ES2751388T3 - IGF-1 para su uso en el tratamiento de la jaqueca - Google Patents

Abstract

Una cantidad eficaz del inductor del receptor del factor de crecimiento insulinoide (IGFR) IGF-1 para su uso en un método para tratar jaquecas en un paciente, en donde IGF-1 se administra al paciente como una monoterapia o en combinación con un segundo compuesto activo seleccionado de un segundo inductor de IGFR que es insulina, IL-11, interferón γ, un analgésico y/o un fármaco contra la jaqueca.

Description

DESCRIPCIÓN

IGF-1 para su uso en el tratamiento de la jaqueca

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a medicina y neurología. En particular, las realizaciones están dirigidas al tratamiento de la jaqueca y trastornos neurológicos relacionados.

Antecedentes de la invención

La cefalea de tipo jaqueca es un trastorno complejo y recurrente que es una de las quejas más comunes en medicina. En los Estados Unidos, más de 30 millones de personas tienen uno o más dolores de cabeza de tipo jaqueca por año. Aproximadamente el 75% de todas las personas que experimentan jaquecas son mujeres.

Anteriormente, la jaqueca se consideraba un fenómeno vascular que era el resultado de la vasoconstricción intracraneal seguida de vasodilatación de rebote. En la actualidad, sin embargo, la teoría neurovascular describe la jaqueca como un proceso principalmente neurogénico con cambios secundarios en la perfusión cerebral. La teoría neurovascular sostiene que una serie compleja de eventos neuronales y vasculares inicia la jaqueca.

La teoría de la depresión cortical propagada (CSD por sus siglas del inglés cortical spreading depression) se ha avanzado para explicar el mecanismo neurológico de la jaqueca con aura. La CSD es una onda bien definida de excitación neuronal inicial seguida de silencio neuronal y después nuevamente excitación que vuelve a la normalidad en las áreas de materia gris cortical que se propaga desde su sitio de origen. Se entiende que esta despolarización celular transitoria provoca el fenómeno cortical primario o la fase del aura; a su vez, activa las fibras trigéminas que causan la fase de cefalea. Se entiende que cambios similares provocan dolor por jaqueca con y sin aura. La CSD es una ola de hiperactividad electrofisiológica seguida de una ola de inhibición, que se observa con mayor frecuencia en la corteza visual. El escotoma centelleante (aura visual) de la jaqueca en seres humanos puede estar relacionado con el fenómeno neurofisiológico denominado depresión propagada de Leao.

El tratamiento de la jaqueca implica una terapia aguda (abortiva) y preventiva (profiláctica). Los pacientes con ataques frecuentes pueden requerir ambas. Los tratamientos agudos están destinados a detener o prevenir la progresión de una cefalea o revertir una cefalea que ha comenzado. El tratamiento preventivo, que se administra incluso en ausencia de cefalea, tiene como objetivo reducir la frecuencia y la gravedad de la crisis jaquecosa, hacer que los ataques agudos respondan mejor a la terapia abortiva y quizás también mejorar la calidad de vida del paciente. Sigue existiendo una necesidad de terapias adicionales para tratar la jaqueca u otros trastornos neurológicos.

Sumario

Se proporcionan métodos y composiciones basados en datos experimentales que muestran que pueden lograr un efecto fisiológico deseado que puede implementarse para tratar pacientes con jaqueca-pacientes que han padecido previamente una jaqueca y que están en riesgo de padecer futuras jaquecas. Se entenderá que el tratamiento de un paciente con jaqueca reduce o limita la frecuencia, la gravedad y/o la duración de las jaquecas. También se contempla que los métodos y composiciones también se pueden implementar como se analiza en las realizaciones a continuación para efectuar la prevención de las jaquecas. En determinados aspectos, los métodos y composiciones inhiben la depresión propagada y los eventos de jaqueca. Dichos métodos y composiciones se contemplan en algunas realizaciones para su uso en un sujeto humano.

En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para tratar un paciente con jaqueca que comprenden administrar al paciente interleucina-11 (IL-11) o una composición que comprende IL-11. En otras realizaciones, existen métodos para tratar jaquecas crónicas o recurrentes en un paciente que comprenden administrar al paciente IL-11 o una composición que comprende IL-11.

En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para tratar a un paciente con jaqueca que comprenden administrar al paciente un inductor del receptor del factor de crecimiento insulínico (IGFR, por sus siglas del inglés insulin-like growth factor receptor) o una composición que comprende un inductor de IGFR. En determinadas realizaciones, el inductor de IGFR es IGF-1 o insulina. En realizaciones específicas, el inductor de IGFR es IGF-1. En otras realizaciones, el inductor de IGFR es insulina. En realizaciones adicionales, existen métodos para tratar jaquecas crónicas o recurrentes en un paciente que comprenden administrar al paciente IGF-1 o una composición que comprende IGF-1. En realizaciones adicionales, existen métodos para tratar a un paciente con jaqueca que comprenden administrar al paciente insulina o una composición que comprende insulina. En otras realizaciones, existen métodos para tratar jaquecas crónicas o recurrentes en un paciente que comprenden administrar al paciente insulina o una composición que comprende insulina. En realizaciones particulares, existen métodos para tratar a un paciente con jaqueca que comprenden administrar al paciente un inductor de IGFR o una composición que comprende un inductor de IGFR, en donde el inductor de IGFR es un polipéptido. En otras realizaciones, el inductor de IGFR no es insulina. Además, se contempla específicamente que cuando se incluye insulina en algunas realizaciones para tratar jaqueca o un paciente con jaqueca, la insulina no se ingiere ni administra por vía subcutánea.

Los aspectos adicionales incluyen métodos para tratar a un paciente con jaqueca que comprenden administrar al paciente interferón gamma (IFN-y) o una composición que comprende IFN-y. En otras realizaciones, existen métodos para tratar jaquecas crónicas o recurrentes en un paciente que comprenden administrar al paciente IFN-y o una composición que comprende IFN-y.

En realizaciones adicionales, existen métodos para tratar a un paciente con jaqueca que comprenden administrar al paciente IL-11, IFN-y y/o IGF-1. En aspectos adicionales, existen métodos para tratar a un paciente con jaqueca que comprenden administrar por vía intranasal a las células cerebrales del paciente una cantidad efectiva de una composición que comprende IL-11, IFN-y, IGF-1 y/o insulina. En otras realizaciones, existen métodos para tratar jaquecas crónicas o recurrentes en un paciente que comprenden administrar por vía intranasal al paciente una cantidad eficaz de IL-11, IFN-y, IGF-1 y/o insulina.

En determinadas realizaciones, el paciente padece síntomas de cefalea de tipo jaqueca cuando se administra la composición. Una jaqueca generalmente incluye una cefalea unilateral, punzante, de moderado a intenso. Otros síntomas de jaqueca incluyen, pero sin limitación, náuseas, aura, visión borrosa, delirios, congestión nasal, diarrea, tinnitus, poliuria, palidez, sudoración, edema localizado del cuero cabelludo o la cara, sensibilidad del cuero cabelludo, prominencia de una vena o arteria en la sien, rigidez y sensibilidad del cuello, alteración de la concentración y el estado de ánimo, o sensación de frío y humedad en los apéndices.

En realizaciones adicionales, el paciente es un paciente con jaqueca crónica o recurrente, lo que significa que experimente dolores de cabeza más de la mitad del tiempo, durante 15 días o más en un mes, durante al menos tres meses. En determinadas realizaciones, el paciente ha probado una o más opciones de tratamiento a corto plazo, tal como analgésicos simples, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), triptanos y ergotaminas, y no ha experimentado alivio significativo del dolor.

Se contempla que al paciente se le administre una cantidad que se considera eficaz o que ha sido eficaz en otros pacientes para lograr un efecto beneficioso con respecto a las jaquecas o los síntomas de una jaqueca. Una cantidad eficaz de IL-11, IFN-y, IGF-1 y/o insulina se administra a, o es tomada por el, paciente.

La justificación del suministro por fases de los agentes terapéuticos propuestos para la jaqueca comienza a ilustrarse en la FIG. 1B (3-4). En general, esto significa que la exposición del paciente a los agentes terapéuticos no es constante. En cambio, los agentes se administran para iniciar una respuesta adaptativa (3), que después se deja desarrollar (4), en ausencia de exposición continua del agente, antes de que el agente se suministre de nuevo. Se proporciona evidencia ejemplar que respalda la ventaja de este enfoque para IGF-1 utilizando cultivos de cortes de hipocampo (FIG. 5, 8), donde durante siete días, se administró IGF-1 cada 12 horas y se eliminó por sucesivas intervenciones 12 horas antes de probar la susceptibilidad a SD (por sus siglas en inglés, spreading depression). Esto proporcionó una protección máxima y continua contra la CSD. Además, se observó una protección máxima basada en IFN-y contra CSD cuando se pulsó IFN-y en cultivos de cortes durante solo 12 horas una vez por semana (FIG, 5, 15, 16). En cada caso, este patrón de suministro del agente se eligió para imitar los efectos fásicos del enriquecimiento ambiental (EA) que consiste en ciclos de ejercicio-descanso-ejercicio.

En algunos métodos, la composición se administra al paciente por vía intranasal. En determinadas realizaciones, la composición se administra a las células cerebrales o al tejido cerebral del paciente. En realizaciones adicionales, la composición se administra a microglía en el cerebro del paciente. Se contempla específicamente que las neuronas, microglía, oligodendrocitos o astrocitos en el cerebro del paciente se pongan en contacto con una composición que comprende IL-11, IFN-y, IGF-1 y/o insulina.

La IL-11, IFN-y, IGF-1 o insulina se purifica y/o aísla en las realizaciones descritas en el presente documento. Estos polipéptidos pueden producirse de manera recombinante o pueden ser sintéticos.

En algunas realizaciones, la composición es un líquido. En otras realizaciones, la composición es un gel o un polvo. Se contempla específicamente que la composición puede ser un líquido que se proporciona al paciente como una nebulización.

Los métodos pueden implicar la administración de una composición que contiene aproximadamente, al menos aproximadamente, o como máximo aproximadamente 0,01, 0,o2, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8.5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14.5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 410, 420, 425, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 475, 480, 490, 500, 510, 520, 525, 530, 540, 550, 560, 570, 575, 580, 590, 600, 610, 620, 625, 630, 640, 650, 660, 670, 675, 680, 690, 700, 710, 720, 725, 730, 740, 750, 760, 770, 775, 780, 790, 800, 810, 820, 825, 830, 840, 850, 860, 870, 875, 880, 890, 900, 910, 920, 925, 930, 940, 950, 960, 970, 975, 980, 990, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 nanogramos (ng), microgramos (mcg), miligramos (mg), o gramos de IL-11, IFN-y, IGF-1, y/o insulina, o cualquier intervalo derivable de los mismos.

Alternativamente, las realizaciones pueden implicar proporcionar o administrar al paciente o a células o tejidos del paciente aproximadamente, al menos aproximadamente, o como máximo aproximadamente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7.5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10.5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 410, 420, 425, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 475, 480, 490, 500, 510, 520, 525, 530, 540, 550, 560, 570, 575, 580, 590, 600, 610, 620, 625, 630, 640, 650, 660, 670, 675, 680, 690, 700, 710, 720, 725, 730, 740, 750, 760, 770, 775, 780, 790, 800, 810, 820, 825, 830, 840, 850, 860, 870, 875, 880, 890, 900, 910, 920, 925, 930, 940, 950, 960, 970, 975, 980, 990, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 nanogramos (ng), microgramos (mcg), miligramos (mg), o gramos de IL-11, IFN-y, IGF-1, y/o insulina, o cualquier intervalo derivable en los mismos, en una dosis o colectivamente en múltiples dosis. En algunas realizaciones, la composición comprende entre aproximadamente 0,1 ng y aproximadamente 2,0 g de IL-11, IFN-y, IGF-1 y/o insulina. Los valores numéricos anteriores también pueden ser la dosis que se administra al paciente en función del peso del paciente, expresada como ng/kg, mcg/kg o mg/kg, y cualquier intervalo derivable de esos valores.

Alternativamente, la composición puede tener una concentración de IL-11 que es 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 410, 420, 425, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 475, 480, 490, 500, 510, 520, 525, 530, 540, 550, 560, 570, 575, 580, 590, 600, 610, 620, 625, 630, 640, 650, 660, 670, 675, 680, 690, 700, 710, 720, 725, 730, 740, 750, 760, 770, 775, 780, 790, 800, 810, 820, 825, 830, 840, 850, 860, 870, 875, 880, 890, 900, 910, 920, 925, 930, 940, 950, 960, 970, 975, 980, 990, 1000 ng/ml, pg/ml, mg/ml, o g/ml, o cualquier intervalo derivable de los mismos.

Si una composición es líquida, gel o semisólida, el volumen de la composición que se administra al paciente puede ser aproximadamente, al menos aproximadamente, o como mucho aproximadamente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 microlitros (pl) o mililitros (ml), o cualquier intervalo derivable de los mismos. En determinadas realizaciones, se administra al paciente hasta aproximadamente 10 ml de la composición.

La cantidad de IL-11, IFN-y, IGF-1 y/o la insulina administrada o tomada por el paciente pueden basarse en el peso del paciente (en kilogramos). Por lo tanto, en algunas realizaciones, el paciente es administrado o toma una dosis o dosis múltiples que ascienden a aproximadamente, al menos aproximadamente, o como mucho aproximadamente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1.6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7.0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9.7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19.0, 19,5, 20,0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 410, 420, 425, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 475, 480, 490, 500, 510, 520, 525, 530, 540, 550, 560, 570, 575, 580, 590, 600, 610, 620, 625, 630, 640, 650, 660, 670, 675, 680, 690, 700, 710, 720, 725, 730, 740, 750, 760, 770, 775, 780, 790, 800, 810, 820, 825, 830, 840, 850, 860, 870, 875, 880, 890, 900, 910, 920, 925, 930, 940, 950, 960, 970, 975, 980, 990, 1000 pg/kilogramo (kg) o mg/kg, o cualquier intervalo derivable de los mismos.

La composición puede administrarse a (o tomarse por ) el paciente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más veces, o cualquier intervalo derivable en los mismos, y se pueden administrar cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 horas, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días, o 1, 2, 3, 4, 5 semanas, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses, o cualquier intervalo derivable en los mismos. Se contempla específicamente que la composición se puede administrar una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día, cinco veces al día, o seis veces al día (o cualquier intervalo derivable del mismo) y/o según sea necesario para el paciente. Alternativamente, la composición puede administrarse cada 2, 4, 6, 8, 12 o 24 horas (o cualquier intervalo derivable del mismo) a o por el paciente. En algunas realizaciones, al paciente se le administra la composición durante un determinado período de tiempo o con un cierto número de dosis después de experimentar los síntomas de una jaqueca. En realizaciones particulares, IGF-1 puede administrarse una vez al día; IFN-y puede administrarse una vez por semana.

En realizaciones particulares, la composición se puede administrar a un paciente en fases o ciclos. Por ejemplo, la composición puede administrarse al paciente, en donde la composición está en una cantidad que el compuesto activo (IL-11, IFN-y, IGF-1 o insulina) en la composición ya no es biodisponible o terapéuticamente eficaz dentro de un primer período del tiempo de administración, tal como después de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 horas, preferentemente 12 horas. La composición puede volver a administrarse al paciente después de un segundo período de tiempo desde el final del primer período de tiempo, tal como después de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 horas, preferentemente 12 horas. El compuesto puede ser IL-11, IFN-y, IGF-1 o insulina. Por ejemplo, se puede administrar IFN-y o IGF-1 y se pueden aclarar del cuerpo después de 12 horas, pero la segunda dosis de IFN-y o IGF-1 no se puede reanudar hasta después de otras 12 horas, durante las segundas 12 horas el paciente no tiene el IFN-y o IGF-1 administrado.

En algunas realizaciones, los métodos también incluyen administrar al paciente más de uno de los siguientes compuestos: IL-11, IFN-y, IGF-1 o insulina. Se contempla que la combinación se pueda administrar al paciente simultáneamente (al mismo tiempo) y en la misma composición, simultáneamente pero en composiciones separadas, o en serie.

En determinadas realizaciones, IL-11 e IFN-y se administran al, o son tomados por el paciente. En algunas realizaciones, IL-11 e IGF-1 se administran al, o son tomados por el paciente. En realizaciones adicionales, IL-11 e insulina se administran al, o son tomados por el paciente. En realizaciones que implican IL-11, IL-11 puede administrarse al, o ser tomada por el, paciente antes o después del otro compuesto.

En otras realizaciones, IFN-y e IGF-1 se administran al, o son tomados por el paciente antes o después del otro compuesto. En algunas realizaciones, IFN-y e insulina se administran al, o son tomados por el paciente antes o después del otro compuesto. En realizaciones que implican IFN-y, IFN-y puede administrarse al, o ser tomado por el, paciente después del otro compuesto.

En algunos aspectos, IGF-1 e insulina se administran al, o son tomados por el paciente. IGF-1 puede administrarse al, o ser tomado por el, paciente antes o después de la insulina.

En otras realizaciones, uno o más de IL-11, IFN-y, IGF-1, o insulina pueden administrarse a, o ser tomados por, un paciente que también recibe o toma un fármaco contra la jaqueca. En determinados aspectos, la composición también incluye un fármaco contra la jaqueca, que puede ser un medicamento para aliviar el dolor o un medicamento preventivo. Los medicamentos para aliviar el dolor incluyen, pero sin limitación, analgésicos como AINE o acetaminofén, una combinación de acetaminofén, aspirina y cafeína, triptanos, fármacos combinados de ergotamina y cafeína, medicamentos contra las náuseas, opiáceos, tal como la codeína y un corticosteroide tal como dexametasona. Los medicamentos preventivos incluyen, pero sin limitación, betabloqueantes, antidepresivos tales como los antidepresivos tricíclicos, un fármaco anticonvulsivo, ciproheptadina o toxina botulínica tipo A. En algunas realizaciones, al paciente se le administra el fármaco contra la jaqueca dentro de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas, o cualquier intervalo derivable en los mismos, de haber administrado la composición que contiene uno o más de IL-11, IFN-y, IGF-1 y/o insulina.

En algunas realizaciones, un polipéptido tal como IL-11, IFN-y o IGF-1 no se proporciona directamente al paciente o a las células del paciente, y en su lugar, se proporciona al paciente un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido bajo el control de un promotor, en donde el polipéptido se expresa en una célula que contiene el vector. En consecuencia, las realizaciones que implican polipéptidos pueden implementarse con un vector de expresión para lograr un tratamiento para pacientes con jaqueca.

Se analizan otras realizaciones a lo largo de la presente solicitud. Cualquier realización analizada con respecto a un aspecto se aplica también a otros aspectos y viceversa. Se entiende que las realizaciones en la sección de Ejemplos son realizaciones de la invención que son aplicables a todos los aspectos de la invención.

Los términos "mejorar", "inhibir", o "reducir", o cualquier variación de estos términos, cuando se usan en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva incluyen cualquier disminución medible o inhibición completa para lograr un resultado deseado.

A lo largo de la presente solicitud, la expresión "cantidad eficaz" se usa para indicar que los compuestos se administran en una cantidad suficiente para tratar una afección en un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, la afección es, pero sin limitación, jaqueca aguda o crónica, u otras afecciones asociadas con la jaqueca aguda o crónica, o afecciones asociadas con la depresión cortical propagada (CSD).

El uso de la palabra "un" o "una", cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva puede significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno", y "uno o más de uno".

A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la desviación estándar de error para el dispositivo o método que se emplea para determinar el valor.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiera solo a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere solamente a alternativas e "y/o".

Como se usa en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, las expresiones "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, como "comprenden" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, como "tienen" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier la forma de que incluye, como "incluye" e "incluyen") o "que contiene" (y cualquier forma de que contiene, como "contiene" y "contienen") son inclusivos o abiertos y no excluyen elementos o etapas de métodos adicionales que se hayan mencionado.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. La invención es como se define en las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos. La invención se puede entender mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

FIG. 1A-1B. Ilustra un esquema de un patrón sugerido de aumento de la vitalidad cerebral frente a la actividad neuronal (FIG. 1A y FIG. 1B). Estímulos de iniciativa irritante (1) (por ejemplo, TNF-a, IL-11, IGF-1 o IFN-a) y respuesta adaptativa (2) que, cuando se suministran, reduce la susceptibilidad a SD (3-4). Con estímulos de activación recurrentes (3) y tiempo suficiente (4), el cerebro aumenta su resistencia a la enfermedad. Pueden producirse cambios desadaptativos dentro del cerebro cuando se producen estímulos irritantes sin tiempo suficiente para permitir cambios nutritivos adaptativos (5) o se vuelven constantes (6), por ejemplo, como puede ocurrir con jaqueca crónica o de alta frecuencia.

FIG. 2A-2E. SD inducida por una mayor susceptibilidad a la SD. (FIG. 2A) Los experimentos comienzan con la determinación de la corriente necesaria para maximizar las posibles respuestas de campo de la región CA3 convencionales. La intensidad media máxima se utiliza para provocar potenciales de campo evocados en el área CA3 de la estimulación eléctrica bipolar del giro dentado. Esto documenta la normalidad de las respuestas sinápticas evocadas entre preparaciones. Si los potenciales postsinápticos excitatorios de un campo de cortes no son de al menos 3 mV, se descartan los cortes. A continuación, se observan los trenes de potencial de campo (i) para verificar que las preparaciones son lo suficientemente saludables como para seguir la estimulación de 10 Hz (por ejemplo, las amplitudes de las desviaciones verticales en los registros de potencial rápido son similares) y se registra la corriente necesaria para desencadenar SD (ii) (Pusic y Kraig, 2010). (FIG. 2B) Por ejemplo, el umbral de SD se reduce significativamente (p <0,001; n = 13 y 17, respectivamente) 3 días después de que se provocaran 6 SD durante una hora en comparación con el control. (FIG. 2C) Este efecto está significativamente (p <0,002; n = 37 y 10, respectivamente) relacionado con TNF-a ya que se puede imitar mediante la exposición de 3 días (100 ng/ml) a TNF-a en comparación con el control. (FIG. 2d ) Además, el umbral de SD aumenta significativamente (p <0,001; n = 37 y 15, respectivamente) al eliminar la señalización de TNF-a mediante la inclusión de sTNFR1 (100 ng/ml) en comparación con el control. (FIG. 2E) Finalmente, la minociclina (MinoC; 10 pg/ml), que previene una mayor producción de TNF-a a partir de la microglía (Hulse et al., 2008) aumenta significativamente (p <0,002; n = 9 y 3, respectivamente) el umbral de SD comparado con el control (Mitchell et al., 2010).

FIG. 3A-3C. Los linfocitos T en cultivos de cortes producen IFN-y, lo que aumenta de manera aguda la susceptibilidad a SD. (FIG. 1A) CD-6 (marcador de superficie para linfocitos T; flecha amarilla) linfocitos T positivos dentro del parénquima de un cultivo de cortes de hipocampo maduro (> 21 días in vitro) mantenido en medios sin suero. (Pusic et al., 2011). Barra de Cal, 15 pm. (FIG. 1B) Cuando se activan, los linfocitos T en cultivos de cortes son inmunopositivos para IFN-y (flechas amarillas). Barra de Cal, 30 pm. (FIG. 1C) La exposición aguda (15-60 min) a IFN-y (500 U/ml) desencadena un aumento significativo (p <0,001; n = 5 para cada grupo) en la susceptibilidad a SD.

FIG. 4A-4F Estrés oxidativo (OS por sus siglas del inglés oxidative stress) por SD y su reducción por IGF-1. (FIG.

4A) Citoarquitectura normal de un cultivo de cortes del hipocampo que muestra áreas de neuronas piramidales de CA1, giro dentado (DG por sus siglas del inglés dentate gyrus) y la zona de imágenes para el trabajo de los inventores en este caso (línea de puntos), CA3. (FIG. 4B) Se midió el OS usando CellROX, un marcador fluorescente fijable de Invitrogen. La imagen muestra el OS 24 horas después de 6 SD. (FIG. 4C) La preincubación en IGF-1 (40 ng/ml durante 3 días antes de SD) desencadenó una reducción en el OS medido un día después. (FIG. 4D) Esta reducción frente a SD de control fue significativa (p <0,02; n=4 y 5). (FIG. 4E) CellROX se puede usar para medir el EO relativo en tipos específicos de células cerebrales. La imagen en la FIG. 4A muestra una neurona piramidal de un cultivo de cortes marcado con NeuN. (FIG. 4F) La imagen comarcada de CellROX muestra el OS asociado.

FIG. 5A-5C Susceptibilidad de SD reducida por moléculas pequeñas que imitan el ambiente enriquecido (EE, por sus siglas de inglés enriched environment). Los cultivos de cortes se expusieron a agentes durante 3 días y después se determinó la susceptibilidad a SD. IL-11 (100 ng/ml) proporcionó una cantidad significativa (p = 0,001; n = 9 y 6, respectivamente) (F iG. 5A) al igual que IFN-y (500 U/ml; p<0,001; n = 9 y 6) (FIG. 5B) e IGF-1 (40 ng/ml; p<0,001; n = 8 y 7) (FIG. 5C).

FIG. 6. Se usó un paradigma completo de registro de animales para determinar el umbral para SD en neocorteza e hipocampo de rata anestesiada, con ejemplos de SD mostradas.

FIG. 7A-7C La administración nasal de IGF-1, IL-11, IFN-y e insulina redujeron significativamente (p <0,001) la susceptibilidad a SD. Las imágenes muestran configuraciones experimentales para administración y pruebas nasales. (FIG. 7A) Configuración de inyección nasal que muestra una lámpara de calor y un termorregulador que mantiene la temperatura a 37 °C más el cono nasal utilizado para administrar anestesia con isoflurano. (FIG. 7b ) Se muestra al operador administrando solución nasal de IGF-1, que se realiza en una campana extractora para ventilar adecuadamente el isoflurano del cono nasal. (FIG. 7C) La imagen ilustra la configuración electrofisiológica patrón. El animal anestesiado se coloca en un soporte electrofisiológico convencional y la anestesia se mantiene mediante un cono nasal que proporciona isoflurano al 3 % en oxígeno. La saturación de oxígeno arterial se controla con un oxímetro de pulso. Los animales se calientan a 37,5 °C con una placa calefactora. La SD se induce mediante la inyección progresiva de volúmenes mayores de KCl 0,5 M desde un microelectrodo de 8 pm de diámetro. La SD se registra con un segundo microelectrodo utilizado para registros de CC colocado más caudalmente. Después de que se evoque SD mediante un pulso de inyección dado, se retira el electrodo estimulante y se reinyecta un volumen en aceite mineral. El diámetro de la esfera de inyección de KCl resultante se mide después fuera de línea usando un microscopio compuesto y se calcula el volumen de inyección. Por ejemplo, en los experimentos con animales completos anteriores, se necesitaron 1-8 nl de KCl 0,5 M para evocar Sd en las regiones cerebrales de control, mientras que después de IGF-1 aguda esta cantidad aumentó a 67-109 nl. Un día después del tratamiento con IGF-1, el volumen necesario para evocar SD fue de 34-48 nl. El tratamiento con IFN-y requirió 338 nl de KCl 0,5 M un día después del tratamiento e IL-11 requirió 67-200 nl. Por otro lado, si bien aún es significativamente mayor que el control, el tratamiento agudo con insulina solo requirió 8-34 nl.

FIG. 8a-8f IGF-1 redujo la susceptibilidad a la depresión propagada en cultivos de cortes de hipocampo. (FIG. 8a) Potencial de campo evocado en área CA3 ejemplar. Los experimentos comienzan con el establecimiento de la intensidad actual necesaria para evocar respuestas de potencial de campo máximo; los estímulos de intensidad media máxima se utilizaron para provocar potenciales de campo posteriores. Solo aquellos cultivos con respuestas post-sinápticas de neuronas piramidales de CA3 de al menos 3 mV se usaron para experimentos. (FIG. 8b) Se usó la respuesta de CA3 a la estimulación bipolar del giro dentado (10 pulsos a 10 Hz, 500 pA) para provocar una depresión propagada (SD), como se muestra en la (FIG. 8c). (FIG. 8c) La depresión propagada (SD) mostrada en este caso fue inducida por la estimulación/respuesta (flecha) mostrada en la (FIG. 8b). (FIG. 8d) La corriente promedio necesaria para inducir SD (umbral de SD) fue significativamente (* p = 0,001) mayor cuando los cultivos de cortes se expusieron a 40 ng/ml de IGF-1 de forma aguda (n = 6 y 7 para el control y los cortes experimentales, respectivamente). (FIG. 8e) De manera similar, el umbral de SD promedio también aumentó significativamente (* p <0,001) cuando los cultivos de cortes se expusieron a IGF-1 durante 3 días antes de SD (n = 8 y 7 para cortes de control y experimentales, respectivamente). (FIG. 8f) Finalmente, el umbral de SD promedio aumentó significativamente ( * p <0,001) cuando los cultivos de cortes se expusieron a IGF-1 durante 7 días antes de SD (n = 11 y 6 para cortes de control y experimentales, respectivamente). En este caso el tratamiento de siete días fue fásico: los cultivos se expusieron al IGF-1 durante solo 12 horas al día durante siete días para imitar mejor los efectos fásicos del ejercicio-descanso-ejercicio observados con EE. Comparaciones entre grupos realizadas a través de la prueba f de Student.

FIG. 9a-9f IGF-1 disminuyó el estrés oxidativo de la depresión propagada. (FIG. 9a) Etiquetado inmunohistoquímico con NeuN de un cultivo de cortes de hipocampo, para referencia de citoarquitectura y para mostrar el área CA3 de interés (recuadro de línea de puntos) utilizada para la cuantificación del estrés oxidativo (OS) a través de la intensidad de fluorescencia de CellROX™. (FIG. 9b-c) Cortes representativos de hipocampo marcados con CellROX™ expuestos a SD (FIG. 9b) y a 3 días de incubación con IGF-1 seguido de depresión propagada (SD) (FIG. 9c). Los recuadros de línea de puntos ilustran áreas CA3 de interés utilizadas para cuantificaciones de OS relativo. (FIG. 9d) El OS aumentó significativamente (* p = 0,008) de los controles después de que los cultivos de cortes de hipocampo se expusieran a SD, y este efecto se anuló cuando se expuso a IGF-1 de forma aguda (n = 21, 12 y 9 para los cortes de control, 'SD' y 'SD IGF-1', respectivamente). (FIG. 9e) De manera similar, el aumento significativo (* p = 0,007) del OS inducido por SD se anuló cuando los cortes se expusieron a IGF-1 durante 3 días antes de SD (n = 21, 8 y 6 para los cortes 'SD' y 'SD IGF-1', respectivamente). (FIG. 9f) El aumento significativo en OS por SD (* p <0,001), en comparación con los controles, se redujo significativamente (* p <0,001) en cortes expuestos a IGF-1 durante 7 días antes de la inducción de SD (n = 21, 12 y 3 para cortes 'SD' y 'SD IGF-1', respectivamente). De nuevo, los tratamientos de siete días consistieron en exponer los cultivos a IGF-1 durante 12 horas al día durante siete días. Observación: La exposición a IGF-1 continuó durante las 24 horas adicionales de incubación con CellROX™. Barras de escala = 400 pm (a) y 200 pm (b y c). Las comparaciones entre grupos se realizaron a través de ANOVA más prueba post hoc de Holm-Sidak.

FIG. 10a-10c El ascorbato antioxidante ejemplar redujo, mientras que el peróxido de hidrógeno oxidante aumentó, la susceptibilidad a la depresión propagada, con el último efecto anulado por IGF-1. (FIG. 10a) La corriente promedio necesaria para inducir la depresión propagada (SD; es decir, el umbral de SD) fue significativamente (* p = 0,018) mayor cuando los cultivos de cortes se expusieron de forma aguda a ascorbato (AA; n = 8) en comparación con los controles (n = 12). (FIG. 10b) En cambio, la corriente promedio necesaria para inducir SD fue significativamente menor (* p <0,001) cuando los cultivos de cortes se expusieron a peróxido de hidrógeno 50 pM (H2O2; n = 8 y 11 para cortes de control y experimentales, respectivamente). (FIG. 10c) Si bien IGF-1 desencadenó una protección significativa contra la susceptibilidad a SD (*p <0,0001) y este efecto continuó cuando se administró conjuntamente con H2O250 pM, la dosis más alta de H2O2200 pM anuló este efecto a una diferencia no significativa del control. (n = 14, 16, 5, 9 para control, IGF-1, IGF-1 H2O250 pM e IGF-1 H2O2200 pM, respectivamente). En comparación con IGF-1, los umbrales de SD de los controles e IGF-1 H2O2 200 pM disminuyeron significativamente (#p < 0,00001). Las comparaciones entre los grupos se realizaron mediante la prueba f de Student (FIG. 10a, b) o ANOVA más la prueba post hoc de Holm-Sidak.

FIG. 11a-11 g IGF-1 disminuyó el estrés oxidativo (OS) de CA3 y su hiperexcitabilidad relacionada. (FIG. 11a) La excitabilidad del cultivo en cortes en respuesta al OS se caracterizó además por clasificar los cambios de potenciales evocados en un solo pulso de corriente que normalmente desencadenaba una respuesta de potencial de campo medio máxima donde un potencial de campo normal (FP por sus siglas del inglés field potential; izquierda) se calificó como "1"; un FP que incluía actividad de estallido relacionada con el estímulo (centro) se calificó como "2"; y un estímulo que dio como resultado la depresión propagada (derecha) fue calificado como "3". La excitabilidad evocada relativa se determinó como una suma de respuestas observadas (por ejemplo, las respuestas de "2" y "3" produjeron una puntuación de excitabilidad global de cinco). Las respuestas se midieron 30 minutos después de la exposición al peróxido de hidrógeno (H2O2). (FIG. 11b) La exposición al H2O2 (n = 7) desencadenó un aumento significativo ( * p <0,001) en la excitabilidad evocada en comparación con el control (n = 8) y este aumento se anuló mediante la aplicación aguda de IGF-1 (n = 4) a una diferencia no significativa del control. La exposición a IGF-1 sola (n = 4) no tuvo un impacto significativo sobre la excitabilidad evocada del área de corte CA3 (es decir, mostró una respuesta de "1"). (FIG. 11c) La exposición de 3 días a IGF-1 tuvo un impacto similar sobre la excitabilidad aumentada por OS de cultivo de cortes imitada por la aplicación de H2O2. H2O2 aumentó significativamente (* p <0,001) la excitabilidad de los cortes (n = 15) en comparación con el control (n = 18). El pretratamiento con IGF-1 durante 3 días (n = 9) redujo la excitabilidad aumentada inducida por H2O2 a una diferencia no significativa del control. (FIG. 11d-e) Imágenes ejemplares de OS de cultivos de cortes de control (FIG. 11d) en comparación con el aumento de OS de los cortes inducido por la exposición a menadiona (FIG. 11e). Barra de calibración, 200 pm. Los recuadros punteados indican áreas CA3 de interés utilizadas para cuantificaciones relativas de Os (f y g). (FIG. 11f) La exposición a menadiona (M; n = 12) desencadenó un aumento significativo ( *p <0,001) en el OS en comparación con el control (n = 18). El tratamiento agudo con IGF-1 (n = 15) redujo el OS de menadiona a una diferencia no significativa (p = 0,15) del control (n = 18). La exposición aguda a IGF-1 sola (n = 18) no redujo el OS del cultivo de cortes de control. (FIG. 11 g) El pretratamiento con IGF-1 durante 3 días (n = 15) también redujo el aumento significativo inducido por menadiona en el OS ( *p <0,001; n = 12) a una diferencia no significativa (p = 0,148) del control (n = 15). Además, el pretratamiento con IGF-1 solo (n = 18) redujo significativamente (* p = 0,008) el OS del cultivo de cortes en comparación con el control.

FIG. 12a-12e IGF-1 aumentó la actividad de aumento neuronal espontáneo. (FIG. 12a) Registro ejemplar de actividad electrofisiológica espontánea de la capa piramidal de CA3 de control no estimulada. (FIG. 12b) Registro ejemplar de actividad electrofisiológica espontánea de la capa piramidal CA3 expuesta a IGF-1 durante 3 días. (FIG. 12c) El tratamiento agudo con IGF-1 (n = 9) desencadenó un aumento significativo (* p = 0,03) en el aumento espontáneo de neuronas piramidales de CA3 en comparación con el control (n = 6). (FIG. 12d) El tratamiento con IGF-1 de 3 días también (n = 7) desencadenó un aumento significativo (* p = 0,001) en el estallido espontáneo de neuronas piramidales de CA3 en comparación con el control (n = 6). (FIG. 12e) De manera similar, El tratamiento con IGF-1 de 7 días también (n = 6) desencadenó un aumento significativo ( *p <0,001) en el estallido espontáneo de neuronas piramidales de CA3 en comparación con el control (n = 7). Los tratamientos de siete días consistieron en la exposición a IGF-1 durante solo 12 horas diarias. Las comparaciones entre grupos se realizaron a través de ANOVA más prueba post hoc de Holm-Sidak.

FIG. 13 El estrés oxidativo por SD aumenta preferentemente en los astrocitos y la microglía, con este último efecto mitigado por IGF-1. Los presentes inventores han demostrado recientemente que la depresión propagada (SD), la causa más probable de aura de jaqueca y quizás jaqueca (Lauritzen y Kraig, 2005), se produce con un mayor estrés oxidativo (OS) y que el OS, a su vez, aumenta la susceptibilidad a SD (Grinberg et al., 2012). Las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno que causan OS tienen capacidades de señalización tanto autocrinas como paracrinas que pueden afectar a la susceptibilidad a SD al alterar la excitabilidad (Kishida y Klann, 2007). Por consiguiente, los presentes inventores buscaron el origen celular del OS por SD. En este caso, los presentes inventores usaron cultivos de cortes de hipocampo (HSC, por sus siglas del inglés hippocampal slice cultures) para investigar los cambios específicos de células en OS por SD. La SD se indujo de forma trans-sináptica en HSC de rata usando estímulos eléctricos bipolares en el giro dentado (Pusic et al., 2011). Se indujeron seis SD cada 7 - 9 min durante una hora, seguidas de una incubación de 24 h en CellROX™, se utilizó una sonda fluorogénica fijable para medir el OS (Grinberg et al., 2012). Después, los HSC se fijaron en formalina al 10 % tamponada con fosfato. Otros fijadores (PLP, paraformaldehído al 4 %) impidieron la detección de cambios en el OS. Después se marcó el tejido para la detección de neuronas (anti-NeuN), oligodendrocitos (anti-RIP), astrocitos (anti-GFAP), o para microglía (isolectina GS-IB4). Utilizando microscopía confocal, seguida del análisis MetaMorph de la intensidad de fluorescencia específica celular, los presentes inventores descubrieron que el OS por SD aumentó significativamente en los astrocitos (p = 0,019) y la microglía (p = 0,003) pero no en las neuronas u oligodendrocitos, en comparación con los controles simulados (n = 3 - 6/grupo). Debido a que el factor de crecimiento tipo insulina 1 mimético del enriquecimiento ambiental (IGF-1) mitiga el OS tisular por SD (Grinberg et al., 2012), los presentes inventores buscaron a continuación los tipos de células responsables de este efecto. Los presentes inventores aplicaron IGF-1 (100 ng/ml) durante tres días y observaron que el OS por SD visto en la microglía disminuyó significativamente (p = 0,018) por IGF-1, pero el OS astrocítico de SD no cambió. El hallazgo de que los astrocitos, pero no las neuronas, muestran un aumento del OS por SD proporciona evidencia fisiológica que extiende el trabajo reciente que indica que los astrocitos tienen un mayor potencial de metabolismo oxidativo (Lovatt et al., 2007). Sin embargo, el aumento del OS de los astrocitos fue sorprendente dado su alto potencial antioxidante esperado (Belanger et al., 2011). Asimismo, SD desencadena microgliosis reactiva (Caggiano y Kraig, 1996), un cambio que se puede esperar que se produzca con el aumento del OS. Los resultados confirman esto, pero, es importante destacar que, muestran que IGF-1 anuló selectivamente el OS microglial. Debido a que el Os promueve la SD (Grinberg et al., 2012), el presente trabajo apunta a la microglía y su OS asociado como posibles dianas terapéuticas en nuevos tratamientos terapéuticos para la jaqueca crónica y de alta frecuencia.

FIG. 14A-14C. La proteína básica de mielina reducida (MBP, por sus siglas del inglés myelin basic protein) por SD depende de la activación de IFN-Y/linfocito T y esfingomielinasa. (FIG. 14A) Los análisis de transferencia Western para MBP confirman que el IFN-y aplicado de forma crónica (500 U/ml x 24 horas) es suficiente para reducir significativamente ("*", p <0,01; n > 5 para todos los grupos de la figura) los niveles de MBP. Asimismo, la administración conjunta de TNF-a (100 ng/ml) con IFN-y conduce a una disminución adicional de MBP. (FIG. 14B) Es importante destacar que, la eliminación de los linfocitos T de los cultivos de cortes del hipocampo por exposición a anti-CD4 durante 24 horas a 7 días in vitro, anula la disminución de MBP que de otra manera se observa después de la SD. Confirmando, así, la participación de los linfocitos T. (FIG. 14C) Además, el bloqueo de la esfingomielinasa neutra con GW 4869 evita la caída de MBP después de SD. En conjunto, estos resultados sugieren que la exposición aguda y alta a IFN-y [recordar SD solo desencadena una elevación abrupta de IFN-y y TNF-a, entre otras citocinas (Kunkler et al., 2004)] desencadena una elevación abrupta en TNF-a que activa la esfingomielinasa que está involucrada en la desmielinización por SD.

FIG. 15A-15C. La elevación fisiológica y transitoria [es decir, fásica (véase la Fig. 1)] de IFN-y desencadena efectos completamente opuestos. La exposición transitoria (es decir, 500 U/ml x 12 horas; todos los grupos n >5) de los cultivos de cortes del hipocampo fue nutritiva cuando se evaluó siete días después. (FIG. 15A) MBP aumentó significativamente (p <0,001) por encima de la línea de referencia. (FIG. 15B) Es importante destacar que, la susceptibilidad a SD aumentó significativamente (p <0,001) y el OS se redujo de manera similar (FIG.15C).

FIG. 16A-16F. Cuando se pulsa IFN-y en cultivos de cortes durante 12 horas, se desencadena la liberación de exosomas nutritivos que imitan el efecto de la exposición pulsada a IFN-y. Los cultivos de cortes se expusieron a IFN-y (500 U/ml x 12 horas) y tres días después se recogieron exosomas de sus medios de incubación circundantes. Estos últimos se aplicaron después a cultivos de cortes sin tratar y se realizaron mediciones siete días después. Todos los tamaños de grupo fueron > 5; todas las medidas de significación p < 0,001. Las micrografías electrónicas muestran exosomas a potencia baja (FIG. 16A) y alta (FIG.16B); barras de cal, 200 y 100 nm, respectivamente. (FIG. 16C) Las transferencias Western confirman marcadores de proteínas específicas de exosoma. Los exosomas estimulados por IFN-y desencadenaron un aumento significativo en MBP por encima de los niveles de referencia (FIG. 16D), una reducción significativa en la susceptibilidad a SD que fue mayor que un factor de cambio de 200 (FIG. 16E), así como (FIG. 16F) una reducción significativa en el OS.

FIG. 17A-17B. Detección de un aumento de glutatión inducido por IFN-y en el cultivo de cortes utilizando Thiol Tracker™, un indicador fluorescente de glutatión. (FIG. 17A) Las imágenes confocales para glutatión (flecha larga) y un marcador de microglía (flecha corta) confirmaron que la exposición pulsada a IFN-y aumenta selectivamente el glutatión microglial. (FIG. 17B) Además, este aumento es significativo (p <0,001; n > 5/grupo) y puede imitarse por exposición a exosomas aislados de cultivos de cortes activados por exposición pulsada a IFN-y.

Descripción detallada de la invención

El episodio clásico de jaqueca se caracteriza por una cefalea unilateral precedido por varios síntomas visuales, sensoriales y motores, conocidos colectivamente como un aura. Muy frecuentemente, el aura consiste en manifestaciones visuales como escotomas, fotofobia o centelleos visuales (por ejemplo, líneas brillantes en zigzag). La cefalea típica de la jaqueca es palpitante o pulsátil. (Sin embargo, más del 50 % de las personas que padecen jaquecas informan dolor no punzante en algún momento durante el ataque). La cefalea es inicialmente unilateral y localizado en el área frontotemporal y ocular, pero el dolor se puede sentir en cualquier lugar alrededor de la cabeza o el cuello. El dolor generalmente se acumula durante un período de 1-2 horas, progresa posteriormente y se vuelve difuso. La cefalea generalmente dura de 4-72 horas. Entre las mujeres, más de dos tercios de los pacientes informan ataques que duran más de 24 horas. Los dolores de cabeza de tipo jaqueca pueden ser unilaterales o bilaterales y pueden aparecer con o sin aura. Las jaquecas sin aura son las más comunes, y representan más del 80% de todas las jaquecas. Los ataques de jaqueca también pueden incluir manifestaciones visuales sin cefalea. Los presentes inventores indican que la jaqueca no es una afección neurodegenerativa, así pues, no es necesario que un tratamiento sea neuroprotector. En determinados aspectos, los efectos neuroprotectores pueden excluirse explícitamente del alcance de las reivindicaciones.

El diagnóstico de jaqueca sin aura, de acuerdo con la International Headache Society, se puede realizar de acuerdo con los siguientes criterios, los "5, 4, 3, 2, 1 criterios": 5 o más ataques. Para la jaqueca con aura, dos ataques son suficientes para el diagnóstico. De 4 horas a 3 días de duración. 2 o más de los siguientes: Unilateral (que afecta a la mitad de la cabeza); Pulso; "Intensidad de dolor moderada o grave"; "Agravación por, o que causa evitación de, la actividad física de rutina". 1 o más de los siguientes: "Náuseas y/o vómitos"; Sensibilidad tanto a la luz (fotofobia) como al sonido (fonofobia).

La CSD o Depresión propagada (SD) es una perturbación paroxística del cerebro que se cree que causa aura de jaqueca, y quizás jaqueca (Lauritzen y Kraig, 2005). Se define clásicamente como una pérdida transitoria en la actividad eléctrica espontánea y evocada, asociada con un gran cambio de potencial de CC en el espacio intersticial, que se propagan a una velocidad única y lenta de aproximadamente 3 mm/min (Bures et al., 1974; Somjen, 2001). SD se desencadena en áreas susceptibles de materia gris del cerebro donde se despolariza sincrónicamente un volumen suficiente (Brazier, 1963). Este efecto desencadenante es el resultado del aumento de la excitación, la reducción de la inhibición o una combinación de estos dos efectos, lo que da como resultado una ráfaga de descargas espontáneas que preceden inmediatamente a la pérdida de actividad de SD (Mody et al., 1987; Kruger et al., 1996; Kunkler y Kraig, 1998). Asimismo, la evidencia reciente mostró que la actividad espontánea y evocada aumenta mucho después de los episodios de SD.

La evidencia indica que las microglías se activan por una mayor actividad sináptica (Ziv et al., 2006; Hung et al., 2010) y que su señalización también puede influir en la actividad sináptica (Beattie et al., 2002; Kaneko et al., 2008; Stellwagen et al., 2005; Stellwagen y Malenka, 2006). Stellwagen y sus colaboradores muestran que TNF-a potencia la excitación neuronal al aumentar la expresión en la superficie celular del receptor AMPA y reducir los niveles de membrana del receptor GABA (Stellwagen et al., 2005; Stellwagen y Malenka, 2006). Además, Turrigiano y sus colegas muestran que esta capacidad de la microglía está implicada en el escalado sináptico homeostático, una respuesta adaptativa del cerebro dirigida a sintonizar la actividad del circuito neuronal a un estado funcionalmente óptimo (Steinmetz y Turrigiano, 2010). Así, por extensión, es probable que las microglías estén implicadas en la SD. De hecho, la SD activa la microglía (Caggiano et al., 1996; Hulse et al., 2008). Los inventores muestran que la microglía activada (p. ej., que produce TNF-a (Hulse et al., 2008); FIG. 2) o el estrés oxidativo (Grinberg et al., 2012 a, b; FIG.

9) aumentan la susceptibilidad a la depresión propagada.

El movimiento microglial refleja su estado de activación. Dentro del contexto de la enfermedad, las microglías viajan direccionalmente hacia sitios de lesión irreversible (McGlade-McCulloh et al., 1989). Por el contrario, dentro del tejido cerebral sano, los somas microgliales permanecen en su lugar, pero durante el aumento de la actividad sináptica, sus procesos se extienden y retraen a un ritmo acelerado (Nimmerjahn et al., 2005). Debido a que la SD está precedida por una ráfaga de actividad sináptica incrementada (Brazier, 1963; Kruger et al., 1996; Kunkler y Kraig, 1998) seguida por un breve período de silencio eléctrico durante la SD, y luego mucho después, un aumento persistente en la actividad sináptica.

Los presentes inventores contemplan que las células inmunitarias se activan (e influyen en otras células) por los efectos mediados por contacto, así como por la señalización paracrina. Los presentes inventores investigaron el movimiento de las células microgliales asociados con SD utilizando imágenes vitales de microglía en cultivos maduros de cortes de hipocampo de rata. Los resultados muestran que una fracción de microglía en cultivos de cortes de control se movió de una manera estereotípica consistente con los vuelos de Levy. Asimismo, horas después de la SD, el número de microglías que se desplazan grandes distancias aumentó significativamente. Los presentes inventores se preguntaron si este efecto podría imitarse por alteraciones en la actividad sináptica. La actividad sináptica aumentó por la activación de la microglía (con lipopolisacárido (LPS)), así como la actividad neuronal aumentada por la potenciación química a largo plazo (cLTP, por sus siglas del inglés Chemical long-term potentiation) disminuyó significativamente el número de microglías que se mueven a largas distancias. Por el contrario, el bloqueo de la actividad sináptica a través de la exposición a la tetrodotoxina (TTX) aumentó significativamente el número de microglías que se mueven largas distancias y este aumento podría anularse por la incubación conjunta con glutamato y adenosín trifosfato (ATP), dos mediadores paracrinos liberados con actividad sináptica, para los que la microglía tiene receptores.

Recientemente, el estudio de los movimientos celulares desde la perspectiva de un desplazamiento aleatorio ha atraído un gran interés (Berg, 1993; Li et al., 2008; Reynolds, 2010a; Reynolds, 2010b; Selmeczi et al., 2008; Selmeczi et al., 2005; Takagi et al., 2008). Estos estudios se han centrado en los movimientos de las células en cultivo o sobre superficies. Los presentes inventores proporcionan evidencia para demostrar que las microglías viajan a través de vuelos Levy. Además, los presentes inventores muestran que estos movimientos corresponden al tipo de vuelo Levy que se ha asociado con un patrón de búsqueda aleatorio óptimo (Cabrera y Milton, 2004; Viswanathan et al. 1999). Los presentes inventores contemplan que la migración microglial después de la SD es un medio por el cual estas células influyen en una extensión más amplia del cerebro, ya sea por contacto o por señalización paracrina, tal vez para aumentar la susceptibilidad regional a la SD, y por extensión, la jaqueca.

En un aspecto, se proporcionan nuevas terapias y métodos terapéuticos que previenen la jaqueca recurrente y su transición a la jaqueca crónica.

El interferón gamma (IFN-y) es una citocina producida por los linfocitos T y los linfocitos citolíticos naturales, y es el único miembro de la clase de interferones de tipo II. Este interferón se llamaba originalmente factor de activación de macrófagos, un término que actualmente se usa para describir una familia más grande de proteínas a la que pertenece IFN-y. En seres humanos, la proteína IFN-y está codificada por el gen IFNG. Se ha demostrado que IFN-y interactúa con el receptor 1 de interferón gamma. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de IFN-y se encuentra en el número de registro de GenBank AAB59534 (GI: 184639), Determinados aspectos están dirigidos a isoformas y variantes de IFN-y que conservan una o más funciones de IFN-y, particularmente los efectos terapéuticos descritos en el presente documento. Los péptidos o polipéptidos IFN-y pueden comprender la totalidad o parte de una secuencia de aminoácidos similar a la proporcionada en el número de registro de GenBank AAB59534, que es la SEQ ID NO: 1.

La interleucina 11 (IL-11) es miembro de una familia de factores de crecimiento que incluye la hormona del crecimiento, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y otros. IL-11 también es miembro de una familia de citocinas que incluye IL-6, factor inhibidor de leucemia (LIF por sus siglas del inglés leukemia inhibitory factor), oncostatina M (OSM por sus siglas del inglés oncostatin M) y factor neurotrófico ciliar (CNTF por sus siglas en inglés), que todos señalan a través de una subunidad de receptor común, gp130. La IL-11 es producida naturalmente por las células del estroma de la médula ósea, y es un factor de crecimiento trombopoyético que, junto con otros factores, estimula la proliferación de células madre hematopoyéticas y células progenitoras megacariocíticas e induce la maduración, lo que da como resultado una mayor producción de plaquetas. IL-11 también se conoce con el nombre de factor inhibidor de la adipogénesis (AGIF) y oprelvekina. En seres humanos, la proteína IL-11 está codificada por el gen IL11. Se ha demostrado que la interleucina 11 interactúa con el receptor de interleucina 11, además de gp130. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de IL-11 se encuentra en el número de registro de GenBank NP_000632 (GI: 10834994), Determinados aspectos están dirigidos a isoformas y variantes de IL-11 que conservan una o más funciones de IL-11, particularmente los efectos terapéuticos descritos en el presente documento. Los péptidos o polipéptidos IL-11 pueden comprender todo o parte de una secuencia de aminoácidos similar a la proporcionada en el número de registro de GenBank NP_000632, que es la SEQ ID NO: 2.

El factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1) también se conoce como somatomedina C o factor de crecimiento mecánico, y también se lo conoce como un "factor de sulfatación" o "actividad tipo insulina no suprimible" (NSILA). La familia del factor de crecimiento tipo insulina incluye dos ligandos, IGF-1 e IGF-2, dos receptores de membrana celular, IGF-1R e IGF-2R, y seis proteínas de unión a IGF-1, IGFBP1-6. En seres humanos, la proteína IGF-1 está codificada por el gen IGF1. Se ha demostrado que el factor de crecimiento tipo insulina 1 interactúa con el receptor de IGF-1 (IGF1R) y el receptor de insulina. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de IGF-1 se encuentra en el número de registro de GenBank CAA01955 (GI: 4529932), Determinados aspectos están dirigidos a isotermas y variantes de IGF-1 que conservan una o más funciones de IGF-1, particularmente los efectos terapéuticos descritos en el presente documento. Los péptidos o polipéptidos IGF-1 pueden comprender todo o parte de una secuencia de aminoácidos similar a la proporcionada en el número de registro de GenBank CAA01955, que es la SEQ ID NO: 3.

La insulina es una hormona central para regular el metabolismo de carbohidratos y grasas en el cuerpo. La insulina se sintetiza en el páncreas dentro de las células p de los islotes de Langerhans. También se ha demostrado que la insulina se produce dentro del cerebro. La proinsulina precursora de insulina está codificada por el gen INS. Se ha demostrado que la insulina interactúa con el receptor de insulina. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de insulina se encuentra en el número de registro de GenBank AAA59172 (GI:386828). Determinados aspectos están dirigidos a isoformas y variantes de insulina que conservan una o más funciones de la insulina, particularmente los efectos terapéuticos descritos en el presente documento. Los péptidos o polipéptidos de insulina pueden comprender todo o parte de una secuencia de aminoácidos similar a la proporcionada en el número de registro de GenBank AAA59172, que es la SEQ ID NO: 4.

Los péptidos y/o polipéptidos descritos en el presente documento pueden poseer deleciones y/o sustituciones de aminoácidos en relación con la secuencia natural. Se contemplan secuencias con sustituciones de aminoácidos, tales como secuencias con una deleción, y secuencias con una deleción y una sustitución. En algunas realizaciones, estos polipéptidos pueden incluir además inserciones o aminoácidos añadidos.

Los polipéptidos que pueden administrarse incluyen aquellos que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80l, 81, , 85, 90, 9 , 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99 , 101 , 103, 104, 105, 106.

107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152.

153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175.

176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313.

314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 710, 720, 730, 740 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970 980, 990 o 1000 aminoácidos contiguos, o cualquier intervalo derivable en los mismos, de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Alternativamente, el polipéptido en composiciones o métodos puede ser 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 %, o cualquier intervalo derivable en los mismos, idéntico a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

Los siguiente es un análisis basado en el cambio de los aminoácidos de un péptido y/o polipéptido para crear una biblioteca de moléculas o una molécula de segunda generación. Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en un polipéptido sin pérdida apreciable de la función, tal como la capacidad de interactuar con una secuencia de péptido diana. Debido a que es la capacidad de interacción y la naturaleza de un polipéptido lo que define la actividad funcional de ese polipéptido, se pueden realizar determinadas sustituciones de aminoácidos en una secuencia de polipéptidos y, sin embargo, producen un polipéptido con propiedades similares.

Al hacer tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice de aminoácidos hidropáticos para conferir una función interactiva sobre una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse de forma eficaz basándose en la hidrofilicidad. La Patente de Estados Unidos 4.554.101, establece que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, según lo regido por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la Patente de Estados Unidos 4.554.101, se han asignado a los restos de aminoácido los siguientes valores de hidrofilicidad: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).

Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y aún producir una proteína biológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, se prefieren aún más particularmente aquellos que están dentro de ± 1, y aquellos dentro de ± 0,5.

Como se describe anteriormente, las sustituciones de aminoácidos generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Sin embargo, en algunos aspectos se contempla una sustitución no conservativa. En determinados aspectos, también se contempla una sustitución aleatoria. Las sustituciones ejemplares que toman en consideración las diversas características anteriores son bien conocidas por los expertos en la materia e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden una cantidad eficaz de interferón gamma, interleucina 11, factor de crecimiento tipo insulina 1, insulina o una combinación de los mismos y/o agentes adicionales disueltos o dispersos en un transportador farmacéuticamente aceptable. Las expresiones "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen efectos adversos, reacción alérgica o negativa distinta cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea adecuado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene interferón gamma, interleucina 11, factor de crecimiento tipo insulina 1, insulina o una combinación de los mismos principios activos adicionales serán conocidos por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación, como se ejemplifica en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, Además, para la administración en animales (por ejemplo, seres humanos), se entenderá que las preparaciones deberían cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por la Oficina de Patrones Biológicos de la FDA u organismos reguladores similares.

En determinadas realizaciones, el compuesto activo, por ejemplo, interferón gamma, interleucina 11, factor de crecimiento tipo insulina 1, insulina o una combinación de los mismos, puede formularse para administración intranasal. La administración nasal de la presente invención puede comprender el uso de un aerosol nasal que usa agua o soluciones salinas como transportador líquido con péptido o polipéptido que se dispersa o disuelve en el agua en una cantidad terapéuticamente eficaz. En otra realización, se emulsiona un potenciador de permeación en la fase acuosa que contiene el compuesto activo. La emulsificación puede realizarse mediante el uso de uno o más tensioactivos adecuados. Cualquier tensioactivo o mezcla de tensioactivos adecuados puede usarse en la práctica de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, tensioactivos aniónicos, catiónicos y no iónicos. Ejemplos de tensioactivos no iónicos son los glicéridos de maíz PEG-60, monoestearato de sorbitán PEG-20, fenoxi-poli (etilenoxi) etanol, monooleato de sorbitán y similares. En general, el tensioactivo está presente en una cantidad inferior a aproximadamente el 4, 3, 2, 1,5, 1, 0,5, 0,2 % (p/p) de la composición, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos. En otra realización, el tensioactivo puede estar presente en cantidades inferiores a aproximadamente el 1,5 % (p/p), inferiores a aproximadamente el 1,3 % (p/p), inferiores a aproximadamente el 1 % (p/p) o inferiores a aproximadamente el 0,3% (p/p). Para ejemplos véase el documento PCT/US2009/046438.

En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden formularse como gotas para los ojos, atomizadores intranasales, inhaladores y/o como otros aerosoles. Los métodos para suministrar composiciones directamente al conducto nasal o los pulmones a través de atomizadores nasales se han descrito en las patentes de los Estados Unidos 5.756.353 y 5.804.212 De forma análoga, el suministro de fármacos usando resinas de micropartículas intranasales (Takenaga et al, 1998) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (Patente de Estados Unidos 5.725.871, también son bien conocidos en las técnicas farmacéuticas. De forma análoga, se describe el suministro transmucoso de fármacos en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno en la Patente de Estados Unidos 5.780.045.

El término aerosol se refiere a un sistema coloidal de partículas sólidas o líquidas finamente divididas dispersas en un propulsor de gas licuado o presurizado. Un aerosol típico para inhalación puede consistir en una suspensión de principios activos en propelente líquido o una mezcla de propelente líquido y un disolvente adecuado. Los propulsores adecuados incluyen hidrocarburos y éteres de hidrocarburos. Los recipientes adecuados pueden variar de acuerdo con los requisitos de presión del propelente. La administración del aerosol puede variar según la edad del sujeto, el peso y la gravedad y la respuesta de los síntomas.

Como se usa en el presente documento, "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes de retardo de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizadores de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, colorantes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como sabría un experto en la materia (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, págs. 1289-1329). Excepto en la medida en la que un transportador convencional cualquiera sea incompatible con el principio activo, se considera su uso en las composiciones farmacéuticas.

Las realizaciones pueden comprender diferentes tipos de transportadores dependiendo de si se administrará en forma sólida, líquida o en aerosol, y si necesita ser estéril para tales vías de administración como inyección. La presente invención puede administrarse por vía intravenosa, intradérmica, transdérmica, intratecal, intraarterial, intraperitoneal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, tópica, intramuscular, subcutánea, mucosa, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada bañando una diana directamente, mediante un catéter, mediante un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas) o mediante otros métodos o cualquier combinación de los anteriores, como sabría un experto en la materia (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a Ed. Mack Printing Company, 1990).

Los compuestos pueden formularse en una composición en una base libre, neutra o en forma de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteica o que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos, tales como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. También pueden obtenerse sales formadas con los grupos carboxilo libres a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o de hierro; o bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Tras la formulación, las soluciones se pueden administrar de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones pueden administrarse fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como formuladas para administraciones parenterales tales como soluciones inyectables o aerosoles, o formuladas para administraciones alimentarias tales como cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Los métodos y composiciones que son adecuados para la administración pueden proporcionarse en un transportador farmacéuticamente aceptable con o sin un diluyente inerte. El transportador debe ser asimilable e incluye transportadores líquidos, semisólidos (es decir, pastas) o sólidos. Excepto en la medida en que cualquier medio, agente, diluyente o transportador convencional sea perjudicial para el receptor o para la eficacia terapéutica de la composición contenida en el mismo, es apropiado su uso en una composición administrable para su uso en la práctica de los métodos de la presente invención. Ejemplos de transportadores o diluyentes incluyen grasas, aceites, agua, soluciones salinas, lípidos, liposomas, resinas, aglutinantes, cargas, y similares, o combinaciones de los mismos. La composición también puede comprender diversos antioxidantes para retardar la oxidación de uno o más componentes. Adicionalmente, puede lograrse la prevención de la acción de los microorganismos mediante conservantes tales como diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, que incluyen, pero sin limitación, parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, acido sórbico, timerosal o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición se combina con el transportador de cualquier manera conveniente y práctica (es decir, mediante solución, suspensión, emulsión, mezcla, encapsulación, absorción y similares). Dichos procedimientos son rutinarios para los expertos en la materia.

En una realización adicional, la composición se combina o mezcla a fondo con un transportador semisólido o sólido. La mezcla puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, tal como molienda. También se pueden añadir agentes estabilizantes en el proceso de mezcla para proteger la composición de la pérdida de actividad terapéutica (es decir, desnaturalización en el estómago). Ejemplos de estabilizadores para su uso en una composición incluyen tampones, aminoácidos tales como glicina y lisina, carbohidratos tales como dextrosa, manosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, maltosa, sorbitol, manitol, etc.

En realizaciones adicionales, los métodos pueden referirse al uso de composiciones farmacéuticas de vehículos lipídicos que incluyen interferón gamma, interleucina 11, factor de crecimiento tipo insulina 1, insulina o una combinación de los mismos, uno o más lípidos y un disolvente acuoso. Como se usa en el presente documento, el término "lípido" se definirá para incluir cualquiera de una amplia gama de sustancias que son característicamente insolubles en agua y extraíbles con un disolvente orgánico. Los expertos en la materia conocen bien esta amplia clase de compuestos, y como el término "lípido" se usa en el presente documento, no se limita a ninguna estructura particular. Los ejemplos incluyen compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados. Un lípido puede ser de origen natural o sintético (es decir, diseñado o producido por el hombre). Sin embargo, un lípido suele ser una sustancia biológica. Los lípidos biológicos son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, grasas neutras, fosfolípidos, fofoglicéridos, esteroides, terpenos, lisolípidos, glucoesfingolípidos, glucolípidos, sulfatidas, lípidos con éter y ácidos grasos unidos a éster y lípidos polimerizables y combinaciones de los mismos. Por supuesto, los compuestos diferentes a los que se describen específicamente en el presente documento que los expertos en la técnica entienden como lípidos también están abarcados por las composiciones y los métodos descritos en el presente documento.

Un experto en la materia estaría familiarizado con la gama de técnicas que se pueden emplear para dispersar una composición en un vehículo lipídico. Por ejemplo, la composición que comprende interferón gamma, interleucina 11, factor de crecimiento tipo insulina 1, insulina o una combinación de los mismos se puede dispersar en una solución que contiene un lípido, disolver con un lípido, emulsionar con un lípido, mezclar con un lípido, combinar con un lípido, unir covalentemente a un lípido, contener como una suspensión en un lípido, contener o formar un complejo con una micela o liposoma, o asociar de otra manera con un lípido o una estructura lipídica mediante cualquier medio conocido por los expertos en la materia. La dispersión puede o no dar como resultado la formación de liposomas.

La cantidad de dosificación real de una composición que se administra a un sujeto puede determinarse por factores físicos y fisiológicos tales como el peso corporal, la gravedad de la afección, el tipo de enfermedad que se está tratando, las intervenciones terapéuticas anteriores o concurrentes, la idiopatía del paciente y la vía de administración. Dependiendo de la dosis y la vía de administración, el número de administraciones de una dosis preferida y/o una cantidad eficaz puede variar de acuerdo con la respuesta del sujeto. El médico responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la concentración de principio activo (o principios activos) en una composición y la dosis adecuada para el sujeto individual.

En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente un 0,1 % de un compuesto activo. En otras realizaciones, un compuesto activo puede comprender entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 75 % del peso de la unidad, o entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 60 %, por ejemplo, aproximadamente un 2 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 % y cualquier intervalo derivable de los mismos. Naturalmente, la cantidad de compuesto activo (o compuestos activos) en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de tal manera que se obtendrá una dosificación adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Factores tales como la solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, vía de administración, vida media del producto, así como otras consideraciones farmacológicas se contemplarán por un experto en la materia de preparar dichas formulaciones farmacéuticas, y como tales, pueden ser deseables una variedad de dosificaciones y regímenes de tratamiento.

En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 10 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 50 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 100 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 200 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 350 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 500 miligramo/kg/peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal o más por administración y cualquier intervalo derivable a partir de los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 mg/kg/peso corporal hasta aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 mg/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, etc., basándose en los números descritos anteriormente.

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención están formuladas para administrarse a través de una vía alimentaria. Las rutas alimentarias incluyen todas las rutas posibles de administración en las que la composición está en contacto directo con el tracto alimentario. Específicamente, las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden administrarse por vía oral, bucal, rectal o sublingual. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un transportador comestible asimilable, o pueden encerrarse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con la comida de la dieta.

En determinadas realizaciones, los compuestos activos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares (Mathiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; Patente de Estados Unidos 5.641.515; 5.580.579 y 5.792.451). Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: un aglutinante, por ejemplo, goma de tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz, gelatina o combinaciones de los mismos; un excipiente, por ejemplo, fosfato de dicalcio, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio o combinaciones de los mismos; un agente disgregante, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico o combinaciones de los mismos; un lubricante, por ejemplo, estearato de magnesio; un agente edulcorante, por ejemplo, sacarosa, lactosa, sacarina o combinaciones de los mismos; un agente aromatizante, por ejemplo, menta, aceite de gaulteria, aroma de cereza, aroma de naranja, etc. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un transportador líquido. Pueden estar presentes varios otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden estar recubiertas con goma laca, azúcar o ambos. Cuando la forma de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, transportadores tales como un transportador líquido. Las cápsulas de gelatina, comprimidos o píldoras pueden estar recubiertas entéricamente. Los recubrimientos entéricos evitan la desnaturalización de la composición en el estómago o el intestino superior donde el pH es ácido. Véase, la patente de Estados Unidos 5.629.001. Al llegar al intestino delgado, el pH básico en el mismo disuelve el recubrimiento y permite que la composición sea liberada y absorbida por células especializadas, por ejemplo, enterocitos epiteliales y células M de las placas de Peyer. Un jarabe de elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un tinte y agente aromatizante, como el aroma a cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado para preparar cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos pueden incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.

Para la administración oral, las composiciones de la presente invención pueden incorporarse alternativamente con uno o más excipientes en forma de enjuague bucal, dentífrico, comprimido bucal, atomizador oral o formulación sublingual administrada por vía oral. Por ejemplo, puede prepararse un enjuague bucal incorporando el principio activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado, tal como una solución de borato de sodio (solución de Dobell). Alternativamente, el principio activo puede incorporarse en una solución oral tal como una que contiene borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio, o dispersarse en un dentífrico, o agregarse en una cantidad terapéuticamente eficaz a una composición que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espumantes y humectantes. Alternativamente, las composiciones pueden formarse en forma de comprimido o solución que puede colocarse debajo de la lengua o de otra manera disolverse en la boca.

Formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración alimentaria incluyen supositorios. Los supositorios son formas de dosificación sólidas de varios pesos y formas, generalmente medicadas, para su inserción en el recto. Después de la inserción, los supositorios se ablandan, funden o disuelven en los fluidos de la cavidad. En general, para los supositorios, los vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles, triglicéridos o combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, los supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen, por ejemplo, el principio activo en el intervalo de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 10 %, y preferiblemente de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 %.

En realizaciones adicionales, la composición de la presente invención puede administrarse por vía parenteral. Como se usa en el presente documento, el término "parenteral" incluye vías que evitan el tracto alimentario. Específicamente, las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden administrarse, por ejemplo, pero sin limitación por vía intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraarterial, intratecal, subcutánea o intraperitoneal Patentes de Estados Unidos 6.753.514, 6.613.308, 5.466.468, 5.543.158; 5.641.515; y 5.399.363).

Las soluciones de los compuestos activos en forma de base libre o como sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (Patente de Estados Unidos 5.466.468). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista facilidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El transportador puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (es decir, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución puede tamponarse de manera adecuada en caso necesario y el diluyente líquido primero se hace isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán los medios acuosos estériles que pueden emplearse a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en una solución isotónica de NaCl bien se añade fluido de hipodermoclisis o se inyecta en el sitio de infusión propuesto, (véase, por ejemplo "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580).

Necesariamente se producirá cierta variación en la dosis dependiendo de la afección del sujeto que se esté tratando.

La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis adecuada para el sujeto individual. Además, para administración a seres humanos, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por la Oficina de Patrones Biológicos de la FDA u otros organismos reguladores.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según necesidades, seguido de esterilización por filtrado. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y criodesecado, que proporcionan un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de los mismos previamente esterilizada por filtración. Una composición en polvo se combina con un transportador líquido tal como, por ejemplo, agua o una solución salina, con o sin agente estabilizante.

En otras realizaciones, el compuesto activo, es decir, interferón gamma, interleucina 11, factor de crecimiento tipo insulina 1, insulina o una combinación de los mismos, puede formularse para administración a través de varias vías misceláneas, por ejemplo, administración transdérmica.

Las composiciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir el compuesto activo formulado para una aplicación medicada tal como una pomada, pasta, crema o polvo. Las pomadas incluyen todas las composiciones oleaginosas, de adsorción, de emulsión y solubles en agua para aplicación tópica, mientras que las cremas y lociones son aquellas composiciones que incluyen solo una base de emulsión. Los medicamentos administrados tópicamente pueden contener un potenciador de penetración para facilitar la absorción de los principios activos a través de la piel.

Los potenciadores de penetración adecuados incluyen glicerina, alcoholes, alquilmetilsulfóxidos, pirrolidonas y luarocapram. Las posibles bases para composiciones para aplicación tópica incluyen polietilenglicol, lanolina, crema fría y vaselina, así como cualquier otra base adecuada de absorción, emulsión o pomada soluble en agua. Las preparaciones tópicas también pueden incluir emulsionantes, agentes gelificantes y conservantes antimicrobianos según sea necesario para preservar el principio activo y proporcionar una mezcla homogénea. La administración transdérmica de la presente invención también puede comprender el uso de un "parche". Por ejemplo, el parche puede suministrar una o más sustancias activas a una tasa predeterminada y de manera continua durante un período fijo de tiempo.

En determinadas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención implican una composición terapéutica que comprende un compuesto que reduce, mejora o previene la jaqueca. Estas composiciones pueden usarse en combinación con una segunda terapia para potenciar el efecto terapéutico de una primera y/o segunda terapia. Estas composiciones se proporcionarían en una cantidad combinada eficaz para lograr el efecto deseado.

Este proceso puede implicar proporcionar o administrar una primera terapia y una segunda terapia al mismo tiempo o en otro diferente. Esto se puede lograr administrando una o más composiciones o formulaciones farmacológicas que incluyen o más de los agentes, o poniendo en contacto la célula con dos o más composiciones o formulaciones distintas, en donde una composición proporciona (1) una primera terapia que comprende administrar efector de la vía de TNF-a, tales como interferón gamma, IL-11, IGF-1, insulina o una combinación de los mismos; y/o (2) una segunda terapia. Se puede administrar una segunda terapia que incluya analgésicos, tales como aspirina, cafeína, vasoconstrictores, narcóticos, agonista del receptor 5HT1 (p. ej., sumatriptán, naratriptán, rizatriptán, zolmitriptán, eletriptán, almotriptán y frovatriptán), otros fármacos contra la jaqueca y combinaciones de los mismos. Se conocen varios fármacos contra la jaqueca. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 4.650.810, 4.914.125, 4.916.125, 4.994.483, 5.021. 428, 5.200.413, 5.242.949, 5.248.684, 5.273.759, 5.317.103, 5.364.863, 5.399.574, 5.434.154, 5.441.969, 5.464.864, 5.466.699, 5.468.768, 5.491.148 y 5.494.910. Los fármacos contra la jaqueca más frecuentemente utilizados en el tratamiento de la jaqueca se dividen en los siguientes grupos: alcaloides de ergot, agentes beta-bloqueantes, agentes bloqueantes de canales de calcio, antidepresivos, agonistas de 5-HT. selectivos, sedantes, anestésicos locales, agentes bloqueantes adrenérgicos y mezclas de estos.

Se contempla que uno pueda proporcionar a un paciente la primera terapia y la segunda terapia dentro de aproximadamente 12-24 h entre sí y, más preferentemente, dentro de aproximadamente 6-12 h entre sí. En algunas situaciones, sin embargo, puede ser conveniente extender el período de tiempo para el tratamiento de manera significativa, donde transcurren varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las administraciones respectivas.

En determinadas realizaciones, un curso de tratamiento (es decir, una primera terapia, o una primera terapia en combinación con una segunda terapia) durará 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 8 85, 86, 87, 88, 89, 90 días o más. Se contempla que se puedan administrar una o más terapias los días 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,

39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,

70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, y/o 90, cualquier combinación de los mismos, y se puede administrar una segunda terapia los días 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,

19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, y/o 90 o cualquier combinación de los mismos. Dentro de un solo día (período de 24 horas), el sujeto puede recibir una o múltiples administraciones de una primera y/o segunda terapia. Además, después de un curso de tratamiento, se contempla que hay un período de tiempo en el que no se administra ningún tratamiento.

Este período de tiempo puede durar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días y/o 1, 2, 3, 4, 5 semanas y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,

12 meses o más, dependiendo de la condición del paciente, tal como su pronóstico, resistencia, salud, etc.

Se pueden emplear diversas combinaciones, por ejemplo, una primera terapia es "A" y una segunda terapia es "B":

La administración a un sujeto de cualquier compuesto o terapia de la presente invención seguirá protocolos generales para la administración de dichos compuestos o terapias, teniendo en cuenta la toxicidad, si la hubiera, del vector o cualquier proteína u otro agente. Por lo tanto, en algunas realizaciones hay una etapa de monitorizar la toxicidad que es atribuible a la terapia de combinación. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan según sea necesario.

También se contempla que se puedan aplicar varias terapias convencionales en combinación con la terapia descrita.

Los agentes terapéuticos de la invención pueden administrarse en dosis de 0,01, 0,05, 0,01, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 pg, ng, |jg, o mg por dosis o por kilogramos de peso corporal del sujeto, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos.

Los componentes y compuestos de la invención se pueden proporcionar a un sujeto al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más veces como parte de una terapia o tratamiento. Además, se contempla que puede prescribirse un curso de terapia y que el curso puede repetirse, si es necesario.

En otras realizaciones, los componentes o compuestos de la invención se proporcionan al paciente por separado. Se contempla que al sujeto se proporcione con el primer agente y se proporcione o administre un segundo agente dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 horas, y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días y/o

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 semanas, o cualquier intervalo derivable en los mismos. En consecuencia, un sujeto puede tomar o recibir un primer o segundo componente o compuesto de la invención 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,

12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más veces cada uno, o cualquier intervalo derivable en los mismos, dentro de un período de tiempo especificado desde que se proporciona un primer o segundo componente o compuesto.

En algunas realizaciones, un polipéptido, tal como IL-11, IFN-y, IGF-1 o insulina no se proporciona directamente al paciente o a las células del paciente, y en su lugar, se proporciona al paciente un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido bajo el control de un promotor, en donde el polipéptido se expresa en una célula que contiene el vector. En consecuencia, las realizaciones que implican polipéptidos pueden implementarse con un vector de expresión para lograr un tratamiento para pacientes con jaqueca. Hay dos enfoques básicos para tal terapia, (i) expresión génica ex vivo y (ii) expresión génica in vivo.

En la expresión génica ex vivo, las células se eliminan de un sujeto y se transfectan con un gen deseado in vitro. Las células genéticamente modificadas se expanden y después se implantan nuevamente en el sujeto. Pueden usarse en la práctica de la presente invención varios métodos de transfección de células, tal como por electroporación, precipitación con fosfato de calcio, liposomas, micropartículas y otros métodos conocidos por los expertos en la materia.

En la expresión génica in vivo, el gen deseado se introduce en las células del receptor in vivo. Esto se puede lograr mediante el uso de una variedad de métodos conocidos por los expertos en la materia. Tales métodos incluyen, pero sin limitación, inyección directa de un vector de expresión e introducción de un vector de expresión en un transportador tal como un virus, liposoma o exosoma.

Se pueden usar varios procesos de transducción para la transferencia de ácido nucleico a una célula usando un virus de ADN o ARN. En un aspecto de la presente invención, se utiliza un retrovirus para transferir ácido nucleico a una célula. El material genético exógeno que codifica un producto génico deseado está contenido dentro del retrovirus y se incorpora al genoma de la célula transducida. En otros aspectos, el material genético exógeno que codifica un producto génico deseado está contenido dentro del virus y se mantiene en el citoplasma de la célula transducida. La cantidad de producto génico que se proporciona in situ está regulada por varios factores, tal como el tipo de promotor utilizado, el número de copias génicas en la célula, el número de células transducidas/transfectadas que se administran

y el nivel de expresión del producto deseado. El vector de expresión de la presente invención puede incluir un gen de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, para facilitar la selección de las células transfectadas o transducidas.

Los vectores de expresión pueden estar comprendidos en virus, tales como retrovirus. Los virus deficientes en replicación son incapaces de producir partículas infecciosas. Los vectores de expresión víricos alterados genéticamente son útiles para la transducción de genes de alta eficacia en células cultivadas y también son útiles para la transducción eficaz de genes en células in vivo. Los expertos en la materia conocen los protocolos convencionales para el uso de virus para transferir material genético a las células. Por ejemplo, se puede encontrar un protocolo convencional en Kriegler (1990) y Murray (1991).

El vector de expresión también puede estar en forma de un plásmido, que puede transferirse a las células diana usando una variedad de metodologías convencionales, tales como electroporación, microinyección, coprecipitación de calcio o estroncio, suministro mediado por lípidos, liposomas catiónicos y otros procedimientos conocidos por los expertos en la materia.

La presente invención también proporciona métodos para terapia génica in vivo. Un vector de expresión que porta un producto génico heterólogo se inyecta en un receptor. En particular, el método comprende introducir un vector de expresión dirigido, es decir, un vector que tiene un promotor específico de células o tejidos.

Las realizaciones también se refieren a kits, tal como kits terapéuticos. Por ejemplo, un kit puede comprender una o más composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento y, opcionalmente, instrucciones para su uso. Los kits también pueden comprender uno o más dispositivos para lograr la administración de dichas composiciones. Por ejemplo, un kit objeto puede comprender una composición farmacéutica y un dispositivo para lograr la administración nasal de una composición a un sujeto en riesgo de desarrollar, tener o comenzar a tener una jaqueca. En otras realizaciones, un kit objeto puede comprender ampollas precargadas de un péptido u otra composición farmacéutica, opcionalmente formulada como una composición liofilizada, para su uso con un dispositivo de administración.

Los kits pueden comprender un envase con una etiqueta. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales y tubos de ensayo. Los envases pueden formarse a partir de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase puede contener una composición que incluye un péptido o polipéptido que es eficaz para aplicaciones terapéuticas o no terapéuticas, tal como se ha descrito anteriormente. La etiqueta en el envase puede indicar que la composición se usa para una terapia específica o para una aplicación no terapéutica, y también puede indicar instrucciones para su uso in vivo o in vitro, tal como los descritos en el presente documento. El kit de la invención comprenderá generalmente el envase descrito anteriormente y uno o más envases que comprenden materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, inhaladores, cartuchos, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de paquetes con instrucciones de uso.

Ejemplos

Ejemplo 1 (ilustrativo)

IFN-y tiene efectos cerebrales perjudiciales y beneficiosos, consistentes con la hormesis de condicionamiento fisiológico. IFN-y exacerba la desmielinización de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE), un modelo de esclerosis múltiple. No obstante, un IFN-y a bajo nivel antes del inicio de la enfermedad protege contra la desmielinización, un efecto que implica una respuesta al estrés oxidativo (OSR, por sus siglas del inglés oxidative stress response) de oligodendrocitos. Además, la depresión propagada (SD) desencadena una caída transitoria (1 y 3 pero no 7 días) de la proteína básica de mielina (MBP) en cultivos de cortes de hipocampo de rata (HSC); y la desmielinización aumenta la susceptibilidad a SD in vivo.

Debido a que los linfocitos T están presentes en los cultivos de cortes del hipocampo (HSC) y la SD aumenta su producción de IFN-y, los presentes inventores examinaron cómo los linfocitos T y el IFN-y afectan la susceptibilidad a SD. Los resultados se basaron en n > 3-6/grupo y las comparaciones hicieron frente a simulados.

Las matrices de PCR muestran un aumento de 3,61 veces en osteopontina y una disminución de 2,22 veces en IL-10, lo que indica un efecto potenciado de Th1 por SD. La exposición a la citocina IFN-y de Th1(500 U/ml) desencadena una susceptibilidad significativamente mayor a la SD a 1 día pero, es importante destacar que, da como resultado una susceptibilidad significativamente reducida a los 3 días. La eliminación de IFN-y por el agotamiento de los linfocitos T por anti-CD4 evitó la susceptibilidad alterada a SD y evitó la desmielinización inducida por SD, que de otro modo desencadenó la ruptura de las vainas de mielina, mostrado a través de microscopía electrónica (ME). La SD neocortical in vivo desencadenó una reducción similar en MBP un día después.

El tratamiento de tres días con IFN-y (500 U/ml) redujo significativamente las especies reactivas de oxígeno generadas por la potenciación química a largo plazo (cLTP), un medio fisiológi

que se observa horas después de la SD. Este efecto beneficioso de IFN-y a bajo nivel está respaldado por los resultados de las ratas. En ratas, el enriquecimiento, que se produce con el aprendizaje del hipocampo, condujo a una elevación significativa en los linfocitos T del hipocampo, IFN-y y MBP.

Los resultados muestran que la SD activa de forma aguda los linfocitos T y supera la OSR cerebral, dando como resultado una mayor susceptibilidad a la SD y la desmielinización. Estos efectos pueden prevenirse mediante el tratamiento con iFN-y, que modula los parámetros inmunitarios que favorecen una respuesta sesgada de Th1 extendida con el tiempo. Estos resultados respaldan el uso de IFN-y como terapia para la jaqueca.

Ejemplo 2 (ilustrativo)

Es probable que las citocinas participen en la depresión propagada (SD), un modelo bien aceptado de la patogénesis de la jaqueca. La SD recurrente reduce significativamente el umbral de SD posterior a través de la señalización de TNF-a. Además, el preacondicionamiento en frío es neuroprotector a través de la producción de TNF-a a bajo nivel a partir de microglía. Es importante destacar que, la producción de IL-11 a partir de neuronas amortigua este efecto protector. Los presentes inventores se centraron en las posibles interrelaciones del estrés oxidativo (OS) y la IL-11, dado que SD genera OS e IL-11 tiene propiedades antioxidantes.

Los experimentos se realizaron en cultivos de cortes de hipocampo de ratas y se indujo SD como se describe previamente (Pusic et al., 2011). Los resultados derivaron de n > 3-6/grupo. El pretratamiento con minociclina redujo significativamente la susceptibilidad a SD, lo que respalda aún más el papel de la microglía en la SD. Es importante destacar que, el tratamiento tanto agudo como crónico (tres días) con IL-11 (100 ng/ml) redujo significativamente la susceptibilidad a SD. Es importante destacar que, cLTP, un modelo celular de aprendizaje, redujo significativamente la susceptibilidad a SD. El tratamiento de los cultivos de cortes con IL-11 durante 3 días redujo significativamente el OS generado por la activación fisiológica de los cultivos a través de cLTP en comparación con las simulaciones. Esto es consistente con el aumento de la actividad neuronal visto después de SD, que imita la hiperexcitabilidad evidente en pacientes con jaqueca. IL-11 redujo la susceptibilidad a SD a través de mecanismos que incluyen señalización de OSR. Asimismo, los experimentos con animales completos que implican enriquecimiento ambiental (es decir, aumento de la actividad física, intelectual y social volitiva), que se produce con una mayor actividad cerebral, dieron como resultado un aumento en el ARNm y la proteína IL-11, lo que respalda la idea de que un mayor ejercicio puede ayudar a prevenir la jaqueca al alterar la OSR neuronal a través de IL-11. Estos resultados respaldan el uso de IL-11 como terapia para la jaqueca.

Ejemplo 3

El enriquecimiento ambiental no solo protege el hipocampo, sino que también reduce la susceptibilidad a las convulsiones, ambos efectos que se producen con el aumento del aprendizaje. Se sabe que dicho aprendizaje se produce con el aumento del estallido de neuronas piramidales del área CA3. Los presentes inventores encontraron que el estallido de neuronas piramidales del área CA3 en cultivos de cortes de hipocampo (HSC) redujo la susceptibilidad a la depresión propagada (SD), la causa más probable de aura de jaqueca y quizás jaqueca (Lauritzen y Kraig, 2005; Benedict et al., 2004).

Esto llevó a los presentes inventores a examinar si la insulina pudiera reducir la susceptibilidad a SD al aumentar el estallido de neuronas piramidales de CA3. Los presentes inventores indujeron SD de forma trans-sináptica en HSC de rata usando estímulos eléctricos (pulsos de 100 ps @ 10 Hz durante 1 s) que van de 1 a 10.000 nC para determinar el umbral de SD en grupos simulados y experimentales (Pusic et al., 2011). Los resultados se basaron en n > 3-6/grupo. La exposición a la insulina (400 pg/ml) durante tres días desencadenó una reducción significativa en la susceptibilidad a SD. Esta dosis de insulina se aproxima a los niveles farmacológicos observados en seres humanos tratados con insulina nasal. Sin embargo, los presentes inventores descubrieron que IGF-1 era mucho más eficaz, produciendo resultados cuando se administraba a 40 ng/ml. Los presentes inventores plantearon la hipótesis de que el efecto de la insulina se produjo a través de la diafonía del receptor de IGF-1. IGF-1 redujo significativamente la susceptibilidad a SD tanto en el tratamiento agudo como después de tres días de tratamiento. Este efecto de IGF-1 no implicó un cambio en los niveles del ARNm de TNF-a dos horas después de la SD evocada cada 7-9 minutos durante una hora. Por el contrario, el tratamiento de tres días con IGF-1 conduce a una reducción significativa en el OS de la cLTP, un medio fisiológi

de la SD. Estos resultados respaldan el uso de IGF-1 y/o insulina como una terapia para la jaqueca.

Ejemplo 4

SD es la causa más probable del aura y dolor de la jaqueca (Lauritzen y Kraig, 2005). La SD neocortical y del hipocampo desencadena un aumento significativo en la activación nociceptiva del núcleo caudal del trigémino (TGN, por sus siglas en inglés). Para los fines de este ejemplo, los inventores se centraron en la SD del hipocampo, ya que se sabe que se produce en el cerebro humano no lesionado y es el área cerebral más susceptible a SD.

El paradigma para provocar SD neocortical o de hipocampo consiste en desencadenar SD mediante KCl local o estímulos eléctricos en la neocorteza rostral o hipocampo respectivamente. La aparición de SD se confirma con un electrodo de registro de potencial de CC colocado en la neocorteza caudal o hipocampo respectivamente.

La inmunotinción para c-fos sirve como un marcador funcional para la activación nociceptiva en el TGN. Las células c-fos positivas en el TGN se pueden detectar después de 2 horas de SD desencadenada cada 9 min.

Los experimentos se realizaron en HSC ya que esta preparación in vitro es muy similar a su homóloga in vivo. Los cultivos se cultivaron inicialmente en un medio basado en suero de caballo (Kunkler y Kraig, 1997) y después de 18 días in vitro (DIV), algunos cultivos se transfirieron a un medio sin suero basado en Neurobasal y Gem-21 (Mitchell et al., 2010, Mitchell et al., 2011). La SD se indujo por estimulación eléctrica bipolar en el giro dentado y la SD se confirmó al registrar su cambio de CC en el área CA3. Sd mostró los cambios típicos de CC. La actividad basal aumentó con una ráfaga de actividad después de la estimulación para desencadenar SD seguida de una pérdida en la actividad espontánea o evocada antes de la recuperación de la SD.

SD se produce con una mayor producción de citocinas, que algunos consideran una consecuencia y no una causa de la enfermedad. Sin embargo, el TNF-a microglial aumenta los receptores AMPA y disminuye los receptores GABA, lo que altera la excitabilidad. Los mecanismos responsables de esto no se entienden. Debido a que los linfocitos T vasculares se activan en las jaquecas (Empl et al., 1999) y los linfocitos T activados ingresan al cerebro (Engelhardt y Ransohoff, 2005), los presentes inventores exploraron si los linfocitos T pueden inducir un cambio aguas arriba que influye en la susceptibilidad a SD mediante señalización entre neuronas y glía. Debido a que los linfocitos T pueden vivir hasta un año (Empl et al., 1999) pero tal vez menos en el cerebro, los presentes inventores investigaron su presencia en HSC (18-35 DIV), donde se pueden controlar las condiciones ambientales y seguir células individuales en el espacio y tiempo.

Después de una hora de SD, se permitió que los cortes se recuperaran durante 2 horas y después se recogieron para el aislamiento total de ARN y la amplificación por PCR de las dianas de citocinas. Las estrategias de extracción produjeron ARN intacto de alta calidad según se determinó mediante un gel que mostró bandas nítidas de ARN. A continuación, se verificaron las amplificaciones de las curvas de dilución de los cebadores para asegurarse de que los cebadores produjeran diferencias de amplificación uniformes. Por ejemplo, las amplificaciones óptimas muestran un aumento uniforme en los umbrales de Ct (umbrales de ciclo). Por el contrario, las amplificaciones no son uniformes con cebadores defectuosos.

Los presentes inventores primero investigaron el aumento de la expresión de ARNm de TNF-a y encontraron que SD indujo un aumento significativo (P <0,001) de 2-20 veces en el ARNm de TNF-a (n = 6/grupo). Estas muestras positivas se usaron para la evaluación de la matriz de PCR. A continuación, la tecnología de matriz de PCR se utilizó como un medio más sensible que los chips genéticos tradicionales para buscar evidencia de linfocitos T en cultivos de cortes de hipocampo de adulto. La evaluación de la expresión génica para los cambios inflamatorios de citocinas se completó mediante matrices de PCR RT2 Profiler™.

Varias dianas de citocinas sugieren que los linfocitos T pueden estar presentes en cortes maduros. Los presentes inventores buscaron la presencia de linfocitos T utilizando el marcado c D6. Los presentes inventores encontraron que ~ 56 linfocitos T fueron positivos para CD6 en cultivos de cortes individuales. Los linfocitos T marcados con CD6 se pueden visualizar mediante microscopía confocal, los diámetros de las células son de aproximadamente 5-6 pm.

Se cree que IFN-y es expresado predominantemente, si no únicamente, por linfocitos T en el cerebro. Así pues, el hecho de que el ARNm de IFN-y no pudiera detectarse después de SD parecía extraño, especialmente porque los presentes inventores detectaron previamente un cambio modesto pero significativo en la proteína IFN-y (mediante ensayos ELISA basados en perlas) después de SD (Kunkler et al., 2004).

Debido a que solo se encuentran ~ 50 linfocitos T en un cultivo de cortes (de un total de -100.000 células), los presentes inventores usaron el kit de síntesis de ADNc SAB RT2 nano PreAMP como un medio para detectar la posible expresión de IFN-y de nivel ultra bajo. Este medio de preamplificación de ADNc proporcionó un aumento de 12 veces en la sensibilidad a los niveles de ARN. Los resultados ilustran la capacidad de preamplificación para aumentar la sensibilidad de detección. El umbral de Ct para el constitutivo, Rpl13a, fue de 20,5 con la amplificación inicial y este se incrementó a 14,1 con el uso del kit de preamplificación, un aumento de 12 veces correspondiente a 12 ciclos de amplificación por PCR de ADNc. En paralelo, el iFN-y en cultivos de control no era detectable pero estaba dentro del intervalo de detección con preamplificación.

A continuación, los presentes inventores buscaron evidencia de la producción de IFN-y después de la exposición de los cortes a lipopolisacárido (LPS) y lo encontraron en células de 5-6 pm de acuerdo con una morfología de los linfocitos T. Asimismo, los presentes inventores descubrieron que el ARNm de IFN-y aumentó 4,66 veces con 2 horas de SD provocada cada 9 minutos durante una hora.

Goddard y sus colaboradores (Goddard et al., 2007) muestran que la expresión de MHC, necesaria para la activación de linfocitos T, cambia con la actividad neuronal en las neuronas. Asimismo, los astrocitos activados y especialmente la microglía también presentan MHC. Así pues, La SD (o jaqueca) puede activar los linfocitos T y sus interacciones con el MHC de las células neuronales pueden iniciar cambios de excitabilidad directamente o mediante señalización inmunitaria hormética (Kraig et al., 2010). Si es así, los linfocitos T y su comportamiento de activación, pueden ser dianas ideales para el desarrollo de nuevas terapias para mitigar la jaqueca episódica y prevenir la jaqueca crónica.

Ejemplo 5

La jaqueca crónica (CM por sus siglas del inglés chronic migraine) es una carga de salud prevalente cuya patogénesis permanece incompleta. La evidencia sugiere que está implicada la sensibilización central que implica una mayor expresión de mediadores proinflamatorios y alteraciones en la sustancia gris periacueductal (Aurora, 2009). Sin embargo, el aumento de la frecuencia de la jaqueca también se correlaciona con la transformación de la jaqueca episódica (EM, por sus siglas de inglés episodic migraine) en CM (Silberstein y Olesen, 2005)).

La sensibilización central y las alteraciones de la sustancia gris periacueductal pueden ser fenómenos de señalización "aguas abajo" de CM, mientras que la depresión propagada recurrente (SD) es el cambio de señalización neuronal "aguas arriba". Esta conclusión se basa en varios hechos. En primer lugar, SD puede desencadenar tanto aura de jaqueca como dolor, ya que es suficiente para la activación nociceptiva de los núcleos trigémino y la sustancia gris periacueductal. En segundo lugar, SD puede inhibir la activación neuronal en el tronco encefálico y facilitar la activación trigeminovascular, lo que sugiere aún más su participación en la CM. En tercer lugar, SD inicia cambios proinflamatorios dentro del cerebro implicado. Los astrocitos y la microglía muestran cambios reactivos durante semanas después de la SD recurrente. Es importante destacar que, SD también desencadena una mayor producción de eicosanoides y citocinas innatas, incluyendo TNF-a, Interleucina-1 beta (IL-1p) y potencialmente IFN-y que implica principalmente microglía. Estas moléculas de señalización están implicadas en la sensibilización central somatosensorial y, por lo tanto, pueden tener un impacto funcional similar sobre la SD.

La evidencia creciente indica que TNF-a tiene una implicación particular en la función de señalización dependiente de la actividad dentro del cerebro. Malenka y sus colaboradores muestran que los niveles fisiológicos de TNF-a aumentan la expresión en la membrana del receptor AMPA y reducen la expresión del receptor GABA en ella. El trabajo de los presentes inventores y el de otros indican que una mayor actividad cerebral asociada con el enriquecimiento ambiental (es decir, mayores oportunidades sociales, físicas e intelectuales) se produce con una mayor expresión de TNF-a. Asimismo, los efectos neuroprotectores del enriquecimiento ambiental que requieren TNF-a pueden ser amplificados por eicosanoides e implican la activación de la microglía, que genera el TNF-a. A diferencia de los efectos agudos de TNF-a a dosis altas de enfermedades que son tóxicas, estos cambios fisiológicos de TNF-a a dosis bajas dependientes de la actividad mejoran la función cerebral y requieren tiempo para desarrollarse.

Los presentes inventores contemplan que el mayor cambio de TNF-a a partir de SD (en comparación con el visto desde el aprendizaje), aunque no es tóxico, es lo suficientemente alto como para ser inadaptado y con el tiempo desencadena la excitabilidad aumentada observada después de SD y jaqueca recurrentes. Esto último se produce a través de alteraciones en la expresión y función de la membrana de los receptores AMPA y GABA. Por consiguiente, los presentes inventores examinan el grado en que la expresión de microglía y TNF-a alteran la excitabilidad cerebral a partir de la SD recurrente.

Los cultivos en cortes se prepararon y mantuvieron como se describe previamente (Mitchell et al., 2010a,). Después de 18 días in vitro (DIV), los cultivos de cortes se transfirieron a medios sin suero que incluían calcio y magnesio adicionales. Los cultivos se evaluaron a los 21 DIV para asegurar que no hubiera muerte neuronal piramidal. Se realizaron registros electrofisiológicos convencionales colocando un inserto de cultivo de cortes en una cámara de registro PDMI con temperatura y pH controlados (FIG. 1). La cámara de registro se aireó con aire en equilibrio de CO2 al 5 % a 36 °C y el medio que fluía a 1,2 ml/min o se mantuvo estático alrededor del inserto de cultivo de cortes. Se colocó un electrodo de registro en la capa de células piramidales de CA3 y se colocó un electrodo estimulante en la superficie del giro dentado. Los registros se iniciaron antes de colocar el electrodo de estimulación en el cultivo para garantizar que no se desencadenara una depresión propagada como resultado.

Los estudios comenzaron con la determinación de la corriente necesaria para maximizar las posibles respuestas de campo de la región CA3 convencionales. Esto documentó la normalidad de las respuestas sinápticas evocadas entre preparaciones. Si los EPSP de campo de un corte no eran de al menos 3-4 mV, este se descartaba.

A continuación, se determinó la SD evocada trans-sinápticamente. Por tanto, los presentes inventores estimularon cortes a través del giro dentado con pulsos de 100 ps suministrados a 10 Hz durante 1 segundo cada 1-2 minutos a intensidades de corriente pA crecientes hasta que se produjo SD. Esto demostró ser el medio más sensible para establecer el umbral para Sd impulsada sinápticamente.

Se realizó un esfuerzo considerable para establecer un medio de cultivo de cortes que proporcione cultivos sanos a 35 días in vitro, produzca SD fácilmente y permita la detección de la señalización inmunitaria de bajo nivel. Los cultivos en cortes mantenidos en medios basados en suero de caballo son casi siempre resistentes a la inducción de SD. Los presentes inventores descubrieron que esto también es cierto para un medio que contenía suero de caballo al 20 %, Neurobasal A, B-27, insulina y ascorbato. Sin embargo, rara vez se observó una respuesta de potencial de campo de área CA3 fuerte y la capacidad de desencadenar SD. En cambio, los pulsos desencadenantes para SD generalmente evocaron estallido.

Los presentes inventores probaron la susceptibilidad a SD en cultivos cultivados en medios sin suero (basados en Neurobasal y bien B-27 o Gem-21 (Chen et al., 2008) que también incluyeron ascorbato. Los potenciales de campo evocados fueron análogos a los de los medios basados en suero de caballo. Se pudo estimular SD fácilmente en los medios sin suero. Asimismo, la SD redujo significativamente el umbral para la SD posterior desencadenada tres días después.

Los presentes inventores determinaron que TNF-a estaba implicado en la susceptibilidad a SD (FIG. 2D). Por ejemplo, la exposición al TNF-a (100 ng/ml) durante 3 días redujo significativamente el umbral para la SD en comparación con el necesario en otros cultivos en la primera exposición a estímulos de SD (FIG. 2D). Asimismo, la susceptibilidad aumentada a SD desencadenada por la SD anterior podría anularse mediante la eliminación de la señalización de TNF-a mediante tratamiento con TNFR1 soluble (200 ng/ml) después del primer día de SD (FIG. 2E).

Las microglías son la fuente predominante, si no la única, de TNF-a en el cerebro no lesionado. Así pues, tomados en conjunto, los resultados de los presentes inventores demuestran que la SD, y por lo tanto la jaqueca, implica microglía y su producción a bajo nivel de la citocina proinflamatoria TNF-a.

La SD y TNF-a están implicados en la mejora de la función cerebral a través de neuroprotección de preacondicionamiento. Así pues, la implicación de TNF-a en el aumento de la susceptibilidad a SD puede parecer contradictoria. Sin embargo, los principios básicos de la señalización hormética explican esta aparente contradicción de la señalización microglía-TNF-a en el cerebro.

Un patrón de respuesta a la dosis hormética (o en forma de U) consiste en una estimulación a bajo nivel y una inhibición a alto nivel que implica dos principios básicos. En primer lugar, un estímulo irritante (o de estrés) debe ser de suficiente magnitud. En segundo lugar, debe transcurrir el tiempo suficiente para que se produzcan cambios adaptativos que den como resultado un efecto nutritivo (FIG. 1).

La FIG. 1 describe el patrón sugerido por los presentes inventores de aumento de la vitalidad cerebral frente a la actividad neuronal (A y B). Estímulos irritantes [(FIG. 2B); por ejemplo, TNF-a, IL-11, IGF-1, insulina o IFN-y)] (1). Los procesos adaptativos son (2). Con estímulos de activación recurrentes (3) y tiempo suficiente (4), el cerebro aumenta su resistencia a la enfermedad.

Pueden producirse cambios desadaptativos dentro del cerebro cuando se producen estímulos irritantes sin tiempo suficiente para permitir cambios nutritivos adaptativos (5) o se vuelven constantes (6). Los presentes inventores contemplan que dicha señalización neuroinmunitaria de microglía y TNF-a puede estar implicada en la transformación de la jaqueca episódica en jaqueca crónica. Descifrar la señalización de citocinas innatas dependiente de SD dentro del cerebro identificará dianas terapéuticas para prevenir la jaqueca episódica y crónica.

Ejemplo 6

La actividad neuronal necesariamente aumenta los niveles de TNF-a cerebral (a partir de microglía) e IFN-y (a partir de linfocitos T), así como el estrés oxidativo (OS) (a partir del metabolismo oxidativo). A su vez, estas pequeñas moléculas y el OS pueden aumentar la actividad neuronal. Si la actividad neuronal se vuelve excesiva (es decir, como se produce después de la SD recurrente), aumentará la susceptibilidad a SD. Por consiguiente, los presentes inventores definen los papeles interrelacionados de TNF-a, IFN-y y el OS en la promoción de la susceptibilidad a SD. Los presentes inventores usan un modelo de SD en cultivos de cortes de hipocampo de rata y ratas in vivo. La susceptibilidad a SD se compara con las mediciones del OS neto, antioxidantes específicos y cambios críticos en el sistema de señalización del OS. Los cambios en la expresión génica relacionados con el OS se evalúan utilizando matrices de PCR y los cambios proteómicos se evalúan usando ELISA multiplexados e inmunotinción. La especificidad celular de los cambios relevantes de ARNm y proteína se determina utilizando microscopía de disección láser e inmunotinción de doble marcador, respectivamente. Los presentes inventores examinan el impacto de inhibir los puntos críticos de señalización del OS sobre la susceptibilidad a SD.

Los presentes inventores han establecido un modelo in vitro altamente confiable que muestra que la susceptibilidad a SD incrementada inducida por SD depende del TNF-a de la microglía activada. (FIG. 2).

Utilizando la tecnología de matriz de PCR, los presentes inventores descubrieron que los cultivos en cortes contienen linfocitos T Th1 (Pusic y Kraig, 2010). Debido a que los linfocitos T vasculares se activan en las jaquecas (Empl et al., 1999) y los linfocitos T activados ingresan al cerebro (Engelhardt y Ransohoff, 2005), los presentes inventores comenzaron a explorar si los linfocitos T inducen un cambio aguas arriba que influye en la susceptibilidad a SD. Los resultados muestran que los linfocitos T se activan después de la SD en cultivos de cortes y aumentan su producción de IFN-y, lo que aumenta de manera aguda la susceptibilidad a SD (FIG. 3). Así pues, los cultivos de cortes son adecuados para el estudio de la señalización de los linfocitos T de SD.

Se cree que el IFN-y de los linfocitos T desempeña un papel crucial en la enfermedad desmielinizante inmunomediada (Popko et al., 1997; Imitola et al., 2005; Lees y Cross, 2007). SD desencadena una disrupción aguda, pero transitoria, de mielina que se asocia con una reducción significativa en la proteína básica de mielina (MBP) después de 1 y 3 días (Kunkler et al., 2006). Usando inmunotinción, los presentes inventores han confirmado que esta caída en MBP también se observa in vivo 1-2 días después de SD. Asimismo, los oligodendrocitos son muy sensibles al OS (Lin et al., 2008; Juurlink et al., 1998) y SD aumenta el OS, un hallazgo que los presentes inventores han confirmado que se produce en cultivos de cortes (FIG. 4). Finalmente, la eliminación de linfocitos T por exposición a anti-CD4 (0,1 mg/ml) a los 7 días durante 24 horas evitó por completo la mayor susceptibilidad a SD inducida por SD frente al control> 21 días más tarde en cultivos de cortes (p = 0,964; n=6/ cada grupo).

Los cultivos de cortes se preparan, mantienen e inducen a disparar SD como se describe previamente usando excitación trans-sináptica de CA3, donde se inicia SD (FIG. 4) (Kunkler et al., 2005; Pusic et al., 2011). Aunque otros evalúan los cambios en el impulso sináptico excitador e inhibitorio a través de análisis potenciales de campo evocados, los presentes inventores están de acuerdo con el laboratorio Dudek en que este enfoque es menos confiable (Waldbaum y Dudek, 2009; Shao y Dudek, 2009). En cambio, es preferible medir la excitabilidad relativa del circuito neuronal (como la usan los presentes inventores para la susceptibilidad a SD).

Los presentes inventores comparan la susceptibilidad a SD a la citocina innata, el OS, los nodos críticos de señalización del OS y los niveles de antioxidantes. La determinación de esta aparentemente amplia gama de parámetros en este caso se realiza cómodamente utilizando ensayos multiplexados. Los presentes inventores utilizan matrices de PCR multiplexadas (de SABiosciences) y ensayos de citometría de flujo multiplexado [(MFCA por sus siglas en inglés) para proteínas; de Bio-Rad y Millipore]. La microscopía de disección láser y la inmunotinción de doble marcador se utilizan para mediciones específicas de ARN y proteínas mejoradas por el tipo celular, respectivamente.

La evaluación de citocinas, IGF-1 y antioxidantes se realiza primero utilizando matrices de PCR que contienen pocillos para: (1) citocinas (TNF-a, IFN-y ), sus receptores afines; (2) IGF-1 y una proteína de unión a IGF-1 principal implicada en la señalización cerebral, IGFBP-3 (Jogie-Brahim et al., 2009; Carro et al., 2000); y (3) antioxidantes [MnSOD (superóxido dismutasa de manganeso), CuSOD (superóxido dismutasa de cobre), catalasa, GSH (glutatión), peroxirredoxina, tiorredoxina, NQO-1 (NAD(P)H deshidrogenasa quinona 1) y HO-1 ( hemo oxigenasa 1)]. Los cambios significativos de ARNm (es decir, > 2 veces) se verifican mediante MFCA e inmunotinción para la producción de proteínas correspondiente. Además, los MFCA se utilizan para evaluar los cambios en las fosfoproteínas quinasas (GSK3p y eIF2a) y los factores de transcripción (ATF-4 y Nrf2) críticos para la señalización del OS.

Los presentes inventores utilizan procedimientos de inmunotinción de doble marcador y cuantificación de imágenes digitales que son convencionales en el laboratorio de los presentes inventores para confirmar el origen celular de los cambios en la molécula de señalización de citocinas-OS (Mitchell et al., 2010; Mitchell et al., 2011). Los procedimientos de microscopía de disección láser siguen los establecidos en el laboratorio de los presentes inventores (Hulse et al., 2008). Las muestras de ARNm de disección láser se preparan como se describe previamente (Hulse et al., 2008). Sin embargo, los presentes inventores en este caso utilizan un sistema de nanopreamplificación de SABiosciences que permite la detección de ARN de baja expresión (por ejemplo, de ~ 50 células en 100.000) (Pusic et al., 2011). Esta sensibilidad permitirá la detección de mediciones de ARNm antioxidante de citocinas de tipos específicos de células cerebrales, como lo han hecho los inventores para los linfocitos T en cultivos de cortes (Pusic et al., 2011; Pusic y Kraig, 2010).

Inhibición de la señalización del OS. Las dosis óptimas de inhibidores se determinan por un paradigma utilizado con éxito por los inventores (Pusic et al., 2011) y otros (Romera et al., 2004). En primer lugar, las dosis iniciales derivarán de estudios in vitro publicados o de las recomendaciones del fabricante. Los presentes inventores aplican dosis 10x por debajo y por encima de estos valores para evaluar la toxicidad en cultivos de cortes. Es necesario al menos 1 día para permitir los cambios adaptativos que requieren la síntesis de proteínas inducida por la tolerancia a la isquemia o el ambiente enriquecido (EE) (Pusic et al., 2011; Kraig et al., 2010). Estos efectos persisten durante varios días o semanas. Así pues, el uso de un paradigma adaptativo de 3 días permite la eficacia del experimento y es de duración suficiente para evitar cualquier efecto tóxico de la modulación de la señalización en cascada de las alteraciones crónicas. Esto es consistente con la idea de que la aplicación fásica de señalización tipo EE (por ejemplo, de IL-11, IFN-y, IGF-1, insulina) es probable que sea óptima. En este caso se usan tres días como un solo ciclo del paradigma fásico. Para los controles negativos, los inhibidores inactivados por calor se aplican a dosis determinadas previamente (Hulse et al., 2008). Los presentes inventores también modelaron condiciones tipo EE más prolongadas utilizando tratamientos de IGF-1 de siete días en los que se administró IGF-1 durante solo 12 horas al día, así como el tratamiento con IFN-y durante solo 12 horas una vez por semana. Los controles simulados consisten en la exposición al vehículo solo. Los controles simulados consisten en la exposición al vehículo solo.

Los presentes inventores inhibirán la señalización crítica del OS del nódulo usando estrategias farmacológicas y de ARNip establecidas. Para inhibir la desfosforilación de eIF2a, los presentes inventores aplicarán sal003 (10 pM, cultivo de cortes de hipocampo) (Costa-Mattioli et al., 2007). El bloqueo farmacológico de Nrf2 se logra mediante la aplicación de brusatol (40 nM, línea celular cultivada) (Ren et al., 2011). La inhibición de GSK3p se puede lograr mediante el uso bien de cloruro de litio (LiCl, 2 mM, neuronas del hipocampo cultivadas) (Mendes et al., 2009) o tiadiazolidinona-8 (TDZD-8, 1 pM, células endoteliales microvasculares cerebrales primarias) (Ramirez et al., 2010). Los reactivos de ARNip Accell que se dirigen a estos genes en ratones y ratas están disponibles comercialmente en Thermo Scientific y se usan de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Pusic et al., 2011). El ARNip No dirigido Accell Rojo se usa para demostrar la transfección celular.

Los presentes inventores analizarán los datos utilizando el software SigmaStat (v. 3.5). Todos los datos serán probados para normalidad (valor P para rechazar: 0,05) e igual varianza (valor P para rechazar: 0,05). Los datos de control se normalizarán a 1,00 por experimento con los resultados del grupo relacionado escalados proporcionalmente para facilitar las comparaciones entre experimentos. Todos los grupos experimentales incluirán controles simulados. Los resultados se expresan como la media ± ETM. El análisis de potencia se utiliza para determinar la adecuación del tamaño de la muestra. Se usan dos repeticiones técnicas para los ensayos de ARNm y proteínas y se usan 5 o más repeticiones biológicas para todos los experimentos de cultivo de cortes. La prueba de comportamiento se completa con n = 15/grupo. Se usa ANOVA con la prueba post hoc Holm Sidak (o, cuando corresponda, la prueba t de Student) evaluar la significación (es decir, p <0,05).

El paradigma de estimulación es desencadenar 1, 3 o 6 SD y medir el umbral de las respuestas de SD 1, 3, 7 y 14 días después, como se muestra en la FIG. 2. Los controles simulados consisten en disparar potenciales de campo medio máximos a través de pulsos simples de 100 ps en lugar de SD y después evaluar el umbral de SD 1, 3, 7 y 14 días después (FIG. 2).

En determinados estudios, el patrón de estimulación es el mismo que se describe anteriormente con mediciones de cambios de OS específicos de (a) tejido y (b) del tipo de célula 1, 3, 7 y 14 días después de la SD. Se pueden usar los mismos cultivos para ambos conjuntos. Las mediciones específicas de células se realizan usando secciones de 20 pm, microscopía confocal y tinción de doble marcados (FIG. 4, 13). Debido a que los oligodendrocitos son muy sensibles al OS, y el trabajo de los presentes inventores muestra que la MBP cae poco después de la SD recurrente, los presentes inventores también medirán la MBP como un posible marcador funcional del OS. En estudios adicionales, el patrón de estimulación es evocar 6 SD durante una hora con (a) mediciones de ARNm multiplexadas de citocinas, receptores y antioxidantes utilizando matrices de PCR. De nuevo, los cambios significativos en el ARNm de tejido se confirman mediante (b) microscopía de disección láser para cambios específicos de ARNm potenciado por células y (c) ELISA multiplexados para confirmar la expresión de proteínas. La inmunotinción de doble marcador se usa para la identificación del tipo de célula. (d) Los cambios en el estado de fosforilación de las quinasas relacionadas con la señalización del OS tisular y los factores de transcripción se miden mediante ELISA multiplexados. (e) El origen celular de los cambios significativos se verifica con inmunotinción de doble marcador. Las mediciones de las especies de ARNm se realizan 2 horas después de la SD y las proteínas 1, 3, 7 y 14 días después de la SD. Se incluyen simulaciones y controles (descritos anteriormente).

En otros estudios adicionales, el paradigma experimental es evocar 6 SD durante una hora y recoger tejido 3 días después. Los presentes inventores inhibirán los puntos clave del sistema de señalización SD-OS y medirán los cambios resultantes en (a) susceptibilidad a SD, (b) niveles de OS y (c) niveles de proteína antioxidante. La inhibición se logra a nivel de citocinas (TNF-a e IFN-y) usando sTNFR1 y anti-CD4. La inhibición de las quinasas clave (Nrf2, eIF2a y GSK3p) se realiza como se describe anteriormente. Los inhibidores se aplicarán el día anterior y se mantendrán durante la SD, hasta la recogida. La inhibición excesivamente larga de las vías del OS puede ser perjudicial, al igual que el OS excesivo. Las exposiciones de tres días [es decir, a TNF-a, sTNFR1, anti-IFN-Y, anti-CD4, IL-11, IFN-y, iGF-1, como muestran los presentes inventores (FIG. 8)] son lo suficientemente largas como para que se produzcan los cambios adaptativos (p. ej., que implican síntesis de proteínas) sin desencadenar una lesión celular irreversible y son lo suficientemente cortos como para ser consistentes con la señalización fásica de EE.

En determinados estudios, el mismo paradigma descrito anteriormente (1, 3 y 6 SD) se realiza in vivo (hipocampo y neocorteza) para establecer el siguiente paso traduccional en la aplicación de la señalización de citocina-OS para terapias de la jaqueca. Después de las mediciones de susceptibilidad a SD 1, 3, 7 y 14 días después, se recogen los cerebros para medir el OS utilizando un kit de análisis de carbonilo para proteínas oxidadas (Shin et al., 2008). El paradigma que produce el mayor cambio en la susceptibilidad se repite, y el tejido se cosecha un día después para la cuantificación de MBP.

Los presentes inventores esperan que el cambio agudo de susceptibilidad para SD y OS asociado a partir de la SD muestre una respuesta lineal o umbral (y no hormética). Esta conclusión se basa en datos preliminares y la suposición de que no habría transcurrido el tiempo adecuado para la producción adaptativa de proteínas antioxidantes aumentadas necesarias para amortiguar la hiperexcitabilidad de la SD. Los presentes inventores también esperan que los tipos específicos de células cerebrales muestren cambios diferenciales en el nivel de OS, por lo que requieren mediciones (preferiblemente multiplexadas) a nivel de tipos específicos de células cerebrales. Las respuestas celulares son variadas y dependientes de la dosis, con menos células que responden a una dosis más baja (Tay et al., 2010). Incluso dentro de un cultivo homogéneo, las células no responden uniformemente a la activación de TNF-a. Por consiguiente, se puede esperar que el cerebro con cuatro tipos de células principales diferentes (más las células endoteliales vasculares) muestre respuestas heterogéneas similares a las citocinas (y al OS), que probablemente sean interactivas. El pretratamiento con IFN-y protege la microglía del OS a través de la regulación positiva de MnSOD (Chen et al., 2009) y los astrocitos previenen la muerte neuronal por OS (Rohl et al., 2008). Adicionalmente, la microglía activada influye en la expresión de antioxidantes en los astrocitos (Correa et al., 2011). Finalmente, un estudio reciente muestra que la SD se correlaciona inversamente con el contenido de mielina cortical (Merkler et al., 2009), lo que indica la importancia de los oligodendrocitos en la susceptibilidad a SD. Los datos de los presentes inventores extienden directamente este hallazgo de un modelo de enfermedad desmielinizante para mostrar que la SD recurrente puede ser desmielinizante en sí misma.

La señalización del OS también es probable que muestre cambios celulares diferenciales. La actividad sináptica aumenta la actividad antioxidante intrínseca en las neuronas (Papadia et al., 2008) y eIF2a desempeña un papel crítico en la actividad sináptica neuronal asociada con la memoria y el aprendizaje (Costa-Mattioli et al., 2005; Costa-Mattioli et al., 2009; Gkogkas et al., 2010) y en la señalización del OS en los oligodendrocitos (Lin et al., 2008). NRf2 desempeña un papel importante en la respuesta al OS de los astrocitos (Haskew-Layton et al., 2010). El papel de estos factores en la microglía es menos claro y se desconoce si todos (incluidos GSK3p) están implicados. El mecanismo de cómo los tipos de células específicas son responsables de la producción de determinados antioxidantes en respuesta a SD no está claro. Los presentes inventores esperan que el OS (y la señalización aguas abajo y la producción de antioxidantes relacionada) muestre heterogeneidad del tipo de células neuronales, con tal vez el mayor cambio que se produce en microglía y astrocitos, en comparación con las neuronas y los oligodendrocitos.

También se puede esperar que las citocinas muestren cambios diferenciales en el tipo de células. Los linfocitos T son la principal, si no la única, fuente de IFN-y, mientras que la microglía produce TNF-a en condiciones fisiológicas (Hulse et al., 2008) y las neuronas principalmente IL-11 y, en menor medida, los astrocitos (Mitchell et al., 2011). IGF-1, por otro lado, a menudo proviene de la periferia (Jogie-Brahim et al., 2009) pero también puede producirse por astrocitos y neuronas. Los receptores afines para estos mediadores también se expresan diferencialmente entre los tipos de células cerebrales.

Los estudios in vivo serán paralelos a los resultados del cultivo ya que los cortes son paralelos a los homólogos in vivo. Los datos respaldan esta sugerencia al mostrar que la MBP disminuye 1-2 días después de 1 hora de SD recurrente en neocorteza animal, un hallazgo establecido por primera vez en cortes. Para mostrar que las mediciones no son exclusivas del hipocampo, se realizarán mediciones paralelas después de la SD neocortical.

Ejemplo 7

El ambiente enriquecido (EE) reduce la hiperexcitabilidad de las convulsiones (Kraig et al., 2010; Young et al., 1999), SD (Guedes et al., 1996) y jaqueca (Darabaneanu et al., 2011) a través de la señalización adaptativa. Sin embargo, se desconoce la señalización del EE que impide el desarrollo de una mayor susceptibilidad a SD. Los presentes inventores contemplan que los niveles bajos de IL-11, IFN-y e IGF-1, pequeñas moléculas implicadas en la neuroprotección del preacondicionamiento, también están implicados en el Ee y siguen un patrón hormético. IL-11, IFN-y, IGF-1 y el OS tienen papeles interrelacionados en la reducción de la susceptibilidad a SD a través del EE. Los estudios que usan EE, EE SD y SD EE se modelan en cultivos de cortes de hipocampo, con sus resultados confirmados in vivo usando EE SD en ratas. El punto final experimental de la susceptibilidad a SD alterada por EE se compara con las mediciones del OS neto, los niveles de antioxidantes específicos y los cambios en las moléculas de señalización críticas del OS. Las mediciones siguen a las descritas anteriormente, extendidas para incluir la confirmación mediante pruebas de comportamiento de la eficacia de EE. El resultado general esperado es definir el distintivo de pequeñas moléculas críticas para la señalización del OS mediante las cuales el EE reduce la susceptibilidad a SD. Esto proporciona información novedosa sobre cómo el EE potencia los medios de origen natural para prevenir una mayor susceptibilidad a SD a partir de SD y, por extensión, jaqueca crónica y de alta frecuencia (HFCM por sus siglas en inglés).

La señalización adaptativa (es decir, hormética) requiere que (a) un estímulo iniciador sea lo suficientemente fuerte como para evocar una respuesta adaptativa y (b) debe transcurrir el tiempo suficiente para que se produzcan respuestas adaptativas. Para los fines de los presentes inventores, los estímulos dependientes de la actividad iniciadora (EE) son las citocinas proinflamatorias TNF-a a partir de la microglía (Kraig et al., 2010) e IFN-y a partir de linfocitos T, que desencadenan respuestas adaptativas.

La señalización adaptativa de EE incluye la producción de IL-11, IFN-y e IGF-1. IL-11 es una citocina antiinflamatoria localizada en neuronas y, en menor medida, en astrocitos (Mitchell et al., 2010; Mitchell et al., 2011). TNF-a estimula la producción de IL-11, que a su vez inhibe la producción de TNF-a (Mitchell et al., 2010; Mitchell et al., 2011). Los linfocitos T, la principal, si no la única, fuente de IFN-y en condiciones cerebrales fisiológicas, desempeñan un papel en el efecto nutritivo del EE en el cerebro. Un mayor número de linfocitos T ingresan al parénquima cerebral con EE (Ziv et al., 2006). Asimismo, los linfocitos T están implicados en el mantenimiento de la neurogénesis y el aprendizaje espacial (Ziv et al., 2006), los efectos que muestran los datos de los presentes inventores requieren IFN-y. El IGF-1 circulante media los efectos neuroprotectores del ejercicio (Carro et al., 2000), probablemente a través de la entrada dependiente de la actividad del IGF-1 desde la periferia (Nishijima et al., 2010). Sin embargo, la lesión cerebral isquémica desencadena la expresión de IGF-1 en neuronas y astrocitos (Hwang et al., 2004), y estas células también pueden ser una fuente de IGF-1 a partir del EE. Asimismo, IGF-1 puede aumentar la excitabilidad cerebral (Nunez et al., 2003; Ramsey et al., 2005) y, por lo tanto, pueden desempeñar un papel en el aumento de la actividad del EE. Finalmente, IGF-1 afecta al OS ya que GSK3p es el principal efector aguas abajo de la señalización de IGF-1. En cada caso, estas moléculas pequeñas (es decir, IL-11, IFN-y e IGF-1) estimulan la producción de antioxidantes, que aumentan con la actividad neuronal (Papadia et al., 2008). Los presentes inventores contemplan que el aumento de los niveles de antioxidantes dependientes de la actividad es un medio importante por el cual el e E puede reducir la susceptibilidad a SD (Guedes et al., 1996) y, por extensión, la jaqueca (Darabaneanu et al., 2011). Los datos de los presentes inventores respaldan esta conclusión.

Los presentes inventores muestran que IL-11, IFN-y e IGF-1 redujeron significativamente la susceptibilidad a SD después de 3 días de pretratamiento (FIG. 5), efectos que reducen el OS (FIG. 4,9,10,13,15,16). Asimismo, tanto EE (que aumenta MBP) como cLTP (un modelo de aprendizaje in vitro utilizado en este caso) aumentan significativamente el umbral para SD. El EE en ratones C57BL/10J desencadenó un aumento significativo (2 y 2,2 veces, respectivamente) en el ARNm de IFN-y e IL-11. De forma similar, el cLTP en los cortes desencadenó un aumento de 89 veces en el ARNm de IL-112 horas después de la estimulación.

Los cultivos de cortes se usan para EE, EE SD y SD EE con grupos y mediciones por experimento como se describe anteriormente, excepto en lo que se indica más adelante. El paradigma experimental será: evocar cLTP y a continuación, un día después, desencadenar SD (es decir, 1, 3 o 6), seguido de mediciones tomadas 1, 3 o 7 días después. Observación: Se excluyen las mediciones de 14 días después de la SD, ya que los cultivos se usan de 21­ 35 días in vitro. Los criterios de valoración son comparar la susceptibilidad a SD después de EE a citocinas innatas, el OS, los nodos críticos de señalización del OS y los niveles de antioxidantes.

Los presentes inventores utilizan un método bien aceptado para inducir cLTP en cultivos de cortes (Kraig et al., 2010; Otmakhov et al., 2004a; Otmakhov et al., 2004b; Kopec et al., 2006). El protocolo consiste en aumentar los niveles de AMPc y aumentar la actividad sináptica utilizando rolipram/forskolina aplicados en una solución de Ringer sin Mg2+ (36 °C) durante 5 minutos, permitiendo después que los cortes se recuperen en medios normales.

Para el EE, las ratas (12/jaula) se alojan en una jaula de enriquecimiento de estilo Marlau con acceso libre a alimentos y agua, una variedad de juguetes, una rueda para correr y un tazón de socialización que se cambian semanalmente durante 4 semanas para proporcionar mayores oportunidades volitivas para estimulación intelectual, física y social (es decir, EE). Las ratas sin enriquecimiento se alojan en jaulas convencionales simples.

Se inducirá SD de hipocampo y neocortical en ratas anestesiadas con isoflurano como se describe previamente para ratas usando inyecciones de nanolitros de KCl 0,5 M (o NaCl 0,5 M para controles simulados) cada 9 minutos durante 1 hora (Kunkler y Kraig, 2003) para SD aguda, SD después de EE o SD después de imitar la señalización del EE.

Se utiliza una tarea de reconocimiento visual para evaluar la memoria dependiente del hipocampo, ya que no es estresante. La capacidad de reconocer un objeto nuevo frente a uno familiar es una medida de la memoria dependiente del hipocampo (Clark et al., 2000; Gobbo y O'Mara, 2004; Mansuy et al., 1998; Mumby et al., 2002; Rampon et al., 2000; Ruby et al., 2008; Rutten et al., 2008; Thuret et al., 2009).

Los métodos seguirán los descritos anteriormente, excepto que SD estará precedida por EE (es decir, cLTP). Determinados estudios incluirán SD seguida de EE. Los presentes inventores imitarán las variables de los inventores de señalización de EE dirigido (es decir, IL-11, IFN-y e IGF-1) aplicándolas durante 3 días, como se muestra en la FIG.

7. Las concentraciones iniciales serán como se describe previamente (FIG. 5), así como 0,1x y 10x de esas dosis. Esta última también incluirá mediciones de umbral de SD.

Para garantizar que EE potencie la memoria dependiente del hipocampo, los animales se someten a pruebas de comportamiento. El umbral para los niveles de SD, OS y antioxidantes se medirá 1, 3, 7 y 14 días después. El paradigma de las pruebas de comportamiento no debe interferir con la señalización de citocinas y OS, ya que no es estresante. Los controles frente a Ee solo verificarán esto.

Si bien es probable que el proceso de reducción de la susceptibilidad a SD por la actividad asociada con EE sea hormético, los presentes inventores contemplan que la respuesta a la dosis de la susceptibilidad a SD y el cambio de OS a partir de EE mostrará un patrón de dosis-respuesta lineal o umbral que es más alto que aquellos vistos en ausencia de EE.

Los presentes inventores esperan que los tipos específicos de células cerebrales muestren cambios diferenciales en el nivel de OS. Sin embargo, es probable que dichos cambios se reduzcan como resultado del EE. Esto sugiere que los números (o diversidad) de tipos de células que responden se reducen, como lo ilustran las respuestas diferenciales de los cultivos primarios a dosis más bajas de TNF-a (Tay et al., 2010).

Los resultados in vivo deben ser paralelos a los resultados de cortes in vitro. Como se señala anteriormente, los cultivos de cortes de hipocampo se parecen mucho a la estructura y función de sus homólogos in vivo. Hasta la fecha, los resultados de los presentes inventores de susceptibilidad a SD, respuestas celulares a SD [por ejemplo, astrogliosis, microgliosis y en este caso, disfunción de oligodendrocitos (reducción de MBP)] y OS son comparables entre las preparaciones.

Ejemplo 8

La insulina nasal ingresa al cerebro (Born et al., 2002) y mejora la función cognitiva (Stockhorst et al., 2004; Hallschmid et al., 2008), por lo tanto, podría usarse como un mimético de EE. Si la insulina puede imitar eficazmente el EE, los presentes inventores contemplan que otras moléculas pequeñas pueden ejercer un efecto similar. De hecho, considerable evidencia demuestra que el IGF-1 suministrado por vía nasal ingresa al cerebro (Thorne et al., 2004) y mejora significativamente la función cerebral después de una lesión (Liu et al., 2001). Debido a que también se ha demostrado que otras moléculas pequeñas ingresan al cerebro y median un impacto terapéutico (Akpan et al., 2011; De Rosa et al., 2005), los presentes inventores esperan que IL-11 e IFN-y también lo hagan. Por consiguiente, los presentes inventores definen el grado en que las moléculas pequeñas de la invención (IL-11, IFN-y e IGF-1) ingresan al cerebro y reducen la susceptibilidad a SD y el OS. Los presentes inventores usaron ratas para Sd de hipocampo y neocortical (FIG. 6-7).

Las ratas (FIG. 6 y 7) se anestesian con isoflurano por inhalación y se mantienen calientes. Mientras se anestesian, los animales se colocan en posición supina y se administran 50 pl de solución fármaco estéril (es decir, IFN-y, IGF-1 o IL-11) [o vehículo salino estéril (control simulado)] por vía nasal mediante el suministro de 5 pl alternando entre la narina izquierda y derecha cada 2 min durante 20 minutos. Los animales reciben diariamente tratamientos con fármacos nasales al mismo tiempo durante 7 días antes de los experimentos posteriores. Las dosis para los 3 agentes comienzan con las dosis eficaces observadas en el trabajo de los presentes inventores utilizando cultivos de cortes (1x), después se incluyen otras (0,1x y 10x). Los presentes inventores basan esta estrategia en el hecho de que la dosis de cultivo eficaz para IGF-1 (40 ng/ml) se aproxima mucho a la dosis utilizada in vivo (143 pg/kg).

Los presentes inventores detectarán el suministro de agentes simuladores de EE mediante inmunotinción. El IFN-y recombinante humano y el IGF-1 recombinante humano se identifican mediante anticuerpos monoclonales (Nishijima et al., 2010). Debido a que no existe un anticuerpo específico para la IL-11 recombinante humana que no reaccione de forma cruzada con el ratón o la rata, la IL-11 biotinilada se administra y detecta con un anticuerpo anti-biotina.

En determinados estudios, los agentes se suministrarán vía administración nasal diariamente durante siete días antes de los experimentos. El 8° día, se determinará el umbral inicial de SD y se inducirán 1, 3 o 6 SD. Esto se seguirá por la medición del umbral de SD [y OS] 1, 3, 7 y 14 días después. La SD se evocará y las mediciones se realizarán por separado en hipocampo y neocorteza.

En otros estudios, se administra una dosis alta de antioxidante (100x vitamina C) durante 4 semanas (es decir, "anti-EE"), después se mide el umbral hasta la primera SD, después se provocan 1, 3 o 6 SD seguidas de mediciones del umbral de SD y OS 1, 3, 7 y 14 días después. De nuevo, los estudios se realizan e hipocampo y neocorteza.

Los agentes de molécula pequeña (IL-11, IFN-y, IGF-1) pueden tener el mismo impacto sobre la reducción de la susceptibilidad a SD ya que el suministro nasal de IGF-1 aumenta de manera comparable el IGF-1 en varias regiones del cerebro, tales como el hipocampo y la neocorteza (Thorne et al., 2004). Asimismo, dado el tamaño molecular similar de los otros agentes, su entrada en el cerebro debería ser comparable a la observada con IGF-1. Dada la eficacia comparable de estos tres agentes para prevenir una mayor susceptibilidad a SD in vitro, estos mostrarán una eficacia similar in vivo.

Se desarrolló un paradigma completo de registro de animales para determinar el umbral para SD en neocorteza e hipocampo de rata anestesiada. La FIG. 6 a continuación ilustra esta capacidad.

Este enfoque se aplicó a la medición del umbral de SD (FIG. 10) después del tratamiento (FIG. 7) con IGF-1 (150 pg), IL-11 (1 pg), IFN-y (50.000 unidades) e insulina (20 pg) administrados por vía nasal. En cada caso, el suministro nasal de estos agentes redujo significativamente (p <0,001) la susceptibilidad a SD en neocorteza más hipocampo. La resistencia contra SD siempre fue mayor en el hipocampo en comparación con la neocorteza (n = 4, controles; n=3, aguda después de IGF-1; n=6, un día después de IGF-1; n=6, un día después de IL-11; n=6, un día después de IFN-y; y n=3, aguda después de insulina).

Administración nasal seguida de evaluación del umbral de SD in vivo. El vehículo o IGF-1 recombinante humano (150 pg) se administra por vía intranasal. El umbral de SD se establece mediante la inyección de volúmenes de nanolitros de KCl 0,5 M en neocorteza o hipocampo (-2,0 mm desde el Bregma y 1,5 mm lateral desde la línea media a 750 pm o 2.800 pm en el cerebro, respectivamente) usando una pipeta de vidrio de pared delgada y Picospritzer. Una vez que se establece un umbral, se confirma dos veces más, con un registro ejemplar de un animal vehículo-simulado que se muestra a continuación. El volumen de inyección se mide inyectando, con la misma presión y duración, la cantidad de KCl 0,5 M que condujo a la primera SD, en un pocillo de vidrio lleno de aceite de máquina ligero (un líquido de densidad apropiada para mantener una esfera de la solución de inyección que no se hunda). El diámetro de la esfera inyectada se mide después con un microscopio compuesto y se usa para calcular el volumen inyectado, después moles de potasio. Los registros se realizan a -6,0 mm desde el Bregma y 4,5 mm lateral a la línea media a 750 pm o 4.500 pm de profundidad para neocorteza e hipocampo, respectivamente.

Ejemplo 9

Los experimentos que usaron cultivos de cortes de hipocampo demostraron que el IGF-1 fásico protegía notablemente contra SD y este efecto estaba relacionado con la reducción del estrés oxidativo.

La depresión propagada (SD), la causa probable del aura de jaqueca y quizás de la jaqueca, se desencadena por la hiperexcitabilidad neuronal generalizada y sin restricciones. La jaqueca y la hiperexcitabilidad inicial de las convulsiones, que implican estrés oxidativo (OS), probablemente estén interrelacionadas. El enriquecimiento ambiental (EE) disminuye las convulsiones y puede reducir la jaqueca. El efecto neuroprotector bien caracterizado del EE implica el factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1). Por consiguiente, los presentes inventores se preguntaron si IGF-1 podría mitigar la hiperexcitabilidad que inicia la SD utilizando cultivos de cortes de hipocampo de rata. Los presentes inventores demuestran que IGF-1 disminuyó significativamente la susceptibilidad a SD y el Os relacionado. Los presentes inventores imitaron el OS de SD y observaron que IGF-1 abolió la hiperexcitabilidad por OS. La aplicación de un antioxidante disminuyó significativamente la susceptibilidad a SD y la administración conjunta de un antioxidante con IGF-1 no produjo ningún efecto aditivo, mientras que un oxidante aumentó significativamente la SD e IGF-1 anuló esté efecto. Además, IGF-1 disminuyó significativamente el OS basal, a pesar de que aparentemente paradójicamente aumentó el estallido de CA3. Estos resultados sugieren que IGF-1 aumentó los antioxidantes endógenos a niveles suficientes para amortiguar contra el OS de SD. La insulina mitigó de manera similar la susceptibilidad a SD, pero requirió una dosis mucho mayor. Debido a que IGF-1 cerebral aumenta con el EE y, al igual que la insulina, funciona independientemente como un mimético de EE, los presentes inventores sugieren que los miméticos de EE son una fuente novedosa de agentes terapéuticos para la SD y, por extensión, la jaqueca.

IGF-1 (e insulina) aumentaron significativamente el umbral de SD. Los cortes de hipocampo se expusieron a IGF-1 de forma aguda (es decir, 15-30 min), bien durante 3 días o durante 7 días antes de evaluar el umbral de SD. La exposición a IGF-1 de 7 días se realizó por fases para imitar mejor los efectos anticipados de la EE [es decir, los intervalos de ejercicio y descanso (Will et al., 2004; Kraig et al., 2010)], donde se expusieron los cortes a medios suplementados con IGF-1 en el día y se volvieron a los medios regulares en la noche. La exposición aguda, de 3 días y de 7 días a IGF-1 aumentó significativamente el umbral de SD en comparación con el control en 24, 75 y 22 veces (FIG. 8). Asimismo, la exposición de 3 días a insulina [(400 pg/ml); pero no dosis menores de insulina, es decir, es decir, 6, 12 y 100 pg/ml (n = 3-9/grupo)] dio como resultado un umbral de SD significativamente mayor (p = 0,03) frente al control [es decir, 22,60 ± 9,60 (n = 8) y 1,00 ± 0,20 (n = 9), respectivamente]. Sin embargo, la dosis de insulina necesaria para este efecto protector fue 15500 veces mayor que IGF-1 (es decir, 70 pM frente a 4,5 o 10 nM), lo que sugiere que IGF-1 tiene mayor utilidad terapéutica contra Sd . Por consiguiente, los presentes inventores centraron su trabajo posterior en IGF-1.

IGF-1 redujo significativamente el OS de SD. Debido a que la SD puede aumentar el OS (Viggiano et al. 2011), el OS puede potenciar la excitabilidad cerebral (Muller et al. 1993; Gulati et al. 2005; Waldbaum y Patel 2010), e IGF-1 está implicado en la señalización antioxidante, los presentes inventores probaron después si el tratamiento con IGF-1 alteraba el OS inducido por SD. Los resultados muestran que el tratamiento agudo de 3 días y 7 días con IGF-1 redujo significativamente el OS de SD (FIG. 9). La exposición de siete días fue nuevamente por fases, como se describe anteriormente para los estudios de umbral de SD anteriores. Mientras que el tratamiento agudo con IGF-1 condujo a una disminución del 20 % en el OS por SD, la exposición de 3 días a IGF-1 proporcionó un nivel de protección aún mayor, con una disminución del 30 % en el OS de SD, y la de 7 días ofreció un 73 % de disminución en el OS por SD.

La susceptibilidad a SD está modulada por el OS. Los cortes se expusieron a ácido ascórbico o peróxido de hidrógeno y se evaluó el umbral de SD. El ascorbato (2 mM) aumentó significativamente el umbral de SD, mientras que el peróxido de hidrógeno (50 pM) disminuyó significativamente el umbral de SD (FIG. 14). La exposición conjunta a IGF-1 y una dosis más alta de peróxido de hidrógeno (200 pM) condujo a una disminución significativa en el umbral de SD en comparación con el IGF-1 solo. Sin embargo, el peróxido de hidrógeno 50 pM expuesto conjuntamente con IGF-1 fue un estrés oxidante insuficiente para superar el efecto protector de IGF-1 sobre la susceptibilidad a SD (FIG. 10). Finalmente, La incubación conjunta de cultivos de cortes con ascorbato e IGF-1 (n = 8) no aumentó significativamente el umbral para SD frente a Ig F-1 solo (n = 7; p = 0,28 con niveles de umbral de SD relativos de 7,39 ± 6,16 y 1,00 ± 0,31, respectivamente).

IGF-1 eliminó los efectos de los miméticos de SD sobre la excitabilidad y el OS. Los presentes inventores evaluaron además la capacidad de IGF-1 para reducir la excitabilidad del cultivo de cortes disminuyendo el OS. En primer lugar, los presentes inventores imitaron el OS por SD mediante la aplicación de peróxido de hidrógeno. Este OS inducido exógenamente aumentó significativamente la hiperexcitabilidad de los cortes evocados (FIG. 11), como el observado por SD (Mitchell et al. 2010a). La exposición tanto aguda como de 3 días a IGF-1 anuló esta hiperexcitabilidad inducida por peróxido de hidrógeno. En segundo lugar, los presentes inventores imitaron adicionalmente el OS por SD mediante la exposición de los cortes a menadiona (FIG. 11). Como cabía esperar, este tratamiento desencadenó un aumento significativo en el OS de los cortes, un efecto que se anuló por la exposición aguda y de 3 días a IGF-1. De hecho, la exposición de 3 días a IGF-1 solo podría reducir significativamente el OS basal de los niveles de control. Asimismo, La exposición de 7 días a IGF-1 también redujo significativamente los niveles basales de OS en un 26 % en comparación con los controles (p = 0,001; n = 11 y 9 para los controles y el IGF-1 de 7 días, respectivamente). Esto último es importante porque la exposición a IGF-1 solo, que condujo a reducciones significativas en el OS basal (FIG.

11), desencadenó un aumento significativo en el estallido espontáneo de CA3 (FIG. 12).

Ejemplo 10

El estrés oxidativo por SD aumenta preferentemente en los astrocitos y la microglía, con este último efecto mitigado por IGF-1 (FIG. 13). Los presentes inventores han demostrado recientemente que la depresión propagada (SD), la causa más probable de aura de jaqueca y quizás jaqueca (Lauritzen y Kraig, 2005), se produce con un mayor estrés oxidativo (OS) y que el OS, a su vez, aumenta la susceptibilidad a SD (Grinberg et al., 2012). Las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno que causan OS tienen capacidades de señalización tanto autocrinas como paracrinas que pueden afectar a la susceptibilidad a SD al alterar la excitabilidad (Kishida y Klann, 2007). Por consiguiente, los presentes inventores buscaron el origen celular del OS por SD. En este caso, los presentes inventores usaron cultivos de cortes de hipocampo (HSC) para investigar los cambios específicos de células en OS por SD. La SD se indujo de forma trans-sináptica en HSC de rata usando estímulos eléctricos bipolares en el giro dentado (Pusic et al., 2011). Se indujeron seis SD cada 7 - 9 min durante una hora, seguidas de una incubación de 24 h en CellROX™, se utilizó una sonda fluorogénica fijable para medir el OS (Grinberg et al., 2012). Después, los HSC se fijaron en formalina al 10 % tamponada con fosfato. Otros fijadores (PLP, paraformaldehído al 4 %) impidieron la detección de cambios en el OS. Después se marcó el tejido para la detección de neuronas (anti-NeuN), oligodendrocitos (anti-RIP), astrocitos (anti-GFAp ), o para microglía (isolectina GS-IB4). Utilizando microscopía confocal, seguida del análisis MetaMorph de la intensidad de fluorescencia específica celular, los presentes inventores descubrieron que el OS por SD aumentó significativamente en los astrocitos (p = 0,019) y la microglía (p = 0,003) pero no en las neuronas u oligodendrocitos, en comparación con los controles simulados (n = 3 - 6/grupo).

Debido a que el factor de crecimiento tipo insulina 1 mimético del enriquecimiento ambiental (IGF-1) mitiga el OS tisular por SD (Grinberg et al., 2012), los presentes inventores buscaron a continuación los tipos de células responsables de este efecto. Los presentes inventores aplicaron IGF-1 (100 ng/ml) durante tres días y observaron que el OS por SD visto en la microglía disminuyó significativamente (p = 0,018) por IGF-1, pero el OS astrocítico de Sd no cambió. El hallazgo de que los astrocitos, pero no las neuronas, muestran un aumento del OS por SD proporciona evidencia fisiológica que extiende el trabajo reciente que indica que los astrocitos tienen un mayor potencial de metabolismo oxidativo (Lovatt et al., 2007). Sin embargo, el aumento del OS de los astrocitos fue sorprendente dado su alto potencial antioxidante esperado (Belanger et al., 2011). Asimismo, SD desencadena microgliosis reactiva (Caggiano y Kraig, 1996), un cambio que se puede esperar que se produzca con el aumento del OS. Los resultados confirman esto, pero, es importante destacar que, muestran que IGF-1 anuló selectivamente el OS microglial. Debido a que el OS promueve la SD (Grinberg et al., 2012), el presente trabajo apunta a la microglía y su OS asociado como posibles dianas terapéuticas en nuevos tratamientos terapéuticos para la jaqueca crónica y de alta frecuencia.

Ejemplo 11

Los presentes inventores señalaron anteriormente que IFN-y tiene efectos perjudiciales y beneficiosos sobre los oligodendrocitos (por ejemplo, mielina), respuestas que contrastan que implican mutuamente estrés oxidativo (OS). La pérdida de mielina y la remielinización deteriorada en la esclerosis múltiple, y su modelo animal, la encefalomielitis alérgica autoinmunitaria experimental, implican un aumento de la señalización de IFN-y y OS concomitante con la enfermedad. A la inversa, si se produce antes del inicio de la enfermedad y se permite un tiempo adecuado para la adaptación, el IFN-y elevado y el OS asociado reducen el grado de desmielinización que de otro modo se observa en modelos animales de esclerosis múltiple. Si bien los mecanismos para los efectos de IFN-y/OS sobre la mielina están incompletamente definidos, la evidencia reciente sugiere la implicación de la producción de antioxidantes impulsada por la actividad neuronal.

El enriquecimiento ambiental [(EE), es decir, el aumento volitivo de la actividad intelectual, social y física] se produce con un aprendizaje y memoria potenciados debido al aumento por fases de la actividad neuronal y disminuye la lesión posterior de una amplia gama de trastornos neurodegenerativos, incluidas las enfermedades desmielinizantes. Además, el EE aumentó el tráfico de linfocitos T en el cerebro, la expresión de IFN-y, la producción de mielina y la reducción del OS. Es importante destacar que, la actividad neuronal potenciada conduce a una producción elevada de antioxidantes, incluido el glutatión. Asimismo, el glutatión inhibe la desmielinización al bloquear la esfingomielinasa y los antioxidantes estimulan la expresión de genes asociados con la mielinización.

Como se señala anteriormente, los presentes inventores buscaron más evidencia de estas posibles interacciones antioxidantes de IFN-y/OS sobre la mielina cerebral utilizando cultivos maduros de cortes de hipocampo, ya que están presentes los linfocitos T y el tejido muestra un aumento en IFN-y después de SD. La SD es una perturbación benigna del cerebro que se cree que es la causa más probable de aura de jaqueca, y quizás de jaqueca. Cuando es recurrente, la SD también puede desempeñar un papel en la conversión de jaqueca episódica a alta frecuencia y crónica. Asimismo, la SD aumenta el OS y desmielinización experimental aumenta la susceptibilidad a SD.

Los últimos resultados confirman que cuando se pulsa IFN-y en cultivos de cortes de hipocampo, se reduce el OS, se reduce la susceptibilidad a SD y, de manera importante, la MBP se eleva por encima del valor basal, efectos que parecen deberse a una mayor producción de antioxidantes, incluido el glutatión. La proteína básica de mielina reducida (MBP) por SD depende de la activación de IFN-Y/linfocito T y esfingomielinasa (FIG. 18). Por el contrario, la elevación fisiológica y transitoria de IFN-y desencadena efectos completamente opuestos (FIG. 19).

Debido a que las células inmunitarias estimuladas liberan exosomas que son capaces de reducir el OS en las células receptoras, los presentes inventores probaron después si los cultivos de cortes estimulados por IFN-y (y posiblemente su microglía) liberan exosomas que imitaban los efectos de IFN-y. Los resultados de los presentes inventores confirman esta hipótesis (Fig. 15-17). Cuando se pulsa IFN-y en cultivos de cortes durante 12 horas, se desencadena la liberación de exosomas nutritivos que imitan el efecto de la exposición pulsada a IFN-y (16, 17). Debido a que la exposición pulsada a IFN-y reduce el OS y el glutatión es un inhibidor de origen natural de la esfingomielinasa neutra, los presentes inventores probaron un aumento inducido por IFN-y en el glutatión de cultivo de cortes de utilizando Thiol Tracker™, un indicador fluorescente de glutatión (Fig. 17).

REFERENCIAS

Las siguientes referencias, en la medida en que proporcionan procedimientos ejemplares u otros detalles complementarios a los establecidos en el presente documento,

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una cantidad eficaz del inductor del receptor del factor de crecimiento insulinoide (IGFR) IGF-1 para su uso en un método para tratar jaquecas en un paciente, en donde IGF-1 se administra al paciente como una monoterapia o en combinación con un segundo compuesto activo seleccionado de un segundo inductor de IGFR que es insulina, IL-11, interferón y, un analgésico y/o un fármaco contra la jaqueca.

2. La cantidad eficaz de IGF-1 para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde IGF-1 se disuelve o dispersa en un transportador farmacéuticamente aceptable.

3. La cantidad eficaz de IGF-1 para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la cantidad eficaz de IGF-1 está entre aproximadamente 0,1 ng y aproximadamente 2,0 g de IGF-1.

4. La cantidad eficaz de IGF-1 para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el paciente padece síntomas de una cefalea de tipo jaqueca.

5. La cantidad eficaz de IGF-1 para su uso en un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en donde IGF-1 se administra al paciente por vía intranasal.

6. La cantidad eficaz de IGF-1 para su uso en un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en donde se administran hasta aproximadamente 10 ml de IGF-1 y un transportador líquido farmacéuticamente aceptable, y/o hasta cuatro veces al día y/o cada 4 a 8 horas, o una vez al día.

7. La cantidad eficaz de IGF-1 para su uso en un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en donde la composición se administra a las células cerebrales del paciente, o a la microglía u otros tipos de células cerebrales que incluyen células inmunitarias y células vasculares en el cerebro del paciente.

8. La cantidad eficaz de IGF-1 para su uso en un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en donde el paciente ha experimentado más de cuatro jaquecas en un período de 4 semanas.

9. La cantidad eficaz de IGF-1 para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al paciente se le administra el fármaco contra la jaqueca al mismo tiempo que IGF-1 o dentro de las 24 horas posteriores de haberse administrado el IGF-1.