ES2762672T3 - Proteínas de fusión de P97-IDS - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión de p97 (melanotransferrina) que comprende un polipéptido de iduronato-2-sulfatasa (IDS) fusionado al extremo N de un polipéptido de p97 y un enlazador peptídico opcional (L) entremedio, en donde el polipéptido de p97 consiste en la secuencia de aminoácidos DSSHAFTLDELR.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión de P97-IDS

Antecedentes

Campo técnico

La presente invención se refiere a proteínas de fusión entre p97 (melanotransferrina) e iduronato-2-sulfatasa (IDS, por sus siglas), y composiciones y métodos de uso relacionados con estas, por ejemplo, para facilitar el suministro de IDS a través de la barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés) y/o mejorar su penetración en el tejido en el CNS y/o tejidos periféricos y tratar y/o diagnosticar, de este modo, el síndrome de Hunter (Mucopolisacaridosis tipo II; MPS II, por sus siglas) y trastornos de almacenamiento lisosómico relacionados, incluidos aquellos que tienen un componente del sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés).

Descripción de la técnica relacionada

Las enfermedades del almacenamiento lisosómico (LSD, por sus siglas en inglés) surgen por la ausencia o actividad reducida de enzimas o proteínas específicas dentro de los lisosomas de una célula. Dentro de las células, el efecto de la actividad enzimática faltante se puede observar como una acumulación de un "material de almacenamiento" no degradado dentro del lisosoma intracelular. Este aumento provoca que los lisosomas se hinchen y fallen, lo que resulta en daño celular y tisular. Dado que las enfermedades de almacenamiento lisosómico típicamente tienen una etiología genética, muchos tejidos carecerán de la enzima en cuestión. Sin embargo, diferentes tejidos sufren la ausencia de la misma actividad enzimática de manera diferente. Cuán adversamente se verá afectado un tejido se determina, en cierta medida, por el grado en que dicho tejido genera el sustrato de la enzima faltante. A su vez, los tipos de tejidos más cargados por el almacenamiento, indican cómo se debe administrar el fármaco al paciente. Se ha identificado y correlacionado una gran cantidad de enzimas de enfermedad de almacenamiento lisosómico con sus respectivas enfermedades. Después de que se ha identificado la enzima faltante o deficiente, el tratamiento se puede centrar en el problema de suministrar de manera eficaz la enzima de reemplazo a los tejidos afectados de un paciente. El síndrome de Hunter o Mucopolisacaridosis tipo II (MPS II) es un trastorno de almacenamiento lisosómico (LSD, por sus siglas en inglés) causado por una deficiencia de iduronato-2-sulfatasa (I2S o IDS). La I2S es una enzima lisosómica responsable del metabolismo de mucopolisacáridos. La deficiencia en la actividad de la enzima conduce finalmente a una variedad de patologías y a la muerte prematura. La terapia de reemplazo enzimático (ERT, por sus siglas en inglés) con I2S recombinante (Elaprase®) puede tratar síntomas periféricos, pero los pacientes sufren eventualmente demencia debido a que la enzima no puede cruzar la barrera hematoencefálica (BBB). Las formas desfosforiladas de proteínas de enfermedad de almacenamiento lisosómico (LSD), incluidas formas desfosforiladas de iduronato-2-sulfatasa (IDS o I2D) e iduronidasa (IDU), que tienen mayor capacidad de atravesar o penetrar la barrera hematoencefálica (BBB) con respecto a las formas fosforiladas de la proteína, y conjugados con p97 de estas se describen en la publicación internacional WO 2014/022515 A1.

La terapia de reemplazo enzimático (ERT) intravenosa puede ser beneficiosa para LSD tales como MPSII. Sin embargo, serían ventajosos medios para potenciar el suministro de la enzima terapéutica al lisosoma en dichas enfermedades en relación con un costo reducido y mayor eficacia terapéutica.

Como uno de los problemas, la barrera hematoencefálica (BBB) bloquea la transferencia libre de muchos agentes desde la sangre al cerebro. Por este motivo, no se espera que las LSD que presentan un aspecto neurológico significativo respondan a la ERT intravenosa. Para dichas enfermedades, serían muy deseables métodos para mejorar el suministro de la enzima a través de la BBB y hacia los lisosomas en las células afectadas.

Breve compendio

La presente invención se refiere a proteínas de fusión de p97 (melanotransferrina o MTf), que comprenden un polipéptido de iduronato-2-sulfatasa (IDS o I2S) fusionado al extremo N de un polipéptido de p97 y un enlazador peptídico opcional (L) entremedio, en donde el polipéptido de p97 consiste en la secuencia de aminoácidos DSSHAFTLDELR. La presente invención se refiere, además, a proteínas de fusión de p97 (melanotransferrina), que comprenden un polipéptido de iduronato-2-sulfatasa (IDS) fusionado al extremo C de un polipéptido de p97 y un enlazador peptídico opcional (L) entremedio, en donde el polipéptido de p97 consiste en la secuencia de aminoácidos DSSHAFTLDELR.

Ciertas proteínas de fusión comprenden el enlazador peptídico entremedio. En ciertas realizaciones, el enlazador peptídico se selecciona de uno o más de un enlazador rígido, un enlazador flexible y un enlazador enzimáticamente escindible. En ciertas realizaciones, el enlazador peptídico es un enlazador rígido, opcionalmente que comprende la secuencia (EAAAK)-^{i _3} (SEQ ID NOS:36-38), tal como EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID NO:38). En algunas realizaciones, el enlazador peptídico es un enlazador flexible. En ciertas realizaciones, el enlazador peptídico es un enlazador enzimáticamente escindible.

En ciertas realizaciones, la proteína de fusión comprende una secuencia de péptido señal (SP, por sus siglas en inglés) en el extremo N, opcionalmente seleccionada de la Tabla 4. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende la estructura: (a) SP-IDS-L-p97 o (b) SP-p97-L-IDS.

En realizaciones específicas, el SP comprende la secuencia MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (SEQ ID NO:149) y la proteína de fusión de p97 comprende la estructura: (a) SP-p97-IDS o (b) SP-p97-L-IDS.

En ciertas realizaciones, el SP comprende la secuencia de SP de p97 humana MRGPSGALWLLLALRTVLG (SEQ ID NO:39) y la proteína de fusión de p97 comprende la estructura: (a) SP-p97-IDS o (b) SP-p97-L-IDS.

En ciertas realizaciones, el SP comprende la secuencia de SP de IDS humana MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALG (SEQ ID NO:40) y la proteína de fusión de p97 comprende la estructura: (a) SP-IDS-p97 o (b) SP-IDS-L-p97.

En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una etiqueta de purificación (TAG), opcionalmente seleccionada de la Tabla 5. En ciertas realizaciones, la proteína de fusión comprende la estructura: (a) SP-TAG-IDS-L-p97 o (b) SP-TAG-p97-L-IDS. En ciertas realizaciones, la etiqueta comprende una etiqueta de poli-histidina, opcionalmente una etiqueta de 10X poli-histidina. En algunas realizaciones, la etiqueta comprende una etiqueta FLAG DYKDDDDK (SEQ ID NO:122). En realizaciones específicas, la etiqueta comprende una etiqueta de polihistidina, por ejemplo, una etiqueta de 10X poli-histidina y una etiqueta FLAG.

En ciertas realizaciones, la proteína de fusión comprende un sitio de proteasa (PS, por sus siglas en inglés), opcionalmente seleccionado de la Tabla 6. En realizaciones específicas, la proteína de fusión comprende la estructura: (a) SP-TAG-PS-IDS-L-p97 o (b) SP-TAG-PS-p97-enlazador-IDS. En realizaciones específicas, el sitio PS comprende el sitio de proteasa TEV ENL^y F^q G (SEQ ID NO:135).

En ciertas realizaciones, la proteína de fusión comprende la estructura (a) SP (MEWSWVFLFFLSVTTGVHS; SEQ ID NO:149)-HIS TAG-TEV PS-IDS-L rígido-p97 o (b) SP (MEWSWVFLFFLSVTTGVHS; SEQ ID NO: 149)-HIS TAG-TEV PS-p97-L rígido-IDS.

En realizaciones específicas, la proteína de fusión comprende la estructura (a) SP (MEWSWVFLFFLSVTTGVHS; SEQ ID NO: 149)-HIS TAG-TEV PS-IDS-(EAAAK)a-p97 o (b) SP (MEWSWVFLFFLSVTTGVHS; SEQ ID NO: 149)-HIS TAG-TEV PS-p97-(EAAAK)a-IDS.

En ciertas realizaciones, la proteína de fusión comprende la estructura (a) IDS SP-HIS TAG-TEV PS-IDS-L rígidop97 o (b) p97 SP-HIS TAG-TEV PS-p97-L rígido-IDS.

En realizaciones específicas, la proteína de fusión comprende la estructura (a) IDS SP-10xHIS TAG-TEV PS-IDS-(EAAAK)3-p97 (SEQ ID NO:29) o (b) p97 SP-10xHIS TAG-TEV PS-p97-(EAAAK)3-IDS (SEQ ID NO:30).

En ciertas realizaciones, el polipéptido de IDS comprende, consiste o consiste esencialmente en (a) una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOs:31-35; (b) una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a una secuencia expuesta en SEQ ID NOs:31-35; (c) o una secuencia de aminoácidos que difiere de SEQ ID NOs:31-35 por la adición, sustitución, inserción o eliminación de aproximadamente 1-50 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido de IDS comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:32 o 33.

El polipéptido de p97 según la invención consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:14 (MTfpep).

En ciertas realizaciones, la proteína de fusión comprende, consiste o consiste esencialmente en (a) una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOs: 140-142; (b) una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 140-142; (c) o una secuencia de aminoácidos que difiere de SEQ ID NO: 140-142 por la adición, sustitución, inserción o eliminación de aproximadamente 1-50 aminoácidos. En realizaciones específicas, la proteína de fusión comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 140-142.

También se incluyen polinucleótidos aislados que codifican la proteína de fusión de p97 descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, el polinucleótido aislado se optimiza por codón para su expresión en una célula hospedante. En ciertas realizaciones, la célula hospedante es una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de levadura o una célula bacteriana. El polinucleótido descrito en la presente memoria puede comprender una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:143-147.

Algunas realizaciones incluyen células hospedantes recombinantes, que comprenden un polinucleótido aislado descrito en la presente memoria, donde el polinucleótido aislado está funcionalmente enlazado a uno o más elementos reguladores.

También se incluyen vectores que comprenden un polinucleótido aislado que codifica una proteína de fusión de p97 descrita en la presente memoria, que está funcionalmente enlazado a uno o más elementos reguladores.

También se incluyen células hospedantes recombinantes que comprenden un vector, polinucleótido aislado y/o proteína de fusión de p97 descrita en la presente memoria. En ciertas realizaciones, la célula hospedante es una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de levadura o una célula bacteriana. En realizaciones específicas, la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), una célula HEK-293 o una célula de fibrosarcoma humano HT-1080.

Ciertas realizaciones incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión de p97 según la invención, donde la composición farmacéutica es estéril y no pirógena.

También se incluyen métodos para el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosómico en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una proteína de fusión de p97 o composición farmacéutica según la invención. En ciertas realizaciones, la enfermedad de almacenamiento lisosómico es el síndrome de Hunter (MPS II). En ciertas realizaciones, la enfermedad de almacenamiento lisosómico tiene afectación del sistema nervioso central (CNS). En ciertas realizaciones, el sujeto está en riesgo de desarrollar afectación del CNS de la enfermedad de almacenamiento lisosómico. En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano de sexo masculino. En ciertas realizaciones, la proteína de fusión de p97 o composición farmacéutica se administra mediante infusión intravenosa (IV) o inyección intraperitoneal (IP).

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B ilustran la estructura general de proteínas de fusión ilustrativas que tienen un péptido señal (SP), etiqueta de purificación o afinidad (TAG), sitio de proteasa (PS) para la eliminación del SP y la TAG, polipéptido de p97 (melanotransferrina), un enlazador (L) y un polipéptido de iduronato-2-sulfatasa (IDS).

La Figura 2 muestra la evaluación de la actividad enzimática de las proteínas de fusión I2S-MTf y MTf-12S según se mide por su capacidad de hidrolizar el sustrato 4-Nitrocatecol Sulfato (PNCS) con respecto a IDS humana recombinante y un testigo negativo (fusión TZM-MTf). Se usó 1 ug de cada muestra en el ensayo de actividad enzimática y los datos presentados están normalizados con respecto a rhIDS.

La Figura 3 muestra la evaluación de la actividad enzimática de las proteínas de fusión MTfpep-I2S y I2S-MTfpep (con propéptido de I2S) según se mide por su capacidad de hidrolizar el sustrato PNCS con respecto a la fusión I2S-MTf y un testigo negativo (fusión TZM-MTf). Se usó 1 ug de cada muestra en el ensayo de actividad enzimática y los datos presentados están normalizados con respecto al blanco de sustrato.

La Figura 4 muestra una comparación de la actividad enzimática de las proteínas de fusión I2S-MTfpep (con propéptido de I2S) e I2S-MTfpep (sin propéptido de I2S) según se mide por su capacidad de hidrolizar el sustrato PNCS. Se usó 1 ug de cada muestra en el ensayo de actividad enzimática y los datos presentados están normalizados con respecto al blanco de sustrato.

La Figura 5 muestra la cuantificación de la distribución relativa de las proteínas de fusión MTfpep-I2S (con propéptido) e I2S-MTf entre capilares (C) y el parénquima (P) en el cerebro, con respecto a la señal total (T). La generación de imágenes por microscopía confocal cuantitativa muestra que ambas proteínas de fusión MTfpep-I2S y I2S-MTf se asociaron intensamente con tejidos parenquimatosos del CNS.

Descripción detallada

La puesta en práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de biología molecular y técnicas de ADN recombinante que están dentro de la experiencia en la técnica, muchas de las cuales se describen a continuación con fines ilustrativos. Dichas técnicas se explican de manera completa en la literatura. Ver, p. ej., Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratorio Manual (3a edición, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, tomos I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin and Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R.I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 5a ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3a edición 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3a edición, 2005).

Definiciones

A menos que se definan de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por los expertos en la técnica a los cuales corresponde la invención. Aunque se pueden usar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la puesta en práctica o evaluación de la presente invención, se describen ciertos métodos y materiales ilustrativos en la presente memoria. A los efectos de la presente invención, se definen los siguientes términos a continuación.

Los artículos "un/uno" y "una" se usan en la presente memoria para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Se entiende por "aproximadamente" una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, monto, peso o longitud que varía tanto como 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, monto, peso o longitud de referencia. Según se usa en la presente memoria, se pretende que el término "aminoácido" signifique aminoácidos de origen natural y de origen no natural, así como análogos y miméticos de aminoácidos. Los aminoácidos de origen natural incluyen los 20 (L)-aminoácidos usados durante la biosíntesis proteica, así como otros tales como 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, desmosina, isodesmosina, homocisteína, citrulina y ornitina, por ejemplo. Los aminoácidos de origen no natural incluyen, por ejemplo, (D)-aminoácidos, norleucina, norvalina, p-fluorofenilalanina, etionina y similares, que conoce un experto en la técnica. Los análogos de aminoácidos incluyen formas modificadas de aminoácidos de origen natural y de origen no natural. Dichas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, sustitución o reemplazo de grupos y restos químicos en el aminoácido o la derivación del aminoácido. Los miméticos de aminoácidos incluyen, por ejemplo, estructuras orgánicas que exhiben propiedades funcionalmente similares, tales como características de carga y espaciamiento de carga del aminoácido de referencia. Por ejemplo, una estructura orgánica que imita Arginina (Arg o R) tendría un resto de carga positiva ubicado en un espacio molecular similar y que tendría el mismo grado de movilidad que el grupo e-amino en la cadena lateral del aminoácido Arg de origen natural. Los miméticos también incluyen estructuras restringidas para mantener un espaciamiento óptimo e interacciones de carga del aminoácido o de los grupos funcionales del aminoácido. Los expertos en la técnica saben o pueden determinar qué estructuras constituyen análogos de aminoácidos o miméticos de aminoácidos funcionalmente equivalentes.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, se entenderá que las palabras "comprenden", " comprende" y "que comprende/n" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos indicados, pero no la exclusión de ninguna otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Se entiende por "consiste en" que incluye, y se limita a, todo lo que sigue a la frase "consiste en". Por lo tanto, la frase "consiste en" indica que los elementos indicados son necesarios u obligatorios, y que ningún otro elemento puede estar presente. Se entiende por "consiste esencialmente en" que incluye cualesquiera elementos indicados después de la frase y se limita a otros elementos que no interfieren en ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la descripción de los elementos indicados. Por lo tanto, la frase "consiste esencialmente en" indica que los elementos indicados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes, dependiendo de si afectan o no materialmente la actividad o acción de los elementos indicados.

Se pretende que el término "conjugado" haga referencia a la entidad formada como resultado de un acoplamiento o enlace covalente o no covalente de un agente u otra molécula, p. ej., una molécula biológicamente activa, con un polipéptido de p97 o secuencia de p97. Un ejemplo de un polipéptido conjugado es una "proteína de fusión" o "polipéptido de fusión", es decir, un polipéptido que se crea a través de la unión de dos o más secuencias codificantes, que originalmente codificaban polipéptidos separados; la traducción de las secuencias codificantes unidas genera un polipéptido de fusión simple, típicamente con propiedades funcionales derivadas de cada uno de los polipéptidos separados.

Según se usan en la presente memoria, los términos "función" y "funcional" y similares se refieren a una función biológica, enzimática o terapéutica.

"Homología" se refiere al número porcentual de aminoácidos que son idénticos o constituyen sustituciones conservadoras. La homología se puede determinar mediante el uso de programas de comparación de secuencias tales como GAP (Deveraux et al., Nucleic Acids Research. 12, 387-395, 1984). De este modo, se podrían comparar secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente con las mencionadas en la presente memoria mediante la inserción de espacios en la alineación, tales como espacios que se determinan, por ejemplo, mediante el algoritmo de comparación usado por GAP.

Se entiende por "aislado" material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado natural. Por ejemplo, un "péptido aislado" o un "polipéptido aislado" y similares, según se usa en la presente memoria, incluye el aislamiento y/o la purificación in vitro de una molécula de péptido o polipéptido de su entorno natural celular, y de la asociación con otros componentes de la célula; es decir, no está asociado significativamente con sustancias in vivo.

El término "enlace", "enlazador", "resto enlazador" o "L" se usa en la presente memoria para hacer referencia a un enlazador que se puede usar para separar un polipéptido de p97 de un agente de interés, o para separar un primer agente de otro agente, por ejemplo, donde dos o más agentes se enlazan para formar un conjugado o proteína de fusión de p97. El enlazador puede ser fisiológicamente estable o puede incluir un enlazador liberable tal como un enlazador enzimáticamente degradable (p. ej., enlazadores proteolíticamente escindibles). En ciertos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador peptídico, por ejemplo, como parte de una proteína de fusión de p97. En ciertos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador no peptídico o un enlazador no proteínico. En ciertos aspectos, el enlazador puede ser una partícula, tal como una nanopartícula.

Los términos "modular" y "alterar" incluyen "aumentar", "potenciar" o " estimular", así como "disminuir" o "reducir" típicamente en una cantidad o grado estadísticamente significativo o fisiológicamente significativo con respecto a un testigo. Una cantidad "aumentada", "estimulada" o "potenciada" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir un aumento que es 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces mayor (p. ej., 500, 1000 veces) (incluidos todos los números enteros y puntos decimales entre y por encima de 1, p. ej., 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) que la cantidad producida sin la composición (p. ej., la ausencia de una proteína de fusión de la invención) o una composición, muestra o sujeto de prueba testigo. Una cantidad "disminuida" o "reducida" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir una disminución de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % en la cantidad producida sin composición o mediante una composición testigo, incluidos todos los números enteros entremedio. Como un ejemplo no limitante, un testigo podría comparar la actividad, tal como la actividad enzimática, la cantidad o la velocidad de transporte/suministro a través de la barrera hematoencefálica, la velocidad y/o los niveles de distribución al tejido del sistema nervioso central y/o la Cmáx para el plasma, tejidos del sistema nervioso central o cualesquiera otros tejidos que no pertenecen al sistema nervioso central sistémicos o periféricos, de una proteína de fusión de p97 con respecto al agente/proteína solo. Otros ejemplos de comparaciones y cantidades "estadísticamente significativas" se describen en la presente memoria.

En ciertas realizaciones, la "pureza" de un agente dado (p. ej., un conjugado de p97 tal como una proteína de fusión) se puede definir específicamente en una composición. Por ejemplo, ciertas composiciones pueden comprender un agente que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % puro, incluidos todos los decimales entremedio, según se mide, por ejemplo, y de ningún modo como limitación, mediante cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés), una forma conocida de cromatografía en columna usada frecuentemente en bioquímica y química analítica para separar, identificar y cuantificar compuestos.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable en la presente memoria para hacer referencia a un polímero de residuos aminoacídicos y a variantes y análogos sintéticos de los mismos. Por lo tanto, estos términos se aplican a polímeros aminoacídicos en lo que uno o más residuos aminoacídicos son aminoácidos de origen no natural sintéticos, tales como un análogo químico de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros aminoacídicos de origen natural. Los polipéptidos descritos en la presente memoria no se limitan a una longitud específica del producto; por lo tanto, se incluyen péptidos, oligopéptidos y proteínas dentro de la definición de polipéptido, y dichos términos se pueden usar de manera intercambiable en la presente memoria a menos que se indique específicamente de cualquier otra manera. Los polipéptidos descritos en la presente memoria también pueden comprender modificaciones postexpresión, tales como glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural. Un polipéptido puede ser una proteína entera, o una subsecuencia, fragmento, variante o derivado de esta.

Una unión "fisiológicamente escindible" o "hidrolizable" o "degradable" es una unión que hace reacción con agua (es decir, se hidroliza) en condiciones fisiológicas. La tendencia de una unión a hidrolizarse en agua dependerá no solo del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales, sino también de los sustituyentes acoplados a estos átomos centrales. Los enlaces hidrolíticamente inestables o débiles adecuados incluyen, pero no se limitan a: éster de carboxilato, éster de fosfato, anhídrido, acetal, cetal, éter de aciloxialquilo, imina, ortoéster, tio éster, tiol éster, carbonato e hidrazona, péptidos y oligonucleótidos.

Un "enlazador liberable" incluye, pero no se limita a, un enlazador fisiológicamente escindible y un enlazador enzimáticamente degradable. Por lo tanto, un "enlazador liberable" es un enlazador que puede sufrir hidrólisis espontánea o escisión mediante algún otro mecanismo (p. ej., catalizado por enzima, catalizado por ácido, catalizado por base, entre otros) en condiciones fisiológicas. Por ejemplo, un "enlazador liberable" puede implicar una reacción de eliminación que tiene una abstracción de base de un protón (p. ej., un átomo de hidrógeno ionizable, Ha), como la fuerza impulsora. A efectos de la presente memoria, un "enlazador liberable" es sinónimo de un "enlazador degradable". Un "enlace enzimáticamente degradable" incluye un enlace, p. ej., una secuencia de aminoácidos que se somete a degradación mediante una o más enzimas, p. ej., peptidasas o proteasas. En realizaciones específicas, un enlazador liberable tiene una semivida a pH 7,4, 25 °C, p. ej., un pH fisiológico, temperatura corporal humana (p. ej., in vivo), de aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 hora, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas o aproximadamente 96 horas o menos.

El término "secuencia de referencia" se refiere generalmente a una secuencia codificante de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos, con la que se compara otra secuencia. Todas las secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas descritas en la presente memoria se incluyen como secuencias de referencia, incluidas las descritas por nombre y las descritas en la Lista de secuencias.

Los términos "identidad de secuencia" o, por ejemplo, que comprenden una "secuencia 50 % idéntica a", según se usan en la presente memoria, hacen referencia a la medida en que dichas secuencias son idénticas en función de una ventana de comparación nucleótido por nucleótido o aminoácido por aminoácido. Por lo tanto, un "porcentaje de identidad de secuencia" se puede calcular al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación y determinar la cantidad de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (p. ej., A, T, C, G, I) o el residuo aminoacídico idéntico (p.ej., Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) aparece en ambas secuencias para proporcionar la cantidad de posiciones coincidentes, dividir la cantidad de posiciones coincidentes entre la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicar el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. Se incluyen nucleótidos y polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a cualquiera de las secuencias de referencia descritas en la presente memoria (ver, p. ej., la Lista de secuencias), típicamente donde la variante polipeptídica mantiene al menos una actividad biológica del polipéptido de referencia.

Los términos usados para describir relaciones secuenciales entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene al menos 12, pero frecuentemente 15 a 18 y a menudo al menos 25 unidades monoméricas, que incluyen nucleótidos y residuos aminoacídicos, de longitud. Dado que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solo una porción de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos típicamente se llevan a cabo al comparar secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud secuencial. Una "ventana de comparación" hace referencia a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, habitualmente, aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más habitualmente, aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el que una secuencia se compara con una secuencia de referencia con la misma cantidad de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de manera óptima. La ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, espacios) de aproximadamente 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede llevar a cabo mediante implementaciones informáticas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EE. UU.) o por la inspección y la mejor alineación (es decir, que da como resultado el porcentaje de homología más alto en la ventana de comparación) generadas mediante cualesquiera de los diversos métodos seleccionados. También se puede consultar la familia de programas BLAST como, por ejemplo, la descrita por Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389, 1997. Se puede encontrar una descripción detallada del análisis de secuencias en la Unidad 19.3 de Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15.

Se entiende por "estadísticamente significativo" que es improbable que el resultado se produjera por casualidad. La significación estadística se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica. Las mediciones de la significación usadas comúnmente incluyen el valor de la p, que es la frecuencia o probabilidad de que se produjera el evento observado, si la hipótesis nula fuera verdadera. Si el valor de la p obtenido es menor que el nivel de significación, entonces la hipótesis nula se rechaza. En casos simples, el nivel de significación se define por un valor de la p de 0,05 o menor.

El término "solubilidad" se refiere a la propiedad de una proteína de disolverse en un disolvente líquido y formar una disolución homogénea. La solubilidad típicamente se expresa como una concentración, ya sea en masa de soluto por unidad volumen de disolvente (g de soluto por kg de disolvente, g por dL (100 mL), mg/ml, etc.), molaridad, molalidad, fracción molar u otras descripciones de la concentración similares. La cantidad de soluto en equilibrio máximo que se puede disolver por la cantidad de disolvente es la solubilidad de dicho soluto en dicho disolvente en las condiciones especificadas, incluidas temperatura, presión, pH y la naturaleza del disolvente. En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide a pH fisiológico, u otros pH, por ejemplo, a pH 5,0, pH 6,0, pH 7,0 o pH 7,4. En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide en agua o un tampón fisiológico tal como PBS o NaCl (con o sin NaP). En realizaciones específicas, la solubilidad se mide a pH relativamente más bajo (p. ej., pH 6,0) y sal relativamente más alta (p. ej., 500mM NaCl y 10mM NaP). En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide en un fluido biológico (disolvente) tal como sangre o suero. En ciertas realizaciones, la temperatura puede ser aproximadamente temperatura ambiente (p. ej., aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25 °C) o aproximadamente temperatura corporal (~37 °C). En ciertas realizaciones, una proteína de fusión de polipéptido p97 tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 mg/ml a temperatura ambiente o a aproximadamente 37 °C.

Un "sujeto", según se usa en la presente memoria, incluye cualquier animal que exhibe un síntoma, o está en riesgo de exhibir un síntoma, que se puede tratar o diagnosticar con una proteína de fusión de p97 de la invención. Los sujetos adecuados (pacientes) incluyen animales de laboratorio (tales como ratón, rata, conejo o cobayo), animales de granja y animales domésticos o mascotas (tales como un gato o perro). Se incluyen primates no humanos y, preferiblemente, pacientes humanos.

"Sustancialmente" o "esencialmente" significa casi totalmente o completamente, por ejemplo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de alguna cantidad dada.

"Sustancialmente libre" se refiere a la ausencia casi completa o completa de una cantidad dada, por ejemplo, menos de aproximadamente 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o menos de alguna cantidad dada. Por ejemplo, ciertas composiciones pueden estar "sustancialmente libres" de proteínas celulares, membranas, ácidos nucleicos, endotoxinas u otros contaminantes.

"Tratamiento" o "tratar", según se usa en la presente memoria, incluye cualquier efecto deseable en los síntomas o la patología de una enfermedad o afección, y puede incluir incluso cambios o mejoras mínimos en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que se está tratando. "Tratamiento" o "tratar" no indica necesariamente la erradicación o cura completa de la enfermedad o afección, o síntomas asociados a estas. El sujeto que recibe este tratamiento es un cualquier sujeto que lo necesita. Los marcadores ilustrativos de mejora clínica serán evidentes para las personas con experiencia en la técnica.

El término "natural" se refiere a un gen o producto génico que tiene las características de dicho gen o producto génico cuando se asila de una fuente de origen natural. Un gen o producto génico natural (p. ej., un polipéptido) es el que se observa más frecuentemente en una población y, por lo tanto, se designa arbitrariamente como la forma "normal" o "natural" del gen.

Proteínas de fusión

Realizaciones de la presente invención se refieren generalmente a proteínas de fusión que comprenden una secuencia polipeptídica de p97 (melanotransferrina; MTf) humana que consiste en la secuencia de aminoácidos DSSHAFTLDELR y una secuencia polipeptídica de iduronato-2-sulfatasa (IDS o I2S), polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión, células hospedantes y métodos para producir proteínas de fusión, y composiciones y métodos de uso relacionados con estas. Se describen proteínas de fusión ilustrativas (p. ej., Tabla 1), secuencias polipeptídicas de p97 (p. ej., Tabla 2) y secuencias polipeptídicas de IDS (p. ej., Tabla 3) en la presente memoria. Los términos "p97" y "MTf" se usan de manera intercambiable en la presente memoria, así como los términos "IDS" e "I2S".

También se describen métodos y componentes ilustrativos para acoplar una secuencia polipeptídica de p97 a una secuencia de IDS. En ciertas realizaciones, la proteína de fusión de p97 comprende una o más secuencias de péptido señal (SP), etiquetas de purificación (TAG), sitios de escisión por proteasa (PS) y/o enlazadores peptídicos (L), incluida cualquier combinación de los anteriores, cuyos ejemplos se proporcionan en la presente memoria. Las variantes y fragmentos de cualesquiera de los anteriores también se describen en la presente memoria.

En ciertas realizaciones, la proteína de fusión de p97 comprende, consiste o consiste esencialmente en al menos una de las configuraciones ilustradas a continuación (extremo N > extremo C):

■ IDS-p97

■ p97-IDS

■ IDS-L-p97

■ p97-L-IDS

■ SP-IDS-p97

■ SP-p97-IDS

■ SP-IDS-L-p97

■ SP-P97-L-IDS

■ SP-PS-IDS-p97

■ SP-PS-P97-IDS

■ SP-PS-IDS-L-p97

■ SP-PS-p97-L-IDS

■ SP-TAG-PS-IDS-p97

■ SP-TAG-PS-p97-IDS

■ SP-TAG-PS-IDS-L-p97

■ SP-TAG-PS-p97-L-IDS

■ TAG-IDS-p97

■ TAG-p97-IDS

■ TAG-IDS-L-p97

■ TAG-p97-L-IDS

■ TAG-PS-IDS-p97

■ TAG-PS-p97-IDS

■ TAG-PS-IDS-L-p97

■ TAG-PS-p97-L-IDS

■ IDS SP-HIS TAG-TEV PS-IDS-L rígido-p97

■ IDS SP-HIS TAG-TEV PS-IDS-(EAAAK)³ -p97

■ p97 SP-HIS TAG-TEV PS-p97-L rígido-IDS

■ p97 SP-HIS TAG-TEV PS-p97-(EAAAK)³ -IDS

Las proteínas de fusión de estas y configuraciones relacionadas se pueden construir mediante el uso de cualesquiera de las secuencias de IDS, p97, L, SP, TAG o PS descritas en la presente memoria, incluidas variantes funcionales o activas y fragmentos de estas.

Los ejemplos específicos de proteínas de fusión de p97 se ilustran en la Tabla 1 a continuación.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de la Tabla 1, o una variante y/o fragmento de esta.

Secuencias de p97. Una secuencia polipeptídica de p97 usada en una composición y/o proteína de fusión descrita en la presente memoria comprende, consiste esencialmente, o consiste en una secuencia de referencia de p97 humana proporcionada en la Tabla 2 a continuación. También se incluyen variantes y fragmentos de esta. La secuencia polipeptídica de p97 usada en una composición y/o proteína de fusión de la invención consiste en la secuencia de p97 humana proporcionada como SEQ ID NO: 14 en la Tabla 2.

Una secuencia polipeptídica de p97 descrita en la presente memoria puede comprender una secuencia que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad o homología, a lo largo de su longitud, con respecto a una secuencia de p97 humana en la Tabla 2, o un fragmento de esta.

La secuencia polipeptídica de p97 de la invención consiste en la SEQ ID NO:14 (MTfpep).

Una secuencia polipeptídica de p97 descrita en la presente memoria puede comprender un fragmento de una secuencia de p97 humana en la Tabla 2. Un fragmento polipeptídico de p97 descrito en la presente memoria puede tener aproximadamente, al menos aproximadamente, o hasta aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 700, 710, 720, 730 o más aminoácidos de longitud, incluidos todos los números enteros e intervalos entremedio, y que puede comprender toda o una porción de la secuencia de una secuencia de referencia de p97.

Un fragmento polipeptídico de p97 descrito en la presente memoria puede tener aproximadamente 5-700, 5-600, 5­ 500, 5-400, 5-300, 5-200, 5-100, 5-50, 5-40, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-700, 10-600, 10-500, 10-400, 10-300, 10-200, 10-100, 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 20-700, 20-600, 20-500, 20-400, 20-300, 20-200, 20-100, 20-50, 20-40, 20-30, 20-25, 30-700, 30-600, 30-500, 30-400, 30-300, 30-200, 30-100, 30-50, 30-40, 40-700, 40-600, 40-500, 40-400, 40-300, 40-200, 40-100, 40-50, 50-700, 50-600, 50-500, 50-400, 50-300, 50-200, 50-100, 60-700, 60-600, 60-500, 60-400, 60-300, 60-200, 60-100, 60-70, 70-700, 70-600, 70-500, 70-400, 70-300, 70-200, 70-100, 70-80, 80-700, 80-600, 80-500, 80-400, 80-300, 80-200, 80-100, 80-90, 90-700, 90-600, 90-500, 90-400, 90-300, 90­ 200, 90-100, 100-700, 100-600, 100-500, 100-400, 100-300, 100-250, 100-200, 100-150, 200-700, 200-600, 200­ 500, 200-400, 200-300 o 200-250 aminoácidos de longitud, y comprende toda o una porción de una secuencia de referencia de p97.

Las secuencias polipeptídicas de p97 descritas en la presente memoria incluyen secuencias de aminoácidos de p97, subsecuencias y/o variantes de p97 que son eficaces para transportar un agente de interés a través de la barrera hematoencefálica y hacia el sistema nervioso central (CNS). La variante o fragmento descrito en la presente memoria puede comprender el lóbulo N de p97 humana (residuos 20-361 de la SEQ ID NO:1). En aspectos específicos, la variante o fragmento descrito en la presente memoria puede comprender un sitio de unión a Fe3+ intacto y funcional.

Una secuencia polipeptídica de p97 descrita en la presente memoria puede ser una forma soluble de un polipéptido de p97 (ver Yang et al., Prot Exp Purif. 34:28-48, 2004), o un fragmento o variante de esta. En algunos aspectos, el polipéptido de p97 soluble descrito en la presente memoria puede tener una eliminación de todo o de una porción del dominio hidrófobo (residuos 710-738 de la SEQ ID NO:1), sola o en combinación con una eliminación de todo o de una porción del péptido señal (residuos 1-19 de la SEQ ID NO:1). En aspectos específicos, el polipéptido de p97 soluble descrito en la presente memoria puede comprender o consistir en la SEQ ID NO:2 (-residuos 20-710 o 20­ 711 de la SEQ ID NO:1), incluidas variantes y fragmentos de esta.

Para aquellos que emplean liposomas, la secuencia polipeptídica de p97 descrita en la presente memoria puede ser una forma soluble lipídica de un polipéptido de p97. Por ejemplo, algunos de estos y polipéptidos relacionados pueden incluir un polipéptido de p97 que comprende todo o una porción del dominio hidrófobo, opcionalmente con o sin el péptido señal.

El fragmento o variante de p97 descrito en la presente memoria puede ser capaz de unirse específicamente a un receptor de p97, un receptor de LRP1 y/o un receptor de LRP1B.

Las variantes y fragmentos de polipéptidos de p97 de referencia descritos en la presente memoria y otros polipéptidos de referencia se describen en mayor detalle más adelante.

Secuencias de iduronato-2-sulfatasa. En ciertas realizaciones, una secuencia polipeptídica de IDS (o I2S) usada en una proteína de fusión de la invención comprende, consiste esencialmente, o consiste en una o más secuencias de IDS humana ilustradas en la Tabla 3 a continuación.

También se incluyen variantes y fragmentos biológicamente activos de las secuencias de IDS en la Tabla 3 y la Lista de secuencias. En ciertos aspectos, un polipéptido de IDS biológicamente activo o variantes/fragmento de este hidrolizan los grupos 2-sulfato de las unidades L-iduronato 2-sulfato de sulfato de dermatán, sulfato de heparán y/o heparina, por ejemplo, a aproximadamente 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más de la actividad de la IDS humana natural (p. ej., SEQ ID NO:31).

Enlazadores. Según se indicó anteriormente, ciertas proteínas de fusión pueden emplear uno o más grupos enlazadores, incluidos enlazadores peptídicos. Dichos enlazadores pueden ser enlazadores rígidos, enlazadores flexibles, enlazadores estables o enlazadores liberables, tales como enlazadores enzimáticamente escindibles. Ver, p. ej., Chen et al., Adv. Drug. Deliv. Ref., 65:1357-69, 2012.

Por ejemplo, para conjugados polipéptido-polipéptido, los enlazadores peptídicos pueden separar los componentes una distancia suficiente para garantizar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundarias y terciarias. Dicha secuencia de enlazador peptídico se puede incorporar en la proteína de fusión mediante el uso de técnicas estándares descritas en la presente memoria y conocidas en la técnica. Las secuencias de enlazador peptídico adecuadas se pueden elegir en función de los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida rígida o flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podrían interactuar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptidos; y (3) la carencia de residuos hidrófobos o cargados que podrían hacer reacción con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de manera útil como enlazadores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; la patente estadounidense núm. 4935233 y la patente estadounidense núm. 4751 180.

En ciertas realizaciones ilustrativas, un enlazador peptídico tiene entre aproximadamente 1 y 5 aminoácidos, entre 5 y 10 aminoácidos, entre 5 y 25 aminoácidos, entre 5 y 50 aminoácidos, entre 10 y 25 aminoácidos, entre 10 y 50 aminoácidos, entre 10 y 100 aminoácidos, o cualquier intervalo intermedio de aminoácidos. En otras realizaciones ilustrativas, un enlazador peptídico comprende aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos de longitud. Los enlazadores particulares puede tener una longitud de aminoácidos general de aproximadamente 1-200 aminoácidos, 1-150 aminoácidos, 1-100 aminoácidos, 1-90 aminoácidos, 1-80 aminoácidos, 1-70 aminoácidos, 1-60 aminoácidos, 1-50 aminoácidos, 1-40 aminoácidos, 1-30 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 1­ 10 aminoácidos, 1-5 aminoácidos, 1-4 aminoácidos, 1-3 aminoácidos o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos.

Un enlazador peptídico puede emplear uno cualquiera o más aminoácidos de origen natural, aminoácido(s) de origen no natural, análogos de aminoácidos y/o miméticos de aminoácido según se describe en otra parte en la presente memoria y se conoce en la técnica. Ciertas secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de manera útil como enlazadores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., PNAS USA.

83:8258-8262, 1986; la patente estadounidense núm. 4935233 y la patente estadounidense núm. 4751 180. Las secuencias de enlazador peptídico particulares contienen residuos Gly, Ser y/o Asn. Se pueden emplear otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala en la secuencia de enlazador peptídico, si se desea.

En realizaciones específicas, el enlazador es un enlazador rígido. Los ejemplos de enlazadores rígidos incluyen, sin limitación, (EAAAK)^x (SEQ ID NO:36) y A(EAAAK)^xALEA(EAAAK)^xA (SEQ ID NO:41), y (Ala-Pro)^x donde ^x es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más. Los ejemplos específicos de enlazadores rígidos incluyen EAAAK (SEQ ID NO:36), (EAAAK)² (SEQ ID NO:37), (EAAAK)3 (SEQ ID NO:38), A(EAAAK)⁴ALEA(EAAAK)⁴A (SEQ ID NO:42), PAPAP (SEQ ID NO:43) y AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO:44).

En realizaciones específicas, el enlazador comprende, consiste o consiste esencialmente en (EAAAK)³ o EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID NO:38).

En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador flexible. En realizaciones específicas, el enlazador flexible es GGGGS (SEQ ID NO:45), (GGGGS)^SEQ ID NO:46), (GGGGS)3 (SEQ ID NO:47) o Gly^2-10 (SEQ ID NOS:48-54). A continuación, se proporcionan ejemplos adicionales de enlazadores flexibles.

Ciertos enlazadores ilustrativos incluyen enlazadores que contienen Gly, Ser y/o Asn, como los siguientes: enlazadores [G]^x , [S]^x , [N]^x , [GS]^x , [GGS]^x , [GSS]^x , [GSGS]^x (SEQ ID NO:55), [GGSG]^x (SEQ ID NO:56), [GGGS]^x (SEQ ID NO: 57), [GGGGS]^x (SEQ ID NO: 45), [GN]^x , [GGN]^x , [GNN]^x , [GNGN]^x (SEQ ID NO: 58), [GGNG]^x (SEQ ID NO: 59), [GGGN]^x (SEQ ID NO: 60), [GGGGN]^x (SEQ ID NO: 61), donde ^x es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más. Otras combinaciones de estos y aminoácidos relacionados serán evidentes para las personas con experiencia en la técnica. En realizaciones específicas, el enlazador comprende o consiste en una secuencia [GGGGS]³ (SEQ ID NO: 47) o GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 47).

En realizaciones específicas, la secuencia de enlazador comprende una secuencia de enlazador Gly3, que incluye tres residuos glicina. En realizaciones específicas, los enlazadores flexibles se pueden diseñar racionalmente mediante el uso de un programa informático capaz de modelar sitios de unión a ADN y los propios péptidos (Desjarlais & Berg, PNAS. 90:2256-2260, 1993; y PNAS. 91:11099-11103, 1994) o mediante métodos de visualización en fagos.

Los enlazadores peptídicos pueden ser fisiológicamente estables o pueden incluir un enlazador liberable tal como un enlazador fisiológicamente degradable o enzimáticamente degradable (p. ej., enlazadores proteolíticamente o enzimáticamente escindibles). En ciertas realizaciones, uno o más enlazadores liberables pueden dar como resultado una semivida más corta y aclaramiento más rápido de la proteína de fusión. Estas y realizaciones relacionadas se pueden usar, por ejemplo, para potenciar la solubilidad y tiempo de circulación en sangre de las proteínas de fusión de p97 en el torrente circulatorio, mientras también se suministra un agente en el torrente circulatorio (o a través de la BBB) que, después de la degradación del enlazador, está sustancialmente libre de la secuencia de p97. Estos aspectos son especialmente útiles en aquellos casos donde polipéptidos u otros agentes, cuando están fusionados de manera permanente a una secuencia de p97, demuestran actividad reducida. Mediante el uso de los enlazadores, según se proporcionan en la presente memoria, dichos polipéptidos pueden mantener su actividad terapéutica cuando están en forma conjugada o fusionada. De estas y otras maneras se pueden adaptar de manera más eficaz las propiedades de las proteínas de fusión de p97 para equilibrar la bioactividad y la semivida en circulación de los polipéptidos con el tiempo.

Los ejemplos específicos de enlazadores enzimáticamente escindibles incluyen, sin limitación, un enlazador escindible por Factor XIa/FVIIa (VSQTSKLTR^AETVFPDV) (SEQ ID NO:62), un enlazador escindible por metaloproteasa-1 de matriz (PLG^LWA) (SEQ ID NO:63), un enlazador escindible por proteasa de VIH (RVL^^a E^a ) (SEQ ID NO:64), un enlazador escindible por proteasa NS3 de virus de la hepatitis C (EDVVCC^Sm Sy ) (SEQ ID NO:65), un enlazador escindible por Factor Xa (GGIEGR/GS) (SEQ ID NO:66), un enlazador escindible por Furina (TRHRQPR^GWE o AGNRVRR^SVG o RRRRRRR^R^R) (SEQ ID NOS:67-69) y un enlazador escindible por Catepsina B (GFLG) (SEQ ID NO:70).

Los enlaces enzimáticamente degradables adecuados para su uso en realizaciones específicas incluyen, pero no se limitan a: una secuencia de aminoácidos escindida por una serina proteasa tal como trombina, quimotripsina, tripsina, elastasa, calicreína o subtilisina. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoácidos escindibles por trombina incluyen, pero no se limitan a: -Gly-Arg-Gly-Asp-(SEQ ID NO: 71), -Gly-Gly-Arg-, -Gly- Arg-Gly-Asp-Asn-Pro-(SEQ ID NO:72), -Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-(SEQ ID NO: 73), -Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-(SEQ ID NO: 74), -Gly-Pro- Arg-, -Val-Pro-Arg- y -Phe- Val -Arg-. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoácidos escindibles por elastasa incluyen, pero no se limitan a: -Ala-Ala-Ala-, -Ala-Ala-Pro-Val-(SEQ ID NO:75), -Ala-Ala-Pro-Leu-(SEQ ID NO: 76), -Ala-Ala-Pro-Phe-(SEQ ID NO: 77), -Ala-Ala-Pro-Ala-(SEQ ID NO: 78) y -Ala-Tyr-Leu-Val-(SEQ ID NO: 79). Los enlaces enzimáticamente degradables adecuados para su uso en realizaciones específicas también incluyen secuencias de aminoácidos que se pueden escindir mediante una metaloproteinasa de matriz tal como colagenasa, estromelisina y gelatinasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoácidos escindibles por metaloproteinasa de matriz incluyen, pero no se limitan a: -Gly-Pro-Y-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO: 80), -Gly-Pro-, Leu-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO: 81), -Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:82) y -Ala-Pro-Gly-Leu-Z-(SEQ ID NO: 83), donde Y Z son aminoácidos. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoácidos escindibles por colagenasa incluyen, pero no se limitan a: -Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-Z-(SEQ ID NO: 84), -Pro- Leu-Gly-Leu-Leu-Gly-Z-(SEQ ID NO: 85), -Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Trp-(SEQ ID NO: 86), -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-(SEQ ID NO: 87), -Pro-Leu-Gly-Leu-Tyr-Ala-(SEQ ID NO:88), -Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-(SEQ ID nO: 89) y -Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg-(SEQ ID NO: 90), donde Z es un aminoácido. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de aminoácidos escindible por estromelisina es -Pro-Tyr-Ala-Tyr-Tyr-Met-Arg-(SEQ ID NO: 91); y un ejemplo de una secuencia de aminoácidos escindible por gelatinasa es -Pro-Leu-Gly-Met-Tyr- Ser-Arg-(SEQ ID NO: 92).

Los enlaces enzimáticamente degradables adecuados para su uso en realizaciones específicas también incluyen secuencias de aminoácidos que se pueden escindir mediante una enzima convertidora de angiotensina tales como, por ejemplo, -Asp-Lys-Pro-, -Gly-Asp-Lys-Pro-(SEQ ID NO: 93) y -Gly-Ser-Asp-Lys-Pro-(SEQ ID NO: 94).

Los enlaces enzimáticamente degradables adecuados para su uso en realizaciones específicas también incluyen secuencias de aminoácidos que se pueden degradar mediante catepsina B, tales como, por ejemplo, -Val-Cit-, -Ala-Leu-Ala-Leu-(SEQ ID NO:95), -Gly-Phe-Leu-Gly-(SEQ ID NO:96) y -Phe-Lys-.

En ciertas realizaciones, sin embargo, uno cualquiera o más de los enlazadores no peptídicos o peptídicos son opcionales. Por ejemplo, las secuencias de enlazador pueden no ser necesarias en una proteína de fusión donde el primer y segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C no esenciales que se pueden usar para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica.

Secuencias de péptido señal. En ciertas realizaciones, una proteína de fusión de p97 comprende una o más secuencias de péptido señal (SP). En realizaciones específicas, la secuencia de péptido señal es una secuencia señal de extremo N, es decir, la porción más cercana al extremo N de la proteína de fusión.

Los ejemplos específicos de secuencias señal se proporcionan en la Tabla 4 a continuación. Ver también Kober et al., Biotechnology and Bioengineering. 110:1164-73, 2013.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, el péptido señal comprende, consiste o consiste esencialmente al menos una secuencia de la Tabla 4. En algunas realizaciones, el péptido señal comprende la SEQ ID NO:149.

En realizaciones específicas, la secuencia de péptido señal corresponde a la proteína más cercana al extremo N (p97 o IDS) de la proteína de fusión. Es decir, en algunas realizaciones, la secuencia de péptido señal del extremo N es la secuencia de péptido señal de P97 humana (SEQ ID NO:39) y la proteína de fusión de p97 comprende la estructura general: p97 SP-p97-IDS. En otras realizaciones, la secuencia de péptido señal del extremo N es la secuencia de péptido señal de IDS humana (SEQ ID NO:40) y la proteína de fusión de p97 comprende la estructura general: IDS SP-IDS-p97. Opcionalmente, la proteína de fusión puede comprender, además, una o más etiquetas de purificación y/o sitios de proteasa, por ejemplo, entre la secuencia señal del extremo N y las porciones p97/IDS de la proteína de fusión, según se describen en otra parte en la presente memoria. Aquí, el sitio de proteasa se coloca típicamente en el extremo C de la secuencia señal o etiqueta de purificación para que el tratamiento con la proteasa correspondiente elimine la secuencia señal, la etiqueta de purificación y la mayor parte o todo el sitio de proteasa del extremo N de la proteína de fusión.

Etiquetas de purificación. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una o más etiquetas de purificación o afinidad (TAG o TAGs). Los ejemplos no limitantes de etiquetas de purificación incluyen etiquetas de poli-histidina (p. ej., etiquetas 6xHis), avidina, etiquetas FLAG, etiquetas de glutatión S-transferasa (GST), etiquetas de proteína de unión a maltosa, proteína de unión a quitina (CBP, por sus siglas en inglés) y otras. También se incluyen etiquetas epitópicas, que se unen a anticuerpos con alta afinidad, cuyos ejemplos incluyen etiquetas V5, etiquetas Myc y etiquetas HA. En ejemplos específicos, la etiqueta de purificación es una etiqueta de polihistidina (H^5-10), por ejemplo, H⁵, H^a , H⁷, H⁸ , H⁹ o H¹⁰ (SEQ ID NOS:113-118).

Los ejemplos no limitantes de etiquetas de purificación se proporcionan en la Tabla 5 a continuación.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la etiqueta de purificación comprende, consiste o consiste esencialmente en al menos una secuencia de la Tabla 5. En realizaciones específicas, la etiqueta comprende una etiqueta FLAG y una HIS, por ejemplo, etiqueta de 10X-HIS.

Sitios de proteasa (PS). En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende uno o más sitios de proteasa. Opcionalmente, el uno o más sitios de proteasa se posicionan en el extremo C de la secuencia de etiqueta de purificación y/o péptido señal (si una cualquiera o ambas están presentes) para que el tratamiento con la proteasa correspondiente elimine la secuencia señal, la etiqueta de purificación y/o la mayor parte o todo el sitio de proteasa del extremo N de la proteína de fusión.

En realizaciones específicas, por ejemplo, donde la proteína de fusión comprende un enlazador enzimáticamente escindible, el sitio de proteasa típicamente difiere del enlazador enzimáticamente escindible, para que el tratamiento con la proteasa elimine cualesquiera secuencias terminales (p. ej., secuencias de péptido señal, etiqueta de purificación) sin escindir el enlazador peptídico entre las secuencias de p97 e IDS.

Los ejemplos no limitantes de sitios de proteasa se proporcionan en la Tabla 6 a continuación.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el sitio de proteasa comprende, consiste o consiste esencialmente en al menos una secuencia de la Tabla 6. En realizaciones específicas, el sitio de proteasa comprende el sitio de proteasa de TEV (SEQ ID NO:135).

Secuencias variantes. Ciertas realizaciones incluyen variantes de las secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas de referencia descritas en la presente memoria, ya estén descritas por nombre o por referencia a un identificador de secuencia, incluidas secuencias de p97, secuencias de IDS, secuencias de enlazador, secuencias de péptido señal, etiquetas de purificación y sitios de proteasa (ver, p. ej., las Tablas 1-6 y la Lista de secuencias). Las secuencias naturales o más prevalentes de estos polipéptidos se conocen en la técnica y se pueden usar como comparación para las variantes y fragmentos descritos en la presente memoria.

Una secuencia "variante", según se usa el término en la presente memoria, se refiere a una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que difiere de una secuencia de referencia descrita en la presente memoria en una o más sustituciones, eliminaciones (p. ej., truncamientos), adiciones e/o inserciones. Ciertas variantes, por lo tanto, incluyen fragmentos de una secuencia de referencia descrita en la presente memoria. Los polipéptidos variantes son biológicamente activos, es decir, continúan teniendo la actividad enzimática o de unión de un polipéptido de referencia. Dichas variantes pueden originarse a partir de, por ejemplo, polimorfismo genético y/o a partir de manipulación humana.

En muchos casos, una variante biológicamente activa contendrá una o más sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es una en que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente incambiadas. Según se describió anteriormente, se pueden hacer modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención y todavía obtener una molécula funcional que codifica un polipéptido variante o derivado con características deseables. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear una variante o porción equivalente, o incluso mejorada, de un polipéptido de la invención, un experto en la técnica típicamente cambiará uno o más de los codones de la secuencia de ADN codificante según la Tabla A a continuación.

Por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas de sustrato. Dado que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína son lo que definen la actividad biológica funcional de dicha proteína, ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos se pueden hacer en una secuencia proteica, y, evidentemente, su secuencia codificante de ADN y obtener, no obstante, una proteína con propiedades similares. Por lo tanto, se contempla que se pueden hacer diversos cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones descritas o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos sin pérdida apreciable de su utilidad.

Al hacer dichos cambios, se puede tomar en cuenta el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir la función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte & Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultate que, a su vez, define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. Se ha asignado a cada aminoácido un índice hidropático en función de sus características de hidrofobicidad y carga (Kyte & Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5). Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tiene un índice o puntuación hidropático similar y todavía dar como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, todavía obtener una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al hacer dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2, aquellos dentro de ±1 se prefieren particularmente y aquellos dentro de ±0,5 se prefieren incluso más particularmente.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer de manera eficaz en función de la hidrofilicidad. La patente estadounidense 4554101 indica que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, según se rige por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Según se detalla en la patente estadounidense 4554101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a residuos aminoacídicos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar y todavía obtener una proteína biológicamente equivalente y, en particular, inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, aquellos dentro de ±1 se prefieren particularmente y aquellos dentro de ±0,5 se prefieren incluso más particularmente.

Según se señaló anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente, por lo tanto, en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ilustrativas que toman varias de las características anteriores en consideración son conocidas para los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer, adicionalmente, en función de la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de extremo polar no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservadores incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

Una variante puede también, o alternativamente, contener cambios no conservadores. En una realización preferida, los polipéptidos variantes difieren de una secuencia natural o de referencia por la sustitución, eliminación o adición de menos de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 aminoácidos, o incluso 1 aminoácido. Las variantes también (o alternativamente) se pueden modificar, por ejemplo, por la eliminación o adición de aminoácidos que influyen mínimamente en la inmunogenicidad, estructura secundaria, actividad enzimática y/o naturaleza hidropática del polipéptido.

En ciertas realizaciones, una secuencia polipeptídica tiene aproximadamente, al menos aproximadamente o hasta aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 o más aminoácidos contiguos de longitud, incluidos todos los números enteros entremedio, y que puede comprender toda o una porción de una secuencia de referencia (ver, p. ej., Lista de secuencias).

En otras realizaciones específicas, una secuencia polipeptídica consiste en aproximadamente o no más de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 o más aminoácidos contiguos, incluidos todos los números enteros entremedio, y que puede comprender toda o una porción de una secuencia de referencia (ver, p. ej., Lista de secuencias).

En todavía otras realizaciones específicas, una secuencia polipeptídica tiene aproximadamente 10-1000, 10-900, 10­ 800, 10-700, 10-600, 10-500, 10-400, 10-300, 10-200, 10-100, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 20-1000, 20-900, 20-800, 20-700, 20-600, 20-500, 20-400, 20-300, 20-200, 20-100, 20-50, 20-40, 20-30, 50-1000, 50-900, 50-800, 50-700, 50­ 600, 50-500, 50-400, 50-300, 50-200, 50-100, 100-1000, 100-900, 100-800, 100-700, 100-600, 100-500, 100-400, 100-300, 100-200, 200-1000, 200-900, 200-800, 200-700, 200-600, 200-500, 200-400 o 200-300 aminoácidos contiguos, incluidos todos los intervalos entremedio, y comprende toda o una porción de una secuencia de referencia. En ciertas realizaciones, la región del extremo C o el extremo N de cualquier polipéptido de referencia se puede truncar en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 o 800 o más aminoácidos, o en aproximadamente 10-50, 20-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800 o más aminoácidos, incluidos todos los números enteros e intervalos entremedio (p. ej., 101, 102, 103, 104, 105), siempre que el polipéptido truncado conserve las propiedades de unión y/o la actividad del polipéptido de referencia. Típicamente, el fragmento biológicamente activo tiene no menos de aproximadamente 1 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 25 %, o aproximadamente 50 % de una actividad del polipéptido de referencia biológicamente activo del que se deriva.

En general, las variantes exhibirán al menos aproximadamente 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 % 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de similitud o identidad de secuencia u homología de secuencia con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia. Asimismo, se contemplan secuencias que difieren de las secuencias naturales u originales por la adición (p. ej., adición en el extremo C, adición en el extremo N, ambas), eliminación, truncamiento, inserción o sustitución (p. ej., sustitución conservadora) de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 aminoácidos (incluidos todos los números enteros e intervalos entremedio), pero que conservan las propiedades o actividades de una secuencia polipeptídica original o de referencia.

En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes difieren con respecto a la secuencia de referencia en al menos uno, pero menos de 50, 40, 30, 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3 o 2 residuos aminoacídicos. En otras realizaciones, los polipéptidos variantes difieren con respecto a la secuencia de referencia en al menos 1 %, pero menos de 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de los residuos. (Si esta comparación requiere alineación, las secuencias se deben alinear para la máxima similitud. Las secuencias "en bucle" a partir de eliminaciones o inserciones, o emparejamientos incorrectos se consideran diferencias).

Los cálculos de similitud de secuencia o identidad de secuencia entre secuencias (los términos se usan de manera intercambiable en la presente memoria) se llevan a cabo de la siguiente manera. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para una comparación óptima (p. ej., se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para la alineación óptima y se pueden ignorar las secuencias no homólogas a los fines de la comparación). En ciertas realizaciones, la longitud de una secuencia de referencia alineada para comparación es de al menos 30 %, preferiblemente, al menos 40 %, más preferiblemente, al menos 50 %, 60 %, e incluso más preferiblemente, al menos 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los residuos aminoacídicos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo aminoacídico o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en dicha posición.

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta la cantidad de espacios y la longitud de cada espacio, que se deben introducir para la alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación el porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr mediante el uso de un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina mediante el uso del algoritmo de Needleman and Wunsch, (J. %mol. Biol.

48: 444-453, 1970) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete informático GCG, mediante el uso de una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y un valor de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un valor de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En todavía otra realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina mediante el uso del programa GAP en el paquete informático GCG, mediante el uso de una matriz NWSgapdna.CMP y un valor de espacio de 40, 50, 60, 70 u 80 y un valor de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto de parámetros particularmente preferido (y el que se debe usar a menos que se especifique de cualquier otra manera) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por espacio de 12, una penalización extendida de espacio de 4 y una penalización de espacio de desplazamiento de marco de 5.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se puede determinar mediante el uso del algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Cabios. 4:11-17, 1989) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), mediante el uso de una tabla de valor de residuo PAM120, una penalización por longitud de espacio de 12 y una penalización por espacio de 4.

Las secuencias de ácido nucleico y proteicas descritas en la presente memoria se pueden usar como una "secuencia de consulta" para llevar a cabo una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden llevar a cabo mediante el uso de los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) deAltschul, et al., (1990, J. Mol. Biol, 215: 403-10). Las búsquedas de nucleótidos por BLAST se pueden llevar a cabo con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias nucleotídicas homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteína por BLAST se pueden llevar a cabo con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas proteicas de la invención. Para obtener alineaciones con espacios para comparación, se puede usar Gapped BLAST según se describe en Altschul et al., (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Cuando se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (p. ej., XBLAST y NBLAST).

En una realización, según se indicó anteriormente, los polinucleótidos y/o polipéptidos se pueden evaluar mediante el uso de la herramienta de alineación BLAST. Una alineación local consiste simplemente en un par de segmentos de secuencia, uno de cada una de las secuencias que se van a comparar. Una modificación de los algoritmos de Smith-Waterman o Sellers encontrará todos los pares de segmentos cuyas puntuaciones no se pueden mejorar por medio de extensión o recorte, llamados pares de segmentos con alta puntuación (HSP, por sus siglas en inglés). Los resultados de las alineaciones por BLAST incluyen mediciones estadísticas para indicar la probabilidad de que la puntuación de BLAST se pueda esperar solo por casualidad.

La puntuación bruta, S, se calcula a partir de la cantidad de espacios y sustituciones asociados a cada secuencia alineada en donde las puntuaciones de similitud más alta indican una alineación más significativa. Las puntuaciones de sustitución se proporcionan mediante una tabla de búsqueda (ver PAM, BLOSUM).

Las puntuaciones de espacio se calculan típicamente como la suma G, la penalización de apertura de espacio y L, la penalización de extensión de espacio. Para un espacio de longitud n, el costo del espacio sería G+Ln. La elección de los costos de espacio, G y L es empírica, pero es habitual elegir un valor alto para G (10-15), p. ej., 11, y un valor bajo para L (1-2) p. ej., 1.

La puntuación de trozo, S', se deriva de la puntuación de alineación bruta S en la que se han tomado en cuenta las propiedades estadísticas del sistema de puntuación usado. Las puntuaciones de trozo se normalizan con respecto al sistema de puntuación, por lo tanto, se pueden usar para comparar puntuaciones de alineación de diferentes búsquedas. Los términos "puntuación de trozo" y "puntuación de similitud" se usan de manera intercambiable. La puntuación de trozo proporciona una indicación de cuán buena es la alineación; cuanto mayor es la puntuación, mejor es la alineación.

El valor E, o valor esperado, describe la probabilidad de que una secuencia con una puntuación similar aparezca en la base de datos por casualidad. Es una predicción de la cantidad de diferentes alineaciones con puntuaciones equivalentes a o mejores que S que se espera que aparezcan en una búsqueda de base de datos por casualidad.

Cuanto menor es el valor E, más significativa es la alineación. Por ejemplo, una alineación que tiene un valor E de e_

117 significa que es muy improbable que una secuencia con una puntuación similar aparezca simplemente por casualidad. Además, la puntuación esperada por alinear un par aleatorio de aminoácidos debe ser negativa, de lo contrario las alineaciones largas tenderían a tener una puntuación alta independientemente de si los segmentos alineados estuviesen relacionados. Además, el algoritmo BLAST usa una matriz de sustitución, nucleótido o aminoácido adecuada y para alineaciones con espacios usa penalizaciones de creación y extensión de espacios.

Por ejemplo, la alineación y la comparación de secuencias polipeptídicas por BLAST típicamente se llevan a cabo mediante el uso de la matriz BLOSUM62, una penalización de existencia de espacio de 11 y una penalización de extensión de espacio de 1.

En una realización, las puntuaciones de similitud de secuencia se informan a partir de análisis por BLAST llevados a cabo mediante el uso de la matriz BLOSUM62, una penalización de existencia de espacio de 11 y una penalización de extensión de espacio de 1.

En una realización específica, las puntuaciones de identidad/similitud de secuencia proporcionadas en la presente memoria se refieren al valor obtenido mediante el uso de GAP Versión 10 (GCG, Accelrys, San Diego, Calif.) con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia nucleotídica mediante el uso de un valor de GAP de 50 y un valor de Longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos mediante el uso de un valor de GAP de 8 y un valor de Longitud de 2, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff, PNAS USA. 89:10915-10919, 1992). GAP usa el algoritmo de Needleman and Wunsch (J Mol Biol. 48:443-453, 1970) para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de espacios.

En una realización específica, el polipéptido variante comprende una secuencia de aminoácidos que se puede alinear de manera óptima con una secuencia polipeptídica de referencia (ver, p. ej., la Lista de secuencias) para generar puntuaciones de trozo o puntuaciones de similitud de secuencia por BLAST de al menos aproximadamente

50, 60, 70, 80, 90, 100, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270,

280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 510, 520, 530, 540,

550, 560,

570, 580, 590, 600,

610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 970, 980, 990, 1000 o más, incluidos todos los números enteros e intervalos entremedio, en donde la alineación BLAST usó la matriz BLOSUM62, una penalización por existencia de espacio de 11 y una penalización de extensión de espacio de 1.

Según se indicó anteriormente, un polipéptido de referencia se puede alterar de varias maneras que incluyen sustituciones, eliminaciones, truncamientos, adiciones e inserciones de aminoácidos. Los métodos para dichas manipulaciones se conocen generalmente en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia se pueden preparar mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de la secuencia nucleotídica se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel (PNAS USA. 82: 488­

492, 1985); Kunkel et al., (Methods in Enzymol. 154: 367-382, 1987), la patente estadounidense núm.

4 873192, Watson, J. D. et al., ("Molecular Biology of the Gene," cuarta edición, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987) y las referencias mencionadas en estas. Se puede encontrar orientación para sustituciones de aminoácidos adecuadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés en el modelo de Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).

Los métodos para barrer productos génicos en bibliotecas combinatorias elaboradas mediante dichas modificaciones y para barrer bibliotecas de ADNc para encontrar productos génicos que tienen una propiedad seleccionada se conocen en la técnica. Dichos métodos son adaptables para el barrido rápido de las bibliotecas génicas generadas mediante mutagénesis combinatoria de polipéptidos de referencia. Como ejemplo, la mutagénesis de ensamble recursivo (REM, por sus siglas en inglés), una técnica que potencia la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinación con los ensayos de barrido para identificar variantes de polipéptidos (Arkin and Yourvan, PNAS USA 89: 7811-7815, 1992; Delgrave et al., Protein Engineering. 6: 327-331, 1993).

Polinucleótidos, células Hospedantes y métodos de producción. Ciertas realizaciones se refieren a polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión descritas en la presente memoria, y vectores que comprenden dichos polinucleótidos, por ejemplo, donde los polinucleótidos están funcionalmente enlazados a uno o más elementos reguladores. También se incluyen células hospedantes recombinantes que comprenden dichos polinucleótidos, vectores, proteínas de fusión y métodos de producción recombinante de los anteriores.

Las proteínas de fusión se pueden preparar mediante el uso de técnicas estándar. Preferiblemente, sin embargo, una proteína de fusión se expresa como una proteína recombinante en un sistema de expresión, según se describe en la presente memoria y se conoce en la técnica. Las proteínas de fusión pueden contener una o múltiples copias de una secuencia de p97 y una o múltiples copias de una secuencia de IDS, presentes en cualquier disposición deseada.

Los polinucleótidos y polinucleótidos de fusión pueden contener una o múltiples copias de un ácido nucleico que codifica una secuencia polipeptídica de p97 y/o una o múltiples copias de un ácido nucleico que codifica una secuencia de IDS.

Para las proteínas de fusión, los componentes de secuencias de ADN que codifican la secuencia polipeptídica de p97, la secuencia de IDS de interés y, opcionalmente, un enlazador peptídico se puede ensamblar por separado y a continuación ligarse en un vector de expresión adecuado. El extremo hacia 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico se puede ligar, con o sin un enlazador peptídico, al extremo hacia 5' de una secuencia de ADN que codifica el(los) otro(s) componente(s) polipeptídico(s) de manera que los marcos de lectura de las secuencias estén dentro del mismo marco. Las secuencias de ADN ligadas se enlazan funcionalmente a elementos reguladores de la transcripción y/o traducción adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN habitualmente solo se ubican hacia 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De manera similar, los codones de terminación necesarios para detener las señales de terminación de traducción y transcripción están solo presentes hacia 3' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido más cercano al extremo C. Esto permite la traducción en un único polipéptido de fusión que conserva la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes.

Se pueden aplicar técnicas similares, principalmente la disposición de los elementos reguladores tales como promotores, codones de terminación y señales de terminación de la transcripción, para la producción recombinante de proteínas que no tienen fusión.

Se pueden elegir o construir vectores adecuados que contengan secuencias reguladoras adecuadas, incluidas secuencias promotoras, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, según sea adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos, fagos, p. ej., víricos o fagémidos, según sea adecuado. Para obtener detalles adicionales ver, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, segunda edición, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992, o actualizaciones posteriores de este.

Como lo entenderán los expertos en la técnica, puede ser ventajoso en algunos casos producir secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que poseen codones de origen no natural. Por ejemplo, se pueden seleccionar los codones preferidos por un hospedante procariota o eucariota particular para aumentar la tasa de expresión proteica o para producir un transcrito de ARN recombinante que tiene propiedades deseables, tal como una semivida que es más extensa que la de un transcrito generado a partir de la secuencia de origen natural. Dichos polinucleótidos se denominan comúnmente "optimizados por codón". Cualesquiera de los polinucleótidos descritos en la presente memoria se pueden usar en una forma optimizada por codón. En ciertas realizaciones, un polinucleótido se puede optimizar por codón para su uso en bacterias específicas tales como E. coli o levadura tal como S. cerevisiae (ver, p. ej., Burgess-Brown et al., Protein Expr Purif. 59:94-102, 2008).

Las secuencias polinucleotídicas ilustrativas se proporcionan en la Tabla 7 a continuación.

Por lo tanto, un polinucleótido que codifica una proteína de fusión o fusión de anticuerpo descrita en la presente memoria, o una porción de estas, puede comprender una o más secuencias polinucleotídicas de la Tabla 7 (p. ej., SEQ ID NOS:143-147), o un fragmento/variante de estas.

En algunas realizaciones, ácidos nucleicos o vectores que codifican un polipéptido de p97 objeto, un polipéptido de IDS y/o una fusión p97-IDS se introducen directamente en una célula hospedante, y la célula se incuba en condiciones suficientes para inducir la expresión del(de los) polipéptido(s) codificado(s). Por lo tanto, según ciertas realizaciones relacionados, se proporciona una célula hospedante recombinante que comprende un polinucleótido o un polinucleótido de fusión que codifica una o más proteínas de fusión descritas en la presente memoria, y que opcionalmente comprende polinucleótidos exógenos adicionales.

La expresión de una proteína de fusión en la célula hospedante se puede lograr al cultivar las células hospedantes recombinantes (que contienen el(los) polinucleótido(s)) en condiciones adecuadas. Después de la producción por expresión, el(los) polipéptido(s) y/o proteínas de fusión se pueden aislar y/o purificar mediante el uso de cualquier técnica adecuada y después usarse según se desee. El término "célula hospedante" se usa para hacer referencia a una célula en la que se ha introducido, o que es capaz de tener introducida en ella, una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más de los polipéptidos descritos en la presente memoria, y que expresa, además, o es capaz de expresar un gen de interés seleccionado, tal como un gen que codifica cualquier polipéptido descrito en la presente memoria. El término incluye la progenie de la célula original, sea o no la progenie idéntica en morfología o en composición genética al genitor original, siempre que el gen seleccionado esté presente. Las células hospedantes se pueden elegir por ciertas características, por ejemplo, la expresión de una aminoacil ARNt sintetasa(s) que puede incorporar aminoácidos no naturales en el polipéptido.

Los sistemas para la clonación y la expresión de una proteína en una variedad de células hospedantes diferentes se conocen. Las células hospedantes adecuadas incluyen células de mamífero, bacterias, levadura y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de bebé de hámster, células HEK-293, la línea celular de fibrosarcoma humano HT-1080 (ver, p. ej., Moran, Nat. Biotechnol. 28:1139-40, 2010), células de melanoma de ratón NSO y muchas otras. Los ejemplos adicionales de líneas celulares hospedantes de mamíferos útiles incluyen la línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de bebé de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATc C CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC C^c L 34); células de hígado de rata buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep g2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Otras líneas celulares hospedantes de mamíferos útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluidas células DHFR-CHO (Urlaub et al., PNAS USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como NSO y Sp2/0. Para acceder a una reseña de ciertas líneas celulares hospedantes de mamíferos adecuadas para la producción de polipéptidos, ver, p. ej., Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, tomo 248 (B. K.C Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), págs. 255-268. Ciertos sistemas de expresión en células de mamíferos preferidos incluyen los sistemas de expresión basados en células CHO y HEK293. Los sistemas de expresión en mamíferos pueden usar líneas celulares acopladas, por ejemplo, en matraces T, frascos rotativos o fábricas celulares, o cultivos en suspensión, por ejemplo, en centrifugadores de 1L y 5L, biorreactores de tanque con agitación de 5L, 14L, 40L, 100L y 200L o biorreactores WAVE de 20/50L y 100/200L, entre otros conocidos en la técnica.

Un hospedante bacteriano común preferido es E. coli. La expresión de proteínas en células procariotas tales como E. coli está bien establecida en la técnica. Para acceder a una reseña, ver, por ejemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology. 9:545-551 (1991). La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la técnica como una opción para la producción recombinante de polipéptidos (ver, Ref, Curr. Opinion Biotech. 4:573-576, 1993; y Trill et al., Curr. Opinion Biotech. 6:553-560, 1995). En realizaciones específicas, la expresión proteica se puede controlar mediante una ARN polimerasa T7 (p. ej., la serie de vectores pET). Estas y realizaciones relacionadas pueden usar la cepa hospedante para expresión b L21(DE3), un lisógeno ADE3 de BL21 que admite la expresión mediada por T7 y carece de Ion y ompT proteasas para una estabilidad mejorada de la proteína diana. También se incluyen cepas hospedantes de expresión que llevan plásmidos que codifican ARNt rara vez usados en E. coli, tales como las cepas Rosetta™ (DE3) y Rosetta 2 (DE3). La lisis celular y la manipulación de muestras también se pueden mejorar mediante el uso de reactivos tales como nucleasa Benzonase® y reactivo de extracción proteica BugBuster®. Para el cultivo celular, los medios autoinductores pueden mejorar la eficacia de muchos sistemas de expresión, incluidos sistemas de expresión de alto rendimiento. Los medios de este tipo (p. ej., el sistema de autoinducción Overnight Express™) gradualmente desencadenan la expresión proteica a través de desplazamiento metabólico sin la adición de agentes inductores artificiales tales como IPTG. Realizaciones específicas emplean etiquetas de hexahistidina (tales como fusiones His^Tag®) y posterior purificación mediante cromatografía de afinidad con inmovilización en metal (IMAC, por sus siglas en inglés) o técnicas relacionadas. En ciertos aspectos, sin embargo, las proteínas de grado clínico se pueden aislar a partir de cuerpos de inclusión de E. coli, sin o sin el uso de etiquetas de afinidad (ver, p. ej. Shimp et al., Protein Expr Purif. 50:58-67, 2006). Como ejemplo adicional, ciertas realizaciones pueden emplear un sistema de producción de alto rendimiento en E. coli inducido por choque frío, dado que la sobreexpresión de proteínas en Escherichia coli a baja temperatura mejora su solubilidad y estabilidad (ver, p. ej., Qing et al., Nature Biotechnology. 22:877-882, 2004).

Además, una cepa de célula hospedante se puede elegir por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de la manera deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, modificaciones postraducción tales como acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraducción, que escinde una forma "prepro" de la proteína, también se puede usar para facilitar la correcta inserción, plegado y/o función. Se pueden elegir diferentes células hospedantes tales como levadura, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y W138, además de células bacterianas, que tienen o incluso carecen de maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraducción, para garantizar la correcta modificación y procesamiento de la proteína de fusión de interés.

Para una producción a largo plazo, de alto rendimiento de proteínas recombinantes, se prefiere generalmente una expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable un polinucleótido de interés se pueden transformar mediante el uso de vectores de expresión que pueden contener orígenes de replicación víricos y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo o en un vector separado. Después de la introducción del vector, se puede dejar que las células crezcan durante aproximadamente 1-2 días en medios enriquecidos antes de pasarlas a medios selectivos. El objetivo del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas de manera estable se pueden proliferar mediante el uso de técnicas de cultivo de tejido adecuadas para el tipo celular. También se puede emplear la producción transitoria, tal como por transfección o infección transitoria. Los sistemas de expresión en mamíferos ilustrativos que son adecuados para la producción transitoria incluyen sistemas basados en HEK293 y CHO.

Las células hospedantes transformadas con una secuencia polinucleotídica de interés se pueden cultivar en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. Ciertas realizaciones específicas usan sistemas de expresión celular sin suero. Los ejemplos incluyen células HEK293 y células CHO que pueden crecer en medio sin suero (ver, p. ej., Rosser et al., Protein Expr. Purif. 40:237-43, 2005; y la patente estadounidense número 6210922).

La(s) proteína(s) producida mediante una célula recombinante se puede(n) purificar y caracterizar según una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Los sistemas ilustrativos para llevar a cabo la purificación proteica y analizar la pureza de la proteína incluyen cromatografía de líquidos de proteína rápida (FPLC, por sus siglas en inglés) (p. ej., los sistemas de FPLC AKTA y Bio-Rad), cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés) (p. ej., HPLC de Beckman and Waters). Las químicas ilustrativas para la purificación incluyen cromatografía de intercambio iónico (p. ej., Q, S), cromatografía de exclusión por tamaño, gradientes de sal, purificación por afinidad (p. ej., Ni, Co, ^fL^a G, maltosa, glutatión, proteína A/G), filtración en gel, fase inversa, cromatografía de intercambio iónico en cerámica HyperD® y columnas de interacción hidrófoba (HIC, por sus siglas en inglés), entre otras conocidas en la técnica. También se incluyen métodos analíticos tales como SDS-PAGE (p. ej., coomassie, tinción con plata), inmunotransferencia, Bradford y ELISA, que se pueden usar durante cualquier etapa del proceso de producción o purificación, típicamente para medir la pureza de la composición proteica.

Se incluyen, además, métodos para concentrar proteínas producidas de manera recombinante, p. ej., proteínas de fusión. Los ejemplos incluyen liofilización, que se emplea típicamente cuando la disolución contiene pocos componentes solubles distintos de la proteína de interés. La liofilización se lleva a cabo frecuentemente después de un ciclo de HPLC y puede retirar la mayoría o todos los componentes volátiles de la mezcla. También se incluyen técnicas de ultrafiltración que emplean, típicamente, una o más membranas permeables selectivas para concentrar una disolución proteica. La membrana permite que el agua y moléculas pequeñas pasen a través de ella y retiene la proteína; la disolución se puede impulsar contra la membrana mediante una bomba mecánica, presión de gas o centrifugación, entre otras técnicas.

En ciertas realizaciones, las proteínas de fusión tienen una pureza de al menos aproximadamente 90 %, según se mide de acuerdo con técnicas rutinarias en la técnica. En ciertas realizaciones, tales como composiciones de diagnóstico o ciertas composiciones terapéuticas, las proteínas de fusión tienen una pureza de al menos aproximadamente 95 %. En realizaciones específicas, tales como composiciones terapéuticas o farmacéuticas, las proteínas de fusión tienen una pureza de al menos aproximadamente 97 % o 98 % o 99 %. En otras realizaciones, tales como cuando se usan como reactivos de referencia o investigación, las proteínas de fusión pueden tener una pureza menor, y pueden tener una pureza de al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 % u 80 %. La pureza se puede medir en general o en relación con componentes seleccionados, tales como otras proteínas, p. ej., pureza en función de una proteína.

En ciertas realizaciones, según se indicó anteriormente, las composiciones descritas en la presente están aproximadamente libres sustancialmente de endotoxinas, incluso, por ejemplo, aproximadamente 95 % libres de endotoxinas, preferiblemente, aproximadamente 99 % libres de endotoxinas y, más preferiblemente, aproximadamente 99,99 % libres de endotoxinas. La presencia de endotoxinas se puede detectar según técnicas rutinarias en la técnica, según se describen en la presente memoria. En realizaciones específicas, las proteínas de fusión se producen a partir de una célula eucariota tal como una célula de mamífero o humano en medios sustancialmente sin suero.

Métodos de uso y composiciones farmacéuticas

Ciertas realizaciones de la presente invención se refieren a métodos de uso de las proteínas de fusión de p97 descritas en la presente memoria. Los ejemplos de dichos métodos incluyen métodos de tratamiento y métodos de diagnóstico incluso, por ejemplo, el use de proteínas de fusión de p97 para generación de imágenes con fines médicos de ciertos órganos/tejidos, tales como los del sistema nervioso. Algunas realizaciones incluyen métodos para diagnosticar y/o tratar trastornos o afecciones del sistema nervioso central (CNS), o trastornos o afecciones que tienen un componente del CNS. Aspectos particulares incluyen métodos para tratar un trastorno de almacenamiento lisosómico (LSD), incluidos los que tienen un componente del CNS.

Por consiguiente, ciertas realizaciones incluyen métodos para tratar a un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar una proteína de fusión de p97 descrita en la presente memoria. También se incluyen métodos para suministrar una enzima IDS al sistema nervioso (p. ej., tejidos del sistema nervioso central) de un sujeto, que comprenden administrar una composición que comprende una proteína de fusión de p97 descrita en la presente memoria. En algunas de estas y realizaciones relacionadas, los métodos aumentan la tasa de suministro del agente a los tejidos del sistema nervioso central con respecto, por ejemplo, al suministro mediante una composición que comprende una enzima IDS no fusionada.

En algunos casos, el sujeto padece o está en riesgo de padecer una enfermedad de almacenamiento lisosómico. Por lo tanto, ciertos métodos se refieren al tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosómico en un sujeto que lo necesita, opcionalmente aquellas enfermedades de almacenamiento lisosómico asociadas al sistema nervioso central, o que presentan afectación del CNS. Las enfermedades de almacenamiento lisosómico ilustrativas incluyen mucopolisacaridosis tipo II (síndrome de Hunter). El síndrome de Hunter es un trastorno multisistémico ligado al cromosoma X caracterizado por una acumulación de glicosaminoglicanos (GAG, por sus siglas). La amplia mayoría de los individuos afectados son de sexo masculino; en raras ocasiones las mujeres portadoras manifiestan signos. La edad de aparición, la gravedad de la enfermedad y la velocidad de progresión pueden variar significativamente.

En aquellos con enfermedad grave, la afectación del CNS (se manifiesta principalmente por el deterioro cognitivo progresivo), la enfermedad de las vías respiratorias progresiva y la enfermedad cardíaca habitualmente resultan en la muerte en la primera o segunda década de vida. Por lo tanto, ciertas realizaciones incluyen el tratamiento del síndrome de Hunter con afectación del CNS.

En aquellos con enfermedad atenuada, el CNS no se ve afectado (o mínimamente), aunque el efecto de la acumulación de GAG en otros sistemas orgánicos puede ser tan grave como en los que padecen deterioro cognitivo progresivo. La supervivencia en los primeros años de la vida adulta con inteligencia normal es común en la forma atenuada de la enfermedad. Sin embargo, los sujetos con enfermedad atenuada todavía pueden beneficiarse de la administración de una proteína de fusión de p97-IDS que tiene mejor penetración en los tejidos del CNS, por ejemplo, para reducir el riesgo de progresión de un síndrome de Hunter atenuado a uno con afectación del CNS. Los signos adicionales en ambas formas del síndrome de Hunter incluyen: estatura baja; macrocefalia con o sin hidrocefalia comunicante; macroglosia; voz gruesa; pérdida auditiva conductiva y neurosensitiva; hepatomegalia y/o esplenomegalia; disostosis múltiples y contracturas articulares que incluyen anquilosis de la articulación temporomandibular; estenosis espinal; y síndrome de túnel carpiano. Los sujetos que se someten a tratamiento con las proteínas de fusión descritas en la presente memoria, por lo tanto, pueden tener uno o más de estos signos del síndrome de Hunter.

Mediante detección de GAG en la orina y series óseas radiográficas se puede establecer la presencia de una afección MPS, pero no son específicas para MPS II. El criterio de referencia para el diagnóstico de MPS II en una probando de sexo masculino es la actividad enzimática deficiente de iduronato sulfatasa (IDS) en leucocitos, fibroblastos o plasma en presencia de actividad normal de al menos una otra sulfatasa. Las pruebas genéticas moleculares de IDS, el único gen cuya mutación se sabe que está asociada al síndrome de Hunter, se pueden usar para confirmar el diagnóstico en un probando de sexo masculino con un fenotipo inusual o un fenotipo que no coincide con los resultados de la prueba de GAG.

Los tratamientos comunes para el síndrome de Hunter incluyen terapia del desarrollo, ocupacional y física; derivación para la hidrocefalia; amigdaloadenoidectomía; ventilación con presión positiva (CPAP o traqueostomía); liberación del túnel carpiano; remplazo de la válvula cardíaco; reparación de hernia inguinal. Por consiguiente, en ciertos aspectos, un sujeto para tratamiento mediante las proteínas de fusión descritas en la presente memoria puede estar por recibir, estar recibiendo o haber recibido uno o más de estos tratamientos.

La monitorización de la enfermedad puede depender de la afectación del sistema orgánico y la gravedad de la enfermedad, y habitualmente incluye una evaluación cardíaca anual y ecocardiogramas; evaluaciones pulmonares que incluyen evaluar la función pulmonar; audiogramas; exploraciones oculares; evaluaciones del desarrollo; y exploraciones neurológicas. Los estudios adicionales pueden incluir estudios del sueño para la apnea obstructiva; velocidad de conducción nerviosa (NCV, por sus siglas en inglés) para evaluar el síndrome del túnel carpiano; evaluaciones para la hidrocefalia; evaluaciones ortopédicas para monitorizar la enfermedad de cadera. Por lo tanto, en algunos aspectos, un sujeto para tratamiento mediante las proteínas de fusión descritas en la presente memoria puede estar por recibir, estar recibiendo o haber recibido uno o más de estos protocolos de monitorización de la enfermedad.

Para el uso in vivo, por ejemplo, para el tratamiento de una enfermedad humana, generación de imágenes para fines médicos o evaluación, las proteínas de fusión de p97 descritas en la presente memoria se incorporan generalmente en una composición farmacéutica antes de la administración. Una composición farmacéutica comprende una o más de las proteínas de fusión de p97 descritas en la presente memoria en combinación con un portador o excipiente fisiológicamente aceptable.

Para preparar una composición farmacéutica, se mezcla una cantidad eficaz o deseada de una o más proteínas de fusión con cualquier portador(es) farmacéutico(s) o excipiente conocido para los expertos en la técnica por ser adecuado para el modo de administración específico. Un portador farmacéutico puede ser líquido, semilíquido o sólido. Las disoluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica, subcutánea o tópica pueden incluir, por ejemplo, un diluyente estéril (tal como agua), disolución salina (p. ej., disolución salina tamponada con fosfato; PBS, por sus siglas en inglés), aceite fijo, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol u otro disolvente sintético; agentes antimicrobianos (tales como alcohol bencílico y metilparabenos); antioxidantes (tales como ácido ascórbico y bisulfito sódico) y agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); tampones (tales como acetatos, citratos y fosfatos). Si se administran por vía intravenosa (p. ej., mediante infusión IV), los portadores adecuados incluyen disolución salina fisiológica o disolución salina tamponada con fosfato (PBS), y disoluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol, polipropilenglicol y mezclas de estos.

La administración de proteínas de fusión descritas en la presente memoria, en forma pura o en una composición farmacéutica adecuada, se puede llevar a cabo a través de cualquier modo de administración aceptado de agentes que sirven para utilidades similares. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar al combinar una composición que contiene una proteína de fusión con un portador, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable adecuado, y se pueden formular en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, disoluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas y aerosoles. Además, otros ingredientes farmacéuticamente activos (incluidas otras moléculas pequeñas según se describen en otra parte en la presente memoria) y/o excipientes adecuados tales como sales, tampones y estabilizadores pueden estar presentes dentro de la composición, pero no necesariamente.

La administración se puede lograr mediante una variedad de vías diferentes, incluidas oral, parenteral, nasal, intravenosa, intradérmica, subcutánea o tópica. Los modos de administración preferidos dependen de la naturaleza de la afección que se va a tratar o prevenir. Realizaciones específicas incluyen administración por infusión IV. Algunas realizaciones incluyen administración por inyección intraperitoneal (IP). También se incluyen combinaciones de estas.

Los portadores pueden incluir, por ejemplo, portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o mamífero que se expone a ellos en las dosificaciones y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una disolución tamponada por pH acuosa. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluidos glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como polisorbato 20 (TWEEN™) polietilenglicol (PEG) y poloxámeros (PLURONICS™) y similares.

En ciertos aspectos, una proteína de fusión se une a o encapsula dentro de una partícula, p. ej., una nanopartícula, perla, formulación lipídica, partícula lipídica o liposoma, p. ej., inmunoliposoma. Las proteínas de fusión se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980). La(s) partícula(s) o liposomas pueden comprender, además, otros agentes terapéuticos o de diagnóstico.

La dosificación exacta y la duración del tratamiento dependen de la enfermedad que se está tratando y se pueden determinar empíricamente mediante el uso de protocolos de prueba conocidos o mediante la evaluación de las composiciones en sistemas modelo conocidos en la técnica y la extrapolación a partir esta. También se pueden llevar a cabo ensayos clínicos controlados. Las dosificaciones pueden variar también según la gravedad de la afección que se va a aliviar. Una composición farmacéutica generalmente se formula y administra para ejercer un efecto terapéuticamente útil, mientras se minimizan los efectos secundarios indeseables. La composición se puede administrar una vez o se puede dividir en varias dosis más pequeñas para administrarlas en intervalos de tiempo. Para cualquiera sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos se pueden ajustar con el tiempo según la necesidad del individuo.

Las vías de administración típicas de estas y composiciones farmacéuticas relacionadas incluyen, por lo tanto, sin limitación, oral, tópica, transdérmica, inhalación, parenteral, sublingual, bucal, rectal, vaginal e intranasal. El término parenteral, según se usa en la presente memoria, incluye inyecciones subcutáneas, técnicas de inyección o infusión intravenosa, intramuscular, intraesternal. Las composiciones farmacéuticas según ciertas realizaciones de la presente invención se formulan para permitir que los ingredientes activos contenidos en ellas estén biodisponibles después de la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que se administrarán a un sujeto o paciente pueden tomar la forma de una o más dosificaciones unitarias donde, por ejemplo, un comprimido puede ser una dosificación unitaria simple, y un contenedor de un conjugado descrito en la presente memoria en forma de aerosol puede alojar una pluralidad dosificaciones unitarias. Los métodos reales para preparar dichas formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en esta técnica; por ejemplo, ver Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). La composición que se va a administrar típicamente contendrá una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión descrita en la presente memoria, para el tratamiento de una enfermedad o afección de interés.

Una composición farmacéutica puede estar en forma de un sólido o líquido. En una realización, el(los) portador(es) están particulados, de manera que las composiciones están, por ejemplo, en forma de comprimido o polvo. El(los) portador(es) pueden ser líquidos, con las composiciones que son, por ejemplo, un aceite oral, un líquido inyectable o un aerosol, que es útil, por ejemplo, en la administración por inhalación. Cuando se prevé la administración oral, la composición farmacéutica preferiblemente está en forma sólida o líquida, donde las formas semisólidas, semilíquidas, suspensión y gel se incluyen dentro de las formas consideradas en la presente memoria como sólidas o líquidas.

Como una composición sólida para administración oral, la composición farmacéutica se puede formular en polvo, gránulo, comprimido, pastilla, cápsula, goma de mascar, oblea o similares. Dicha composición sólida típicamente contendrá uno o más diluyentes inertes o portadores comestibles. Además, uno o más de los siguientes pueden estar presentes: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes desintegrantes tales como ácido algínico, alginato sódico, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; fluidificantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja; y un agente colorante. Cuando la composición farmacéutica está en forma de cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, puede contener, además de los materiales del tipo indicado anteriormente, un portador líquido tal como polietilenglicol o aceite.

La composición farmacéutica puede estar en forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, disolución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para administración oral o para suministro mediante inyección, como dos ejemplos. Cuando está prevista para administración oral, la composición preferida contiene, además de los presentes compuestos, uno o más de un agente edulcorante, conservantes, tinte/colorante y potenciador de sabor. En una composición prevista para administración mediante inyección, se puede incluir uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizador y agente isotónico.

Las composiciones farmacéuticas líquidas, ya sean disoluciones, suspensiones u otras formas similares, pueden incluir uno o más de los siguientes adyuvantes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, disolución salina, preferiblemente disolución salina fisiológica, disolución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como el disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral se puede alojar en ampollas, jeringas descartables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico. La disolución salina fisiológica es un adyuvante preferido. Una composición farmacéutica inyectable es preferiblemente estéril.

Una composición farmacéutica líquida prevista para administración parenteral u oral debería contener una cantidad de una proteína de fusión tal que se obtuviera una dosificación adecuada. Típicamente, esta cantidad es al menos 0,01 % del agente de interés en la composición. Cuando está prevista para administración oral, esta cantidad se puede variar entre 0,1 y aproximadamente 70 % del peso de la composición. Ciertas composiciones farmacéuticas orales contienen entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 75 % del agente de interés. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y preparaciones según la presente invención se preparan de manera que una dosificación unitaria parenteral contenga entre 0,01 y 10 % en peso del agente de interés antes de la dilución.

La composición farmacéutica puede estar prevista para administración tópica, en tal caso el portador puede comprender, de manera adecuada, una base de disolución, emulsión, ungüento o gel. La base, por ejemplo, puede comprender uno o más de los siguientes: vaselina, lanolina, polietilenglicoles, cera de abeja, aceite mineral, diluyentes tales como agua y alcohol, y emulsionantes y estabilizadores. Puede haber agentes espesantes presentes en una composición farmacéutica para administración tópica. Si está prevista para administración transdérmica, la composición puede incluir un parche transdérmico o dispositivo de iontoforesis.

La composición farmacéutica puede estar prevista para administración rectal en forma de, por ejemplo, un supositorio, que se fundirá en el recto y liberará el fármaco. La composición para administración rectal puede contener una base oleaginosa tal como un excipiente no irritante adecuado. Duchas bases incluyen, sin limitación, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol.

La composición farmacéutica puede incluir diversos materiales que modifican la forma física de una dosificación unitaria sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que forman una cubierta de recubrimiento alrededor de los ingredientes activos. Los materiales que forman la cubierta de recubrimiento son típicamente inertes y se pueden seleccionar de, por ejemplo, azúcar, laca y otros agentes de recubrimiento entérico. Alternativamente, los ingredientes activos se pueden encapsular en una cápsula de gelatina. La composición farmacéutica en forma sólida o líquida puede incluir un agente que se une al conjugado o agente y ayuda, de este modo, en el suministro del compuesto. Los agentes adecuados que pueden actuar de este modo incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales, una o más proteínas o un liposoma.

La composición farmacéutica puede consistir esencialmente en dosificaciones unitarias que se pueden administrar como un aerosol. El término aerosol se usa para denotar una variedad de sistemas que varían de los de naturaleza coloidal a sistemas que consisten en envases presurizados. El suministro puede hacerse mediante un gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bomba adecuado que dispensa los ingredientes activos. Los aerosoles se pueden suministrar en un sistema de fase simple, bifásicos o trifásicos para suministrar el(los) ingrediente(s) activo(s). El suministro del aerosol incluye el contenedor, activadores, válvulas, subcontenedores y similares necesarios, que juntos pueden formar un kit. Un experto en la técnica sin experimentación indebida puede determinar los aerosoles preferidos.

Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden preparar con portadores que protegen las proteínas de fusión contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como formulaciones o recubrimientos de liberación prolongada. Dichos portadores incluyen formulaciones de liberación controlada, tales como, pero sin limitarse a, implantes y sistemas de suministro microencapsulados, y polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilenvinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, poliortoésteres, ácido poliláctico y otros conocidos para los expertos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar mediante metodología conocida en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, una composición farmacéutica prevista para administración mediante inyección puede comprender uno o más de sales, tampones y/o estabilizadores, con agua estéril, destilada para formar una disolución. Se puede agregar un tensioactivo para facilitar la formación de una disolución o suspensión homogénea. Los tensioactivos son compuestos que interactúan de manera no covalente con el conjugado para facilitar la disolución o suspensión homogénea del conjugado en el sistema de suministro acuoso.

Las composiciones se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz, que variará dependiendo de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado; la estabilidad metabólica y la extensión de la acción del compuesto; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el modo y tiempo de administración; la velocidad de excreción; la combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o afección específico; y si el sujeto se somete a tratamiento. Generalmente, una dosis diaria terapéuticamente eficaz es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 0,001 mg/kg (es decir, ~ 0,07 mg) a aproximadamente 100 mg/kg (es decir, ~ 7,0 g); preferiblemente, una dosis terapéuticamente eficaz es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 0,01 mg/kg (es decir, ~ 0,7 mg) a aproximadamente 50 mg/kg (es decir, ~ 3,5 g); más preferiblemente, una dosis terapéuticamente eficaz es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 1 mg/kg (es decir, ~ 70 mg) a aproximadamente 25 mg/kg (es decir, ~ 1,75 g).

Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden administrar también simultáneamente con, antes o después de la administración de uno o más agentes terapéuticos disantos, según se describió en la presente memoria. Por ejemplo, en una realización, el conjugado se administra con un agente antiinflamatorio. Los fármacos o agentes antiinflamatorios incluyen, pero no se limitan a, esteroides y glucocorticoides (incluidos betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) incluidas aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato.

Dicha politerapia puede incluir la administración de una única formulación de dosificación farmacéutica, que contiene un compuesto de la invención (es decir, proteína de fusión) y uno o más agentes activos adicionales, así como la administración de composiciones que comprenden conjugados de la invención y cada agente activo en su propia formulación de dosificación farmacéutica separada. Por ejemplo, una proteína de fusión según se describe en la presente memoria y el otro agente activo se pueden administrar al paciente juntos en una única composición de dosificación oral tal como un comprimido o cápsula, o cada agente se administra en formulaciones de dosificación orales separadas. De manera similar, una proteína de fusión según se describe en la presente memoria y el otro agente activo se pueden administrar al paciente juntos en una única composición de dosificación parenteral tal como en una disolución salina u otra disolución fisiológicamente aceptable, cada agente se administra en formulaciones de dosificación parenterales separadas. Cuando se usan formulaciones de dosificación separadas, las composiciones que comprenden las proteínas de fusión y uno o más agentes activos adicionales se pueden administrar esencialmente al mismo tiempo, es decir, concomitantemente, o en momentos separados en el tiempo, es decir, secuencialmente y en cualquier orden; se entiende que la politerapia incluye todos estos regímenes.

Las diversas realizaciones descritas en la presente memoria se pueden combinar para proporcionar realizaciones adicionales. Se pueden modificar aspectos de las realizaciones, si es necesario para emplear conceptos de las diversas patentes, solicitud y publicaciones para proporcionar todavía realizaciones adicionales.

Estos y otros cambios se pueden hacer a las realizaciones en virtud de la descripción detallada anteriormente. Ejemplos

Ejemplo 1

Actividad in vitro de proteínas de fusión

Se prepararon y sometieron a prueba proteínas de fusión de p97 humana (melanotransferrina; MTf) y duronato-2-sulfatasa humana (IDS) para determinar la actividad enzimática in vitro. La Tabla E1 proporciona las secuencias de aminoácidos y la Tabla E2 proporciona las secuencias codificantes polinucleotídicas correspondientes de las proteínas de fusión que se prepararon y sometieron a prueba (SEQ ID NO: 138, 139, 143 y 144 son ejemplos de referencia).

Las proteínas recombinantes se prepararon y sometieron a prueba para determinar la actividad enzimática contra el sustrato 4-Nitrocatecol Sulfato (PⁿC^s) con respecto a IDS humana recombinante y un testigo negativo (la fusión trastuzumab-MTf). Los resultados se muestran en la Figuras 2-4. Se usó un ^g de cada muestra en el ensayo de actividad enzimática y los datos presentados están normalizados con respecto al blanco de sustrato.

La Figura 2 muestra la evaluación de la actividad enzimática de las proteínas de fusión I2S-MTf y MTf-I2S según se mide por su capacidad de hidrolizar el sustrato 4-Nitrocatecol Sulfato (PNCS) con respecto a IDS humana recombinante y un testigo negativo (fusión TZM-MTf). Estos datos muestran que las proteínas de fusión I2S-MTf y MTf-I2S no solo tuvieron actividad enzimática significativa, sino que también tuvieron mayor actividad enzimática con respecto a la IDS humana natural (sin fusión).

La Figura 3 muestra la evaluación de la actividad enzimática de las proteínas de fusión MTfpep-I2S y I2S-MTfpep (con propéptido de I2S) según se mide por su capacidad de hidrolizar el sustrato PNCS con respecto a la fusión I2S-MTf y un testigo negativo (fusión TZM-MTf). Estos datos muestran que las proteínas de fusión MTfpep-I2S y I2S-MTfpep no solo tuvieron actividad enzimática significativa, sino que también tuvieron mayor actividad enzimática con respecto a la proteína de fusión I2S-MTf significativamente activa (de la Figura 2) y, por lo tanto, mayor actividad enzimática con respecto a IDS humana natural (sin fusión).

La Figura 4 muestra una comparación de la actividad enzimática de las proteínas de fusión I2S-MTfpep (con propéptido de I2S) e I2S-MTfpep (sin propéptido de I2S) según se mide por su capacidad de hidrolizar el sustrato PNCS. Estos datos muestran que las proteínas de fusión MTfpep-I2S y I2S-MTfpep no solo tuvieron actividad enzimática significativa, sino que también tuvieron mayor actividad enzimática relativamente a la IDS humana natural (sin fusión).

Ejemplo 2

Distribución in vivo de las fusiones I2S-MTf y MTfpep-I2S en el cerebro

La biodistribución en el cerebro de las proteínas de fusión I2S-MTf (ejemplo de referencia) y MTfpep-I2S en ratones se evaluó mediante generación de imágenes por microscopía confocal cuantitativa. Se administraron equivalentes de dosis terapéuticas de I2S-MTf y MTfpep-I2S en volumen de 100 pL a ratones a través de inyección en la vena de la cola. Antes de la eutanasia, los ratones recibieron por inyección (i.v.) Lectina de tomate-FlTc (40 pg) durante 10 min para teñir la vasculatura cerebral. La sangre se aclaró mediante perfusión intracardíaca de 10 ml de disolución salina heparinizada a una velocidad de 1 ml por minuto. Los cerebros se extirparon y congelaron en OCT y se almacenaron a -80 °C. Los cerebros se montaron en Tissue Tek y se cortaron en secciones con un crióstato a -20 °C. Las secciones se montaron en portaobjetos para microscopio Superfrost Plus, se fijaron en Acetona/MeOH fríos (1:1) durante 10 minutos a temperatura ambiente y se lavaron con PBS. Se montaron cubiertas de vidrio sobre las secciones mediante el uso del reactivo para fluorescencia Prolong Gold con DAPI (sondas moleculares, P36931). Se llevaron a cabo microscopía confocal tridimensional (3D) y análisis cuantitativo.

La Figura 5 muestra la cuantificación de la distribución relativa de las proteínas de fusión MTfpep-I2S (con propéptido) e I2S-MTf entre capilares (C) y el parénquima (P) en el cerebro, con respecto a la señal total (T). La tinción significativa de tejidos parenquimatosos con respecto a los capilares confirma que las proteínas de fusión MTfpep-I2S y I2S-MTf fueron ambas capaces de cruzar la barrera hematoencefálica (BBB) y acumularse en tejidos del sistema nervioso central.

En resumen, los datos de los Ejemplos 1 y 2 muestran que las proteínas de fusión MTfpep-I2S (con propéptido) y I2S-MTf no solo son capaces de cruzar la BBB y acumularse en tejidos del CNS, sino que también tienen actividad enzimática significativamente mayor con respecto a la IDS humana recombinante natural (sin fusión).

Ejemplo 3

Actividad in vivo de las fusiones I2S-MTf y MTfpep-I2S en modelo de MPS II en ratón

Se evaluó la eficacia terapéutica de las proteínas de fusión I2S-MTf (ejemplo de referencia) y MTfpep-I2S en un modelo de síndrome de Hunter o Mucopolisacaridosis tipo II (MPS II) en ratón con respecto a Idursulfasa (Elaprase®), que se indica para el tratamiento del síndrome de Hunter. Estos estudios se diseñaron para evaluar el efecto de la administración intravenosa (IV) e intraperitoneal (IP) de las proteínas de fusión en la patología cerebral en un modelo de Mucopolisacaridosis II (MPSII) en ratón con gen inactivado.

Síndrome de Hunter. Según se indicó anteriormente, el síndrome de Hunter es una enfermedad recesiva ligada al cromosoma X causada por niveles insuficientes de la enzima iduronato 2-sulfatasa (IDS) lisosómica. Esta enzima escinde los restos de 2-O-sulfato terminales de los glicosaminoglicanos (GAG) sulfato de dermatán y sulfato de heparán. Debido a la actividad faltante o defectuosa de la enzima IDS en pacientes con síndrome de Hunter, los ^gA^g se acumulan progresivamente en los lisosomas de una variedad de tipos celulares. Esto conduce a congestión celular, organomegalia, destrucción de tejido y disfunción de sistema orgánico.

Modelo en ratón. Los ratones IDS-KO tienen escasa o ninguna actividad de IDS en los tejidos y exhiben muchos de los efectos celulares y clínicos observados en el síndrome de Hunter, incluida mayor vacuolización de tejidos, niveles de GAG y excreción urinaria de GAG. Debido a la naturaleza recesiva, ligada al cromosoma X del síndrome de Hunter, todos los estudios de farmacología se llevaron a cabo en ratones macho. La reproducción animal se lleva a cabo según lo describen Garcia et al, 2007 (3). En resumen, se aparean hembras portadoras con ratones macho naturales de la cepa C57BI/6, se producen ratones hembra heterogéneos y macho hemicigóticos con gen inactivado, así como hembras y machos naturales (WT, por sus siglas en inglés). Se obtienen ratones macho IDS-KO alternativamente al aparear hembras portadoras con ratones macho IDS-KO. El genotipo de todos los ratones usados en estos experimentos se confirma mediante reacción en cadena de la polimerasa de ADN obtenido a partir de corte en la cola. Todos los ratones IDS-KO son machos IKO (-/0) hemicigóticos de entre 12-13 semanas en el comienzo de la iniciación del tratamiento (no se usan ratones menores de 12 semanas en este estudio). Se usa un grupo de machos WT de la camada (+/0) no tratados como testigos.

Idursulfasa (Elaprase®). La idursulfasa es un fármaco usado para tratar el síndrome de Hunter (también denominado MPS-II) (ver Garcia et al., Mol Genet Metab. 91:183-90, 2007). Es una forma purificada de la enzima lisosómica iduronato-2-sulfatasa y se produce mediante tecnología de ADN recombinante en una línea celular humana. Diseño del estudio. El diseño del estudio se señala en la Tabla E3 a continuación.

Todos los artículos de prueba y testigos de vehículo se administran mediante dos bolos lentos (uno por inyección IV y uno por IP) que se llevan a cabo una vez por semana durante un total de 6 semanas.

Los pesos corporales se determinan en la aleatorización durante el primer día de tratamiento y semanalmente a continuación. Se llevan a cabo observaciones clínicas a diario. Los animales se sacrifican aproximadamente 24 horas después del último tratamiento.

Se recogen los órganos seleccionados (cerebro, hígado, riñón y corazón) y se registran sus pesos. Los cerebros se conservan para análisis de histopatología e inmunotinción. Los otros tejidos se dividen en una mitad u órgano de par y se conservan para histopatología e inmunotinción de manera similar al cerebro. La otra mitad u órgano del par se congela en nitrógeno líquido y se almacena a -80 °C hasta que se someten a ensayo para determinar GAG.

Criterios de valoración del estudio: Los criterios de valoración primarios son los siguientes:

• Evaluación histológica: Tinción con hematoxilina y eosina de secciones del cerebro. Este método se usa para evaluar si el tratamiento tuvo un efecto de reducción de la cantidad/tamaño de vacuolas de almacenamiento celular observadas en ratones IDS-KO; y

• Evaluación inmunohistoquímica de la proteína de membrana asociada lisosómica-1 (LAMP-1) en secciones de cerebro: este método se usa para determinar si el tratamiento tuvo un efecto de reducción de la inmunorreactividad de LAMP-1 elevada que se observa en ratones IDS-KO.

Si es factible, también se emplean métodos cualitativos o semicualitativos para el análisis de los criterios de valoración 1-2 (tales como puntuación, mediciones de área, barridos de sección, etc.). El histopatólogo que lleva a cabo este análisis desconoce la asignación de los portaobjetos a los grupos del estudio. El área superficial del lisosoma se cuantifica al barrer áreas teñidas para LAMP1 (IHC) y se compara entre grupos experimentales.

Los criterios de valoración secundarios son los siguientes:

• Niveles de GAG en tejidos seleccionados (hígado, riñón y corazón);

• Tinción con H&E de tejidos seleccionados y detección de vacuolas de almacenamiento celular; y

• Evaluación inmunohistoquímica de los niveles de LAMP-1 en órganos/tejidos seleccionados.

Histopatología (tinción con H&E). Los tejidos se recogen y fijan en formalina tamponada neutra al 10 %, después se procesan y embeben en parafina. Se preparan y tiñen secciones de parafina de 5 pm con hematoxilina y eosina (H&E) mediante procedimientos estándares.

Inmunohistoquímica (LAMP-1). Los portaobjetos desparafinizados se incuban durante toda la noche con IgG anti-LAMP-1 de rata (Santa CruzBiotechnology) como el anticuerpo primario o IgG2a de rata como anticuerpo testigo (AbDSerotec, Raleigh, NC). Después de la incubación durante toda la noche a 2-8 °C, se agrega IgG de conejo anti­ rata (H&L) adsorbida por ratón biotinilada (Vector Laboratories). Después de 30 minutos de incubación a 37 °C, las muestras se lavan y después se tratan con complejo avidina-biotina-peroxidasa (Vector Laboratories) durante 30 minutos. La proteína etiquetada se localiza mediante incubación con 3,39-diaminobenzidina. El área de células positivas para LAMP-1 se analiza con el programa informático Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD).

Mediciones de GAG. Se preparan extractos de tejido al homogeneizar tejido en un tampón de lisis (10 mM Tris, 5 mM EDTA, Igepal CA-630 al 0,1 %, 2 mM Pefabloc SC) con un triturador de vidrio (Kontes Glass Company, Vineland, NJ) o un homogeneizador de tejido motorizado (PowerGen Model 125, Omni International, Warrenton, VA). A continuación, los homogenatos se someten a 5 ciclos de congelamiento-descongelamiento usando un baño de etanol/hielo seco y un baño de agua a 37 °C. Los residuos de tejido se granulan dos veces mediante centrifugación a temperatura ambiente a 2000 g durante 12 minutos y los sobrenadantes se recogen y se someten a ensayo para determinar la concentración de proteína total (mg/mL) usando el ensayo de ácido bicincónico (BCA, por sus siglas en inglés) (Pierce, Rockford, IL).

La concentración de GAG en orina y extractos de tejido se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico usando tinte azul de 1,9-dimetilmetileno (DMB) y una curva estándar (1,56-25 pg/mL) preparada a partir de sulfato de dermatán (MP Biomedicals, Aurora, OH). Las muestras de orina se procesan en diluciones de 1/10, 1/20 y 1/40. Para evitar la interferencia de la proteína en el ensayo, las muestras de extracto de tejido se diluyen hasta concentraciones de proteína <200 pg / ml. Las concentraciones de GAG en la orina se ajustan según las concentraciones de creatinina medidas con un kit disponible comercialmente (Sigma, St. Louis, MO, parte núm. 555A) para compensar las diferencias en la función renal y se expresan como pg de GAG/mg de creatinina. Los niveles de GAG en extractos de tejido se ajustan según la concentración de proteína (pg de GAG/mg de proteína) o gramos de tejido.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión de p97 (melanotransferrina) que comprende un polipéptido de iduronato-2-sulfatasa (IDS) fusionado al extremo N de un polipéptido de p97 y un enlazador peptídico opcional (L) entremedio, en donde el polipéptido de p97 consiste en la secuencia de aminoácidos DSSHAFTLDELR.

2. Una proteína de fusión de p97 (melanotransferrina) que comprende un polipéptido de iduronato-2-sulfatasa (IDS) fusionado al extremo C de un polipéptido de p97 y un enlazador peptídico opcional (L) entremedio, en donde el polipéptido de p97 consiste en la secuencia de aminoácidos DSSHAFTLDELR.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el polipéptido de iduronato-2-sulfatasa (IDS) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:33.

4. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos (EAAAK)1-3.

5. La proteína de fusión de la reivindicación 1 y la reivindicación 2, en donde el enlazador tiene la secuencia de aminoácidos (EAAAK)3.

6. La proteína de fusión de la reivindicación 1 y la reivindicación 2, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia de péptido señal (SP) en el extremo N.

7. La proteína de fusión de la reivindicación 1 y la reivindicación 2, en donde la proteína de fusión comprende una etiqueta de purificación (TAG).

8. La proteína de fusión de la reivindicación 1 y la reivindicación 2, en donde la proteína de fusión comprende un sitio de proteasa (PS).

9. Un polinucleótido aislado que codifica una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o un vector que comprende el polinucleótido aislado que está funcionalmente enlazado a uno o más elementos reguladores.

10. El polinucleótido aislado o vector de la reivindicación 9, que se optimiza por codón para su expresión en una célula hospedante.

11. El polinucleótido aislado o vector de la reivindicación 10, donde la célula hospedante es una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de levadura o una célula bacteriana.

12. Una célula hospedante recombinante que comprende una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o un polinucleótido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 que está funcionalmente enlazado a uno o más elementos reguladores, o un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11.

13. La célula hospedante recombinante de la reivindicación 12, donde la célula hospedante es una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de levadura o una célula bacteriana.

14. La célula hospedante recombinante de la reivindicación 13, donde la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula HEK-293 o una célula de fibrosarcoma humano HT-1080.

15. Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la composición farmacéutica es estéril y no pirógena.

16. Una composición farmacéutica de la reivindicación 15 para su uso en el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosómico en un sujeto que lo necesita.

17. La composición para su uso según la reivindicación 16, donde la enfermedad de almacenamiento lisosómico es el síndrome de Hunter (MPS II).

18. La composición para su uso según la reivindicación 16 o 17, donde la enfermedad de almacenamiento lisosómico presenta afectación del sistema nervioso central (CNS).

19. La composición para su uso según la reivindicación 16 o 17, donde el sujeto está en riesgo de desarrollar afectación del CNS de la enfermedad de almacenamiento lisosómico.

20. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 16-19, donde el sujeto es un humano de sexo masculino.

21. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 16-20, donde la proteína de fusión o composición farmacéutica se administra mediante infusión intravenosa (IV).