y RXR, investigamos si la activación de los LXR o RXR en células de melanoma podría inhibir los fenotipos de progresión del melanoma. A la luz de los papeles establecidos de los receptores de hormonas nucleares tales como ER y AR en la regulación de la proliferación celular en el cáncer de mama y de próstata, examinamos en primer lugar si el agonismo farmacológico de los LXR o RXR en células de melanoma afecta el crecimiento celular in vitro.
El tratamiento de células de melanoma con dos agonistas de LXR estructuralmente distintos, GW39652 o T0901317 1, o el agonista de RXR bexaroteno no afectó las tasas de proliferación celular o viabilidad celular (Figura 20 B-C). A continuación, evaluamos los efectos de la activación de LXR o RXR en la invasión celular y el reclutamiento endotelial - fenotipos presentados por poblaciones de melanoma metastásico y cáncer de mama metastásico (Pencheva et al., 2012; Png et al., 2012). El tratamiento de las líneas de melanoma humano mutacionalmente diversas MeWo (B-Raf/N-Ras tipo salvaje), HT-144 (B-Raf mutante), y SK-Mel-2 (N-Ras mutante), así como la línea de melanoma humano primario SK-Mel-334.2 (B-Raf mutante) con GW3965 2 o T0901317 1 suprimió de forma consistente la capacidad de las células de melanoma de invadir a través de matrigel y de reclutar células endoteliales en ensayos trans-well (Figura 19B-C). En comparación, el tratamiento con bexaroteno suprimió la invasión en solo la mitad de las líneas de melanoma ensayadas y no afectó significativamente el fenotipo de reclutamiento endotelial (Figuras 19B-C).
Dada la superioridad del agonismo de LXR sobre RXR en la inhibición amplia tanto de la invasión celular como del reclutamiento endotelial en múltiples líneas de melanoma, investigamos el requerimiento de la señalización de LXR en la mediación de los efectos supresores de los agonistas de LXR. La inactivación de LXRp de melanoma, pero no de LXRa, suprimió la capacidad de GW3965 2 y T0901317 1 de suprimir la invasión y el reclutamiento endotelial (Figura 19D-G y Figuras 20D-G), lo que revela que el LXRp de células de melanoma es la diana funcional de los agonistas de LXR en la incitación de la supresión de estos fenotipos in vitro. Nuestros descubrimientos moleculares son consistentes con que LXRp sea la isoforma de LXR predominante expresada por células de melanoma (Figura 19A, P < 0,0001).
La expresión basal ubicua de LXRp en melanoma es probablemente un reflejo del papel general que juegan los LXR en el control del transporte, síntesis, y catabolismo de lípidos (Calkin y Tontonoz, 2013). Aunque dicha expresión estable de LXRp sería clave para mantener el metabolismo y crecimiento de las células de melanoma, también hace que la señalización de LXR sea un candidato atractivo para el direccionamiento terapéutico de amplio espectro en melanoma.
Ejemplo 14 La Administración terapéutica de agonistas de LXR suprime el crecimiento tumoral del melanoma
Los agonistas de LXR se desarrollaron originalmente como candidatos de fármacos orales para el propósito de disminuir el colesterol en pacientes con dislipidemia y aterosclerosis (Collins et al., 2002; Joseph y Tontonoz, 2003). Estos compuestos se abandonaron clínicamente por su incapacidad de reducir los niveles de lípidos en modelos preclínicos en animales grandes (Groot et al., 2005).
Dada la capacidad robusta de GW39652 y T0901317 1 de suprimir los fenotipos de progresión del melanoma in vitro (Figura 19B-C), investigamos si la activación terapéutica de LXR podría utilizarse para el tratamiento del melanoma. De hecho, la administración oral de GW39652 o T0901317 1 a dosis bajas (20 mg/kg), posteriormente a la formación de tumores subcutáneos con un volumen de 5-10 mm3, suprimió el crecimiento tumoral por las células agresivas de melanoma de ratón B16F10 en un modelo inmunocompetente un 67% y 61%, respectivamente (Figura 21A-B). La administración de una dosis mayor de agonista de LXR (100 mg/kg) dio lugar a una reducción de 80% en el crecimiento tumoral (Figura 21A), consistente con efectos supresores dependientes de la dosis.
La administración oral de GW39652 también suprimió de forma robusta el crecimiento tumoral por las líneas celulares de melanoma humano MeWo (inhibición del 70%) y SK-Mel-2 (inhibición del 49%), así como la línea de melanoma primario humano SK-Mel-334.2 (inhibición del 73%) (Figura 21C-E y Figura 22A).
Animados por el impacto robusto supresor de tumores de los agonistas de LXR en tumores pequeños (5-10 mm3) (Figura 21A-E), investigamos a continuación si la terapia de activación de LXR podía inhibir el crecimiento de tumores grandes (~150 mm3).
Encontramos que el tratamiento con GW3965 2 dio lugar a una reducción de aproximadamente el 50% en el crecimiento de tumores B16F10 grandes establecidos (Figura 21F). De forma importante, la administración terapéutica de GW39652 posteriormente al establecimiento de los tumores prolongó sustancialmente el tiempo de supervivencia global de ratones inmunocompetentes a los que se inyectaron células B16F10, ratones inmunocomprometidos que portaban xenoinjertos tumorales derivados de la línea de melanoma humano establecido MeWo, así como la línea de melanoma humano primario SK-Mel.334-2 (Figura 21G-I). Estos descubrimientos son consistentes con una capacidad de respuesta de amplio espectro a la terapia de activación de LXR en tumores de melanoma establecidos melanóticos y amelanóticos de diversos subtipos mutacionales: B-Raf y N-Ras de tipo salvaje (B16F10 y MeWo; Figura 21A-C), B-Raf mutante (SK-Mel-334.2; Figura 21D), y N-Ras mutante (SK-Mel-2; Figura 21E).
A continuación, buscamos determinar los fenotipos biológicos celulares regulados por los agonistas de LXR en la supresión del crecimiento tumoral. Consistente con los efectos inhibidores de GW39652 en el reclutamiento endotelial por células de melanoma in vitro, la administración de GW3965 2 dio lugar a una reducción de aproximadamente 2 veces en el contenido de células endoteliales de los tumores (Figura 21J). Este efecto estuvo acompañado de una disminución modesta (23%) en el número de células tumorales con proliferación activa in vivo (Figura 21K) sin un cambio en el número de células apoptóticas (Figura 21L). Estos resultados sugieren que, además de reducir la invasión tumoral local, la activación de LXR suprime el crecimiento tumoral del melanoma principalmente a través de la inhibición de la angiogénesis tumoral con una reducción resultante en la proliferación in vivo.
Ejemplo 15 El agonismo de LXR suprime las metástasis de melanoma al pulmón y cerebro e inhibe la progresión de metástasis incipientes
Los fuertes efectos supresores de los agonistas de LXR en el crecimiento tumoral de melanoma nos motivaron a examinar si la activación de LXR podía suprimir también la colonización metastásica por células de melanoma. Para este fin, el pretratamiento de células de melanoma humano MeWo con GW3965 2 dio lugar a una reducción de más de 50 veces en su capacidad de colonización metastásica (Figura 23A). A la luz de este efecto inhibidor dramático, evaluamos a continuación la capacidad de agonistas de LXR administrados oralmente de suprimir las metástasis. Los ratones inmunocomprometidos a los que se había administrado oralmente GW3965 2 o T0901317 1 experimentaron reducciones respectivas de 31 veces y 23 veces en la colonización metastásica pulmonar por células humanas MeWo (Figura 23B-C). El tratamiento con GW39652 también suprimió la colonización metastásica por la línea de melanoma HT-144 (Figura 23D) así como la línea de melanoma primario SK-Mel-334.2 (Figura 23E).
GW3965 2 es una molécula lipofílica que puede cruzar de manera eficiente la barrera hematoencefálica y activar potentemente la señalización de LXR en el cerebro. Consistente con esto, se ha mostrado previamente que la administración oral de GW3965 2 mejora la patología de las placas amiloides y los déficits de memoria en modelos preclínicos de la enfermedad de Alzheimer (Jiang et al, 2008). Nos preguntamos así si el agonismo de LXR podría presentar una actividad terapéutica en la supresión de las metástasis cerebrales del melanoma - un resultado temido del melanoma con una necesidad urgente de terapias efectivas (Fonkem et al., 2012). Notablemente, la administración oral de GW3965 2 inhibió tanto la diseminación sistémica como la colonización cerebral después de la inyección intracardiaca de células de melanoma metastásicas en el cerebro derivadas de la línea parental MeWo (Figura 23F). Estos resultados revelan una supresión robusta de la metástasis por la terapia de activación de LXR en múltiples líneas de melanoma y en múltiples sitios metastásicos en órganos distales.
Animados por los efectos robustos observados en la supresión de la formación de metástasis (Figura 23A-F), a continuación buscamos determinar si la terapia de activación de LXR podría parar la progresión de las células de melanoma que ya se han diseminado metastásicamente. En primer lugar, ensayamos la capacidad de GW39652 de reducir la colonización pulmonar por células de melanoma que se diseminan desde un sitio ortotópico después de la eliminación del tumor primario (Figura 23G). De forma importante, la administración oral de GW39652 después de la escisión tumoral inhibió la colonización pulmonar por células de melanoma diseminadas 17 veces (Figura 23H). De forma importante, el tratamiento de ratones con GW3965 2 también suprimió dramáticamente (28 veces) la colonización por metástasis pulmonares incipientes que habían progresado 8 veces desde la línea base a la siembra (Figura 23I). Consistente con que la activación de LXR inhibe el inicio metastásico, el tratamiento con GW3965 2 disminuyó el número de nódulos metastásicos macroscópicos formados (Figura 23J). Finalmente, el tratamiento de ratones con GW3965 2 en este contexto preclínico 'adyuvante' prolongó significativamente sus tiempos de supervivencia después de la colonización metastásica (Figura 23K).
Ejemplo 16 La activación de LXR reduce la progresión y metástasis del melanoma en un modelo de melanoma dirigido genéticamente en ratón
Aproximadamente el 60% de los tumores de melanoma humano están marcados por mutaciones activadoras en el oncogén Braf, siendo una variante de un único aminoácido, B-RafV600E, la mutación predominante encontrada (Davies et al., 2002). Cerca del 20% de los melanomas presentan mutaciones activadoras en B-Raf con el silenciamiento concurrente del supresor tumoral Pten, que dirige la progresión a un estado de melanoma maligno (Tsao et al., 2004; Chin et al., 2006). Recientemente, se ha mostrado que la activación de B-Raf y pérdida de Pten condicional dirigidas por tirosinasa (Tyr) cooperan genéticamente para dirigir la progresión del melanoma en ratones (Dankort et al., 2009).
Para determinar si la activación de LXR podría suprimir la progresión del melanoma en este modelo iniciado genéticamente, inducimos melanomas en ratones Tyr::CreER; B-RafV600E/+; Ptenlox/+ y Tyr::CreER; B-RafV600E/+; Ptenlox/lox por la administración intraperitoneal de 4-hidroxitamoxifeno (4-HT). Notablemente, la administración oral de GW3965 2 después del inicio del melanoma atenuó la progresión tumoral y prolongó significativamente los tiempos de supervivencia global de ratones tanto heterocigotos para PTEN Tyr::CreER; B-RafV600E/+; Ptenlox/+ como homocigotos para PTEN Tyr::CreER; B-RafV600E/+; Ptenlox/lox (Figura 24A-B y Figura 25A-B). A continuación, examinamos la capacidad de GW39652 de suprimir la metástasis de melanoma en este contexto genético. Aunque no detectamos metástasis macroscópicas en los pulmones o cerebros de los ratones control Tyr::CreER; B -R a f600E/+; Ptenlox/lox tratados con 4-HT, observamos de forma consistente metástasis de melanoma en los nódulos linfáticos de las glándulas salivares. De forma importante, los ratones Tyr::CreER; B-RafV600E/+; Ptenlox/lox tratados con GW3965 2 presentaron una disminución en el número de metástasis linfáticas detectadas post-mortem (Figura 24C). Estos descubrimientos indican que la activación de LXR inhibe la metástasis ortotópica en un modelo de melanoma dirigido genéticamente, además de sus efectos supresores en la progresión de tumor de melanoma primario.
La cooperatividad entre la activación de B-Raf y la pérdida de Pten en la dirección de la progresión del melanoma puede aumentarse más por la inactivación de CDKN2A, un regulador del ciclo celular mutado frecuentemente en melanomas familiares (Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994). Examinamos así el efecto de la activación de LXR en los melanomas B-RafV600E/+; Pten-/-; CDKN2A-/-, lo que nos permitió ensayar la eficacia terapéutica del agonismo de LXR en un modelo de progresión de melanoma dirigido genéticamente más agresivo. De forma importante, la administración terapéutica de GW39652 inhibió de forma robusta el crecimiento tumoral y la metástasis pulmonar por células de melanoma primario de ratón B -R a f600E/+; Pten-/-; CDKN2A-/-, inyectadas en ratones singénicos inmunocompetentes y prolongó la supervivencia global de ratones que portaban la carga de melanoma B -R a f600E/+; Pten-/-; CDKN2A-/- (Figura 24D-F). Tomados conjuntamente, la supresión robusta de la progresión del melanoma en modelos de melanoma en ratones inmunocompetentes independientes de xenoinjertos e inducidos genéticamente que presentan los diversos perfiles mutaciones de los melanomas humanos motiva el ensayo clínico de la terapia de activación de LXR.
Ejemplo 17 La activación farmacológica de LXRp suprime los fenotipos de melanoma por la inducción transcripcional de la expresión de ApoE por células de melanoma
A continuación, buscamos determinar la diana molecular aguas abajo de LXRp que media la supresión de la progresión del melanoma. Para este fin, perfilamos transcriptómicamente células de melanoma MeWo humanas tratadas con el agonista de LXR GW39652.
De los 365 genes que se indujeron significativamente en respuesta a la activación de LXR, identificamos ApoE, una diana transcripcional de los LXR validada previamente en macrófagos y adipocitos (Laffitte et al., 2001), como el factor secretado más regulado al alza en células de melanoma (Figura 26). La validación por PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) reveló una regulación al alza robusta de la expresión del transcrito de ApoE después del tratamiento con agonistas de LXR independientes en múltiples líneas de melanoma humano (Figura 27A-C).
A la vista de la función supresora de metástasis de ApoE reportada previamente en melanoma (Pencheva et al., 2012), investigamos si la activación de LXRp suprime la progresión del melanoma a través de la inducción transcripcional de ApoE. De hecho, se encontró que GW39652 y T09013171 aumentan la actividad dirigida por las células de melanoma de una construcción de informador de luciferasa que contiene el promotor de ApoE fusionado con cualquiera de dos elementos multipotenciadores de unión a LXR caracterizados previamente (ME.1 o ME.2) (Laffitte et al., 2001) (Figura 28A). De forma importante, esta inducción transcripcional dio lugar a niveles elevados de proteína ApoE secretada (Figura 28B). Consistente con el direccionamiento directo de LXRp a ApoE en células de melanoma, la neutralización de ApoE extracelular con un anticuerpo bloqueó completamente la supresión mediada por LXRp de la invasión celular y el reclutamiento endotelial y aumentó adicionalmente estos fenotipos respecto al tratamiento con IgG control (Figura 28C-G y Figura 27D-F), lo que revela que los efectos del agonismo de LXR están modulados por la ApoE extracelular.
Adicionalmente, la inactivación molecular de ApoE en células de melanoma también bloqueó la supresión mediada por GW39652 de los fenotipos de invasión celular y reclutamiento endotelial (Figura 27G-H). De acuerdo con esto, la depleción de células de melanoma de LXRp, pero no de LXRa, suprimió la capacidad de GW39652 y T0901317 1 de regular al alza la transcripción de ApoE y finalmente la expresión de la proteína (Figura 28H-I y Figura 27I-K). Colectivamente, estos descubrimientos indican que la activación farmacológica de LXRp, la isoforma predominante de LXR expresada por células de melanoma, suprime la invasión celular intrínseca y el reclutamiento endotelial por células de melanoma a través de la activación transcripcional de la expresión de ApoE en células de melanoma.
Ejemplo 18 Implicación de ApoE derivada de melanoma y sistémica por la terapia de activación de LXRp
La supresión inducida por LXRp de los fenotipos clave del melanoma por ApoE extracelular in vitro sugirió que los efectos supresores de los agonistas de LXR in vivo podrían aumentar más por la activación de los LXR en los tejidos periféricos, que podrían servir como fuentes robustas de ApoE extracelular.
De forma importante, dichos tejidos no transformados serían menos vulnerables a desarrollar resistencia a la terapia de activación de LXR, permitiendo la inducción crónica de ApoE en pacientes. Investigamos así si el agonismo de LXR terapéutico suprime la progresión de melanoma mediante la inducción de ApoE derivada de células de melanoma o tejidos sistémicos. Consistente con que el agonismo de LXRp incrementa la expresión de ApoE en células de melanoma in vivo, los niveles del transcrito de ApoE se regularon al alza en tumores primarios de melanoma, así como en metástasis de melanoma en pulmón y cerebro disociados de ratones que se alimentaron con una dieta suplementada con agonista de LXR (Figura 29A-E). De forma importante, el tratamiento de ratones bien con GW3965 2 o T0901317 1 elevó significativamente la expresión de la proteína ApoE en tejidos sistémicos adiposo, de pulmón y cerebro de los ratones (Figuras 30A-B) y también reguló al alza los niveles de transcrito de ApoE en células sanguíneas blancas circulantes (Figura 30C). Estos resultados indican que la terapia de activación de LXR induce tanto la expresión de ApoE en células de melanoma como en tejidos sistémicos in vivo.
Para determinar el requerimiento in vivo de la activación de LXR derivada de melanoma y sistémica para los efectos supresores de tumores de los agonistas de LXR administrados oralmente, ensayamos en primer lugar la capacidad de GW39652 de suprimir el crecimiento tumoral por células de melanoma ratón B16F10 deplecionadas de LXRp.
Consistente con nuestros descubrimientos en células de melanoma humano, la inactivación de LXRp de células de melanoma de ratón suprimió la inducción de la expresión de ApoE mediada por GW3965 (Figura 29F-H). A pesar de esto, la inactivación de LXRp de células de melanoma fue incapaz de prevenir la supresión del crecimiento tumoral por GW39652 (Figura 29D), lo que implica un papel para la activación de LXR sistémica en la inhibición del crecimiento tumoral por GW3965 2. Para identificar la isoforma de LXR que media esta supresión no autónoma de tumor del crecimiento del melanoma por agonistas de LXR, examinamos los efectos de GW3965 2 en tumores implantados en ratones con inactivación genética de LXRa o LXRp. De forma interesante, la ablación genética de LXRp sistémica bloqueó la capacidad de GW3965 de suprimir el crecimiento tumoral del melanoma, mientras la inactivación de LXRa no tuvo efecto en la inhibición del crecimiento tumoral por GW3965 (Figura 6D). De forma importante, la regulación al alza de la expresión de ApoE sistémica por GW39652, un agonista con una actividad 6 veces mayor para LXRp que para LXRa, se suprimió en ratones LXRp -/-, pero no en ratones LXRa -/- (Figura 30E y Figura 29I). Estos resultados indican que la inducción de ApoE por GW3965 2 en tejidos periféricos está dirigida predominantemente por la activación de LXRp sistémica. De acuerdo con esto, encontramos que LXRp sistémica era la diana molecular principal y efector de GW39652 en la mediación de la supresión del crecimiento tumoral del melanoma.
A continuación, examinamos si ApoE se requiere para los efectos supresores de melanoma in vivo de los agonistas de LXR. Consistente con la ausencia de un impacto de la inactivación de LXRp de células de melanoma en la actividad supresora de tumores de GW39652, la depleción de ApoE de células de melanoma tampoco previno la inhibición del crecimiento tumoral por GW3965 2 (Figura 29F-H y Figura 30F). Estos descubrimientos sugieren que los efectos supresores de tumores de GW3965 2 podrían estar mediados principalmente a través de la inducción de ApoE en tejidos sistémicos.
De hecho, GW39652 fue completamente inefectivo en la supresión del crecimiento tumoral en ratones con inactivación genética de ApoE (Figura 30F), lo que revela que la ApoE sistémica es el efector aguas abajo de LXRp sistémico para dirigir la supresión del crecimiento tumoral del melanoma. De forma interesante, a diferencia de la regulación del crecimiento tumoral primario, la inactivación de la ApoE de células de melanoma previno parcialmente el efecto supresor de metástasis de GW3965 2 (Figura 30G). De forma similar, también la inactivación genética de ApoE solo previno parcialmente la supresión de metástasis incitada por GW3965 2 (Figura 30G). La inhibición de metástasis dirigida por GW3965 se bloqueó completamente solo en el contexto tanto de la inactivación de ApoE de células de melanoma como la inactivación genética de ApoE sistémica (Figura 30G), indicativo de un requerimiento de la implicación tanto de ApoE derivada de células de melanoma como sistémica por LXRp en la supresión de metástasis. Concluimos así que los efectos de la activación de LXRp en el crecimiento tumoral primario están incitados principalmente a través de la inducción de ApoE sistémica, mientras los efectos del agonismo de LXRp en la metástasis están mediados a través de la inducción transcripcional de ApoE tanto en células de melanoma como en tejidos sistémicos.
La identificación de ApoE como el único mediador aguas abajo de la supresión de fenotipos de melanoma inducida por LXRp relata más la importancia de este gen como un supresor de la progresión del melanoma. Para determinar si la expresión de ApoE es un pronóstico clínico de los resultados metastásicos del melanoma, evaluamos los niveles de la proteína ApoE mediante la realización de análisis de inmunohistoquímica ciegos en 71 lesiones de melanoma primario humano extraídas quirúrgicamente.
Encontramos que los pacientes cuyos melanomas habían metastatizado presentaban una expresión de ApoE aproximadamente 3 veces menor en sus tumores primarios respecto a los pacientes cuyos melanomas no habían metastatizado (Figura 30H, P = 0,002). De forma importante, los niveles de expresión de ApoE en las lesiones de melanoma primario de los pacientes estratificó de forma robusta a los pacientes en alto riesgo respecto a los que presentaban bajo riesgo de recidiva metastásica (Figura 30I, P = 0.002). Estas observaciones son consistentes con descubrimientos previos que revelaron niveles significativamente menores de ApoE en metástasis de melanoma distantes respecto a las lesiones primarias (Pencheva et al., 2012). Colectivamente, este trabajo indica que ApoE, como un único gen, podría actuar probablemente como un biomarcador de pronóstico y predictivo en melanomas primarios para identificar a pacientes que i.) están en riesgo de recidiva metastásica de melanoma y como tal ii.) podrían obtener un beneficio clínico de la inducción de ApoE mediada por un agonista de LXRp.
Ejemplo 19 La terapia de activación de LXRp suprime el crecimiento de melanomas resistentes a dacarbazina y vemurafenib
Animados por la capacidad robusta de la terapia de activación de LXRp para suprimir el crecimiento tumoral y metástasis de melanoma en un amplio rango de líneas de melanoma con diversos fondos mutacionales, a continuación buscamos determinar si los melanomas que son resistentes a dos de los agentes clínicos principales usados en la gestión del melanoma metastásico - dacarbazina y vemurafenib - podrían responder a la terapia de activación de LXRp.
Para este fin, generamos clones de B16F10 resistentes a dacarbazina (DTIC) mediante el cultivo continuo de células de melanoma en presencia de DTIC durante dos meses. Esto rindió una población de células que presentaba un incremento de 7 veces en la viabilidad en respuesta al tratamiento con alta dosis de DTIC comparado con la línea celular B16F10 parental (Figura 31A). Para confirmar que este clon de DITC derivado in vitro también era resistente a DTIC in vivo, evaluamos los efectos del tratamiento con dacarbazina en el crecimiento tumoral.
Aunque la dacarbazina suprimió significativamente el crecimiento de la línea parental sensible a DTIC (Figura 31B), no afectó el crecimiento tumoral por las células B16F10 resistentes a DTIC (Figura 31C). GW39652 suprimió de forma robusta el crecimiento tumoral por el clon de melanoma B16F10 resistente a DTIC más del 70% (Figuras 31C-D). De forma importante, la administración oral de GW3965 2 también inhibió fuertemente el crecimiento de tumores de melanoma humano resistentes a DTIC derivados in vivo formados por la línea celular MeWo independiente (Figura 31E-F y Figura 32A).
Estos resultados revelan que el agonismo de LXRp es efectivo para suprimir múltiples poblaciones de células de melanoma que son resistentes a dacarbazina - el único quimioterapéutico citotóxico aprobado por la FDA en melanoma metastásico. Nuestros descubrimientos tienen implicaciones clínicas importantes para el tratamiento del melanoma ya que todos los pacientes en estadio IV que se tratan con dacarbazina progresan finalmente desarrollando tumores que son resistentes a este agente.
Ensayamos el impacto de la terapia de activación de LXRp en células de melanoma resistentes al inhibidor de quinasa B-Raf aprobado recientemente, vemurafenib- un régimen que muestra actividad frente a melanomas mutantes para B-Raf (Bollag et al., 2010; Sosman et al., 2012). Numerosos investigadores han derivado líneas de melanoma resistentes a vemurafenib (Poulikakos et al., 2011; Shi et al, 2012, Das Thakur et al, 2013). El tratamiento con GW3965 2 suprimió el crecimiento de la línea resistente a vemurafenib SK-Mel-239 derivada previamente un 72% (Figura 31G) y prolongó significativamente la supervivencia de ratones que portaban carga de melanoma resistente a vemurafenib (Figura 31H). Nuestros descubrimientos de estudios farmacológicos, moleculares y genéticos combinados en diversos modelos preclínicos de melanoma establecen que el direccionamiento de LXRp es una nueva estrategia terapéutica que suprime de forma robusta el crecimiento tumoral y la metástasis de melanoma a través de la inducción transcripcional de ApoE - un supresor clave de la invasión y angiogénesis metastásica del melanoma (Pencheva et al., 2012; Figura 31I).
Ejemplo 20 El tratamiento con ApoE inhibe la invasión de células tumorales y el reclutamiento endotelial en múltiples tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, cáncer de células renales y cáncer pancreático
Con el fin de determinar si el tratamiento con ApoE podría ser efectivo para tratar tipos de cáncer además de melanoma, se realizaron ensayos in vitro para evaluar el efecto del tratamiento con ApoE en varias líneas celulares de cáncer diferentes, incluyendo líneas celulares de cáncer de mama, cáncer de células renales, y cáncer pancreático (Figura 33).
La capacidad de las células cancerosas de invadir a través de matrigel in vitro se ensayó usando un sistema de cámaras de invasión de matrigel trans-well (354480, BD Biosciences). Se privó de suero a varias líneas celulares de cáncer toda la noche en medio que contenía FBS al 0,2%. Al día siguiente, se preequilibraron las cámaras de invasión antes del ensayo mediante la adición de 0,5 mL de medio de privación a los pocillos superiores e inferiores. Mientras tanto, las células cancerosas se tripsinizaron y las células viables se contaron usando la tinción de exclusión de células muertas con azul de tripán. Las células cancerosas se resuspendieron entonces a una concentración de 1 x 105 células/1 mL de medio de privación, y se sembraron 0,5 mL de suspensión celular, que contenía 5 x 104 células en cada trans-well. Para determinar el efecto de ApoE recombinante en la invasión de las células cancerosas, se añadieron ApoE3 humana recombinante (4696, Biovision) o BSA a cada trans-well a 100 pg/mL al inicio del ensayo. El ensayo de invasión se dejó proceder durante 24 horas a 37 °C. Después de la compleción del ensayo, los insertos se lavaron en PBS, las células que no invadieron se rasparon suavemente del lado superior de cada inserto usando puntas q, y las células que invadieron en el lado basal del inserto se fijaron en PFA al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, los insertos se lavaron en PBS y se cortaron entonces y se montaron en portaobjetos usando medio de montaje VectaShield que contenía la tinción nuclear DAPI (H-1000, Vector Laboratories). Se formaron imágenes del lado basal de cada inserto usando un microscopio de fluorescencia invertido (Zeiss Axiovert 40 CFL) a un aumento 5X, y se cuantificó el número de células positivas para DAPI usando ImageJ.
De hecho, el tratamiento con ApoE inhibió tanto la invasión de células tumorales como el reclutamiento endotelial en los tres de estos tipos de cáncer (Figura 33A-I).
Ejemplo 21 Los agonistas de LXR LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO-2010-0138598 Ej. 9, y SB742881, inducen la expresión de ApoE en células de melanoma humano
Dado que la activación de ApoE por tratamiento con los agonistas de LXR GW3965 2 y T0901317 1 dio lugar a un beneficio terapéutico para inhibir el crecimiento tumoral y la metástasis, a continuación examinamos la capacidad de otros agonistas de LXR para inducir la expresión de ApoE en líneas celulares de melanoma humano (Figura 34).
Para determinar el efecto de los varios agonistas de LXR (LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO-2010-0138598 Ej.
9, y SB742881 en la expresión de ApoE en las células de melanoma, se sembraron 1 x 105 células de melanoma humano MeWo en una placa de 6 pocillos. Al día siguiente, se añadió DMSO o el agonista de LXR respectivo al medio celular a una concentración de 500 nM, 1 pM, o 2 pM, como se indica, y las células se incubaron en presencia de DMSO o el fármaco durante 48 horas a 37 °C. La cantidad total de DMSO añadida al medio celular se mantuvo por debajo del 0,2%. Se extrajo ARN de lisados celulares completos usando el kit de Purificación de ARN Total (17200, Norgen). Para cada muestra, se transcribieron de forma inversa 600 ng de ARN en ADNc usando el kit de Síntesis de la Primera Cadena de ADNc (Invitrogen). Se mezclaron aproximadamente, 200 ng de ADNc con Mezcla Maestra SYBR® verde de PCR y los cebadores directos e inversos correspondientes específicos para la detección de ApoE humana. Cada reacción se llevó a cabo en cuadruplicado, y los niveles de expresión del ARNm de ApoE se midieron por amplificación con PCR cuantitativa en tiempo real usando un Sistema de PCR en Tiempo Real a B i Prism 7900HT (Applied Biosystems). La expresión relativa de ApoE se determinó usando el método AACt. Se usó GAPDH como un control endógeno para propósitos de normalización.
De hecho, tratamiento con los agonistas de LXR LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO- 2010-0138598 Ej. 9, y SB742881 dio lugar en todos los casos a grados variados de inducción de la expresión de ApoE. (Figura 34A-C).
Ejemplo 22 El tratamiento con el agonista de LXR GW3965 inhibe la invasión de células tumorales in vitro de cáncer renal, cáncer pancreático, y cáncer de pulmón
Hemos demostrado que el tratamiento con agonistas de LXR daba lugar a la inhibición de la invasión de células tumorales de melanoma. Dado que este efecto está mediado por la activación de la expresión de ApoE, establecimos la hipótesis de que el tratamiento con agonistas de LXR daría lugar a la inhibición de la invasión in vitro de células tumorales en cáncer de mama, cáncer pancreático, y cáncer renal, ya que estos tipos de cáncer son capaces de responder al tratamiento con ApoE. Con el fin de ensayar esta hipótesis, realizamos ensayos in vitro de invasión de células tumorales mediante el tratamiento de líneas celulares de cáncer de mama, cáncer pancreático, y cáncer de células renales con el agonista de LXR GW39652 (Figura 35).
Varias líneas celulares (5 x 104 células de cáncer renal humano RCC, 5 x 104 células de cáncer pancreático humano PANC1, y 5 x 104 células de cáncer de pulmón humano H460) se trataron con DMSO o GW3965 a 1 pM durante 56 horas. Las células se privaron de suero durante 16 horas en medio con FBS al 0,2% en presencia de DMSO o GW3965. Después de la privación de suero, las células se sometieron al ensayo de invasión trans-well usando un sistema de cámaras de invasión de matrigel (354480, BD Biosciences). Las cámaras de invasión se preequilibraron antes del ensayo mediante la adición de 0,5 mL de medio de privación a los pocilios superiores e inferiores. Mientras tanto, las células cancerosas se tripsinizaron y las células viables se contaron usando azul de tripán. Las células cancerosas se resuspendieron entonces a una concentración de 1 x 105 células/1 mL de medio de privación, y se sembraron 0,5 mL de suspensión celular, que contenía 5 x 104 células en cada trans-well. El ensayo de invasión se dejó proceder durante 24 horas a 37 °C. Después de la compleción del ensayo, los insertos se lavaron en PBS, las células que no invadieron se rasparon suavemente del lado superior de cada inserto usando puntas q, y las células que invadieron en el lado basal del inserto se fijaron en PFA al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, los insertos se lavaron en PBS y se cortaron entonces y se montaron en portaobjetos usando medio de montaje VectaShield que contenía la tinción nuclear DAPI (H-1000, Vector Laboratories). Se formaron imágenes del lado basal de cada inserto usando un microscopio de fluorescencia invertido (Zeiss Axiovert 40 CFL) a un aumento 5X, y se cuantificó el número de células positivas para DAPI usando ImageJ.
De hecho, el tratamiento con GW39652 dio lugar a la inhibición de la invasión de células tumorales en los tres tipos de cáncer ensayados (Figura 35A-C). Esto demostró adicionalmente el amplio potencial terapéutico de los agonistas de LXR para tratar varios tipos de cáncer.
Ejemplo 23 El tratamiento con el agonista de LXR GW3965 inhibe el crecimiento tumoral del cáncer de mama in vivo
Hemos demostrado que los agonistas de LXR inhiben los fenotipos de progresión de cáncer in vitro en el cáncer de mama, cáncer pancreático, y cáncer renal. Para investigar si el tratamiento con agonistas de LXR inhibe el crecimiento tumoral primario del cáncer de mama in vivo, ratones a los que se habían inyectado células de cáncer de mama humano MDA-468 se trataron bien con una dieta control o con una dieta suplementada con el agonista de LXR GW39652 (Figura 36).
Para determinar el efecto de GW3965 2 administrado oralmente en el crecimiento tumoral del cáncer de mama, se resuspendieron 2 x 106 células de cáncer de mama humano MDA-468 en 50 pL de PBS y 50 pL de matrigel y la suspensión celular se inyectó en ambos panículos adiposos mamarios inferiores de ratones hembra Nod Scid gamma de 7 semanas de edad. Los ratones se asignaron a un tratamiento con dieta control o un tratamiento con una dieta suplementada con GW3965 (75 mg/kg/día) dos días antes de la inyección de las células cancerosas. El compuesto farmacéutico GW39652 se formuló en la dieta de los ratones por Research Diets, Inc. Las dimensiones tumorales se midieron usando calibradores digitales, y el volumen tumoral se calculó como (diámetro pequeño)2 x (diámetro grande)/2.
El tratamiento con GW3965 dio lugar a una reducción significativa en el tamaño tumoral del cáncer de mama in vivo (Figura 36).
EJEMPLO 24 Efectos del tratamiento con los agonistas de LXR LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO-2010-0138598 Ej. 9, y SB742881 en los fenotipos de progresión de melanoma in vitro
Hemos demostrado la capacidad de varios agonistas de LXR para inducir la expresión de ApoE con potencia variada en células de melanoma (Figura 34). Como el efecto terapéutico de los agonistas de LXR sobre el cáncer es a través de la activación de la expresión de ApoE, establecimos la hipótesis de que la potencia terapéutica de cualquier agonista de LXR dado está correlacionada directamente con su capacidad de inducir la expresión de ApoE. Para confirmar esto, cuantificamos el efecto del tratamiento con varios agonistas de LXR en el reclutamiento endotelial y la invasión de células tumorales de células de melanoma in vitro. Como se muestra en la Figura 37, el grado en el cual los agonistas de LXR inhiben los fenotipos de progresión del cáncer in vitro está relacionado con la potencia de inducción de ApoE del agonista de LXR.
Invasión celular: se trataron células de melanoma humano MeWo con DMSO, LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO-2010-0138598 Ej. 9, o SB742881 a 1 |jM cada uno durante 56 horas. Las células se privaron de suero durante 16 horas en medio con FBS al 0,2% en presencia de cada fármaco correspondiente o DMSO. Después de la privación de suero, las células se sometieron al ensayo de invasión trans-well usando un sistema de cámaras de invasión de matrigel (354480, BD Biosciences). Las cámaras de invasión se preequilibraron antes del ensayo mediante la adición de 0,5 mL de medio de privación a los pocillos superiores e inferiores. Mientras tanto, las células cancerosas se tripsinizaron y las células viables se contaron usando azul de tripán. Las células cancerosas se resuspendieron entonces a una concentración de 1 x 105 células/1 mL de medio de privación, y se sembraron 0,5 mL de suspensión celular, que contenía 5 x 104 células, en cada trans-well. El ensayo de invasión se dejó proceder durante 24 horas a 37 °C. Después de la compleción del ensayo, los insertos se lavaron en PBS, las células que no invadieron se rasparon suavemente del lado superior de cada inserto usando puntas q, y las células que invadieron en el lado basal del inserto se fijaron en PFA al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, los insertos se lavaron en PBS, se cortaron y se montaron en portaobjetos usando medio de montaje VectaShield que contenía la tinción nuclear DAPI (H-1000, Vector Laboratories). Se formaron imágenes del lado basal de cada inserto usando un microscopio de fluorescencia invertido (Zeiss Axiovert 40 CFL) a un aumento 5X, y se cuantificó el número de células positivas para DAPI usando ImageJ.
Reclutamiento endotelial: se trataron células de melanoma humano MeWo con DMSO, LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO-2010-0138598 Ej. 9, o SB742881 a 1 j M cada uno durante 56 horas. Posteriormente, se sembraron 5 x 104 células cancerosas en placas de 24 pocilios en presencia de cada fármaco o DMSO y se dejó que se adhirieran durante 16 horas antes de empezar el ensayo. Se privaron de suero células endoteliales de la vena umbilical humana (células HUVEC) en medio que contenía FBS al 0,2 % toda la noche. Al día siguiente, se sembraron 1 x 105 células HUVEC en un inserto de 3,0 pm HTS Fluoroblock (351151, BD Falcon) ajustado en cada pocillo que contenía las células cancerosas en la parte inferior. Se dejó que las células HUVEC migraran hacia las células cancerosas durante 20 horas, después de lo cual los insertos se lavaron en PBS, se fijaron en PFA al 4%, se marcaron con DAPI, y se montaron en portaobjetos. Se formaron imágenes del lado basal de cada inserto usando un microscopio de fluorescencia invertido (Zeiss Axiovert 40 CFL) a un aumento 5X, y se cuantificó el número de células positivas para DAPI usando ImageJ.
Los agonistas de LXR que inducen potentemente la expresión de ApoE (p. ej., WO-2010-0138598 Ej. 9 y SB742881) son más efectivos para inhibir los fenotipos de progresión del cáncer (Figura 37) que los agonistas de LXR con menor potencia. Esto demuestra adicionalmente que el beneficio terapéutico del tratamiento con agonistas de LXR para el cáncer es un resultado de la inducción de ApoE.
Ejemplo 25 El tratamiento con agonistas de LXR inhibe el crecimiento tumoral de melanoma in vivo
Hemos demostrado que los agonistas de LXR que inducen la expresión de ApoE inhiben la actividad tumoral in vitro. Para confirmar si estos agonistas inhiben el crecimiento tumoral de melanoma in vivo, ratones a los que se inyectaron células de melanoma B16F10 se trataron bien con LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO-2010-0138598 Ej. 9, o SB742881.
Para evaluar el efecto de LXR-623, WO-2007-002563 Ej. 19, WO-2010-0138598 Ej. 9, o SB742881 administrados oralmente en el crecimiento tumoral del melanoma, se resuspendieron 5 x 104 células de melanoma de ratón B16F10 en 50 pL de PBS y 50 pL de matrigel y la suspensión celular se inyectó subcutáneamente en ambos flancos dorsales inferiores de ratones C57BL/6 de 7 semanas de edad. Los ratones se palparon diariamente para detectar la formación de tumores y después de la detección de tumores con un volumen de 5-10 m3, los ratones se asignaron a un pienso control o un pienso que contenía cada agonista de LXR respectivo: LXR-623 (20 mg/kg/día), WO-2007-002563 Ej. 19 (100 mg/kg/día), WO-2010-0138598 Ej. 9 (10 mg/kg/día o 100 mg/kg/día), o SB742881 (100 mg/kg/día). Los compuestos farmacéuticos de LXR se formularon en el pienso de los ratones por Research Diets, Inc. Las dimensiones tumorales se midieron usando calibradores digitales, y el volumen tumoral se calculó como (diámetro pequeño)2 x (diámetro grande)/2.
Consistente con nuestros datos in vitro, los agonistas de LXR que inducen potentemente la expresión de ApoE in vitro (WO-2010-0138598 Ej. 9, y SB742881) inhibieron significativamente el crecimiento tumoral primario del melanoma in vivo (Figura 38). Esto también es consistente con nuestros resultados que demuestran que otros agonistas de LXR que inducen potentemente la expresión de ApoE (GW3965 2, T0901317 1) también inhiben el crecimiento tumoral primario in vivo (Figura 21).
De acuerdo con esto, los ejemplos anteriores se centraron en la caracterización de los mecanismos moleculares y celulares mediante los que ejerce sus efectos. Para este fin, se encontró que ApoE está dirigido a dos receptores distintos, pero homólogos, en dos tipos de células diversos. La ApoE que actúa en los receptores LRP1 de células de melanoma inhibe la invasión del melanoma, mientras su acción en los receptores LRP8 de células endoteliales suprime la migración endotelial. Los resultados de los análisis de pérdida de función, ganancia de función, epistasis, correlación clínica, y selección de la expresión de derivados in vivo dieron lugar a un modelo en donde tres miARN tienen como diana de manera convergente una red supresora de la metástasis para limitar la secreción de ApoE, suprimiendo así la señalización de ApoE/LRP1 en células de melanoma y la señalización de ApoE/LRP8 en células endoteliales (Figura 7K). Aunque los análisis sistemáticos anteriores han identificado ApoE y DNAJA4 como dianas clave y mediadores directos de los fenotipos metastásicos regulados por estos miARN, no puede excluirse que los tres miARN puedan retener individualmente genes diana adicionales cuyo silenciamiento pueda contribuir a la progresión metastásica. La capacidad de la inactivación de ApoE o DNAJA4 de rescatar completamente los fenotipos de supresión de la metástasis observados con el silenciamiento de miARN individuales, sin embargo, sugiere fuertemente que estos genes son moduladores clave de los efectos dependientes de los miARN en la metástasis.
Los resultados anteriores revelan una evidencia combinada molecular, genética e in vivo para un papel requerido y suficiente para ApoE en la supresión de la progresión metastásica del melanoma. La ApoE puede distribuirse en el sistema circulatorio tanto en un estado unido a lipoproteínas como libre de lípidos (Hatters et al., 2006). Aunque se ha mostrado que la ApoE recombinante libre de lípidos es suficiente para suprimir la invasión y migración endotelial del melanoma, es posible que la ApoE contenida en partículas de lipoproteínas también pueda suprimir la invasión y el reclutamiento endotelial del melanoma. La capacidad de ApoE recombinante de inhibir estos fenotipos prometastásicos, así como los fenotipos incrementados de invasión y reclutamiento endotelial del melanoma observados con la neutralización de ApoE mediada por anticuerpo sugiere que la molécula de ApoE en sí misma es el mediador clave de estos fenotipos. Consistente con los descubrimientos descritos en la presente memoria, se encontró previamente que un fragmento peptídico sintético de ApoE inhibía la migración endotelial a través de mecanismos desconocidos (Bhattacharjee et al., 2011). Los descubrimientos descritos en la presente memoria son consistentes con un papel para la ApoE secretada por células de melanoma y endógena sistémica en la inhibición del reclutamiento endotelial, que no es secundario a un crecimiento alterado de las células endoteliales.
Los estudios moleculares, genéticos, e in vivo descritos anteriormente revelan un papel para la ApoE derivada de cáncer endógena en la modulación de la migración endotelial y angiogénesis cancerosa a través de la señalización del receptor LRP8 endotelial. Este fenotipo robusto de reclutamiento endotelial no autónomo de células mediado por la señalización de ApoE/LRP8 sugiere que ApoE también puede modular la angiogénesis metastásica en otros tipos de cáncer, y dicho papel general para ApoE en la biología de la angiogénesis cancerosa permanece por explorar. La ApoE es una molécula polimórfica con papeles bien establecidos en trastornos lipídicos, cardiovasculares, y neurodegenerativos. Sus tres variantes principales, ApoE2, ApoE3, y ApoE4, presentan representaciones variadas en la población humana, siendo ApoE3 la variante más común (Hatters et al., 2006). Las tres isoformas se diferencian en los residuos 112 y 158 en el dominio N-terminal, que contiene el dominio de unión a receptor de ApoE. Se piensa que estas variaciones estructurales dan lugar a distintos atributos funcionales entre las variantes. Consistente con esto, las tres isoformas de ApoE se diferencian en su afinidad de unión para los miembros de la familia de receptores de LDL, preferencia de unión a lipoproteínas, y estabilidad del extremo N. Concretamente, ApoE2 tiene una capacidad de unión al receptor de LDL que está atenuada 50 a 100 veces comparada con ApoE3 y ApoE4 (Weisgraber et al., 1982), mientras ApoE4, a diferencia de las otras dos variantes, se une preferentemente a lipoproteínas grandes de menor densidad (Weisgraber et al, 1990) y presenta la menor estabilidad en el extremo N (Morrow et al., 2000). Estas diferencias funcionales confieren propiedades patofisiológicas para la seleccionar las isoformas de ApoE. Mientras ApoE3, encontrada en el 78% de la población, se considera un alelo neutro, ApoE2 está asociada con hiperlipoproteinemia de tipo III (Hatters et al., 2006) y ApoE4 representa el factor genético de riesgo principal conocido para la enfermedad de Alzheimer (Corder et al., 1993) y también se correlaciona con un incremento modesto en el riesgo de desarrollar enfermedad cardiovascular (Luc et al, 1994). Dado que las múltiples líneas celulares de melanoma humano analizadas en el estudio anterior son homocigotas para el alelo de ApoE3, así como la capacidad de ApoE3 recombinante de inhibir la invasión y el reclutamiento endotelial del melanoma, los descubrimientos anteriores son consistentes con que ApoE3 sea suficiente y se requiera para la supresión de la progresión metastásica del melanoma. Sin embargo, será interesante en el futuro determinar si ApoE2 y ApoE4 pueden modular estos fenotipos prometastásicos en un grado similar al de ApoE3 y si los genotipos específicos de ApoE confieren un riesgo aumentado para la progresión metastásica del melanoma.
Además de la resección quirúrgica de lesiones de melanoma primarias, actualmente no hay terapias efectivas para la prevención de las metástasis de melanoma con la terapia con interferón incrementando las tasas de supervivencia global a los 5 años un escaso 3% sobre la base de meta-análisis, mientras la demostración de los datos de ensayos de fase III respecto a beneficios significativos en la supervivencia están todavía pendientes (Garbe et al., 2011). El aumento dramático de la progresión metastásica del melanoma en el contexto de la ablación genética de ApoE sistémica sugiere que la modulación de los niveles de ApoE puede tener implicaciones terapéuticas significativas para el melanoma - una enfermedad que es responsable de aproximadamente 48.000 muertes al año globalmente (Lucas et al, 2006). Dada la capacidad robusta de ApoE para suprimir la invasión, migración endotelial, angiogénesis metastásica, y colonización metastásica del melanoma, las estrategias terapéuticas dirigidas a la inducción farmacológica de los niveles de ApoE endógena pueden reducir significativamente las tasas de mortalidad por melanoma al disminuir la incidencia metastásica.
La estrategia basada en la selección in vivo no sesgada descrita anteriormente dio lugar al descubrimiento de miARN desrregulados que promueven sinérgicamente y dramáticamente la metástasis por las células cancerosas de líneas celulares de melanoma de pacientes independientes que representaban tanto melanomas melanóticos como amelanóticos. Aunque miR-1908 no se ha caracterizado previamente, miR-199a se ha implicado en el carcinoma hepatocelular (Hou et al., 2011; Shen et al., 2010) y el osteosarcoma (Duan et al., 2011) que, al contrario que el melanoma, presentan una regulación a la baja de los niveles de expresión de miR-199a. Estas diferencias son consistentes con los perfiles de expresión específicos de tejido establecidos de miARN en varios tipos de cáncer. La identificación de miR-199a como un promotor de la metástasis de melanoma está apoyada por un estudio previo de asociación clínica que revela que niveles incrementados de miR-199a se correlacionan con la progresión del melanoma uveal (Worley et al, 2008), lo que sugiere que la expresión inducida de miR-199a puede ser una característica que define el melanoma metastásico independientemente del sitio de origen. Estudios previos han implicado a miARN adicionales en la promoción de la progresión metastásica del melanoma tales como miR-182 (Segura et al., 2009), miR-214 (que estaba regulado al alza en células metastásicas de melanoma, pero no actuaban funcionalmente en los estudios anteriores; Penna et al., 2011), y miR-30b/miR-30d (Gaziel-Sovran et al., 2011). Se ha reportado que cada uno de estos miARN modula solo modestamente la metástasis de melanoma, dando lugar a una modulación de la metástasis incrementada o disminuida 1,5 a 2 veces después de la sobreexpresión o inactivación de los miARN, respectivamente. A diferencia de esto, la sobreexpresión de cualquiera de miR-199a o miR-1908 aumentó la metástasis 9 veces (Figura 1C), mientras la inactivación combinatoria de miARN suprimió sinérgicamente la metástasis de melanoma más de 70 veces (Figura 7E). Por lo tanto, el estudio descrito en la presente memoria representa el primer descubrimiento sistemático de múltiples miARN que de forma convergente y robusta promueven la metástasis del melanoma humano, así como el primero en asignar papeles duales autónomos de células/no autónomos de células a miARN endógenos reguladores de la metástasis en el cáncer.
Los análisis sistemáticos previos de miARN en cáncer de mama revelaron principalmente una disminución en los niveles de expresión de múltiples microARN en células de cáncer de mama metastásico seleccionadas in vivo (Tavazoie et al., 2008). Estos descubrimientos fueron consistentes con el descubrimiento posterior de muchos miARN supresores de metástasis adicionales en cáncer de mama (Shi et al., 2010; Wang y Wang, 2011), la identificación de varios miARN como dianas transcripcionales directas del supresor tumoral p53 (He et al, 2007), la regulación a la baja de miARN en cáncer de mama respecto a tejidos normales (Calin y Groce, 2006; Iorio et al., 2005), la regulación a la baja de drosha y dicer en cáncer de mama (Yan et al., 2011) y cáncer de mama metastásico (Grelier et al., 2011), así como los efectos protumorogénicos y prometastásicos del silenciamiento global de miARN a través de la inactivación de dicer (Kumar et al, 2007; Kumar et al, 2009; Martello et al, 2010; Noh et al, 2011). A diferencia del cáncer de mama, los descubrimientos anteriores en melanoma revelan un conjunto de miARN regulados al alza en melanoma humano metastásico, dando lugar a la posibilidad intrigante de que el procesamiento de los miARN puede actuar realmente de una manera protumorogénica y prometastásica en el melanoma. Consistente con esto, dicer se requiere para el desarrollo melanocítico (Levy et al, 2010), y se ha encontrado recientemente que la expresión de dicer se correlaciona positivamente con la progresión del melanoma humano en un estudio clínico-patológico (Ma et al, 2011). Estos descubrimientos, cuando se integran con los descubrimientos descritos aquí, motivan futuros estudios para investigar el requerimiento funcional de dicer (Bernstein et al., 2001) en la metástasis de melanoma.
El establecimiento de modelos de selección in vivo de metástasis de melanoma melanocítico y amelanocítico ha permitido identificar los fenotipos celulares presentados por las células de melanoma altamente metastásico. El trabajo revela que, además de una capacidad de invasión aumentada, la capacidad de las células de melanoma para reclutar células endoteliales está aumentada significativamente en células de melanoma altamente metastásico respecto a células de melanoma poco metastásico. Adicionalmente, se encontró que tres reguladores principales de la metástasis posteriores a la transcripción median fuertemente el reclutamiento endotelial. Se encontró además que la ruta de señalización aguas abajo modulada por estos miARN también regula el reclutamiento endotelial. Estos descubrimientos revelan que el reclutamiento endotelial es una característica que define a las células de melanoma metastásico. Recientemente, también se ha encontrado que la capacidad aumentada de reclutamiento endotelial es una característica que define al cáncer de mama metastásico, en donde la supresión de metástasis por miR-126 estaba mediada a través del direccionamiento de miARN a dos rutas de señalización distintas que promueven el reclutamiento endotelial (Png et al., 2012). En el cáncer de mama, el reclutamiento endotelial incrementó la probabilidad de inicio metastásico en lugar del crecimiento tumoral. De forma similar, los miARN promotores de metástasis de melanoma estudiados aquí aumentaron dramáticamente la colonización metastásica, sin aumentar el crecimiento tumoral primario, e incrementaron el número de nódulos metastásicos - consistente con un papel de estos miARN y su red reguladora en el inicio metastásico en lugar de en la promoción del crecimiento tumoral. Tomados conjuntamente, estos descubrimientos son consistentes con que el reclutamiento endotelial en el nicho metastásico actúa como un promotor del inicio y la colonización metastásica en estos distintos tipos de cáncer epitelial. Dicho papel no canónico para las células endoteliales en la progresión del cáncer estaría enfrentado al papel establecido de las células endoteliales en el aumento angiogénico de la activación del suministro de sangre del crecimiento tumoral aumentado. Se sabe que las células endoteliales juegan dichos papeles no canónicos en el desarrollo mediante el suministro de señales a las células vecinas durante la organogénesis (Lammert et al, 2001). Recientemente, también se ha mostrado que dichas señales promueven la regeneración de órganos (Ding et al, 2011; Ding et al, 2010; Kobayashi et al, 2010). Es necesario un trabajo futuro para determinar los factores estimuladores de metástasis proporcionados por las células endoteliales que catalizan el inicio metastásico.
La capacidad de miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 para predecir individualmente la supervivencia sin metástasis en una cohorte de pacientes con melanoma indica la significancia de cada miARN como un predictor clínico de la progresión de cáncer de melanoma. De forma importante, la capacidad dramática y altamente significativa de la firma agregada de los tres miARN (Figura 7D) para estratificar a pacientes con alto riesgo respecto a aquellos esencialmente sin riesgo para recidiva metastásica revela tanto la cooperatividad de estos miARN, así como su potencial clínico como biomarcadores de melanoma (Sawyers, 2008) para identificar el subconjunto de pacientes que podría beneficiarse de la terapia de inhibición de miARN. El direccionamiento terapéutico de los miARN ha obtenido un impulso a través del uso de LNA in vivo que se ha mostrado que antagonizan miARN en ratones (Elmer et al., 2008(b); Krutzfeldt et al, 2005; Obad et al, 2011) y primates (Elmer et al, 2008(a)) y actualmente se están ensayando en ensayos clínicos en seres humanos. La potente capacidad de pronóstico de los tres miARN, una demostración de prueba de principio de la prevención sinérgica robusta de la metástasis conseguida tratando células de melanoma altamente metastásicas con una mezcla de LNA dirigidos a miR-199a-3p, miR-199a-5p, y miR-1908 (Figura 7E), así como el efecto supresor de la metástasis de LNA optimizados in vivo administrados terapéuticamente dirigidos a estos miARN (Figura 7J) motivan estudios clínicos futuros con el objetivo de determinar el potencial terapéutico del direccionamiento combinatorio de estos miARN prometastásicos y proangiogénicos en pacientes con alto riesgo de metástasis de melanoma - un resultado que actualmente carece de opciones quimioterapéuticas efectivas.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un agonista de LXRp, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de un cáncer metastásico en un sujeto que lo necesita mediante el incremento del nivel de expresión o el nivel de actividad de ApoE, en donde el cáncer metastásico es resistente a un antiproliferativo de la Tabla 2 y el agonista de LXRp es:
Figure imgf000229_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El agonista de LXRp para uso según la reivindicación 1, en donde el cáncer metastásico es melanoma, cáncer de mama, cáncer de células renales, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de colon, o cáncer de ovario.
3. El agonista de LXRp para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el cáncer es melanoma.
4. El agonista de LXRp para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el cáncer es cáncer de mama.
5. El agonista de LXRp para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas.
6. El agonista de LXRp para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el cáncer es cáncer de células renales.
7. El agonista de LXRp para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el cáncer metastásico es resistente a vemurafenib, dacarbazina, un inhibidor de BRAF, un inhibidor de CTLA4, un inhibidor de PD1, un inhibidor de MEK, y/o un inhibidor de PDL1.
8. El agonista de LXRp para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el tratamiento comprende administrar un antiproliferativo de la Tabla 2, en donde el agonista de LXRp y el antiproliferativo de la Tabla 2 se administran en una cantidad que, conjuntamente, es suficiente como para ralentizar la progresión del cáncer metastásico.
ES13829165T 2012-08-13 2013-08-13 Tratamiento y diagnóstico de melanoma Active ES2765573T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261682339P 2012-08-13 2012-08-13
US201361784057P 2013-03-14 2013-03-14
PCT/US2013/054690 WO2014028461A2 (en) 2012-08-13 2013-08-13 Treatment and diagnosis of melanoma

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2765573T3 true ES2765573T3 (es) 2020-06-09

Family

ID=50101591

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19189895T Active ES2941477T3 (es) 2012-08-13 2013-08-13 Agonista de LXRbeta para el tratamiento de cáncer
ES13829165T Active ES2765573T3 (es) 2012-08-13 2013-08-13 Tratamiento y diagnóstico de melanoma

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19189895T Active ES2941477T3 (es) 2012-08-13 2013-08-13 Agonista de LXRbeta para el tratamiento de cáncer

Country Status (10)

Country Link
US (8) US9399028B2 (es)
EP (3) EP3626309B1 (es)
JP (5) JP6320382B2 (es)
CN (3) CN116271053A (es)
AU (4) AU2013302861A1 (es)
CA (2) CA2882292C (es)
DK (1) DK2882496T3 (es)
ES (2) ES2941477T3 (es)
HU (1) HUE046292T2 (es)
WO (1) WO2014028461A2 (es)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009140550A2 (en) 2008-05-14 2009-11-19 Dermtech International Diagnosis of melanoma and solar lentigo by nucleic acid analysis
SG10201607345YA (en) 2012-03-02 2016-11-29 Ralexar Therapeutics Inc Liver x receptor (lxr) modulators for the treatment of dermal diseases, disorders and conditions
ES2941477T3 (es) * 2012-08-13 2023-05-23 Univ Rockefeller Agonista de LXRbeta para el tratamiento de cáncer
CA2923178A1 (en) 2013-09-04 2015-03-12 Alexar Therapeutics, Inc. Liver x receptor (lxr) modulators for the treatment of dermal diseases, disorders and conditions
BR112016004904B1 (pt) 2013-09-04 2023-01-24 Ellora Therapeutics, Inc. Compostos moduladores de receptor x do fígado (lxr), seu uso e composição farmaceutica compreendendo os mesmos
AU2015204572B2 (en) * 2014-01-10 2020-07-30 Inspirna, Inc. LXR agonists and uses thereof
US20190125745A1 (en) * 2014-12-17 2019-05-02 Rgenix, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US10478494B2 (en) 2015-04-03 2019-11-19 Astex Therapeutics Ltd FGFR/PD-1 combination therapy for the treatment of cancer
US10709428B2 (en) 2015-05-01 2020-07-14 Dermtech, Inc. Non-invasive skin collection system
EP3314018A1 (en) * 2015-06-24 2018-05-02 Oxford Biodynamics Limited Detection processes using sites of chromosome interaction
JP2018527895A (ja) 2015-06-29 2018-09-27 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 抗−ａｐｏｂｅｃ３抗体並びにその製造及び使用方法
WO2017004165A1 (en) * 2015-06-29 2017-01-05 Regents Of The University Of Minnesota Apobec3b mutagenesis and immunotherapy
AU2017207291B2 (en) * 2016-01-11 2023-06-15 The Rockefeller University Methods for the treatment of myeloid derived suppressor cells related disorders
EP3416668A4 (en) * 2016-02-18 2020-02-19 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF MELANOMA
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
TWI786044B (zh) * 2016-05-13 2022-12-11 美商再生元醫藥公司 藉由投予ｐｄ-１抑制劑治療皮膚癌之方法
CN109689062B (zh) * 2016-07-11 2023-02-17 丹娜法伯癌症研究院 使用抗PI3Kβ和抗免疫检查点药剂的组合治疗PTEN缺陷型上皮癌的方法
MX393780B (es) 2017-01-17 2025-03-24 Heparegenix Gmbh Inhibidores de proteina cinasa para promover la regeneracion hepatica o reducir o prevenir la muerte de hepatocitos
MX394833B (es) * 2017-03-03 2025-03-24 Rgenix Inc Formulaciones con mejora de la estabilidad.
CN106890315B (zh) * 2017-03-16 2019-09-06 北京热休生物技术有限公司 Apo-e蛋白及其多肽在治疗与预防癌症中的应用
WO2018213302A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Biomed Valley Discoveries, Inc. Compositions and methods for treating cancer with atypical braf mutations
AU2018373028A1 (en) 2017-11-21 2020-04-30 Inspirna, Inc. Polymorphs and uses thereof
CA3090785A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 John Daniel Dobak Iii Novel gene classifiers and uses thereof in non-melanoma skin cancers
WO2020112802A1 (en) * 2018-11-28 2020-06-04 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for neurodegenerative disease
WO2020176846A2 (en) * 2019-02-28 2020-09-03 The Rockefeller University Apoe genotyping in cancer prognostics and treatment
EP3948290A4 (en) 2019-03-26 2023-08-09 Dermtech, Inc. NEW GENE CLASSIFIERS AND THEIR USES FOR SKIN CANCERS
EP3752524A4 (en) * 2019-04-27 2021-11-24 Ocugen, Inc. GENE THERAPY MEDIATED BY AN ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR FOR OPHTHALMIC DISEASES
CN110218235B (zh) * 2019-05-09 2020-09-25 中山大学 一种化合物及其制备方法和作为荧光偏振探针在LXRβ配体筛选中的应用
EP4027989A4 (en) * 2019-09-11 2023-09-06 Inspirna, Inc. METHOD FOR TREATING CANCER
CA3152258A1 (en) * 2019-09-27 2021-04-01 Sohail F. Tavazoie Compositions and methods for treating metastatic gastrointestinal cancer
RU2716811C1 (ru) * 2019-11-14 2020-03-16 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого" Способ ранней диагностики поверхностно распространяющихся меланом
RS65646B1 (sr) 2019-12-13 2024-07-31 Inspirna Inc Soli metala i njihove upotrebe
EP4081302A4 (en) * 2019-12-23 2025-01-29 University Of Massachusetts OLIGONUCLEOTIDES FOR TISSUE-SPECIFIC GENE EXPRESSION MODULATION
EP4200615A2 (en) * 2020-08-21 2023-06-28 CSL Behring AG Cd91 polypeptide for use in detecting hemopexin:heme complex
EP4376953A1 (en) * 2021-07-30 2024-06-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Peptide ligands for cns and ocular delivery of rnai compounds
CN114276999A (zh) * 2022-03-03 2022-04-05 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) 黑素瘤细胞株及其制备方法

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5676978A (en) 1989-02-14 1997-10-14 Amira, Inc. Methods of inhibiting undesirable cell growth using a combination of a cyclocreatine compound and a hyperplastic inhibitory agent
US5324731A (en) 1989-02-14 1994-06-28 Amira, Inc. Method of inhibiting transformation of cells in which purine metabolic enzyme activity is elevated
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5215882A (en) 1989-11-30 1993-06-01 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Method of immobilizing nucleic acid on a solid surface for use in nucleic acid hybridization assays
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5837832A (en) 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
EP0735144B1 (en) 1995-03-28 2002-06-05 Japan Science and Technology Corporation Method for molecular indexing of genes using restriction enzymes
US5843974A (en) * 1995-06-06 1998-12-01 Eli Lilly And Company Methods of inhibiting melanoma using Benzothiophenes as cytotoxic agents per se
US5958342A (en) 1996-05-17 1999-09-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Jet droplet device
US6060240A (en) 1996-12-13 2000-05-09 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
US6090556A (en) 1997-04-07 2000-07-18 Japan Science & Technology Corporation Method for quantitatively determining the expression of a gene
US5994076A (en) 1997-05-21 1999-11-30 Clontech Laboratories, Inc. Methods of assaying differential expression
ATE338118T1 (de) 1997-12-12 2006-09-15 Univ Western Ontario Neues peptid, apoep1.b, zusammensetzungen und verwendungen davon
US6004755A (en) 1998-04-07 1999-12-21 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Quantitative microarray hybridizaton assays
US6048695A (en) 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
US6087112A (en) 1998-12-30 2000-07-11 Oligos Etc. Inc. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
US6316503B1 (en) 1999-03-15 2001-11-13 Tularik Inc. LXR modulators
US8257750B2 (en) 1999-04-30 2012-09-04 Kibow Biotech, Inc. Calcium carbonate compositions for preventing or treating hyperphosphatemia
WO2002006451A1 (en) 2000-07-18 2002-01-24 Uab Research Foundation Tissue-specific self-inactivating gene therapy vector
AU2001288955A1 (en) 2000-09-07 2002-03-22 Vanderbilt University Genome engineering by cell-permeable dna site-specific recombinases
DE60107449T2 (de) 2000-09-18 2005-12-08 Glaxo Group Ltd., Greenford Substituierte aminopropoxyarylderivate als lxr agonisten
AU2002219718A1 (en) 2000-12-13 2002-06-24 Sca Hygiene Products Zeist B.V. Process for oxidising primary alcohols
JP2003033179A (ja) 2001-07-05 2003-02-04 Asahi Kasei Corp 可逆的遺伝子導入ベクター
JP4471842B2 (ja) * 2002-03-27 2010-06-02 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー アミド化合物および該化合物を用いる方法
WO2003082205A2 (en) 2002-03-27 2003-10-09 Smithkline Beecham Corporation Compounds and methods
EP1487776A4 (en) 2002-03-27 2005-05-25 Smithkline Beecham Corp ACID COMPOUNDS AND ESTERS AND METHODS OF USE THEREOF
US7476519B2 (en) 2002-07-19 2009-01-13 Joseph Monforte Strategies for gene expression analysis
US7135575B2 (en) * 2003-03-03 2006-11-14 Array Biopharma, Inc. P38 inhibitors and methods of use thereof
WO2004078939A2 (en) 2003-03-03 2004-09-16 University Of Massachusetts REGULATION OF Mdm2 FUNCTION
US20050130919A1 (en) 2003-07-18 2005-06-16 University Of Massachusetts Regulatable promoters for synthesis of small hairpin RNA
CA2543189A1 (en) 2003-10-20 2005-05-06 Nsgene A/S In vivo gene therapy of parkinson's disease
AU2004298486A1 (en) 2003-12-12 2005-06-30 Wyeth Quinolines useful in treating cardiovascular disease
FR2865736B1 (fr) 2004-02-02 2006-07-14 Synt Em Inhibiteurs de l'angiogenese, compositions les contenant et leur utilisation pour le traitement des maladies liees a une deregulation de l'angiogenese
WO2005112620A2 (en) 2004-05-18 2005-12-01 Massachusetts Institute Of Technology A cre-lox based method for conditional rna interference
TW200606157A (en) * 2004-07-02 2006-02-16 Sankyo Co Suppressant of production of tissue factor
US7649009B2 (en) 2004-07-07 2010-01-19 Merck & Co., Inc. Pyrazole amide derivatives, compositions containing such compounds and methods of use
US20060058311A1 (en) 2004-08-14 2006-03-16 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combinations for the treatment of diseases involving cell proliferation
RU2383524C2 (ru) 2004-10-01 2010-03-10 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Гексафторизопропанол-замещенные производные простых эфиров
CN101087754B (zh) 2004-12-22 2012-01-18 霍夫曼-拉罗奇有限公司 环己烷衍生物
JP2008526842A (ja) 2005-01-10 2008-07-24 アストラゼネカ アクチボラグ 肝ｘ受容体モジュレーターとしてのイソチアゾール−３（２ｈ）−チオン１，１−ジオキシドのアニリン誘導体
SE0500055D0 (sv) 2005-01-10 2005-01-10 Astrazeneca Ab Therapeutic agents 3
SE0500058D0 (sv) 2005-01-10 2005-01-10 Astrazeneca Ab Therapeutic agents 5
WO2006073363A1 (en) 2005-01-10 2006-07-13 Astrazeneca Ab Derivatives of isothiazol-3(2h)-one 1,1-dioxides as liver x receptor modulators
SE0500056D0 (sv) 2005-01-10 2005-01-10 Astrazeneca Ab Therapeutic agents 4
US7700595B2 (en) 2005-03-01 2010-04-20 Wyeth Llc Cinnoline compounds
WO2006102067A1 (en) 2005-03-21 2006-09-28 Merck & Co., Inc. Substituted aryl and heteroaryl derivatives
CA2613517A1 (en) 2005-06-27 2007-01-04 Exelixis, Inc. Pyrazole based lxr modulators
CA2622755C (en) 2005-10-07 2017-01-31 Exelixis, Inc. Azetidines as mek inhibitors
US7741317B2 (en) 2005-10-21 2010-06-22 Bristol-Myers Squibb Company LXR modulators
US7790745B2 (en) 2005-10-21 2010-09-07 Bristol-Myers Squibb Company Tetrahydroisoquinoline LXR Modulators
CN101309915A (zh) 2005-11-14 2008-11-19 Irm责任有限公司 作为lxr调节剂的化合物和组合物
WO2007081335A1 (en) 2006-01-12 2007-07-19 Merck & Co., Inc. Therapeutic compounds for treating dyslipidemic conditions
ATE495197T1 (de) 2006-03-20 2011-01-15 Cepep Iii Ab Chimäre konstrukte zwischen auf krebs zielenden peptiden und zellpenetrierenden peptiden gekoppelt an antikrebsmittel und/oder diagnostische mittel
WO2008011071A2 (en) * 2006-07-19 2008-01-24 The Regents Of The University Of California Interactions of hedgehog and liver x receptor signaling pathways
TW200825054A (en) 2006-10-18 2008-06-16 Wyeth Corp Quinoline compounds
US8324367B2 (en) 2006-11-03 2012-12-04 Medtronic, Inc. Compositions and methods for making therapies delivered by viral vectors reversible for safety and allele-specificity
WO2008065754A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Kowa Company, Ltd. Substituted carbinol compound
WO2008073825A1 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Exelixis, Inc. Lxr and fxr modulators
JP2008179562A (ja) 2007-01-24 2008-08-07 Kowa Co Ｌｘｒアゴニスト
US8993628B2 (en) 2007-02-23 2015-03-31 City Of Hope Synthetic ligands selective for LXRβ over LXRα, identification and methods of use thereof
MX2009012474A (es) 2007-05-18 2009-12-18 Wyeth Corp Compuestos de quinazolina.
EP3443976A1 (en) 2007-06-29 2019-02-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Tissue specific peptide conjugates and methods
AU2008288537B2 (en) 2007-08-13 2011-03-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel piperazine amide derivatives
TW200922582A (en) 2007-08-20 2009-06-01 Organon Nv N-benzyl, N'-arylcarbonylpiperazine derivatives
US8039493B2 (en) 2007-09-27 2011-10-18 Hoffmann-La Roche Inc. Biaryl sulfonamide derivatives
DK2623599T3 (en) * 2007-10-04 2019-04-08 Roche Innovation Ct Copenhagen As Micromirers
KR101502267B1 (ko) 2007-11-09 2015-03-18 페레그린 파마수티컬즈, 인크 항-ｖｅｇｆ 항체 조성물 및 방법
WO2009075836A2 (en) * 2007-12-10 2009-06-18 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Rap variants for drug delivery
BRPI0822239A2 (pt) 2007-12-21 2015-06-30 Wyeth Llc Composto de pirazolo[1,5-a] pirimidina
US20100331333A1 (en) 2007-12-21 2010-12-30 Wyeth Llc Imidazo [1,2-B] Pyridazine Compounds
BRPI0821315A2 (pt) 2007-12-21 2019-09-24 Wyeth Llc compostos benzimidazol
US20110112135A1 (en) 2007-12-21 2011-05-12 Singhaus Jr Robert Ray Imidazo [1,2-A] Pyridine Compounds
EP2248811B1 (en) 2008-02-29 2012-11-14 Kowa Company, Ltd. 2-oxochromene derivative
US20090311187A1 (en) * 2008-05-29 2009-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Methods for predicting patient response to modulation of the Co-stimulatory pathway
US20110166079A1 (en) * 2008-07-01 2011-07-07 Cognosci, Inc. Methods of treating cancer with apoe peptides
WO2010036959A2 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Dana-Farber Cancer Institute Human anti-pd-1, pd-l1, and pd-l2 antibodies and uses therefor
US20120156216A1 (en) * 2009-03-02 2012-06-21 Youngman Oh Methods and Compositions for Treatment of Tumor Metastasis
AU2010254082B2 (en) * 2009-05-28 2015-01-29 Exelixis, Inc. LXR modulators
WO2011115892A1 (en) * 2010-03-15 2011-09-22 Griffin Patrick R Modulators of the retinoic acid receptor-related orphan receptors
US9421218B2 (en) * 2010-04-13 2016-08-23 New York University Compositions and methods for treatment of melanoma
US20130090258A1 (en) 2010-06-16 2013-04-11 National University Corporation Hamamatsu University School Of Medicines Method for detecting colorectal tumor
EP2474617A1 (en) * 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
US20130004481A1 (en) * 2011-01-12 2013-01-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anticancer therapy
TW201242953A (en) 2011-03-25 2012-11-01 Bristol Myers Squibb Co Imidazole prodrug LXR modulators
AU2013201121A1 (en) * 2011-09-20 2013-04-04 Vical Incorporated Synergistic anti-tumor efficacy using alloantigen combination immunotherapy
ES2941477T3 (es) * 2012-08-13 2023-05-23 Univ Rockefeller Agonista de LXRbeta para el tratamiento de cáncer

Also Published As

Publication number Publication date
CN110037999B (zh) 2023-01-13
AU2020200715A1 (en) 2020-02-20
US10945978B2 (en) 2021-03-16
WO2014028461A2 (en) 2014-02-20
CA3211094A1 (en) 2014-02-20
EP3626309B1 (en) 2023-03-08
AU2020200715B2 (en) 2022-05-12
ES2941477T3 (es) 2023-05-23
AU2018226488B2 (en) 2020-01-23
AU2018226488A1 (en) 2018-09-27
JP2022001571A (ja) 2022-01-06
HUE046292T2 (hu) 2020-02-28
EP2882496A4 (en) 2016-07-06
US20210220306A1 (en) 2021-07-22
US20240252458A1 (en) 2024-08-01
CN104780976A (zh) 2015-07-15
US20200230090A1 (en) 2020-07-23
JP7472080B2 (ja) 2024-04-22
US11865094B2 (en) 2024-01-09
JP2019151646A (ja) 2019-09-12
EP3626309A1 (en) 2020-03-25
US20160331726A1 (en) 2016-11-17
US20150023955A1 (en) 2015-01-22
US9399028B2 (en) 2016-07-26
CN116271053A (zh) 2023-06-23
EP4218935A1 (en) 2023-08-02
DK2882496T3 (da) 2019-11-11
JP2024041827A (ja) 2024-03-27
CN110037999A (zh) 2019-07-23
JP6320382B2 (ja) 2018-05-09
WO2014028461A3 (en) 2014-04-17
US20180153833A1 (en) 2018-06-07
JP2018140982A (ja) 2018-09-13
US9962348B2 (en) 2018-05-08
JP2015532642A (ja) 2015-11-12
JP6523502B2 (ja) 2019-06-05
US10543183B2 (en) 2020-01-28
AU2022215282A1 (en) 2022-11-03
CA2882292A1 (en) 2014-02-20
HK1212273A1 (en) 2016-06-10
EP2882496B1 (en) 2019-10-09
EP2882496A2 (en) 2015-06-17
AU2013302861A1 (en) 2015-03-05
US9707195B2 (en) 2017-07-18
US9526710B2 (en) 2016-12-27
CA2882292C (en) 2023-10-17
CN104780976B (zh) 2019-01-01
JP7005551B2 (ja) 2022-02-04
US20170319525A1 (en) 2017-11-09
US20150073053A1 (en) 2015-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2765573T3 (es) Tratamiento y diagnóstico de melanoma
WO2016100619A2 (en) Treatment and diagnosis of cancer
HK40005229A (en) Treatment and diagnosis of melanoma
HK40005229B (en) Treatment and diagnosis of melanoma
HK1212273B (zh) 治疗和诊断黑素瘤