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ES2751386T3 - Polipéptidos Fc variantes con unión potenciada al receptor de Fc neonatal - Google Patents

Polipéptidos Fc variantes con unión potenciada al receptor de Fc neonatal Download PDF

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ES2751386T3
ES2751386T3 ES12808642T ES12808642T ES2751386T3 ES 2751386 T3 ES2751386 T3 ES 2751386T3 ES 12808642 T ES12808642 T ES 12808642T ES 12808642 T ES12808642 T ES 12808642T ES 2751386 T3 ES2751386 T3 ES 2751386T3
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ES12808642T
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Jeonghoon Sun
Seog Joon Han
Susie M Harris
Randal R Ketchem
Ji Lu
Mark L Michaels
Marc W Retter
Mei-Mei Tsai
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Original Assignee
Amgen Inc
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Abstract

Un polipéptido Fc variante que comprende un fragmento de Fc variante de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana; en el que el fragmento de Fc variante comprende una inserción de 3 a 20 aminoácidos en comparación con un fragmento de Fc de control, en el que la inserción en el fragmento de Fc variante es una inserción en una secuencia de aminoácidos correspondiente a una parte del fragmento de Fc de control seleccionada de: (a) los aminoácidos 383-387 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1, (b) los aminoácidos 383-387 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1, en el que los aminoácidos 384-386 están eliminados, y (c) los aminoácidos 382-391 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1, en el que la inserción es entre los aminoácidos 382 y 383, 383 y 384, 384 y 385, 385 y 386, 386 y 387, 387 y 388, 388 y 389, 389 y 390 o 390 y 391; en el que el fragmento de Fc de control comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: los aminoácidos 169-175 de la SEQ ID NO: 1 (fragmento de Fc de IgG1), los aminoácidos 165-171 de la SEQ ID NO: 3 (fragmento de Fc de IgG2), los aminoácidos 216-222 de la SEQ ID NO: 5 (fragmento de Fc de IgG3), y los aminoácidos 166-172 de la SEQ ID NO: 7 (fragmento de Fc de IgG4); en el que el polipéptido Fc de control comprende el fragmento de Fc de control y tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido de Fc variante excepto que el polipéptido Fc de control no contiene la inserción de 3 a 20 aminoácidos; en el que el polipéptido Fc variante se une a un receptor de Fc neonatal humano (hFcRn) con mayor actividad de unión a pH 6,0 que el polipéptido Fc de control; en el que el polipéptido Fc variante tiene poca o ninguna actividad de unión para la unión a hFcRn a pH 7,4 y la respuesta de unión residual detectada a pH 7,4 es de no más de 0,2 nanómetros más que la detectada usando el polipéptido Fc de control; y en el que los valores comparativos para la actividad de unión y la respuesta de unión residual se determinan por interferometría de biocapa.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos Fc variantes con unión potenciada al receptor de Fc neonatal
Prioridad
Esta solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes provisionales de Estados Unidos n.° 61/578.780, 61/585.993 y 61/729.050, presentadas el 21 de diciembre de 2011, el 12 de enero de 2012 y el 21 de noviembre de 2012, respectivamente, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria en su totalidad.
Campo
La invención se refiere a polipéptidos que comprenden fragmentos de Fc variantes que se unen al receptor de Fc neonatal con mayor afinidad y/o mayor actividad de unión en comparación con un fragmento de Fc de control. La invención se refiere además a métodos de aislamiento, preparación y uso de dichos polipéptidos.
Antecedentes
Los anticuerpos monoclonales terapéuticos se han usado satisfactoriamente como tratamientos para una diversidad de enfermedades. La semivida in vivo relativamente largo de los anticuerpos está mediada al menos en parte por la interacción de la región Fc del anticuerpo con el receptor de Fc neonatal (FcRn). Véase, por ejemplo, Ghetie et al. (1996), Eur. J. Immunol. 26: 690-96. FcRn se une a la región Fc de anticuerpos IgG con afinidad nanomolar (Kd = 100 nM) a un pH de menos de o igual a 6,0, pero no se une al pH de la sangre, es decir, aproximadamente pH 7,4. Tesar y Bjorkman (2001), Curr. Opin. Struct. Biol. 20(2): 226-233. Tras la internalización de un anticuerpo por una célula, por ejemplo, por pinocitosis, una IgG puede unirse por FcRn en el entorno ácido de un endosoma. Id. Cuando se une por FcRn dentro del endosoma, la IgG se dirigirá de nuevo a la superficie celular, en oposición a la entrada en una ruta catabólica por defecto dentro del endosoma. Id. En el entorno de pH en general fisiológico en la superficie celular, la IgG puede disociarse de FcRn y volver a entrar en la circulación. Este proceso permite que el anticuerpo regrese a la circulación después de la internalización dentro de una célula, en oposición a degradarse en la célula dentro de un endosoma.
La publicación internacional número WO 2005/047327 A2 (Biogen IDEC MA Inc.; Cambridge MA (US)) divulga métodos de generación de variantes de Fc que muestran unión diferencial a FcRn a, por ejemplo, pH 6,0 en comparación con pH 7,4. Los polipéptidos que contienen Fc (anticuerpos y proteínas de fusión que contienen una región Fc o una parte biológicamente activa de la misma) pueden modificarse en uno, dos o más restos de aminoácido (pero en general no más de diez restos) adyacentes a una o más posiciones de la región Fc identificadas por conferir unión a FcRn por la región Fc.
La publicación internacional número WO 2008/119096 A1 (F-Star Biotechnologische Forschungs- und Enwicklungsges.m.b.H.; Vienna (AT)) divulga métodos de producción de variantes de IgG que muestran mayor afinidad de unión a FcRn a pH 5-7 que a pH 7,1 a 7,6. Estas variantes comprenden sustitución, eliminación y/o inserción de dos o más restos de aminoácido, preferiblemente mutaciones puntuales o mutación de hasta 20, 25 o 30 restos de aminoácido de bucles de la región Fc seleccionados (siendo el bucle 5 particularmente preferido), para conseguir prolongación de la semivida in vivo con la retención de la actividad biológica.
La publicación internacional número WO 2009/058492 A2 (Xencor, Inc.; Monrovia CA, (US)) divulga variantes de Fc, métodos de manipulación para su generación y optimización, y su aplicación, particularmente con fines terapéuticos. Se propone la preparación de variantes que muestran retención aumentada en suero in vivo: la inserción o eliminación de restos de aminoácido en ubicaciones de bucle de la región Fc seleccionadas aumenta la afinidad de unión entre el polipéptido Fc y FcRn a aproximadamente pH 6,0, mientras se mantiene afinidad menor a pH 7,4.
Hay una necesidad en la técnica de anticuerpos con semividas in vivo aumentadas para disminuir las cantidades y/o frecuencias de dosificación. Dichos anticuerpos son ventajosos a causa de una conveniencia aumentada por parte del paciente y, por lo tanto, también un cumplimiento posiblemente aumentado por parte del paciente, y/o costes disminuidos. En el entorno actual de asistencia sanitaria consciente de los costes, los costes pueden ser un factor determinante en la utilidad práctica de un producto terapéutico.
Compendio
La presente invención se define por las reivindicaciones.
Se proporcionan fragmentos de Fc variantes que se unen a FcRn con mayor afinidad y/o mayor actividad de unión que un fragmento Fc de control a un pH ligeramente ácido y que se unen a FcRn con aproximadamente la misma afinidad o menor que un fragmento de Fc de control, es decir, poca o ninguna actividad de unión, a un pH fisiológico. También se proporcionan polipéptidos Fc variantes, que contienen un fragmento Fc variante, así como una región de unión que se une a una molécula diana. Se demuestra en la presente memoria que polipéptidos Fc variantes que contienen fragmentos de Fc variantes con las propiedades de unión mencionadas anteriormente también tienen semividas in vivo más largas que los polipéptidos Fc de control. Se proporcionan además ácidos nucleicos que codifican estos fragmentos de Fc y polipéptidos Fc y métodos de preparación de estas proteínas usando estos ácidos nucleicos. También se incluyen métodos para prolongar la semivida in vivo de un polipéptido Fc y métodos para identificar fragmentos de Fc variantes que se unen a FcRn con mayor afinidad a pH 5-6 y se unen a FcRn con afinidad comparable o inferior a pH fisiológico en comparación con un fragmento de Fc de control.
Aquí se describe un polipéptido Fc variante que comprende un fragmento Fc variante de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana, en el que el fragmento de Fc variante comprende una inserción de 3 a 20, de 10 a 20, de 20 a 40, 40 a 60 o de 60 a 80 aminoácidos dentro de o adyacente al bucle 5, 8 y/o 10 del fragmento de Fc variante, en el que el polipéptido Fc variante se une a un receptor de Fc neonatal humano (hFcRn) con mayor afinidad y/o mayor actividad de unión a un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 y/o a un pH de aproximadamente 5,0, 5,2, 5,5, 5,7 o 6,0 que un polipéptido Fc de control que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido Fc variante excepto que no contiene la inserción dentro de o adyacente al bucle 5, 8 y/o 10 y en el que el polipéptido Fc variante se une al receptor Fc neonatal humano (hFcRn) con aproximadamente la misma afinidad o actividad de unión o inferior en comparación con el polipéptido Fc de control, es decir, poca o ninguna actividad de unión, a un pH fisiológico y/o a un pH de aproximadamente 7,4, 7,5 o 7,6. La inserción dentro de o adyacente al fragmento de Fc variante puede ser de al menos seis aminoácidos de longitud, no más de 25 aminoácidos de longitud, de 6 a 16 aminoácidos de longitud y/o al menos 12 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la inserción no contiene restos de metionina y/o triptófano. La inserción dentro de o adyacente al fragmento de Fc variante puede comprender al menos una cisteína entre los primeros cuatro aminoácidos insertados y al menos una cisteína entre los últimos cuatro aminoácidos insertados. Opcionalmente, la inserción puede carecer de restos de cisteína distintos de cualquier resto de cisteína que aparezca en los cuatro primeros o últimos aminoácidos de la inserción. En algunas realizaciones, la inserción es dentro de o adyacente al bucle 10 del fragmento de Fc variante, opcionalmente entre los aminoácidos 384 y 385 del fragmento de Fc variante usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1. La inserción puede ser dentro de los aminoácidos 383 a 387 usando el sistema de numeración EU. En algunas realizaciones, la inserción en el fragmento de Fc humano variante puede ser entre los aminoácidos 382 y 383, 383 y 384, 385 y 386, 386 y 387, 387 y 388, 388 y 389, 389 y 390 o 390 y 391 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1. Como alternativa, pueden eliminarse los aminoácidos 384-386, y la inserción puede ser entre los aminoácidos 383 y 387 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1. Como se describe en la presente memoria, la inserción en el fragmento de Fc variante puede comprender la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 90-356 y 359-379. Además, la inserción en el fragmento de Fc variante puede comprender la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las siguientes: SEQ ID NO: 41-67; SEQ ID NO: 90-246; SEQ ID NO: 247-356; SEQ ID NO: 367, 369, 372, 373 y 375-379; los aminoácidos 4-9 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 41-53, 67, 90-162, 90-163, 165-215, 164-214, 217-247, 216-246, 359-379 y 392-399, 401 -409, 411 -426, 428-439, 441 -447, 449-453, 456, 459, 461,464 y 470, 475, 477-489, 491-496; los aminoácidos 4-10 de las SEQ ID NO: 164, 252 y 490 y los aminoácidos 4-8 de la SEQ ID NO: 215 o 216; los aminoácidos 4-11 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 248-288, 290-306, 342, 400, 410, 427, 440, 448, 454, 455, 457, 458, 460, 465-469, 471-474 y 476; los aminoácidos 4-12 de la SEQ ID NO: 289 o 307; y los aminoácidos 4-13 de una cualquiera de las SEQ ID n O: 308-341 y 343-356.
En la presente memoria se describe además un polipéptido Fc variante que comprende un fragmento de Fc variante de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana, en el que el fragmento de Fc variante comprende una inserción de 3 a 20, de 10 a 20, de 20 a 40, de 40 a 60 o de 60 a 80 aminoácidos dentro de o adyacente al bucle 10, en el que el polipéptido Fc variante se une a un hFcRn con mayor afinidad y/o mayor actividad de unión a un pH en un intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 y/o a un pH de aproximadamente 5,0, 5,2, 5,5, 5,7 o 6,0 que un polipéptido Fc de control que es igual que el polipéptido Fc variante excepto que no contiene la inserción dentro de o adyacente al bucle 10 y en el que el polipéptido Fc variante se une al hFcRn con aproximadamente la misma afinidad o inferior en comparación con el polipéptido Fc de control, es decir, con poca o ninguna actividad de unión, a un pH fisiológico y/o a un pH de aproximadamente 7,4, 7,5 o 7,6. La inserción puede ser de al menos seis aminoácidos de longitud, puede ser de no más de 25 aminoácidos de longitud, puede ser de 6 a 16 aminoácidos de longitud, puede ser de al menos 12 aminoácidos de longitud y/o puede contener al menos una cisteína entre los cuatro primeros aminoácidos de la inserción y al menos una cisteína entre los cuatro últimos aminoácidos de la inserción. La inserción puede carecer de restos de cisteína en otras posiciones dentro de la inserción. La inserción puede carecer de restos de metionina y/o triptófano. La inserción en el fragmento de Fc variante puede ser dentro de los aminoácidos 383-387 de acuerdo con el sistema de numeración EU. La inserción en el fragmento de Fc variante puede ser entre los aminoácidos 382 y 383, 383 y 384, 384 y 385, 385 y 386, 386 y 387, 387 y 388, 388 y 389, 389 y 390 o 390 y 391 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1. Como alternativa, pueden eliminarse los aminoácidos 384-386, y la inserción puede producirse entre los aminoácidos 383 y 387, usando el sistema de numeración EU. La inserción en el fragmento de Fc variante puede comprender la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 90-356, 359-379 y 392-496. Además, la inserción en el fragmento de Fc variante puede comprender la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las siguientes: SEQ ID NO: 41-67; SEQ ID NO: 90-246; SEQ ID NO: 247-356; SEQ ID NO: 367, 369, 372, 373 y 375-379; los aminoácidos 4-9 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 41-53, 67, 90-162, 90-163, 165-215, 164-214, 217-247, 216-246, 359-379 y 392-399, 401-409, 411-426, 428-439, 441-447, 449-453, 456, 459, 461, 464 y 470, 475, 477-489, 491-496; los aminoácidos 4-10 de las SEQ ID n O: 164, 252 y 490 y los aminoácidos 4-8 de la SEQ ID NO: 215 o 216; los aminoácidos 4-11 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 248-288, 290-306, 342, 400, 410, 427, 440, 448, 454, 455, 457, 458, 460, 465-469, 471 -474 y 476; los aminoácidos 4-12 de la SEQ ID NO: 289 o 307; y los aminoácidos 4-13 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 308-341 y 343-356. El polipéptido Fc variante puede ser una proteína de fusión de Fc variante que comprende un polipéptido que no es de anticuerpo. En aspectos particulares, una proteína de fusión de Fc de control para la proteína de fusión de Fc variante puede ser alafacept, rilonacept, aflibercept, etanercept, romiplostim o abatacept. En otros aspectos, el polipéptido Fc variante puede comprender una región variable de cadena pesada (Vh) y/o una región variable de cadena ligera (Vl) de cualquier anticuerpo y también puede comprender una primera región constante de cadena pesada (Ch1) y una región constante de cadena ligera (CL). En algunos aspectos, el polipéptido Fc variante puede comprender (a) una cadena pesada que comprende una región Vh, una primera región constante de cadena pesada (Ch1), una región de bisagra, una región CH2 y una región CH3, y (b) cadena ligera que comprende una región VL y una región constante de cadena ligera (Cl). El polipéptido Fc variante puede ser monovalente. El polipéptido Fc variante puede ser dímero o puede ser un tetrámero.
En aspectos adicionales, se describen en la presente memoria ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos Fc variantes o los fragmentos Fc variantes descritos en la presente memoria, así como las inserciones dentro de o adyacentes a los bucles de los fragmentos de Fc variantes. También se describen células hospedadoras que contienen dichos ácidos nucleicos. También se contemplan métodos de preparación de un polipéptido Fc variante o fragmento de Fc variante, que comprende (a) introducir un ácido nucleico que codifica el polipéptido Fc variante o fragmento de Fc en una célula hospedadora, (b) cultivar la célula hospedadora que comprende el ácido nucleico en condiciones tales que el ácido nucleico se expresa y (c) recuperar el polipéptido Fc variante o fragmento de Fc expresado del medio de cultivo o la masa celular, en el que el fragmento de Fc variante o el polipéptido Fc variante que contiene un fragmento de Fc variante comprende una inserción de 3 a 20, de 10 a 20, de 20 a 40, de 40 a 60 o de 60 a 80 aminoácidos dentro de o adyacente al bucle 5, 8 y/o 10 del fragmento de Fc variante, y en el que el polipéptido Fc variante o fragmento de Fc se une a un hFcRn con afinidad mayor y/o actividad de unión mayor a un pH en un intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 y/o a un pH de aproximadamente 5,0, 5,2, 5,5, 5,7 o 6,0 que un polipéptido Fc o fragmento de Fc de control y en el que el polipéptido Fc variante o fragmento de Fc se une al receptor de Fc neonatal humano (hFcRn) con aproximadamente la misma afinidad o actividad de unión o inferior en comparación con el polipéptido Fc de control o fragmento de Fc de control, es decir, con poca o ninguna actividad de unión, a un pH fisiológico y/o a un pH de aproximadamente 7,4, 7,5 o 7,6.
También se describen métodos para preparar cualquiera de los fragmentos de Fc o polipéptidos Fc variantes descritos en la presente memoria, que comprenden (a) introducir un ácido nucleico que codifica el polipéptido Fc variante o fragmento de Fc en una célula hospedadora, (b) cultivar la célula hospedadora que comprende el ácido nucleico en condiciones tales que se expresa el ácido nucleico y (c) recuperar el polipéptido Fc variante o fragmento de Fc expresado del medio de cultivo o la masa celular.
En un aspecto adicional, se describe en la presente memoria un método para prolongar la semivida de un polipéptido Fc que comprende un fragmento de Fc de IgG humana que comprende las siguientes etapas: seleccionar un sitio dentro de o adyacente al bucle 5, 8 y/o 10 para inserción; e insertar un péptido en el sitio seleccionado, en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 41-67; SEQ ID NO: 90-246; SEQ ID NO: 247-356; SEQ ID NO: 367, 369, 372, 373 y 375-379; los aminoácidos 4-9 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 41-53, 67, 90-162, 90-163, 165-215, 164-214, 217-247, 216-246, 359-379 y 392-399, 401-409, 411-426, 428-439, 441-447, 449-453, 456, 459, 461, 464 y 470, 475, 477-489, 491-496; los aminoácidos 4-10 de las SEQ ID n O: 164, 252 y 490 y los aminoácidos 4-8 de la SEQ ID NO: 215 o 216; los aminoácidos 4-11 de una cualquiera de las s Eq ID NO: 248-288, 290-306, 342, 400, 410, 427, 440, 448, 454, 455, 457, 458, 460, 465-469, 471 -474 y 476; los aminoácidos 4-12 de la SEQ ID NO: 289 o 307; y los aminoácidos 4-13 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 308-341 y 343-356. El sitio seleccionado puede ser dentro de o adyacente al bucle 10, y el sitio de inserción puede ser entre los aminoácidos 384 y 385, numerados de acuerdo con el sistema de numeración EU. El sitio de inserción puede ser dentro de los aminoácidos 383 a 387 usando el sistema de numeración EU. La inserción en el fragmento de Fc variante puede ser entre los aminoácidos 382 y 383, 383 y 384, 384 y 385, 385 y 386, 386 y 387, 387 y 388, 388 y 389, 389 y 390 o 390 y 391 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1. Como alternativa, pueden eliminarse los aminoácidos 384-386, y la inserción puede producirse entre los aminoácidos 383 y 387, usando el sistema de numeración EU.
En la presente memoria se describe además un método para identificar un fragmento de Fc variante de IgG humana que confiere una semivida in vivo más larga a un polipéptido Fc variante que comprende el fragmento de Fc variante, en comparación con un polipéptido Fc de control, que comprende las siguientes etapas: (a) crear una colección de ácidos nucleicos que codifican fragmentos de Fc que contienen una inserción que comprende 4-20, 10 a 20, 20-40, 40-60 o 60-80 aminoácidos aleatorizados dentro de o adyacentes al bucle 10; (b) cribar los fragmentos de Fc codificados por la colección para identificar los fragmentos de Fc variantes que (i) se unen a FcRn humano con mayor afinidad y/o mayor actividad de unión a pH 5,5 y/o a un pH de aproximadamente 5-6, que un fragmento de Fc de control y (ii) se unen al FcRn humano a la misma afinidad o actividad de unión o inferior en comparación con el fragmento de Fc de control, es decir, con poca o ninguna actividad de unión, a pH fisiológico y/o a un pH de 7,4, 7,5 o 7,6; (c) construir un ácido nucleico que codifica un polipéptido Fc variante que comprende un fragmento de Fc variante identificado en (b), en el que la concentración de un polipéptido Fc de control, que comprende un fragmento de Fc de control en el lugar del fragmento de Fc variante, se sabe que disminuye linealmente a lo largo del tiempo cuando se administra a un animal in vivo; (d) introducir el ácido nucleico de (c) en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora en condiciones tales que puede expresarse el polipéptido Fc variante codificado por el ácido nucleico; (e) recuperar el polipéptido Fc variante de la masa celular o medio de cultivo celular; (f) administrar el polipéptido Fc variante a un animal y administrar el polipéptido Fc de control a otro animal; y (g) controlar las concentraciones de los polipéptidos Fc variantes y de control en sangre periferia a lo largo del tiempo después de la administración, identificando de ese modo un fragmento de Fc variante que confiere una semivida in vivo más larga a un polipéptido Fc variante. La inserción de la etapa (a) puede ser entre las posiciones 384 y 385 usando el sistema de numeración EU como se ilustra en la tabla 1. El sitio de inserción puede ser dentro de los aminoácidos 383 a 387 usando el sistema de numeración EU. La inserción en el fragmento de Fc variante puede ser entre los aminoácidos 382 y 383, 383 y 384, 384 y 385, 385 y 386, 386 y 387, 387 y 388, 388 y 389, 389 y 390 o 390 y 391 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1. Como alternativa, pueden eliminarse los aminoácidos 384-386, y la inserción puede producirse entre los aminoácidos 383 y 387, usando el sistema de numeración EU.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar una enfermedad crónica, que comprende administrar a un paciente que lo necesita un polipéptido Fc variante como se describe en la presente memoria.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Diagrama de cintas de la estructura tridimensional predicha de partes de FcRn humano (hFcRn) y un fragmento de Fc de IgG1 humana que entra en contacto muy estrecho tras unión de FcRn al fragmento de Fc. En la parte superior hay un diagrama de cintas de una parte de la estructura terciaria de hFcRn. Debajo hay un diagrama de cintas de una parte de un fragmento de Fc de IgG1 humana que entra en contacto muy estrecho con FcRn cuando se une FcRn al mismo. Los bucles se muestran como cordones, mientras que las hélices alfa y láminas beta se muestran como cintas. Los seis sitios en los que se hicieron las inserciones se indican por los nombres de las ocho colecciones que se construyeron como se describe a continuación, es decir, L1, L2A, L2B, L3, L4, L5, L6A y L6B.
Figura 2: Formato de las colecciones de inserción. En la parte superior se muestra la secuencia de un fragmento de Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 1). Los aminoácidos dentro de los bucles en que, o adyacentes a los que, se hicieron inserciones se indican por subrayado y negrita. Los nombres de las colecciones, es decir, L1, L2A, etc., aparecen encima de la región en la que se hicieron las inserciones para esa colección particular. El formato de las inserciones se indica debajo. En el lado izquierdo están los nombres de las colecciones, es decir, L1, L2A, etc. Justo a la derecha de los nombres de la colección está la secuencia original alrededor del sitio de inserción antes de la inserción de cualquier aminoácido. Las letras en cursiva indican aminoácidos que se eliminan antes de la inserción. Una línea discontinua vertical indica el sitio de inserción en aquellas colecciones en que no se eliminaron aminoácidos. En el lado derecho está la secuencia alrededor del sitio de inserción con la inserción en su sitio. Las denominaciones "(19R)s" o "(19R)6" significan cinco o seis, respectivamente, aminoácidos aleatorizados, que pueden ser cualquiera de los 19 aminoácidos distintos de cisteína. La denominación "(20R)s" significa ocho aminoácidos aleatorizados, que pueden ser cualquiera de los veinte aminoácidos.
Figura 3: Curvas de asociación y disociación a pH 6 y pH 7,4, respectivamente, de fragmentos de Fc variantes de la colección L5. Las curvas a la izquierda muestran la respuesta detectada usando el sistema ForteBio Octet® como se explica en el ejemplo 4, donde las partes de las curvas a la izquierda de la línea vertical central muestra las cantidades relativas de asociación de los diversos fragmentos de Fc a FcRn a pH 6 y las partes de las curvas a la derecha de la línea vertical central muestran la disociación de los fragmentos de Fc de FcRn a pH 7,4. La tabla a la derecha proporciona la respuesta de unión máxima detectada a pH 6 para cada variante y para un fragmento de Fc de tipo silvestre (FcWT).
Figura 4: Promedio de concentraciones de anticuerpos que contienen fragmentos de Fc variantes y de control como una función del tiempo tras la inyección en macacos cangrejeros. El eje x indica el tiempo en horas tras la inyección, y el eje y indica la concentración del anticuerpo en nanogramos por mililitro (ng/ml) en sangre periférica de macacos cangrejeros a los que se ha inyectado un anticuerpo.
Figura 5: Secuencias de variantes del bucle 10. Se muestran las secuencias de aminoácidos de tipo silvestre o las versiones variantes de un bucle en un fragmento de Fc de IgG1 humana, más tres aminoácidos adyacentes en cualquier lado. La secuencia de aminoácidos mostrada es de los restos de aminoácido 166-178, en el esquema de numeración de la figura 2, o los aminoácidos 381-393 de acuerdo con la numeración EU (SEQ ID NO: 563) como se muestra en esta figura y en la tabla 1. La secuencia de la región de bucle de tipo silvestre inalterada se denomina "secuencia de tipo silvestre". La secuencia de esta región de bucle en la variante 5-1 de Fc (codificada por un aislado de la colección L5) se denomina "5-1" (SEQ ID NO: 564). Las secuencias de aminoácidos insertadas se muestran en negrita con subrayado. La secuencia de esta misma región de bucle de diversas variantes de 5-1, que tienen el mismo péptido insertado en diferentes ubicaciones dentro de o adyacente a este bucle, en algunos casos con algunos aminoácidos del bucle eliminados, se muestran debajo.
Figura 6: Curvas de asociación y disociación a pH 6 y pH 7,4, respectivamente, de fragmentos de Fc variantes que tienen la misma inserción en diferentes posiciones del bucle 10. A la izquierda se muestran las curvas de asociación a pH 6 (a la izquierda de la línea vertical central) y las curvas de disociación a pH 7,4 (a la derecha de la línea vertical central) de los diversos fragmentos de Fc variantes y un fragmento de Fc de tipo silvestre (FcWT). A la derecha, se muestra la respuesta de unión máxima detectada para cada variante a pH 6 en forma de tabla.
Figura 7: Curvas de asociación y disociación a pH 6 y pH 7,4 de fragmentos de Fc variantes de la colección L5 cribados en levadura. A la izquierda se muestran las curvas de asociación a pH 6 (a la izquierda de la línea vertical central) y las curvas de disociación a pH 7,4 (a la derecha de la línea vertical central) de los diversos fragmentos de Fc variantes y un fragmento de Fc de tipo silvestre (FcWT). A la derecha se muestra la respuesta de unión máxima detectada para cada variante a pH 6 en forma de tabla
Figura 8: Curvas de asociación y disociación a pH 6 y pH 7,4 de fragmentos de Fc variantes de la colección L-8 y L-10 cribados en levadura. A la izquierda se muestran las curvas de asociación a pH 6 (a la izquierda la línea vertical central) y las curvas de disociación a pH 7,4 (a la derecha de la línea vertical central) de los diversos fragmentos de Fc variantes y un fragmento de Fc de tipo silvestre (FcWT). A la derecha se muestra la respuesta de unión máxima detectada para cada variante a pH 6 en forma de tabla.
Figura 9: Promedio de concentraciones de anticuerpos que contienen fragmentos de Fc variantes y de control como una función del tiempo después de la inyección en macacos cangrejeros. El eje x indica el tiempo en horas después de la inyección y el eje y indica la concentración del anticuerpo en nanogramos por mililitro (ng/ml) en sangre periférica de macacos cangrejeros a los que se ha inyectado un anticuerpo.
Figura 10: Promedio de concentraciones de anticuerpos que contienen fragmentos de Fc variantes y de control como una función del tiempo después de la inyección en macacos cangrejeros. El eje x indica el tiempo en horas después de la inyección y el eje y indica la concentración del anticuerpo en nanogramos por mililitro (ng/ml) en sangre periférica de macacos cangrejeros a los que se ha inyectado un anticuerpo. Como se indica, los círculos rellenos representan datos puntuales individuales para macacos cangrejeros a los que se ha inyectado Y-5-112, y la línea continua representa la media de estos datos. Asimismo, los triángulos representan datos puntuales individuales para macacos cangrejeros a los que se ha inyectado anticuerpo Y, y la línea discontinua representa la media de estos datos.
Breve descripción de las secuencias
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Descripción detallada
Los cambios en una proteína terapéutica que aumenta la semivida in vivo pueden ser útiles porque dichas proteínas pueden dosificarse en cantidades menores y/o menos frecuencia. La presente invención proporciona polipéptido Fc variantes que comprenden fragmentos de Fc variantes que se unen a FcRn con afinidad y/o actividad de unión aumentada a pH ligeramente ácidos, tales como, por ejemplo, pH 5,0-6,0 y no se unen bien a FcRn a pH fisiológicos de aproximadamente 7,2 a 7,6. Como se demuestra en la presente memoria, dichos polipéptidos Fc variantes que contienen los fragmentos de Fc variantes pueden tener semividas in vivo más largas en comparación con polipéptido Fc de control. Se proporcionan polipéptidos Fc variantes que comprenden fragmentos de Fc humano variantes, que contienen al menos una inserción dentro de o adyacente a un bucle, que se unen a FcRn con afinidad y/o actividad de unión potenciada a un pH de aproximadamente 5 a 6 en comparación con polipéptido Fc de control que difieren únicamente en que no contienen la una o más inserciones. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican proteínas que contienen dichos fragmentos de Fc variantes y polipéptidos Fc variantes, células hospedadoras que contienen dichos ácidos nucleicos y métodos de preparación de polipéptidos Fc variantes y fragmentos de Fc variantes. Además, se proporcionan métodos de prolongación de la semivida de un polipéptido Fc, y también se proporcionan métodos de identificación de fragmentos de Fc variantes que se unen a FcRn con mayor afinidad y/o actividad de unión a pH 5-6 con menor afinidad y/o actividad de unión o comparable a un pH fisiológico en comparación con fragmentos de Fc de control.
Un fragmento de Fc variante como se describe en la presente memoria contiene inserciones cortas en sitios seleccionados en los bucles. FcRn interactúa con un fragmento de Fc. Un dominio de inmunoglobulina, tal como el dominio Ch2 o Ch3, tiene una estructura con forma de barril que comprende partes de lámina beta que alternan con bucles. Hunkapiller y Hood (1989), Adv. Immunol. 44: 1-63; Williams y Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405. Se eligieron sitios de inserción en un fragmento de Fc en los bucles que son parte de la zona que entra en contacto relativamente cercano con FcRn cuando se une al fragmento de Fc o en bucles que están adyacentes a estas zonas. La figura 1 muestra diagramas de cintas de parte de FcRn (parte superior) y un fragmento de Fc (parte inferior) e indica las posiciones en el fragmento de Fc de los sitios seleccionados para las inserciones.
Como se mostrará a continuación, muchas inserciones en la colección L5 tienen las propiedades deseadas de unión potenciada a FcRn a pH 5 a 6 y poca o ninguna unión a FcRn a pH fisiológico. Otras colecciones, incluyendo las colecciones L1, L2B, L3 y L4 (véanse las figuras 1 y 2), no producían inserciones que tuvieran las propiedades deseadas, aunque se cribó aproximadamente el mismo número de variantes. Las colecciones L2A, L6A y L6B produjeron algunas inserciones que tienen las propiedades deseadas, aunque los números fueron mucho más pequeños que los números obtenidos de la colección L5. Sorprendentemente, la colección que produjo las inserciones más numerosas con las propiedades deseadas, es decir, la colección L5, recae en una región de bucle que no es parte de la zona que entra en contacto más cercano con FcRn. Figura 1.
Definiciones
El término "afinidad", como se entiende en la presente memoria, se refiere a la afinidad de unión medida como una CE50 medida usando un BIAcore® T100 (o un instrumento similar) como se explica en el ejemplo 3. La "afinidad mayor" de un polipéptido Fc variante (que contiene un fragmento de Fc variante), en comparación con un polipéptido Fc de control (que contiene un fragmento de Fc de control), por FcRn significa que el polipéptido Fc variante tiene una CE50 que es de no más de un 50 % de la CE50 del polipéptido Fc de control. Asimismo, la "afinidad menor" de un polipéptido Fc variante, en comparación con un polipéptido Fc de control, significa que el polipéptido Fc variante tiene una CE50 que es de más de un 150 % de la de un polipéptido Fc de control. La afinidad de un polipéptido Fc variante se considera "sustancialmente igual" a la de un polipéptido Fc de control si su CE50 es de un 50-150 % de la CE50 del polipéptido Fc de control.
La expresión "actividad de unión", como se entiende en la presente memoria, se refiere a la actividad de unión de un polipéptido Fc a un FcRn medida usando biosensores de estreptavidina recubiertos con FcRn humano (hFcRn) biotinilado en el sistema Octet Red® como se describe en el ejemplo 4 donde se produce asociación a pH 6 y se produce disociación a pH 7,4. La actividad de unión de un polipéptido Fc variante a pH 6 se considera que es "mayor que" la de un polipéptido Fc de control si la respuesta máxima observada en al menos 1,5, 1,75 o 2,0 veces la respuesta máxima observada para el polipéptido Fc de control. La cantidad muy pequeña de respuesta de unión residual, es decir, la respuesta de unión que permanece después de que la mayoría de la proteína se haya disociado de hFcRn a pH 7,4, observada usando un polipéptido Fc de control que comprende un fragmento de Fc de tipo silvestre se menciona como "poca o ninguna actividad de unión". Un polipéptido Fc variante también se considera que tiene "poca o ninguna actividad de unión" a pH 7,4 si la respuesta de unión residual detectada después de que algo o toda la proteína se haya disociado a pH 7,4 es de no más de 0,2 o 0,1 nanómetros más que la detectada usando un polipéptido Fc de control usando el sistema ForteBio como se describe en el ejemplo 4.
Un "aminoácido", como se entiende en la presente memoria, se refiere a uno cualquiera de los veinte L aminoácidos habitualmente encontrados en las proteínas humanas, que son los siguientes: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.
Un "anticuerpo", como se entiende en la presente memoria, es una proteína que contiene al menos una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada o ligera, por ejemplo, un scFv, una molécula que comprende dos o más scFv y los anticuerpos de dominio que consisten esencialmente en una única región variable de inmunoglobulina (como se describe en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 7.563.443) son "anticuerpos" como se entiende en la presente memoria. En muchos casos un anticuerpo incluye una región variable de cadena pesada y una ligera más una región Fc de IgG humana. Por tanto, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos de longitud completa que contienen dos cadenas pesadas de longitud completa y dos ligeras de longitud completa, tal como los anticuerpos IgG IgA, IgD, IgD o IgM de origen natural encontrados en mamíferos. Carayannopoulos y Capra, capítulo 9 en FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3.a ed., Paul, ed., Raven Press, Nueva York, 1993, pág. 284­ 286); las partes de esta referencia que describen anticuerpos se incorporan en la presente memoria por referencia. Anticuerpos ejemplares incluyen adalimumab, (HUMIRA®, Abbott Laboratories), infliximab (REMICADE®, Centocor Ortho Biotech Inc.), ustekinumab (STELLArA®, Centocor), golimumab (SiMpONI®, Centocor Ortho Biotech), canakinumab (ILARlS®, Novartis Pharmceuticals Corporation), ofatumumab (ARZERRA®, Glaxo Group Ltd.), tocilizumab (ACTEMRA®, Chugai Seiyaku Kabushiki Corp., Japón), belimumab (BENLYSTA®, LYMPHOSTAT-B®, Human Genome Sciences, Inc.), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech), cetuximab (ERBITUX®, ImClone Systems Inc.), efungumab (MYCo Gr a B®, Novartis AB Corp.), efalizumab, (Ra PTIVA®, Genentech Inc.), etaracizumab (ABEGRIN®, Medimmune LLC), gemtuzumab ozogamicina (MYLOt A r G®, Wyeth), girentuximab (RENCAREX®, Wilex AG Corp., Alemania), natalizumab (TYSABRI®, Elan Pharmceuticals, Inc.), omalizumab (XOLAIR®, Novartis AG Corp., Suiza), oregovomab (OVAREX®, AltaRex Corp., Canadá), palivizumab (SYNAGIS®, ABBOSYNAGIS®, Medimmune Inc.). panitumumab (VECTIBIX®, Amgen Inc.), ranibizumab (LUCENTIS®, Genentech Inc.), rituximab (MABTHERA®, RITUXAN®, Idec Pharmaceuticals Corp.) tefibazumab (a Ur EXIS®, Inhibitex Corp.), tositumomab, (BEXXAR®, GlaxoSmithKline Beecham Corp.), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech Inc.) y denosumab (PROLIA® o XGEVA®, Amgen Inc.), entre muchos otros. Dichos anticuerpos IgG puede ser del isotipo IgG 1, IgG2, IgG3, o IgG4 y pueden ser anticuerpos quiméricos, humanos o humanizados. Además, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos diméricos que contienen dos cadenas pesadas y ninguna cadena ligera, tales como los anticuerpos de origen natural encontrados en camellos, otras especies de dromedario y tiburones. Véase, por ejemplo, Muyldermans et al., 2001, J. Biotechnol. 74:277-302; Desmyter et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:26285-90; Streltsov et al. (2005), Protein Science 14: 2901-2909. Un anticuerpo puede ser monoespecífico (es decir, que se une únicamente a un tipo de antígeno) o multiespecífico (es decir, que se une a más de un tipo de antígeno). En algunas realizaciones, un anticuerpo puede ser biespecífico (es decir, que se une a dos tipos diferentes de antígeno). Además, un anticuerpo puede ser monovalente, bivalente o multivalente, lo que significa que puede unirse a una o dos o más moléculas de antígeno de una vez. Algunos de los posibles formatos de dichos anticuerpos incluyen anticuerpos de longitud completa monoespecíficos o biespecíficos, anticuerpos monovalentes monoespecíficos (como se describe en la solicitud internacional WO 2009/089004 y la publicación de solicitud de Estados Unidos 2007/0105199 y la publicación de solicitud de Estados Unidos 2005/0227324) que pueden inhibir o activar la molécula a la que unen, Fv-Fc dimérico monoespecífico o biespecífico bivalente, scFv-Fc o diacuerpo Fc, scFv-Fc/Fc monovalente monoespecífico y las proteínas de unión multiespecíficas e inmunoglobulinas de dominio variable doble descritas en la publicación de Estados Unidos 2009/0311253, entre muchos otros posibles formatos de anticuerpo.
Una "región de unión", como se entiende en la presente memoria, es una región incluida en un "polipéptido Fc", un "polipéptido Fc de control" o "polipéptido Fc variante", como se describe en la presente memoria, que se une a una molécula diana tal como, por ejemplo, una proteína que se expresa a altos niveles en una célula cancerosa, una célula que media una afección autoinmunitaria o inflamatoria, una célula infectada, un agente infeccioso o una célula que media una función efector inmunitaria, por ejemplo, una célula NK. Una región de unión puede contener una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera (Vh y/o Vl) o un polipéptido que no es inmunoglobulina. Las regiones de unión ejemplares incluyen, por ejemplo, un Fv (que comprende una región VH y/o Vl unidas por un conector) o una forma soluble de un receptor humano que se une a una molécula diana.
Un "fragmento Fc", como se entiende en la presente memoria, es un polipéptido que consiste en parte o toda una región de bisagra más las regiones Ch2 y Ch3 de un anticuerpo más, opcionalmente, regiones encontradas después de la región Ch3 en algunos isotipos de origen natural tales como anticuerpos IgA o IgM. El anticuerpo puede ser del isotipo IgG, incluyendo los isotipos IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4, o del isotipo IgM, IgE, IgD o IgA el anticuerpo puede ser de origen humano o animal, por ejemplo, el anticuerpo puede ser de un mamífero, tal como un ratón, rata, hámster, conejo, cabra u oveja, o de una especie de camélido o un tiburón. Las secuencias de fragmentos de Fc de IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4 humana se divulgan en las SEQ ID NO: 1, 3, 5 y 7, respectivamente. Estas secuencias también se muestran en la tabla 1 a continuación. En general, los fragmentos de Fc forman dímeros mediante interacciones entre dominios Ch3 dentro de dos fragmentos de Fc, que se estabilizan por enlaces disulfuro que se producen entre restos de cisteína en las regiones de bisagra. Un fragmento de Fc mencionado en la presente memoria como "región Fc" se define específicamente como un fragmento de Fc dimérico, aunque se reconoce que los fragmentos de Fc en general dimerizarán en condiciones fisiológicas. Los dímeros pueden disociarse en condiciones fuertemente reductoras.
Un "polipéptido Fc", como se entiende en la presente memoria, es una proteína que comprende un fragmento de Fc y una región de unión. Los polipéptidos Fc incluyen anticuerpos, proteínas de fusión de Fc y anticuerpos o proteínas de fusión que contienen un "resto farmacológicamente activo" adicional, que es un resto orgánico no peptídico (es decir, "molécula pequeña") o un péptido, que puede actuar como toxina y/o puede imitar, antagonizar o agonizar la actividad de una ruta biológica, conjugado covalentemente o fusionado al polipéptido Fc. Los polipéptidos Fc, como los fragmentos de Fc, habitualmente forman dímeros que se estabilizan por enlaces disulfuro entre restos de cisteína en las regiones de bisagra de dos polipéptidos Fc.
Un "fragmento de Fc de control", como se entiende en la presente memoria, es un fragmento de Fc que es igual al "polipéptido Fc variante" con el que se está comparando excepto en que no tiene una inserción en un bucle como el fragmento de Fc variante. Por tanto, el "fragmento de Fc de control" tiene la secuencia sin modificar encontrada en un fragmento de Fc de origen natural en el bucle donde el fragmento de Fc variante tiene una inserción que aumenta la afinidad del fragmento de Fc variante por FcRn a pH 5 a 6. Un fragmento de Fc de control puede contener modificaciones con respecto a un fragmento de Fc de origen natural distintas de la una o más inserciones. Por ejemplo, las alteraciones de heterodimerización u otras modificaciones mínimas descritas a continuación pueden estar presentes tanto en el fragmento de Fc variante como en el fragmento de Fc de control con el que se está comparando. Por tanto, la única diferencia entre un "fragmento de Fc de control" y un "fragmento de Fc variante" es la inserción dentro de o adyacente a un bucle en el fragmento de Fc variante. Una "región Fc de control" se define como un dímero que comprende dos fragmentos de Fc de control, aunque un fragmento de Fc de control en general se esperaría que existiera en una forma dimérica.
Un "fragmento de Fc variante", como se entiende en la presente memoria, es un fragmento de Fc que incluye una inserción de no más de 80, no más de 60, no más de 40 o no más de 20 aminoácidos dentro de o adyacentes a un bucle del fragmento de Fc. Los bucles en un fragmento de Fc de IgG humana se muestran en la tabla 1, y los bucles en que se hicieron las inserciones se muestran en la figura 2. Se conocen en la técnica bucles en otros fragmentos de Fc. Se conocen numerosas secuencias en la técnica. Véase, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991, cuyas partes se refieren a las secuencias y estructura terciaria de las regiones de bisagra, Ch2 y Ch3. Kabat et al. proporciona alineaciones de numerosas secuencias. Dadas las alineaciones proporcionadas en Kabat et al., la estructura altamente conservada de dominios de inmunoglobulina y las ubicaciones de los bucles proporcionadas en la presente memoria, así como la abundante información adicional disponible en la técnica, podrían ubicarse los bucles en un fragmento de Fc de cualquier isotipo de cualquier especie. Por ejemplo, el cibersitio del Protein Data Bank contiene abundante información sobre estructuras terciarias de muchas proteínas. En algunos aspectos, los aminoácidos insertados pueden remplazar de uno a diez aminoácidos que existen de forma natural en el bucle. Los aminoácidos insertados pueden ser de menor, mayor o igual número que los aminoácidos que se retiran. En determinadas realizaciones, todos los aminoácidos originalmente en el bucle permanecen, y los aminoácidos insertados simplemente se añaden. En algunos aspectos, un fragmento de Fc de IgG humana variante puede comprender otras "modificaciones mínimas adicionales", es decir, la inserción, eliminación o sustitución de no más de dieciséis aminoácidos en ubicaciones distintas del bucle en que se produce la inserción. En algunos aspectos, puede haber no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 inserciones, eliminaciones o sustituciones de un único aminoácido en ubicaciones distintas del bucle en que se produce la inserción. En otras realizaciones, un fragmento de Fc variante no comprende ninguna modificación mínima adicional. En algunos aspectos, las modificaciones mínimas adicionales pueden ser, por ejemplo, las "alteraciones de heterodimerización" descritas a continuación, que facilitan la formación de regiones Fc heterodiméricas. En algunos aspectos, estas modificaciones mínimas adicionales pueden incluir sustituciones de aminoácido conservativas.
Las sustituciones de aminoácido conservativas incluyen las siguientes: (1) valina, leucina, o isoleucina por alanina; (2) lisina, glutamina o asparagina por arginina; (3) glutamina, glutamato o aspartato por asparagina; (4) glutamato, asparagina o glutamina por aspartato; (5) serina o alanina por cisteína; (6) asparagina, glutamato o aspartato por glutamina; (7) aspartato, glutamina o asparagina por glutamato; (8) prolina o alanina por glicina; (9) asparagina, glutamina, lisina o arginina por histidina; (10) leucina, valina, metionina, alanina o fenilalanina por isoleucina; (11) isoleucina, valina, metionina, alanina o fenilalanina por leucina; (12) arginina, asparagina o glutamina por lisina; (13) leucina, fenilalanina o isoleucina por metionina; (14) leucina, valina, isoleucina, alanina o tirosina por fenilalanina; (15) alanina por prolina; (16) treonina, alanina o cisteína por serina; (17) serina por treonina; (18) tirosina o fenilalanina por triptófano; (19) triptófano, fenilalanina, treonina o serina por tirosina; y (20) isoleucina, metionina, leucina, fenilalanina o alanina por valina.
Además, en algunos aspectos, un fragmento de Fc variante puede contener un "resto farmacológicamente activo" adicional, que es un resto orgánico no peptídico (es decir, "molécula pequeña") o un péptido, que puede actuar como toxina y/o puede imitar, antagonizar o agonizar la actividad de una ruta biológica, conjugado covalentemente o fusionado al fragmento de Fc. Si un fragmento de Fc variante contiene dicho resto farmacológicamente activo, entonces su "fragmento de Fc de control" también contiene dicho resto.
En otros aspectos, el fragmento de Fc de IgG humana variante no comprende ninguna alteración fuera de las que se producen en el bucle en que se produce la inserción. Como un "fragmento de Fc", un "fragmento de Fc variante" puede ser del isotipo IgG, incluyendo los isotipos IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4, o del isotipo IgM, IgE, IgD o IgA. Puede ser de origen humano o animal. Por ejemplo, un fragmento de Fc puede ser de un mamífero, tal como un ratón, rato, hámster, conejo, cabra u oveja, o de una especie de camélido o puede modificarse un tiburón para que produzca un fragmento de Fc variante. Como con otros fragmentos de Fc, un fragmento de Fc variante normalmente es dimérico, y una "región Fc variante" se define específicamente por como un fragmento de Fc variante dimérico.
Un "polipéptido Fc variante", como se entiende en la presente memoria, comprende un fragmento de Fc variante y una región de unión. Opcionalmente, un polipéptido Fc variante puede contener múltiples regiones de unión. Un polipéptido Fc variante puede ser un multímero, tal como un dímero, trímero, tetrámero o multímero de orden superior. En muchos casos, la parte del fragmento de Fc variante del polipéptido Fc puede formar enlaces disulfuro para dimerizar. Los polipéptidos Fc variantes incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión de Fc diméricas, anticuerpos de longitud completa tetraméricos (que contienen dos cadenas pesadas y dos ligeras), scFv-Fc diméricos, etc. Pueden ser heteromultímeros u homomultímeros, tales como heterodímeros u homodímeros. Un polipéptido Fc variante puede ser un anticuerpo, una proteína de fusión de Fc o, en algunas realizaciones, un anticuerpo o una proteína de fusión de Fc que comprende un resto farmacológicamente activo adicional que no es de anticuerpo. Dicho "resto farmacológicamente activo" puede conjugarse covalentemente o fusionarse al polipéptido Fc y puede ser un resto orgánico no peptídico (es decir, "molécula pequeña") o un péptido, que puede actuar como toxina o puede imitar, antagonizar o agonizar la actividad de una ruta biológica.
Una "proteína de fusión de Fc", como se entiende en la presente memoria, es una proteína que contiene un fragmento de Fc fusionado a otro polipéptido que no es de anticuerpo. El polipéptido que no es de anticuerpo comprende una región de unión que se une a una molécula diana y no comprende una región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo. La región de unión de una proteína de fusión de Fc puede comprender un polipéptido que no es de anticuerpo tal como una parte soluble de un receptor o uno o más péptidos que se unen a una molécula diana (tal como, por ejemplo, un "dominio monomérico", como se define en la patente de Estados Unidos 7820790 que se une a una proteína diana, que puede seleccionarse como se analiza en la patente de Estados Unidos 7820790) u otros polipéptidos. Partes de la patente de Estados Unidos 7.820.790 describen dominios monoméricos y la manera en que se seleccionan. En aspectos específicos, una proteína de fusión de Fc puede ser etanercept (ENBREL® vendido por Amgen Inc.), romiplostim (NPLATE® vendido por Amgen Inc.), alefacept (AMEVIVE®, Biogen Corp.), abatacept (ORENCiA® vendido por Bristol -Myers Squibb), rilonacept (ARCALYST®, vendido por Regeneron) o aflibercept (EYLEA™, vendido por Regeneron). Otros polipéptidos que pueden ser parte de una región de unión de una proteína de fusión de Fc incluyen polipéptidos que comprenden dominios de armazón que se han aleatorizado en determinadas posiciones y sometidos a selección para la unión a una determinada molécula diana. Dichos dominios de armazón incluyen, por ejemplo, proteína 4 asociada a linfocitos T (CTLA-4; Nuttall et al. (1999), Proteins 36: 217-227), el dominio Z de la proteína 1 de estafilococos (Nord et al. (1995), Protein Eng. 8: 601-608), proteína fluorescente verde y el décimo dominio de tipo III de fibronectina humana (f N3; Koide et al. (1998), J. Mol. Biol. 284: 1141-1151; Karatan et al. (2004), Chem. & Biol. 11: 835-844). Partes de estas referencias describen los dominios de armazón y su uso para generar dominios de unión. Las proteínas de fusión de Fc, como otras proteínas que contienen fragmentos de Fc pueden formar multímeros, que pueden ser dímeros. Estos multímeros pueden ser heteromultímeros u homomultímeros. Una proteína de fusión de Fc puede ser heterodimérica u homodimérica y biespecífica o monoespecífica.
Una "proteína de fusión de Fc variante", como se entiende en la presente memoria, es una proteína de fusión de Fc que incluye un fragmento de Fc variante.
Una "proteína de fusión de Fc de control", como se entiende en la presente memoria, es una proteína de fusión de Fc que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la proteína de fusión de Fc variante con la que se está comparando excepto por la inserción en el bucle de la parte de fragmento de Fc de la proteína de fusión de Fc variante.
Un "anticuerpo IgG de longitud completa", como se entiende en la presente memoria, es un anticuerpo IgG que comprende dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas.
Las "alteraciones de heterodimerización" en general se refieren a alteraciones en las dos cadenas, es decir, las cadenas A y B, de una región Fc dimérica que facilitan la formación de regiones Fc heterodiméricas, es decir, regiones Fc en que la cadena A y la cadena B de la región Fc no tienen secuencias de aminoácidos idénticas. Las alteraciones de heterodimerización pueden ser asimétricas, es decir, una cadena A que tiene una determinada alteración puede emparejarse con una cadena B que tiene una diferente alteración. Estas alteraciones facilitan la heterodimerización y desfavorecen la homodimerización. Que se hayan formado hetero- u homodímeros se puede evaluar por las diferencias de tamaño determinadas por electroforesis en gel de poliacrilamida en situaciones donde una cadena polipeptídica es un fragmento de Fc (es decir, que carece de secuencias distintas de las regiones de bisagra Ch2 y Ch3) y el otro es un scFv-Fc. Un ejemplo de dichas alteraciones de heterodimerización emparejadas son las llamadas sustituciones de "botones y ojales". Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 7.695.936 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2003/0078385, cuyas partes describen dichas mutaciones. Como se entiende en la presente memoria, una región Fc que contiene una pareja de sustituciones de botones y ojales, contiene una sustitución en un fragmento de Fc (denominado la cadena A) y otra en el fragmento de Fc (denominado la cadena B). Por ejemplo, se ha descubierto que las siguientes sustituciones de botones y ojales en las cadenas A y B de una región Fc de IgG1 aumentan la formación de heterodímeros en comparación con las encontradas con cadenas A y B sin modificar: 1) Y407T en una cadena y T366Y en la otra; 2) Y407A en una cadena y T366W en la otra; 3) F405A en una cadena y T394W en la otra; 4) f405W en una cadena y T394S en la otra; 5) Y407T en una cadena y T366Y en la otra; 6) t 366Y y F405A en una cadena y T394W e Y407T en la otra; 7) T366W y F405W en una cadena y T394S e Y407A en la otra; 8) F405W e Y407A en una cadena y T366W y T394S en la otra; y 9) T366W en un polipéptido de Fc y T366S, L368A e Y407V en el otro. Como se entiende en la presente memoria, las mutaciones se indican de la siguiente manera. El aminoácido (usando el código de una letra) normalmente presente en una posición dada en el fragmento Fc usando el sistema de numeración EU (véase la tabla 1 a continuación) va seguido por la posición EU, que va seguido por el aminoácido alternativo que está presente en esa posición. Por ejemplo, Y407T significa que la tirosina normalmente presente en la posición EU 407 está remplazada por una treonina. Como alternativa o además de dichas alteraciones, sustituciones que crean nuevos puentes disulfuro pueden facilitar la formación de heterodímeros. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2003/0078385, cuyas partes describen dichas mutaciones. Dichas alteraciones en una región Fc de IgG1 incluyen, por ejemplo, las siguientes sustituciones: Y349C en un fragmento de FC y S354C en el otro; Y349C en un fragmento de Fc y E356C en el otro; Y349C en un fragmento de Fc y E357C en el otro; L351C en un fragmento de Fc y S354C en el otro; T394C en un fragmento de Fc y E397C en el otro; o D399C en un fragmento de Fc y K392C en el otro. Asimismo, a sustituciones que cambian la carga de uno o más restos, por ejemplo, en la superficie de contacto Ch3-Ch3, pueden potenciar la formación de heterodímeros como se explica en la publicación internacional WO 2009/089004, cuyas partes describen dichas sustituciones. Dichas sustituciones se mencionan en la presente memoria como "sustituciones de pareja de carga" y una región Fc que contenga un par de sustituciones de pareja de carga contiene una sustitución en la cadena A y una sustitución diferente en la cadena B. Ejemplos generales de sustituciones de pareja de carga incluyen los siguientes: 1) K409D o K409E en una cadena más D399K o D399R en la otra; 2) K392D o k392E en una cadena más D399K o d 399R en la otra; 3) K439D o K439E en una cadena más D356K o D356R en la otra; y 4) K370D o K370E en una cadena más E357K o E357R en la otra. Además, las sustituciones R355D, R355E, K360D o K360R en ambas cadenas pueden estabilizar los heterodímeros cuando se usan con otras alteraciones de heterodimerización. Pueden usarse sustituciones de pareja de carga específicas en solitario o con otras sustituciones de pareja de carga. Ejemplos específicos de pares individuales de sustituciones de pareja de carga y combinaciones de las mismas incluyen las siguientes: 1) K409E en una cadena más D399K en la otra; 2) K409E en una cadena más D399R en la otra; 3) K409D en una cadena más D399K en la otra; 4) K409D en una cadena más D399R en la otra; 5) K392E en una cadena más D399R en la otra; 6) K392E en una cadena más D399K en la otra; 7) K392D en una cadena más D399R en la otra; 8) K392D en una cadena más D399K en la otra; 9) K409D y K360D en una cadena más D399K y E356K en la otra; 10) K409D y K370D en una cadena más D399K y E357K en la otra; 11) K409D y K392D en una cadena más D399K, E356K y E357K en la otra; 12) K409D y K392D en una cadena y D399K en la otra; 13) K409D y K392D en una cadena más D399K y E356K en la otra; 14) K409D y K392D en una cadena más D399K y D357K en la otra; 15) K409D y K370D en una cadena más D399K y D357K en la otra; 16) D399K en una cadena más K409D y K360D en la otra; y 17) K409D y K439D en una cadena más D399K y E356K en la otra. Cualquiera de estas alteraciones de heterodimerización puede ser parte de una región Fc variante como se describe en la presente memoria, que puede unirse a FcRn con una mayor afinidad de lo que lo hace una región Fc de control.
Un "bucle", como se entiende en la presente memoria es una parte de una estructura terciaria en un fragmento de Fc que se une a hebras beta que componen las láminas beta del plegamiento de inmunoglobulina central. Un bucle puede contener no más de dos restos consecutivos denominados como implicados en una lámina beta (como en los bucles 10 y 11; véase la tabla 1 a continuación) y también puede contener restos denominados como una hélice, un giro, un puente p aislado o un codo. Las regiones de bucle de las regiones Fc de IgG humana, como se entiende en la presente memoria, se muestran en la tabla 1.
Una "inserción dentro de un bucle" o "dentro de" cualquier tramo de aminoácidos, por ejemplo, una inserción dentro del buble 10, es una inserción de 3-35, 3-20, 6-20, 6-15, 6-12, 3-15, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoácidos entre dos aminoácidos adyacentes dentro de un bucle o entre un aminoácido dentro de un bucle y un aminoácido adyacente que no es parte del buble. Una "inserción dentro de un buble" también abarca situaciones donde se retiran aminoácidos de un bucle, y se insertan otros aminoácidos en el bucle. El número de aminoácidos insertados en el bucle puede ser de 3-35, 3-22, 4-20, 6-18, 6-15, 6-12, 3-15, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoácidos, y el número de aminoácidos retirados del bucle puede ser de menos de, igual a o más del número de aminoácidos insertados en el bucle. Por ejemplo, pueden retirarse 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos del bucle. Además, una "inserción dentro de un bucle" abarca aspectos en que se produce más de una inserción dentro del mismo bucle, tal como inserciones entre dos pares diferentes de aminoácidos que están dentro de o adyacentes a un bucle, como se describe anteriormente, o donde uno o más aminoácidos no adyacentes dentro de un bucle se eliminan y se remplazan con menos aminoácidos, el mismo número o más aminoácidos de los que se eliminaron. La colección L3 (como se muestra en la figura 2) es un ejemplo de dicho esquema de inserción.
Una "inserción dentro de o adyacente a un bucle", es como una "inserción dentro de un bucle", como se describe anteriormente excepto en que también incluye situaciones donde la inserción es entre un primer aminoácido que está adyacente al bucle y otro aminoácido que está adyacente a este primer aminoácido y está fuera del bucle.
Un "pH fisiológico", como se entiende en la presente memoria, es un pH de aproximadamente 7,2-7,6.
Un "scFv-Fc/Fc" es una proteína dimérica que consiste esencialmente en un scFv-Fc más un fragmento de Fc que están unidos por uno o más enlaces disulfuro. Además, la región Fc formada por el fragmento de Fc y scFv-Fc pueden contener "alteraciones de heterodimerización" en los dominios Ch3, tales como dos, tres o más pares de sustituciones de pareja de carga, como se describe.
Un "péptido", como se entiende en la presente memoria, es un polipéptido corto. En general, un péptido es de 2 a 80, de 2 a 60, de 2 a 50, de 2 a 40, de 2 a 30 o 2-20 aminoácidos de longitud.
Una "molécula diana", como se entiende en la presente memoria, es una molécula a la que se une la región de unión de un polipéptido Fc, como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, una molécula diana es, por ejemplo, una proteína que se expresa a altos niveles en una célula cancerosa o se expresa en una célula que media una afección autoinmunitaria o inflamatoria o en una célula infectada, en un agente infeccioso o en una célula que media una función efectora inmunitaria, por ejemplo, una célula NK.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un polipéptido Fc variante que tiene mayor afinidad por FcRn que un polipéptido Fc de control, como se describe en la presente memoria, es una cantidad que tiene el efecto de, por ejemplo, reducir o eliminar la carga tumoral de un paciente con cáncer o reducir o eliminar los síntomas de cualquier estado patológico para cuyo tratamiento se usa la proteína. Una cantidad terapéuticamente eficaz no tiene que eliminar completamente todos los síntomas de la afección, sino que puede reducir la gravedad de uno o más síntomas o retardar la aparición de síntomas más graves o una enfermedad más grave que puede producirse con alguna frecuencia después de la afección tratada. Como alternativa, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína que contiene un polipéptido Fc modificado es suficiente para afectar de forma detectable a la expresión de un biomarcador relevante cuando se administra a un paciente que necesita tratamiento in vivo.
El "tratamiento" de cualquier enfermedad mencionada en la presente memoria abarca un alivio de al menos un síntoma de la enfermedad, una reducción en la gravedad de la enfermedad o el retardo o prevención de la progresión de la enfermedad en síntomas más graves que pueden acompañar, en algunos casos, a la enfermedad o dar lugar a al menos otra enfermedad. El tratamiento no significa necesariamente que la enfermedad se cure totalmente. Un agente terapéutico útil solamente tiene que reducir la gravedad de una enfermedad, reducir la gravedad de uno o más síntomas asociados con la enfermedad o su tratamiento, o retardar la aparición de síntomas más graves o una enfermedad más grave que puede producirse con alguna frecuencia después de la afección tratada.
Polipéptidos Fc variantes
Se proporcionan polipéptidos Fc variantes que se unen FcRn, con una afinidad y/o actividad de unión a pH de 5,0 a 6,0 que los polipéptidos Fc de control. Dichos polipéptidos Fc variantes, como los polipéptidos Fc de control se unen a FcRn con baja afinidad y/o actividad de unión, si acaso a pH de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,6. Como se describe en la presente memoria, estos polipéptidos Fc variantes pueden (antes de la modificación) ser de origen humano o animal y pueden ser de un isotipo IgG, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. El FcRn también puede ser de origen humano o animal. Estos polipéptidos Fc variantes comprenden además una región de unión que puede unirse a una molécula diana, como se describe en la presente memoria, y pueden usarse para tratar una afección que está mediada, al menos en parte, por la molécula diana. En algunas realizaciones, la molécula diana puede no mediar directamente la afección tratada, sino que la unión a la molécula diana puede servir para ubicar el polipéptido Fc o la molécula o moléculas diana a las que se une. Por ejemplo, un polipéptido Fc biespecífico podría formar puentes con dos tipos celulares diferentes, por ejemplo, una célula cancerosa y una célula del sistema inmunitario, cada una de las cuales expresa una molécula diana en su superficie a la que puede unirse el polipéptido Fc. Los polipéptidos Fc variantes pueden ser anticuerpos o proteínas de fusión de Fc que comprenden un fragmento de Fc variante. Un polipéptido Fc variante podría ser, además, un anticuerpo que contiene una región de unión que no es de anticuerpo adicional. Opcionalmente, un polipéptido Fc variante puede contener un fragmento de Fc variante de IgG humana.
En la tabla 1 a continuación, se alinean las secuencias de aminoácidos de polipéptidos Fc de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humana (SEQ ID NO: 1, 3, 5 y 7, respectivamente). Las secuencias se enumeran de acuerdo con el sistema EU de Edelman et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. 63: 78-85. Como se muestra en la tabla 1, puede usarse un único número para hacer referencia a una posición que es análoga en los cuatro isotipos de IgG humana, aunque un esquema de numeración lineal forzaría a nombrar un número diferente para esta posición en cada isotipo. Por ejemplo, la asparagina en la posición 297 es un sitio de glucosilación bien conocido y altamente conservado presente en todos los anticuerpos IgG humanos que se conoce como asparagina 297, independientemente del isotipo de IgG humana en análisis.
Los anticuerpos IgG3 humanos tienen una región de bisagra mucho más larga que otros isotipos de IgG humana, y únicamente la parte más carboxiterminal en esta región de bisagra se muestra en la tabla 1. Las secuencias de IgG1, IgG2 e IgG4 humana mostradas en la tabla 1 incluyen la región de bisagra completa. Como es evidente en la tabla 1, la región de bisagra de un anticuerpo IgG4 humano es tres aminoácidos más corta que la de un anticuerpo IgG1. Los anticuerpos IgG2 humanos tienen una región de bisagra ligeramente más corta y un hueco de un aminoácido cerca del extremo aminoterminal de la región Ch2 en comparación con IgG1 humana. Los aminoácidos 216-447 mostrados en la línea de IgG1 y los aminoácidos 224-447 en la línea de IgG4 de la tabla 1 corresponden a los aminoácidos 1-232 de la SEQ ID NO: 1 y 6-229 de la SEQ ID NO: 7, respectivamente. Los aminoácidos 216-447 en la línea de IgG3 de la tabla 1, corresponden a los aminoácidos 48-279 de la SEQ ID NO: 5. Los aminoácidos 237 a 447 en la línea de IgG2 de la tabla 1 corresponden a los aminoácidos 18 a 228 de la SEQ ID NO: 3.
En la tabla 1, los aminoácidos que están ubicados en los bucles, como se entiende en la presente memoria, se muestran en negrita y están subrayados. Cada buble se marca con un número, es decir, "bucle 1", "bucle 2", etc., por debajo del mismo. En más detalle, se producen bucles en las siguientes ubicaciones: bucle 1, aminoácidos 29­ 43 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 25-39 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 76-90 de la SEQ ID NO: 5, y aminoácidos 26-40 de la SEQ ID NO: 7; bucle 2, aminoácidos 50-58 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 46-54 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 97-105 de la SeQ ID NO: 5, y aminoácidos 47-55 de la SEQ ID NO: 7; bucle 3, aminoácidos 70-72 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 66-68 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 117-119 de la SEQ ID NO: 5, y aminoácidos 67-69 de la SEQ ID NO: 7; bucle 4, aminoácidos 80-84 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 76­ 80 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 127-131 de la SEQ ID NO: 5, y aminoácidos 77-81 de la SEQ ID NO: 7; bucle 5, aminoácidos 92-103 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 88-99 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 139-150 de la SEQ ID NO: 5, y aminoácidos 89-100 de la SEQ ID NO: 7; bucle 6, aminoácidos 110-116 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 106-112 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 157-163 de la SEQ ID NO: 5, y aminoácidos 107-113 de la SEQ ID NO: 7; bucle 7, aminoácidos 122-131 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 118-127 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 169-178 de la SEQ ID NO: 5, y aminoácidos 119-128 de la SEQ ID NO: 7; bucle 8, aminoácidos 137­ 146 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 133-142 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 184-193 de la SEQ ID NO: 5, y aminoácidos 134-143 de la SEQ ID NO: 7; bucle 9, aminoácidos 158-162 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 154-158 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 205-209 de la SEQ ID NO: 5, y aminoácidos 155-159 de la SEQ ID NO: 7; bucle 10, aminoácidos 169-175 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 165-171 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 216-222 de la SEQ ID NO: 5, y aminoácidos 166-172 de la SEQ ID NO: 7; bucle 11, aminoácidos 179-188 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 175-184 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 226-235 de la SEQ ID NO: 5, y aminoácidos 176-185 de la SEQ ID NO: 7; bucle 12, aminoácidos 199-207 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 195-203 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 246-254 de la SEQ ID NO: 5, y aminoácidos 196-204 de la SEQ ID NO: 7; bucle 13, aminoácidos 214­ 221 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 210-217 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 261-268 de la SEQ ID NO: 5, y aminoácidos 211-218 de la SEQ ID NO: 7
Tabla 1: Alineación de regiones Fc de IgG humana (la alineación divulga las SEQ ID NO: 1 y 3, los restos 48-279 de la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 7, respectivamente, en orden de aparición)
225 235 245 255 265 275
i r i r i r i r i r i r
TgGl EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKF lgG2 ERKCCVE--CPPCPAPPVA-GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVOF
I gG3 EPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVOF
IgG4 ESKYG---PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSOEDPEVQF
DSSP S SS S S SSS EEEEE HHHHH TTS EEEEEE TT EE
Bucle 1 Bucle 2
285 295 305 315 325 335
I gGl NWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT
I gG2 MWYVDGMEVHNAKTKPREEOFNSTFRVVSVLTWHODWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKT
I gG3 KWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKI i gG4 mwyvdgvev hnakt k pr eeqf nst y r wsv l t vl hq dwln gkeyk ckvs nkgl pssiekt
DSSP EEEETTEEE EEEEEEE TTS EEEEEEE HHHHHHT EEEEEE TTSSS EEEE
Bucle 3 Bucle 4 Bucle 5 Bucle 6
345 355 365 375 385 395
IgGl ISKAKGQPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
IgG2 ISKTKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
IgG3 ISKTKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGOPENNYHTTP
I gG4 ISKAKGQPREPOVYTLPPSOEEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
OSSI? E B EEEEE GGGGGSSEEEEEEEEEEEBSS EEEEEETTEE EEE
Bucle 7 BucleS Bucle 9 Bucle 10
405 415 425 435 445
IgGl PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
I gG2 PMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
I gG3 PMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNIFSCSVMHEALHNRFTOKSLSLSPGK
I gG4 PVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSLGK
DSSP EE TTS EEEEEEEEEEHHHHHTT EEEEEE TTSGGG EEEEE S
Bucle 11 Bucle 12 Bucle 13
Las marcas en la quinta línea de cada grupo alineado, denominada "DSSP" (que significa Dictionary of Protein Secondary Structure) se obtuvieron de la estructura 1HZH (cadena H) disponible en el Protein Data Bank, y tienen los siguientes significados: "G" indica una hélice de 3 giros (hélice 3i0), que tiene una longitud mínima de 3 restos; "H" indica una hélice de 4 giros (hélice a), que tiene una longitud mínima de 4 restos; "I" indica una hélice de 5 giros (hélice n), que tiene una longitud mínima de 5 restos; "T" indica un giro con enlace de hidrógeno (giro 3, 4 o 5); "E" indica una hebra prolongada en conformación de lámina p paralela y/o antiparalela, que tiene una longitud mínima de 2 restos; "B" indica un resto en un puente p aislado (formación de un único par de enlaces de hidrógeno de lámina p); "S" indica un codo (la única asignación basada en enlaces que no son de hidrógeno). A los restos de aminoácido que no están en ninguna de las conformaciones anteriores se le asigna un espacio en blanco en la línea "DSSP". Estas denominaciones son convencionales en la técnica y están disponibles en la página web del Protein Data Bank (PDB).
La región de bisagra de dos fragmentos de Fc de IgG humana van desde el aminoácido 216 hasta el 230 numerados en la tabla 1. La región Ch2 se prolonga desde el aminoácido 231 hasta el 340 y la región Ch3 se prolonga desde el aminoácido 341 hasta el 447. Es evidente a partir de la alineación de la tabla 1 que las secuencias de los fragmentos de Fc de IgG humana están muy conservadas. La mayoría de las diferencias de secuencia se producen en la región de bisagra, y se producen muy pocas diferencias de secuencia en las regiones Ch2 y Ch3. Por tanto, los resultados obtenidos usando los polipéptidos Fc variantes que comprenden un fragmento de Fc variante de IgG humana que comprenden inserciones en la región Ch2 o Ch3 de un subtipo de IgG humana probablemente serán aplicables a otros subtipos de IgG humana.
Las inserciones en los polipéptidos Fc de IgG humana variantes descritos en la presente memoria pueden producirse en ubicaciones que se sabe que están en los bucles. Las inserciones pueden producirse dentro de o adyacentes a cualquiera de los bucles 1-13 (como se muestra en la tabla 1 anterior) de una parte de fragmento de Fc del polipéptido Fc. En algunos aspectos, pueden hacerse inserciones de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16 o 1-18, 6-16,10-16,12-14, 3-20, 20-30, 30-50 o 50-80 aminoácidos entre dos aminoácidos adyacentes, al menos uno de los cuales se incluye en un bucle de un fragmento de Fc. Dos cisteínas pueden incluirse de forma no aleatoria en la inserción, cada una entre los cuatro primeros y últimos aminoácidos de la inserción, para restringir los aminoácidos entre las cisteínas en un bucle apretado unido por un enlace disulfuro; los tres primeros aminoácidos de la inserción pueden ser Gly-Gly-Cys y los tres últimos aminoácidos pueden ser Cys-Gly-Gly. Puede insertarse una inserción de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 10-30 aminoácidos adicionales entre estas dos cisteínas. En otros aspectos más, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos del bucle se eliminan y remplazan por una inserción de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 o 1-18, 6-16, 10-16, 12-14, 15-30, 30-50 o 50-80 aminoácidos y/o por una inserción que contiene dos cisteínas entre los cuatro primeros y últimos aminoácidos de la inserción. El número de aminoácidos eliminados puede ser igual, menor o mayor al número de aminoácidos insertados. En otros aspectos, puede producirse más de una inserción en un único bucle. Los polipéptidos Fc variantes, que contienen las inserciones, pueden unirse a FcRn humano con una afinidad mayor a pH 5 a 6 que el polipéptido Fc de control. Los aminoácidos insertados pueden incluir los 20 aminoácidos o cualquiera de todos los aminoácidos distintos de cisteína. Además, como se describe en la presente memoria, un fragmento de Fc variante puede comprender una inserción en únicamente un bucle o en más de un bucle, tal como en 2, 3 o 4 bucles.
Las inserciones dentro de o adyacentes a los bucles 5, 8 o 10 de un fragmento de Fc pueden aumentar la afinidad de unión de dicho fragmento de Fc variante por FcRn humano a pH 5 a 6. En aspectos específicos, puede hacerse una inserción en un fragmento de Fc de IgG humana dentro de o adyacente al bucle 8 entre los aminoácidos 358 y 359 o, en determinadas realizaciones, dentro de o adyacentes al bucle 10 entre los aminoácidos 384 y 385 (usando el esquema de numeración EU como se ilustra en la tabla 1). La inserción, como se divulga y/o reivindica en la presente memoria, puede contener de 4-20, 1-18, 6-16, 10-16, 12-14, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoácidos. Opcionalmente, los aminoácidos pueden limitarse a todos los aminoácidos distintos de cisteína. En algunas realizaciones, la inserción puede contener una cisteína entre los cuatro primeros y últimos aminoácidos de la inserción. Y los aminoácidos insertados pueden limitarse de otro modo a aminoácidos distintos de cisteína. En algunas realizaciones, la inserción puede no contener cisteínas. En algunas realizaciones, la inserción puede tener una fórmula seleccionada del grupo que consiste en CXXXXXXC (SEQ ID NO: 13), CXXXXXXXC (SEQ ID NO: 14), CXXXXXXXXC (SEQ ID NO: 15), GCXXXXXXCG (SEQ ID NO: 16), GCXXXXXXXCG (SEQ ID NO: 17), GCXXXXXXXXCG (SEQ ID NO: 18), GGCXXXXXXCGG (SEQ ID NO: 19), GGCXXXXXXXCGG (SEQ ID NO: 20), y GGCXXXXXXXXCGG (SEQ ID NO: 21), GGGCXXXXXXCGGG (SEQ ID NO: 22), GGGCXXXXXXXCGGG (SEQ ID NO: 23) y GGGCXXXXXXXXCGGG (s Eq ID NO: 24), donde X representa cualquier aminoácido excepto cisteína. Como la inserción real es el resultado de un proceso de cribado como se describe en los ejemplos a continuación, son los aminoácidos aleatorizados los que probablemente desempeñan una función dominante en los cambios observados en las propiedades del fragmento de Fc. Por tanto, se contempla que un fragmento de Fc variante que tenga una inserción que contenga únicamente las posiciones aleatorizadas de inserciones que, como las anteriores, contienen algunos aminoácidos no aleatorios, pueda tener también las propiedades deseadas. Ejemplos de dicha secuencia incluyen los seis aminoácidos centrales de la SEQ ID NO: 41-53, que se muestran como la SEQ ID NO: 54-66.
En otro aspecto, los aminoácidos 308 y 309 (usando la numeración EU como se muestra en la tabla 1) dentro de o adyacentes al bucle 5 se eliminan y remplazan de 4-20, 1-18, 6-16, 10-16, 12-14, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 15-20, 20-40, 40-60 o 60-80 aminoácidos, que pueden estar limitados a todos los aminoácidos distintos de cisteína. En algunos aspectos, la inserción puede contener una cisteína entre los cuatro primeros y últimos aminoácidos de la inserción, y los aminoácidos insertados pueden limitarse de otro modo a aminoácidos distintos de cisteína. La inserción puede tener una fórmula seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 13-24.
Estos fragmentos de Fc variantes, así como los polipéptidos Fc que los contienen, que comprenden las inserciones de aminoácidos descritas anteriormente y a continuación, pueden unirse a FcRn humano a pH 5 a 6 con mayor afinidad y/o actividad de unión en comparación con un fragmento de Fc de control y pueden unirse a FcRn humano a pH fisiológico con una afinidad y/o actividad de unión comparable a o inferior a la de fragmentos de Fc de control. Además, estos fragmentos de Fc variantes pueden alterarse adicionalmente y cribarse para alteraciones que confieren afinidad y/o actividad de unión incluso mayor por FcRn humano a pH 5 a 6, afinidad y/o actividad de unión inferior por FcRn humano a pH fisiológico u otras propiedades deseables, tales como estabilidad en almacenamiento. En los ejemplos siguientes, se muestran inserciones de secuencias de aminoácidos particulares (por ejemplo, SEQ ID NO: 41-66 y 90-246) en sitios definidos dentro de un fragmento de Fc que son eficaces en aumentar la afinidad y/o actividad de unión del fragmento de Fc por FcRn humano a pH 5 a 6.
Los polipéptidos Fc variantes que comprenden los fragmentos de Fc variante de IgG humana también comprenden una región de unión que se une a una molécula diana. La unión de dichos polipéptidos Fc variantes a la molécula diana puede modular, opcionalmente antagonizar o agonizar, la actividad biológica de la molécula diana y/o puede servir para ubicar el polipéptido Fc en una ubicación donde se expresa la molécula diana. Un polipéptido Fc puede incluir más de una región de unión, tal como dos, tres o cuatro regiones de unión en un polipéptido Fc. Como un polipéptido Fc puede multimerizar formando, en algunos casos, dímeros, trímeros o tetrámeros, la multimerización de diferentes polipéptidos Fc puede formar polipéptidos Fc multiméricos que pueden unirse a más de una molécula diana. Si hay múltiples regiones de unión en un polipéptido Fc, pueden unirse a las mismas o diferentes moléculas diana o partes de una molécula diana. La modulación de la actividad de la molécula diana puede afectar a la evolución de una enfermedad o afección que está mediada al menos en parte por la molécula diana. Los polipéptidos Fc variantes de IgG humana pueden comprender una región de unión que incluye una o más regiones variables de anticuerpo que se unen a una o más moléculas diana. Dichos polipéptidos Fc variantes de IgG humana pueden ser, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa tales como anticuerpos IgG humanos, humanizados o quiméricos, scFc-Fv, formas monovalentes de anticuerpos tales como las descritas en la publicación de solicitud internación WO 2005/063816 y la publicación de solicitud de Estados Unidos 2007/0105199, que comprenden una región Fc dimérica, así como las regiones Vh, Ch1, Vl, Cl y de bisagra. Se describen formas adicionales, por ejemplo, en la figura 2 de la publicación de solicitud de Estados Unidos 2010/0286374, junto con el texto que describe y/o se refiere a la figura 2, y en la patente de Estados Unidos 5.837.821, que describe "minicuerpos" que comprenden una scFv unido a una región Fc. Como alternativa, la región de unión puede comprender la totalidad o parte de una proteína que no es de anticuerpo, opcionalmente una proteína humana, que se une a la molécula diana. Por ejemplo, la región de unión podría comprender una parte extracelular de un receptor tal como, por ejemplo, la región extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral p75 humano (SEQ ID NO: 13) o la proteína 4 asociada a linfocitos T humana (CTLA4) (SEQ ID NO: 14).
La región de unión puede comprender uno o más péptidos que se unen a una molécula diana (tal como, por ejemplo, un "dominio monomérico", como se define en la patente de Estados Unidos 7.820.790 que se une a una proteína diana, que puede seleccionarse como se analiza en la patente de Estados Unidos 7.820.790) u otros péptidos. Partes de la patente de Estados Unidos 7.820.790 describen dominios monoméricos y la manera en que se seleccionan. Un ejemplo de dicho péptido es la parte de unión de la proteína de fusión de Fc romiplostim (NPLATE®, Amgen Inc., Thousand Oaks, California). Ficha técnica, NPlAt E®, Amgen Inc., 2008-2011. Otros polipéptidos que pueden ser parte de una región de unión de una proteína de fusión de Fc incluyen polipéptidos que comprenden dominios de armazón que se han aleatorizado en determinadas posiciones y se han sometido a selección para la unión a una determinad molécula diana. Dichos dominios de armazón incluyen, por ejemplo, CTLA-4 (Nuttall et al. (1999), Proteins 36: 217-227), el dominio Z de la proteína 1 de estafilococos (Nord et al. (1995), Protein Eng. 8: 601-608), proteína fluorescente verde y el décimo dominio de tipo III de fibronectina humana (FN3; Koide et al. (1998), J. Mol. Biol. 284: 1141-1151; Karatan et al. (2004), Chem. & Biol. 11: 835-844). Partes de estas referencias describen los dominios de armazón y su uso para generar dominios de unión.
Una molécula diana, a la que se une una región de unión, puede ser una molécula donde la modulación de la actividad biológica de la molécula puede afectar a la evolución de una enfermedad o afección o puede ser una molécula ubicada en una zona enferma, por ejemplo, una proteína expresada en la superficie de células cancerosas. En una afección autoinmunitaria o inflamatoria, la molécula diana puede ser una molécula que actúa en una ruta que desempeña una función en la mediación de la afección. Una molécula diana puede ser una molécula que se ubica de modo que la unión a la molécula diana colocará a un polipéptido Fc apropiadamente de modo que pueda afectar a la evolución de una enfermedad. Por ejemplo, si un polipéptido Fc incluye una toxina, colocarlo cerca de una célula cancerosa mediante una región de unión que se une a una proteína muy expresada en las células cancerosas puede ser ventajoso. Las moléculas diana incluyen, por ejemplo, clases generales de proteínas tales como ligandos solubles, ligandos unidos a receptor, receptores solubles, receptores unidos a membrana, proteínas de canal de membrana, proteínas solubles y unidas a membrana y antígenos no proteínicos, incluyendo moléculas diana extracelulares e intracelulares. Las moléculas diana ejemplares incluyen, sin limitación, las siguientes proteínas humanas: factor de necrosis tumoral, receptor de factor de necrosis tumoral, interleucina 1, interleucina-6 (IL-6), receptor de IL-6, CD80/86, CD20, CD33, CD52, interleucina-12, interleucina-23, interleucina-17, HER2, receptor de HER2 neu, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), factor activador de linfocitos B (BAFF), ligando de RANK, OR51E2, claudinas, CDH3, CD22, factores del complemento y esclerostina, entre muchos otros.
Dependiendo en parte de la célula hospedadora en que se produce un polipéptido Fc variante y/o los métodos de purificación usados, el polipéptido Fc variante puede comprender además secuencias de aminoácidos adicionales tales como, por ejemplo, una secuencia señal que facilita la secreción en células eucariotas (que se elimina en las formas maduras de la proteína), una metionina en el extremo N para facilitar la traducción en bacterias y/o una secuencia de marca (por ejemplo, una marca de polihistidina o una marca FLAG®) para facilitar la purificación o identificación de la proteína.
Colecciones que codifican ácidos nucleicos de fragmentos de Fc variantes
En la presente memoria también se describen colecciones de ácidos nucleicos que codifican fragmentos de Fc que tienen inserciones, que están al menos parcialmente aleatorizados, que se producen dentro de o adyacentes a bucles de los fragmentos de Fc. La figura 2 ilustra el formato para cada una de las ocho colecciones que se prepararon, como se describe a continuación en los ejemplos. Las secuencias de estas colecciones y las secuencias de aminoácidos codificadas por las mismas se divulgan en las SEQ ID NO: 25-40. Dichas colecciones son útiles para paneo para seleccionar ácidos nucleicos individuales que codifican fragmentos de Fc de IgG humana variantes que se unen con afinidad potenciada a FcRn a pH 5,0 a 6,0 en comparación con un fragmento de Fc de control. Dichos polipéptidos Fc de IgG humana variantes también pueden unirse a FcRn escasamente, si acaso, a pH 7,2 a 7,6, como un fragmento de Fc de control.
En algunos aspectos, estas colecciones de ácidos nucleicos que codifican fragmentos de Fc con inserciones en regiones que codifican regiones de bucle (como se expone en la tabla 1) pueden ser de origen humano o animal, incluyendo ácidos nucleicos que codifican fragmentos Fc de ratón, rata, conejo o mono o fragmentos de Fc de una especie de camélido. Como se describe en la presente memoria, el fragmento de Fc codificado puede ser un fragmento de Fc de IgG, tal como un fragmento de Fc de IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4, o un fragmento de Fc de un isotipo IgA, IgE, IgD e IgM. Las inserciones en las partes de los ácidos nucleicos que codifican los bucles pueden estar dentro de o adyacentes a las secuencias nucleotídicas que codifican el bucle 1, bucle 2, bucle 3, bucle 4, bucle 5, bucle 6, bucle 7, bucle 8, bucle 9, bucle 10, bucle 11, bucle 12 o bucle 13 como se muestra en la tabla 1.
El tamaño de la colección, en comparación con el número de variantes diferentes en la colección, es una consideración importante. En un mejor caso, el procedimiento de paneo al que se somete la colección tendrá una alta probabilidad de incluir todas las variantes diferentes que se incluyen en la colección. El número de variantes diferentes en la colección depende del número de posiciones aleatorizadas en la colección y el número de aminoácidos diferentes que pueden usarse en cada posición aleatorizada. Por ejemplo, una colección que tiene seis posiciones aleatorizadas que pueden contener cualquiera de 19 aminoácidos diferentes puede tener teóricamente 196 = 4,7 x 107 variantes diferentes. Si, por ejemplo, se someten a paneo 109 fagos o bacterias independientes que expresan esas variantes, hay una probabilidad muy alta de que se recuperen todos los aislados con las propiedades seleccionadas en el cribado. Véase, por ejemplo, Grossman y Turner, Mathematics for the Biological Sciences, Capítulo 2, Sección 2.9, pág. 97-104, Macmillan Publishing Co., Inc., Nueva York y Collier Macmillan Publishers, Londres, 1974. Se contemplan colecciones de un tamaño que hace posible cribar aislados suficientes para detectar aislados infrecuentes con las propiedades deseadas. Por tanto, se contemplan colecciones que codifican de 105 a 1013, de 106 a 1012 o de 107 a 1010 variantes diferentes.
Pueden ser ventajosas colecciones con inserciones aleatorizadas dentro de o adyacentes a secuencias nucleotídicas que codifican los bucles 5, 8 y 10 de la parte que codifica el fragmento de Fc. Dichas colecciones pueden codificar fragmentos de Fc con inserciones dentro de o adyacentes a los bucles 5, 8 o 10 que contienen 20-40, 4-20, 1-18, 6-16, 10-16, 12-14, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoácidos aleatorizados. Estos aminoácidos aleatorizados pueden estar flanqueados por restos de cisteína. Como se describe en la presente memoria, también pueden insertarse aminoácidos no aleatorizados adicionales antes o después de los aminoácidos aleatorizados; los aminoácidos aleatorizados codificados pueden estar precedidos por Gly-Gly-Cys y seguidos por Cys-Gly-Gly.
Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos Fc variantes, fragmentos de Fc e inserciones
También se describen ácidos nucleicos que codifican fragmentos de Fc variantes específicos, que pueden ser parte de un polipéptido Fc variante, y ácidos nucleicos que codifican inserciones dentro de o adyacentes a bucles de fragmentos de Fc variantes. Las secuencias nucleotídicas que codifican fragmentos de Fc son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991) y secuencias que codifican fragmentos de Fc IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humana (SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8, respectivamente) se presentan en la presente memoria. Las ubicaciones de los bucles dentro de los fragmentos de Fc están delimitadas (tabla 1) y en la presente memoria se describen diversos tipos de inserciones en estas regiones. También se presentan secuencias que codifican inserciones de aminoácidos que aumentan la unión a FcRn a pH en el intervalo de 5 a 6 (véanse, por ejemplo, las SEQ ID NO: 41 -53).
Más en general, en la presente memoria se describen ácidos nucleicos que codifican un fragmento de Fc variante que tiene una inserción dentro de o adyacente a un bucle, en el que el fragmento de Fc puede unirse a FcRn humano con mayor afinidad a pH 5-6 que un fragmento de Fc de control. Las posiciones en que se producen dichas inserciones incluyen los bucles 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 dentro del polipéptido Fc.
Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos Fc variantes pueden usarse para producir polipéptidos Fc variantes introduciendo los ácidos nucleicos en células hospedadoras, incluyendo células hospedadoras procariotas o eucariotas, y cultivando las células en condiciones de modo que se expresará la una o más proteínas codificadas por los ácidos nucleicos. El polipéptido Fc variante puede recuperarse de la masa celular o el sobrenadante de cultivo. Dichos polipéptidos pueden purificarse por métodos bien conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de interacción hidrófoba, entre otros métodos disponibles.
Métodos de aislamiento y preparación de fragmentos de Fc y polipéptidos Fc variantes
Los fragmentos de Fc variantes pueden aislarse usando procedimientos de cribado descritos en detalle en los ejemplos a continuación. En términos amplios, se prepara una colección de ácidos nucleicos que codifican fragmentos de Fc con inserciones que incluyen aminoácidos aleatorizados dentro de o adyacentes a un bucle. Esta colección entonces se introduce en un virus o una célula, que se cultiva en condiciones tales que se puedan expresar los ácidos nucleicos de la colección, de modo que el virus (que puede ser, por ejemplo, un baculovirus o un fago filamentoso) o célula (que puede ser, por ejemplo, una célula bacteriana, de levadura o de mamífero) pueda presentar los fragmentos de Fc que contienen las inserciones. En un aspecto alternativo, la colección puede traducirse in vitro en un sistema de presentación de ribosoma de modo que los fragmentos de Fc con las propiedades deseadas, y los ácidos nucleicos que los codifican puedan seleccionarse de esta mezcla. Como alternativa, puede usarse un sistema de presentación CIS. Véase, por ejemplo, Odegrip et al. (2004), Proc. Natl. Acad. Sci. 101(9): 2806-2810. En los métodos descritos en la presente memora, los fragmentos de Fc variantes que pueden unirse a FcRn humano con mayor afinidad en comparación con un fragmento de Fc de control dentro del intervalo de pH de 5 a 6 pueden enriquecerse por paneo con FcRn como se describe en los ejemplos a continuación y cribarse para usar, por ejemplo, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), que puede realizarse inicialmente en grupos de aislados o en aislados individuales. Si se realiza inicialmente ELISA en grupos de aislados, estos aislados pueden amplificarse y volver a cribarse individualmente para obtener aislados individuales que expresen un fragmento de Fc variante con afinidad potenciada por FcRn humano a pH 5-6 y con afinidad inferior o aproximadamente la misma por FcRn humano a pH fisiológico en comparación con un fragmento de Fc de control.
En etapas adicionales, los ácidos nucleicos que codifican los fragmentos de Fc variantes pueden aislarse de fagos o células, tales como bacterias, células de levadura o mamífero, o amplificarse a partir de ARN en el caso de presentación en ribosoma. Estos ácidos nucleicos pueden secuenciarse para determinar la posición exacta y la naturaleza de la inserción. Usando esta información, pueden construirse ácidos nucleicos que codifican un polipéptido Fc variante o fragmento de Fc variante deseado usando métodos bien conocidos en la técnica. Puede emprenderse modificación adicional del ácido nucleico que codifica el fragmento Fc o polipéptido Fc variante, si se desea.
Dichos ácidos nucleicos pueden insertarse en vectores apropiados para la célula hospedadora en que se expresará el polipéptido Fc o fragmento de Fc. Estos ácidos nucleicos pueden introducirse en las células hospedadoras por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica. Las células hospedadoras que podrían usarse incluyen bacterias, incluyendo Escherichia coli, levaduras, incluyendo Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, células de insecto, células vegetales y células de mamífero, incluyendo células de ovario de hámster chino (CHO), células 293 y células de riñón de cría de hámster (BHK), entre muchas otras. Estas células hospedadoras pueden cultivarse en condiciones tales que se expresarán los ácidos nucleicos introducidos, y pueda recuperarse el polipéptido Fc o fragmento de Fc del sobrenadante de cultivo o la masa celular.
En general, el procedimiento usado para introducir los ácidos nucleicos en las células hospedadoras puede depender de la célula hospedadora en la que tienen que introducirse los ácidos nucleicos. Los métodos de introducción de ácidos nucleicos en bacterias son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, habitualmente se usa electroporación o transformación con cloruro de calcio. Los métodos para la introducción de ácidos nucleicos en levaduras son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, métodos de transformación usando acetato de litio y polietilenglicol. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del uno o más polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos.
Los vectores de expresión usados en cualquiera de las células hospedadoras contendrán secuencias para el mantenimiento del plásmido y para la clonación y expresión de secuencias nucleotídicas exógenas. Dichas secuencias típicamente incluirán una o más de las siguientes secuencias nucleotídicas: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación de la transcripción, una secuencia intrónica completa que contiene un sitio de ayuste donador y aceptador, una secuencia que codifica una secuencia líder para la secreción del polipéptido, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región policonectora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido a expresar y un elemento marcador de selección.
Usos terapéuticos de polipéptidos Fc variantes
Los polipéptidos Fc variantes descritos en la presente memoria pueden usarse como agentes terapéuticos para seres humanos para una diversidad de afecciones. Que un polipéptido Fc variante sea apropiado para dicha afección puede determinarse mediante la una o más regiones de unión del polipéptido Fc, así como posiblemente otros aspectos de su estructura tales como, por ejemplo, un resto tóxico adherido. Los polipéptidos Fc variantes pueden haber aumentado las semividas in vivo en comparación con los polipéptidos Fc de control y, por lo tanto, pueden requerir dosificaciones inferiores y/o menos frecuentes que los polipéptidos Fc de control. Por tanto, los polipéptidos Fc variantes podrían ser muy adecuados para tratar afecciones crónicas, donde es particularmente deseable una dosificación menos frecuente. Sin embargo, un polipéptido Fc variante puede usarse como tratamiento de la mayoría o todas las afecciones que se pueden tratar usando un polipéptido Fc de control (que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido Fc variante, excepto en que no tiene la inserción en un bucle). Los polipéptidos Fc variantes descritos en la presente memoria también pueden usarse simultáneamente con otras medicaciones usadas para tratar la afección que se está tratando.
Por ejemplo, una proteína de fusión de Fc que es un polipéptido Fc variante que contiene una inserción en un bucle puede usarse como tratamiento para las mismas afecciones que se usa un polipéptido Fc de control. Sin embargo, la cantidad y/o frecuencia de dosificación del polipéptido Fc variante puede ser diferente a causa de su semivida aumentada. Por ejemplo, un polipéptido Fc variante podría prepararse partiendo de una proteína de fusión de Fc terapéutica tal como etanercept (que está indicada para artritis reumatoide de moderada o grave, artritis idiopática juvenil poliarticular, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante y psoriasis en placas de moderada a grave), abatacept (que está indicada para artritis reumatoide de moderada a grave, artritis idiopática juvenil poliarticular de moderada a grave) o romiplostim (que está indicada para púrpura trombocitopénica inmunitaria crónica) insertando una de las inserciones que potencian la unión a FcRn divulgada en la presente memoria, por ejemplo, las SEQ ID NO: 41-53, en un bucle en la parte del fragmento de Fc de cada una de estas moléculas. La inserción podría generarse, por ejemplo, dentro de o adyacente a los bucles 5, 8 o 10 de la parte del fragmento de Fc de la proteína de fusión de Fc. Dichas formas variantes de etanercept, abatacept o romiplostim podrían usarse para tratar las mismas enfermedades que pueden tratarse usando etanercept, abatacept o romiplostim inalteradas.
Asimismo, si el polipéptido Fc variante es un anticuerpo terapéutico tal como, por ejemplo, adalimumab, ustikinumab, golimumab, natalizumab, infliximab o denosumab, dicha forma variante del anticuerpo que comprende un fragmento de Fc variante puede usarse para tratar las mismas enfermedades para las que se usan estos anticuerpos, en una forma inalterada, para tratarlas. Por tanto, un fragmento de Fc variante, como se describe en la presente memoria, puede cambiar la cantidad de dosificación o frecuencia del tratamiento, pero no la afección para la que se usa el polipéptido Fc para tratarla.
En general, los polipéptidos Fc se usan para tratar una amplia diversidad de enfermedades incluyendo indicaciones oncológicas, afecciones autoinmunitarias e inflamatorias, afecciones relacionadas con los huesos, afecciones, afecciones metabólicas y afecciones neurológicas tales como, por ejemplo, dolor crónico, entre muchas otras.
Composiciones farmacéuticas
La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los fragmentos de Fc variantes o polipéptidos Fc variantes descritos en la presente memoria. Dichas composiciones pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido Fc variante o fragmento de Fc variante con uno o más componentes adicionales tal como un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Dichos componentes adicionales pueden incluir tampones, glúcidos, polioles, aminoácidos, agentes quelantes, estabilizantes y/o conservantes, entre muchas posibilidades.
Métodos de administración
Los polipéptidos Fc variantes o fragmentos de Fc variantes o composiciones farmacéuticas que contienen estas moléculas, pueden administrarse por cualquier método factible. Los agentes terapéuticos que comprenden una proteína se administrarán habitualmente por inyección ya que la administración oral, en ausencia de una formulación o circunstancia especial, daría lugar a hidrólisis de la proteína en el entorno ácido del estómago. La inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarterial, intralesional o peritoneal son vías posibles de administración. La administración tópica también es posible, especialmente para enfermedades que implican la piel. Como alternativa, los polipéptidos Fc variantes o fragmentos de Fc variantes pueden administrarse a través del contacto con una membrana mucosa, por ejemplo, por administración intranasal, sublingual, vaginal o rectal o como un inhalante. Como alternativa, determinadas composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido Fc variante o fragmento de Fc variante pueden administrase por vía oral.
Habiendo descrito la materia en cuestión que se refiere a la invención en términos generales anteriormente, se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración.
Ejemplos
Ejemplo 1: Creación de un modelo de la estructura terciaria de FcRn humano:Fc de IgG1 humana
Par ayudar al diseño de las colecciones descritas a continuación, se creó un modelo de homología de la estructura terciaria de un FcRn humano en un complejo con un fragmento de Fc de IgG1 humana basándose en la estructura de un complejo de un FcRn de ratón y un fragmento de Fc de IgG de rata disponible en Protein Data Bank (número de acceso a PDB 1FRT). Se hizo una búsqueda en Protein Data Bank (PDB) con secuencias se aminoácidos del fragmento de Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 1) y las cadenas de a y p-2-microglobulina (p2m) de FcRn humano, SEQ ID NO: 9 y 10, respectivamente. Se obtuvieron varios moldes basándose en la homología de secuencia de aminoácidos y la estructura terciaria. Las estructuras de cadena a de FcRn (1EXU (cadena A), 1FRT (cadena A), y 1I1A (cadena A)), las estructuras de cadena p2m de FcRn (1CE6 (cadena B), 1Hs A (cadena B), 1YPZ (cadena B), 1HHG (cadena B) y 1I1A (cadena B)), y las estructuras de Fc 1h Zh (cadena H), 1I1A (cadena C), 1o Qo (cadena A), 1T83 (cadena A) y 2J6E (cadena A)) se seleccionaron. Las estructuras a de FcRn 1EXU (cadena A), 1FRT (cadena A) y 1I1A (cadena A) se superpusieron y los valores de la desviación de la media cuadrática resultante (RMSD), es decir, el promedio de la distancia entre átomos análogos en estructuras proteínicas superpuestas, son de 0,30 Á a 0,76 Á, dentro de valor medio de 0,59 Á. Los valores de RMSD entre las estructuras de dominio p2m de FcRn 1CE6 (cadena B), 1HSA (cadena B), 1y Pz (cadena B), 1HHG (cadena B) y 1I1A (cadena B) varían de 0,30 Á a 0,76 Á dentro del valor medio de 0,59 Á. Los valores de RMSD entre las estructuras de Fc 1HZH (cadena H), 111A (cadena C), 10QO (cadena A), 1T83 (cadena A) y 2J6E (cadena A) varían de 0,30 Á a 0,76 Á dentro del valor medio de 0,59 Á. Estos valores de RMSD indican que las estructuras de FcRn y Fc de molde de diferentes fuentes comparten estructuras terciarias muy similares.
Basándose en estas estructuras de molde y las secuencias de aminoácidos de FcRn humano (hFcRn) y el fragmento de Fc de IgG 1 humana (Fc hIgG1), se creó un modelo de homología del complejo de hFcRn:Fc hIgG1 usando un módulo de modelado molecular basado en Linux del programa informático Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group, Montreal, Quebec, Canadá). La figura 1 muestra la parte de este complejo modelado donde el Fc de hIgG1 (debajo) y el hFcRn (arriba) entran en contacto muy estrecho, así como algunas zonas adyacentes de estas proteínas.
Ejemplo 2: Construcción de las colecciones de inserción
Se construyeron ocho colecciones que codifican regiones Fc de IgG1 humana variantes, teniendo cada colección diferentes tipos de inserciones. La figura 2 muestra la secuencia de región Fc de IgG1 humana y las posiciones y el formato de las seis colecciones de inserción. Las posiciones de los bucles en que se insertaron las colecciones de inserción descritas a continuación se indican en las figuras 1 y 2 como L1, L2A, L2B, L3, L4, L5, L6A y L6B. Algunos sitios de inserción en el Fc están entre los puntos más cercanos de contacto entre Fc de hIgG1 y hFcRn (tales como L1, L2A, L2B y L3) y otros (L4, L5, L6A y L6B) están a alguna distancia de los puntos más cercanos de contacto entre hFc y hFcRn.
Como se muestra en la figura 2, en algunas de las colecciones, tales como L1, L2A, L2B y L3, se eliminaron aminoácidos dentro de un bucle y se remplazaron con aminoácidos aleatorizados, en la mayoría de los casos con un número ligeramente mayor de aminoácidos que el que se había eliminado. Los aminoácidos aleatorizados incluyen todos los aminoácidos distintos de cisteína. En la colección L2B, seis aminoácidos aleatorizados estaban precedidos por la secuencia Gly-Gly-Cys y seguidos por la secuencia Cys-Gly-Gly. Como se esperaría que las dos cisteínas formaran un puente disulfuro dada su proximidad, se esperaría que los seis aminoácidos aleatorizados entre las cisteínas formaran un bucle restringido espacialmente. Por ejemplo, en L2B, seis aminoácidos aleatorizados estaban precedidos por la secuencia Gly-Gly-Cys y seguidos por la secuencia Cys-Gly-Gly, creando de este modo bucles restringidos espacialmente que contienen los aminoácidos aleatorizados. En otras colecciones, es decir, L4 y L5, se insertaron aminoácidos aleatorizados sin eliminar ningún aminoácido normalmente presente.
Se usaron dos rondas de PCR para construir las colecciones L1, L2A, L2B, L3, L4 y L5 que codifican un grupo de fragmentos de Fc variantes de IgG 1 humana. El molde usado en la primera y segunda serie de reacciones de PCR en la primera ronda de reacciones fue un vector fagómido en que se había insertado ADN que codifica un fragmento de Fc IgG 1 humana (SEQ ID NO: 2) para permitir su expresión como parte de una proteína de envuelta del fago en cepas bacterianas apropiadas (pIgG1-Fc). La primera serie de reacciones de PCR en la primera ronda de reacciones usada para generar las colecciones utilizó cebadores directos e inversos para crear fragmentos de PCR que contenían un sitio para la enzima de restricción ApaLI en el extremo en dirección 5'. El siguiente cebador directo, que coincidía con las secuencias de vector en dirección 5' de la región que codifica el fragmento de Fc, se usó para toda la primera serie de reacciones de PCR en la primera ronda de reacciones: 5'-GTTCCT TTC TAT TCTCAC-3' (SEQ ID NO: 521). Los cebadores inversos, que estaban dentro de las secuencias codificantes de Fc, fueron los siguientes: 5'-GAG GGT GTC CTT GGG TTT TGG GGG-3' (SEQ ID NO: 522; colección L1); 5'-GGT GAG GAC GCT GAC CAC ACG GTA-3' (SEQ ID NO: 523; colecciones L2A y L2B); 5'-ATG CAT CAC GGA GCA TGA GAA GAC-3' (SEQ ID NO: 524; colección L3); 5'-ATT ATG CAC CTC CAC GCC GTC CAC-3' (SEQ ID NO: 525; colección 4); y 5'-ATT GCT CTC CCA CTC CAC GGC GAT-3' (SEQ ID NO: 526; colección L5).
Una segunda serie de reacción de PCR en la primera ronda de reacciones también usó pIgG1-Fc como molde y usó un oligonucleótido que coincidía con el complemento de las secuencias del vector en dirección 3' desde las secuencias que codifican Fc como cebador inverso. Este cebador inverso tenía la siguiente secuencia: 5'-CCC ATT CAG ATC CTC TTC-3' (SEQ ID NO: 527). Los cebadores directos usados para estas reacciones fueron los siguientes: colección L1, 5'-AAA CCC AAG GAC ACC CTC (TRIM)6 ACC CCT GAG GTC ACA TGC-3' (SEQ ID NO: 528); colección L2A, 5'-GTG GTC AGC GTC CTC ACC (TRIM)6 CAC CAG GAC TGG CTG AAT-3' (SEQ ID NO: 529); colección L2B, 5'-GTG GTC AGC GTC CTC ACC GGT GGT TGT (TRIM)6 TGT GGT GGT CAC CAG GAC TGG CTG AAT-3' (SEQ ID NO: 530); colección L3: 5'-TCA TGC TCC GTG ATG CAT (TRIM)s CAC (TRIM)1 CAC TAC ACG CAG AAG AGC-3' (SEQ ID NO: 531); colección L4: 5'-GGC GTG GAG GTG CAT AAT GGT GGT TGT (TRIM)6 TGT GGT GGT GCC AAG ACA AAG CCG CGG-3' (SEQ ID NO: 532); y colección L5: 5'-GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT (TRIM)6 TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC AAC-3' (SEQ ID NO: 533). En estos oligonucleótidos, "TRIM" representa una mezcla de trinucleótidos que codifican todos los aminoácidos excepto cisteína (mezcla 2 de fosforamidita trimérica, n.° de catálogo de Glen Research 13-1992-95). La mezcla es una mezcla equimolar de los siguientes trinucleótidos: AAA, AAC, ACT, ATC, ATG, CAG, CAT, CCG, CGT, CTG, GAA, GAC, GCT, GGT, GTT, TAC, TCT, TGG, TTC. Por tanto, los codones que codifican todos los aminoácidos excepto cisteína estaban representados de forma aproximadamente igual en la mezcla TRIM. Por tanto, "(TR IM y significa que se incluyen seis trinucleótidos aleatorios que codifican cualquier aminoácido excepto cisteína en el oligo.
En una segunda ronda de reacciones de PCR (una para cada colección), los productos de la primera y segunda serie de reacciones de PCR de la primera ronda descrita anteriormente sirvieron como moldes. Los cebadores usados fueron los mismos para todas las colecciones y fueron los siguientes: 5'-GTT CCT TTC TAT TCT CAC-3' (directo; SEQ ID NO: 534) y 5'-CCC ATT CAG ATC CTC TTC-3' (inverso; SEQ ID NO: 535).
Las colecciones L6A y L6B se construyeron en una ronda de PCR, usando pIgG1-Fc como molde. En la reacción de PCR descrita a continuación, se cambió un sitio de restricción XmaI (5'-CCCGGG-3') en la región codificante para el fragmento de Fc a un sitio de restricción XhoI (5'-CTCGAG-3") debido a las secuencias de los cebadores. Estas alteraciones fueron mutaciones sinónimas que no codificaban diferentes aminoácidos del pIgG1-Fc no modificado y se hicieron porque una digestión de restricción con XhoI más NotI era más eficaz que una digestión con XmaI más NotI. Los cebadores directos usados para estas reacciones fueron los siguientes: colección L6A: 5'-CTG CCC CCA TCT CGA GAT GAG CTG GGT TGT (TRIM)8 TGT GGT GGT ACC AAC CAG GTC AGC CTG ACC-3' (SEQ ID NO: 536); y colección L6B: 5'-CTG CCC CCA TCT CGA GAT GAG CTG GGT TGT (NNK)e TGT GGT GGT ACC AAC CAG GTC AGC CTG ACC-3' (SEQ ID NO: 537). La secuencia del cebador inverso fue 5'-GGC CCC GTG ATG GTG ATG ATG-3' (SEQ ID NO: 538). En L6B, se usó una mezcla de trinucleótidos llamada NNK, que contiene trinucleótidos que codifican los veinte aminoácidos en 32 codones degenerados. En esta mezcla trinucleotídica, "N" representa una posición aleatorizada que es adenosina, guanidina, citidina o timidina y "K" representa una posición parcialmente restringida que es guanidina o timidina.
Para todas las reacciones de PCR, se usaron kits esenciales de PCR (Roche, n.° de catálogo 11 578 553 001) con las siguientes condiciones de reacción: 95 °C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 95 °C durante 45 segundos - 55 °C durante 45 segundos - 72 °C durante 90 segundos y finalmente 72 °C durante 10 minutos. En ADN de las reacciones de PCR se purificó usando kits de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN, 28104). Se digirieron aproximadamente 200 gg de ADN de vector fagómido y 10 gg de producto de PCR purificado (de la tercera ronda de reacciones de PCR) con ApaLI y NotI (para las colecciones L1-L5) y XhoI y NotI (para las colecciones L6A y L6B). El ADN digerido se purificó en gel con kits de purificación de gel QIAquick (QIAGEN, 28704).
El ADN de vector digerido y los productos de PCR de las colecciones en una relación molar de 1:2 se ligaron usando ADN ligasa T4 (New England Biolabs). La mezcla se incubó a 16 °C durante una noche. El ADN se purificó por precipitación en etanol. Se sometió a electroforesis un total de 25 gg de ADN en 1000 gl de células de E. coli XL1 blue electrocompetentes (Stratagene) en un campo de 2,5 kV usando resistencia de 200 Q y capacitancia de 25 gF para obtener aproximadamente 1 x 109 transformantes de E. coli. Los tamaños exactos de las colecciones variaban de 7 x 108 (para L5) a 1,8 x 109 (para L4). Las células se inocularon en 1000 ml de medio YT 2x (que contiene 16 g/l de triptona Bacto, 10 g/l de extracto de levadura Bacto y 5 g/l de NaCl a un pH de 7,0-7,2) que contenía 100 gg/ml de ampicilina y glucosa al 2 % y se cultivaron hasta que la DO600 fue de aproximadamente 0,5. Después de añadieron aproximadamente 3 x 109 unidades formadoras de placas por mililitro (UFP/ml) del fago auxiliar M13, y el cultivo se incubó a 37 °C durante 1 h. Las células infectadas entonces se centrifugaron y resuspendieron con 1000 ml de medio YT 2x que contenía 100 gg/ml de ampicilina y 40 gg/ml de kanamicina. Las células se cultivaron a 30 °C durante una noche. El fago entonces se precipitó con PEG 6000.
Todas las colecciones usadas en estas transformaciones, distintas de L6A y L6B, contenían seis codones aleatorizados, cada uno de los cuales codificaba diecinueve aminoácidos diferentes y, por lo tanto, se esperaría que codificaran aproximadamente 4,7 x 107 (196) fragmentos de Fc variantes diferentes. Asimismo, se esperaría que L6A codificara aproximadamente 1,76 x 1010 (208) fragmentos de Fc variantes diferentes, ya que contenía ocho codones aleatorizados que codificaban cualquiera de los 20 aminoácidos diferentes. Para colecciones distintas de las colecciones L6A y L6B, dado el número esperado de diferentes variantes en cada colección, los tamaños de colección de aproximadamente 109 (que varían de 7 x 108 a 1,8 x 109) eran 7-33 veces el número de variantes.
Ejemplo 3: Cribado de las colecciones de bucle de Fc
Se realizaron dos rondas de paneo para fagos que expresan fragmentos de Fc variantes que se unen a FcRn con afinidad aumentada en comparación con un fragmento de Fc de tipo silvestre a pH 6,0 (y que tiene una baja afinidad de unión a pH 7,4) de la siguiente manera. En la primera ronda, el fago se resuspendió en un líquido que contenía 0,4 de MES 20 mM, pH 6,0, leche desnatada al 5 %, Tween 20 al 0,05 %. Cada uno de los cuatro pocillos de una inmunoplaca MAXISORP™ (Nunc, Rochester, NY) se recubrió con 10 pg de hFcRn y se bloqueó con leche desnatada al 5 % y se añadieron 100 pl de fago a 5 x 1011 UFP/ml. Después de 1 h de incubación a 37 °C, los pocillos se lavaron 3-10 veces con MES 20 mM, pH 6,0, Tween 20 al 0,2 %. El fago se eluyó añadiendo 100 pl de disolución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 a cada pocillo e incubando la placa durante 1 h a 37 °C. Estos fagos se usaron para reinfectar un cultivo de E. co liXL1 blue en crecimiento exponencial, que se cultivó hasta que alcanzó una DO600 de aproximadamente 0,5. Después se añadieron aproximadamente 3 x 109 UFP/ml del fago auxiliar M13 y el cultivo se incubó a 37 °C durante 1 h. Las células infectadas entonces se centrifugaron y se resuspendieron con 1000 ml de medio YT 2x que contenía 100 pg/ml de ampicilina y 40 pg/ml de kanamicina. Las células se cultivaron a 30 °C durante una noche. El fago entonces se precipitó con PEG6000.
Usando estos fagos, se realizó una segunda ronda de paneo usando esencialmente los mismos métodos usados en la primera ronda. La rigurosidad del paneo se aumentó ligeramente reduciendo la concentración de FcRn recubierto sobre las placas de microvaloración ligeramente y aumentando el número de lavados. El fago eluido, después de lavar varias veces se usó para reinfectar un cultivo de E. coli XL1 blue en crecimiento exponencial a una DO600 de aproximadamente 0,5, que después se cultivó durante una hora a 37 °C y se sembró en placas que contenían aproximadamente 100 pg/ml de ampicilina y kanamicina para obtener colonias.
Se inocularon colonias individuales en placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contenían 120 pl/pocillo de medio YT 2x que contenía 100 pg/ml de ampicilina y glucosa al 2 %. Las células se cultivaron a 37 °C en un agitador hasta que se alcanzó una DO600 de aproximadamente 0,5. Después, se añadieron 3 x 109/ml de fago auxiliar M13 a cada pocillo y se encubaron durante 1 h. Las células entonces se centrifugaron y resuspendieron con 180 pl/pocillo de medio Yt 2x que contenía 100 pg/ml de ampicilina y 40 pg/ml de kanamicina. El cultivo entonces se incubó a 30 °C durante una noche en un agitador.
Se añadieron aproximadamente 100 pl de FcRn humano biotinilado a 2 pg/ml a los pocillos de placas MAXISORP™ con 10 pg/ml de estreptavidina. Después de lavar con PBS más Tween 20 al 0,05 % (PBST) cinco veces, se añadió el fago de los cultivos de una noche en tampón MES a pH 6,0 o pH 7,4 a las placas y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Se usó anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) para detectar el fago de unión, y las placas se puntuaron mediante un lector de placa de microvaloración usando una longitud de onda en el intervalo visible. Se seleccionaron los positivos basándose en una señal superior a pH 5,5 (aproximadamente un 150 % de la señal generada por un fragmento de Fc de control) y una señal que era comparable a la de un fragmento de Fc de control o inferior a pH 7,4. En una segunda ronda de cribado en que se ensayó una única placa de microvaloración de 96 pocillos de colonias aisladas para cada colección, no se detectaron positivos para las colecciones L2B, L3 o L4. Aproximadamente un 20 % de las colonias recogidas para la colección L2A eran positivas, así como aproximadamente un 10 % de las colonias recogidas para las colecciones L6A y L6B. La colección L5 era claramente distinguible de todas las demás colecciones ya que aproximadamente un 90 % de las colonias recogidas eran positivas. Por tanto, la colección L5 era, por amplio margen, la colección que producía la mayoría de positivos. Estos datos indican que el sitio en que se insertan la colección 5 es particularmente favorable para el aislamiento de variantes que aumentan la unión a FcRn a pH 5-6, mientras se mantiene la baja afinidad del fragmento de Fc por FcRn a pH fisiológicos.
Se seleccionaron positivos de las colecciones L2A, L5, L6A y L6B, que se secuenciaron y caracterizaron adicionalmente como se describe a continuación. La unión se evaluó por un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) cuantitativo. Las puntuaciones de ELISA reflejan la afinidad de unión, significando puntuaciones mayores mayor afinidad. Típicamente, puntuaciones mayores de aproximadamente 3 ~ 5 indican unión por encima del fondo. Las secuencias de las inserciones de estos positivos y sus puntuaciones en un ELISA se muestran en la tabla 2 a continuación. Para la colección L5, las inserciones están entre N169 y G170 de acuerdo con la numeración de la figura 2. Para las colecciones 6A y 6B, las inserciones están entre L143 y T144 de acuerdo con la numeración de la figura 2.
Tabla 2: Secuencias y puntuaciones de ELISA de positivos seleccionados
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*Como estas muestras de control se midieron múltiples veces, estos resultados se presentan como un intervalo. "WT" "phg" y "medios" significan, respectivamente, fago que expresa un fragmento de Fc de control, fago que no expresa fragmento de Fc y sin fago.
Ejemplo 4: Estudios sobre velocidades de asociación y disociación de unión
Para caracterizar adicionalmente algunos de los fragmentos de Fc variantes identificados por el ELISA de fagos, se caracterizó la unión de los fragmentos de Fc variantes a FcRn a pH 6 y 7,4 para un subconjunto de los fragmentos de Fc variantes identificados. El ADN que codifica los aislados de fragmento de Fc variantes seleccionados, todos de la colección L5, se introdujo en un vector de expresión de mamífero, que se usó para transfectar células 293 6E usando PEI desacetilado esencialmente como se describe por Thomas et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 102(16): 5679-5684, 2005). Se seleccionaron los aislados que tienen altas puntuaciones de ELISA para la unión a FcRn. Las concentraciones de fragmentos de Fc variantes en medio acondicionado (CM) se midieron usando muestras de CM diluidas 1:2 y 1:10 con biosensores de proteína A (ForteBio, Inc., número de catálogo 18-5010) en Octet Red® (ForteBio Inc., Menlo Park, California). Las concentraciones se calcularon usando una curva patrón creada con una proteína de fusión de Fc purificada.
El hFcRn biotinilado a 100 nM se capturó en biosensores de estreptavidina (SA) (FortéBio Inc., 18-5019) fuera de línea a TA durante 2 horas. Usando estos biosensores de SA recubiertos con hFcRn biotinilados en el sistema Octet Red®, puede detectarse la asociación y disociación de proteínas no marcadas en tiempo real mediante difracción de la luz. Se diluyeron muestras de CM de fragmento de Fc variante y de control hasta 10 pg/ml a pH 6 o pH 7,4. Se establecieron tres condiciones de asociación y disociación: (1) a pH 6 y disociación a pH 6; (2) asociación a pH 6 y disociación a pH 7,4; y (3) asociación a pH 7,4 y disociación a pH 7,4. Los biosensores de SA recubiertos con hFcRn biotinilado se sumergieron en tampón a un pH específico durante 1 min y después se remojaron en las muestran que contenían fragmentos de Fc variantes o controles a un pH específico durante 5 min para permitir la unión a FcRn. Los biosensores de Fc entonces se remojaron en tampón a un pH específico durante 5 minutos más para permitir que los fragmentos de Fc unidos se disociaran de FcRn. La detección de la unión y disociación de los fragmentos de Fc fue posible a través del uso de interferometría de biocapa implementada usando el sistema Octet Red®, de modo que se detectó la unión y disociación en tiempo real.
Las velocidades de asociación y disociación de los fragmentos de Fc variantes a diferentes pH se compararon con los controles. Unión mayor a pH 6, disociación más lenta a pH 6, unión muy débil a pH 7,4 y disociación más rápida a pH 7,4 en comparación con el fragmento de Fc de control fueron los criterios usados para la selección de fragmentos de Fc variantes para caracterización adicional. Varios de los 61 fragmentos de Fc variantes ensayados mostraron más unión y disociación más lenta a pH 6 y disociación comparable o más rápida a pH 7,4 después de la unión a pH 6 con respecto a un fragmento de Fc de control. La figura 3 muestra las curvas de unión a pH 6 (a la izquierda de la línea vertical central) y disociación a pH 7,4 (a la derecha de la línea vertical central) para 24 fragmentos de Fc variantes ensayados que tenían las propiedades más favorables. A la derecha de las curvas, se enumera el nombre de cada fragmento de Fc variante ensayado junto con la respuesta de unión máxima (en nanómetros (nm)) observado durante la fase de asociación del experimento. El número absoluto para la respuesta máxima puede variar algo de un experimento a otro, y no es directamente proporcional a las constantes de unión tales como kon, kdis o Kd (kdis/kon). En la figura 3, se observó la respuesta de unión más baja con un fragmento de Fc de tipo silvestre, y todas las variantes mostradas tenían respuestas mayores a pH 6. La mayoría de los fragmentos de Fc variantes se disociaron rápidamente a pH 7,4, como un fragmento de Fc de tipo silvestre. Sin embargo, la variante 5-1 se disociaba claramente mucho más lentamente a pH 7,4 que cualquier otra variante, mientras que todas las demás variantes ensayadas se disociaban rápidamente a pH 7,4, como el fragmento de Fc de tipo silvestre. La variante de Fc 5-85 destacó como la variante con la máxima respuesta a pH 6 que también se disociaba rápidamente a pH 7,4. Otras varias variantes, tales como 5-106, 5-104, 5-112, 5-79, 5-51 y 5-69, entre otras, también tenían altas respuestas a pH 6 y rápida disociación a pH 7,4. Por tanto, muchos fragmentos de Fc variantes con propiedades mejoradas se aislaron de la colección L5.
Ejemplo 5: Producción de fragmentos de Fc variantes
El ADN que codifica aislados seleccionados, todos de la colección L5, se introdujo en un vector de expresión de mamífero, que se usó para transfectar células 293 usando PEI desacetilado esencialmente como se describe por Thomas et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 102(16): 5679-5684, 2005). Se eligieron células de mamífero debido a la facilidad de expresión y procesamiento postraduccional en este sistema. Los métodos de expresión y producción de proteínas usados se describen en Durocher et al. (Nucl. Acids Res. 30(2): e9, 2002). Los fragmentos de Fc variantes secretados se purificaron del medio de cultivo usando cromatografía de afinidad de proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. Se usó cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para comprobar la pureza de los fragmentos de Fc. Para directrices generales sobre métodos de purificación, véase Methods in Molecular Biology: Protein Purification Protocols v.244, Cultler, ed., Humana, Nueva Jersey, 2004. Se evaluaron los títulos de proteína de las variantes de Fc por tinción con azul de Coomassie de un gel de poliacrilamida. Todos los aislados se expresaron a niveles adecuados para su ensayo.
Ejemplo 6: Estabilidad térmica de fragmentos de Fc variantes
La calorimetría diferencial de barrido (DSC) mide la entalpía (AH) de desplegamiento debido a desnaturalización por calor. Las moléculas proteínicas (u otras macromoléculas) en disolución están en equilibrio entre las poblaciones plegadas nativas y las poblaciones desplegadas desnaturalizadas. Cuanto mayor es el punto medio de transición térmica (Tm), cuando un 50 % de las moléculas proteínicas están desplegadas, más estable es la molécula. También se usa DSC para determinar el cambio en la capacidad calorífica (ACp) de desnaturalización. Se realizaron experimentos de DSC con DSC capilar VP MicroCal (GE Helathcare, Piscataway, NJ) para medir la Tm de los diversos fragmentos de Fc. La concentración del fragmento de Fc de control (Fc-WT) o variante purificado en cada experimento fue de 0,5 mg/ml en acetato de sodio 10 mM, sacarosa al 9 % a pH 5. Las muestras se calentaron de 20 °C a 95 °C a una tasa de calentamiento de 60 °C/hora. Los puntos medios de transición térmica (Tm) de los dominios individuales se determinaron cuando un 50 % del dominio individual estaba desplegado. Los valores de Tm de los fragmentos de Fc variantes y el fragmento de Fc de tipo silvestre de control se enumeran en la table 3 a continuación.
Tabla 3: Valores de Tm de los fragmentos de Fc variantes
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Estos datos indican que la Tm del dominio Ch2 no se veía afectada sustancialmente por las inserciones de la colección L5, que están en el dominio Ch3. Aunque la Tm del dominio Ch3 estaba ligeramente disminuida en los fragmentos de Fc variantes en comparación en fragmento de Fc de control (Fc-WT), los valores de Tm del dominio Ch3 en los fragmentos de Fc variantes aún son aproximadamente 10 °C mayores que los valores de Tm del dominio Ch2. Por tanto, el umbral inferior de la estabilidad térmica del dominio Fc completo, es decir, la Tm del dominio Ch2, no se ve afectado.
Ejemplo 7: Unión de fragmentos de Fc variantes a FcRn humano o de macaco cangrejero
Se ensayó la unión de fragmentos de Fc variantes a FcRn humano y de macaco cangrejero usando un sistema de análisis BIAcore® T100 (GE Healthcare Bio-Sciences AB Private Limited Liability Company, Uppsala, Suecia) tanto a pH 5,5 como a pH 7,4. El ensayo consistía en incubar diversas concentraciones de los fragmentos de Fc variantes o fragmentos de Fc de control con una cantidad fija de FcRn humano o de macaco cangrejero en condiciones de unión y medir posteriormente la cantidad de FcRn sin unir libre en estas mezclas por la unión a una superficie (en una cubeta de lectura de un chip CM5 (Biacore)) en que se inmovilizó un fragmento de Fc. El fragmento de Fc inmovilizado en el chip era de cantidad suficiente para unirse esencialmente a todo el FcRn sin unir libre en la mezcla. Por tanto, la cantidad de FcRn sin unir en la mezcla se averiguó cuantitativamente por resonancia de plasmones superficiales a través del uso del sistema de análisis BIAcore® T100. A partir de esta información, se calculó una CE50, es decir, la concentración del fragmento de Fc variante o de control a la que un 50 % del FcRn en la mezcla estaba unido. Inicialmente, se ensayó un grupo de 23 fragmentos de Fc variantes (considerando Fc-5-1 un control) identificados en los experimentos descritos anteriormente para la unión a FcRn humano. Basándose en estos datos, se seleccionaron catorce fragmentos de Fc variantes y se ensayaron adicionalmente para la unión a FcRn de macaco cangrejero.
El protocolo experimental se describe en mayor detalle a continuación. Los fragmentos de Fc a ensayar se produjeron en células 293 y se purificaron como se describe anteriormente. Se inmovilizó un fragmento de Fc de control humano de tipo silvestre (Fc-WT) y un fragmento de Fc variante (Fc-5-1) en las cubetas de lectura de un chip CM5 (Biacore) usando acoplamiento de amina con densidad de aproximadamente 6000 unidades de resonancia (UR). Se usó Fc-5-1 porque, a diferencia de Fc-WT, se une a FcRn bien a pH 7,4. Se usó una cubeta de lectura sin proteína inmovilizada unida a la misma como control de fondo. Fue posible usar una única cubeta de lectura para muestras sucesivas lavando entre las muestras con una disolución a pH 7,4 para liberar el FcRn unido al fragmento de Fc inmovilizado en la cubeta de lectura.
Para obtener una señal razonable para las diferentes moléculas y condiciones ensayadas, se usaron diferentes condiciones de ensayo. Para los ensayos a pH 5,5, se mezcló 10 nM de FcRn humano o de macaco cangrejero con diluciones en serie de los fragmentos de Fc variantes y de control que se estaban ensayando (que variaban de 0 ,1 ~ 2 .000 nM) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en acetato de sodio 10 mM, pH 5,5, NaCl 150 mM, P20 al 0,005 %, 0,1 mg/ml de BSA. Como controles positivos, se incubaron FcRn humano y de macaco cangrejero cada uno 10 mM en la misma disolución, durante el mismo tiempo y a la misma temperatura descrita justo anteriormente, pero sin un fragmento de Fc añadido. En estas muestras, supuestamente todo el FcRn estaba sin unir. La unión del FcRn sin unir libre en cada una de estas mezclas al Fc-WT y Fc-5-1 inmovilizado se midió inyectando las mezclas sobre las superficies de las cubetas de lectura y detectando el FcRn unido a las superficies mediante resonancia de plasmones superficiales.
Para los ensayos a pH 7,4, se mezcló FcRn humano y de macaco cangrejero 10 nM con diluciones en serie de los fragmentos de Fc variantes y de control que se estaban ensayando (que variaban de 0,1 ~ 2.000 nM) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) con polisorbato 20 al 0,005 %, 0,1 mg/ml de BSA. Como controles positivos, se incubó FcRn humano y de macaco cangrejero cada uno 10 mM en la misma disolución, durante el mismo tiempo y a la misma temperatura descritos justo anteriormente, pero sin un fragmento de Fc añadido. Las cantidades de FcRn sin unir libre en estas mezclas se determinaron por unión al fragmento de Fc Fc-5-1 inmovilizado, que se midió inyectando estas mezclas sobre la superficie de una cubeta de lectura con Fc-5-1 y detectando el FcRn unido a las superficies mediante resonancia de plasmones superficiales. Se usó Fc-5-1- en estos ensayos porque se une a FcRn con afinidad mucho mayor que Fc-WT a pH 7,4.
Una respuesta de unión a FcRn disminuida con concentraciones crecientes de fragmento de Fc en las mezclas indicaba que FcRn se unía al fragmento de Fc en disolución, que bloqueaba FcRn de su unión al fragmento de Fc inmovilizado sobre las superficies de las cubetas de lectura. Representando la señal de unión a FcRn frente a las concentraciones de fragmento de Fc, se calcularon las CE50 usando regresión no lineal de competición de un sitio en el programa informático GraphPad Prism 5™. Estos resultados se muestran en la tabla 4.
Tabla 4. CE50 de fragmentos de Fc para la unión a FcRn a pH 5,5 y 7,4
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* ND indica "no determinado"
Los datos en la tabla 4 indican que muchos de los fragmentos de Fc variantes ensayados tienen unión sustancialmente mejorada a FcRn humano a pH 5,5 (es decir, tienen una CE50 sustancialmente inferior en comparación con Fc-WT) y mantienen una baja unión a pH 7,4 (es decir, tienen una alta CE50, como la de Fc-WT). Sin embargo, cinco de ellos (Fc-5-57, Fc-5-64, Fc-5-66, Fc-5-73 y Fc-5-110) no mostraron unión muy mejorada a pH 5,5. Ocho de ellos (Fc-5-55, Fc-5-60, Fc-5-79, Fc-5-91, Fc-5-92, Fc-5-96, Fc-5-101 y Fc-5-112) mostraron una mejora de casi aproximadamente 2~5x en la unión a pH 5,5. Estos datos indican además que las CE50 de los fragmentos de Fc variantes para la unión a FcRn humanos y de macacos cangrejeros son comparables. Todos los fragmentos de Fc variantes ensayados (distintos de Fc-5-1, que se consideró un control) mantenían la baja unión tanto a FcRn humano como de macaco cangrejero a pH 7,4.
Ejemplo 8: Construcción de fragmentos de Fc variantes modificados adicionalmente
Se prepararon versiones modificadas adicionalmente de los fragmentos de Fc variantes Fc-5-69 y Fc-5-106. Las variantes de Fc-5-69 se prepararon de la siguiente manera. Se insertó ADN que codifica el fragmento de Fc variante Fc-5-69 en un vector de expresión de mamífero que también podía propagarse en E. coli, que se usó como molde.
Para la variante Fc-5-69-W1 F, se usaron los dos siguientes cebadores: directo, GAG AGC AAT GGT GGT TGT TTC CCG CTG CAG GAC TAC (SEQ ID NO: 497); e inverso, GTA GTC CTG CAG CGG GAA ACA ACC ACC ATT GCT CTC (SEQ ID NO: 498). Para Fc-5-69-W1Y, se usaron los dos siguientes cebadores: directo, GAG AGC AAT GGT GGT TGT TAC CCG CTG CAG GAC TAC (SEQ ID NO: 499); e inverso, GTA GTC CTG CAG CGG GTA ACA ACC ACC ATT GCT CTC (SEQ ID NO: 500). Se usó el protocolo del kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchange (Stratagene, 200518). La mezcla de reacción era dNTP 200 nM, cebadores 100 nM, 1 ng de molde ADN, 1 ql de ADN polimerasa y agua en un volumen total de 50 ql. La reacción se procesó a 95 °C durante 30 segundos, después 16 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 60 segundos, 68 °C durante 6 minutos, seguido de 68 °C durante 10 minutos. Después, se añadió un 1 ql de DpnI y la reacción se incubó a 37 °C durante 1 hora. Después, se usaron 2 ql de la mezcla para transformar 30 ql de células supercompetentes XL1 blue (Stratagene) a 42 °C durante 45 segundos. Después de ello, se añadieron 0,5 ml de SOC, y las células se incubaron a 37 °C durante 1 hora en un agitador a 300 revoluciones por minutos (r.p.m.). Las células transformadas se extendieron en placas de agar de LB-ampicilina y se incubaron a 37 °C durante una noche.
Se recogieron colonias individuales y se preparó y secuenció el ADN plasmídico. Las secuencias de ADN indicaron que los fragmentos de Fc variantes tenían las siguientes secuencias de aminoácidos insertadas, que diferían en un aminoácido del inserto de Fc-5-69: Fc-5-69-W1F, GGCFPLQDYCGG (SEQ ID NO: 367); y Fc-5-69-W1Y, GGCYPLQDYCGG (SEQ ID NO: 368). El ADN que codifica estos fragmentos de Fc variantes se introdujo en células 293 y se produjeron fragmentos de Fc purificados como se describe anteriormente para su uso en ensayos de unión Biacore® realizados como se describe anteriormente.
Se prepararon versiones modificadas de Fc-5-106 por métodos similares excepto que el molde para las reacciones de PCR era un ADN que codifica Fc-5-106 insertado en un vector de expresión de mamífero. Los cebadores usados para las reacciones de PCR tenían las siguientes secuencias: Fc-5-106-M4A, directo, GGT GGT TGT GTT TTC AAC GCG TTC AAC TGT GGT GGT GGG (SEQ ID NO: 501) e inverso, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CGC GTT GAA AAC ACA ACC ACC (SEQ ID NO: 502); Fc-5-106-M4G, directo, GGT GGT TGT GTT TTC AAC GGG TTC AAC TGT GGT GGT GGG (SEQ ID NO: 503), e inverso, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CCC GTT GAA AAC ACA ACC ACC (SEQ ID NO: 504); Fc-5-106-M4H, directo, GGT GGT TGT GTT TTC AAC CAT TTC AAC TGT GGT GGT GGG (SEQ ID NO: 505), e inverso, CCC ACC ACC ACA GTT GAA ATG GTT GAA AAC ACA ACC ACC (SEQ ID NO: 506); Fc-5-106-M4I, directo, GGT GGT TGT GTT TTC AAC ATC TTC AAC TGT GGT GGT GGG (SEQ ID NO: 507), e inverso, CCC ACC ACC ACA GTT GAA GAT GTT GAA AAC ACA ACC ACC (SEQ ID NO: 508); Fc-5-106-M4L, directo, GGT GGT TGT GTT TTC AAC TTG TTC AAC TGT GGT GGT GGG (SEQ ID NO: 509), e inverso, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CAA GTT GAA AAC ACA ACC ACC (SEQ ID NO: 510); Fc-5-106-M4N, directo, GGT GGT TGT GTT TTC AAC AAC TTC AAC TGT GGT GGT GGG (SEQ ID NO: 511), e inverso, CCC ACC ACC ACA GTT GAA GTT GTT GAA AAC ACA ACC ACC (SEQ ID NO: 512); Fc-5-106-M4Q, directo, GGT GGT TGT GTT TTC AAC CAG TTC AAC TGT GGT GGT GGG (SEQ ID NO: 513), e inverso, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CTG GTT GAA AAC ACA ACC ACC (SEQ ID NO: 514); Fc-5-106-M4S, directo, GGT GGT TGT GTT TTC AAC TCG TTC AAC TGT GGT GGT GGG (SEQ ID NO: 515), e inverso, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CGA GTT GAA AAC ACA ACC ACC (SEQ ID NO: 516); Fc-5-106-M4T, directo, GGT GGT TGT GTT TTC AAC ACG TTC AAC TGT GGT GGT GGG (SEQ ID NO: 517), e inverso, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CGT GTT GAA AAC ACA ACC ACC (SEQ ID NO: 518); Fc-5-106-M4V, directo, GGT GGT TGT GTT TTC AAC GTG TTC AAC TGT GGT GGT GGG (SEQ ID NO: 519), e inverso, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CAC GTT GAA AAC ACA ACC ACC (SEQ ID NO: 520).
Las reacciones de PCR se realizaron como se describe anteriormente y se usaron para transformar E. coli. Se secuenciaron los ADN plasmídicos de colonias individuales. Se seleccionaron aislados que codificaban fragmentos de Fc que tienen las siguientes secuencias insertadas: Fc-5-106-M4A, GGCVFNAf Nc GG (SEQ ID NO: 369); Fc-5-106-M4G, GGCVFNGFNCGG (SEQ ID NO: 370); Fc-5-106-M4H, GGCVFNHFNCGG (SEQ ID NO: 371); Fc-5-106-M4I, GGCVFNIFNCGG (SEQ ID NO: 372); Fc-5-106-M4L, GGCVFNLFNCGG (SEQ ID NO: 373); Fc-5-106-M4N, GGCVFNNFNCGG (SEQ ID NO: 374); Fc-5-106-M4Q, GGCVFNQFNCGG (SEQ ID NO: 375); Fc-5-106-M4S, GGCVFNSFNCGG (SEQ ID NO: 376); Fc-5-106-M4T, GGCVFNTFNCGG (SEQ ID NO: 377); Fc-5-106-M4V, GGCVFNVFNCGG (SEQ ID NO: 378).
Estos derivados de Fc-5-69 y Fc-5-106 se prepararon y ensayaron para la afinidad de unión relativa a FcRn humano y de macaco cangrejero a pH 5,5 y 7,4 usando los métodos descritos en el ejemplo 7.
Tabla 5: Unión de variantes de 5-69 y Fc-5-106 a FcRn humano y macaco cangrejero
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Ambos derivados de Fc-5-69 mostraron afinidad de unión más débil que el propio Fc-5-69 a pH 5,5. Dos derivados de Fc-5-106 (Fc-5-106-M4I y Fc-5-106-M4L) mostraron mayor afinidad de unión a FcRn humano y de macaco a pH 7,4 en comparación con Fc-5-106. Además, cuatro de los derivados de Fc-5-106 incluyendo estos dos (Fc-5-106-M4I, Fc-5-106-M4L, Fc-5-106-M4T y Fc-5-106-M4V) mostraron actividad de unión mejorada o aproximadamente igual a pH 5,5 en comparación con el propio Fc-5-106. Estos cuatro se ensayaron para la afinidad de unión a FcRn de macaco cangrejero. Los cuatro tenían CE50 para la unión a FcRn de macaco cangrejero que eran similares a aquellas para FcRn humano tanto a pH 5,5 como a 7,4.
Ejemplo 9: Caracterización in vivo de fragmentos de Fc variantes
Para determinar si los anticuerpos que contienen los fragmentos de Fc variantes identificados anteriormente tienen propiedades farmacocinéticas (PK) mejoradas in vivo, se ensayaron un anticuerpo X sin modificar (que es un anticuerpo IgG2 humana anti-IL-23 humana) y versiones variantes de anticuerpo X que contienen fragmentos de Fc variantes in vivo en macacos cangrejeros para definir los parámetros farmacocinéticos. El anticuerpo X se seleccionó como anticuerpo apropiado en el que ensayar los parámetros farmacocinéticos de los fragmentos de Fc variantes porque se sabe que tiene un perfil pK lineal y porque se sabe que se expresa IL-23 a bajas concentraciones in vivo. Por tanto, se esperaba que los efectos relacionados con la diana sobre los parámetros PK fueran mínimos, haciendo más fácil detectar los efectos pK debido a los fragmentos de Fc variantes.
Se prepararon cinco anticuerpos IgG2 variantes llamados (X-5-51, X-5-69, X-5-104, X-5-106 y X-5-112). Estos anticuerpos IgG2 tenían las mismas inserciones en las mismas posiciones (de acuerdo con la alineación de la tabla 1) que los fragmentos de Fc de IgG1 variantes Fc-5-51, Fc-5-69, Fc-5-104, Fc-5-106 y Fc-5-112, respectivamente. Más específicamente, las inserciones estaban entre los aminoácidos 384 y 385 (numeración EU como en la tabla 1) en el fragmento de Fc de IgG2 humana. Se usó un plásmido que contenía ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo X como molde para cinco reacciones de PCR hechas usando los siguientes cebadores: para X-5-51, directo, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT CAT CTG CCG TTC GCT GTT TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3' (SEQ ID NO: 539), e inverso, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA AAC AGC GAA CGG CAG ATG ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3' (SEQ ID NO: 540); para X-5-69, directo, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT TGG CCG CTG CAG GAC TAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3' (SEQ ID NO: 541), e inverso, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GTA GTC CTG CAG CGG CCA ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3' (SEQ ID NO: 542); para X-5-104, directo, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GGT CAT GAA TAC ATG TGG TGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3' (SEQ ID NO: 543), e inverso, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACA CCA CAT GTA TTC ATG ACC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3' (SEQ ID NO: 544); para X-5-106, directo, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GTT TTC AAC ATG TTC AAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3' (SEQ ID NO: 545), e inverso, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GTT GAA CAT GTT GAA AAC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3' (SEQ ID NO: 546); y para X-5-112, directo, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GCT CTG TAC CCG ACT AAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3' (SEQ ID NO: 547), e inverso, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GTT AGT CGG GTA CAG AGC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3' (SEQ ID NO: 548). Se usó el protocolo del kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchange (Stratagene, 200518). La mezcla de reacción era dNTP 200 nM, cebadores 100 nM, 1 ng de molde de ADN, 1 pl de ADN polimerasa y agua en un volumen total de 50 pl. La reacción se procesó a 95 °C durante 30 segundos, después 16 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 60 segundos, 68 °C durante 6 minutos, seguido de 68 °C durante 10 minutos. Después se añadió 1 pl de DpnI, y la reacción se incubó a 37 °C durante 1 hora. Después, se usaron 2 pl de la mezcla para transformar 30 pl de células supercompetentes XL1 blue (Stratagene) a 42 °C durante 45 segundos. Después de ello, se añadieron 0,5 ml de SOC y las células se incubaron a 37 °C durante 1 hora en un agitador a 300 r.p.m. Las células transformadas se extendieron en placas de agar de LB-ampicilina y se incubaron a 37 °C durante una noche. Se recogieron colonias individuales y se preparó el ADN plasmídico y se secuenció para asegurar que los aislados elegidos tenían la secuencia de ADN esperada.
Se prepararon anticuerpos esencialmente de la misma manera que se describe anteriormente para fragmentos de Fc, excepto que las células hospedadoras de mamífero se transfectaron con ADN que codifican tanto la cadena pesada de IgG2, incluyendo una parte que codifica un fragmento de Fc variante o de control, como la cadena ligera de anticuerpo X. Las hospedadoras se incubaron en condiciones apropiadas para la expresión de los anticuerpos, y los anticuerpos se recuperaron del medio de cultivo, se purificaron como se describe anteriormente y se usaron para los siguientes experimentos.
Macacos cangrejeros (n=2/grupo) recibieron una única dosis intravenosa de una versión no modificada o una variante de anticuerpo X a una dosis de 1 mg/kg y se hizo un seguimiento durante una fase en vida de 8 semanas. Se recogieron muestras de sangre en puntos temporales especificados a lo largo del curso del experimento. Se recogieron muestras antes de la dosis 0,25, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 168, 240, 336, 408, 504, 576, 672, 744, 840, 1008, 1176 y 1344 horas después de la dosis.
Se usó un ELISA emparedado anti-IgG humana para determinar las concentraciones sistémicas de los anticuerpos inyectados por comparación con una curva patrón derivada de la misma molécula. Específicamente, se diluyó un anticuerpo de ratón anti-Fc humano en PBS, se recubrió sobre placas y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Se descartaron los contenidos de los pocillos y se añadió PBS-Tween 20 (SuperBlock®, Thermo Scientific) a los pocillos como tampón de bloqueo. Después de incubación durante una hora a temperatura ambiente, los pocillos de la placa se lavaron con PBS-Tween 20 y se añadieron muestras de suero a los pocillos y se incubaron durante 1 hora con agitación. Los pocillos se lavaron de nuevo y se añadió un anticuerpo de ratón anti-Fc humano marcado con peroxidasa de rábano rusticano a las placas. Después de una hora de incubación, los pocillos se lavaron y revelaron durante 10 minutos usando un sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). La reacción colorimétrica resultante se detuvo con ácido fosfórico o sulfúrico añadido a la placa. Se determinaron las densidades ópticas (DO) a 450 nm y 650 nm, y se restó la DO a 650 nm de la DO a 450 nm. La conversión de los valores de DO en concentraciones para las muestras de estudio se consiguió a través de regresión de los datos usando un modelo logístico con ponderación establecida a 1/Y2 en Watson LIMS versión 7.0.0.04.
Se realizó análisis farmacocinético usando el paquete analítico de PK proporcionado en Watson LIMS, versión 7.0.0.04. se obtuvieron los valores de exposición (área bajo la curva (ABC)) y eliminación (ml/kg/h) a partir de este análisis. Se usaron datos de concentración frente al tiempo para al menos 5 puntos temporales de muestreo para cada macaco cangrejero para calcular los valores de semivida (T1/2).
Como se muestra en la figura 4, las versiones variantes de anticuerpo X que contenían los fragmentos de Fc variantes X-5-51, X-5-69, X-5-104, X-5-106 y X-5-112 demostraron todas mayores concentraciones de mAb en macacos cangrejeros en un punto temporal de muestreo dado en comparación con anticuerpo X sin modificar. Como se muestra en la tabla 6, se demostraron valores de exposición aumentados y valores de eliminación disminuidos para todas las versiones variantes de anticuerpo X ensayadas en comparación con anticuerpo X sin modificar. Además, cuatro de las cinco versiones variantes de anticuerpo X tenían semividas aumentadas. La variante que no mostraba una semivida aumentada (X-5-106), puede representar una situación donde pueden haberse desarrollado anticuerpos antifármaco contra el anticuerpo inyectado en un mono, ya que los datos de uno de los dos monos ensayados indicaron una semivida muy corta (48 horas), mientras que los datos del otro mono indicaron una semivida aumentada (538 horas). Experimentación adicional para medir la presencia de anticuerpos antifármaco puedo aclarar esta cuestión.
Tabla 6: Valores medios para la semivida, exposición y eliminación
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En general estos datos indican que la unión aumentada de un fragmento de Fc variante a FcRn a pH 5,5-6,0 (con respecto a un fragmento de Fc de control) y la rápida disociación de FcRn a pH 7,4 se correlacionan con una semivida en vivo más larga de un anticuerpo que contiene el fragmento de Fc variante en macacos cangrejeros. Sin embargo, no se muestra una relación cuantitativa exacta entre el grado de mejora en la unión a pH 5,5 o 6 de un fragmento de Fc variante de IgG1 y el grado de mejora en los parámetros farmacocinéticos para un anticuerpo IgG2 de longitud completa que tiene la misma inserción que el fragmento de Fc variante, por estos datos. Estos datos indican, sin embargo, que X-5-51, X-5-69, X-5-104 y X-5-112 tienen semividas aumentadas con respecto al anticuerpo X sin alterar y sugieren que lo mismo es cierto para X-5-106. Además, todos los anticuerpos variantes ensayados tenían tasas de eliminación inferiores y mayor exposición en comparación con el anticuerpo de control.
Ejemplo 10: Construcción de fragmentos de Fc variantes con inserciones en sitios alternos
El hecho de que muchas variantes de la colección L5 tuvieran propiedades deseables indicaba que la posición de estas inserciones era favorable. Se hicieron los siguientes experimentos para determinar si otros sitios dentro de o adyacentes al mismo bucle que el sitio de inserción de L5 pudieran tener mejores propiedades. Para ensayar esta idea, se insertó uno de los péptidos seleccionados en diferentes ubicaciones en este bucle, y los fragmentos de Fc variantes resultantes se ensayaron para la unión a FcRn. La inserción del péptido del fragmento de Fc variante 5-1 se eligió como péptido a insertar. Este péptido tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: GGCGMPIEFCGG (SEQ ID NO: 67). Como se muestra en la figura 5 (que usa el sistema de numeración EU como se ejemplifica en la tabla 1), este péptido se insertó en sitios dentro de o adyacentes al bucle de la colección L5 distintos del sitio de inserción de la colección L5. La unión de los fragmentos de Fc resultantes a FcRn se ensayó usando biosensores de SA (ForteBio Inc. 18-5019) recubiertos con huFcRn biotinilado como se describe en el ejemplo 4 anterior.
En más detalle, las construcciones de ADN que codifican estos fragmentos de Fc variantes se prepararon de la siguiente manera. Se usó el protocolo del kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchange® (Stratagene, 200518). La mezcla de reacción estaba compuesta de dNTP 200 nM, cebadores 100 nM, 1 ng de molde de ADN, 1 gl de ADN polimerasa y agua hasta un volumen total de 50 gl. Los cebadores usados en estas reacciones para cada variante se muestran a continuación en la tabla 7. El molde de ADN era un ADNc que codifica un polipéptido Fc de IgG1 humana de tipo silvestre insertado en un vector. La reacción se procesó a 95 °C durante 30 segundos, después 16 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 60 segundos y 68 °C durante 6 minutos, seguido de un ciclo final de 68 °C durante 10 minutos. Después se añadió 1 gl de Dpnl y la reacción se incubó a 37 °C durante 1 hora. después, se usaron 2 gl de la mezcla para transformar 30 gl de células de E. coli supercompetentes XL1 blue (Stratagene) a 42 °C durante 45 segundos. Después de ello, se añadieron 0,5 ml de caldo superóptimo con represión de catabolitos (SOC; que contiene triptona Bacto al 2 %, extracto de levadura al 0,5 %, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM y glucosa 20 mM) y las células se incubaron a 37 °C durante 1 hora en un agitador a 300 revoluciones por minuto (r.p.m.). Las células transformadas se extendieron en placas de agar de LB-ampicilina y se incubaron a 37 °C durante una noche.
Tabla 7: Cebadores usados en reacciones de PCR para la construcción de ADN que codifican fragmento de Fc variante
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Se recogieron colonias individuales y se preparó y secuenció el ADN plasmídico. El ADN que codifica estos fragmentos de Fc variantes se introdujo en células 293-6E y los fragmentos de Fc en medio acondicionado (CM) de estas células se usaron en ensayos de unión ForteBio realizados como se describe anteriormente. Véase el ejemplo 4.
Los resultados para la unión a pH 6 y la disociación a pH 7 se muestran en la figura 6. Dos de los fragmentos de Fc variantes, 5-1-10 y 5-1-2, tuvieron una respuesta máxima mayor que la variante 5-1 a pH 6, pero también se disociaban más lentamente a pH 7,4. Véase la figura 6. Todas las demás construcciones mostraron una respuesta máxima algo menor, en comparación con la variante 5-1, a pH 6, pero todas estas respuestas fueron comparables o mayores que las de un fragmento de Fc de tipo silvestre (denominado FcWT en la figura 6). Además, la disociación de estas construcciones a pH 7,4, a diferencia de la de 5-1, fue comparable con la de FcWT. Por tanto, la mayoría de las variantes de Fc, distintas de 5-1-2 y 5-1-10 (ambas cuales tienen una inserción entre las posiciones 383 y 384), con inserciones dentro de o adyacentes al bucle 10 se disociaban más rápido a pH 7,4 que la variante 5-1. Además, las variantes 5-1 -1,5-1 -2, 5-1 -3, 5-1 -9 y 5-1 -10 tenían claramente respuestas máximas mayores que FcWT a pH 6 de la variante 5-1, mientras que las variantes 5-1-6, 5-1-7 y 5-1-8 tuvieron respuestas máximas comparables con las de FcWT. Las variantes 5-1-4 y 5-1-5 tuvieron respuestas solo ligeramente mayores que FcWT. Estos datos indican que la inserción del péptido tenía efectos más favorables en determinados sitios dentro del bucle 10. Específicamente, la inserción entre las posiciones 382 y 383, 383 y 384, 384 y 385, 385 y 386 (usando el sistema de numeración EU como se ilustra en la tabla 1 y en la figura 5) producía variantes de Fc que tenían una respuesta máxima mayor a pH 6 que FcWT más rápida disociación a pH 7,4. Por el contrario, las variantes de Fc que tienen inserciones entre las posiciones 388 y 389, 389 y 390 o 390 y 391 tenían propiedades similares a FcWT. Finalmente, las variantes de Fc que tienen inserciones entre 386 y 387 o 387 y 388 mostraban respuestas ligeramente mayores a pH 6 que FcWT y rápida disociación a pH 7,4. Además, la eliminación de los aminoácidos 384-386 y la inserción del péptido en su lugar, como se hizo en las variantes 5-1-9 y 5-1-10, también mejoró las propiedades de estas variantes de Fc en comparación con FcWT. La inserción ligeramente más larga de 5-1-10, que incluía tres en lugar de dos restos de glicina como en 5-1 -9 al inicio y al final de la inserción, tuvo una mayor respuesta que cualquier otra variante, incluyendo 5-1-2, que tenía una inserción (sin eliminación concomitante) entre las posiciones 383 y 384. Estos datos indican que inserciones de un péptido que puede potenciar la unión a FcRn dentro de la región entre las posiciones 382 y 387 pueden potenciar la unión de un fragmento de Fc a FcRn a pH 6, mientras se conserva su rápida disociación de FcRn a pH 7,4. Por otro lado, la inserción de dicho péptido entre las posiciones 388 y 391 no potenció sustancialmente la actividad de unión y/o afinidad de un fragmento de Fc a FcRn a pH 6 en comparación con FcWT y también tuvo poco o ningún efecto sobre la disociación a pH 7,4. Por tanto, estos datos apuntan a que una parte del bucle 10, es decir, de la posición 382 a 386, 387 o 388 (numeración EU), contiene sitios particularmente favorables para hacer inserciones que pueden potenciar la actividad de unión y/o afinidad por FcRn a pH 6.
Ejemplo 11: Selección del fragmento de Fc variante por presentación en levaduras
Para obtener un grupo diferente de polipéptidos Fc variantes, se realizó una selección usando presentación en levaduras. Para preparar las colecciones para el cribado en levaduras, se usaron tres colecciones preparadas previamente como puntos de partida. Una de estas era la colección L5, que se describe anteriormente. Véase la figura 2 y el ejemplo 2. Las otras dos colecciones tenían inserciones en exactamente el mismo sitio que la colección L5 y se prepararon usando los mismos métodos generales que se usaron para preparar la colección L5, pero el formato de las inserciones difería en que la colección L5 codificaba inserciones con seis aminoácidos aleatorizados mientras que las colecciones L-8 y L-10 codificaban inserciones con ocho y diez aminoácidos aleatorizados, respectivamente. Específicamente, estas colecciones codificaban inserciones con los siguientes formatos: colección L-8, GGC(19R)8CGG (SEQ ID n O: 88); y colección L-10, GGC(19R)1üCGG (SEQ ID NO: 89). Estas inserciones, como las de la colección L5, están entre la "N" a la posición 169 y la "G" en la posición 170 de acuerdo con el esquema de numeración de la figura 2. El "(19R)e" y "(19R)i0" indican ocho y diez, respectivamente, aminoácidos aleatorizados, que pueden ser cualquier aminoácido distinto de cisteína.
Las colecciones L5, L-8 y L-10 se digirieron con SaclI y NotI, y los fragmentos resultantes, que codificaban los fragmentos de Fc variantes, se purificaron y ligaron en un vector apropiado para la expresión tanto en Escherichia coli como en Saccharomyces cerevisiae. El vector también codificaba una marca de HA (una secuencia peptídica corta (YPYDVPDYA) (SEQ ID NO: 575) de hemaglutinina de gripe humana) en el mismo marco con la inserción, que se usó para confirmar que las regiones Fc se presentaban en la superficie de las células de levadura. Estas tres nuevas colecciones se introdujeron en E. coli, específicamente, en células de E. coli supercompetentes XL1 blue. Se usó el ADN de aproximadamente 5 x 108 transformantes de E. coli para transformar aproximadamente 1-2 x 109 células de S. cerevisiae usando el método convencional de acetato de litio. Un cultivo durante una noche de S. cerevisiae se diluyó hasta una DO600 de 0,2-0,3 en 100 mililitros de medio glucosado con peptona de extracto de levadura (que contiene 20 g/l de pectona Bacto, 10 g/l de extracto de levadura, glucosa al 2 % (YPD)) y se cultivó a 30 °C agitando a 300 revoluciones por minutos (r.p.m.) hasta que la DO600 alanzó 1,0-2,0. Las células entonces se lavaron con 30 mililitros de agua y con 30 mililitros de LiOAc 100 mM. Para cada colección, se añadió una mezcla de transformación que contenía LiOAc 1 M, PEG al 50 %, ADN transportador monocatenario, agua y 25 ug del ADN de la colección, a las células. Cada transformación se sometió a choque térmico a 42 °C durante 45 minutos. Las células se sedimentaron y después se cultivaron en 50 mililitros de medio YPD a 30 °C durante 1 hora. Las células se sedimentaron de nuevo y se lavaron con 30 mililitros en medio SD-leu (14,7 g/l de citrato de sodio, 4,29 g/l de ácido cítrico, dextrosa al 2 %, 6,7 g/l de base nitrogenada de levadura (YNB), 1,6 g/l de complementos de medio de agotamiento sintético de levadura sin leucina (Sigma, Y1376)). Las células entonces se resuspendieron en 10 mililitros de medio SD-leu. Los 10 mililitros de células transformadas se inocularon entonces en 300 mililitros de medio SD-leu y se cultivaron durante una noche a 30 °C.
La inducción de la expresión de los fragmentos de Fc variantes en los transformantes de levadura se consiguió por inoculación de una alícuota de un cultivo durante una noche (aproximadamente 108 células) en medio de inducción (5,4 g/l de Na2HPO4, 8,56 g/l de NaH2PO4, galactosa al 2 %, 6,7 g/l de YNB, y 1,6 g/l de complementos de medio de agotamiento sintético de levadura sin leucina (Sigma, Y1376)) y cultivando las células durante aproximadamente 48 horas a 20 °C.
Estas células inducidas se centrifugaron y resuspendieron en tampón de disolución salina tamponada con fosfato (PBS) (+BSA al 0,5 %) a pH 7,4. Después, se incubaron 0,5-1 x 108 células inducidas durante una hora con FcRn biotinilado (biotina-FcRn) 1 pM. Las células entonces se lavaron y se incubaron con 2 pg/ml de estreptavidina marcada (estreptavidina (SA)-Alexa Fluor® 647 (número de catálogo S32357, Invitrogen)) durante 15 minutos. Las células entonces se lavaron e incubaron con microesferas anti-Cy5/anti-Alexa Fluor® 647 (número de catálogo 130-091-395, MACS Miltenyi Biotec) durante 15 minutos. Las células se lavaron y separaron usando columnas de LS (número de catálogo 130-042-401, MACS Miltenyi Biotec) y una unidad de separación QuadroMACS® (número de catálogo 130-091-051, MACS Miltenyi Biotec). Se recogieron alícuotas de las fracciones de antes de la columna, flujo continuo, lavados y elución para el análisis FACS. El flujo continuo y los lavados se recogieron como nuestra población reducida, que contenía células que expresan polipéptidos Fc variantes que se unían a FcRn con muy baja afinidad a pH 7,4.
Esta población reducida de células entonces se cultivó durante una noche a 30 °C en medio SD-leu. Las células entonces se indujeron durante aproximadamente 48 horas a 20 °C en medio de inducción como se describe anteriormente. Las posteriores etapas de lavado e incubación se realizaron en tampón MES (MES 20 mM, NaCl 137 mM, BSA al 0,5 %) a pH 5,5. Las células inducidas se incubaron en hielo con biotina-FcRn 250 nM durante una hora. Posteriormente se añadió SA-Alexa Fluor® 647 (2 pg/ml) y anti-HA-FITC (1 pg/ml) y, después de lavarse y ponerse a través de un tamizador celular, las células se sometieron a análisis FACS a pH 5,5. Las ventanas de adquisición se establecieron para recoger células que mostraban una señal robusta tanto para FITC como para Alexa Fluor®. Estas células entonces se cultivaron durante una noche a 30 °C en medio SD-leu y después se indujeron durante aproximadamente 48 hora a 20 °C en medio de inducción. Después, en una segunda ronda, las células inducidas se incubaron en hielo con biotina-FcRn 25 nM durante una hora, y se repitieron las etapas de marcaje, lavado, tamizado, FACS, cultivo e inducción, como se describe anteriormente. Finalmente, en una tercera ronda, las células inducidas se incubaron en hielo con biotina-FcRn 5 nM durante una hora, seguido de las etapas de marcaje, lavado, tamizado, FACS y cultivo descritas anteriormente. Por tanto, el resultado final fue una población de células que expresaban fragmento de Fc que podían unirse a FcRn con mayor afinidad que un fragmento de Fc de tipo silvestre podía a pH 5,5
Esta población de células se sembró en placas, y se seleccionaron 500 colonias de la colección L5 y 400 colonias de cada una de las colecciones L-8 y L-10 para análisis adicional. Cada una de estas colonias individuales se cultivó a 30 °C durante una noche en medio SD-leu como se describe anteriormente. Las secuencias de las inserciones en cada uno de estos aislados se determinaron a partir del ADN plasmídico de levadura. En todas, se encontraron 317, 265 y 313 secuencias únicas entre estos aislados en cada una de las colecciones L5, L-8 y L-10, respectivamente. Las células entonces se indujeron a 20 °C durante 48 horas en el medio de inducción descrito anteriormente. Las etapas posteriores de lavado e incubación se realizaron en paralelo en tampón MES (MES 20 mM, NaCl 137 mM, BSA al 0,5 %) a pH 5,5 y en tampón PBS (+BSA al 0,5 %) a pH 7,4. Se incubaron aproximadamente 5 x 105 células por muestra con biotina-FcRn 250 nM y 1 pg/ml de anti-HA-FITC durante 1 hora. Después, las células se lavaron e incubaron con 2 pg/ml SA-Alexa-Fluor® 647 durante 15 minutos. Las células se lavaron y analizaron para la unión mediante FACS para determinar si se unían a FcRn fuertemente a pH 5,5 y débilmente a pH 7,4. Las líneas celulares individuales que mostraban las máximas señales para la unión a FcRn a pH 5,5, junto con una baja señal para la unión a FcRn a pH 7,4 y pocos o ningún resto de metionina o triptófano, se eligieron de cada colección para análisis adicional. Estos aislados seleccionados incluían 158, 59 y 50 líneas celulares de L5, L-8 y L-10, respectivamente, y las secuencias de las inserciones en estos aislados se muestran en la tabla 8 a continuación. (Obsérvese que el clon llamado 5y-37 no se incluyó en el análisis adicional porque no se volvió a clonar satisfactoriamente en el vector apropiado.)
Tabla 8: Secuencias de polipéptidos Fc variante que se unen con alta afinidad a pH 5,5 y baja afinidad a pH 7,4
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Los clones individuales seleccionados de cada colección se combinaron y se aisló el ADN usando el kit Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II (D2004, Zymo Research). Se realizó PCR sobre el ADN combinado usando cebador directo (5' GGA AAA GTC GAC TAG ACC ACC ATG GA 3' (SEQ ID NO: 357)) y cebador inverso (5' CTT TGC GGC CGC t Ca TTA TTT 3' (SEQ ID NO: 358)). Se usó un kit esencial de PCR (Roche, n.° de catálogo 11 578 553 001) con las siguientes condiciones de reacción: 95 °C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 95 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 45 segundos, 72 °C durante 90 segundos y finalmente 72 °C durante 10 minutos. La reacción de PCR y un vector de expresión de mamífero se digirieron durante una noche a 37 °C con las enzimas de restricción SalI y NotI (New England Biolabs). El ADN digerido se purificó en gel usando el kit de purificación de gel QIAquick (28704, Qiagen). El ADN del vector digerido y los productos de PCR se ligaron usando ADN ligasa T4 (New England Biolabs) y se incubaron a 16 °C durante una noche. El ADN ligado se usó para transformar células de E. coli ultracompetentes XL10-gold (n.° 200315, Stratagene) y se seleccionaron clones individuales. El ADN plasmídico de un clon de E. coli que contenía ADN que codificaba cada polipéptido Fc variante seleccionado se introdujo en células de mamífero 293-6E. Específicamente, se sembraron células 293-6E a 5 x 104 células/pocillo en placas de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina y se incubaron durante una noche a 37 °C. Después, se transfectaron 200 ng de ADN plasmídico en las células usando el reactivo de transfección Fugene® HD (n.° E2312, Promega) y se incubaron durante una noche a 37 °C. El siguiente día, se cambió el medio de crecimiento a medio sin suero que contenía triptona al 0,5 %. Se recogió el medio acondicionado después de otros 6 días de crecimiento a 37 °C. El medio acondicionado, que contenía los fragmentos de Fc variantes, se ensayó entonces para la unión a FcRn usando la tecnología ForteBio descrita en el ejemplo 4. Se muestran curvas de asociación y disociación a pH 6 y 7,4, respectivamente, de los fragmentos de Fc variantes que tienen los perfiles de unión más favorables en la figura 7.
La figura 7 muestra perfiles de asociación y disociación para la unión de FcRn a pH 6 y pH 7,4, respectivamente, de los 28 mejores fragmentos de Fc variantes de la colección en levadura L5, así como un fragmento de Fc de tipo silvestre (FcWT) y la figura 8 muestra los perfiles de unión a FcRn para los 18 mejores fragmentos de Fc variantes seleccionados de las colecciones en levadura L-8 y L-10. Todos los fragmentos de Fc variantes de L5 tenían una respuesta máxima mucho mayor a pH 6, es decir, mayor actividad de unión, que FcWT. A pH 7,4, todos se disociaban rápidamente, es decir, tenían poca o ninguna actividad de unión, similar a FcWT. Todos los fragmentos de Fc variantes de L-8 y L-10 tuvieron una respuesta máxima mucho mayor a pH 6, es decir, mayor actividad de unión que FcWT. A ph7,4, todos se disociaron rápidamente, aunque la mayoría mostraron bajos niveles de unión residual no observada en FcWT. Por tanto, todos estos fragmentos de Fc variantes tienen propiedades favorables en comparación con FcWT. Por lo tanto, pueden usarse satisfactoriamente inserciones de péptidos con diferentes longitudes para potenciar la actividad de unión a FcRn a pH 6 mientras se conserva la rápida disociación de FcRn a pH 7,4 con poca o ninguna unión residual.
Ejemplo 12: Caracterización in vivo de fragmentos de Fc variantes seleccionados en levadura
Para determinar si los anticuerpos que contienen los fragmentos de Fc variantes identificaos en el cribado de levaduras descrito anteriormente tienen propiedades farmacocinéticas (PK) mejoradas in vivo, se ensayó un anticuerpo X sin modificar (que es un anticuerpo IgG2 humana anti-IL-23 humana) y versiones variantes de anticuerpo X que contiene fragmentos de Fc variantes in vivo en macacos cangrejeros para definir los parámetros farmacocinéticos. Se seleccionó anticuerpo X como anticuerpo apropiado en el que ensayar los parámetros farmacocinéticos de los fragmentos de Fc variantes porque se sabía que tenía un perfil pK lineal y porque se sabía que IL-23 se expresaba a bajos niveles in vivo. Por tanto, se esperaba que los efectos relacionados con la diana sobre los parámetros PK fueran mínimos, haciendo más fácil detectar los efectos pK debido a los fragmentos de Fc variantes.
Se prepararon seis anticuerpos IgG2 variantes llamados (X-5y-8, X-5y-132, X-5y-38, X-5y-91, X-5y-119 y X-5y-127). Estos anticuerpos IgG2 tenían las mismas inserciones en las mismas posiciones que los fragmentos de Fc de IgG1 variantes 5y-8, 5y-132, 5y-38, 5y-91, 5y-119 y 5y-127, respectivamente. Se usó un plásmido que contenía ADN que codifica la cadena pesada de anticuerpo X como molde para cinco reacciones de PCR hechas usando los siguientes cebadores: para X-5y-8, directo, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT CCG GTT CTG CTG TTC AAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3' (SEQ ID NO: 380), e inverso, 5'- GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GTT GAA CAG CAG AAC CGG ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC -3'(SEQ ID NO: 381); para X-5y-132, directo, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GTT TTC TCT GCT CTG TGG TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3'(SEQ ID NO: 382), e inverso, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA CCA CAG AGC AGA GAA AAC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3' (SEQ ID NO: 383); para X-5y-38, directo, 5'- GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GAA ACT TAC TGG TTG TTC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3' (SEQ ID NO: 384), e inverso, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GAA CAA CCA GTA AGT TTC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3' (SEQ ID NO: 385); para X-5y-91, directo, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT CCG CAT TGG CCG TTC GAA TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3' (SEQ ID NO: 386), e inverso, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA TTC GAA CGG CCA ATG CGG ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3' (SEQ ID NO: 387); para X-5y-119, directo, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GCT TTC GAA TTC ATC TAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3' (SEQ ID NO: 388), e inverso, 5'- GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GTA GAT GAA TTC GAA AGC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC -3' (SEQ ID NO: 389); y para X-5y-127, directo, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT CAG TAC TTC TTG CCG TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3' (SEQ ID NO: 390), e inverso 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA CGG CAA GAA GTA CTG ACA ACC Ac C ATT GCT CTC Cc A CTC-3' (SEQ ID NO: 391). Se usó el protocolo del kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchange (Stratagene, 200518). La mezcla de reacción era dNTP 200 nM, cebadores 100 nM, 1 ng de molde de ADN, 1 pl de ADN polimerasa y agua en un volumen total de 50 pl. La reacción se procesó a 95 °C durante 30 segundos, después 16 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 60 segundos, 68 °C durante 6 minutos, seguido de 68 °C durante 10 minutos. Después se añadió 1 pl de DpnI y la reacción se incubó a 37 °C durante 1 hora. Después, se usaron 2 pl de la mezcla para transformar 30 pl de células supercompetentes XL1 blue (Stratagene) a 42 °C durante 45 segundos. Después de ello, se cargaron 0,5 ml de SOC y las células se incubaron a 37 °C durante 1 hora en un agitador a 300 r.p.m. Las células transformadas se extendieron en placas de agar de LB-ampicilina y se incubaron a 37 °C durante una noche. Se cogieron colonias individuales y se preparó ADN plasmídico y se secuenció para asegurar que los aislados elegidos tuvieran la secuencia de ADN esperada.
Se prepararon anticuerpos esencialmente de la misma manera que se describe anteriormente para fragmentos de Fc, excepto que se transfectaron células hospedadoras de mamífero con ADN que codifican tanto la cadena pesada de IgG2, incluyendo una parte que codifica un fragmento de Fc variante o de control, como la cadena ligera de anticuerpo X. Las células hospedadoras se incubaron en condiciones apropiadas para la expresión de los anticuerpos, y los anticuerpos se recuperaron del medio de cultivo, se purificaron como se describe anteriormente y se usaron para los siguientes experimentos.
Macacos cangrejeros (n=2/grupos) recibieron una única dosis intravenosa de una versión sin modificar o una versión variante de anticuerpo X a una dosis de 1 mg/kg y se hizo un seguimiento durante una fase en vida de 8 semanas. El anticuerpo X-5-112, que se ensayó previamente, se usó como control, así como el propio anticuerpo X. Se recogieron muestras de sangre en puntos temporales especificados a lo largo del curso del experimento. Se recogieron muestras antes de la dosis 0,25, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 168, 240, 336, 408, 504, 576, 672, 744, 840, 1008, 1176 y 1344 horas después de la dosis. Los anticuerpos se detectaron en muestras de sangre y el análisis farmacocinético se realizó esencialmente como se describe anteriormente en el ejemplo 9.
Como se muestra en la figura 9, versiones variantes del anticuerpo X que contienen todos los fragmentos de Fc variantes ensayados demostraron mayores concentraciones de mAb en macacos cangrejeros en la mayoría de puntos temporales de muestreo, incluyendo todos los puntos temporales más allá de 400 horas, en comparación con el anticuerpo X sin modificar. Además, algunas variantes fueron comparables a X-5-112, que se había ensayado previamente, incluyendo X-5y-8, X-5y-127 y X-5y-91.
La tabla 11 a continuación muestra la semivida (T^), exposición (área bajo a curva (ABC)) y tasa de eliminación (CI) de anticuerpo X y variantes del mismo en cada uno de los macacos cangrejeros en el estudio.
Tabla 11: Valores individuales para la semivida (TV 2 ), exposición (ABC) y eliminación (CI).
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Todas las variantes mostraron semividas y ABC aumentadas en comparación con las del anticuerpo X en al menos uno de los dos monos a los que se ha inyectado cada uno. En los monos n.° 207 y n.° 213, X-5y-132 y X-5y-119, respectivamente, tuvieron semividas más cortas que el anticuerpo X. Podía interpretarse que esto indicaba que estos monos particulares desarrollaban anticuerpos antifármaco, que daban lugar a eliminación más rápida de los anticuerpos. Lo valores de ABC también fueron mayores que los de anticuerpo X para la mayoría de las variantes ensayadas.
Los datos promediados para estos parámetros farmacocinéticos, que omiten los monos n.° 207 y n.° 213, se muestran en la tabla 12 a continuación. Se incluyen valores de un estudio previo presentado en la tabla 6 anterior para los anticuerpos X y X-5-112, que muestran que los valores son relativamente constantes de un estudio al siguiente.
Tabla 12: Valores medios para la semivida (T1/ 2), exposición (ABC) y eliminación (CI).
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*Estos son valores de un estudio previo presentado en el ejemplo 9 y la tabla 6 e incluidos aquí por motivos de comparación.
#Únicamente uno de los dos monos ensayados en este estudio se incluyó porque se sospecha que los anticuerpos antifármaco son la causa de la rápida eliminación observada en el otro mono.
Estos datos muestran que los parámetros farmacocinéticos para anticuerpo X y para X-5-112 son relativamente constantes de un estudio al siguiente. También indican que la semivida y la exposición están aumentadas en todas las variantes ensayadas. Por tanto, estos datos indican en general que la unión aumentada de un fragmento de Fc variante a FcRn a pH 5,5-6,0 (con respecto a un fragmento de Fc de control) y la rápida disociación de FcRn a pH 7,4 se correlacionan con una semivida in vivo más larga de un anticuerpo que contiene el fragmento de Fc variante en macacos cangrejeros.
Ejemplo 13: Caracterización in vivo de un anticuerpo que contiene Fc variante que tiene un perfil PK no lineal
Para determinar si las propiedades PK de un anticuerpo que tiene un perfil PK no lineal podrían mejorarse por la inserción de uno de los péptidos descritos en la presente memoria, se transfirió la inserción del fragmento de Fc variante Fc-5-112 al anticuerpo Y, un anticuerpo IgG2 humana que tiene un perfil PK no lineal. Esta forma variante del anticuerpo Y, un anticuerpo IgG2 variante llamado Y-5-112, se preparó esencialmente como se describe

Claims (31)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido Fc variante que comprende un fragmento de Fc variante de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana;
en el que el fragmento de Fc variante comprende una inserción de 3 a 20 aminoácidos en comparación con un fragmento de Fc de control, en el que la inserción en el fragmento de Fc variante es una inserción en una secuencia de aminoácidos correspondiente a una parte del fragmento de Fc de control seleccionada de:
(a) los aminoácidos 383-387 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1,
(b) los aminoácidos 383-387 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1, en el que los aminoácidos 384-386 están eliminados, y
(c) los aminoácidos 382-391 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1, en el que la inserción es entre los aminoácidos 382 y 383, 383 y 384, 384 y 385, 385 y 386, 386 y 387, 387 y 388, 388 y 389, 389 y 390 o 390 y 391;
en el que el fragmento de Fc de control comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
los aminoácidos 169-175 de la SEQ ID NO: 1 (fragmento de Fc de IgG1),
los aminoácidos 165-171 de la SEQ ID NO: 3 (fragmento de Fc de IgG2),
los aminoácidos 216-222 de la SEQ ID NO: 5 (fragmento de Fc de IgG3), y
los aminoácidos 166-172 de la SEQ ID NO: 7 (fragmento de Fc de IgG4);
en el que el polipéptido Fc de control comprende el fragmento de Fc de control y tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido de Fc variante excepto que el polipéptido Fc de control no contiene la inserción de 3 a 20 aminoácidos;
en el que el polipéptido Fc variante se une a un receptor de Fc neonatal humano (hFcRn) con mayor actividad de unión a pH 6,0 que el polipéptido Fc de control;
en el que el polipéptido Fc variante tiene poca o ninguna actividad de unión para la unión a hFcRn a pH 7,4 y la respuesta de unión residual detectada a pH 7,4 es de no más de 0,2 nanómetros más que la detectada usando el polipéptido Fc de control; y
en el que los valores comparativos para la actividad de unión y la respuesta de unión residual se determinan por interferometría de biocapa.
2. El polipéptido Fc variante de la reivindicación 1, en el que la respuesta de unión residual detectada a pH 7,4 es de no más de 0,1 nanómetros más que la detectada usando el polipéptido Fc de control.
3. El polipéptido Fc variante de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el fragmento de Fc de control comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
SEQ ID NO: 1 (fragmento de Fc de IgG 1),
SEQ ID NO: 3 (fragmento de Fc de IgG2),
SEQ ID NO: 5 (fragmento de Fc de IgG3), y
SEQ ID NO: 7 (fragmento de Fc de IgG4).
4. El polipéptido Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la inserción del fragmento de Fc variante está en una secuencia de aminoácidos correspondiente a la parte del fragmento de Fc de control que es los aminoácidos 383-387 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1.
5. El polipéptido Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la inserción del fragmento de Fc variante está en una secuencia de aminoácidos correspondiente a la parte del fragmento de Fc de control que es los aminoácidos 383-387 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1, en el que los aminoácidos 384-386 están eliminados.
6. El polipéptido Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la inserción del fragmento de Fc variante está en una secuencia de aminoácidos correspondiente a una parte del fragmento de Fc de control seleccionada de: los aminoácidos 382-391 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1, en el que la inserción es entre los aminoácidos 382 y 383, los aminoácidos 383 y 384, los aminoácidos 384 y 385, los aminoácidos 385 y 386, los aminoácidos 386 y 387, los aminoácidos 387 y 388, los aminoácidos 388 y 389, los aminoácidos 389 y 390 o los aminoácidos 390 y 391.
7. El polipéptido Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el fragmento de Fc de control comprende la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 165-171 de la SEQ ID NO: 3 (fragmento de Fc de IgG2).
8. El polipéptido de Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la inserción de 3 a 20 aminoácidos es de al menos seis aminoácidos de longitud.
9. El polipéptido Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la inserción de 3 a 20 aminoácidos es de 10 a 20 aminoácidos de longitud.
10. El polipéptido Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la inserción de 3 a 20 aminoácidos es de 6 a 16 aminoácidos de longitud.
11. El polipéptido Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-10, en el que la inserción es entre los aminoácidos 382 y 383, los aminoácidos 383 y 384, los aminoácidos 384 y 385, los aminoácidos 385 y 386, los aminoácidos 386 y 387 o los aminoácidos 387 y 388 del fragmento de Fc variante usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1.
12. El polipéptido Fc variante de la reivindicación 9, en el que la inserción es entre los aminoácidos 384 y 385, usando el sistema de numeración EU; o en el que los aminoácidos 384-386 están eliminados y la inserción es entre los aminoácidos 383 y 387, usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1.
13. El polipéptido Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la inserción es de la posición 382 a 386, 387 o 388, usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1.
14. El polipéptido Fc variante de la reivindicación 13, en el que el fragmento de Fc de control es un fragmento de Fc de IgG2 humana.
15. El polipéptido Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la inserción comprende al menos una cisteína entre los cuatro primeros aminoácidos insertados y al menos una cisteína entre los cuatro últimos aminoácidos insertados.
16. El polipéptido Fc variante de la reivindicación 15, en el que los tres primeros aminoácidos de la inserción son Gly-Gly-Cys y los tres últimos aminoácidos de la inserción son Cys-Gly-Gly.
17. El polipéptido Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la inserción comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 13-24, 41-67, 90-356, 359-367, 369, 372, 373, 375-379, los aminoácidos 4-8 de la s Eq ID NO: 216; los aminoácidos 4-9 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 41-53, 67, 90-163, 165-215, 217-247 y 359-378, los aminoácidos 4-10 de la SEQ ID NO: 164, los aminoácidos 4-11 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 248-288, 290-306 y 342, los aminoácidos 4-12 de la SEQ ID NO: 289 o 307 y los aminoácidos 4-13 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 308-341 y 343-356.
18. El polipéptido Fc variante de la reivindicación 17, en el que la inserción tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 41 -45, 54-58, 97, 127, 180, 208, 216 y 221.
19. El polipéptido Fc variante de la reivindicación 17, en el que inserción es entre los aminoácidos 384 y 385, usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1.
20. El polipéptido Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19,
que es una proteína de fusión de Fc variante que comprende un polipéptido que no es de anticuerpo, que es un anticuerpo que comprende una región VH, una región VL, una región CH2 y una región CH3, que es monovalente o divalente, y/o
que es un dímero o un tetrámero.
21. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido Fc variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.
22. Una célula hospedadora que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 21.
23. Un método para preparar un polipéptido Fc variante que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 22 en condiciones tales que se exprese el ácido nucleico, y recuperar el polipéptido Fc variante expresado del medio de cultivo o la masa celular.
24. Un método para prolongar la semivida de un polipéptido Fc que comprende un fragmento de Fc de IgG humana, en el que el método comprende:
(1) seleccionar un sitio para la inserción de un péptido en una secuencia de aminoácidos del fragmento de Fc de IgG humana, en el que dicho sitio para inserción se selecciona de:
(a) entre los aminoácidos 383-387 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1,
(b) entre los aminoácidos 383-387 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1, en el que los aminoácidos 384-386 están eliminados, y
(c) entre los aminoácidos 382-391 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1, en el que la inserción es entre los aminoácidos 382 y 383, los aminoácidos 383 y 384, los aminoácidos 384 y 385, los aminoácidos 385 y 386, los aminoácidos 386 y 387, los aminoácidos 387 y 388, los aminoácidos 388 y 389, los aminoácidos 389 y 390 o los aminoácidos 390 y 391, usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1;
en el que el fragmento de Fc de control comprende una secuencia de aminoácidos del fragmento de Fc de IgG humana seleccionada de:
los aminoácidos 169-175 de la SEQ ID NO: 1 (fragmento de Fc de IgG1),
los aminoácidos 165-171 de la SEQ ID NO: 3 (fragmento de Fc de IgG2),
los aminoácidos 216-222 de la SEQ ID NO: 5 (fragmento de Fc de IgG3), y
los aminoácidos 166-172 de la SEQ ID NO: 7 (fragmento de Fc de IgG4);
y
(2) insertar un péptido en el sitio seleccionado, en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO: 41-67, 90-356, 359-367, 369, 372, 373 y 375-379,
(b) los aminoácidos 4-8 de la SEQ ID n O: 216,
(c) los aminoácidos 4-9 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 41-53, 67, 90-163, 165-215, 217-247 y 359-378,
(d) los aminoácidos 4-10 de la SEQ ID NO: 164,
(e) los aminoácidos 4-11 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 248-288, 290-306 y 342,
(f) los aminoácidos 4-12 de la SEQ iD NO: 289 o 307, y
(g) los aminoácidos 4-13 de una cualquiera de las SeQ ID NO: 308-341 y 343-356.
25. El método de la reivindicación 24, en el que la inserción es entre los aminoácidos 382 y 383, los aminoácidos 383 y 384, los aminoácidos 384 y 385 o los aminoácidos 385 y 386 del fragmento de Fc variante, usando el sistema de numeración EU mostrado en tabla 1.
26. Un método para identificar un fragmento de Fc variante de IgG humana que confiere una semivida in vivo más larga a un polipéptido Fc variante y que comprende el fragmento de Fc variante, en comparación con un polipéptido Fc de control, en el que el polipéptido Fc de control comprende un fragmento de Fc de control que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
los aminoácidos 169-175 de la SEQ ID NO: 1 (fragmento de Fc de IgG1),
los aminoácidos 165-171 de la SEQ ID NO: 3 (fragmento de Fc de IgG2),
los aminoácidos 216-222 de la SEQ ID NO: 5 (fragmento de Fc de IgG3),
los aminoácidos 166-172 de la SEQ ID NO: 7 (fragmento de Fc de IgG4);
comprendiendo dicho método:
(1) crear una colección de ácidos nucleicos que codifican fragmentos de Fc que contienen una inserción que comprende 4-20 aminoácidos aleatorizados, en el que la inserción está en una secuencia de aminoácidos del polipéptido Fc de control seleccionada de:
(a) los aminoácidos 383-387 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1,
(b) los aminoácidos 383-387 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1, en el que los aminoácidos 384-386 están eliminados, y
(c) los aminoácidos 382-391 usando el sistema de numeración EU mostrado en la tabla 1, en el que la inserción está entre los aminoácidos 382 y 383, los aminoácidos 383 y 384, los aminoácidos 384 y 385, los aminoácidos 385 y 386, los aminoácidos 386 y 387, los aminoácidos 387 y 388, los aminoácidos 388 y 389, los aminoácidos 389 y 390 o los aminoácidos 390 y 391;
(2) cribar fragmentos de Fc codificados por la colección para identificar los fragmentos de Fc variantes que (i) se unen a hFcRn con mayor actividad de unión a pH 6 que un fragmento de Fc de control y (ii) tienen poca o ninguna actividad de unión para la unión a hFcRn a pH 7,4, que se determinada por interferometría de biocapa;
(3) construir un ácido nucleico que codifica un polipéptido Fc variante que comprende un fragmento de Fc variante identificado en (2), en el que la concentración de un polipéptido Fc de control, que comprende un fragmento de Fc de control en lugar del fragmento de Fc variante, se sabe que disminuye linealmente a lo largo del tiempo cuando se administra a un animal in vivo;
(4) introducir el ácido nucleico de (3) en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora en condiciones tales que se pueda expresar el polipéptido Fc variante codificado por el ácido nucleico;
(5) recuperar el polipéptido Fc variante de la masa celular o medio de cultivo celular;
(6) administrar el polipéptido Fc variante a un primer animal no humano y administrar el polipéptido Fc de control a un segundo animal no humano; y
(7) controlar las concentraciones de los polipéptidos Fc variantes y de control en sangre periférica a lo largo del tiempo después de la administración, identificando de ese modo un fragmento de Fc variante que confiere una semivida in vivo más larga y mayor exposición en un polipéptido Fc variante;
en el que el polipéptido Fc de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido Fc variante excepto que el polipéptido Fc de control no contiene la inserción que comprende 4-20 aminoácidos aleatorizados.
27. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que el fragmento de Fc de control comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
SEQ ID NO: 1 (fragmento de Fc de IgG1),
SEQ ID NO: 3 (fragmento de Fc de IgG2),
SEQ ID NO: 5 (fragmento de Fc de IgG3), y
SEQ ID NO: 7 (fragmento de Fc de IgG4).
28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en el que el fragmento de Fc de control comprende la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 165-171 de la SEQ ID NO: 3.
29. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido Fc variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-20 y un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.
30. El polipéptido Fc variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 28, para su uso en el tratamiento de una enfermedad crónica.
31. El polipéptido Fc variante para su uso, o la composición farmacéutica para su uso, de acuerdo con la reivindicación 30, en el que el uso es para tratar a un paciente humano, y la enfermedad crónica se selecciona del grupo de enfermedades crónicas que consiste en:
(a) una indicación oncológica,
(b) una afección inflamatoria,
(c) una afección relacionada con los huesos,
(d) una afección metabólica,
(e) una afección neurológica, y
(f) dolor crónico.
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