ES2761583T3

ES2761583T3 - Planta Brassica que comprende un alelo indehiscente mutante

Info

Publication number: ES2761583T3
Application number: ES16179838T
Authority: ES
Inventors: Benjamin Laga; Boer Bart Den; Bart Lambert
Original assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Current assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2008-07-17
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2020-05-20
Anticipated expiration: 2029-07-09
Also published as: PT3156488T; HUE046536T2; ZA201100136B; CL2011000016A1; LT3156488T

Abstract

Un alelo mutante defectivo parcial de un gen IND, en el que el gen IND comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3 desde el nucleótido en la posición 46 hasta el nucleótido en la posición 633, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7; (b) una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 desde el aminoácido en la posición 16 hasta el aminoácido en la posición 210, o la SEQ ID NO: 4, en el que dicho alelo mutante defectivo parcial comprende una o más mutaciones de sentido erróneo en la secuencia de ácido nucleico de dicho gen IND que da como resultado la producción de una proteína IND en la que al menos un aminoácido seleccionado del aminoácido en una posición correspondiente a la posición 124 de SEQ ID NO:2, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 146 de la SEQ ID NO:2, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 159 de la SEQ ID NO:2, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 136 de la SEQ ID NO:4, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 139 de la SEQ ID NO:4 o el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 142 de la SEQ ID NO:4, está sustituido con otro aminoácido.

Description

DESCRIPCIÓN

Planta Brassica que comprende un alelo indehiscente mutante

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la agricultura, más específicamente al uso de técnicas de biología molecular para alterar plantas de semilla dehiscente, particularmente de la familia Brassicaceae, en particular la especie Brassica, y/o acelerar la reproducción de tales plantas de semilla dehiscente. Más específicamente, la invención se refiere a procedimientos y medios mejorados para reducir el desgranado de la semilla o retrasar el desgranado de la semilla hasta después de la cosecha, en plantas tales como plantas Brassicaceae, particularmente plantas Brassicaceae cultivadas para la producción de semillas, a la vez que mantienen al mismo tiempo una capacidad de trilla agronómicamente relevante de las vainas. También se describen procedimientos para identificar marcadores moleculares asociados con un desgranado retrasado de las semillas en una población de plantas de semilla dehiscente. También se proporcionan procedimientos y medios para aumentar el rendimiento, particularmente el rendimiento de grano y semilla. El fenotipo de aumento de rendimiento puede estar separado del fenotipo de fragmentación de semillas reducido o retrasado.

Antecedentes de la invención

Las silicuas o vainas de plantas de Brassica liberan sus semillas a través de un procedimiento denominado dehiscencia del fruto. Una silicua consiste en dos carpelos unidos margen con margen. La sutura entre los márgenes forma un nervio grueso, denominado replum. A medida que se acerca la madurez de las vainas, las dos valvas se separan progresivamente del replum, a lo largo de líneas designadas de debilidad en la vaina, lo que, en última instancia, da como resultado el desgranado de las semillas que estaban unidas al replum. La zona de dehiscencia define la localización exacta de la disociación de las valvas.

El desprendimiento de la semilla (también conocido como "desgranado de la semilla" o "desgranado de la vaina") por vainas maduras antes o durante la cosecha del cultivo es un fenómeno universal con cosechas que desarrollan frutos dehiscentes secos. El desgranado prematuro de semillas da como resultado una recuperación reducida de las semillas, lo que representa un problema en cultivos que crecen principalmente para las semillas, tales como plantas de Brassica productoras de aceite, particularmente colza. Otro problema relacionado con el desgranado prematuro de las semillas es un incremento en el crecimiento voluntario en el año posterior del cultivo. En la colza, las pérdidas de productividad relacionadas con el desgranado de las vainas son, de media, del 20 % (Child y col., 1998, J Exp Bot 49: 829-838), pero pueden alcanzar hasta el 50 %, dependiendo de las condiciones meteorológicas (MacLeod, 1981, Harvesting in Oilseed Rape, por ejemplo, 107-120, Cambridge Agricultural Publishing, Cambridge).

Las variedades comerciales actuales de colza son extremadamente susceptibles al desgranado. Hay poca variación para la resistencia al desgranado dentro de los programas de cultivo de B. napusexistentes, pero se han encontrado líneas resistentes dentro de los progenitores diploides de B. napus (B. oleracea y B. rapa) así como dentro de otros miembros del género Brassica, principalmente B. júncea, B. carinata y B. nigra. Kadkol y col., (1986, Aust. J. Botany 34 (5): 595-601) dan a conocer una mayor resistencia frente al desgranado en ciertos registros de B. campestris que estaba asociada con la ausencia de una capa de separación en la región de unión de las valvas de la silicua al replum. Prakash y Chopra (1988, Plant breeding 101: 167-168) describen la introgresión de la resistencia al desgranado en Brassica napus desde Brassica júncea mediante recombinación no homóloga. Spence y col., (1996, J of Microscopy 181: 195-203) describen que algunas líneas de Brassica júncea muestran una tendencia reducida a desgranarse en comparación con líneas de Brassica napus. Morgan y col., 1998 (Fields Crop Research 58, 153-165) describen variación genética para la resistencia al desgranado de vainas entre líneas de colza desarrolladas a partir de B. napus sintético y concluyen que las líneas que requirieron mucha energía para abrir sus vainas parecieron tener una mayor vascularización en la zona de dehiscencia y una degradación reducida de la pared celular en la zona de dehiscencia. Descubrieron además una correlación negativa significativa entre la longitud del espolón de las vainas y la fuerza necesaria para provocar el desgranado de las vainas. Child y Huttly (1999, Proc 10th Int. Rapeseed Congress) describen la variación en la maduración de vainas en un mutante de B. napus inducida por irradiación y una población de sus variedades de cultivo progenitoras, Jet Neuf, en la que las plantas de tipo salvaje y mutantes más resistentes mostraron una gran lignificación de grupos de células a lo largo de la zona de dehiscencia, y en la que se describieron trazas vasculares situadas próximas al borde interno de la zona de dehiscencia en el mutante, para ayudar a asegurar las valvas. Child y col., (2003, J Exp Botany 54 (389): 1919-1930) describen además la asociación entre una mayor resistencia al desgranado de las vainas y cambios en la estructura vascular en vainas de una línea de Brassica napus resintetizada. Sin embargo, los procedimientos tradicionales para el cultivo no han tenido éxito a la hora de introducir resistencia al desgranado en variedades de cultivo de colza, sin interferir con otros rasgos deseables tales como floración temprana, maduración y resistencia al pie negro (Prakash y Chopra, 1990, Genetical Research 56: 1-2).

Se han identificados varios genes, que promueven o inhiben la dehiscencia de las vainas, en Arabidopsis thaliana a través del análisis de mutantes: mutantes combinados tanto en SHATTERPROOF1 (SHP1; inicialmente conocido como ACL1) como en SHATTERPROOF2 (SHP2; inicialmente conocido como AGL5) dan como resultado silicuas indehiscentes (es decir, silicuas que permanecen cerradas con la maduración en Arabidopsis thaliana) (Liljegren y col., 2000, Nature 404, 766-770). De manera similar, mutantes en el gen INDEHISCEn T (denominado iNd 1) en Arabidopsis thaliana (Liljegren y col., 2004, Cell 116: 843-853; publicación PCT WO 01/79517), así como en ALCATRAZ (conocido como ALC; Rajani y col., 2001, Current Biology 11, 1914-1922) interfirieron con la dehiscencia de las vainas, conduciendo a resistencia al desgranado de las vainas. La expresión constitutiva de FRUITFUL (FUL), un represor de SHP e IND, en Arabidopsis thaliana, también dio como resultado silicuas indehiscentes (Ferrandiz y col., 2000, Science, 289, 436-438). Se cree que estos factores de transcripción forman una red transcripcional no lineal que controla la identidad del margen de la valva y el desgranado de las vainas. Liljegren y col., (2004, Cell 116: 843 853) describen además que IND, un gen de hélice-bucle-hélice básica (bHLH) atípico, dirige la diferenciación del margen de la valva en las capas de separación y lignificadas en Arabidopsis thaliana. La capa de células lignificadas adyacente a la capa de separación junto con la capa b del endocarpio (una única capa de células lignificadas en cada valva) producen una tensión semejante a un muelle en el fruto que se está secando, que contribuye a su apertura. La lignificación de la capa b del endocarpio de la valva requiere las actividades de IND, SHP, ALC y FUL, un factor de transcripción de dominio MADS que se expresa a lo largo de las valvas (Liljegren y col., 2004, citado anteriormente; Mandel y Yanofsky, 1995, Plant Cell 7, 1763-1771). Se ha descubierto que FUL y REPLUMLESS (RPL), un factor de transcripción de homeodominio que se expresa en el replum (Roeder y col., 2003, Curr Biol 13, 1630-1635), establecen los límites de los genes que confieren identidad del margen de la valva (Gu y col., 1998, Development 125, 1509-1517; Ferrandiz y col., 2000, Science, 289, 436-438; Roeder y col., 2003, citado anteriormente). Finalmente, se identificó que FILAMENTOUS FLOWER (FIL) y YABBY3 (YAB3), dos factores de transcripción de la familia YABBY (Sawa y col., 1999, Genes Dev 13, 1079-1088; Siegfried y col., 1999, Development 126, 4117-4128), y JAGGED (JAG), un factor de transcripción con dedos de cinc C2H2 (Dinneny y col., 2004, Development 131, 1101-1110; Ohno y col., 2004, Development 131, 1111-1122), contribuyen redundantemente al desarrollo apropiado de la valva y del margen de la valva al promover la expresión de FUL y SHP de una manera específica de la región (Dinneny y col., 2005, Development 132, 4687-4696). También se han identificado genes para un número de enzimas hidrolíticas, tales como endopoligalacturonasas, que desempeñan un papel, durante la dehiscencia de las vainas, en la rotura programada de la zona de dehiscencia en vainas de plantas de Brassica (véase, por ejemplo, el documento WO 97/13865; Petersen y col., Plant. Mol. Biol., 1996, 31:517-527).

Liljegren y col., (2004, Cell 116: 843-853) describen cinco alelos mutantes de IND de Arabidopsis. Las células lignificadas en la zona de dehiscencia están ausentes o presentes en plantas que comprenden estos alelos mutantes, dependiendo de la gravedad de las mutaciones (los mutantes ind graves no contienen células lignificadas en la región que corresponde a la parte interna del margen de la valva en plantas de tipo salvaje), pero en todos los casos, la silicua es indehiscente. Wu y col., (2006), Planta 224, 971-979) describen un sexto alelo mutante de IND de Arabidopsis. Las plantas que comprenden este alelo mutante no muestran células lignificadas en las uniones del margen de la valva y el replum, contienen menos células en una región de siete capas de células, que parece que engloba la zona de dehiscencia habitualmente conocida y el borde del replum en plantas salvajes, y muestran citocinesis incompleta en esta capa.

Los documentos US 2005/0120417 y US 2007/0006336 describen la identificación y aislamiento de dos ortólogos de IND1 de Brassica napus.

Los documentos WO99/00503, WO01/79517 y WO0159122 describen la regulación por disminución de la expresión de los genes ALC, IND, AGL1 y AGL5 de Arabidopsis, y sus ortólogos, usando técnicas de silenciamiento génico (tales como supresión o cosupresión antisentido) y mutagénesis.

Vancanneyt y col., 2002 (XIII International Conference on Arabidopsis Research, Sevilla, España, 28 de junio-2 de julio; 2002) dieron a conocer que la expresión de FUL de A. thaliana bajo el control de un promotor de CaMV 35S en colza dio como resultado un número de transformantes resistentes al desgranado de las vainas. Las vainas de tales líneas resistentes al desgranado de las vainas no tuvieron zona de dehiscencia y la apertura de las vainas solamente se pudo lograr mediante fractura al azar de las valvas aplicando una presión considerable.

Vancanneyt y col., 2002 (XIII International Conference on Arabidopsis Research, Sevilla, España, 28 de junio-2 de julio; 2002) también dieron a conocer que el silenciamiento del gen IND en Arabidopsis thaliana usando las denominadas técnicas de silenciamiento de ARNbc dieron como resultado una resistencia casi completa al desgranado de las vainas. El noventa y ocho por ciento de las líneas transgénicas de Arabidopsis desarrolló silicuas, que no se abrieron a lo largo de la sutura de la valva y solo se pudieron abrir aplicando una presión considerable a las valvas.

Es importante observar que aunque el desgranado de las semillas constituye un problema importante en el cultivo de colza, que se puede resolver desarrollando líneas resistentes al desgranado de las vainas, en última instancia, la separación de las semillas de las vainas es todavía necesaria. En la práctica agrícola normal esto se logra trillando las vainas mediante una cosechadora combinada. El trillado de las vainas mediante una cosechadora combinada debe de ser total y debe de provocar un daño mínimo a las semillas así liberadas. Sin embargo, a medida que aumenta la fortaleza de las vainas, la acción más intensa requerida para trillarlas provoca un nivel inaceptable de daño a la semilla. Las vainas de plantas Brassicaceae resistentes al desgranado de las vainas no deberían de ser así tan fuertes de manera que no puedan ser trilladas en una cosechadora combinada (Bruce y col., 2001, J. Agric. Engng Res. 80, 343 350).

El documento WO 2004/113542 describe que el silenciamiento génico de ARNbc moderado de genes implicados en el desarrollo de la zona de dehiscencia y márgenes de la valva de vainas en plantas Brassicaceae permite el aislamiento de líneas transgénicas con una mayor resistencia al desgranado de las vainas y un menor desgranado de las semillas, cuyas vainas, sin embargo, todavía se pueden abrir a lo largo de la zona de dehiscencia aplicando fuerzas físicas limitadas.

El documento WO09/068313 (que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052) desvela plantas Brassica que comprenden al menos dos genes IND, en particular plantas de Brassica napus, caracterizados por que comprenden tres alelos IND mutantes completamente defectivos en su genoma y en los que la resistencia al desgranado de las vainas de las plantas aumenta significativamente en comparación con la resistencia al desgranado de las vainas de una planta que no comprende alelos IND mutantes, pero en los que la planta mantiene, preferentemente, una capacidad de trillado agronómicamente relevante de las vainas.

Las invenciones descritas a continuación en las diferentes realizaciones, ejemplos y reivindicaciones proporcionan procedimientos y medios mejorados adicionales para modular las propiedades de dehiscencia en plantas de semillas dehiscentes. Más específicamente, la presente invención describe otros procedimientos y medios mejorados para reducir el desgranado de semillas o retrasar el desgranado de semillas hasta después de la cosecha, en plantas tales como plantas Brassicaceae, particularmente plantas Brassicaceae cultivadas para la producción de semillas, a la vez que mantienen al mismo tiempo una capacidad de trilla agronómicamente relevante de las vainas. En particular, la presente solicitud desvela plantas de Brassica que comprenden al menos dos genes IND, en particular plantas de Brassica napus, caracterizados por que comprenden dos alelos IND mutantes defectivos parciales en su genoma o dos alelos IND mutantes defectivos parciales y dos completos y en los que la resistencia al desgranado de las vainas de las plantas aumenta significativamente en comparación con la resistencia al desgranado de las vainas de una planta que no comprende alelos IND mutantes, pero en los que la planta mantiene, preferentemente, una capacidad de trillado agronómicamente relevante de las vainas. También se proporcionan procedimientos y medios para aumentar el rendimiento, particularmente el rendimiento de grano y semilla. El fenotipo de aumento de rendimiento puede estar separado del fenotipo de fragmentación de semillas reducido o retrasado.

Sumario de la invención

Los inventores han descubierto que se pueden obtener plantas de Brassica napus con un fenotipo de desgranado de vainas similar al de las plantas de Brassica descritas en el documento WO09/068313 (que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052), es decir, que combinan una mayor resistencia al desgranado de las vainas con una capacidad de trillado agronómicamente relevante de las vainas combinando dos alelos IND mutantes defectivos parciales con o sin dos alelos IND mutantes completos defectivos en lugar de combinar tres alelos IND mutantes defectivos completos.

Por tanto, en el presente documento se describe una planta de Brassica que comprende al menos dos genes IND, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, caracterizado porque comprende al menos dos alelos IND mutantes defectivos parciales en su genoma. Los genes IND pueden ser genes IND-A1 o IND-C1. Los genes IND pueden comprender una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3 del nucleótido en la posición 46 con el nucleótido en la posición 633, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7; y una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 del aminoácido en la posición 16 con el aminoácido en la posición 21 o la SEQ ID NO: 4. Los alelos IND mutantes defectivos parciales pueden ser alelos IND mutantes del gen IND-C1. Los alelos IND mutantes defectivos parciales pueden seleccionarse del grupo que consiste en ind-a1-EMS06, ind-a1-EMS09, ind-a1-EMS13, ind-c1-EMS04, ind- c1-EMS08 e ind-c1 -EMS09. La planta puede comprender además al menos un alelo IND mutante defectivo completo en su genoma. Los alelos IND mutantes defectivos completos pueden ser un alelo IND mutante del gen IND-C1. El alelo IND mutante defectivo completo puede seleccionarse del grupo que consiste en ind-a1-EMS01, ind-a1-EMS05, ind-c1-EMS01 e ind-c1-EMS03. La planta puede ser homocigota para el alelo IND mutante defectivo parcial y/o completo. La planta puede producir una cantidad significativamente reducida de proteína IND funcional en comparación con la cantidad de proteína IND funcional producida por una planta correspondiente que no comprende alelos IND mutantes. El desgranado de la semilla de la planta puede reducirse o retrasarse significativamente en comparación con el desgranado de la semilla de una planta correspondiente que no comprende alelos IND mutantes. La planta puede mantener una capacidad de trilla agronómicamente relevante de las vainas. La planta puede ser una planta de una especie de cultivo de Brassica, preferentemente Brassica napus, Brassica juncea, Brassica carinata, Brassica rapa o Brassica oleracea. La planta puede ser una planta de una especie de semilla de aceite de Brassica, preferentemente Brassica napus, Brassica juncea o Brassica rapa.

También se describe una planta o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, que comprende al menos un alelo mutante defectivo parcial de un gen IND en su genoma, en el que el gen IND comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3 del nucleótido en la posición 46 con el nucleótido en la posición 633, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7; y una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 del aminoácido en la posición 16 con el aminoácido en la posición 21 o la SEQ ID NO: 4. El alelo IND mutante defectivo parcial puede seleccionarse del grupo que consiste en ind-a1-EMS06, ind-a1-EMS09, ind-a1EMS13, ind-c1-EMS04, ind-c1-EMS08 e ind-c1-EMS09. El alelo IND mutante puede derivarse de una planta de una especie de Brassica. La planta puede ser una planta de una especie de Brassica.

También se describe una vaina de semilla obtenible a partir de las plantas descritas en el presente documento.

En un aspecto, se proporciona un alelo mutante defectivo parcial de un gen IND, en el que el gen IND comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3 del nucleótido en la posición 46 con el nucleótido en la posición 633, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7; y una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 del aminoácido en la posición 16 con el aminoácido en la posición 21 o la SEQ ID NO: 4. En una realización, el alelo mutante se selecciona del grupo que consiste en ind-a1 -EMS06, ind-a1-EMS09, ind-a1-EMS13, ind-c1-EMS04, ind-c1-EMS08 e ind-c1-EMS09. En otra realización, el alelo mutante deriva de una planta de una especie de Brassica, preferentemente de una especie de cultivo de Brassica o una especie de semilla oleosa de Brassica. En todavía un aspecto adicional, se proporciona una proteína IND mutante codificada por los alelos IND mutantes de la invención.

Incluso en un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para identificar un alelo IND mutante según la invención en una muestra biológica que comprende determinar la presencia de una región específica de IND mutante en un ácido nucleico presente en la muestra biológica. En una realización, el procedimiento comprende además someter la muestra biológica a un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa usando un conjunto de al menos dos cebadores, estando dicho conjunto seleccionado del grupo que consiste en: un conjunto de cebadores, en el que uno de dichos cebadores reconoce específicamente la región flanqueante en 5' del alelo IND mutante y el otro de dichos cebadores reconoce específicamente la región flanqueante en 3' del alelo IND mutante, respectivamente; un conjunto de cebadores, en el que uno de dichos cebadores reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y el otro de dichos cebadores reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante; y un conjunto de cebadores, en el que uno de dichos cebadores reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y el otro de dichos cebadores reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante, respectivamente. El cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante puede consistir en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante o del complementario del mismo, respectivamente, o el cebador que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante puede consistir en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de mutación del alelo IND mutante o del complementario del mismo, o el cebador que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante puede consistir en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o del complementario del mismo, en el que dichos 17 a 200 nucleótidos consecutivos no derivan exclusivamente de la mutación o las secuencias flanqueantes. El cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante puede comprender en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante o del complementario del mismo, respectivamente, o el cebador que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante puede comprender en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de mutación del alelo IND mutante o del complementario del mismo, o el cebador que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante puede comprender en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o del complementario del mismo, en el que dichos 17 nucleótidos consecutivos localizados en 3' no derivan exclusivamente de la mutación o las secuencias flanqueantes. En otra realización adicional, el procedimiento comprende además someter la muestra biológica a un ensayo de hibridación usando un conjunto de sondas específicas que comprenden al menos una sonda específica, estando dicho conjunto seleccionado del grupo que consiste en: un conjunto de sondas específicas, en el que una de dichas sondas reconoce específicamente la región flanqueante en 5' del alelo IND mutante y la otra de dichas sodas reconoce específicamente la región flanqueante en 3' del alelo IND mutante; un conjunto de sondas específicas, en el que una de dichas sondas reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y la otra de dichas sondas reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante; un conjunto de sondas específicas, en el que una de dichas sondas reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y la otra de dichas sondas reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante, respectivamente; y una sonda específica que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante. La sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante puede consistir en una secuencia de nucleótidos de 13 a 1.000 nucleótidos consecutivos seleccionados de la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante o del complementario del mismo, respectivamente, o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80 % con el mismo, o la sonda que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante puede consistir en una secuencia de nucleótidos de 13 a 1.000 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de mutación del alelo IND mutante o del complementario del mismo, o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80 % con el mismo, o la sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante puede consistir en una secuencia de nucleótidos de 13 a 1.000 nucleótidos consecutivos seleccionados de una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o del complementario del mismo, respectivamente, en el que dichos 13 a 1.000 nucleótidos consecutivos no derivan exclusivamente de la mutación o las secuencias flanqueantes o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80 % con el mismo. La sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante puede comprender una secuencia de nucleótidos de al menos 13 nucleótidos consecutivos seleccionados de la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante o del complementario del mismo, respectivamente, o la sonda que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante puede comprender una secuencia de nucleótidos de al menos 13 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de mutación del alelo IND mutante o del complementario del mismo, o la sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante puede comprender una secuencia de nucleótidos de al menos 13 nucleótidos consecutivos seleccionados de una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o del complementario del mismo, respectivamente, en el que dichos al menos 13 nucleótidos consecutivos no derivan exclusivamente de la mutación o las secuencias flanqueantes. En otra realización particular, la región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 a 929 o de 931 a 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 930 de SEQ ID NO: 5 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 930 o del 930 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; la región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 995 o del 997 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 996 de SEQ ID NO: 5 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 996 o del 996 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; o la región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 1035 o del 1037 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 1036 de SEQ ID NO: 5 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 1036 o del 1036 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; o la región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 902 o del 904 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 903 de SEQ ID NO: 7 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 903 o del 903 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; o la región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 910 o del 912 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 911 de SEQ ID NO: 7 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 911 o del 911 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; o la región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 919 o del 921 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 920 de SEQ ID NO: 7 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 920 o del 920 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente. El conjunto de sondas se puede seleccionar del grupo que consiste en: un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 12; un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 14 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15; un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 18; un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21; un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 23 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 24; y un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 26 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 27.

En otro aspecto más, se proporciona un procedimiento para determinar el estado de cigosidad de un alelo IND mutante de acuerdo con la invención en una planta o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, que determina la presencia de un mutante y/o una región específica IND de tipo salvaje correspondiente en el ADN genómico de dicha planta, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma. En una realización, el procedimiento comprende además someter el ADN genómico de dicha planta, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, a un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa usando un conjunto de al menos dos o al menos tres cebadores, en el que al menos dos de dichos cebadores reconocen específicamente el alelo IND de tipo salvaje, estando dichos al menos dos cebadores seleccionados del grupo que consiste en: un primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y un segundo cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 3' o 5' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, respectivamente; un primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y un segundo cebador que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND de tipo salvaje; y un primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y un segundo cebador que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante de tipo salvaje, respectivamente; y en el que al menos dos de dichos cebadores reconocen específicamente el alelo IND mutante, estando dichos al menos dos cebadores seleccionados del grupo que consiste en: el primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y un segundo cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 3' o 5' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, respectivamente; el primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del mutante del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y un tercer cebador que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante; y el primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y un tercer cebador que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante, respectivamente. El cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje puede consistir en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje o del complementario del mismo, respectivamente; o los cebadores que reconocen específicamente la región de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje puede consistir en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje o del complementario del mismo, respectivamente; o los cebadores que reconocen específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje, puede consistir en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o salvaje o del complementario del mismo, respectivamente, en el que dichos 17 a 200 nucleótidos consecutivos no derivan exclusivamente de la región de mutación o de las secuencias flanqueantes. El cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje puede comprender en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos de 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje o del complementario del mismo, respectivamente; o los cebadores que reconocen específicamente la región de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje puede comprender en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos de 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje o del complementario del mismo, respectivamente; o los cebadores que reconocen específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje pueden comprender en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos de 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje o del complementario del mismo, respectivamente, en el que dichos 17 nucleótidos consecutivos localizados en 3' no derivan exclusivamente del sitio o región de mutación o de las secuencias flanqueantes. En aún una realización adicional, el procedimiento comprende además someter el ADN genómico de dicha planta, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, a un ensayo de hibridación usando un conjunto de al menos dos sondas específicas, en el que al menos una de dichas sondas específicas reconoce específicamente el alelo IND de tipo salvaje, dicha al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en: una primera sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo iNd mutante y de tipo salvaje, y una segundo sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 3' o 5' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, respectivamente; una primera sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y una segunda sonda que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND de tipo salvaje; una primera sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y una segunda sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante de tipo salvaje, respectivamente; y una sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante; y en el que al menos una de dichas sondas específicas reconoce específicamente el alelo IND mutante, dicha al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en: la primera sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y la segunda sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 3' o 5' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, respectivamente; la primera sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del mutante del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y una tercera sonda que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante; la primera sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y una tercera sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante; y una sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante. La sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje puede consistir en una secuencia de nucleótidos de 13 a 1.000 nucleótidos consecutivos seleccionados de la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje o del complementario del mismo, respectivamente, o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la misma, o la sonda que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje puede consistir en una secuencia de nucleótidos de 13 a 1.000 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de la región de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje, respectivamente, o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la misma, o la sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje puede consistir en una secuencia de nucleótidos 13 a 1.000 nucleótidos consecutivos seleccionados de una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje, respectivamente, o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la misma, en el que dichos 13 a 1.000 nucleótidos consecutivos no derivan exclusivamente del sitio o región de mutación o de las secuencias flanqueantes. La sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje puede comprender una secuencia de nucleótidos de al menos 13 nucleótidos consecutivos seleccionados de la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje o del complementario del mismo, respectivamente, o la sonda que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje puede comprender una secuencia de nucleótidos de al menos 13 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje del complementario del mismo, o la sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje puede comprender una secuencia de nucleótidos de al menos 13 nucleótidos consecutivos seleccionados de una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o de tipo salvaje del complementario del mismo, respectivamente, en el que dichos al menos 13 nucleótidos consecutivos no derivan exclusivamente de la mutación o las secuencias flanqueantes. La región flanqueante en 5' o 3' puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 929 o del 931 al 1.622 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación del alelo IND de tipo salvaje puede tener la secuencia de nucleótidos del nucleótido 930 de la SEQ ID NO: 5 o de la complementaria de del mismo; dicha región de mutación del alelo IND mutante puede tener la secuencia a o la complementaria de la misma; dicha región de unión del alelo IND de tipo salvaje puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 del nucleótido 1 al 930 o del 930 al 1622 o de la complementaria de la misma, respectivamente; y dicha región de unión del alelo IND mutante puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 del nucleótido 1 al 929 seguido de a o a seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 931 al 1622 o de la complementaria del mismo, respectivamente; o la región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 995 o del 997 al 1622 0 la complementaria del mismo, respectivamente; dicha región de mutación del alelo IND de tipo salvaje puede tener la secuencia de nucleótidos del nucleótido 996 de la SEQ ID NO: 5 o de la complementaria de del mismo; dicha región de mutación del alelo IND mutante puede tener la secuencia a o la complementaria de la misma; y dicha región de unión del alelo IND de tipo salvaje puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 del nucleótido 1 al 996 o del 996 al 1622 o de la complementaria de la misma, respectivamente; y dicha región de unión del alelo IND mutante puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 del nucleótido 1 al 995 seguido de a o a seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 997 al 1622 o de la complementaria del mismo, respectivamente; o la región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 1035 o del 1037 al 1622 o la complementaria del mismo, respectivamente; dicha región de mutación del alelo IND de tipo salvaje puede tener la secuencia de nucleótidos del nucleótido 1036 de la SEQ ID NO: 5 o de la complementaria de del mismo; dicha región de mutación del alelo IND mutante puede tener la secuencia t o la complementaria de la misma; y dicha región de unión del alelo IND de tipo salvaje puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 del nucleótido 1 al 1036 o del 1036 al 1622 o de la complementaria de la misma, respectivamente; y dicha región de unión del alelo IND mutante puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 del nucleótido 1 al 1035 seguido de t o t seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1037 al 1622 o de la complementaria del mismo, respectivamente; o la región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 902 o del 904 al 1593 o la complementaria de la misma, respectivamente; dicha región de mutación del alelo IND de tipo salvaje puede tener la secuencia de nucleótidos del nucleótido 903 de la SEQ ID NO: 7 o de la complementaria de la misma; dicha región de mutación del alelo IND mutante puede tener la secuencia t o la complementaria de la misma; y dicha región de unión del alelo IND de tipo salvaje puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 del nucleótido 1 al 903 o del 903 al 1593 o de la complementaria de la misma, respectivamente; y dicha región de unión del alelo IND mutante puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 del nucleótido 1 al 902 seguido de t o t seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 904 al 1593 o de la complementaria del mismo, respectivamente; o la región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 910 o del 912 al 1593 o la complementaria de la misma, respectivamente; dicha región de mutación del alelo IND de tipo salvaje puede tener la secuencia de nucleótidos del nucleótido 911 de la SEQ ID NO: 7 o de la complementaria de del mismo; dicha región de mutación del alelo IND mutante puede tener la secuencia a o la complementaria de la misma; y dicha región de unión del alelo IND de tipo salvaje puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 del nucleótido 1 al 911 o del 911 al 1593 o de la complementaria de la misma, respectivamente; y dicha región de unión del alelo IND mutante puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 del nucleótido 1 al 910 seguido de a o a seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 912 al 1593 o de la complementaria del mismo, respectivamente; o la región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 919 o del 921 al 1593 o la complementaria de la misma, respectivamente; dicha región de mutación del alelo IND de tipo salvaje puede tener la secuencia de nucleótidos del nucleótido 920 de la SEQ ID NO: 7 o de la complementaria de del mismo; dicha región de mutación del alelo IND mutante puede tener la secuencia t o la complementaria de la misma; y dicha región de unión del alelo IND de tipo salvaje puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 920 o del 920 al 1.593 o de la complementaria de la misma, respectivamente; y dicha región de unión del alelo IND mutante puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 del nucleótido 1 al 919 seguido de t o t seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 921 al 1593 o de la complementaria del mismo, respectivamente. Adecuado es un conjunto de al menos tres sondas específicas seleccionadas del grupo que consiste en: un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO:11, una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 12 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13; un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO:14, una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 16; un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO:17, una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 18 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19; un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO:20, una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 22; un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO:23, una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 24 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 25; y un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO:26, una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 27 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 28.

También se proporcionan kits para identificar un alelo IND mutante de acuerdo con la invención en una muestra biológica y kits para determinar el estado de cigosidad de un alelo IND mutante de acuerdo con la invención en una planta o célula, parte, semilla o progenie de la misma, que comprende los cebadores o sondas como se ha descrito anteriormente. También se describen procedimientos para combinar los alelos IND mutantes de acuerdo con la invención en una planta, procedimientos para transferir los alelos IND mutantes de acuerdo con la invención de una planta a otra planta, y procedimientos para hacer una planta o semilla (híbrida) según la invención.

En otra realización de la invención, los alelos IND mutantes de la invención se usan para aumentar el rendimiento de semillas o granos cosechados de plantas de Brassica. El aumento del rendimiento puede ser una consecuencia de la reducción o retraso del desgranado de las semillas, pero también puede ser independiente del desgranado de semillas reducido o retrasado. En particular, se describen plantas de Brassica que comprenden al menos dos genes IND, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, caracterizado porque estas plantas comprenden en su genoma dos alelos IND homocigotos mutantes como se describe en el presente documento.

Definiciones generales

"Aumento de la resistencia al desgranado de las vainas" y "reducción del desgranado de las semillas", tal como se usan en el presente documento, se refiere a una disminución de la tendencia al desgranado de semillas y/o un retraso en el momento del desgranado de semillas, en particular hasta después de la cosecha, de plantas de Brassica, cuyos frutos normalmente no maduran de forma síncrona, sino secuencialmente, de modo que algunas vainas se abren y desgranan sus semillas antes o durante la cosecha. El nivel de resistencia al desgranado de las vainas se correlaciona positivamente y, por ejemplo, puede medirse determinando la fuerza necesaria para romper las vainas en la "prueba de separación por tracción" (Davies y Bruce, 1997, J Mat Sci 32: 5895-5899; Morgan y col., 1998, Fields Crop Research 58, 153-165), el número de vainas intactas restantes después de, por ejemplo, 20 segundos ("IP20"; Morgan y col., 1998, citado anteriormente), 9,7 o 17 segundos (Bruce y col., 2002, Biosystems Eng 81 (2): 179-184) en una "prueba de impacto aleatorio", la semivida de la muestra de vainas (en lo sucesivo, también denominada "LD50") en una prueba de impacto aleatorio, es decir, el tiempo de tratamiento necesario para provocar la apertura del 50 % de las vainas en las muestras de vainas analizadas y la "puntuación de campo para el desgranado" (Morgan y col., 1998, citado anteriormente). Bruce y col., 2002 (citado anteriormente, Morgan y col., 1998 (citado anteriormente y los ejemplos siguientes han descrito pruebas de impacto aleatorias (RIT) y algoritmos para definir la semivida de la muestra de vainas en tales RIT. Brevemente, se coloca una muestra de vainas maduras intactas en un tambor cerrado junto con bolas de acero y el tambor se agita enérgicamente durante períodos de tiempo crecientes (por ejemplo, 10 s, 20 s, 40 s, 80 s). Después de cada período, se abre el tambor y se cuenta el número de vainas rotas y dañadas. La estimación más precisa del nivel de resistencia al desgranado para cada línea se calcula ajustando una curva lineal x lineal a todos los datos disponibles y estimando el tiempo necesario para romper la mitad de las vainas dentro de una muestra ("semivida de la muestra de vainas "o" LD50 "). Sin embargo, es importante que las vainas se abran principalmente a lo largo de la zona de dehiscencia y no simplemente se pulverizan, como puede ocurrir con vainas indehiscentes.

Un "aumento agronómicamente relevante de la resistencia al desgranado de vainas", tal como se usan en el presente documento, se refiere a un aumento de la resistencia al desgranado de vainas en una planta que resulta en pérdidas de rendimiento relacionadas con el desgranado de vainas en el campo (antes de la cosecha) por debajo de las observadas normalmente para esa planta en el campo. Para la colza, se informa de que las pérdidas de rendimiento relacionadas con el desgranado de vainas en el campo son de aproximadamente el 11 % para una temporada con, de media, buenas condiciones de crecimiento y aproximadamente el 25 % para una temporada con, de media, malas condiciones de crecimiento. Se ha descubierto una correlación positiva entre estos niveles de pérdida de semillas y el nivel de pérdida de semillas a los 9,7 s y el tiempo de tratamiento de 17 s, respectivamente, en la prueba de impacto aleatorio descrita por Bruce y col., 2002 (Biosystems Eng 81 (2): 179-184). Como alternativa, para determinar si el nivel de resistencia al desgranado de vainas en una planta es agronómicamente relevante, la semivida de la muestra de vaina ("LD50", véase en lo que antecede) de la planta se puede comparar con la semivida de la muestra de vaina de una planta que se sabe que tiene un nivel promedio de resistencia al desgranado de la vaina, tal como, para colza, todas las variedades de colza comercialmente disponibles actualmente.

Como se emplea en el presente documento, "mal desgranado de vainas o semillas" o "dehiscencia de frutas o vainas" se refiere a un procedimiento que tiene lugar en una fruta después de la maduración de las semillas, por lo que las válvulas se desprenden del tabique central liberando las semillas. La región que se rompe (es decir, la "zona de dehiscencia") recorre toda la longitud del fruto entre las válvulas y el replum (tabique externo). En la madurez, la "zona de dehiscencia" es esencialmente una capa de células no lignificadas entre una región de células lignificadas en la válvula y el replum. El desgranado se produce debido a la combinación del aflojamiento de la pared celular en la zona de dehiscencia y las tensiones establecidas por las propiedades mecánicas diferenciales de las células de secado en la silicua.

Un "fruto" de Brassica, tal como se usan en el presente documento, se refiere a un órgano de una planta de Brassica que se desarrolla a partir de un gineceo compuesto por carpelos fusionados, que, tras la fertilización, crece para convertirse en una "vaina (semilla)" o "silicua" que contiene las semillas en desarrollo. Una "vaina" ("semilla") o "silicua" de Brassica consiste en una pared de fruto (carpelo) que encierra dos lóbulos separados por el tabique. Las "zonas de dehiscencia" se desarrollan en los márgenes del carpelo adyacentes al tabique y se extienden a lo largo de la silicua. Las células de la zona de dehiscencia eventualmente comienzan a degradarse y esto debilita el contacto entre las paredes o válvulas del carpelo y el tabique. La pérdida de cohesión celular está confinada a las células de la zona de dehiscencia y es el resultado de la rotura de la lámina media (Meakin y Roberts, 1990, J Exp Bot 41, 995-1011).

"Zonas de dehiscencia", tal como se usan en el presente documento, se refiere a capas de simples, células parenquimatosas, contenidas en las suturas situadas a ambos lados de la vaina bivalva de plantas, en particular plantas de Brassica. Las zonas de dehiscencia están situadas entre el borde de la valva de la vaina y un replum central que contiene el haz vascular principal del pedúnculo o pedicelo. La disociación de las células en la zona de dehiscencia tiene lugar durante la senescencia de las vainas y se completa cuando las vainas alcanzan la madurez completa (Meakin y Roberts, 1990, citado anteriormente). Se puede producir separación de la valva. La zona de dehiscencia contiene trazas vasculares, que pasan de la pared de la vaina al pedicelo (tallo) y el replum. El procedimiento de degradación de la vaina se lleva a cabo solo después de que la fuerza externa fractura los delicados hilos vasculares, permitiendo que las valvas se separen y las semillas caigan al suelo. Esto ocurre durante la perturbación de la canopia, por ejemplo por contacto con la cosechadora durante la cosecha. El tejido vascular contiene células lignificadas engrosadas, que forman los grupos de células colenquimatosas que se encuentran adyacentes a las células conductoras (Meakin y Roberts, 1990, citado anteriormente). Esto proporciona rigidez al tejido y, presumiblemente, cierta resistencia a la fractura.

Como se emplea en el presente documento, "una capacidad de trillado agronómicamente relevante" se refiere a la resistencia de una vaina, particularmente una vaina de colza, a la abertura a lo largo de la zona de dehiscencia de la vaina con la liberación concurrente de las semillas, tras la aplicación de fuerzas físicas que permiten la apertura completa de las vainas mientras previenen el daño a las semillas, como se usan, por ejemplo, en una cosechadora combinada. Se ha descubierto una correlación positiva entre la semivida de una muestra de vaina ("LD50") en una prueba de impacto aleatorio y su capacidad de trillado. Las semividas de la muestra de vainas de colza, según lo determinado en un RIT realizado como se describe en los Ejemplos, que corresponden a la capacidad de trillado agronómicamente relevante, no debe exceder los 80 segundos. Los valores típicos de la semivida de la muestra para las líneas de control de variedades de colza comercialmente disponibles son aproximadamente 10 segundos. Por tanto, las líneas con resistencia al desgranado de vainas significativamente aumentada con capacidad de trillado agronómicamente relevante tienen una semivida de la muestra de vainas en RIT entre aproximadamente 10 y aproximadamente 80 segundos, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 70 segundos, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 70 segundos, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 segundos, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 segundos, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 60 segundos, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 50 segundos, entre aproximadamente 40 y aproximadamente 60 segundos, de aproximadamente 57 segundos.

"Planta de semillas dehiscentes" significa una planta que produce un fruto seco dehiscente, que tiene paredes de fruto que se abren para permitir el escape de las semillas que contiene. Los frutos dehiscentes habitualmente contienen varias semillas e incluyen las frutas conocidas, por ejemplo, como legumbres, cápsulas y silicuas.

"Planta de cultivo" se refiere a especies de plantas cultivadas como cultivo, tal como Brassica napus (AACC, 2n = 38), Brassica júncea (AABB, 2n=36), Brassica carinata (BBCC, 2n=34), Brassica rapa (syn. B. campestris) (AA, 2n=20), Brassica oleracea (CC, 2n=18) o Brassica nigra (BB, 2n=16). La definición no abarca las malezas, tal como Arabidopsis thaliana.

La expresión "secuencia de ácido nucleico" (o molécula de ácido nucleico) se refiere a una molécula de ADN o ARN en forma monocatenaria o bicatenaria, particularmente un ADN que codifica una proteína o fragmento de proteína de acuerdo con la invención. Una "secuencia de ácido nucleico endógeno" se refiere a una secuencia de ácido nucleico dentro de una célula vegetal, por ejemplo, un alelo endógeno de un gen IND presente en el genoma nuclear de una célula de Brassica. Una "secuencia de ácido nucleico aislada" se utiliza para hacer referencia a una secuencia de ácido nucleico que ya no está en su entorno natural, por ejemplo in vitro o en una célula huésped bacteriana o vegetal recombinante.

El término "gen" significa una secuencia de ADN que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN (por ejemplo, en un pre-ARNm, que comprende secuencias de intrones, que luego se cortan y empalman en un ARNm maduro, o directamente en un ARNm sin secuencias de intrones) en una célula, unido operativamente a regiones reguladoras (por ejemplo, un promotor). Por lo tanto, un gen puede comprender varias secuencias unidas operativamente, tal como un promotor, una secuencia líder en 5' que comprende, por ejemplo, secuencias involucradas en el inicio de la traducción, una región codificante (de proteínas) (ADNc o ADN genómico) y una secuencia en 3' no traducida que comprende, por ejemplo, sitios de terminación de la transcripción. "Gen endógeno" se utiliza para diferenciarse de un "gen extraño", "transgén" o "gen quimérico", y se refiere a un gen de una planta de un determinado género vegetal, especie o variedad, que no se ha introducido en esa planta por transformación (es decir, no es un "transgén"), pero que normalmente está presente en plantas de ese género, especie o variedad, o que se introduce en esa planta a partir de plantas de otro género vegetal, especie o variedad, en el que normalmente está presente, por técnicas normales de reproducción o por hibridación somática, por ejemplo, por fusión de protoplastos. De manera similar, un "alelo endógeno" de un gen no se introduce en una planta o tejido vegetal mediante transformación vegetal, pero es, por ejemplo, generado por mutagénesis y/o selección de plantas u obtenido mediante el rastreo de poblaciones naturales de plantas.

"Expresión de un gen" o "expresión génica" se refiere al procedimiento en el que una región de ADN, que está unida operativamente a las regiones reguladoras apropiadas, particularmente un promotor, se transcribe en una molécula de ARN. La molécula de ARN se procesa luego (por procedimientos postranscripcionales) dentro de la célula, por ejemplo, por corte y empalme de ARN e inicio de traducción y traducción en una cadena de aminoácidos (proteína), y terminación de la traducción por codones de terminación de la traducción. La expresión "funcionalmente expresado" se usa en el presente documento para indicar que se produce una proteína funcional; la expresión "no expresado funcionalmente" para indicar que se produce una proteína con funcionalidad significativamente reducida o sin funcionalidad (actividad biológica) o que no se produce proteína (véase más adelante).

El término "proteína" se refiere a una molécula que consiste en una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo de acción específico, el tamaño, estructura tridimensional u origen. Un "fragmento" o "porción" de una proteína puede, por tanto, seguir denominándose "proteína". Una "proteína aislada" se usa para hacer referencia a una proteína que ya no está en su ambiente natural, por ejemplo in vitro o en una célula huésped bacteriana o vegetal recombinante. Los "aminoácidos" son los principales bloques componentes de las proteínas y enzimas. Se incorporan a las proteínas mediante ARN de transferencia de acuerdo con el código genético, mientras que los ribosomas decodifican el ARN mensajero. Durante y después del ensamblaje final de una proteína, el contenido de aminoácidos dicta las propiedades espaciales y bioquímicas de la proteína o enzima. La cadena principal de aminoácidos determina la secuencia primaria de una proteína, pero la naturaleza de las cadenas laterales determina las propiedades de la proteína. "Aminoácidos similares", tal como se usan en el presente documento, se refiere a aminoácidos que tienen cadenas laterales de aminoácidos similares, es decir, aminoácidos que tienen cadenas laterales polares, no polares o prácticamente neutras. "Aminoácidos no similares", tal como se usa en el presente documento, se refiere a aminoácidos que tienen diferentes cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo, un aminoácido con una cadena lateral polar no es similar a un aminoácido con una cadena lateral no polar. Las cadenas laterales polares generalmente tienden a estar presentes en la superficie de una proteína donde pueden interaccionar con el ambiente acuoso que se encuentra en las células (aminoácidos "hidrofílicos"). Por otro lado, los aminoácidos "no polares" tienden a residir dentro del centro de la proteína donde pueden interaccionar con vecinos no polares similares (aminoácidos "hidrofóbicos"). Ejemplos de aminoácidos que tienen cadenas laterales polares son arginina, asparagina, aspartato, cisteína, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina (todos hidrofílicos, excepto la cisteína, que es hidrofóbica). Ejemplos de aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares son alanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina y triptófano (todos hidrofóbicos, excepto la glicina que es neutra).

La expresión "factor de transcripción" se utiliza para referirse a una proteína que consiste en al menos dos dominios discretos, un dominio de unión al ADN y un dominio de activación o represión, que operan juntos para modular la tasa de iniciación de la transcripción a partir de los promotores de genes diana (Ptashne, 1988, Nature 335, 683-689). El término "factor de transcripción del dominio de hélice-bucle-hélice básico (bHLH)" se utiliza para referirse a un factor de transcripción que comprende, aparte del dominio de unión a ADN de bHLH (Heim y col., 2003, Mol Biol Evol 20, 735-747; Toledo-Ortiz y col., 2003, Plant Cell 15, 1749-1770), dominios que se sabe que son importantes para la regulación de la expresión génica que pueden conservarse a nivel de aminoácidos en proteínas relacionadas de diferentes especies (Quong y col., 1993, Mol Cell Biol 13, 792-800). Los reguladores de la transcripción que comprenden un dominio bHLH se unen al ADN a través de restos en la región básica, mientras que el dominio hélicebucle-hélice promueve la dimerización, permitiendo que los miembros de la familia formen hetero u homodímeros (Murre y col., 1989, Cell 56, 777-783).

El término "gen /ND" se refiere en el presente documento a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína INDEHISCENTE (IND), que es un factor básico de transcripción del dominio hélice-bucle-hélice (bHLH) requerido para la dispersión de semillas (Liljegren y col., 2004, Cell 116: 843-853).

Como se emplea en el presente documento, el término "alelo(s)" significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus particular. En una célula diploide (o anfidiploide) de un organismo, los alelos de un gen dado se encuentran en una ubicación específica o locus (loci plural) en un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos.

Como se emplea en el presente documento, la expresión "cromosomas homólogos" significa cromosomas que contienen información para las mismas características biológicas y contienen los mismos genes en los mismos loci pero posiblemente diferentes alelos de esos genes. Los cromosomas homólogos son cromosomas que se emparejan durante la meiosis. "Cromosomas no homólogos", que representan todas las características biológicas de un organismo, forman un conjunto, y el número de conjuntos en una celda se llama ploidía. Los organismos diploides contienen dos conjuntos de cromosomas no homólogos, en los que cada cromosoma homólogo se hereda de un padre diferente. En especies anfidiploides, existen esencialmente dos conjuntos de genomas diploides, por lo que los cromosomas de los dos genomas se denominan "cromosomas homólogos" (y, de manera similar, los loci o genes de los dos genomas se denominan loci o genes homólogos). Una especie vegetal diploide o anfidiploide puede comprender una gran cantidad de alelos diferentes en un locus particular.

Como se emplea en el presente documento, el término "heterocigoto" significa una condición genética que existe cuando dos alelos diferentes residen en un locus específico, pero se posicionan individualmente en pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula. A la inversa, tal como se usa en el presente documento, el término "homocigoto" significa una condición genética que existe cuando dos alelos idénticos residen en un locus específico, pero se posicionan individualmente en pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula.

Como se emplea en el presente documento, el término "locus" (loci plural) significa un lugar o lugares específicos o un sitio en un cromosoma donde, por ejemplo, se encuentra un gen o marcador genético. Por ejemplo, el "locus IND-A1" se refiere a la posición en un cromosoma del genoma A donde se puede encontrar el gen IND-A1 (y dos alelos IND-A1), mientras que el "locus IND-C1" se refiere a la posición en un cromosoma del genoma C donde se puede encontrar el gen IND-C1 (y dos alelos IND-C1).

Siempre que se haga referencia a una "planta" o "plantas" según la invención, se entiende que el presente documento también abarca partes de plantas (células, tejidos u órganos, vainas de semillas, semillas, partes cortadas, tales como raíces, hojas, flores, polen, etc.), progenie de las plantas que conservan las características distintivas de los padres (especialmente las propiedades de dehiscencia del fruto), tales como semillas obtenidas por autofecundación o cruzamiento, por ejemplo, semilla híbrida (obtenida cruzando dos líneas parentales endogámicas), plantas híbridas y partes de plantas derivadas de las mismas, a menos que se indique de otro modo.

Un "ensayo molecular" (o prueba) se refiere en el presente documento a un ensayo que indica (directa o indirectamente) la presencia o ausencia de uno o más alelos IND particulares en uno o ambos loci IND (por ejemplo, en uno o ambos loci IND-A1 o IND-C1). En una realización, permite determinar si un alelo IND particular (tipo salvaje o mutante) es homocigoto o heterocigoto en el locus en cualquier planta individual.

"Tipo salvaje" (también escrito "de tipo salvaje" o "tipo salvaje"), tal como se usa en el presente documento, se refiere a una forma típica de una planta o un gen como se produce más habitualmente en la naturaleza. Una "planta de tipo salvaje" se refiere a una planta con el fenotipo más habitual de dicha planta en la población natural. Un "alelo de tipo salvaje" se refiere a un alelo de un gen requerido para producir el fenotipo de tipo salvaje. Por el contrario, una "planta mutante" se refiere a una planta con un fenotipo raro diferente de dicha planta en la población natural o producida por intervención humana, por ejemplo, por mutagénesis, y un "alelo mutante" se refiere a un alelo de un gen requerido para producir el fenotipo mutante.

Como se emplea en el presente documento, el término "IND de tipo salvaje" (por ejemplo, IND-A1 o IND-C1 de tipo salvaje) significa un alelo IND de origen natural que se encuentra dentro de las plantas, en particular plantas de Brassicacea, especialmente plantas de Brassica, que codifica una proteína IND funcional (por ejemplo, un IND-A1 o IND-C1 funcional, respectivamente). Por el contrario, el término "IND mutante" (por ejemplo, mutante IND-A1 o IND-C1), como se usa en el presente documento, se refiere a un alelo IND, que no codifica una proteína IND funcional, es decir, un alelo IND que codifica una proteína IND no funcional (por ejemplo, una IND-A1 o IND-C1 no funcional, respectivamente), que, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína IND que no tiene actividad biológica o una actividad biológica significativamente reducida en comparación con la proteína IND funcional de tipo salvaje correspondiente, o que no codifica ninguna proteína IND en absoluto. Un alelo IND mutante "defectivo completo" o "nulo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un alelo IND mutante, que codifica una proteína IND que no tiene actividad biológica en comparación con la proteína IND funcional de tipo salvaje correspondiente o que no codifica ninguna proteína en absoluto. Tal como un "alelo IND mutante defectivo completo" es, por ejemplo, un alelo IND de tipo salvaje, que comprende una o más mutaciones en su secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, una o más mutaciones sin sentido o de sentido erróneo. En particular, dicho alelo IND mutante defectivo completo es un alelo IND de tipo salvaje, que comprende una mutación que, preferentemente, da como resultado la producción de una proteína IND que carece de al menos un dominio funcional, tal como el dominio de activación, el dominio de unión al ADN y/o el dominio de dimerización, o que carece de al menos un aminoácido crucial para su función, tal como un aminoácido crucial para la unión al ADN, por ejemplo, la arginina en la posición 127 en la SEQ ID NO: 2 o en la posición 140 en la SEQ ID NO:4 y similares, o la glutamina en la posición 122 en la SEQ ID NO: 2 o en la posición 135 en la SEQ ID NO: 4 y similares, de forma tal que la actividad biológica de la proteína IND está completamente anulada o de modo que la(s) mutación(Es) dan como resultado, preferentemente, la ausencia de producción de una proteína IND. Un alelo IND mutante "defectivo parcial", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un alelo IND mutante, que codifica una proteína IND que tiene una actividad biológica significativamente reducida en comparación con la proteína IND funcional de tipo salvaje correspondiente. Tal "alelo IND mutante defectivo parcial" es,, por ejemplo, una alelo IND de tipo salvaje, que comprende una o más mutaciones en su secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, una o más mutaciones de sentido erróneo. En particular, dicho alelo IND mutante defectivo parcial es un alelo IND de tipo salvaje, que comprende una mutación que, preferentemente, da como resultado la producción de una proteína IND en la que al menos un aminoácido conservado y/o funcional está sustituido por otro aminoácido, tal que la actividad biológica se reduce significativamente pero no se elimina por completo. Tal alelo IND mutante defectivo total o parcial también puede codificar una proteína iNd negativa dominante, que es capaz de afectar negativamente a la actividad biológica de otras proteínas IND dentro de la misma célula. Tal proteína IND negativa dominante puede ser una proteína IND que todavía es capaz de interaccionar con los mismos elementos que la proteína IND de tipo salvaje, pero bloquea algún aspecto de su función. Ejemplos de proteínas IND negativas dominantes son las proteínas IND que carecen del dominio de activación y/o dominio de dimerización o restos de aminoácidos específicos cruciales para la activación y/o dimerización, pero aún contienen el dominio de unión al ADN, de modo que no solo se reduce o elimina su propia actividad biológica, sino que reducen aún más la actividad total de IND en la célula al competir con las proteínas iNd de tipo salvaje y/o defectivas parciales presentes en la célula por los sitios de unión al ADN. Otros ejemplos de proteínas IND negativas dominantes son las proteínas IND que carecen del dominio de activación y/o el dominio de unión al ADN o los restos de aminoácidos específicos cruciales para la activación y/o la unión al ADN, pero aún contienen el dominio de dimerización, de modo que no solo se reduce o elimina su propia actividad biológica, sino que reducen aún más la actividad IND total en la célula produciendo dímeros proteicos que carecen de al menos un dominio funcional. Los alelos mutantes pueden ser secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína IND se designan como "ind" (por ejemplo, ind-a1 o ind-c1, respectivamente) en el presente documento. Los alelos mutantes pueden ser alelos "mutantes naturales", que son alelos mutantes encontrados en la naturaleza (por ejemplo, producidos espontáneamente sin la aplicación humana de mutágenos) o alelos "mutantes inducidos", que son inducidos por la intervención humana, por ejemplo, por mutagénesis.

Una "cantidad significativamente reducida de proteína IND funcional" (por ejemplo, proteína IND-A1 o IND-C1 funcional) se refiere a una reducción en la cantidad de una proteína IND funcional producida por la célula que comprende un alelo IND mutante en al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % (es decir, la célula no produce proteína IND funcional) en comparación con la cantidad de proteína IND funcional producida por la célula que no comprende el alelo IND mutante. Esta definición abarca la producción de una proteína IND "no funcional" (por ejemplo, proteína IND truncada) que no tiene actividad biológica in vivo, la reducción en la cantidad absoluta de la proteína iNd funcional (por ejemplo, no se produce proteína IND funcional debido a la mutación en el gen IND), la producción de una proteína IND con actividad biológica significativamente reducida en comparación con la actividad de una proteína IND de tipo salvaje funcional (tal como una proteína IND en la que uno o más restos de aminoácidos que son cruciales para la actividad biológica de la proteína IND codificada, como se ejemplifica a continuación, son sustituidos por otro resto de aminoácido) y/o el efecto adverso de las proteínas IND negativas dominantes sobre otras proteínas IND funcionales y/o parcialmente funcionales.

El término "proteína IND mutante", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína IND codificada por una secuencia de ácido nucleico IND mutante ("alelo ind ') mediante la cual la mutación da como resultado una actividad de IND significativamente reducida y/o nula in vivo, en comparación con la actividad de la proteína IND codificada por una secuencia IND no mutante, de tipo salvaje ("alelo IND").

"Mutagénesis", tal como se usa en el presente documento, se refiere al procedimiento en el que las células vegetales (por ejemplo, una pluralidad de semillas de Brassica u otras partes, tal como polen, etc.) se someten a una técnica que induce mutaciones en el ADN de las células, tal como el contacto con un agente mutagénico, tal como una sustancia química (tal como etilmetilsulfonato (EMS), etilnitrosourea (ENU), etc.) o radiación ionizante (neutrones (tal como en la mutagénesis de neutrones rápidos, etc.), rayos alfa, rayos gamma (tal como el suministrado por una fuente de cobalto 60), rayos X, radiación UV, etc.), o una combinación de dos o más de estos. Por tanto, la mutagénesis deseada de uno o más alelos IND puede lograrse mediante el uso de medios químicos tales como el contacto de uno o más tejidos vegetales con etilmetilsulfonato (EMS), etilnitrosourea, etc., mediante el uso de medios físicos, tales como rayos X, etc., o por radiación gamma, TAL como el suministrado por una fuente de cobalto 60. Si bien las mutaciones creadas por irradiación suelen ser deleciones grandes u otras lesiones grandes, tal como translocaciones o reordenamientos complejos, las mutaciones creadas por mutágenos químicos a menudo son lesiones más discretas, tales como mutaciones puntuales. Por ejemplo, el EMS alquila bases de guanina, lo que resulta en un mal emparejamiento de bases: una guanina alquilada se emparejará con una base de timina, lo que da como resultado principalmente transiciones de G/C a A/T. Después de la mutagénesis, las plantas de Brassica se regeneran a partir de las células tratadas utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, las semillas de Brassica resultantes se pueden plantar de acuerdo con los procedimientos de cultivo convencionales y después de la autopolinización se forma la semilla en las plantas. Como alternativa, las plántulas haploides duplicadas se pueden extraer para formar inmediatamente plantas homocigotas, por ejemplo, como describen Coventry y col., (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. de Guelph, Guelph, Ontario, Canadá). La semilla adicional que se forma como resultado de tal autopolinización en el presente o en una generación posterior puede cosecharse y seleccionarse para detectar la presencia de alelos IND mutantes. Se conocen varias técnicas para detectar alelos mutantes específicos, por ejemplo, Deleteagene™ (Delete-a-gene; Li y col., 2001, Plant J 27: 235-242) utiliza ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar mutantes por deleción generadas por mutagénesis de neutrones rápidos, TILLING (lesiones locales inducidas dirigidas en genomas; McCallum y col., 2000, Nat Biotechnol 18: 455-457) identifica mutaciones puntuales inducidas por EMS, etc. En los ejemplos siguientes se describen técnicas adicionales para detectar la presencia de alelos IND mutantes específicos.

Como se emplea en el presente documento, la expresión "de origen no natural" o "cultivado" cuando se usa en referencia a una planta, significa una planta con un genoma que ha sido modificado por el hombre. Una planta transgénica, por ejemplo, es una planta de origen no natural que contiene una molécula de ácido nucleico exógena, por ejemplo, un gen quimérico que comprende una región transcrita que cuando se transcribe produce una molécula de ARN biológicamente activa capaz de reducir la expresión de un gen endógeno, tal como un gen IND y, por tanto, ha sido genéticamente modificado por el hombre. Además, una planta que contiene una mutación en un gen endógeno, por ejemplo, una mutación en un gen IND endógeno, (por ejemplo, en un elemento regulador o en la secuencia de codificación) como resultado de una exposición a un agente mutagénico también se considera una planta no natural, ya que ha sido genéticamente modificado por el hombre. Asimismo, una planta de una especie particular, tal como Brassica napus, que contiene una mutación en un gen endógeno, por ejemplo, en un gen IND endógeno, que en la naturaleza no ocurre en esa especie de planta en particular, como resultado de, por ejemplo, procedimientos de reproducción dirigidos, tal como la reproducción y selección asistida por marcadores o la introgresión, con una planta de la misma u otra especie, tal como Brassica júncea o rapa, de esa planta también se considera una planta de origen no natural. Por el contrario, una planta que contiene solo mutaciones espontáneas o naturales, es decir, una planta que no ha sido genéticamente modificada por el hombre, no es una "planta que no es de origen natural" como se define en el presente documento y, por tanto, no está incluida en la invención. Un experto en la materia entiende que, mientras que una planta de origen no natural suele tener una secuencia de nucleótidos alterada en comparación con una planta de origen natural, una planta de origen no natural también puede ser modificada genéticamente por el hombre sin alterar su secuencia de nucleótidos, por ejemplo, modificando su patrón de metilación.

El término "ortólogo" de un gen o proteína se refiere en el presente documento al gen o proteína homólogo encontrado en otra especie, que tiene la misma función que el gen o la proteína, pero es (generalmente) divergente en secuencia desde el momento en que las especies que albergan los genes divergieron (es decir, los genes evolucionaron de un ancestro común por especiación). Por lo tanto, los ortólogos de los genes IND de Brassica napus pueden identificarse en otras especies de plantas (por ejemplo, Brassica júncea, etc.) según ambas comparaciones de secuencias (por ejemplo, en función de porcentajes de identidad de secuencia sobre la secuencia completa o sobre dominios específicos) y/o análisis funcional.

En el presente documento se usa una "variedad" de conformidad con el convenio de la UPOV y se refiere a una agrupación de plantas dentro de un taxón botánico único del rango más bajo conocido, agrupación que puede definirse por la expresión de las características resultantes de un genotipo dado o una combinación de genotipos, puede distinguirse de cualquier otra agrupación de plantas por la expresión de al menos una de dichas características y se considera como una unidad con respecto a su idoneidad para propagarse sin cambios (estable).

El término "que comprende" debe interpretarse como que especifica la presencia de las partes indicadas, etapas o componentes, pero no excluye la presencia de una o más partes adicionales, etapas o componentes. Una planta que comprende un determinado rasgo puede comprender así rasgos adicionales.

Se entiende que cuando se hace referencia a una palabra en singular (por ejemplo, planta o raíz), el plural también se incluye en el presente documento (por ejemplo, una pluralidad de plantas, una pluralidad de raíces). Por tanto, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "uno/a" no excluye la posibilidad de que haya más de uno de los elementos presentes, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "uno/una" normalmente significa "al menos uno/una".

Para los fines de la presente invención, la "identidad de secuencia" de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos relacionadas, expresado como un porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias óptimamente alineadas que tienen restos idénticos (x100) dividido por el número de posiciones comparadas. Un hueco, es decir, una posición en una alineación donde un resto está presente en una secuencia pero no en la otra, se considera como una posición con restos no idénticos. La "alineación óptima" de dos secuencias se encuentra alineando las dos secuencias en toda la longitud de acuerdo con el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J Mol Biol 48 (3): 443-53) en The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS, Rice y col., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277; véase, por ejemplo, http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) usando la configuración predeterminada (penalización por apertura de hueco = 10 (para nucleótidos)/10 (para proteínas) y penalización por extensión de hueco = 0,5 (para nucleótidos)/0,5 (para proteínas)). Para los nucleótidos, la matriz de puntuación predeterminada utilizada es EDNAFULL y para las proteínas, la matriz de puntuación predeterminada es EBLOSUM62.

"Sustancialmente idéntica" o "esencialmente similar", tal como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias, que, cuando se alinean de manera óptima como se ha definido anteriormente, comparten al menos un cierto porcentaje mínimo de identidad de secuencia (como se define más adelante).

Se pueden usar "condiciones de hibridación rigurosas" para identificar secuencias de nucleótidos, que son sustancialmente idénticas a una secuencia de nucleótidos dada. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan de modo que sean aproximadamente 5 °C menos que el punto de fusión térmica (Tf) para las secuencias específicas a un pH y fuerza iónica definidos. La Tf es la temperatura (a fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50 % de una secuencia objetivo complementaria hibrida con una sonda perfectamente emparejada. Normalmente, se elegirán condiciones rigurosas en las que la concentración de sal es de aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura es de al menos 60 °C. Disminuir la concentración de sal y/o aumentar la temperatura aumenta la rigurosidad. Las condiciones rigurosas para las hibridaciones de ARN-ADN (transferencias Northern usando una sonda de, por ejemplo, 100 nt) son, por ejemplo, aquellas que incluyen al menos un lavado en 0,2X SSC a 63 °C durante 20 minutos, o condiciones equivalentes.

Se pueden proporcionar "condiciones de alta rigurosidad", por ejemplo, por hibridación a 65 °C en una solución acuosa que contiene 6x SSC (20x SSC contiene NaCl 3,0 M, Na-citrato 0,3 M, pH 7,0), 5x Denhardt's (100X Denhardt's contiene 2 % de Ficoll, 2 % de polivinilpirrolidona, 2 % de seroalbúmina bovina, 0,5 % de dodecilsulfato de sodio (SDS) y 20 |jg/ml de ADN portador desnaturalizado (ADN de esperma de pescado monocatenario, con una longitud promedio de 120-3.000 nucleótidos) como competidor no específico. Después de la hibridación, el lavado de alta rigurosidad se puede realizar en varias etapas, con un lavado final (aproximadamente 30 minutos) a la temperatura de hibridación en 0,2-0,1X SSC, 0,1 % de SDS.

"Condiciones de rigurosidad moderada" se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en la solución descrita anteriormente pero a aproximadamente 60-62 °C. El lavado moderado riguroso se puede realizar a la temperatura de hibridación en 1x SSC, 0,1 % de SDS.

"Baja rigurosidad" se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en la solución descrita anteriormente a aproximadamente 50-52 °C. El lavado de baja rigurosidad se puede realizar a la temperatura de hibridación en 2x SSC, 0,1 % de SDS. Véase también Sambrook y col., (1989) y Sambrook y Russell (2001).

"Aumento del rendimiento cosechado" o "aumento del rendimiento de semillas o granos" se refiere a la mayor cantidad de semillas o granos cosechados de una pluralidad de plantas, comprendiendo cada uno alelos IND mutantes de acuerdo con la invención, en comparación con la cantidad de semilla o grano cosechada de un número similar de plantas isogénicas sin los alelos IND mutantes. El rendimiento generalmente se expresa en unidades de volumen de semilla cosechada por unidades de superficie, tales como fanegas/acre o kg/ha. El aumento de rendimiento generalmente se expresa en porcentaje, por lo que el rendimiento de la planta de referencia o control se denomina 100 % y el rendimiento de las plantas como se describe en el presente documento se expresa en % con respecto al rendimiento de la planta de control. Los aumentos de rendimiento observados en las plantas de Brassica, como se describe en el presente documento, variaron de al menos 101 % a al menos 124 % y se espera que sean factibles mayores aumentos de rendimiento. El aumento del rendimiento también puede variar del 104 % al 108 % o del 105 % al 110 %.

Descripción detallada

Como se describe en el documento WO09/068313 (que reivindica la prioridad de la solicitud de patente europea EP 07023052), antes se descubrió que las plantas Brassica napus, que son homocigotas para un alelo ind defectivo completo en solo uno de sus dos genes IND, es decir en IND-A1 o IND-C1, no mostró un aumento significativo en la resistencia al desgranado de vainas en comparación con las plantas de Brassica napus que no comprenden alelos IND mutantes, mientras que en plantas de Brassica napus, que eran homocigotas para un alelo ind efectivo completo en ambos genes IND, la resistencia al desgranado de las vainas aumentó significativamente, pero el nivel de resistencia al desgranado de la vaina era demasiado alto para mantener una capacidad de trillado agronómicamente relevante. Por el contrario, la resistencia al desgranado de la vaina se incrementó significativamente en plantas de Brassica napus que comprenden tres alelos ind defectivos completos de los dos genes IND de Brassica napus, a un nivel por el cual las plantas mantienen una capacidad de trillado agronómicamente relevante de las vainas.

Los inventores descubrieron sorprendentemente que las plantas de Brassica napus con un fenotipo de desgranado de vaina similar a las plantas de Brassica descritas en el documento WO09/068313 (que reivindica la prioridad de la solicitud de patente europea EP 07023052), es decir, que combinan una mayor resistencia al desgranado de vainas con una capacidad de trillado agronómicamente relevante de las vainas, también puede obtenerse combinando dos alelos IND mutantes defectivos parciales con dos alelos IND mutantes defectivos completos en lugar de combinar tres alelos IND mutantes defectivos completos. Se descubrió además que las mutaciones en el gen IND-C1 dieron como resultado un aumento más fuerte en la resistencia al desgranado de vainas que las mutaciones en el gen IND-A1. Un aumento más fuerte en la resistencia al desgranado de vainas en plantas de Brassica napus fue, por ejemplo, observado cuando los dos alelos IND mutantes defectivos completos eran alelos IND mutantes defectivos completos del gen IND-C1 y los dos alelos IND mutantes defectivos parciales eran alelos IND mutantes defectivos parciales del gen IND-A1 que cuando los dos alelos IND mutantes defectivos completos eran del gen IND-A1 y los alelos IND mutantes defectivos parciales eran del gen IND-C1. Sorprendentemente, las plantas de Brassica napus que combinan una mayor resistencia al desgranado de la vaina con una capacidad de trillado agronómicamente relevante de las vainas también se pueden obtener mediante la introducción de dos alelos IND mutantes defectivos parciales, en particular del gen IND-C1, solo.

Por tanto, en el presente documento se describe una planta de Brassica que comprende al menos dos genes IND, en particular una planta de Brassica napus que comprende un gen IND-A1 y/o un gen IND-C1, caracterizada por que comprende dos alelos IND mutantes defectivos parciales en su genoma, en particular de un gen IND-A1 y/o un gen IND-C1, preferentemente de un gen IND-C1, se describe en el presente documento, por lo que los alelos ind dan como resultado una cantidad significativamente reducida de proteína IND funcional del tipo codificado por el equivalente de tipo salvaje de estos alelos mutantes y, por lo tanto, una cantidad global reducida significativamente de las proteínas iNd funcionales producidas en las células vegetales, específicamente en las vainas de semillas en desarrollo, in vivo.

La planta de Brassica puede además comprender dos alelos IND mutantes defectivos completos en su genoma, en particular de un gen IND-C1 y/o un gen IND-A1, respectivamente, preferentemente de un gen IND-C1, tales como los descritos en el documento WO09/068313 (que reivindica prioridad de la solicitud de patente europea EP 07023052), por ejemplo, ind-a1-ems01, ind-a1-ems05, ind-c1-ems01 o ind-c1-ems03 y similares.

Se piensa que al combinar suficientes copias de alelos IND mutantes defectivos parciales específicos con copias suficientes de alelos IND mutantes defectivos completos y/o de tipo salvaje específicos en una planta, en particular una planta de Brassica, es posible ajustar la cantidad y/o el tipo de proteínas IND funcionales producidas, que a su vez influye en las propiedades de dehiscencia del fruto de la planta. Por lo tanto, la cantidad absoluta y relativa de las proteínas IND puede ajustarse de tal manera que proporcione plantas que produzcan suficientes proteínas IND para permitir una capacidad de trillado agronómicamente relevante de las vainas de las semillas mientras reduce el desgranado de las semillas antes o durante la cosecha.

También se describe en el presente documento una planta, en particular una planta de Brassica, que comprende al menos un alelo IND mutante defectivo parcial, que codifica una proteína IND parcialmente funcional, tal como las descritas más adelante, por ejemplo, ind-a1-ems06, ind-a1- ems09, ind-a1-ems13, ind-c1-ems04, ind-c1-ems08 o indc1-ems09, y similares, mientras que los alelos restantes pueden ser defectivos parciales, alelos IND defectivos completos y/o de tipo salvaje.

En el presente documento se describe una planta de Brassica que comprende al menos dos genes IND, en particular una planta de Brassica napus, que comprende dos alelos ind defectivos parciales y alelos ind defectivos completos de los dos genes IND en esa planta de Brassica, en particular de los genes Brassica napus IND-A1 y/o IND-C1, preferentemente el gen IND-C l, por lo que n < 2 (por ejemplo, n = 0, 1 o 2), de modo que al menos un alelo produce al menos una proteína IND funcional.

Se describe un único mutante IND homocigoto (n = 2, es decir, homocigoto para un alelo mutante defectivo parcial de un gen IND), y/o un mutante doble IND homocigoto- (n = 4, es decir, homocigoto para un alelo mutante defectivo completo y/o parcial de dos genes IND) de una planta de especie de Brassica que comprende al menos dos genes IND, en particular de Brassica napus, de modo que los alelos mutantes son alelos mutantes de los dos genes IND en esa planta de Brassica, en particular de los genes IND-A1 y/o IND-C1. Dichas plantas mutantes pueden usarse con fines de reproducción.

En el presente documento se describe una planta de Brassica napus con mutante IND defectivo parcial simple homocigota, en la que el genotipo de la planta se puede describir como ind-a1P/ind-a1P, IND-C1/IND-C1, o iND-A1/IND-A1, ind-c1P/ind-c1P. En el presente documento se describe una planta de Brassica napus mutante parcial doble homocigota, en la que el genotipo de la planta se puede describir como ind-a1P/ind-a1P, ind-c1P/ind-c1P. En el presente documento se describe una planta de Brassica napus mutante IND doble parcial y completa homocigota, en la que el genotipo de la planta se puede describir como o ind-a1F/ind-a1F, ind-c1P/ind-c1P o ind-a1P/ind-a1P, ind-c1F/ind-c1F.

Además se proporcionan en el presente documento nuevas secuencias de ácido nucleico de genes/alelos mutantes IND defectivos parciales de especies de Brassica, así como las proteínas IND mutantes defectivas parciales. También se describen procedimientos de generación y combinación de alelos IND mutantes defectivos parciales en plantas de Brassica, así como plantas de Brassica y partes de plantas que comprenden combinaciones específicas de alelos IND mutantes defectivos completos y parciales en su genoma, de modo que se reduce el desgranado de semillas se reduce en estas plantas. El uso de estas plantas para transferir alelos iNd mutantes defectivos parciales a otras plantas también se describe en el presente documento, como también los productos vegetales de cualquiera de las plantas descritas. Además, se proporcionan kits y procedimientos para la selección asistida por marcadores (MAS) para combinar o detectar genes y/o alelos IND. Cada una de las realizaciones de la invención se describe con detalle a continuación en el presente documento.

Las plantas de Brassica descritas en el presente documento que exhiben desgranado semillas reducido o retardado tienen un aumento en el rendimiento de la semilla cosechada. Sin embargo, se observó que no solo el rendimiento de semillas cosechado de las plantas de Brassica que comprende solo el alelo ind-c1-09 en estado homocigoto (que muestra un fenotipo de desgranado de semilla reducido o retardado observable), sino que también se puede describir el rendimiento de semillas cosechado de otras plantas de Brassica que comprenden los dos alelos IND mutantes en estado homocigoto, es decir, en el que el genotipo de la planta puede describirse como ind-a1P/ind-a1P, IND-C1/IND-C1, o IND- A1/IND-A1, ind-c1P/ind-c1P también aumentó significativamente, en comparación con las plantas de Brassica isogénicas que no comprenden los alelos IND mutantes, a pesar de la ausencia de un fenotipo de desgranado de semillas reducido o retrasado observable en las plantas de Brassica que comprende los alelos IND mutantes. También se describen plantas de Brassica que comprenden al menos dos genes IND, en las que al menos dos alelos producen una proteína IND funcional, plantas que tienen un rendimiento de semillas más alto. Quedará claro que los dos alelos mutantes en el locus IND-A o en el locus IND-C pueden ser el mismo alelo mutante o un alelo mutante diferente.

Secuenciación de ácido nucleico de acuerdo con la invención

Se proporcionan secuencias de ácido nucleico ind mutante defectivo parcial que codifican proteínas IND parcialmente funcionales, es decir, proteínas IND con una actividad biológica significativamente reducida (es decir, secuencias de ácido nucleico IND que comprenden una o más mutaciones, que dan como resultado una actividad biológica significativamente reducida de la proteína IND codificada) de genes IND de Brassicaceae, particularmente de especies de Brassica, especialmente de Brassica napus, pero también de otras especies de cultivos de Brassica. Por ejemplo, las especies de Brassica que comprenden un genoma A y/o C pueden comprender alelos de genes IND-A1 o IND-C1, que son esencialmente similares a los alelos IND mutantes defectivos parciales de la presente invención y que pueden identificarse y combinarse en una sola planta. Además, se pueden usar procedimientos de mutagénesis para generar mutaciones en alelos IND de tipo salvaje, generando de ese modo alelos ind mutantes esencialmente similares a los alelos IND mutantes defectivos parciales de la presente invención para su uso de acuerdo con la invención. Debido a que los alelos IND específicos se combinan preferentemente en una planta mediante cruzamiento y selección, las secuencias de ácido nucleico ind pueden proporcionarse dentro de una planta (es decir, endógenamente), por ejemplo, una planta de Brassica, preferentemente una planta de Brassica que puede cruzarse con Brassica napus o que puede usarse para hacer una planta de "sintética" de Brassica napus. La hibridación entre diferentes especies de Brassica se describe en la técnica, por ejemplo, como se hace referencia en Snowdon (2007, Chromosome research 15: 85 95). La hibridación interespecífica puede, por ejemplo, usarse para transferir genes de, por ejemplo, el genoma C en B. napus (AACC) al genoma C en B. carinata (BBCC), o incluso desde, por ejemplo, el genoma C en B. napus (AACC) al genoma B en B. juncea (AABB) (por el evento esporádico de recombinación ilegítima entre sus genomas C y B). Las líneas de Brassica napus "resintetizadas" o "sintéticas" se pueden producir cruzando los antepasados originales, B. oleracea (CC) y B. rapa (AA). Las barreras de incompatibilidad entre especies y entre géneros pueden superarse con éxito en cruzamientos entre especies de cultivos de Brassica y sus parientes, por ejemplo, mediante técnicas de rescate de embriones o fusión de protoplastos (véase, por ejemplo, Snowdon, anteriormente).

Sin embargo, en el presente documento también se proporcionan secuencias de ácido nucleico ind aisladas (por ejemplo, aisladas de la planta por clonación o hechas sintéticamente por síntesis de ADN), así como sus variantes y fragmentos de cualquiera de estos, ya que estos pueden usarse para determinar qué secuencia está presente endógenamente en una planta o parte de la planta, si la secuencia codifica una proteína funcional, parcialmente funcional, no funcional o ninguna proteína (por ejemplo, mediante expresión en una célula huésped recombinante como se describe a continuación) y para la selección y transferencia de alelos específicos de una planta a otra, para generar una planta que tenga la combinación deseada de alelos IND mutantes defectivos parciales y/o completos.

Se han aislado nuevas secuencias de ácido nucleico IND mutantes defectivos parciales IND-A1 e IND-C1de tipo salvaje de Brassica napus. Las secuencias IND de tipo salvaje como se describe en el documento WO09/068313 (que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052) se representan en las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7 del listado de secuencias, mientras que las novedosas secuencias ind mutantes de defectivos parciales de estas secuencias, y de secuencias esencialmente similares a estas, se describen en el presente documento a continuación y en los Ejemplos, con referencia a las secuencias IND de tipo salvaje. El ADN genómico que codifica la proteína IND de Brassica napus no comprende ningún intrón.

Las "secuencias de ácido nucleico IND-A1" o las "secuencias de ácido nucleico variante IND-A1" según la invención son secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 o secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1 o la SEC ID NO:5. Estas secuencias de ácido nucleico también pueden denominarse como "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias IND proporcionadas en el listado de secuencias.

Las "secuencias de ácido nucleico IND-C1" o las "secuencias de ácido nucleico variante IND-C1" según la invención son secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 (IND-C1-long) o con la SEQ ID NO: 4 desde el aminoácido en la posición 16 al aminoácido en la posición 210 (IND-C1-short) o secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 (IND-C1-long), con la SEQ ID NO: 3 desde el nucleótido en la posición 46 hasta el nucleótido en la posición 633 (IND-C1-short) o con SEQ ID NO:7. Estas secuencias de ácido nucleico también pueden denominarse como "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias IND proporcionadas en el listado de secuencias.

Por lo tanto, la invención proporciona nuevas secuencias de ácido nucleico mutante defectivo parcial de secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas IND-A1 e IND-C1 funcionales de tipo salvaje, incluyendo variantes y fragmentos de los mismos (como se define más adelante), por lo que la mutación en la secuencia de ácido nucleico resulta, preferentemente, en la inserción de uno o más aminoácidos, su deleción o sustitución eliminado o sustituido en comparación con la proteína IND de tipo salvaje, en particular en la sustitución de uno o más aminoácidos y por lo cual la actividad biológica de la proteína IND se reduce significativamente. Una reducción significativa en la actividad biológica de la proteína IND se refiere en el presente documento a una reducción en la actividad de unión al ADN, la capacidad de dimerización y/o la actividad reguladora de la transcripción de la proteína IND, tal que la resistencia al desgranado de la vaina de una planta que expresa la proteína IND mutante aumenta en comparación con una planta que expresa la proteína IND de tipo salvaje correspondiente.

Para determinar la funcionalidad de un alelo/proteína IND específico en plantas, particularmente en plantas de Brassica, el nivel de resistencia al desgranado de las vainas en las plantas se puede determinar mediante la realización de ensayos macroscópicos, microscópicos e histológicos en frutos y flores de las plantas que comprenden el alelo/proteína IND específico y de plantas de tipo salvaje correspondientes análogas a los ensayos realizados en frutos y flores de Arabidopsis como se describe en Liljegren y col (2004, citado anteriormente) o como se describe en los Ejemplos siguientes. Brevemente, los cambios en la resistencia al desgranado de la vaina se pueden evaluar y/o medir, por ejemplo, por pruebas macroscópicas, tal como la inspección de las vainas de semillas a simple vista para evaluar, por ejemplo, la presencia o ausencia de los márgenes de la valva, la longitud del espolón de las vainas, etc.; una Prueba de Impacto Manual (MIT) para comparar el nivel de resistencia al desgranado de vainas entre diferentes líneas IND mutantes y las correspondientes líneas de tipo salvaje mediante la evaluación de la facilidad de apertura de las vainas al retorcer las vainas suavemente; una prueba de impacto aleatorio (RIT) para comparar la capacidad de trillado de las vainas de semillas de plantas de diferentes líneas IND mutantes y las correspondientes líneas de tipo salvaje, respectivamente, midiendo la semivida de la muestras de vainas de estas líneas; y/o mediante pruebas microscópicas para examinar, por ejemplo, si las células en el margen de la valva y la zona de dehiscencia de las vainas de semillas y cómo se ven afectadas por mutaciones en IND. Una vez que el compañero de dimerización de la proteína IND (por ejemplo, la propia proteína IND en caso de que su funcionamiento dependa de la formación de un homodímero u otra proteína en caso de que su funcionamiento dependa de la formación de un heterodímero) y/o el (los) gen (es) cuya transcripción está regulada por la proteína IND se identifica y caracteriza, la funcionalidad de un alelo/proteína IND específico puede evaluarse alternativamente mediante técnicas de ADN recombinante como se conoce en la técnica, por ejemplo, coexpresando ambos compañeros del dímero en una célula huésped (por ejemplo, una bacteria, tal como E. coli) y evaluando si todavía se pueden formar dímeros, si los dímeros aún pueden unirse al sitio de unión de bHLH de los genes regulados, y/o si la transcripción de estos genes todavía está regulada por esta unión.

Ambas secuencias de ácido nucleico endógenas y aisladas se proporcionan en el presente documento. También se proporcionan fragmentos de las secuencias IND mutantes y secuencias de ácido nucleico variante IND mutantes definidas anteriormente, para su uso como cebadores o sondas y como componentes de kits de acuerdo con otro aspecto de la invención (véase más adelante). Un "fragmento" de una secuencia de ácido nucleico ind o una variante de la misma (como se define) puede tener varias longitudes, tal como al menos 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 200, 500, 600 nucleótidos contiguos de la secuencia IND o ind (o de la secuencia variante).

Secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas IND funcionales

Las secuencias de ácido nucleico representadas en el listado de secuencias codifican proteínas IND funcionales de tipo salvaje de Brassica napus. Por tanto, estas secuencias son endógenas a las plantas de Brassica napus de las que se aislaron. Otras especies de cultivos de Brassica, variedades, líneas de reproducción o registros salvajes se pueden someter a detección selectiva para detectar otros alelos IND, que codifican las mismas proteínas IND o variantes de las mismas. Por ejemplo, las técnicas de hibridación de ácido nucleico (por ejemplo, análisis de transferencia Southern, usando, por ejemplo, condiciones de hibridación rigurosas) o técnicas basadas en PCR pueden usarse para identificar alelos IND endógenos a otras plantas de Brassica, tal como varias variedades de Brassica napus, líneas o registros, aunque también se pueden someter a detección selectiva plantas, órganos y tejidos de Brassica juncea (especialmente alelos IND en el genoma A), Brassica carinata (especialmente alelos iNd en el genoma C) y Brassica rapa (genoma A) y Brassica oleracea (genoma C) para detectar otros alelos IND de tipo salvaje. Para cribar tales plantas, órganos o tejidos vegetales para la presencia de alelos IND, las secuencias de ácido nucleico IND proporcionadas en el listado de secuencias, o variantes o fragmentos de cualquiera de estos, se pueden usar. Por ejemplo, secuencias completas o fragmentos pueden usarse como sondas o cebadores. Por ejemplo, se pueden usar cebadores específicos o degenerados para amplificar secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas IND del ADN genómico de la planta, órgano o tejido vegetal. Estas secuencias de ácido nucleico IND pueden aislarse y secuenciarse usando técnicas estándar de biología molecular. El análisis bioinformático se puede utilizar para caracterizar el(los) alelos, por ejemplo, para determinar a qué alelo IND corresponde la secuencia y qué proteína IND o variante de proteína está codificada por la secuencia.

Si una secuencia de ácido nucleico codifica una proteína IND funcional puede analizarse mediante técnicas de ADN recombinante como se conoce en la técnica, por ejemplo, mediante una prueba de complementación genética usando, por ejemplo, una planta de Arabidopsis, que es homocigota para un alelo ind mutante defectivo completo o una planta Brassica napus, que es homocigoto para un alelo mutante ind defectivo completo tanto del gen IND-A1 como del gen IND-C1.

Además, se entiende que las secuencias de ácido nucleico IND y sus variantes (o fragmentos de cualquiera de estos) pueden identificarse in silico, seleccionando bases de datos de ácidos nucleicos para secuencias esencialmente similares. De manera análoga, una secuencia de ácido nucleico puede sintetizarse químicamente. También se proporcionan fragmentos de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que se describen más adelante. Los fragmentos incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican solo el dominio bHLH, o fragmentos más pequeños que comprenden parte del dominio bHLH, tal como el dominio básico o el dominio HLH, etc.

Secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas IND mutantes

La invención proporciona secuencias de ácido nucleico que comprenden una o más deleciones, inserciones o sustituciones de nucleótidos relativas a las secuencias de ácido nucleico IND de tipo salvaje representadas en las SEQ ID NO: 1,3, 5 y 7 del listado de la secuencia, en las que la(s) mutación(es) en la secuencia de ácido nucleico dan como resultado una actividad biológica significativamente reducida, es decir, un defectivo parcial de la actividad biológica, de la proteína IND codificada en relación con la proteína IND de tipo salvaje, así como fragmentos de tales moléculas de ácido nucleico mutantes. Dichas secuencias de ácido nucleico mutantes (denominadas secuencias indP) pueden generarse y/o identificarse utilizando diversos procedimientos conocidos, como se describe más adelante. De nuevo, tales moléculas de ácido nucleico se proporcionan tanto en forma endógena como en forma aislada.

Básicamente, cualquier mutación en las secuencias de ácido nucleico IND de tipo salvaje que da como resultado una proteína IND que comprende al menos una inserción de aminoácidos, La eliminación y/o sustitución, deleción y/o sustitución en relación con la proteína IND de tipo salvaje puede conducir a una actividad biológica significativamente reducida o nula. Sin embargo, se entiende que ciertas mutaciones en la proteína IND tienen más probabilidades de dar como resultado una abolición completa de la actividad biológica de la proteína IND, tales como mutaciones por las cuales porciones significativas de los dominios funcionales, tal como el dominio de unión al ADN ("b"), el dominio de dimerización ("HLH") y/o los dominios reguladores de la transcripción, faltan, o por el cual ciertos restos de aminoácidos cruciales dentro de estos dominios, tal como los aminoácidos Gln (Q), Ala (A) y Arg (R) en las posiciones 5, 9 y 13 o los restos de aminoácidos básicos (en particular los restos Arg (R)) en las posiciones 10 y 12 de la secuencia de dominio consenso bHLH definida por Heim y col., (2003, Mol Biol Evol 20, 735-747; correspondientes a las posiciones 123, 127 y 131, y 128 y 130, respectivamente, en la SEQ ID NO: 10, véase la Tabla 1) faltan o están sustituidos, preferentemente por aminoácidos no similares o no conservadores, mientras que otras mutaciones en la proteína IND tienen más probabilidades de producir una reducción significativa de la actividad biológica de la proteína IND, tales como mutaciones que conducen a sustituciones de aminoácidos específicos, por ejemplo, los aminoácidos conservados indicados en la Tabla 1, causando una unión de ADN menos eficiente, una dimerización menos eficiente, y/o una regulación menos eficiente de la transcripción sin abolir completamente la actividad biológica de la proteína IND codificada. El documento WO09/068313 (que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052) describe, por ejemplo, alelos IND mutantes defectivos completos, en particular ind-a1-ems01, ind-c1-EMS01 e ind-c1-EMS03, que comprenden una mutación sin sentido que da como resultado la producción de proteínas IND truncadas que carecen del dominio bHLH y alelos IND mutantes defectivos completos, en particular ind-a1-ems05, que codifica una proteína IND mutante en la que la Arg conservada en la posición 10 del dominio consenso bHLH se sustituye por una His aromática, mientras que la presente invención describe alelos IND mutantes defectivos parciales, en particular, por ejemplo, ind-c1-ems09, que codifica una proteína IND mutante en la que la Ala conservada en la posición 9 del dominio consenso bHLH se sustituye por una Thr e indc1-ems04, que codifica una proteína IND mutante en la que la Arg conservada en la posición 12 del dominio consenso bHLH se sustituye por una Cys.

Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender una o más mutaciones, tales como:

- una "mutación sin sentido", que es un cambio en la secuencia de ácido nucleico que resulta en la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido;

- una "mutación sin sentido" o "mutación del codón de TERMINACIÓN", que es un cambio en la secuencia de ácido nucleico que da como resultado la introducción de un codón de TERMINACIÓN prematuro y, por lo tanto, la terminación de la traducción (que da como resultado una proteína truncada); los genes vegetales contienen los codones de terminación de la traducción "TGA" (UGA en a Rn ), "TAA" (UAA en ARN) y "TAG" (UAG en ARN); así cualquier sustitución, inserción, deleción de nucleótidos que da como resultado que uno de estos codones esté en el ARNm maduro que se está traduciendo (en el marco de lectura) terminará la traducción;

- una "mutación de inserción" de uno o más aminoácidos, debido a que se han añadido uno o más codones en la secuencia de codificación del ácido nucleico;

- una "mutación por deleción" de uno o más aminoácidos, debido a que uno o más codones se han eliminado en la secuencia de codificación del ácido nucleico;

- una "mutación de desplazamiento de marco", que da como resultado que la secuencia de ácido nucleico se traduzca en un marco de lectura diferente corriente abajo de la mutación. Una mutación de cambio de marco puede tener varias causas, tales como la inserción, deleción o duplicación de uno o más nucleótidos.

La Tabla 1 indica la longitud de la proteína IND de Arabidopsis en SEQ ID NO:10, del ADN que codifica IND de Arabidopsis en la SEQ ID NO: 9 y de las proteínas IND-A1 e IND-C1 de Brassica napus en las s Eq ID NO: 2 y 6 y la SEQ ID NO: 4 y 8, respectivamente; la posición de los dominios bHLH en las proteínas IND-A1 e IND-C1 de Brassica napus en función de la posición indicada del dominio pfam PF00010, dominio smart SM00353, dominio prosite PS50888 y dominio superfam G3D.4.10.280.10 o SSF47459 de la proteína IND de Arabidopsis de acuerdo con la base de datos The Arabidopsis Information Resource (TAIR) (http://www.arabidopsis.org/; (http://www.arabidopsis.org/; locus At4 g00120.1; SEQ ID NO: 10); la posición de los dominios bHLH y los aminoácidos conservados en las proteínas IND-A1 e IND-C1 de Brassica napus en función de la posición indicada del dominio bHLH y los aminoácidos conservados en la proteína IND de Arabidopsis según Heim y col., (2003, Mol Biol Evol 20, 735-747), de acuerdo con Toledo-Ortiz y col., (2003, Plant Cell 15: 1749-1770), y de acuerdo con Liljegren y col., (2004, Cell, 116, 843-853); como se describe adicionalmente en el documento WO09/068313 (que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052).

Tabla 1 Proteínas IND: regiones y posiciones de los aminoácidos (AA)

continuación

La alineación óptima de las secuencias de ácido nucleico IND de Arabidopsis (SEQ ID NO:9) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) con las secuencias e ácido nucleico IND, en particular las secuencias de ácido nucleico de IND de Brassica (SEQ ID NO:1 y 3) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 2 y 4) de la presente invención, permite determinar las posiciones de los dominios y aminoácidos conservados correspondientes en estas secuencias de Brassica (véase la Tabla 1 para las secuencias de IND de Brassica de la SEQ ID NO: 1 a 4).

Así, en una realización, se proporcionan secuencias de ácido nucleico de IND mutante defectivo parcial que comprenden uno o más de cualquiera de los tipos de mutaciones descritas anteriormente. Las secuencias ind defectivas parciales pueden comprender una o más mutaciones de codones de terminación (sin sentido), se proporcionan una o más mutaciones sin sentido y/o una o más mutaciones de desplazamiento de marco. Cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mutantes anteriores se proporciona per se (en forma aislada), como las plantas y las partes de la planta que comprenden tales secuencias endógenamente. En las tablas a continuación en el presente documento se describen los alelos ind más preferidos y los depósitos de semillas de semillas de Brassica napus que comprenden uno o más alelos ind se han depositado como se indica.

Una mutación sin sentido en un alelo IND, tal como se usa en el presente documento, es una mutación en un alelo IND por el cual uno o más codones de terminación de la traducción se introducen en el ADN codificante y la secuencia de ARNm correspondiente del alelo IND de tipo salvaje correspondiente. Los codones de terminación de la traducción son TGA (UGA en el ARNm), TAA (UAA) y TAG (UAG). Portanto, cualquier mutación (deleción, inserción o sustitución) que conduzca a la generación de un codón de terminación dentro del marco en la secuencia de codificación dará como resultado la terminación de la traducción y el truncamiento de la cadena de aminoácidos. Se describe un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido en la que se introduce un codón de terminación en el marco en la secuencia del codón de IND mediante una única sustitución de nucleótidos, tal como la mutación de CAG a TAG, TGG a TAG, TGG a TGA o CAA a TAA. Se describe un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido en la que se introduce un codón de terminación en el marco en la secuencia del codón IND mediante sustituciones dobles de nucleótidos, tal como la mutación de CAG a TAA, TGG a TAA, o CGG a TAG o TGA. Se describe un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido en la que se introduce un codón de terminación en el marco en la secuencia del codón IND mediante sustituciones triples de nucleótidos, tal como la mutación de CGG a TAA. La proteína truncada carece de los aminoácidos codificados por el ADN codificador corriente abajo de la mutación (es decir, la parte C-terminal de la proteína IND) y mantiene los aminoácidos codificados por el ADN codificador corriente arriba de la mutación (es decir, la parte N-terminal de la proteína IND). Se describe un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido presente en cualquier lugar frente al resto de Leu conservado del dominio H2 (en la posición 56 en la secuencia de dominio consenso bHLH como se describe por Heim y col., 2003, véase la Tabla 1), de modo que al menos falta el resto de Leu conservado. Cuanto más truncada esté la proteína IND mutante en comparación con la proteína IND de tipo salvaje, más puede el truncamiento dar como resultado una actividad reducida significativamente de la proteína iNd mutante. Se cree que, con el fin de que la proteína IND mutante retenga algo de actividad biológica, al menos debería comprender el dominio de unión al ADN (b). Se describe un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido que da como resultado una proteína truncada de menos de aproximadamente 170 aminoácidos (que carece de la Leu conservada), menos de aproximadamente 150 aminoácidos (sin el dominio H2), menos de aproximadamente 145 aminoácidos (sin los dominios L y H2), o menos de aproximadamente 130 aminoácidos (sin el dominio HLH) (véase la Tabla 1).

Las siguientes tablas en el presente documento describen un rango de posibles mutaciones sin sentido en las secuencias IND de Brassica napus adecuadas para la invención:

Tabla 2a Posibles mutaciones del codón de TERMINACIÓN en IND-A1 (SEQ ID NO:1) Posición de Posición de Tipo salvaje ^ codón Tipo salvaje ^ aminoácido

25 74 tgg ^ tag TRP ^ TERMINACIÓN

75 tgg ^ tga TRP ^ TERMINACIÓN

74+75 tgg ^ taa TRP ^ TERMINACIÓN

(continuación)

Posición de Posición de Tipo salvaje ^ codón Tipo

aminoácido aminoácidos nucleótidos mutante muta

57 169 cag ^ tag GLN > TERMINACION 169+171 cag ^ taa GLN > TERMINACIÓN

91 271 caa ^ taa GLN > TERMINACIÓN

98 292 cag ^ tag GLN > TERMINACIÓN 292+294 cag ^ taa GLN > TERMINACIÓN

122 364 cag ^ tag GLN > TERMINACIÓN 364+366 cag ^ taa GLN > TERMINACIÓN

128 382+383 cgg ^ tag ARG > TERMINACIÓN 382+384 cgg ^ tga ARG > TERMINACIÓN 382+383+384 cgg ^ taa ARG > TERMINACIÓN

138 412+413 cgg ^ tag ARG > TERMINACIÓN 412+414 cgg ^ tga ARG > TERMINACIÓN 412+413+414 cgg ^ taa ARG > TERMINACIÓN

168 502+503 cgg ^ tag ARG > TERMINACIÓN 502+504 cgg ^ tga ARG > TERMINACIÓN 502+503+504 cgg ^ taa ARG > TERMINACIÓN

169 505 cag ^ tag GLN > TERMINACIÓN 505+507 cag ^ taa GLN > TERMINACIÓN

181 542 tgg ^ tag TRP • TERMINACIÓN

543 tgg ^ tga TRP • TERMINACIÓN 542+543 tgg ^ taa TRP • TERMINACIÓN

Tabla 2b Posibles mutaciones del codón de TERMINACIÓN en IND-C1 (SEQ ID NO: 3) Posición de Posición de Tipo salvaje ^ codón Tipo salvaje ^ aminoácido aminoácidos nucleótidos mutante mutante

41 122 tgg ^ tag TRP ^ TERMINACIÓN

123 tgg ^ tga TRP ^ TERMINACIÓN 122+123 tgg ^ taa TRP ^ TERMINACIÓN

50 148 caa ^ taa GLN ^ TERMINACIÓN

73 271 cag ^ tag GLN ^ TERMINACIÓN 271+272 cag ^ taa GLN ^ TERMINACIÓN

104 310 caa ^ taa GLN ^ TERMINACIÓN

111 331 cag ^ tag GLN ^ TERMINACIÓN 331+333 cag ^ taa GLN ^ TERMINACIÓN

135 403 cag ^ tag GLN ^ TERMINACIÓN 403+405 cag ^ taa GLN ^ TERMINACIÓN

141 421+422 cgg ^ tag ARG ^ TERMINACIÓN 421+423 cgg ^ tga ARG ^ TERMINACIÓN 421+422+423 cgg ^ taa ARG ^ TERMINACIÓN

151 451+452 cgg ^ tag ARG ^ TERMINACIÓN 451+453 cgg ^ tga ARG ^ TERMINACIÓN 451+452+453 cgg ^ taa ARG ^ TERMINACIÓN

181 541+542 cgg ^ tag ARG ^ TERMINACIÓN 541+543 cgg ^ tga ARG ^ TERMINACIÓN 541+542+543 cgg ^ taa ARG ^ TERMINACIÓN

182 544 cag ^ tag GLN ^ TERMINACIÓN 544+546 cag ^ taa GLN ^ TERMINACIÓN

187 559 cag ^ tag GLN ^ TERMINACIÓN 559+561 cag ^ taa GLN ^ TERMINACIÓN

191 571 cag ^ tag GLN ^ TERMINACIÓN 571+573 cag ^ taa GLN ^ TERMINACIÓN

Obviamente, las mutaciones no se limitan a las que se muestran en las tablas anteriores y se entiende que las mutaciones de TERMINACIÓN análogas pueden estar presentes en alelos ind diferentes a los representados en el listado de secuencias y mencionados en las tablas anteriores.

Una mutación de sentido erróneo en un alelo IND, tal como se usa en el presente documento, es cualquier mutación (deleción, inserción o sustitución) en un alelo IND por el cual uno o más codones se cambian en el ADN codificante y la secuencia de ARNm correspondiente del alelo IND de tipo salvaje correspondiente, que da como resultado la sustitución de uno o más aminoácidos en la proteína IND de tipo salvaje por uno o más aminoácidos en la proteína IND mutante. En una realización, se proporciona un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido que da como resultado una sustitución de un resto de valina (Val) en la posición 124 de la proteína IND en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia esencialmente similar a la misma, en particular por un resto de metionina (Met), tal como el alelo ind-a1-EMS06 (Tabla 3a). En otra realización, se proporciona un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido que da como resultado una sustitución de un resto de glicina (Gly) en la posición 146 de la proteína IND en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia esencialmente similar a la misma, en particular por un resto de serina (Ser), tal como el alelo ind- a1-EMS09 (tabla 3a). En otra realización más, se proporciona un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido que da como resultado una sustitución de un resto de alanina (Ala) en la posición 159 de la proteína IND en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia esencialmente similar a la misma, en particular por un resto de valina (Val), tal como el alelo ind-a1 -EMS13 (Tabla 3a). En otra realización más, se proporciona un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido que da como resultado una sustitución de un resto de treonina (Thr) en la posición 136 de la proteína IND en la SEQ ID NO: 4 o una secuencia esencialmente similar a la misma, en particular por un resto de metionina (Met), tal como el alelo ind-c1-EMS08 (Tabla 3b). En una realización adicional, se proporciona un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido que da como resultado una sustitución de un resto de alanina (Ala) en la posición 139 de la proteína IND en la SEQ ID NO: 4 o una secuencia esencialmente similar a la misma, en particular por un resto de treonina (Thr), tal como el alelo ind-c1-EMS09 (Tabla 3b). En aún una realización adicional, se proporciona un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido que da como resultado una sustitución de un resto de arginina (Arg) en la posición 142 de la proteína IND en la SEQ ID NO: 4 o una secuencia esencialmente similar a la misma, en particular por un resto de cisteína (Cys), tal como el alelo ind-c1-EMS04 (Tabla 3b). Semilla de referencia que comprende los alelos ind-a1-EMS06, ind-a1-EMS09, ind-a1-EMS13, ind-c1-EMS08, ind-c1-EMS09 e ind-c1-EMS04 en estado homocigoto se han depositado en el NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Escocia, AB21 9YA, Reino Unido) el 7 de julio de 2008, con el número de acceso NCIMB 41570, NCIMB 41571, NCIMB 41572, NCIMB 41573, NCIMB 41574 y NCIMB 41575, respectivamente.

Tabla 3a: Mutaciones sin sentido en IND-A1

Posición de Posiciór de Tipo salvaje ^ Tipo salvaje ^ Nombre del Número de aminoácidos SEQ ID: nucleóti dos codón mutante aminoácido mutante alelo depósito

124 370 930 gtg ^ atg VAL ^ MET ind-a1- NCIMB EMS06 41570 146 436 996 ggc ^ agc GLY ^ SER ind-a1- NCIMB EMS09 41571 159* 476 1036 gcc ^ gtc ALA ^ VAL ind-a1- NCIMB EMS13 41572

Tabla 3b: Mutaciones sin sentido en IND-C1

Posición de Posición c e Tipo salvaje ^ Tipo salvaje ^ aminoácido Nombre del Número aminoácidos nucleótidc s codón mutante mutante alelo de SEQ depósito

136 407 903 acg ^ atg THR ^ MET ind-c1-EMS08 NCIMB 41573 139* 415 911 gct ^ act ALA ^ THR ind-c1-EMS09 NCIMB 41574 142* 424 920 cgt ^ tgt ARG ^ CYS ind-c1-EMS04 NCIMB 41575

En otra realización, se proporciona un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido que codifica una proteína IND en la que uno o más de los aminoácidos conservados indicados anteriormente o en la Tabla 1 está/están sustituidos, tales como alelos IND mutantes defectivos parcial es ind-a1-EMS13, ind-c1-EMS04 e ind-c1-EMS09 (indicado con * en la Tabla 3). Como se describe en Heim y col., (2003, Mol Biol Evol 20, 735-747), Toledo-Ortiz y col., (2003, Plant Cell 15: 1749-1770), Liljegren y col., (2004, Cell, 116, 843-853) y el documento WO09/068313 (que reivindica la prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052), algunos de los aminoácidos conservados son más cruciales para la actividad biológica de la proteína IND que otros. Por tanto, por ejemplo, las mutaciones sin sentido que resultan en la sustitución de, por ejemplo, los aminoácidos en la posición 5, 9 (por ejemplo, ind-c1 -EMS09) y 13 o en las posiciones 10 (por ejemplo, ind-a1-EMS05) y 12 (por ejemplo, ind-c1-EMS04) de la secuencia de dominio consenso bHLH definida por Heim y col., (citado anteriormente) tienen más probabilidades de dar como resultado una actividad significativamente reducida, debido a una capacidad reducida para unirse al ADN objetivo, de la proteína IND. Del mismo modo, las mutaciones sin sentido que resultan en la sustitución de, por ejemplo, los aminoácidos en las posiciones 16, 20, 23, 27 en helixl o en las posiciones 36, 39, 43, 49 (por ejemplo, ind-a1 -EMS13), 53 y 56 en helix2 de la secuencia de dominio consenso bHLH definida por Heim y col., (citado anteriormente) es más probables que den como resultado una actividad significativamente reducida, debido a una capacidad de dimerización reducida, de la proteína IND.

Un alelo IND mutante defectivo parcial que comprende una mutación sin sentido que se puede usar es un alelo IND que comprende una mutación sin sentido correspondiente a la mutación sin sentido en los alelos ind-1 defectivos parciales de Arabidopsis (Liljegren y col., 2004, citado anteriormente) (véase la Tabla 1).

Una mutación de desplazamiento de marco en un alelo IND, tal como se usa en el presente documento, es una mutación (deleción, inserción, duplicación y similares) en un alelo IND que da como resultado la traducción de la secuencia de ácido nucleico en un marco diferente corriente abajo de la mutación.

Secuencias de aminoácido de acuerdo con la invención

Se proporcionan secuencias de aminoácidos IND mutantes defectivos parciales (es decir, secuencias de aminoácidos IND que comprenden una o más mutaciones, que dan como resultado una actividad biológica significativamente reducida de la proteína IND) de Brassicaceae, particularmente de especies de Brassica, especialmente de Brassica napus, pero también de otras especies de cultivos de Brassica. Por ejemplo, las especies de Brassica que comprenden un genoma A y/o C pueden codificar diferentes aminoácidos IND-A1 o IND-C1, que son esencialmente similares a las nuevas proteínas IND mutantes defectivas parciales de la presente invención. Además, se pueden usar procedimientos de mutagénesis para generar mutaciones en alelos IND de tipo salvaje, generando de este modo alelos mutantes que pueden codificar proteínas IND mutantes adicionales, que son esencialmente similares a las proteínas IND mutantes defectivas parciales de la presente invención. En una realización, las secuencias de aminoácidos IND mutantes se proporcionan dentro de una planta de Brassica (es decir, endógenamente). Sin embargo, en el presente documento se proporcionan secuencias de aminoácidos IND aisladas (por ejemplo, aisladas de la planta o hechas sintéticamente), así como sus variantes y fragmentos de cualquiera de estos.

Las secuencias de aminoácidos, que son esencialmente similares a las nuevas proteínas IND mutantes defectivas parciales de la presente invención pueden obtenerse reemplazando aminoácidos en las secuencias de aminoácidos IND defectivas parciales de la presente invención por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobicidad similar, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras a-helicoidales o estructuras de lámina p). Las tablas de sustitución conservadoras son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company y la Tabla 4 de la presente solicitud de patente).

Tabla 4 Eem los de sustituciones de aminoácidos conservadas

Se han aislado nuevas secuencias de aminoácidos IND mutantes defectivas parciales de proteínas IND-A1 e IND-C1 de tipo salvaje de Brassica napus. Las secuencias IND de tipo salvaje como se describe en el documento WO09/068313 (que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052) se representan en las SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4, mientras que las nuevas secuencias IND mutantes defectivas parciales de estas secuencias, y de secuencias esencialmente similares a estas, se describen en el presente documento a continuación y en los Ejemplos, con referencia a las secuencias IND de tipo salvaje. Tal como se ha descrito anteriormente, las proteínas IND de tipo salvaje de Brassica napus tienen una longitud de aproximadamente 185-210 aminoácidos y comprenden una serie de dominios estructurales y funcionales.

Las "secuencias de aminoácidos IND-A1" o las "secuencias de aminoácidos variantes IND-A1" según la invención son secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de Identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2. También se puede hacer referencia a estas secuencias de aminoácidos como "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias IND proporcionadas en el listado de secuencias.

Las "secuencias de aminoácidos IND-C1" o las "secuencias de aminoácidos variantes IND-C1" según la invención son secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 (IND-C1-long) o con la SEQ ID NO: 4 desde el aminoácido en la posición 16 al aminoácido en la posición 210 (IND-C1-short). Estas secuencias de aminoácidos también pueden denominarse como "esencialmente similares" o "esencialmente idénticas" a las secuencias IND proporcionadas en el listado de secuencias.

Por tanto, la invención proporciona nuevas secuencias mutantes defectivas parciales de secuencias de aminoácidos de proteínas IND-A1 e IND-C1 funcionales de tipo salvaje, incluyendo variantes y fragmentos de las mismas (como se define más adelante), por lo que la mutación en la secuencia de aminoácidos preferentemente da como resultado una reducción significativa en la actividad biológica de la proteína IND en comparación con la actividad biológica de la proteína IND de tipo salvaje correspondiente. Una reducción significativa en la actividad biológica de la proteína IND se refiere en el presente documento a una reducción en la actividad de unión al ADN, la capacidad de dimerización y/o la actividad reguladora de la transcripción de la proteína IND, tal que la resistencia al desgranado de la vaina de una planta que expresa la proteína IND mutante se incrementa en comparación con una planta que expresa la proteína IND de tipo salvaje correspondiente en comparación con la resistencia al desgranado de la vaina de una planta de tipo salvaje correspondiente.

Ambas secuencias de aminoácidos endógenas y aisladas se proporcionan en el presente documento. También se proporcionan fragmentos de las secuencias de aminoácidos IND y las secuencias de aminoácidos variantes IND definidas anteriormente. Un "fragmento" de una secuencia de aminoácidos IND o una variante de la misma (como se define) puede tener varias longitudes, tal como de al menos 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 150, 175, 180 aminoácidos contiguos de la secuencia IND (o de la secuencia variante).

Secuencias de aminoácidos de las proteínas IND funcionales

Las secuencias de aminoácidos representadas en el listado de secuencias son proteínas IND funcionales de tipo salvaje de Brassica napus. Por tanto, estas secuencias son endógenas a las plantas de Brassica napus de las que se aislaron. Otras especies de cultivos de Brassica, variedades, líneas de reproducción o registros salvajes pueden seleccionarse para otras proteínas IND funcionales con las mismas secuencias de aminoácidos o variantes de las mismas, tal como se ha descrito anteriormente.

Además, se entiende que las secuencias de aminoácidos IND y sus variantes (o fragmentos de cualquiera de estos) pueden identificarse in silico, seleccionando bases de datos de aminoácidos para secuencias esencialmente similares. También se proporcionan fragmentos de moléculas de aminoácidos según la invención. Los fragmentos incluyen secuencias de aminoácidos del dominio bHLH, o fragmentos más pequeños que comprenden parte del dominio bHLH, tal como el dominio básico o el dominio HLH, etc.

Secuencias de aminoácidos de proteínas IND mutantes

La invención proporciona secuencias de ácido nucleico que comprenden una o más deleciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos relativas a las secuencias de aminoácidos IND de tipo salvaje representadas en las SEQ ID NO:2 y 4 del listado de secuencias, en las que la(s) mutación(es) en la secuencia de aminoácidos dan como resultado una actividad biológica significativamente reducida, es decir, un defectivo parcial de la actividad biológica, de la proteína IND codificada en relación con la proteína de tipo salvaje, así como fragmentos de tales moléculas de aminoácidos mutantes. Dichas secuencias de aminoácidos mutantes se pueden generar y/o identificar utilizando varios procedimientos conocidos, tal como se ha descrito anteriormente. De nuevo, tales moléculas de aminoácidos se proporcionan tanto en forma endógena como en forma aislada.

Tal como se ha descrito anteriormente, básicamente, cualquier mutación en las secuencias de aminoácidos IND de tipo salvaje que da como resultado una proteína IND que comprende al menos una inserción de aminoácidos, deleción y/o sustitución en relación con la proteína IND de tipo salvaje puede conducir a una actividad biológica significativamente reducida o nula. Sin embargo, se entiende que ciertas mutaciones en la proteína IND tienen más probabilidades de dar como resultado una abolición completa de la actividad biológica de la proteína IND, tales como mutaciones que conducen a proteínas truncadas, por el cual faltan porciones significativas de los dominios funcionales, tal como el dominio de unión al ADN ("b"), el dominio de dimerización ("HLH") y/o los aminoácidos que son importantes en la regulación de la transcripción (véase la Tabla 1), o mutaciones por las cuales ciertos restos de aminoácidos cruciales dentro de estos dominios, tal como los aminoácidos Gln (Q), Ala (A) y Arg (R) en las posiciones 5, 9 y 13 o los restos de aminoácidos básicos (en particular los restos Arg (R)) en las posiciones 10 y 12 de la secuencia de dominio consenso bHLH definida por Heim y col., (citado anteriormente; correspondientes a las posiciones 123, 127 y 131, y 128 y 130, respectivamente, en la SEQ ID NO: 10, véase la Tabla 1) faltan o están sustituidos, preferentemente por aminoácidos no similares o no conservadores, mientras que otras mutaciones de la proteína tienen más probabilidades de producir una reducción significativa de la actividad biológica de la proteína IND, tales como mutaciones que conducen a sustituciones de aminoácidos específicos, por ejemplo, los aminoácidos conservados indicados en la Tabla 1, causando una unión de ADN menos eficiente, una dimerización menos eficiente, y/o una regulación menos eficiente de la transcripción sin abolir completamente la actividad biológica de la proteína IND codificada.

Se describen proteínas IND mutantes defectivas parciales que comprenden una o más mutaciones de deleción o inserción, por lo que la (s) deleción(es) o inserción(es) dan como resultado una proteína mutante que tiene una actividad significativamente reducida in vivo. Dichas proteínas IND mutantes son proteínas IND en las que al menos 1, al menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 100, 150, 175, 180 o más aminoácidos se delecionan o insertan en comparación con la proteína IND de tipo salvaje, por lo que la (s) deleción(es) o inserción(es) dan como resultado una proteína mutante que tiene una actividad significativamente reducida in vivo.

Se describen proteínas IND mutantes defectivas parciales que se truncan por lo que el truncamiento da como resultado una proteína mutante que tiene una actividad significativamente in vivo. Dichas proteínas IND truncadas son proteínas IND que carecen de dominios funcionales en la parte C-terminal de la proteína IND de tipo salvaje correspondiente y que mantienen la parte N-terminal de la proteína IND de tipo salvaje correspondiente. Por tanto, se describe una proteína IND mutante defectiva parcial que comprende la parte N-terminal de la proteína IND de tipo salvaje correspondiente hasta el resto Leu conservado del dominio H2, pero sin incluirlo (en la posición 56 en la secuencia consenso del dominio bHLH como describen Heim y col., 2003, véase anteriormente). Cuanto más truncada está la proteína mutante en comparación con la proteína de tipo salvaje, más puede el truncamiento dar como resultado una actividad reducida significativamente de la proteína IND mutante. Se cree que, con el fin de que la proteína IND mutante retenga algo de actividad biológica, al menos debería comprender el dominio de unión al ADN (b). Se describe una proteína IND mutante defectiva parcial que comprende la parte N-terminal de la proteína IND de tipo salvaje correspondiente que carece de parte o todo el segundo dominio H, y/o carece de parte o todo el dominio L, y/o carece de parte o todo del primer dominio H (véase la Tabla 1).

En otra realización más, se proporcionan proteínas IND mutantes defectivas parciales que comprenden una o más mutaciones de sustitución, por lo que la(s) sustitución(es) dan como resultado una proteína mutante que tiene una actividad significativamente reducida in vivo. En una realización, se proporciona una proteína IND mutante defectiva parcial que comprende una mutación por sustitución que da como resultado una sustitución de un resto de valina (Val) en la posición 124 de la proteína IND en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia esencialmente similar a la misma, en particular por un resto de metionina (Met), tal como la proteína IND mutante defectiva parcial codificada por el alelo ind-a1-EMS06 (Tabla 3a). En otra realización, se proporciona una proteína IND mutante defectiva parcial que comprende una mutación por sustitución que da como resultado una sustitución de un resto de glicina (Gly) en la posición 146 de la proteína IND en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia esencialmente similar a la misma, en particular por un resto de serina (Ser), tal como la proteína IND mutante defectiva parcial codificada por el alelo ind-a1-EMS09 (Tabla 3a). En otra realización más, se proporciona una proteína IND mutante defectiva parcial que comprende una mutación por sustitución que da como resultado una sustitución de un resto de alanina (Ala) en la posición 159 de la proteína IND en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia esencialmente similar a la misma, en particular por un resto de valina (Val), tal como la proteína IND mutante defectiva parcial codificada por el alelo ind-a1-EMS13 (Tabla 3a). En otra realización más, se proporciona una proteína IND mutante defectiva parcial que comprende una mutación por sustitución que da como resultado una sustitución de un resto de treonina (Thr) en la posición 136 de la proteína IND en la SEQ ID NO: 4 o una secuencia esencialmente similar a la misma, en particular por un resto de metionina (Met), tal como la proteína IND mutante defectiva parcial codificada por el alelo ind-c1-EMS08 (Tabla 3b). En una realización adicional, se proporciona una proteína IND mutante defectiva parcial que comprende una mutación por sustitución que da como resultado una sustitución de un resto de alanina (Ala) en la posición 139 de la proteína IND en la SEQ ID NO: 4 o una secuencia esencialmente similar a la misma, en particular por un resto de treonina (Thr), tal como la proteína IND mutante defectiva parcial codificada por el alelo ind-c1-EMS09 (Tabla 3b). En aún una realización adicional, se proporciona una proteína IND mutante defectiva parcial que comprende una mutación por sustitución que da como resultado una sustitución de un resto de arginina (Arg) en la posición 142 de la proteína iNd en la SEQ ID NO: 4 o una secuencia esencialmente similar a la misma, en particular por un resto de cisteína (Cys), tal como la proteína IND mutante defectiva parcial codificada por el alelo ind-c1-EMS04 (Tabla 3b).

En otra realización, se proporciona una proteína IND mutante defectiva parcial que comprende una mutación por sustitución que da como resultado la sustitución de restos de aminoácidos conservados como se ha indicado anteriormente o en la Tabla 1, tal como la proteína IND mutante defectiva parcial codificada por ind-a1-EMS13, indc1-EMS04 o ind-c1-EMS09 (indicado con * en la Tabla 3).

Procedimientos según la invención

Se describen procedimientos para generar y seleccionar plantas de semillas dehiscentes y células, partes, semillas y descendencia de las mismas, que contiene al menos un alelo parcial y/o al menos un alelo ind defectivo completo. En particular, se describen procedimientos para generar y seleccionar plantas de Brassica que comprenden al menos dos genes IND, en particular plantas y células de Brassica napus, partes, semillas y descendencia de las mismas, que contiene al menos un alelo ind defectivo parcial y/o al menos completo al menos uno de los al menos dos loci IND diferentes en el genoma, por ejemplo al menos uno de los dos loci diferentes del gen IND-A1 e IND-C1 de Brassica, y para distinguir entre la presencia de alelos ind defectivos completos, alelos ind defectivos parciales y alelos IND de tipo salvaje en una planta de semilla dehiscente o parte de la planta. Por lo tanto, se describen procedimientos (tales como mutagénesis y/o selección asistida por marcadores) para generar y/o identificar alelos ind defectivos parciales y/o alelos ind defectivos completos o plantas de semillas dehiscentes o partes de plantas, que comprenden dichos alelos ind y para combinar un número adecuado de alelos ind defectivos parciales y/o alelos ind defectivos completos y/o diferentes tipos de alelos ind defectivos parciales y/o alelos ind defectivos completos en una sola planta de semillas dehiscentes para alterar las propiedades de dehiscencia del fruto de las plantas, en particular para reducir el desgranado de semillas o retrasar el desgranado de semillas hasta después de la cosecha, a la vez que mantienen al mismo tiempo una capacidad de trilla agronómicamente relevante de las vainas.

Los alelos mutantes defectivos parciales y completos según la invención pueden generarse (por ejemplo inducidos por mutagénesis) y/o identificarse usando una variedad de procedimientos, que son convencionales en la técnica, por ejemplo, utilizando procedimientos basados en PCR para amplificar parte o la totalidad del ADN genómico o ADNc.

Después de la mutagénesis, las plantas se cultivan a partir de las semillas tratadas o se regeneran a partir de las células tratadas utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, las semillas mutagenizadas se pueden plantar de acuerdo con los procedimientos de cultivo convencionales y después de la autopolinización se forman semillas en las plantas. Como alternativa, las plántulas haploides duplicadas pueden extraerse de las células de microesporas o polen tratadas para formar inmediatamente plantas homocigotas, por ejemplo, como describen Coventry y col., (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. de Guelph, Guelph, Ontario, Canadá). La semilla adicional que se forma como resultado de tal autopolinización en la generación actual o en una generación posterior puede cosecharse y seleccionarse para detectar la presencia de alelos IND mutantes, utilizando técnicas que son convencionales en la técnica, por ejemplo, técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (amplificación de los alelos ind) o técnicas basadas en hibridación, por ejemplo, análisis de transferencia Southern, cribado de la biblioteca BAC, y similares, y/o secuenciación directa de alelos ind. Para detectar la presencia de mutaciones puntuales (llamadas polimorfismos de nucleótido único o SNP) en alelos IND mutantes, se pueden usar procedimientos de detección de SNP convencionales en la técnica, por ejemplo, técnicas basadas en oligoligación, técnicas basadas en extensión de base única o técnicas basadas en diferencias en sitios de restricción, tales como ARADO.

Tal como se ha descrito anteriormente, la mutagenización (espontánea e inducida) de un alelo IND de tipo salvaje específico da como resultado la presencia de uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos (en adelante denominados "región de mutación") en el alelo IND mutante resultante. El alelo IND mutante se puede caracterizar así por la ubicación y la configuración de uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos en el alelo IND de tipo salvaje. El sitio en el alelo IND de tipo salvaje donde se han insertado, delecionado o sustituido uno o más nucleótidos, respectivamente, en el presente documento también se denomina "región o secuencia de mutación". Una "región o secuencia flanqueante 5' o 3'" como se usa en el presente documento se refiere a una región o secuencia de ADN en el alelo IND mutante (o el tipo salvaje correspondiente) de al menos 20 pb, preferentemente al menos 50 pb, al menos 750 pb, al menos 1500 pb y hasta 5000 pb de ADN diferente del ADN que contiene el uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos, preferentemente ADN del alelo IND mutante (o el tipo salvaje correspondiente) que se encuentra inmediatamente corriente arriba y contiguo con (región flanqueante o secuencia 5'") o inmediatamente corriente abajo y contiguo con ("región o secuencia flanqueante en 3'") la región de mutación en el alelo IND mutante (o en el alelo IND de tipo salvaje correspondiente). Una "región de unión" como se usa en el presente documento se refiere a una región de ADN en el alelo IND mutante (o el tipo salvaje correspondiente) donde la región de mutación y la región flanqueante 5' o 3' están unidas entre sí. Una "secuencia que abarca la región de unión entre la región de mutación y la región flanqueante 5' o 3'" comprende así una secuencia de mutación así como la secuencia flanqueante contigua a la misma.

Las herramientas desarrolladas para identificar un alelo IND mutante específico o la planta o material vegetal que comprende un alelo IND mutante específico, o productos que comprenden material vegetal que comprende un alelo IND mutante específico se basan en las características genómicas específicas del alelo IND mutante específico en comparación a las características genómicas del alelo IND de tipo salvaje correspondiente, tal como, un mapa de restricción específico de la región genómica que comprende la región de mutación, marcadores moleculares o la secuencia de las regiones de flanqueo y/o mutación.

Una vez que se ha secuenciado un alelo IND mutante específico, se pueden desarrollar cebadores y sondas que reconocen específicamente una secuencia dentro de las regiones flanqueantes en 5', flanqueante en 3' y/o de mutación del alelo IND mutante en el ácido nucleico (ADN o ARN) de una muestra mediante una técnica de biología molecular. Por ejemplo, se puede desarrollar un procedimiento de PCR para identificar el alelo IND mutante en muestras biológicas (como muestras de plantas, material vegetal o productos que comprenden material vegetal). Tal PCR se basa en al menos dos "cebadores" específicos: uno reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del alelo IND mutante y el otro reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 3' o 5' del alelo IND mutante, respectivamente; o uno que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del alelo IND mutante y el otro que reconoce una secuencia dentro de la región de mutación del alelo IND mutante; o uno que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del alelo IND mutante y el otro reconoce una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante específico (como se describe más adelante), respectivamente.

Los cebadores tienen preferentemente una secuencia de entre 15 y 35 nucleótidos que en condiciones de PCR optimizadas "reconocen específicamente" una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3', una secuencia dentro de la región de mutación, o una secuencia que abarca la región de unión entre las regiones flanqueantes y de mutación en 3' o 5' del alelo IND mutante específico, de manera que un fragmento específico ("fragmento específico de IND mutante" o amplicón discriminante) se amplifica a partir de una muestra de ácido nucleico que comprende el alelo IND mutante específico. Esto significa que solo el alelo IND mutante dirigido, y ninguna otra secuencia en el genoma de la planta, se amplifica en condiciones de PCR optimizadas.

Los cebadores de PCR adecuados para la invención pueden ser los siguientes:

- oligonucleótidos que varían en longitud desde 17 nt hasta aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia flanqueante 5' o 3' de un alelo IND mutante específico o el complementario del mismo (es decir, por ejemplo, la secuencia 5' o 3' que flanquea uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos en los alelos iNd mutantes de la invención, tal como la secuencia 5' o 3' que flanquea las mutaciones sin sentido, de sentido erróneo o de desplazamiento de marco descritas anteriormente o la secuencia 5' o 3' que flanquea las mutaciones del codón de TERMINACIÓN indicadas en las Tablas anteriores o las mutaciones de sustitución indicadas anteriormente o el complementario de las mismas) (cebadores que reconocen las secuencias flanqueantes 5'); o

- oligonucleótidos que varían en longitud desde 17 nt hasta aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos seleccionados de la secuencia de la región de mutación de un alelo IND mutante específico o el complementario del mismo (es decir, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos insertada o sustituida en los genes IND de la invención o la complementaria de la misma (cebadores que reconocen secuencias de mutación).

Los cebadores pueden, por supuesto, ser más largos que los 17 nucleótidos consecutivos mencionados, y pueden, por ejemplo, tener 18, 19, 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt de longitud o incluso más. Los cebadores pueden consistir completamente en una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos mencionadas de secuencias de flanqueo y mutación. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de los cebadores en su extremo 5' (es decir, fuera de los 17 nucleótidos consecutivos ubicados en 3') es menos crucial. Por tanto, la secuencia 5' de los cebadores puede consistir en una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de flanqueo o mutación, según sea apropiado, pero puede contener varios (por ejemplo, 1,2, 5, 10) desapareamientos. La secuencia de 5' de los cebadores puede incluso consistir completamente en una secuencia de nucleótidos no relacionada con las secuencias de flanqueo o mutación, como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que representa sitios de reconocimiento de enzimas de restricción. Dichas secuencias no relacionadas o secuencias de a Dn flanqueantes con emparejamientos erróneos preferentemente no deberían ser superiores a 100, más preferentemente no más de 50 o incluso 25 nucleótidos.

Por otra parte, los cebadores adecuados pueden comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos que abarca la región de unión entre secuencias flanqueantes y de mutación (es decir, por ejemplo, la región de unión entre una secuencia 5' o 3' que flanquea uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos en los alelos IND mutantes de la invención y la secuencia de uno o más nucleótidos insertados o sustituidos o la secuencia 3' o 5', respectivamente, flanqueando uno o más nucleótidos delecionados, tal como la región de unión entre una secuencia de 5' o 3' que flanquea mutaciones sin sentido, de sentido erróneo o de desplazamiento de marco en los genes IND de la invención descritos anteriormente y la secuencia de las mutaciones sin sentido, mutaciones sin sentido o de desplazamiento de marco o la región de unión entre una secuencia 5' o 3' que flanquea una posible mutación del codón de TERMINACIÓN como se indica en las Tablas anteriores o las mutaciones por sustitución indicadas anteriormente y la secuencia de la mutación potencial del codón de TERMINACIÓN o las mutaciones por sustitución, respectivamente), siempre que la secuencia de nucleótidos no se derive exclusivamente de la región de mutación o de las regiones flanqueantes.

También será inmediatamente claro para el experto en la materia que los pares de cebadores de PCR seleccionados adecuadamente tampoco deberían comprender secuencias complementarias entre sí.

Para los fines de la presente invención, el "complementario de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID No: X "es la secuencia de nucleótidos que puede derivarse de la secuencia de nucleótidos representada reemplazando los nucleótidos a través de su nucleótido complementario de acuerdo con las reglas de Chargaff (A ^T ; G ^ C ) y leyendo la secuencia en la dirección 5' a 3', es decir, en dirección opuesta a la secuencia de nucleótidos representada.

En los ejemplos se describen ejemplos de cebadores adecuados para identificar alelos IND mutantes específicos.

Como se emplea en el presente documento, "la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. Z desde la posición X a la posición Y" indica la secuencia de nucleótidos que incluye ambos puntos finales de nucleótidos.

Preferentemente, el fragmento amplificado tiene una longitud de entre 50 y 1.000 nucleótidos, tal como una longitud entre 50 y 500 nucleótidos, o una longitud entre 100 y 350 nucleótidos. Los cebadores específicos pueden tener una secuencia que es entre 80 y 100 % idéntica a una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3', a una secuencia dentro de la región de mutación, o a una secuencia que abarca la región de unión entre las regiones de flanqueo y mutación 3' o 5' del alelo IND mutante específico, siempre que los desapareamientos todavía permitan la identificación específica del alelo IND mutante específico con estos cebadores en condiciones de PCR optimizadas. Sin embargo, el rango de desapareamientos permitidos puede determinarse fácilmente de forma experimental y lo conoce un experto en la materia.

La detección y/o identificación de un "fragmento específico de IND mutante" puede producirse de varias maneras, por ejemplo, mediante la estimación del tamaño después de la electroforesis en gel o capilar o mediante procedimientos de detección basados en fluorescencia. Los fragmentos específicos de IND mutantes también pueden secuenciarse directamente. También se conocen en la técnica otros procedimientos específicos de secuencia para la detección de fragmentos de ADN amplificados.

Los protocolos de PCR estándar se describen en la técnica, tal como en el "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2a edición, 1999) y otras referencias. Las condiciones óptimas para la PCR, incluyendo la secuencia de los cebadores específicos, se especifica en un "protocolo de identificación por PCR" para cada alelo IND mutante específico. Sin embargo, se entiende que una serie de parámetros en el protocolo de identificación por PCR pueden necesitar ajustarse a condiciones específicas de laboratorio, y pueden modificarse ligeramente para obtener resultados similares. Por ejemplo, el uso de un procedimiento diferente para la preparación de ADN puede requerir el ajuste de, por ejemplo, la cantidad de cebadores, polimerasa, concentración de MgCh o las condiciones de hibridación usadas. De manera similar, la selección de otros cebadores puede dictar otras condiciones óptimas para el protocolo de identificación de PCR. Sin embargo, estos ajustes serán evidentes para una persona experta en la técnica, y además se detallan en los manuales de aplicación de PCR actuales, como el citado anteriormente.

En los ejemplos se describen ejemplos de protocolos de identificación por PCR para identificar alelos IND mutantes específicos.

Como alternativa, pueden usarse cebadores específicos para amplificar un fragmento específico de IND mutante que puede usarse como una "sonda específica" para identificar un alelo IND mutante específico en muestras biológicas. El contacto con el ácido nucleico de una muestra biológica, con la sonda, en condiciones que permiten la hibridación de la sonda con su fragmento correspondiente en el ácido nucleico, da como resultado la formación de un híbrido ácido nucleico/sonda. Se puede detectar la formación de este híbrido (por ejemplo, marcado del ácido nucleico o sonda), por lo que la formación de este híbrido indica la presencia del alelo IND mutante específico. Tales procedimientos de identificación basados en la hibridación con una sonda específica (ya sea en un vehículo en fase sólida o en solución) se han descrito en la técnica. La sonda específica es, preferentemente, una secuencia que, en condiciones optimizadas, hibrida específicamente a una región dentro de la región flanqueante 5' o 3' y/o dentro de la región de mutación del alelo IND mutante específico (en lo sucesivo, "región específica de IND mutante"). Preferentemente, la sonda específica comprende una secuencia de entre 10 y 1000 pb, 5o y 600 pb, entre 100 y 500 pb, entre 150 y 350 pb, que es al menos un 80 %, preferentemente entre un 80 y un 85 %, más preferentemente entre un 85 y un 90 %, especialmente preferentemente entre un 90 y un 95 %, lo más preferentemente entre un 95 % y 1003 idéntico (o complementario) a la secuencia de nucleótidos de una región específica. Preferentemente, la sonda específica comprenderá una secuencia de aproximadamente 13 a aproximadamente 100 nucleótidos contiguos idénticos (o complementarios) a una región específica del alelo IND mutante específico.

Las sondas específicas adecuadas para la invención pueden ser las siguientes:

- oligonucleótidos que varían en longitud desde 13 nt hasta aproximadamente 1000 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 13 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia flanqueante 5' o 3' de un alelo IND mutante específico o el complementario del mismo (es decir, por ejemplo, la secuencia 5' o 3' que flanquea uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos en los alelos IND mutantes de la invención, tal como la secuencia 5' o 3' que flanquea las mutaciones sin sentido, mutaciones de sentido erróneo o de desplazamiento de marco descritas anteriormente o la secuencia 5' o 3' que flanquea las posibles mutaciones del codón de TERMINACIÓN indicadas en las Tablas anteriores o las mutaciones de sustitución indicadas anteriormente), o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (sondas que reconocen secuencias flanqueantes en 5'); u

- oligonucleótidos que varían en longitud desde 13 nt hasta aproximadamente 1000 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 13 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de mutación de un alelo IND mutante específico o el complementario del mismo (es decir, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos insertada o sustituida en los genes IND de la invención, o la complementaria de la misma), o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con las mismas (sondas que reconocen secuencias de mutación).

Las sondas pueden consistir completamente en una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos mencionadas de secuencias de flanqueo y mutación. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de las sondas en sus extremos 5' o 3' es menos crucial. Por tanto, las secuencias 5' o 3' de las sondas pueden consistir en una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de flanqueo o mutación, según sea apropiado, pero pueden consistir en una secuencia de nucleótidos no relacionada con las secuencias de flanqueo o mutación. Dichas secuencias no relacionadas preferentemente no deberían tener una longitud mayor que 50, más preferentemente no mayor que 25 o incluso no mayor que 20 o 15 nucleótidos.

Por otra parte, las sondas adecuadas pueden comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos que abarca la región de unión entre las secuencias de flanqueo y de mutación (es decir, por ejemplo, la región de unión entre una secuencia 5' o 3' que flanquea uno o más nucleótidos delecionados, insertados o sustituidos en los alelos IND mutantes de la invención y la secuencia de uno o más nucleótidos insertados o sustituidos o la secuencia 3' o 5', respectivamente, flanqueando uno o más nucleótidos delecionados, tal como la región de unión entre una secuencia de 5' o 3' que flanquea mutaciones sin sentido, de sentido erróneo o de desplazamiento de marco en los genes IND de la invención descritos anteriormente y la secuencia de las mutaciones sin sentido, mutaciones erróneas o de desplazamiento de marco, o la región de unión entre una secuencia 5' o 3' que flanquea una posible mutación del codón de TERMINACIÓN como se indica en las Tablas anteriores o las mutaciones de sustitución indicadas anteriormente y la secuencia del potencial codón de TERMINACIÓN o mutación de sustitución, respectivamente), siempre que la secuencia de nucleótidos mencionada no derive exclusivamente de la región de mutación o de las regiones flanqueantes.

En los ejemplos se describen ejemplos de sondas específicas adecuadas para identificar alelos IND mutantes específicos.

La detección y/o identificación de una "región específica de IND mutante" que hibrida con una sonda específica puede ocurrir de varias maneras, por ejemplo, mediante la estimación del tamaño después de la electroforesis en gel o mediante procedimientos de detección basados en fluorescencia. También se conocen en la técnica otros procedimientos de secuencia específica para la detección de una "región específica de IND mutante" que hibrida con una sonda específica.

Como alternativa, las plantas o partes de plantas que comprenden uno o más alelos ind mutantes se pueden generar e identificar utilizando otros procedimientos, tales como el procedimiento "Delete-a-gene™", que utiliza PCR para detectar mutantes por deleción generados por mutagénesis de neutrones rápidos (revisado por Li y Zhang, 2002, Funct Integr Genomics 2: 254-258), mediante el procedimiento TILLING (Guiado a lesiones locales inducidas EN Genomas, Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) que identifica las mutaciones puntuales inducidas por EMS mediante cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante (DHPLC) para detectar cambios de pares de bases mediante análisis heterodúplex (McCallum y col., 2000, Nat Biotech 18:455 y McCallum y col., 2000, Plant Physiol. 123, 439-442), etc. Como se ha mencionado, TILLING utiliza un cribado de alto rendimiento para las mutaciones (por ejemplo, utilizando la división Cel 1 de heterodúplex de ADN de tipo salvaje mutante y la detección utilizando un sistema de gel de secuenciación). Por tanto, el uso de TILLING para identificar plantas o partes de plantas que comprenden uno o más alelos ind mutantes y procedimientos para generar e identificar tales plantas, órganos de plantas, tejidos y semillas se abarcan en el presente documento. Por tanto, se describe un procedimiento que comprende las etapas de mutagenizar semillas de plantas (por ejemplo, mutagénesis EMS), agrupación de individuos de plantas o ADN, amplificación por PCR de una región de interés, formación de heterodúplex y detección de alto rendimiento, identificación de la planta mutante, secuenciación del producto de PCR mutante. Se entiende que otros procedimientos de mutagénesis y selección pueden usarse igualmente para generar tales plantas mutantes.

En lugar de inducir mutaciones en alelos IND, los alelos mutantes naturales (espontáneos) pueden identificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar ECOTILLING (Henikoff y col., 2004, Plant Physiology 135(2):630-6) para detectar una pluralidad de plantas o partes de plantas respecto a la presencia de alelos ind mutantes naturales. En cuanto a las técnicas de mutagénesis anteriores, preferentemente se seleccionan especies de Brassica que comprenden un genoma A y/o C, para que el alelo ind identificado pueda introducirse posteriormente en otras especies de Brassica, tal como Brassica napus, por cruzamiento (cruces inter o intraespecíficos) y selección. En ECOTILLING, los polimorfismos naturales en las líneas de reproducción o especies relacionadas se seleccionan mediante la metodología TILLING descrita anteriormente, en la que se usan individuos o grupos de plantas para la amplificación por PCR del objetivo ind, formación de heterodúplex y análisis de alto rendimiento. Esto puede ser seguido seleccionando plantas individuales que tengan una mutación requerida que pueda usarse posteriormente en un programa de reproducción para incorporar el alelo mutante deseado.

Los alelos mutantes identificados se pueden secuenciar y la secuencia se puede comparar con el alelo de tipo salvaje para identificar la(s) mutación(es). Opcionalmente, la funcionalidad se puede probar como se ha indicado anteriormente. Usando este enfoque, se puede identificar una pluralidad de alelos ind mutantes (y plantas de Brassica que comprenden uno o más de estos). Los alelos mutantes deseados se pueden combinar con los alelos de tipo salvaje deseados mediante procedimientos de cruzamiento y selección como se describe más adelante. Finalmente, se genera una sola planta que comprende el número deseado de ind mutantes y el número deseado de alelos IND de tipo salvaje.

Los oligonucleótidos adecuados como cebadores de PCR o sondas específicas para la detección de un alelo IND mutante específico también se pueden usar para desarrollar procedimientos para determinar el estado de cigosidad del alelo IND mutante específico.

Se puede desarrollar un ensayo basado en PCR para determinar la presencia de un alelo IND mutante y/o de tipo salvaje mutante específico correspondiente:

Para determinar el estado de cigosidad de un alelo IND mutante específico, dos cebadores que reconocen específicamente el alelo IND de tipo salvaje pueden diseñarse de tal manera que estén dirigidos uno hacia el otro y tengan la región de mutación ubicada entre los cebadores. Estos cebadores pueden ser cebadores que reconocen específicamente las secuencias flanqueantes de 5' y 3', respectivamente. Este conjunto de cebadores permite la amplificación de diagnóstico simultáneo por PCR del mutante, así como del alelo IND de tipo salvaje correspondiente.

Como alternativa, para determinar el estado de cigosidad de un alelo IND mutante específico, dos cebadores que reconocen específicamente el alelo IND de tipo salvaje pueden diseñarse de tal manera que estén dirigidos uno hacia el otro y que uno de ellos reconozca específicamente la región de mutación. Estos cebadores pueden ser cebadores que reconocen específicamente la secuencia de la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND de tipo salvaje, respectivamente. Este conjunto de cebadores, junto con un tercer cebador que reconoce específicamente la secuencia de la región de mutación en el alelo IND mutante, permiten la amplificación por PCR de diagnóstico simultáneo del gen IND mutante, así como del gen IND de tipo salvaje.

Como alternativa, para determinar el estado de cigosidad de un alelo IND mutante específico, dos cebadores que reconocen específicamente el alelo IND de tipo salvaje pueden diseñarse de tal manera que estén dirigidos uno hacia el otro y que uno de ellos reconozca específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación. Estos cebadores pueden ser cebadores que reconocen específicamente la secuencia flanqueante 5' o 3' y la región de unión entre la región de mutación y la región flanqueante 3 'o 5' del alelo IND de tipo salvaje, respectivamente. Este conjunto de cebadores, junto con un tercer cebador que reconoce específicamente la región de unión entre la región de mutación y la región flanqueante 3' o 5' del alelo IND mutante, respectivamente, permiten la amplificación por PCR de diagnóstico simultáneo del gen IND mutante, así como del gen IND de tipo salvaje.

Como alternativa, el estado de cigosidad de un alelo IND mutante específico puede determinarse usando conjuntos de cebadores alternativos que reconocen específicamente los alelos iNd mutantes y de tipo salvaje.

Si la planta es homocigota para el gen IND mutante o el gen IND de tipo salvaje correspondiente, los ensayos de diagnóstico de PCR descritos anteriormente darán lugar a un único producto de PCR típico, preferentemente típico en longitud, ni para el mutante o el alelo IND de tipo salvaje. Si la planta es heterocigota para el alelo IND mutante, aparecerán dos productos de PCR específicos, reflejando tanto la amplificación del mutante como el alelo IND de tipo salvaje.

La identificación de los productos de PCR específicos de tipo salvaje y mutante IND puede ocurrir por estimación del tamaño después de la electroforesis en gel o capilar (por ejemplo, para alelos IND mutantes que comprenden una cantidad de nucleótidos insertados o eliminados que da como resultado una diferencia de tamaño entre los fragmentos amplificados del tipo salvaje y el alelo IND mutante, tal que dichos fragmentos se puedan separar visiblemente en un gel); evaluando la presencia o ausencia de los dos fragmentos diferentes después de la electroforesis en gel o capilar, por lo que la amplificación de diagnóstico por PCR del alelo IND mutante puede, opcionalmente, realizarse por separado de la amplificación de diagnóstico por PCR del alelo IND de tipo salvaje; por secuenciación directa de los fragmentos amplificados; o por procedimientos de detección basados en fluorescencia.

Ejemplos de cebadores adecuados para determinar la cigosidad de alelos IND mutantes específicos se describen en los Ejemplos.

Como alternativa, para determinar el estado de cigosidad de un alelo IND mutante específico, se puede desarrollar un ensayo basado en PCR para determinar la presencia de un alelo específico de IND de tipo salvaje mutante y/o correspondiente:

Para determinar el estado de cigosidad de un alelo IND mutante específico, dos sondas específicas que reconocen el alelo IND de tipo salvaje pueden diseñarse de tal manera que una de ellas reconozca específicamente una secuencia dentro del alelo de tipo salvaje IND y que la región de mutación se localiza entre las secuencias reconocidas por las sondas. Estas sondas pueden ser sondas que reconocen específicamente las secuencias flanqueantes de 5' y 3', respectivamente. El uso de una o, preferentemente, El uso de uno o, ambas sondas, así como del alelo IND de tipo salvaje correspondiente.

Como alternativa, para determinar el estado de cigosidad de un alelo IND mutante específico, dos sondas específicas que reconocen el alelo IND de tipo salvaje pueden diseñarse de tal manera que una de ellas reconozca específicamente una secuencia dentro del alelo de tipo salvaje IND corriente arriba y corriente abajo de la región de mutación, preferentemente corriente arriba de la región de mutación, y que uno de ellos reconoce específicamente la región de mutación. Estas sondas pueden ser sondas que reconocen específicamente la secuencia de la región flanqueante 5' o 3', preferentemente la región flanqueante 5' y la región de mutación del alelo IND de tipo salvaje, respectivamente. El uso de una o, preferentemente, ambas sondas, opcionalmente, junto con una tercera sonda que reconoce específicamente la secuencia de la región de mutación en el alelo IND mutante, permitir la hibridación diagnóstica del mutante y del gen IND de tipo salvaje.

Como alternativa, para determinar el estado de cigosidad de un alelo IND mutante específico, una sonda específica que reconoce el alelo IND de tipo salvaje puede diseñarse de tal manera que la sonda reconozca específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3', preferentemente la región flanqueante 5' y la región de mutación del alelo IND de tipo salvaje. Esta sonda, opcionalmente, junto con una segunda sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3', preferentemente la región flanqueante 5' y la región de mutación del alelo IND mutante, permite la hibridación diagnóstica del mutante y del gen IND de tipo salvaje.

Como alternativa, el estado de cigosidad de un alelo IND mutante específico puede determinarse usando conjuntos de sondas alternativos que reconocen específicamente los alelos IND mutantes y de tipo salvaje.

Si la planta es homocigota para el gen IND mutante o el gen IND de tipo salvaje correspondiente, los ensayos de hibridación diagnósticos descritos anteriormente darán lugar a un único producto de hibridación específico, tal como uno o más fragmentos de ADN de hibridación (restricción), típico, preferentemente típico en longitud, ni para el mutante o el alelo IND de tipo salvaje. Si la planta es heterocigota para el alelo IND mutante, aparecerán dos productos de hibridación específicos, lo que refleja tanto la hibridación del mutante como el alelo IND de tipo salvaje.

La identificación de los productos de PCR específicos de tipo salvaje y mutante IND puede ocurrir por estimación del tamaño después de la electroforesis en gel o capilar (por ejemplo, para alelos IND mutantes que comprenden una cantidad de nucleótidos insertados o eliminados que da como resultado una diferencia de tamaño entre los fragmentos de ADN hibridante (restricción) del tipo salvaje y el alelo IND mutante, tal que dichos fragmentos se puedan separar visiblemente en un gel); evaluando la presencia o ausencia de los dos productos de hibridación específicos diferentes después de la electroforesis en gel o capilar, por lo que la hibridación de diagnóstico del alelo iNd mutante puede, opcionalmente, realizarse por separado de la hibridación de diagnóstico del alelo IND de tipo salvaje; por secuenciación directa de los fragmentos de hibridación de ADN (restricción); o por procedimientos de detección basados en fluorescencia.

Ejemplos de sondas adecuadas para determinar la cigosidad de los alelos IND mutantes específicos se describen en los ejemplos.

Asimismo, los procedimientos de detección específicos para un alelo IND mutante específico que difieren de los procedimientos de amplificación basados en PCR o hibridación también se pueden desarrollar utilizando la información de secuencia específica del alelo IND mutante específico proporcionada en el presente documento. Dichos procedimientos de detección alternativos incluyen procedimientos de detección de amplificación de señal lineal basados en la escisión invasiva de estructuras particulares de ácido nucleico, también conocida como tecnología Invader™, (como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 5.985.557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6,001,567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage), procedimientos de detección basados en RT-PCR, tal como Taqman, u otros procedimientos de detección, tal como SNPlex, Extensión de base única (SBE), y similares. Brevemente, en la tecnología Invader™, la secuencia de mutación objetivo puede por ejemplo, hibridarse con un primer oligonucleótido de ácido nucleico marcado que comprende la secuencia de nucleótidos de la secuencia de mutación o una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante 5' y la región de mutación y con un segundo oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia flanqueante 3' inmediatamente corriente abajo y adyacente a la secuencia de mutación, en la que el primer y segundo oligonucleótido se solapan por al menos un nucleótido. La estructura dúplex o triplex producida por esta hibridación permite la escisión selectiva de la sonda con una enzima (Cleavase®) que deja la secuencia objetivo intacta. La sonda marcada escindida se detecta posteriormente, potencialmente a través de una etapa intermedia que resulta en una mayor amplificación de señal.

Un "kit", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un conjunto de reactivos con el fin de realizar el procedimiento de la invención, más particularmente, la identificación de un alelo IND mutante específico en muestras biológicas o la determinación del estado de cigosidad del material vegetal que comprende un alelo IND mutante específico. Más particularmente, una realización preferida del kit de la invención comprende al menos dos cebadores específicos, como se ha descrito anteriormente, para la identificación de un alelo IND mutante específico, o al menos dos o tres cebadores específicos para la determinación del estado de cigosidad. Opcionalmente, el kit puede comprender además cualquier otro reactivo descrito en el presente documento en el protocolo de identificación de PCR. Como alternativa, de acuerdo con otra realización de la presente invención, el kit puede comprender al menos una sonda específica, que hibrida específicamente con ácido nucleico de muestras biológicas para identificar la presencia de un alelo IND mutante específico en el mismo, para la identificación de un alelo IND mutante específico, o al menos dos o tres sondas específicas para la determinación del estado de cigosidad.el kit puede comprender además cualquier otro reactivo (como, entre otros, tampón de hibridación, etiqueta) para la identificación de un alelo IND mutante específico en muestras biológicas, como se ha descrito anteriormente, para la identificación de un alelo IND mutante específico, o al menos dos o tres sondas específicas para la determinación del estado de cigosidad. Opcionalmente, el kit puede comprender además cualquier otro reactivo (tal como, pero sin limitaciones, tampón, marcador de hibridación) para la identificación de un alelo IND mutante específico en muestras biológicas, usando la sonda específica.

Se puede usar el kit de la invención y sus componentes se pueden ajustar específicamente, para fines de control de calidad (por ejemplo, pureza de lotes de semillas), detección de la presencia o ausencia de un alelo IND mutante específico en material vegetal o material que comprende o deriva de material vegetal, tales como, entre otros, alimentos o productos alimenticios.

Con el término "cebador", como se usa en el presente documento, se quiere abarcar cualquier ácido nucleico que es capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un procedimiento dependiente de molde, tal como PCR. Por lo general, los cebadores son oligonucleótidos de 10 a 30 nucleótidos, pero se pueden emplear secuencias más largas. Los cebadores se pueden proporcionar en forma bicatenaria, aunque se prefiere la forma monocatenaria. Las sondas se pueden usar como cebadores, pero están diseñados para unirse al ADN o ARN objetivo y no tienen que usarse en un procedimiento de amplificación.

El término "reconocer" como se usa en el presente documento cuando se refiere a cebadores específicos, se refiere al hecho de que los cebadores específicos se hibridan específicamente con una secuencia de ácido nucleico en un alelo IND mutante específico en las condiciones establecidas en el procedimiento (como las condiciones del protocolo de identificación de PCR), por lo que la especificidad está determinada por la presencia de controles positivos y negativos.

El término "hibridación", como se usa en el presente documento cuando se refiere a sondas específicas, se refiere al hecho de que la sonda se une a una región específica en la secuencia de ácido nucleico de un alelo IND mutante específico en condiciones de restricción estándar. Las condiciones de rigurosidad estándar tal como se usan en el presente documento se refieren a las condiciones de hibridación descritas en este documento o a las condiciones de hibridación convencionales descritas por Sambrook y col., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) que, por ejemplo, puede comprender las siguientes etapas: 1) inmovilizar fragmentos de ADN genómico de la planta o ADN de la biblioteca BAC en un filtro, 2) prehibridar el filtro durante 1 a 2 horas a 65 °C en 6 X SSC, 5 X reactivo de Denhardt, SDS al 0,5% y ADN portador desnaturalizado de 20 |jg/ml, 3) añadir la sonda de hibridación que se ha marcado, 4) incubar durante 16 a 24 horas, 5) lavar el filtro una vez durante 30 minutos. a 68 °C en 6X SSC, SDS al 0,1 %, 6) lavar el filtro tres veces (dos veces durante 30 minutos en 30 ml y una vez durante 10 minutos en 500 ml) a 68 °C en 2 X SSC, SDS al 0,1 %, y 7) exponer el filtro durante 4 a 48 horas a una película de rayos X a -70 °C.

Como se usa en este documento, una "muestra biológica" es una muestra de una planta, material vegetal o producto que comprende material vegetal. Con el término "planta" se pretende abarcar tejidos vegetales, en cualquier etapa de madurez, así como cualquier célula, tejido u órgano tomados o derivados de tales plantas, incluidos, sin limitación, cualquier semilla, hoja, tallo, flor, raíz, célula individual, gameto, cultivos celulares, cultivo de tejidos o protoplasto. "Material vegetal", como se usa en el presente documento se refiere al material que se obtiene o deriva de una planta. Los productos que comprenden material vegetal se refieren a alimentos, piensos u otros productos que se producen utilizando material vegetal o que pueden estar contaminados por material vegetal. Se entiende que, en el contexto de la presente invención, tales muestras biológicas se analizan para determinar la presencia de ácidos nucleicos específicos para un alelo IND mutante específico, implicando la presencia de ácidos nucleicos en las muestras. Por lo tanto, los procedimientos mencionados en el presente documento para identificar un alelo IND mutante específico en muestras biológicas, se refieren a la identificación en muestras biológicas de ácidos nucleicos que comprenden el alelo IND mutante específico.

También se describe en el presente documento la combinación de alelos IND específicos en una planta, la transferencia de uno o más alelos IND mutantes específicos de una planta a otra planta, comprendiendo las plantas uno o más alelos IND mutantes específicos, la progenie obtenida de estas plantas y para plantar células, partes de plantas y semillas de plantas derivadas de estas plantas.

Se describe un procedimiento para combinar un número adecuado de alelos ind defectivos parciales y/o alelos ind defectivos completos y/o diferentes tipos de alelos ind defectivos parciales y/o alelos ind defectivos completos en una única planta de semilla dehiscente para alterar las propiedades de dehiscencia del fruto de la planta, en particular para reducir el desgranado de semillas o retrasar el desgranado de semillas hasta después de la cosecha, a la vez que mantienen al mismo tiempo una capacidad de trilla agronómicamente relevante de las vainas.

En un aspecto, se proporciona un procedimiento para alterar las propiedades de dehiscencia del fruto, en particular para reducir el desgranado de semillas o retrasar el desgranado semillas hasta después de la cosecha, a la vez que mantienen al mismo tiempo una capacidad de trillado agronómicamente relevante de las vainas, de una planta de Brassica que comprenda al menos dos genes IND, que comprende las etapas de:

- generar y/o seleccionar una planta de Brassica que comprenda al menos dos genes IND, en el que al menos dos alelos de los al menos dos genes IND son alelos ind defectivos parciales, como se ha descrito anteriormente, - seleccionar una planta con propiedades alteradas de dehiscencia del fruto, en particular, una planta en la que el desgranado de semillas se reduce o retrasa hasta después de la cosecha, mientras que las vainas mantienen al mismo tiempo una capacidad de trillado agronómicamente relevante

en el que dichos alelos ind defectivos parciales se generan por mutagénesis.

La planta Brassica que comprende al menos dos genes IND puede ser una planta Brassica napus que comprende un gen IND-A1 y un gen IND-C1. Los al menos dos alelos ind defectivos parciales pueden ser alelos defectivos parciales del gen IND-C1.

El procedimiento puede comprender además la etapa de generar y/o seleccionar una planta de Brassica que comprende al menos dos genes IND, en el que al menos dos alelos adicionales de los al menos dos genes IND son alelos ind defectivos completos, tal como se ha descrito anteriormente. La planta Brassica que comprende al menos dos genes IND puede ser una planta Brassica napus que comprende un gen IND-A1 y un gen IND-C1. Los al menos dos alelos ind defectivos parciales pueden ser alelos ind defectivos parciales del gen IND-A1 y los al menos dos alelos ind defectivos completos son alelos ind defectivos completos del gen IND-C1.

También se describe un procedimiento para hacer una planta o semilla híbrida de cultivo de Brassica que comprende al menos dos genes IND, en particular una planta o semilla híbrida de Brassica napus, en el que las propiedades de dehiscencia del fruto de la planta o de la planta cultivada a partir de la semilla se alteran, en particular, en el que el desgranado de semillas se reduce o se retrasa hasta después de la cosecha, mientras que las vainas mantienen al mismo tiempo una capacidad de trillado agronómicamente relevante, que comprende las etapas de:

- generar y/o identificar una primera planta que comprende un primer alelo ind defectivo parcial en estado homocigoto y una segunda planta que comprende un segundo alelo ind defectivo parcial en estado homocigoto, como se ha descrito anteriormente,

- cruzar la primera y la segunda planta y recolectar semillas híbridas F1 del cruce que comprenden dos alelos ind defectivos parciales de los al menos dos genes IND.

La primera planta puede comprender adicionalmente un primer alelo ind defectivo completo en estado homocigoto y la segunda planta puede comprender adicionalmente un segundo alelo ind defectivo completo en estado homocigoto, como se ha descrito anteriormente, y se recolectan semillas híbridas F1 que comprenden dos alelos ind defectivos parciales y dos alelos ind defectivo completos de los al menos dos genes IND.

La posibilidad de usar plantas progenitoras que comprenden un alelo parcial y/o completo inactivado en estado homocigoto para producir semillas híbridas a partir de las cuales se pueden cultivar plantas que muestren un desgranado de semillas reducido o retardado, a la vez que mantienen al mismo tiempo una capacidad de trillado agronómicamente relevante de las vainas, proporciona ventajas sobre el uso de una planta madre que comprende dos alelos ind defectivos completos eliminados en estado homocigoto y una planta madre que comprende un estado de alelo ind defectivo completo como se describe en el documento WO09/068313 (que reivindicando prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052), ya que ambas plantas madre producen vainas que muestran una capacidad de trillado agronómicamente relevante, mientras que las vainas de la planta madre que comprende dos alelos ind defectivos completos en estado homocigoto producen vainas tubulares de las cuales es difícil cosechar las semillas.

El primer y el segundo alelos ind defectivos parciales pueden ser iguales, de modo que las semillas híbridas F1 son homocigotas para un alelo ind defectivo parcial. El primer y el segundo alelos ind defectivos completos pueden ser iguales, de modo que las semillas híbridas F1 son homocigotas para un alelo ind defectivo completo.

Los alelos ind defectivos completos (es decir, alelos IND cuya expresión funcional está completamente abolida), tales como los descritos en el documento WO09/068313 (que reivindica prioridad de la solicitud de patente europea EP 07023052), y/o alelos ind defectivos parciales (es decir, alelos IND cuya expresión funcional está parcialmente abolida) de acuerdo con la invención, se pueden combinar de acuerdo con las técnicas de cultivo estándar.

Los alelos ind defectivos parciales y/o completos pueden, por ejemplo, combinarse con una única planta de semillas dehiscentes mediante

(a) generar y/o identificar dos o más plantas, cada una de las cuales comprende uno o más alelos ind defectivos parciales y/o alelos ind defectivos totales, como se ha descrito anteriormente para el parcial y en el documento WO09/068313 (que reivindica la prioridad de la solicitud de patente europea Ep 07023052), para los alelos ind defectivos completos,

(b) cruzar una primera planta que comprende uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos seleccionados con una segunda planta que comprende uno o más otros alelos ind defectivos parciales y/o completos seleccionados, recolectando semillas F1 del cruzamiento y, opcionalmente, identificar una planta F1 que comprende uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos seleccionados de la primera planta con uno o más alelos i ind defectivos parciales y/o completos seleccionados de la segunda planta, como se ha descrito anteriormente,

(c) opcionalmente, repetir la etapa (b) hasta obtener una planta F1 que comprende todos los alelosind defectivos parciales y/o completos,

d) opcionalmente,

- identificar una planta F1, que es homocigota o heterocigota para un alelo ind defectivo parcial y/o completo seleccionado mediante la determinación del estado de cigosidad de los alelos IND mutantes, como se ha descrito anteriormente para el parcial y en el documento WO09/068313 (que reivindica la prioridad de la solicitud de patente europea EP 07023052), para los alelos ind defectivos completos, o

- generar plantas que son homocigotas para uno o más de los alelos indicios de eliminación parcial y/o total seleccionados mediante una de las siguientes etapas:

- extracción de plantas haploides duplicadas de células de microesporas o polen tratadas de plantas F1 que comprenden uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos, como se ha descrito anteriormente, - autofecundación de las plantas F1 que comprenden los uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos seleccionados para una o más generaciones (y), recolectar las semillas F1 Sy de las autofecundaciones e identificar las plantas F1 Sy, que son homocigotos para el uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos, tal como se ha descrito anteriormente.

Los alelos ind defectivos parciales y/o completos pueden, por ejemplo, ser transferidos de una planta de semillas dehiscentes a otra mediante

(a) generar y/o identificar una primera planta que comprende uno o más alelos ind defectivos parciales o completos seleccionados, como se ha descrito anteriormente (en el que la primera planta es homocigota o heterocigota para el uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos), como se ha descrito anteriormente (en el que la primera planta es homocigota o heterocigota para el uno o más alelos ind defectivos parciales y/o totales), (b) cruzar la primera planta que comprende el uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos con una segunda planta que no comprende el uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos, recolectar semillas F1 del cruzamiento (en el que las semillas son heterocigotas para un alelo ind defectivo parcial y/o completo si la primera planta era homocigota para ese alelo ind defectivo parcial y/o completo y en el que la mitad de las semillas son heterocigotas y la mitad de las semillas son azigas para, es decir, no comprenden, un alelo ind defectivo parcial y/o completo si la primera planta era heterocigota para ese alelo ind defectivo parcial y/o completo, y, opcionalmente, identificar las plantas F1 que comprenden uno o más alelos ind defectivos parciales o completos seleccionados, como se ha descrito anteriormente,

(c) retrocruzar las plantas F1 que comprenden uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos seleccionados con la segunda planta que no comprende uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos seleccionados para una o más generaciones (x), recolectar semillas de BCx de los cruces e identificar en cada generación las plantas de BCx que comprenden uno o más alelos ind defectivos parciales o completos seleccionados, como se ha descrito anteriormente,

d) opcionalmente, generar plantas Bcx que son homocigotas para uno o más de los alelos ind defectivos parciales y/o completos seleccionados mediante una de las siguientes etapas:

- extraer las plantas haploides duplicadas de células de microesporas o polen tratadas de plantas BCx que comprenden uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos, como se ha descrito anteriormente, - autofecundar las plantas BCx que comprenden uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos para una o más generaciones (y), recolectar semillas de BCx Sy de las autofecundaciones e identificar plantas de BCx Sy, que son homocigotas para el uno o más alelos ind defectivos parciales y/o completos deseados, tal como se ha descrito anteriormente.

La primera y la segunda planta de semillas dehiscentes pueden ser plantas de Brassicaceae, particularmente plantas de Brassica, especialmente plantas de Brassica napus o plantas de otras especies de cultivos de Brassica. Como alternativa, la primera planta puede ser una planta Brassicaceae, particularmente una planta de Brassica, especialmente una planta de Brassica napus o una planta de otra especie de cultivo de Brassica, y la segunda planta puede ser una planta de una línea de reproducción de Brassicaceae, particularmente de una línea de cultivo de Brassica, especialmente de una línea de reproducción de Brassica napus o de una línea de reproducción de otra especie de cultivo de Brassica. "Línea de reproducción", tal como se usa en el presente documento, es una línea de planta, preferentemente homocigota, que se distingue de otras líneas de planta por un genotipo y/o fenotipo preferido que se usa para producir descendencia híbrida.

SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1: ADN codificante del gen IND-A1 que codifica una proteína IND-A1 de tipo salvaje de Brassica napus.

SEQ ID NO: 2: Proteína IND-A1 de tipo salvaje codificada por la SEQ ID NO:1.

SEQ ID NO: 3: ADN codificante del gen IND-C1 que codifica una proteína IND-C1 de tipo salvaje de Brassica napus.

SEQ ID NO: 4: Proteína IND-C1 de tipo salvaje codificada por la SEQ ID NO:3.

SEQ ID NO: 5: ADN genómico del gen IND-A1 que codifica una proteína IND-A1 de tipo salvaje de Brassica napus. SEQ ID NO: 6: Proteína IND-A1 de tipo salvaje codificada por la SEQ ID NO:5.

SEQ ID NO: 7: ADN genómico del gen IND-C1 que codifica una proteína IND-C1 de tipo salvaje de Brassica napus. SEQ ID NO: 8: Proteína IND-C1 de tipo salvaje codificada por la SEQ ID NO:7.

SEQ ID NO: 9: ADN codificante del gen IND1 de Arabidopsis.

SEQ ID NO: 10: Proteína IND1 de Arabidopsis.codificada por SEQ ID NO:9.

SEQ ID NO: 11: Oligonucleótido para la detección de IND-A1-EMS06 y -WT.

SEQ ID NO: 12: Oligonucleótido para la detección de IND-A1-EMS06.

SEQ ID NO: 13: Oligonucleótido para la detección de IND-A1-WT.

SEQ ID NO: 14: Oligonucleótido para la detección de IND-A1-EMS09 y -WT.

SEQ ID NO: 15: Oligonucleótido para la detección de IND-A1-EMS09.

SEQ ID NO: 16: Oligonucleótido para la detección de IND-A1-WT.

SEQ ID NO: 17: Oligonucleótido para la detección de IND-A1-EMS13 y -WT.

SEQ ID NO: 18: Oligonucleótido para la detección de IND-A1-EMS13.

SEQ ID NO: 19: Oligonucleótido para la detección de IND-A1-WT.

SEQ ID NO: 20: Oligonucleótido para la detección de IND-C1-EMS04 y -WT.

SEQ ID NO: 21: Oligonucleótido para la detección de IND-C1-EMS04.

SEQ ID NO: 22: Oligonucleótido para la detección de IND-C1-WT.

SEQ ID NO: 23: Oligonucleótido para la detección de IND-C1-EMS08 y -WT.

SEQ ID NO: 24: Oligonucleótido para la detección de IND-C1-EMS08.

SEQ ID NO: 25: Oligonucleótido para la detección de IND-C1-WT.

SEQ ID NO: 26: Oligonucleótido para la detección de IND-C1-EMS09 y -WT.

SEQ ID NO: 27: Oligonucleótido para la detección de IND-C1-EMS09.

SEQ ID NO: 28: Oligonucleótido para la detección de IND-C1-WT.

A menos que se indique lo contrario en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular como se describe en Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, in los volúmenes 1 y 2 de Ausubel y col., (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE.UU. y en los volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, segunda edición, Academic Press (Reino Unido). Los materiales y procedimientos estándar para el trabajo molecular de plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Los materiales y procedimientos estándar para las reacciones en cadena de la polimerasa se pueden encontrar en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson en al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primera edición, Springer Verlag, Alemania. Los procedimientos estándar para el análisis AFLP se describen en Vos y col., (1995, NAR 23:4407-4414) y en la solicitud de patente EP publicada EP 534858.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Generación y aislamiento de alelos IND mutantes defectivos parciales (ind)

Se generaron mutaciones en los genes IND representados en la SEQ ID NO: 1 o 3 y 5 o 7 del listado de secuencias y se identificaron del siguiente modo:

- 30.000 semillas de una línea de reproducción de colza de semillas oleaginosas de élite (semillas M0) se embebieron previamente durante dos horas en papel de filtro húmedo en agua desionizada o destilada. La mitad de las semillas fueron expuestas a 0,8 % de EMS y la mitad a 1 % de EMS (Sigma: M0880) y se incubaron durante 4 horas.

- Las semillas mutagenizadas (semillas M1) se enjuagaron 3 veces y se secaron en una campana de extracción durante la noche. Se cultivaron 30.000 plantas M1 en el suelo y se autofecundaron para generar semillas M2. Se cosecharon semillas M2 para cada planta M1 individual.

- Se cultivaron dos veces 4.800 plantas M2, derivadas de diferentes plantas M1, y se prepararon muestras de ADN a partir de muestras de hojas de cada planta M2 individual de acuerdo con el procedimiento CTAB (Doyle y Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15).

- Se analizaron las muestras de ADN para detectar la presencia de mutaciones puntuales en los genes IND que causan la sustitución de aminoácidos en las proteínas IND, particularmente en el dominio bHLH de las proteínas IND, mediante secuenciación directa mediante técnicas de secuenciación estándar (Agowa) y análisis de las secuencias para detectar la presencia de mutaciones puntuales utilizando el software NovoSNP (VIB Antwerp). - Se identificaron así los alelos IND mutantes defectivos parciales (ind) indicados en las Tablas 3a y b anteriores.

En conclusión, los ejemplos anteriores muestran cómo se pueden generar y aislar alelos IND mutantes defectivos parciales. Asimismo, el material vegetal que comprende dichos alelos mutantes se puede usar para combinar alelos IND mutantes seleccionados en una planta, como se describe en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 2 - Identificación de una planta de Brassica que comprende un alelo mutante IND defectivo parcial de Brassica

Las plantas de Brassica que comprenden las mutaciones en los genes IND identificados en el Ejemplo 1 se identificaron como sigue:

- Para cada gen IND mutante identificado en la muestra de ADN de una planta M2, se cultivaron al menos 50 plantas M2 derivadas de la misma planta M1 que la planta M2 que comprende la mutación IND y se prepararon muestras de ADN a partir de muestras de hojas de cada planta M2 individual.

- Las muestras de ADN se seleccionaron para detectar la presencia de la mutación IND puntual identificada como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1.

- Las plantas M2 heterocigotas y homocigotas (según se determinó según los electroferogramas) que comprendían la misma mutación se autofecundaron y se cosecharon las semillas M3.

Ejemplo 3 - Análisis de las propiedades de dehiscencia del fruto de plantas de Brassica que comprenden un gen IND de Brassica mutante defectivo parcial y/o completo

Para determinar la correlación entre la presencia de genes IND mutantes defectivos parciales y/o completos en las plantas de Brassica y las propiedades de dehiscencia del fruto de las plantas de Brassica, las propiedades de dehiscencia del fruto de las plantas de Brassica napus que comprenden un gen IND mutante defectivo parcial en estado homocigoto solo o un gen IND mutante defectivo parcial y completo en estado homocigoto se analizaron en el invernadero y en el campo y se compararon con las propiedades de dehiscencia del fruto de plantas de Brassica napus que comprenden de 2 a 4 alelos ind defectivos completos como se describe en el documento WO09/068313 (que reivindica la prioridad de la solicitud de patente europea EP 07023052) como sigue:

- Para examinar si los márgenes de la valva del fruto y las propiedades de dehiscencia de las vainas de semillas se vieron afectadas y cómo se vieron afectadas por la presencia de genes IND mutantes defectivos parciales y/o totales, el fruto ind se comparó con el fruto de tipo salvaje utilizando las siguientes pruebas macroscópicas: (a) Inspección de las vainas de semillas y plantas en general a simple vista para determinar las diferencias en el fenotipo de las vainas y plantas causadas por la presencia de diferentes genes IND mutantes defectivos parciales y/o completos. Determinación del fenotipo de las vainas: Cuando las vainas se cultivaron y se llenaron por completo, justo antes de amarillear, se evaluó el grado de nitidez de la zona que delinea la valva y el espolón en la zona donde ambas valvas ya no se tocan (en el extremo distal de la vaina) de 5 vainas aleatorias (de diferentes plantas si hay varias plantas por línea disponibles) y se atribuyó una puntuación de 1 a 5:1 para una indentación clara y una zona fina y afilada que separa la valva y el espolón; 2 para algo de indentación y zona transparente, aunque más borrosa, que separa la valva del espolón; 3 para valvas y espolón que todavía son bien observables como dos tejidos diferentes pero con una transición muy suave entre ellos; 4 para valvas y espolón que apenas son observables como tejidos diferentes; 5 para una transición completamente suavizada entre las valvas y el espolón sin ninguna diferenciación clara entre ambos tipos de tejidos, es decir, cuanto menor sea la indentación entre la valva y el espolón en el extremo distal de las vainas, mayor será la puntuación. Una puntuación de 1 (indentación aguda entre la valva y el pico) corresponde a un fenotipo de tipo salvaje de las vainas, más específicamente, un fenotipo de vaina sensible al desgranado de las vainas; una puntuación de 2 a 4 (transición más gradual entre la valva y el pico) corresponde a un fenotipo de vaina resistente al desgranado de las vainas, en la que el desgranado de las semillas se reduce o retrasa significativamente mientras se mantiene una capacidad de trillado agronómicamente relevante de las vainas, de forma tal que las vainas todavía se pueden abrir a lo largo de la zona de dehiscencia aplicando fuerzas físicas limitadas; y una puntuación de 5 (sin indentación entre la valva y el espolón) corresponde a un fenotipo de vaina resistente al desgranado de las vainas, en el que el desgranado de las semillas se reduce o retrasa a un grado que ya no permite una capacidad de trillado agronómicamente relevante de las vainas, de modo que las vainas no se puedan abrir a lo largo de la zona de dehiscencia aplicando fuerzas físicas limitadas.

(b) Prueba de Impacto Manual (MIT) para determinar el aumento en la resistencia al desgranado de la vaina causada por la presencia de diferentes genes IND mutantes defectivos parciales y/o completos: El nivel de resistencia al desgranado de la vaina de las líneas de Brassica napus que comprenden un gen IND mutante defectivo parcial en estado homocigoto solo o un gen IND mutante defectivo parcial y completo en estado homocigoto y de las líneas Brassica que comprenden los alelos IND de tipo salvaje correspondientes se comparó en un forma semicuantitativa determinando las fuerzas físicas necesarias para abrir vainas maduras cerradas mediante la aplicación manual de torsión en las vainas. A la resistencia al desgranado de las vainas se le atribuyó una puntuación de 1 a 5 en función de esta fuerza física: 1 para vainas que se abren completamente a lo largo de la zona de dehiscencia con la menor torsión, 2-4 para las vainas que se abren solo en la base de la zona de dehiscencia y necesitan una torsión más fuerte para abrirse completamente y 5 para las vainas que solo se pueden aplastar y no se abren a lo largo de la zona de dehiscencia.

(c) Prueba de Impacto Aleatorio (RIT) para determinar el aumento en la resistencia al desgranado de la vaina causada por la presencia de diferentes genes IND mutantes defectivos parciales y/o completos: El nivel de resistencia al desgranado de la vaina de las líneas de Brassica napus que comprenden un gen IND mutante defectivo parcial en estado homocigoto solo o un gen IND mutante defectivo parcial y completo en estado homocigoto y de las líneas de Brassica que comprenden los alelos IND de tipo salvaje correspondientes se comparó de manera cuantitativa determinando la semivida de las muestras de vainas de ambas líneas de acuerdo con Bruce y col., (2002, citado anteriormente,). Más específicamente, dos muestras replicadas de 20 vainas maduras intactas de cada línea se sometieron a un RIT. Se colocaron 20 vainas junto con seis bolas de acero de 12,5 mm de diámetro en un recipiente cilíndrico de 20 cm de diámetro con su eje vertical. A continuación, el recipiente se sometió a un movimiento armónico simple de frecuencia 4,98 Hz y de carrera de 51 mm en el plano horizontal. Las vainas, en las que se comprobó la solidez antes de la prueba, se agitaron durante tiempos acumulativos de 10, 20, 40 y, si más del 50 % de las vainas permanecen intactas, 80 s. El tambor se abrió después de cada período y se contó el número de vainas cerradas. Las vainas se examinaron y clasificaron como "cerradas" si la zona de dehiscencia de ambas valvas todavía estaba cerrada. Por lo tanto, las vainas se clasificaron como "abiertas" si una o ambas valvas se habían separado, de modo que la semilla se había liberado. Si la mayoría de las vainas se rompió o dañó sin abrir la zona de dehiscencia, la muestra se marcó como "incontable" (indicado con * en la Tabla 5b). Para dar a cada punto un peso igual, los datos se separaron de forma uniforme en la variable independiente, el tiempo, añadiendo 1 y tomando el log-¹⁰. El porcentaje de vainas abiertas p se transformó mediante la transformación logit, es decir, logit p = loge(p/100-p). A continuación, se ajustó un modelo lineal a los datos transformados de tiempo y porcentaje, y se usó para estimar la semivida.

(d) Pruebas de campo para determinar la relación entre la resistencia al desgranado de vainas, la capacidad de trillado y el rendimiento y la presencia de ciertos alelos IND mutantes en las plantas: El nivel de resistencia al desgranado de las vainas, la capacidad de trillado y el rendimiento de las líneas de Brassica que comprenden los alelos IND mutantes y las líneas de Brassica que comprenden los alelos IND de tipo salvaje correspondientes se compararon de forma semicuantitativa determinando y comparando el nivel de desgranado de semillas (SHAT), la capacidad de cosechadora combinada (CHA1) y la capacidad de trillado (CHA2) y de manera cuantitativa determinando y comparando el rendimiento de semillas por parcela después de combinar (YLDP) y el rendimiento de semillas después del trillado de la paja (YLDS) en el campo entre parcelas con plantas ind y parcelas con plantas de tipo salvaje. A las parcelas se les atribuyó una puntuación de 1-9 para indicar el nivel de destrucción de semillas en la parcela antes de la cosecha: una puntuación de 1 para indicar que prácticamente todas las plantas en la parcela se habían desgranado antes de la cosecha a una puntuación de 9 para indicar que prácticamente ninguna planta en la parcela se había desgranado antes de la cosecha. A las parcelas se les atribuyó una puntuación de 1-5 para indicar el nivel de capacidad de cosecha de la cosechadora combinada en la parcela: una puntuación de 1, a 3 o 5 para indicar que fue difícil, factible o fácil, respectivamente, cosechar la parcela con una cosechadora combinada. A las parcelas se les atribuyó una puntuación de 1-5 para indicar el nivel de capacidad de trillado de la parcela: una puntuación de 1, a 3 o 5 para indicar que fue difícil, factible o fácil, respectivamente, para cosechar manualmente la semilla que queda en la paja después de la cosechadora combinada. El rendimiento de semilla por parcela después de combinar (YLDP; expresado en gramos por parcela) se determinó cosechando las semillas por parcela con una cosechadora combinada y pesando las semillas y el rendimiento de la semilla después de cortar la paja (YLDS; expresado en % en peso de la paja) se determinó cosechando manualmente las semillas restantes en la paja después de la cosecha de semillas con la cosechadora combinada.

- Para examinar más de cerca si las células en el margen valvar de las vainas de las semillas se ven afectadas por la presencia de genes IND mutantes defectivos parciales y/o completos, se compararon las secciones de fruto ind con secciones de fruto de tipo salvaje mediante evaluación microscópica de las vainas de las semillas:

- Explantes: Explantes de aproximadamente 3 mm tomados del centro y los extremos distales de las vainas de una etapa de desarrollo similar (aproximadamente 35 días después de la antesis (DAA), una etapa de desarrollo que corresponde estrechamente al inicio del amarilleamiento visible del pericarpio) y el tamaño se cosecharon de plantas cultivadas en un invernadero (tres vainas para cada genotipo). Una zona de dehiscencia se diseccionó de las vainas.

- Fijación: La fijación se realizó en tampón K-fosfato 100 mM a pH 7 con formalina al 10 % y glutaraldehído al 0,25 % durante un total de 4 horas. La infiltración al vacío se realizó después de 1 y 2 horas durante 15 minutos. El fijador se renovó después de cada infiltración al vacío.

- Deshidratación: El espécimen se enjuagó 2 veces 30 minutos con tampón K-fosfato 100 mM a pH 7. La deshidratación se realizó con etanol técnico diluido con NaCl al 0,85 % en agua: 60 minutos (') en 50 % de etanol, 90' en 70 % de etanol, 90' en 80 % de etanol, 90' en 90 % de etanol, 90' en 95 % de etanol, 90' en 100 % de etanol a temperatura ambiente.

- Inclusión: La inclusión se realizó con los kits de inclusión Leica 7022-31731 Historesin o Kulzer Histo-Technik 7100 (Heraeus), que son kits de resina de tres componentes (una resina básica, un activador y un endurecedor). Los tres componentes se utilizaron en las proporciones recomendadas por el fabricante de la siguiente manera: la muestra se incubó durante 4 horas en 50 % de etanol/50 % de resina básica, durante la noche en 30 % de etanol/70 % de resina básica (opcional: a 4 °C), durante de 2 a 4 horas en 100 % de resina básica, durante un día en 100 % de resina básica después de renovar la resina básica y la infiltración al vacío durante 20' (opcionalmente a 4 °C), durante un día en resina básica activador (1 %) ("medio de infiltración") después de la infiltración al vacío en este medio durante 20 minutos. La muestra se lavó con resina básica activador (1 %) endurecedor (1 ml en 15 ml) ("medio de inclusión"). La inclusión se realizó en moldes de inclusión planos (moldes de inclusión plana AGAR G3531 con cavidades de aproximadamente 300 pl: 14 mm de largo x 6 mm de ancho x 4 mm de profundidad): se añadieron 100-125 pl de medio/cavidad de inclusión, el medio de inclusión se polimerizó a 55 °C durante aproximadamente una hora, el tejido se colocó en el medio de inclusión polimerizado (1 explante/cavidad), las cavidades se llenaron con medio de inclusión, el medio de inclusión se polimerizó durante de 3 a 5 horas a 55 °C, los moldes se enfriaron, los bloques de plástico se retiraron de los moldes y se almacenaron a temperatura ambiente en un recipiente sellado (por ejemplo, tubo Eppendorf). - Seccionamiento: Los bloques de plástico se pegaron con el lado plano en un bloque de perpex de 1 cm3 y se recortaron en cuadrados alrededor de la muestra. Se cortaron secciones de 4 pm (3 a 4 explantes por genotipo, aproximadamente 25 secciones por explante) con un cuchillo de vidrio ralph (hecho en la posición -1 del histoknifemaker de Reichert-Jung usando varillas de vidrio de 6 mm de espesor bajo un ángulo de corte de aproximadamente 6°) en el microtomo. Las secciones se unieron en portaobjetos de vidrio tratados con Vectabond (Laboratorios Vector).

- Demostración de lignina: se examinaron secciones no teñidas montadas en Eukitt usando un microscopio equipado para fluorescencia (con el filtro Zeiss set 02). La lignina presenta fluorescencia transparente azulada. - Evaluación de histología: las secciones sin teñir se visualizaron usando DIC-Normaski o autofluorescencia (con el filtro Zeiss 18 - Excitación BP390-420; Emisión LP450).

Material vegetal:

Progenie de una línea vegetal que comprende una mutación defectiva completa en el gen IND-A1 (indicado como inda1F), en particular el alelo ind-a1-EMS01 descrito en el documento WO09/068313 (que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052) (indicado como ind-a1-01 en la Tabla 5) y una mutación defectiva parcial en el gen IND-C1 (indicado como ind-c1P), en particular, los alelos ind-c1-EMS04,-EMS08 y -EMS09 indicados en la Tabla 3b (indicados como ind-c1-04, -08 y -09 en la Tabla 5), con genotipo ind-a1F/ind-a1F, And-c1PAnd-c1P (es decir, plantas homocigotas de doble mutante), IND-A1/IND-A1, ind-c1P/md- c1P (es decir, plantas mutantes individuales homocigotas) e ND-A1/IND-A1, IND-C1/IND-C1 (es decir, plantas de tipo salvaje).

Progenie de una línea vegetal que comprende una mutación defectiva parcial en el gen IND-A1 (indicado como inda1P), en particular, los alelos ind-a1-EMS06, -EMS09 y -EMS13 alelos indicados en la Tabla 3a (indicados como inda1-06, -09 y -13 en la Tabla 5)y una mutación defectiva completa en el gen IND-C1 (indicado como ind-c1F), en particular el alelo ind-c1-EM S0l y el alelo ind-c1-EMS03 descritos en el documento WO09/068313 (que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052) (indicado como ind-c1-01 y -03 en la Tabla 5), con genotipo ind-a1P/ind-a1P, ind-c1F/ind-c1 F(es decir, plantas homocigotas doble mutante), IND-A1/IND-A1, ind-c1F/indc1F (es decir, plantas mutantes individuales homocigotas) e IND-A1/IND-A1, IND-C1/IND-C1 (es decir, plantas de tipo salvaje).

Evaluación macroscópica:

a) Inspección de las vainas de semillas y plantas a simple vista.

- Las vainas de plantas hermanas IND homocigotas de doble mutante con genotipo ind-a1F/ind-a1F, ind-c1P/ind-c1P o ind-a1Plind-a1P, ind-c1F/ind-c1F mostraron un fenotipo similar a las vainas de las plantas que comprenden un alelo ind defectivo completo en estado homocigoto y un alelo ind defectivo completo en estado heterocigoto descrito en el documento WO09/068313 (que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052) (genotipo: ind-a1F/ind-a1F, IND-C1/ind-c1Fo IND- A1//nd-a1F, ind-c1F/ind-c1F, en el que ind-a1F es un alelo ind-a1 defectivo completo, en particular el alelo ind-a1-EMS01 o ind- a1-EMS05 descrito en el documento WO09/068313 (que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052) y en el que ind-c1F es un alelo ind-c1 defectivo completo, en particular el alelo ind-c1-EMS01 o ind-c1-EMS03 descrito en el documento WO09/068313 (que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052)). Más específicamente, los márgenes de las valvas de las vainas de estas plantas hermanas mutantes IND estaban en general mejor definidas que en las plantas hermanas IND mutantes dobles homocigotas descritas en el documento WO09/068313 (que reivindica prioridad sobre la solicitud de patente europea EP 07023052) (que mostró una falta de definición de margen de la valva, particularmente evidente tanto en el extremo proximal como distal del fruto, en comparación con las vainas de plantas hermanas IND de tipo salvaje), pero la marcada indentación entre la valva y el espolón en el extremo distal de las vainas en las plantas hermanas de tipo salvaje todavía estaba ausente en gran medida en estas plantas mutantes como en las plantas hermanas ind defectivas completas doble homocigotas, que también mostraron una transición más gradual entre la valva y el tejido del espolón (véase también la puntuación visual en la Tabla 5a para plantas cultivadas en invernadero y en la Tabla 5b para plantas cultivadas en campo).

- Las vainas de plantas hermanas IND mutantes homocigotas simples (genotipo: IND-A1/IND-A1, ind-c1P/ind-c1P o ind- a1P/ind-a1P, IND-C1/IND-C1) mostraron una morfología de vaina similar a las vainas de plantas hermanas IND de tipo salvaje, a excepción de las vainas de plantas hermanas IND mutantes simples homocigotas con genotipo IND-A1-EMS01/IND-A1-EMS01, ind-c1- EMS09/ind-c1-EMS09, que mostraron una morfología de la vaina alterada similar a las vainas de las plantas hermanas IND mutantes doble homocigotas con genotipo ind-a1F/ind-a1F, indc1P/ind-c1P o ind-a1P/ ind-a1P, ind-c1F/ind-c1F (véase también la puntuación visual en la Tabla 5a para plantas cultivadas en invernadero y en la Tabla 5b para plantas cultivadas en campo). Se observó además que la presencia del alelo ind-c1-EMS09 en estado heterocigoto en plantas (genotipo: IND-Al/IND-A1, IND-C1/ind-c1-EMs09) fue suficiente para causar una morfología de la vaina alterada similar a las vainas de las plantas hermanas IND mutantes dobles homocigotas con genotipo ind-a1F/ind-a1F, ind-c1P/ind-c1P o ind-a1P/ind-a1P, ind-c1F/ind-c1F. Se cree que el alelo ind-c1-EMS09, que comprende una mutación de sustitución en un aminoácido conservado del dominio de unión al ADN básico, podría producir una proteína IND negativa dominante que aún sea capaz de formar dímeros, pero no es capaz de unirse al sitio de unión de bHLH del gen o genes regulados.

b) Prueba de impacto aleatorio:

- La Tabla 5 muestra que el valor de LD50 fue, en general, más alto para las vainas de plantas que comprenden un alelo ind-c1 defectivo completo en estado homocigoto y un alelo ind-a1 defectivo parcial en estado homocigoto que para las vainas de plantas que comprenden un alelo ind-a1 defectivo parcial en estado homocigoto que indica que las mutaciones en el alelo IND-C 1 podría tener un efecto más fuerte sobre la resistencia al desgranado de las vainas que las mutaciones en el alelo IND-A1.

Tabla 5a

Genotipo Puntuación visual LD50 Inferior corregido 95 Superior corregido de las vainas 0 sec % 95 %

(continuación)

Genotipo Puntuación visual LD50 Inferior corregido 95 Superior corregido de las vainas (0 (sec) % 95 %

10

IND-A1-09/IND-A1 -09, IND-C1- 0 9,36 2,6 1,7

01/IND-C1-01

ind-a1 -09/ind-a1 -09, IND-C1-01/IND- 1 9,05 2,83 2,15

C1-01

ind-a1-09/ind-a1-09, ind-c1-01/ind- 8 52,03 8,96 14,03 c1-01

IND-A1-09/IND-A1 -09, IND-C1- 0 8,44 2,74 2,26

03/IND-C1-03

ind-a1 -09/ind-a1 -09, IND-C1-03/IND- 0 9,05 2,83 2,15

C1-03

ind-a1-09/ind-a1-09, ind-c1 -03/ind- 8,5 85,57 23,34 64,64 c1-03

IND-A1-13/IND-A1-13, IND-C1- 3 12,91 2,4 2,46

01/IND-C1-01

ind-a1-13/ind-a1-13, IND-C1-01/IND- 2 14,2 2,2 2,59

C1-01

ind-a1-13/ind-a1-13, ind-c1-01/ind- 7 61,21 9,6 15,18 c1-01

IND-A1-13/IND-A1-13, IND-C1- 0 8,86 * *

03/IND-C1-03

ind-a1-13/ ind-a1-13, IND-C1- 0 7,74 3,98 1,54

03/IND-C1-03

ind-a1-13/ind-a1-13, ind-c1 -03/ind- 9 56,68 8,9 13,6 c1-03

IND-A1-01/IND-A1-01, IND-C1- 0 7,89 2,88 2

04/IND-C1-04

IND-A1-01/IND-A1-01, ind-c1-04/ 0 10,91 2,5 2

ind-c1-04

ind-a1-01/ind-a1-01, ind-c1-04/ind- 9 37,8 5,77 8,4

c1-04

IND-A1-01/IND-A1-01, IND-C1- 0 8,94 2,78 2,38

08/IND-C1-08

IND-A1-01/IND-A1-01, ind-c1-08/ 0 9,8 2,8 2,1

ind-c1-08

ind-a1-01/ind-a1-01, ind-c1-08/ind- 8, 31,81 6,66 10,45 c1-08

IND-A1-01/IND-A1-01, IND-C1- 0 7,22 3,56 1,82

09/IND-C1-09

IND-A1-01/IND-A1-01, ind-c1-09/ 8,5 46,6 7,82 11,48 ind-c1-09

ind-a1-01/ind-a1-01, ind-c1-09/ind- 9 90,11 * *

c1-09

Tabla 5b

continuación

c) Pruebas de campo

La Tabla 5c muestra el nivel de desgranado de semillas (SHAT), la capacidad de cosechado de la cosechadora combinada (CHA1), la capacidad de trillado (CHA2), el rendimiento de semillas por parcela después de combinar (YLDP) y el rendimiento de semillas después del trillado de la paja (YLDS) determinado como se ha descrito anteriormente para parcelas de campo con plantas ind y plantas de tipo salvaje como se indica. El valor de YieldWTSeg% representa el YLDP como un porcentaje del segregante de tipo salvaje dentro de una población segregante.

Tabla 5c

(continuación)

Genotipo SHAT (1 CHA1 (1 CHA2 (1 YLDP (en Rendimiento YLDS (en %

9) 5) 5) gramos por en peso WTSeg% de paja) parcela)

md-a1-06/md-a1-06, imd- c1- 8,7 4,4 4,9 2525,1 112 1,1 01/imd-c1-01

IND-A1-06/IND-A1 -06, 8,6 4,6 4,9 2102,0 100 0,5

IND-C1-03/IND-C1-03

md-a1-06Amd-a1-06, IND- 8,7 4,8 5,0 2292,7 109 0,4

C1-03/IND-C1-03

md-a1-06/md-a1-06, imd- c1- 8,8 4,1 4,6 2276,2 108 1,3 03/md-c1-03

IND-A1-09/IND-A1 -09, 8,3 5,0 4,9 1964,2 100 0,3

IND-C1-01/IND-C1-01

imd-a1 -09/imd-a1 -09, IND- 8,0 4,7 5,0 1872,0 95 0,4

C1-01/IND-C1-01

md-a1-09/md-a1-09, imd- c1- 9,0 2,7 3,8 2323,3 118 5,7 01Amd-c1-01

IND-A1-09/IND-A1 -09, 8,6 4,8 5,0 2168,9 100 0,5

IND-C1-03/IND-C1-03

imd-a1 -09/imd-a1 -09, IND- 8,3 4,7 5,0 1985,6 92 0,4

C1-03/IND-C1-03

imd-a1-09/imd-a1-09, imd- c1- 9,0 1,9 3,6 1726,7 80 13,6 03/md-c1-03

IND-A1-13/IND-A1-13, 8,3 4,8 5,0 1977,1 100 0,4

IND-C1-01/IND-C1-01

imd-a1-13Amd-a1-13, IND- 8,4 4,2 4,9 1929,3 98 0,5

C1-01/IND-C1-01

imd-a1-13Amd-a1-13, imd- c1- 8,9 3,6 4,7 2445,6 124 2,0 01Amd-c1-01

IND-A1-13/IND-A1-13, 8,3 4,2 5,0 1885,1 100 0,4

IND-C1-03/IND-C1-03

im d-al-13/im d-al-13, IND- 8,3 4,8 5,0 2137,8 113 0,6

C1-03/IND-C1-03

imd-a1-13Amd-a1-13, imd- c1- 8,9 2,8 3,9 2120,9 113 4,8 03/md-c1-03

IND-A1-01/IND-A1-01, 8,8 4,9 4,8 2120,4 100 0,6

IND-C1-04/IND-C1-04

IND-A1-01/IND-A1-01, imd- 8,6 4,8 5,0 2136,4 101 0,6 c1-04/md-c1-04

imd-a1-01/md-a1-01, imd- c1- 9,0 1,8 2,8 1437,0 68 19,1 04/md-c1-04

IND-A1-01/IND-A1-01, 8,0 4,8 5,0 2250,4 100 0,6

IND-C1-08/IND-C1-08

IND-A1-01/IND-A1-01, imd- 8,3 4,3 4,9 2131,3 95 0,5 c1-08/md-c1-08

imd-a1-01/md-a1-01, imd- c1- 8,9 3,0 4,1 2385,1 106 2,5 08/md-c1-08

IND-A1-01/IND-A1-01, 8,7 4,9 5,0 2080,0 100 0,4

IND-C1-09/IND-C1-09

IND-A1-01/IND-A1-01, imd- 8,7 4,6 4,6 2447,8 118 1,0 c1-09/md-c1-09

imd-a1-01/md-a1-01, imd- c1- 9,0 1,1 1,8 589,6 28 28,4 09/md-c1-09

Evaluación microscópica:

- Las vainas de plantas hermanas IND mutantes dobles homocigotas con genotipo imd-a1F/md-a1F, md-c1PAmd-c1P o ind- a1P/md-a1P, ind-c1F/md-c1F y las vainas de plantas hermanas IND mutantes simples homocigotas con genotipo IND- A1-EMS01/IND-A1-EMS01, md-c1-EMS09/md-c1-EMS09, cultivadas en condiciones de invernadero, mostraron en sus extremos distales lignificación en toda la zona de dehiscencia y una mala diferenciación de las células que pertenecen a la zona de dehiscencia de los tipos de células vecinas, tales como las células del tejido vascular y la capa de células lignificadas que normalmente se encuentran en la pared interna de la vaina (es decir, las células enb). En el centro de las vainas, la lignificación no se produjo en toda la zona de dehiscencia completa, pero las vainas mostraron solo unas pocas capas adicionales de células lignificadas, en cambio, donde la pared interna de la vaina está unida al tabique.

- Las vainas de plantas hermanas IND mutantes dobles homocigotas con genotipo ind-a1-EMS01/ind-aA1-EMS01, ind- c1-EMS09/ind-c1-EMS09 mostraron tanto en sus extremos distales como en el centro de las vainas, lignificación en toda la zona de dehiscencia y una mala diferenciación de las células que pertenecen a la zona de dehiscencia de los tipos de células vecinas, tales como las células del tejido vascular y la capa de células lignificadas que normalmente se encuentran en la pared interna de la vaina (es decir, las células enb).

Ejemplo 4 - Detección y/o transferencia de genes IND mutantes en líneas de Brassica (élite)

Los genes IND mutantes se transfieren a líneas de reproducción de Brassica (élite) mediante el siguiente procedimiento: Una planta que contiene un gen IND mutante (planta donante), se cruza con una línea de Brassica (élite) (padre élite/padre recurrente) o variedad que carece del gen IND mutante. Se utiliza el siguiente esquema de introgresión (el gen IND mutante se abrevia a ind mientras que el tipo salvaje se representa como IND):

Cruce inicial: ind/ind (planta donante) X IND/IND (padre de élite)

Planta F1: IND/ind

Cruce BC1: IND/ind X IND/IND (padre recurrente)

Plantas BC1: 50 % de IND/ind y 50 % de IND/IND

El 50 % de IND/ind se seleccionan utilizando marcadores moleculares (por ejemplo, AFLP, PCR, Invader™, y similares; véase también más adelante) para el alelo IND mutante (ind).

Cruce BC2: IND/ind (planta BC1) X IND/IND (padre recurrente)

Plantas BC2: 50 % de IND/ind y 50 % de IND/IND

El 50 de % IND/ind se seleccionan usando marcadores moleculares para el alelo IND mutante (ind).

El retrocruzamiento se repite hasta las plantas BC3 a BC6 BC3-6: 50 % de IND/ind y 50 % de IND/IND

El 50 % de IND/ind se seleccionan usando marcadores moleculares para el alelo IND mutante (ind). Para reducir el número de retrocruzamientos (por ejemplo, hasta BC3 en lugar de BC6), se pueden usar marcadores moleculares específicos para el fondo genético del padre de élite.

Cruce BC3-6 S1: IND/ind X IND/ind

Plantas BC3-6 S1: 25 % de IND/IND y 50 % de IND/ind y 25 % de ind/ind

Las plantas que contienen ind se seleccionan usando marcadores moleculares para el alelo IND mutante (ind). Las plantas individuales BC3-6 S1 que son homocigotas para el alelo IND mutante (ind/ind) se seleccionan usando marcadores moleculares para los alelos IND mutante y de tipo salvaje. Estas plantas se utilizan después para la producción de semillas.

Para seleccionar plantas que comprenden una mutación puntual en un alelo IND, se puede usar secuenciación directa mediante técnicas de secuenciación estándar conocidas en la técnica, tales como los descritos en el Ejemplo 1.

Como alternativa, se pueden desarrollar ensayos de PCR para discriminar plantas que comprenden una mutación puntual específica en un alelo IND de plantas que no comprenden esa mutación puntual específica. De este modo, se pueden desarrollar los siguientes ensayos de PCR discriminantes para detectar la presencia o ausencia y el estado de cigosidad de los alelos mutantes identificados en el Ejemplo 1 (véase la Tabla 3a y 3b):

- ADN molde:

- ADN genómico aislado del material foliar de plantas de Brassica mutantes homocigotas o heterocigotas (que comprende un alelo IND mutante, denominado en lo sucesivo "IND-Xx-EMSXX").

- Control de ADN de tipo salvaje: ADN genómico aislado del material foliar de plantas de Brassica de tipo salvaje (que comprende el equivalente de tipo salvaje del alelo IND mutante, denominado en lo sucesivo "IND-Xx-WT").

- Control positivo de ADN: ADN genómico aislado del material foliar de plantas de Brassica mutantes homocigotas que se sabe que comprenden IND-Xx-EMSXX.

- En general, cada conjunto de cebadores consiste en un cebador específico tanto para el gen diana mutante como el gen de tipo salvaje (por ejemplo, cebador específico tanto para el alelo IND-A1-EMS06 como para el alelo IND-A1-WT) y un cebador específico para la diferencia de nucleótidos (por ejemplo, cebador específico para el alelo IND-A1-EMS06 o el alelo IND-A1-WT). Habitualmente, el último nucleótido del último cebador coincide con la diferencia de nucleótidos, pero se puede añadir uno (o más) nucleótidos específicos de objetivo adicionales para mejorar la hibridación entre el cebador y su secuencia objetivo.

- Mezcla de PCR: 2,5 pl de tampón de PCR x10 (MgCh 15 mM), 0,25 pl de dNTP (20 mM), 1 pl de cebador directo (10 |jM), 1 |jl de cebador inverso (10 j M), 0,25 |jl de Taq-polimerasa (5U/jiI), 19,5 |jl de H²O Milli-Q, 0,5 |jl de ADN (20-50 ng/jil) = Volumen total de 25 jil.

- Perfil de termociclado: 4 min a 95 °C; 30x [1 min a 95 °C (desnaturalización) y 1 min a temperatura de hibridación y 2 min a 72 °C (alargamiento)]; 5 min a 72 °C; enfriar a 4 °C. La temperatura de hibridación óptima se puede determinar mediante PCR de gradiente de temperatura en la que la temperatura de hibridación se puede variar, por ejemplo, entre 57 °C y 70 °C en un termociclador MJ Research PTC-200 (Biozym). La temperatura de hibridación óptima para los cebadores específicos de IND de tipo salvaje es la temperatura a la que se puede detectar un fragmento de PCR transparente del tamaño esperado (como se describe a continuación) para la muestra de ADN de la planta Brassica de tipo salvaje y no para la muestra de ADN de la planta de Brassica mutante. La temperatura de hibridación óptima para los cebadores específicos de IND mutantes es la temperatura a la que se puede detectar un fragmento de PCR transparente del tamaño esperado (como se describe a continuación) para la muestra de ADN de la planta de Brassica mutante y no para la muestra de ADN de la planta de Brassica de tipo salvaje.

- Después de la amplificación, se añaden 5 jil de pigmento de carga (pigmento naranja) a 15 jil de las muestras de PCR y las muestras se cargan en un gel de agarosa al 1,5 %.

- Los patrones de bandas obtenidos después de la amplificación del ADN genómico de plantas mutantes de Brassica se evalúan de la siguiente manera:

- No se deben aceptar datos de muestras de ADN aisladas del material foliar de las plantas de Brassica mutantes dentro de un solo ciclo de PCR y una única mezcla de PCR a menos que:

- el control de ADN de tipo salvaje muestra el fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de IND-Xx-WT y ningún fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de IND-Xx-EMSXX

- el control de ADN positivo muestra el fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de IND-Xx-EMSXX y ningún fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de IND-Xx-WT

- Carriles que no muestran producto de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de IND-Xx-W T y el fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de IND-Xx-EMSXX, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el ADN genómico molde, es un mutante homocigoto para IND-Xx-EMSXX.

- Carriles que muestran el fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de IND -Xx-W Ty el ensayo de PCR específico de IND-Xx-EMSXX, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el ADN genómico molde, es un mutante heterocigoto para IND-Xx-EMSXX.

- Carriles que muestran el fragmento de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de IND -Xx-W T y ningún producto de PCR del tamaño esperado para el ensayo de PCR específico de IND-Xx-EMSXX, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el ADN genómico molde, es una planta de tipo salvaje.

Como alternativa, se puede usar la tecnología Invader™ (Third Wave Agbio) para discriminar plantas que comprenden una mutación puntual específica en un alelo IND de plantas que no comprenden esa mutación puntual específica. Las siguientes sondas discriminantes Invader™ se desarrollaron para detectar la presencia o ausencia y el estado de cigosidad de los alelos mutantes identificados en el Ejemplo 4 (véase la Tabla 6:

- Las sondas específicas para el gen IND objetivo mutante o correspondiente de tipo salvaje (indicado como "5'flaplx" y "5' flap2-x", respectivamente) y las sondas "invasoras" que pueden usarse en combinación con ellas están indicadas en la tabla 6. Generalmente, cada conjunto de sondas consiste en una sonda específica para el gen diana mutante o de tipo salvaje del cual el primer nucleótido después de la secuencia 5' flap coincide con la diferencia de nucleótidos (nucleótido subrayado en la Tabla 6) (la llamada "sonda primaria"; por ejemplo, la sonda con la SEQ ID NO: 12 es específica para IND-A1-EMS06 y la sonda con la SEQ ID NO: 13 es específica para IND-A1-WT) y una sonda específica para los nucleótidos corriente arriba de la diferencia de nucleótidos (el llamado "invader® oligo"; por ejemplo, la sonda con la SEQ ID NO: 11 es específica para los nucleótidos corriente arriba de la diferencia de nucleótidos entre IND-A1-EMS06 e IND-A1-WT). El último nucleótido del último cebador puede coincidir con la diferencia de nucleótidos en el mutante (como indican los nucleótidos en negrita en la Tabla 6), pero también se pueden usar otros nucleótidos para este último nucleótido siempre que la sonda primaria y el invasor® oligo aún pueden formar una sola superposición de bases cuando se hibridan con el ADN objetivo para generar la estructura invasiva específica reconocida por las enzimas Cleavase® (Third Wave Agbio).

- El procedimiento de ensayo Invader™ y la interpretación de los datos se realizan según lo prescrito por el fabricante (Third Wave Agbio). Brevemente, las secuencias de nucleótidos indicadas como "flap 1" y "flap2" en la Tabla 6 representan las secuencias de los "flap" 5' que se cortan de las sondas primarias en la fase primaria del ensayo Invader™ y que son complementarias a las secuencias en el casete FRET™ 1 y 2, respectivamente, y no complementarias a las secuencias mutantes diana o de tipo salvaje. Si las sondas primarias se cortan en la fase primaria y la sonda flapl y/o la sonda flap2 se hibridan con los casetes FRET™ 1 y 2, respectivamente, en la fase secundaria, se genera una señal indicativa de la presencia en la muestra del gen IND objetivo mutante o correspondiente de tipo salvaje, respectivamente.

Tabla 6

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un alelo mutante defectivo parcial de un gen IND, en el que el gen IND comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3 desde el nucleótido en la posición 46 hasta el nucleótido en la posición 633, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7;

(b) una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con la s Eq ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 desde el aminoácido en la posición 16 hasta el aminoácido en la posición 210, o la SEQ ID NO: 4,

en el que dicho alelo mutante defectivo parcial comprende una o más mutaciones de sentido erróneo en la secuencia de ácido nucleico de dicho gen IND que da como resultado la producción de una proteína IND en la que al menos un aminoácido seleccionado del aminoácido en una posición correspondiente a la posición 124 de SEQ ID NO:2, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 146 de la SEQ ID NO:2, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 159 de la SEQ ID NO:2, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 136 de la SEQ ID n O:4, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 139 de la SEQ ID NO:4 o el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 142 de la SEQ ID NO:4, está sustituido con otro aminoácido.

2. Un alelo mutante de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona entre el grupo que consiste en:

- un alelo IND que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 en la que la G en la posición 370 está sustituida por A; - un alelo IND que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 en la que la G en la posición 436 está sustituida por A; - un alelo IND que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 en la que la C en la posición 476 está sustituida por T; - un alelo IND que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 en la que la C en la posición 407 está sustituida por T; - un alelo IND que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 en la que la G en la posición 415 está sustituida por A; y - un alelo IND que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 en la que la C en la posición 424 está sustituida por T.

3. Un alelo mutante de acuerdo con la reivindicación 1, que se deriva de una planta de una especie de Brassica, preferentemente de una especie de cultivo de Brassica o una especie de semilla oleosa de Brassica.

4. Una proteína IND mutante codificada por un alelo mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un procedimiento de identificación de un alelo IND mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en una muestra biológica que comprende determinar la presencia de una región específica de IND mutante en un ácido nucleico presente en la muestra biológica.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además someter la muestra biológica a un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa usando un conjunto de al menos dos cebadores, estando dicho conjunto seleccionado del grupo que consiste en:

- un conjunto de cebadores, en el que uno de dichos cebadores reconoce específicamente la región flanqueante en 5' del alelo IND mutante y el otro de dichos cebadores reconoce específicamente la región flanqueante en 3' del alelo IND mutante, respectivamente,

- un conjunto de cebadores, en el que uno de dichos cebadores reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y el otro de dichos cebadores reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante,

- un conjunto de cebadores, en el que uno de dichos cebadores reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y el otro de dichos cebadores reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante, respectivamente.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además someter la muestra biológica a un ensayo de hibridación usando un conjunto de sondas específicas que comprenden al menos una sonda específica, estando dicho conjunto seleccionado del grupo que consiste en:

- un conjunto de sondas específicas, en el que una de dichas sondas reconoce específicamente la región flanqueante en 5' del alelo IND mutante y la otra de dichas sodas reconoce específicamente la región flanqueante en 3' del alelo IND mutante,

- un conjunto de sondas específicas, en el que una de dichas sondas reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y la otra de dichas sondas reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante,

- un conjunto de sondas específicas, en el que una de dichas sondas reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y la otra de dichas sondas reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante, respectivamente, - una sonda específica que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante.

8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 929 o del 931 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 930 de SEQ ID NO: 5 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 930 o del 930 al 1622 0 el complementario del mismo, respectivamente, o

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 995 o del 997 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 996 de SEQ ID NO: 5 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 996 o del 996 al 1622 0 el complementario del mismo, respectivamente o

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 1035 o del 1037 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 1036 de SEQ ID NO: 5 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 1036 o del 1036 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente o

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 902 o del 904 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 903 de SEQ ID NO: 7 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 903 o del 903 al 1593 0 el complementario del mismo, respectivamente o

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 910 o del 912 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 911 de SEQ ID NO: 7 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 911 o del 911 al 1593 0 el complementario del mismo, respectivamente o

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 919 o del 921 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 920 de SEQ ID NO: 7 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 920 o del 920 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente.

9. Un procedimiento para determinar el estado de cigosidad de un alelo IND mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una planta o célula, parte, semilla o progenie de la misma, que comprende determinar la presencia de un mutante y/o una región específica de IND de tipo salvaje correspondiente en el ADN genómico de dicha planta, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el procedimiento comprende además someter el ADN genómico de dicha planta, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, a un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa usando un conjunto de al menos dos o al menos tres cebadores, en el que al menos dos de dichos cebadores reconocen específicamente el alelo IND de tipo salvaje, estando dichos al menos dos cebadores seleccionados del grupo que consiste en:

- un primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y un segundo cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 3' o 5' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, respectivamente,

- un primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y un segundo cebador que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND de tipo salvaje, - un primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y un segundo cebador que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante de tipo salvaje, respectivamente, y

en el que al menos dos de dichos cebadores reconocen específicamente el alelo IND mutante, estando dichos al menos dos cebadores seleccionados del grupo que consiste en:

- el primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y un segundo cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 3' o 5' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, respectivamente,

- el primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del mutante del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y un tercer cebador que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante, - el primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y un tercer cebador que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante, respectivamente.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el procedimiento comprende además someter el ADN genómico de dicha planta, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, a un ensayo de hibridación usando un conjunto de al menos dos sondas específicas, en el que al menos una de dichas sondas específicas reconoce específicamente el alelo IND de tipo salvaje, dicha al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:

- una primera sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y una segundo sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 3' o 5' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, respectivamente,

- una primera sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y una segunda sonda que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND de tipo salvaje, - una primera sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y una segunda sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 3' 0 5' y la región de mutación del alelo IND mutante de tipo salvaje, respectivamente,

- una sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante, y

en el que al menos una de dichas sondas específicas reconoce específicamente el alelo IND mutante, dicha al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:

- la primera sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y la segunda sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 3' o 5' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, respectivamente,

- la primera sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del mutante del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y una tercera sonda que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante, - la primera sonda que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y de tipo salvaje, y una tercera sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante,

- una sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante.

12. Un kit para identificar un alelo IND mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una muestra biológica, que comprende un conjunto de cebadores o sondas, estando dicho conjunto seleccionado del grupo que consiste en:

- un conjunto de cebadores o sondas, en el que una de dichos cebadores o sondas reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y la otra de dichas sondas reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante,

- un conjunto de cebadores o sondas, en el que uno de dichos cebadores reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante y el otro de dichos cebadores o sondas reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 3' o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante, respectivamente, - una sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante,

y en la que

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 929 o del 931 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 930 de SEQ ID NO: 5 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 930 o del 930 al 1622 0 el complementario del mismo, respectivamente o

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 910 o del 912 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 911 de SEQ ID NO: 7 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 911 o del 911 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente o

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 919 o del 921 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 920 de SEQ ID NO: 7 o del complementario del mismo; y dicha región de unión comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 920 o del 920 al 1593 0 el complementario del mismo, respectivamente.

13. Un kit de acuerdo con la reivindicación 12, en el que

- dicho cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante puede consistir en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la región flanqueante en 5' o 3' del alelo IND mutante o del complementario del mismo, respectivamente o

- dicho cebador que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante consiste en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de mutación del alelo IND mutante o del complemento del mismo, o

- dicho cebador que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante consiste en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de una secuencia que abarca la región de unión entre los 5' o región flanqueante 3 'y la región de mutación del alelo IND mutante o del complemento del mismo, en el que dichos 17 a 200 nucleótidos consecutivos no derivan exclusivamente de la mutación o las secuencias flanqueantes,

- dicha sonda que reconoce específicamente la región flanqueante 5' o 3' del alelo IND mutante, consiste en una secuencia de nucleótidos de 13 a 1000 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia flanqueante 5' o 3' del alelo IND mutante o del complemento del mismo, respectivamente, o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la misma, o

- dicha sonda que reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante, consiste en una secuencia de nucleótidos de 13 a 1000 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de mutación del alelo IND mutante o del complemento del mismo, o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con el mismo, o

- dicha sonda que reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante en 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante, consiste en una secuencia de nucleótidos de 13 a 1000 nucleótidos consecutivos seleccionados de una secuencia que abarca la región de unión entre la región flanqueante 5' o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante o salvaje o del complementario del mismo, respectivamente, en el que dichos 13 a 1.000 nucleótidos consecutivos no derivan exclusivamente de la mutación o las secuencias flanqueantes o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80 % con el mismo.

14. Un kit para determinar el estado de cigosidad de un alelo IND mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una planta, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, que comprende un conjunto de cebadores o sondas, en el que al menos dos de dichos cebadores o al menos una de dichas sondas reconocen específicamente el alelo IND de tipo salvaje y en el que al menos dos de dichos cebadores o al menos una de dichas sondas reconocen específicamente el alelo IND mutante, seleccionado del grupo que consiste en:

- un conjunto de al menos tres cebadores o sondas, en el que un primer cebador o sonda reconoce específicamente la región flanqueante 5' o 3' del mutante y el alelo IND de tipo salvaje, un segundo cebador o sonda reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND mutante, y un tercer cebador o sonda reconoce específicamente la región de mutación del alelo IND de tipo salvaje,

- un conjunto de al menos tres cebadores o sondas, en el que un primer cebador o sonda reconoce específicamente la región flanqueante 5' o 3' del mutante y el alelo IND de tipo salvaje, un segundo cebador o sonda reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 3 'o 5' y la región de mutación del alelo IND mutante, respectivamente, y un tercer cebador o sonda reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 3 'o 5' y la región de mutación del alelo IND de tipo salvaje, respectivamente,

- un conjunto de al menos dos sondas, en el que una primera sonda reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5 'o 3' y la región de mutación del alelo IND mutante y una segunda sonda reconoce específicamente la región de unión entre la región flanqueante 5 'o 3' y la región de mutación de el alelo IND de tipo salvaje,

y en la que

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 929 o del 931 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación del alelo IND de tipo salvaje tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 930 de la SEQ ID NO: 5 o de la complementaria del mismo; dicha región de mutación del alelo IND mutante tiene la secuencia a o la complementaria de la misma; dicha región de unión del alelo IND de tipo salvaje puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 del nucleótido 1 al 930 o del 930 al 1622 o de la complementaria de la misma, respectivamente; y dicha región de unión del alelo IND mutante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 del nucleótido 1 al 929 seguido de a o a seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 931 al 1622 o de la complementaria del mismo, respectivamente o

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 995 o del 997 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación del alelo IND de tipo salvaje tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 996 de la SEQ ID NO: 5 o de la complementaria de del mismo; dicha región de mutación del alelo IND mutante tiene la secuencia a o la complementaria de la misma; dicha región de unión del alelo IND de tipo salvaje puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 del nucleótido 1 al 996 o del 996 al 1622 o de la complementaria de la misma, respectivamente; y dicha región de unión del alelo IND mutante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 del nucleótido 1 al 995 seguido de a o a seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 997 al 1622 0 de la complementaria del mismo, respectivamente o

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 1035 o del 1037 al 1622 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación del alelo IND de tipo salvaje tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 1036 de la SEQ ID NO: 5 o de la complementaria de del mismo; dicha región de mutación del alelo IND mutante tiene la secuencia t o la complementaria de la misma; dicha región de unión del alelo IND de tipo salvaje puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 del nucleótido 1 al 1036 o del 1036 al 1622 o de la complementaria de la misma, respectivamente; y dicha región de unión del alelo IND mutante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 del nucleótido 1 al 1035 seguido de t o t seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5 desde el nucleótido 1037 al 1622 o de la complementaria del mismo, respectivamente o

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 902 o del 904 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación del alelo IND de tipo salvaje tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 903 de la SEQ ID NO: 7 o de la complementaria de del mismo; dicha región de mutación del alelo IND mutante puede tener la secuencia t o la complementaria de la misma; y dicha región de unión del alelo IND de tipo salvaje comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 del nucleótido 1 al 903 o del 903 al 1593 o de la complementaria de la misma, respectivamente; y dicha región de unión del alelo IND mutante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 del nucleótido 1 al 902 seguido de t o t seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 904 al 1593 o de la complementaria del mismo, respectivamente o

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 910 o del 912 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación del alelo IND de tipo salvaje tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 911 de la SEQ ID NO: 7 o de la complementaria de del mismo; dicha región de mutación del alelo IND mutante tiene la secuencia a o la complementaria de la misma; y dicha región de unión del alelo IND de tipo salvaje puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 del nucleótido 1 al 911 o del 911 al 1593 o de la complementaria de la misma, respectivamente; y dicha región de unión del alelo IND mutante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 del nucleótido 1 al 910 seguido de a o a seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 912 al 1593 0 de la complementaria del mismo, respectivamente o

- dicha región flanqueante en 5' o 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 919 o del 921 al 1593 o el complementario del mismo, respectivamente; dicha región de mutación del alelo IND de tipo salvaje tiene la secuencia de nucleótidos del nucleótido 920 de la SEQ ID NO: 7 o de la complementaria de del mismo; dicha región de mutación del alelo IND mutante puede tener la secuencia t o la complementaria de la misma; y dicha región de unión del alelo IND de tipo salvaje puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 del nucleótido 1 al 920 o del 920 al 1593 o de la complementaria de la misma, respectivamente; y dicha región de unión del alelo IND mutante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 del nucleótido 1 al 919 seguido de t o t seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7 desde el nucleótido 921 al 1593 o de la complementaria del mismo, respectivamente.

15. Un procedimiento para aumentar el rendimiento de la planta de Brassica que comprende al menos dos genes IND, que comprende introducir por mutagénesis dos alelos IND homocigotos mutantes como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en su genoma.

16. Uso de un alelo IND mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para aumentar el rendimiento de semilla o la resistencia al desgranado de las vainas en una planta de Brassica.

17. Un procedimiento para alterar las propiedades de dehiscencia del fruto de una planta de Brassica que comprende al menos dos genes iNd , que comprende las etapas de:

- generar y/o seleccionar una planta de Brassica que comprenda al menos dos genes IND, en el que al menos dos alelos de los al menos dos genes IND son alelos ind defectivos parciales como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,

- seleccionar una planta con propiedades alteradas de dehiscencia del fruto, en particular, una planta en la que el desgranado de semillas se reduce o retrasa hasta después de la cosecha, mientras que las vainas mantienen al mismo tiempo una capacidad de trillado agronómicamente relevante,

en el que dichos alelos ind defectivos parciales se generan por mutagénesis.