ES2638243T3 - Preparación de sistemas micro o nano basados en oxidos inorgánicos con porosidad controlada para el transporte de sustancias biológicamente activas - Google Patents

Abstract

Micro o nano-sistemas constituidos de una matriz a base de óxido inorgánico con porosidad normal controlada a través del uso de un tensioactivo genérico o mediante el uso de un mecanismo de impresión molecular, siendo micro o nano-sistemas adecuados para la orientación activa de moléculas, átomos o iones con actividad biológica y dirigiéndose a la liberación local en compartimentos biológicos de interés terapéutico, caracterizado porque los poros contienen una sustancia biológicamente activa, que una sustancia dedicada a la orientación y el reconocimiento molecular seleccionado de ácido fólico, un péptido, un anticuerpo, un glucósido, un carbohidrato o una proteína se acopla selectivamente sobre la superficie externa de dichos micro o nano-sistemas, y que la sustancia acoplada selectivamente sobre la superficie externa no es la sustancia biológicamente activa contenida dentro de los poros.

Description

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Preparacion de sistemas micro o nano basados en oxidos inorganicos con porosidad controlada para el transporte de sustancias biologicamente activas

Descripcion

CAMPO DE LA INVENCION

[0001] La invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de un sistema multifuncional que utiliza un oxido inorganico con porosidad controlada que lleva una especie activa biologica (drogas) y, al mismo tiempo, apoya sobre la superficie externa una funcion de orientacion con actividad biologica capaz, en particular, de ser reconocida por tejidos biologicos particulares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0002] En los ultimos anos, los investigadores MOBIL introdujeron la familia de tamices moleculares mesoporosos llamados M41S. La fase llamada MCM-41 es el miembro de la familia M41S caracterizada por una matriz hexagonal regular de mesoporos de diametro uniforme. Se sintetizan usando tensioactivos cationicos como agentes estructurantes (CT Kresge, ME, Leonowicz, WJ Roth, J. C Vartuli, JS Beck, Nature, 359, (1992), 710-712, J.S. Beck, J.C. Vartuli, V.J. Roth, M.E. Leonowicz, C.T. Kresge, K.D. Schmitt, C.T.W. Chu, D.H. Olson, E.W. Sheppard, S.B. McCullen, J.B. Higgins y J.L. Schlenker, J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 10834). Se han obtenido materiales mesoporosos usando tensioactivos anionicos (Q. Huo, DI Margolese, U. Cielsa, P. Feng, TE Gier, P. Sieger, R. Leon, P. Petroff, F. Schuth, G.D. Stucky, Nature, 1994, 368,317) y tensioactivos neutros tales como alquilamina con cadena larga [PT Tanev, TJ Pinnavaia, Science, 1995, 267, 865] y oxidos de polietileno [G. Attard, J.C. Glyde, C.G. Goltner, Nature, 1995, 378, 366; S.A. Bagshaw, E. Prouzet y T.J. Pinnavaia, Science, 1995, 269, 1242; D. Zhao, J. Feng, Q. Huo, N. Melosh, G.H. Fredrickson, B.F. Chmelka, GD Stucky, Science, 1998, 279, 548; D. Zhao, Q. Hou, J. Feng, B.F. Chmelka, GD Stucky, J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 6024]. El diametro de los mesoporos se puede adaptar de aproximadamente 20 A a aprox. 100 A dependiendo del tensioactivo y de los aditivos utilizados en la smtesis. El tipo de aluminosilicato MCM-41 se ha considerado desde su descubrimiento como la extension natural de zeolitas y campos inmediatamente de aplicaciones tales como catalisis o procesos de separacion de substratos estericamente impedidos demasiado grandes para difundir en las estrechas zeolitas micropores se han definido. El descubrimiento de la sflice mesoporosa ordenada abrio la ruta para nuevos desarrollos, por ejemplo en la smtesis "huesped-huesped" de materiales nanoestructurados. Se han creado sitios activos con alta definicion mediante injerto de complejos metalocenos sobre sflices mesoporosas. Las estrategias de smtesis ofrecidas por la qmmica de los procesos sol-gel junto con la capacidad de los tensioactivos para las mesofasas lfquido-cristalinas de autoensamblaje representa un codigo modular que permite desarrollar materiales innovadores con arquitecturas complejas que convierten el sustrato ideal en el diseno de una estructura nanofuncional. La hibridacion de un precursor inorganico permite, de hecho, el diseno y el desarrollo de materiales multifuncionales innovadores con estructura compleja y con diversas propiedades. Se han obtenido materiales inorganicos organicos fnbridos unidos covalentemente a la estructura inorganica de los materiales mesoporosos mediante injerto post-smtesis o mediante condensacion simultanea de reactivos silosanicos y organosilossanicos, estando provisto este ultimo de un enlace Si-C no hidrolizable.

[0003] La smtesis de materiales mesoporosos hidrofobos para la eliminacion simultanea del tensioactivo de estructuracion y la modificacion de la superficie externa se ha obtenido tratando el material MCM-41 con trialquilclorosilanos. Recientemente se ha descrito la preparacion de silicatos y aluminosilicatos mesoporosos con diferentes metodos de smtesis y su modificacion qmmica de la superficie. Se puede utilizar un volumen de poro tfpico de los materiales activados con porosidad regular para inmovilizar invitados moleculares con una clase o estructura muy diferente. Entre las diferentes aplicaciones posibles, las que se refieren a moleculas biologicamente activas, con particular atencion a la liberacion controlada de farmacos, parecen ser muy prometedoras.

[0004] Las enzimas y protemas pueden adsorberse en la superficie hidroxilada de oxidos inorganicos activados o en las paredes de los poros funcionalizados de materiales tnbridos con porosidad regular. Se han estudiado sflices mesoporosas MCM-41 para la inmovilizacion de farmacos antiinflamatorios no esteroideos proporcionados por un grupo funcional acido carboxflico. El confinamiento en la matriz puede obtenerse por fisisorcion de la molecula o por injerto qmmico, por ejemplo, sobre la superficie de sflice adecuadamente funcionalizada. [M. Vallet.Regi, A. Ramila, R.P. Del Real y J. Perez pariente, Chem. Materia., 2001, (13), 308; G.Cavallaro, P. Pierro F.S. Palumbo, F. Testa, L. Pasqua, R. Aiello Drug Delivery 11, 41-46, 2004; B. Munoz, A. Ramila, J. Perez Pariente, I. Diaz y M. Vallet Regi, Chem. Mater., 2003, 15.500; A. Ramila, B. Munoz, J. Perez Pariente, M. Vallet-Regi, J. Sol-Gel Sci. Technol., 26 (2003) 1199; C. Tourne-Peteihl, D. Brunel, S. Begu, B. Chiche, F. Fajula, D. Lerner JM Devoisselle, New. J. Chem., 27 (2003) 1415]. En este ultimo caso [New. J. Chem., 27 (2003) 1415] farmaco ibuprofen ha sido unido covalentemente a la superficie de MCM-41 de tipo sflice mesoporosa. La esterificacion se ha realizado utilizando el grupo ibuprofeno carboxflico en la abertura del anillo epoxfdico de 3-glicidoxipropilsilano injertado sobre la superficie de sflice. Un sistema similar basado en un pro-farmaco implica la ventaja debido a la activacion enzimatica a traves de la rotura del enlace ester debido a la esterasa "in vivo".

[0005] Peptido de pentagastrina, un activador de la secrecion gastrica, se ha introducido a traves de remojo de la

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solucion en una sflice mesoporosa sintetizada utilizando un tipo de tensioactivo Tween-80 [C. Tourne-Peteihl, D.A. Lerner, C. Charnay, L. Nicole, S. Begu, J.M. Devoisselle, ChemPhysChem, 3 (2003) 281]. Recientemente, un sistema para la liberacion controlada de farmacos con nanoesferas de sflice mesoporosa de MCM-41 ha sido optimizada. Tapas qmmicamente extrafoles de nanocristales de sulfuro de cadmio con el fin de sostener diferentes farmacos y neurotransmisores dentro del marco mesoporoso se han utilizado [C. Lai, B.G. Trewyn, D.M. Jeftinija, K. Jeftinija, S. Xu, S. Jeftinija, V.S. Lin, J. Am. Chem. Soc., 125 (2003) 4451].

[0006] El uso de materiales y sistemas a escala nanometrica esta en rapido desarrollo solo a partir de unos pocos anos. Se han propuesto recientemente enfoques nanotecnologicos dedicados no solo a la liberacion controlada de farmacos, sino tambien a la imagen molecular y al uso como biomarcadores o biosensores. Diferentes experimentos afrontan el uso de materiales a base de sflice. En 1999 se han patentado vidrios de sflice que incorporan moleculas biologicas como sistemas para la liberacion controlada de farmacos [Patente de EE.UU., n. 5.874.109, 1999]. El sistema Therasphere® es un nuevo sistema terapeutico, comercializado por MDS Nordion, utilizado como agente radioterapico local en el carcinoma hepatico. Esta hecho de microesferas de vidrio insolubles parcialmente constituidas por un emisor p introducido a traves de la arteria hepatica.

[0007] La orientacion activa de un farmaco en un tejido caractenstico puede basarse en el reconocimiento de un grupo funcional unido a una molecula preseleccionada.

[0008] El acido folico se puede emplear en la orientacion activa de un medicamento. Los receptores de acido folico, de hecho, constituyen un objetivo util en el transporte activo de farmacos antitumorales.

1) De hecho, estan sobre-regulados en muchas tipologfas de cancer humano incluyendo tumores malignos, colorrectales, de ovario, de cerebro, de rinon, de mama, de pulmon, celulas mieloides, permitiendo a las celulas neoplasicas, en caso de disponibilidad limitada, un suministro competitivo.

2) El acceso al receptor de folato en los tejidos normales que lo expresan esta seriamente restringido por su posicion en la cara externa de la membrana apical de los epitelios polarizados.

3) La densidad de los receptores de folato parece aumentarse con el aumento de la enfermedad. Aunque el mecanismo de transporte del acido folico en la celula por el receptor de folato no es claramente conocido. Es evidente que el folato conjugado es asumido por las celulas de los mairnferos a traves de un proceso de endocitosis mediado por el receptor. Los mecanismos de endocitosis implican partfculas menores de 100 nm. Sucesivamente a la conjugacion con el receptor de folato en la superficie de la celula tumoral, el conjugado de folato independientemente del tamano penetra y es conducido a compartimentos intracelulares llamados endosomas. Los endosomas que contienen folato conjugado presentan un valor de pH de aprox. 5 debido a un proceso llamado acidificacion de endosomas que es responsable de la disociacion entre conjugado y receptores [Y. Lu, PSLow, Adv. Droga. Deliv. Rev., 54 (2002) 675].

[0009] El direccionamiento de los receptores de folato puede ser empleado para la liberacion intracelular de agentes terapeuticos macromoleculares [K.Kono, M.Liu, JMJ Frechet, Bioconjugate Chem., 1999, 10, 1115], sino tambien medicamentos que no necesitan liberacion intracelular puede llevarse a tejidos neoplasicos. De este modo tumores de tratamiento terapeutico diffcil con metodos clasicos se pueden alcanzar usando espedficamente agentes terapeuticos conjugados-acido folico.

[0010] Con el objetivo de explotar las caractensticas de la sobreexpresion del receptor de acido folico este se ha conjugado a ambos farmacos de bajo peso molecular y a complejos macromoleculares como agente de direccionamiento molecular de moleculas unidas a las celulas neoplasicas. Sistemas basados en polieter con residuos de folato en la superficie externa como vehfculos de farmacos activos con potencialidad espedfica entre las celulas tumorales, se han preparado [K.Kono, M.Liu, J.M.J. Frechet, Bioconjugate Chem., 1999, 10, 1115].

[0011] A nanodispositivo para la liberacion del farmaco que permite una liberacion intracelular y, al mismo tiempo, tiene propiedades de formacion de imagenes obtenidas mediante la union covalente de fluorescema, metotrexato y acido folico, a la superficie de un nucleo etilendiammico de un dendnmero a base de polyamidoamina [A. Quintana, E. Raczka, L. Piehler, I. Lee, A. Myc, I. Mayoros, A.K. Patri, T. Thomas, J. Mule, JR Baker Jr, Pharm. Res. 19 (2002) 1310]. Recientemente, se ha preparado y caracterizado una folato-ciclodestrina conjugada [P. Caliceti, S. Salmaso, A. Semenzato, T. Carofiglio, R. Fornasier, M. Fermeglia, M. Ferrone, y S. Pricl, Bioconjugate Chem., 2003, 14, 899]. La conjugacion de acido folico con las macromoleculas produjo sistemas que mostraron liberacion de farmacos "in vitro" en celulas tumorales que expresan receptores de acido folico en casi todas las situaciones. La focalizacion macromolecular mediada por el acido folico produjo solo resultados parciales "in vivo" debido al problema relacionado con la penetracion de tumores solidos por las macromoleculas. De todos modos, los ejemplos en los que el transporte de folato ha mejorado significativamente los resultados de una terapia basada en vectores macromoleculares, conduce en muchos casos a una recuperacion completa.

- En el documento FR 2794115 se ha tratado un sol de sflice de nanopartfculas con un tamano medio entre 3 y 50 nm en su superficie por injerto o adsorcion de una molecula organica o por dopado con una sustancia dopante. Estas sustancias se han monodispersado en fase lfquida y muestran una concentracion superior o igual al 10%.

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- En el documento USP 6548264 se reivindica un nuevo metodo para la preparacion de nanopartmulas cuyo nucleo esta envuelto en una envoltura de sflice. Las nanopartmulas se han preparado por precipitacion a partir de reactivos disueltos en el medio acuoso de una emulsion agua-en-aceite. Se ha anadido un silicato reactivo para revestir el nucleo de las nanoemulsiones. Las partmulas de sflice revestidas han sido funcionalizadas utilizando diferentes metodos con el objetivo de utilizarlos, por ejemplo, como partmulas dopadas con tinte, metalicas, semiconductoras, magneticas y que contienen farmacos.

[0012] Las nanopartmulas de nucleo que tiene un diametro medio inferior a 1 micrometro y preferiblemente oscila entre 1 y 100 nm o 2 y 10 nm puede ser magnetico y puede incluir un metal elegido entre magnetita, megmita y greigita. En otros casos, el nucleo puede incluir un pigmento que puede ser permanganato de potasio, dicromato de potasio, sulfato de mquel, cloruro de cobalto, cloruro de hierro (III) y nitrato de cuprum. De la misma manera puede incluir un colorante como Ru/Bpy, Eu/Bpy y similar o un metal como Ag o Cd. La cascara de sflice que recubre las nanopartmulas puede derivatizarse con un grupo funcional como una protema (por ejemplo, un anticuerpo), un acido nucleico (por ejemplo, un oligonucleotido) biotina o estreptavidina. Finalmente, el propuesto en la invencion puede usarse para producir nanopartmulas revestidas con sflice derivadas con protemas que contienen un metal tal como magnetita, mafgmita o greigita. En otro aspecto, la invencion presenta un metodo para identificar celulas que expresan molecula preseleccionada. En este caso, una pluralidad de celulas en las que al menos una parte de ellas expresan la molecula particular que se mezcla con una pluralidad de nanopartmulas recubiertas con sflice en condiciones que permiten que las nanopartmulas se unan espedficamente a las celulas que expresan la molecula preseleccionada. En otra realizacion, las nanopartmulas revestidas con sflice son fluorescentes. La nanopartmula es solida y preferiblemente sin poros pero para algunas aplicaciones puede hacerse porosa degradando el recubrimiento de nanopartmulas con un agente corrosivo y eventualmente reconstruyendolo con sflice. En general, se prefieren las particulas solidas cuando se desea aislarlas del entorno exterior, mientras que aquellas porosas son preferidas cuando se desea aumentar el area superficial del revestimiento en contacto con el entorno exterior. El nucleo puede estar formado por cualquier sustancia compatible con el revestimiento con el objetivo de satisfacer requisitos particulares para la aplicacion para el uso de la partmula. Como ejemplo, cuando la partmula necesita ser magnetica, el nucleo esta constituido por un metal magnetico y las particulas pueden utilizarse en aplicaciones tales como separacion/purificacion de celulas o formacion de imagenes de diagnostico. El nucleo tambien puede estar hecho de una mezcla de diferentes sustancias. Como ejemplo, en una partmula magnetica y dopada con colorante, el nucleo puede estar constituido por un metal magnetico y una sal inorganica util como pigmento. El nucleo puede tener cualquier tamano pero debe ser inferior al de la partmula deseada. Para ciertas aplicaciones, el nucleo debe tener preferiblemente un diametro comprendido entre 1 y aprox. 200 nm. Como ejemplo, dado que las particulas con un tamano inferior a 100 nm pueden ser excretadas por los animales, mientras que las de mayor diametro pueden ser retenidas especialmente en el hugado y en el bazo, en el caso en que se prefieran las aplicaciones diagnosticas y terapeuticas y por consiguiente se recomienda que las particulas no estan retenidas, el nucleo debe ser suficientemente pequeno para estar contenido en una partmula con tamano inferior a 100 nm. El recubrimiento puede realizarse con un polfmero (poliestireno, cloruro de polivinilo, polfmeros acnlicos), un polisacarido como destrano, un oxido inorganico como alumina, sflice o una mezcla de los mismos. En muchas aplicaciones se prefiere la sflice porque es relativamente inerte en muchos ambientes, es biocompatible, previene la aglomeracion con otras nanopartmulas en una dispersion y puede derivatizarse facilmente con muchos grupos funcionales. El recubrimiento puede ser realizado por una capa que recubre el nucleo y por una segunda capa que recubre la primera. Esta segunda capa puede estar hecha de un material biodegradable, por ejemplo un azucar o un polfmero, impregnado con un farmaco. Este material biodegradable, cuando se introduce en un organismo animal, puede disolverse y el farmaco puede difundirse gradualmente. El recubrimiento puede hacerse mediante 3, 4, 5 o mas capas separadas. Los grupos funcionales pueden ser derivatizados en el revestimiento. Pueden ser cualquier funcion qrnmica o biologica que pueda estar unida a la nanopartmula a traves del recubrimiento: como ejemplo, una o mas protemas tales como anticuerpos (monoclonales, policlonales), enzimas, biotina, estreptavidina, moleculas de acidos nucleicos, quimiosensores, sondas fluorescentes y grupos bioqmmicos como aminas y grupos de carboxilato.

[0013] El documento USP 6.548.264 describe un sistema no basado en un oxido con porosidad ordenada pero una tipologfa general de nanopartmulas hecha de una sflice o cualquier otro material concha que contiene un nucleo de diferente naturaleza y composicion. La porosidad se obtiene finalmente en la concha por metodos qrnmicos. Cuando se desea la funcionalizacion en la concha, se finaliza a la interaccion espedfica basada en el reconocimiento de una especie caractenstica y en la separacion. Cuando los sistemas estan impregnados con un farmaco, se liberan despues de la erosion de una capa erosionable adicional creada en la envuelta que eventualmente se hace porosa.

[0014] El documento US 6.319.715 reivindica una metodologfa para mejorar la liberacion de moleculas de acido nucleico a las celulas "in vitro" por medio de la formacion de un complejo acido-transfeccion de agente-nanopartmula nucleico. El metodo preve la incubacion de nanopartmulas de sflice con el acido nucleico. Los complejos de acido nucleico-nanopartfcuias se dejan sedimentar sobre las celulas. La liberacion de material genetico en las celulas se lleva a cabo a traves de agentes de transfeccion estandar. El requisito esencial de las nanopartfculas es que son no toxicas y biocompatibles, capaces de asociarse con acidos nucleicos o con complejos de acidos nucleicos y pueden sedimentar en un medio acuoso para aumentar la concentracion de acido nucleico en la superficie de las celulas. Es preferible que no formen agregados.

- El documento US 6319715 no preve el uso de oxidos inorganicos con porosidad controlada y alto volumen

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de poro donde se puede introducir el agente terapeutico. Ademas, el documento citado describe una liberacion pasiva en la que la proximidad entre partmula y celula es inducida por un proceso de sedimentacion sin utilizar ninguna funcion de direccion.

- El documento US 2003/203206 describe una metodologfa de preparacion de s^lice mesoporosa hexagonal capaz de producir una liberacion controlada de una sustancia incorporada. Se proporciona un grupo funcional organico foto-dimerizable en la abertura de poro que bloquea su entrada. La sustancia activa incorporada puede liberarse donde y cuando se desea despues de una division fotoinducida del dfmero.

[0015] El documento US 2003/203206 describe un sistema para el transporte de sustancias biologicamente activas en una matriz de sflice mesoporosa provista de un sistema para el control de la difusion de las mismas sustancias, pero no capaz de dirigirse a tejidos caractensticos a traves de un mecanismo de reconocimiento.

- El documento WO01/12846 reivindica un metodo para la preparacion de soporte cargado con biomoleculas constituidas por la etapa de: a) activacion de la superficie de soporte a traves de un silano que lleva un grupo ammico; b) carga de la superficie activada del soporte con biomoleculas; c) tratamiento del soporte cargado con una solucion acida, basica o neutra. El metodo puede utilizarse, por ejemplo, en la preparacion de sondas analtticas en serie. En este metodo, los grupos ammicos presentes despues de la carga de la biomolecula (que podnan generar interacciones indeseables en el medio donde se usa el soporte cargado) se eliminan selectivamente de la superficie sin afectar a la parte cargada de la superficie. El metodo de la invencion es aplicable en todas las situaciones en las que los grupos ammicos libres deben eliminarse selectivamente de la superficie del oxido metalico cargado con biomoleculas.

[0016] El pH de la solucion en la que el soporte cargado puede tratarse, depende sustancialmente de la clase de la molecula unida a la superficie y en la union (covalente o adsorcion). Los soportes preparados a traves del metodo de la invencion son muy utiles para herramientas de diagnostico como, por ejemplo, en las sondas analfticas. Por ejemplo, a este respecto son series o microestructuras muy adecuadas sin grupos ammicos libres. La serie puede incluir diferentes biomoleculas en diferentes puntos que permiten la deteccion de multiples analitos. Generalmente, un analito es una sustancia, normalmente una biomolecula, cuya deteccion es posible debido a su capacidad de interactuar espedficamente con un determinado reactivo. Una muestra que incluye un analito se pone en contacto con el soporte cargado preparado mediante el metodo descrito en la invencion. El analito se deja reaccionar con una biomolecula que esta unida a la superficie del soporte. La interaccion puede seguirse a traves de un metodo de deteccion.

[0017] El documento WO 01/12846 describe un sistema basado en una superficie donde biomoleculas o diferente tipo de biomoleculas en diferentes "puntos" capaces de reconocer otras especies en una mezcla se injertan o se adsorben. Ademas, no preve el transporte de ningun agente terapeutico y el reconocimiento se finaliza a la deteccion.

Descripcion detallada

[0018] La invencion se ha realizado a partir de oxidos inorganicos con porosidad regular. El control de porosidad se lleva a cabo durante la smtesis mediante el uso de cualquier tensioactivo o a traves de un mecanismo de impresion molecular. Se pueden proporcionar oxidos de una funcion introducida durante la smtesis del material o mediante un proceso de injerto post-smtesis. La funcion introducida es util para el injerto de moleculas o partmulas diferentes de naturaleza y tamano sobre la superficie externa del material mesoporoso. Donde no se especifica, tal molecula o partmula seran nombradas genericamente como funcion de direccionamiento. Entre la posible conjugacion de la superficie externa, particularmente importante parece ser el uso de moleculas biologicamente activas o implicadas en el reconocimiento celular, peptidos o anticuerpos. La funcionalizacion se agrega solo a la superficie externa utilizando el material de fabricacion antes de los procesos de extraccion que hacen que los poros internos sean accesibles a los reactivos.

[0019] La introduccion de la funcion de la orientacion se produce antes de la eliminacion de tensioactivo y la inmovilizacion de la sustancia activa.

[0020] El injerto de la funcion de la orientacion reduce drasticamente las condiciones operativas necesarias sucesivamente para la eliminacion de tensioactivo. De hecho, deben ser compatibles con la estabilidad qrnmica y la actividad biologica del grupo introducido. El volumen de poros disponible despues de los procesos de extraccion es util para la carga del farmaco y el transporte de sustancias biologicamente activas para su liberacion en el sitio diana. Se pueden llevar moleculas, atomos, iones que tienen tipos y tamanos muy diferentes, tales como farmacos antitumorales, antiinflamatorios, hormonas, peptidos, fragmentos de ADN. Cuando no se especifica la molecula, ion, o material seran indicados genericamente con el termino sustancia activa.

[0021] El enfoque a la smtesis, funcionalizacion y carga del farmaco de nano y microsistemas modulares es completamente innovador y las condiciones operativas para ser elegidas deben evaluarse en funcion del problema espedfico a resolverse.

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[0022] A modo de ejemplo, las siguientes consideraciones generales pueden ser utiles como una regla en el diseno de un nano- o microsistema modular:

1) La molecula dirigida esta unida a la funcion qmmica mediante enlace covalente o ionico.

2) La inclusion del farmaco se obtiene por adsorcion en los poros del material.

3) El sistema debe tener una alta afinidad para la adsorcion de la molecula huesped.

4) La liberacion puede ser difusiva con perfil lento o controlado por pH en entornos en los que el pH es diferente al del medio donde se administra el sistema.

5) Las funciones qmmicas pueden obtenerse utilizando reactivos de 3-aminopropiltrietoxisilano o cualquier alcoxido de silicio parcialmente hidrolizable. Estan presentes sobre todo en la superficie externa de la sflice por razon de impedimento esterico y en los poros internos. De hecho, en el caso de los materiales de sflice obtenidos mediante el metodo de funcionalizacion post-smtesis, aunque la modificacion se lleva a cabo en materiales con poros rellenos de tensioactivo, la sflice hforida alcanza las paredes internas por migracion del reactivo a traves de micelas y posterior condensacion en las paredes.

6) El proceso de extraccion del tensioactivo del poro despues de la funcionalizacion debe ser compatible con la preservacion de la actividad biologica de la funcion de direccionamiento. Puede llevarse a cabo en agua a temperatura ambiente o ligeramente superior, en un disolvente que no dane la funcion de direccionamiento ni en un extractor soxhlet a temperatura moderada. La carga de farmaco es posible incluso en presencia completa o parcial de tensioactivo, siendo el propio agente tensioactivo un agente dispersante y un vehfculo. La eleccion de los elementos que constituyen un sistema modular como la matriz, el agente de funcionalizacion, la funcion de focalizacion y el farmaco es una de las fases del diseno del sistema y se basa en consideraciones farmacologicas, biologicas, ffsicas y qmmicas. En la fase de diseno estan tambien implicados el conocimiento de la cinetica de adsorcion del farmaco en el disolvente seleccionado para la carga del farmaco y de la liberacion del farmaco del sistema en la administracion, fluido cruzado y de liberacion.

SECCION EXPERIMENTAL

Ejemplos de preparacion de oxidos y oxidos funcionalizados con porosidad regular.

Proceso A1)

[0023] Preparacion de un material compuesto de sflice-micelas.

[0024] Se emplean los siguientes reactivos: polioxietileno (10) isononilfenileter (Nonfix 10 Condea), silicato de sodio (14% de NaOH, 27% de SO2; Aldrich), HCl al 37% (Carlo Erba).

[0025] El silicato de sodio se anade a la solucion de tensioactivo despues de la solubilizacion completa. Se anade acido hidroclorico y el gel resultante se envejece durante 24 horas a temperatura ambiente y sucesivamente durante 24 horas adicionales a 100°C en un autoclave de acero inoxidable teflonado. La composicion molar del gel es:

SiO2-0,78 NaOH-0,067 Nonfix10-0,82 HCl-58,9 H2O

[0026] Se anaden 36,5 g de silicato de sodio a la solucion de agente tensioactivo (7,25 g de Nonfix 10 en 143,5 g de H2O) despues de la disolucion completa de Nonfix 10. Por ultimo, se anaden 13,32 g de HCl al 37% y el gel resultante se envejecio durante 24 horas a temperatura ambiente y sucesivamente durante 24 horas adicionales a 100°C. La suspension resultante se filtra, se lava y se seca a 80°C.

Proceso A2)

[0027] Preparacion de un material compuesto de sflice-micelas.

[0028] Se emplean los siguientes reactivos: polioxietileno (10) isononilfenileter (Nonfix 10 Condea), tetraetilortosilicato (Aldrich) y acetato de etilo (Aldrich). La composicion molar del gel es:

TEOS-4,30 acetato de etilo-0,315Nonfix10-126,2H2O

donde TEOS indica ortosilicato de tetraetilo.

[0029] 13,77 g de Nonfix 10 se disuelven en 150 g de agua destilada y 13,80 g de TEOS se disuelven en 25,0 g de acetato de etilo.

[0030] La fase organica que disuelve TEOS se anade lentamente a la solucion de agua de tensioactivo. El sistema se envejece a temperatura ambiente durante 8 dfas bajo agitacion lenta. La fase organica se separa y la suspension resultante se filtra, se lava y se seca a 80°C.

Proceso A3)

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[0031] Preparacion de un material compuesto de s^lice-micelas.

[0032] Se emplean los siguientes reactivos: polioxietileno (10) isononilfenileter (Nonfix 10 Condea) y tetraetilortosilicato (Aldrich) e i-octano (Carlo Erba). La composicion molar del gel es:

TEOS-2,65i-octano-0,38Nonfix10-126,2H2O.

[0033] 16,74 g de Nonfix 10 se disuelven en 150 g de agua destilada y se disuelven 13,80 g de TEOS en 20 g de i- octano.

[0034] La fase organica que disuelve TEOS se anade lentamente a la solucion acuosa de tensioactivo. El sistema se envejece a temperature ambiente durante 8 d^as bajo agitacion lenta. La fase organica se separa y la suspension resultante se filtra, se lava y se seca a 80°C.

Proceso A4)

[0035] Preparacion de un material compuesto de sflice-micelas.

[0036] Se emplean los siguientes reactivos: polioxietileno (10) isononilfenileter (Nonfix 10 Condea),

tetraetilortosilicato (Aldrich) y n-heptano (Aldrich). La composicion molar del gel es:

TEOS-2,65n-heptano-0,38Nonfix10-126,2H2O

[0037] 16,74 g de Nonfix 10 se disuelven en 150 g de agua destilada y 13,78 g de TEOS se disuelven en 17,5 g de n-heptano.

[0038] La fase organica que disuelve TEOS se anade lentamente a la solucion de agua de tensioactivo. El sistema se envejece a temperatura ambiente durante 8 dfas bajo agitacion lenta. La fase organica se separa y la suspension resultante se filtra, se lava y se seca a 80°C.

Proceso A5)

[0039] Preparacion de un material compuesto de sflice-micelas.

[0040] Se emplean los siguientes reactivos: polioxietileno (10) isononilfenileter (Nonfix 10 Condea),

tetraetilortosilicato (Aldrich), i-octano (Carlo Erba) y etilenglicol (Aldrich).

[0041] La composicion molar del gel es:

TEOS-2,65i-octano-0,38Nonfix10-25,6 H2O-24,3 glicol de etileno.

[0042] 100,0 g de etilenglicol y 16,7 g de (Nonfix 10 se disuelven en 30,5 g de agua destilada y 13,80 g de TEOS se disuelven en 20,0 g de i-octano.

[0043] La fase organica que disuelve TEOS se anade lentamente a la solucion de agua/etilenglicol de tensioactivo. El sistema se envejece a temperatura ambiente durante 26 dfas bajo agitacion lenta. La fase organica se separa y la suspension resultante se filtra, se lava y se seca a 80°C.

Proceso B)

[0044] Preparacion de una sflice mesoporosa 3-aminopropilo. Metodo directo. Ejemplo de metodo AminoPropiloSiliceDirecto (APSD).

[0045] Se emplean los siguientes reactivos: polioxietileno (10) isononilfenileter (Nonfix 10 Condea), silicato de sodio (14% de NaOH, 27% de SiO2; Aldrich), HCl al 37% (Carlo Erba) y 3-aminopropiltrietoxisilano (Aldrich). La composicion molar del gel es:

TEOS-0,78NaOH-0,067Nonfix10-0,82HCl-0,042APTES-58,9H2O donde APTES es 3-aminopropiltrietoxisilano.

[0046] Se anaden 36,5 g de silicato de sodio a la solucion de agente tensioactivo (7,25 g de Nonfix 10 en 143,5 g de H2O) despues de la disolucion completa de Nonfix 10. Por ultimo, 13,32 g de HCl 37% y 45 g de APTES y el gel resultante se envejece durante 24 horas a temperatura ambiente y sucesivamente durante 24 horas adicionales a 100°C. La suspension resultante se filtra, se lava y se seca a 80°C.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Proceso C)

[0047] Preparacion de una sflice mesoporosa 3-aminopropilo. Metodo directo.

[0048] Se emplean los siguientes reactivos: polioxietileno (10) isononilfenileter (Nonfix 10 Condea), tetraetilortosilicato (Aldrich) y 3-aminopropiltrietoxisilano (Aldrich).

[0049] La composicion molar del gel es:

TEOS-0,235 Nonfix10-0,061APTES-133,5 H2O

[0050] El tensioactivo Nonfix 10 (9,8 g, 0,0148 mol) se disuelve completamente en 150 g de agua destilada a temperatura ambiente. Se anaden sucesivamente TeOs (13,0 g, 0,0624 moles) y APTES (0,85 g, 0,0038 moles). La mezcla se envejece bajo agitacion lenta durante 8 dfas a temperatura ambiente. La suspension resultante se filtra, se lava y se seca a 80°C.

Proceso D)

[0051] Preparacion de una sflice mesoporosa 3-aminopropilo. Funcionalizacion post-smtesis de la sflice mesoporosa. Smtesis ejemplar de amino-propil-silicio (APSP) 3 g de sflice mesoporosa obtenida segun los procedimientos A1, A2, A3, A4, A5 se activan en el horno durante 2 horas a 120°C y luego se suspenden en 25 ml de tolueno anhidro. Se anaden sucesivamente APTES (5 ml) y la suspension se mantiene a reflujo durante 7 horas. Despues, el solido se filtra y se lava con tetrahidrofurano.

Ejemplos de anclaje de acido folico sobre sflice mesoporosa 3-aminopropilo.

Proceso E) Preparacion de una muestra derivada de APSD o APSP de acido folico (APSD-FOL o APSP-FOL)

[0052] Se anadio trietilamina (0,25 ml) y acido folico (0,5 g) se disuelven en dimetilsulfoxido (15 ml). Despues de disolucion completa, nitrometano (3 ml) y sflice mesoporosa 3-aminopropilo (36 g) obtenido segun el procedimiento B, C o D y previamente activado en el horno a 110°C durante 2 horas, se anaden. Finalmente, se anaden 2,27 mmoles de diciclohexilcarbodiimida (0,47 g) o diisopropilcarbodiimida (0,29 g). Las mezclas se agitan durante 30 horas en la oscuridad.

[0053] Proceso F) Preparacion de un sistema de acido folico APSP o APSD.

Se anadio trietilamina (0,25 ml) y acido folico (0,5 g) se disuelven en dimetilsulfoxido (15 ml). Despues de la disolucion completa, nitrometano (3 ml) y sflice mesoporosa 3-aminopropilo (3,6 g) obtenido segun el procedimiento B, C o D y previamente activado en el horno a 110°C durante 2 horas, se anaden. Las mezclas se agitan durante 30 horas en la oscuridad.

Ejemplo de proceso de extraccion de tensioactivo

[0054] Proceso G) extraccion de tensioactivo de APSD-FOL o APSP-FOL (Muestras APSD-FOL-E o APSP-FOL-E).

[0055] El tensioactivo se elimina por consecutivos ciclos de extraccion con 3 gramos de material en 1 litro de agua destilada a 30°C durante 12 horas con el fin de preservar la actividad biologica del acido folico.

Ejemplos de procesos de carga del farmaco en sflice de acido folico-aminopropilo mesoporoso.

[0056] Proceso H) Preparacion del sistema de 3-aminopropilo mesoporosa de sflice/acido folico/cisplatino. Las muestras APSD- FOL-E/cisplatino o APSP-FOL-E/cisplatino.

[0057] La impregnacion de cisplatino en el acido folico/sflice mesoporosa 3-aminopropilo se lleva a cabo por un proceso de remojo. 107 mg de material se suspenden durante 24 horas bajo agitacion continua a temperatura ambiente en una solucion de cisplatino en agua (38 mg en 45 ml). Sucesivamente, el solido se filtro, se lavo con 400 ml de agua bidestilada durante 2 horas y se seco a 50°C.

[0058] Proceso I) Preparacion del sistema de sflice/acido folico/oxaliplatino de 3-aminopropilo mesoporoso. Las muestras APSD- FOL-E/oxaliplatino o APSP-FOL-E/oxaliplatino.

[0059] La impregnacion de oxaliplatino en sflice/acido folico de 3-aminopropilo mesoporoso despues de la extraccion de surfactante se lleva a cabo como en el proceso de H. Se suspenden 100 mg de materiales durante 24 horas bajo agitacion continua a temperatura ambiente en una solucion de oxaliplatino en agua ( 5 mg en 6,3 ml). Sucesivamente el solido se filtro, se lavo con 400 ml de agua bidestilada durante 2 horas y se seco a 50°C.

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65

RESULTADOS

[0060] El proceso de smtesis A permite preparar materiales ordenados mesoporosos que exponen, despues de la activacion, el area de superficie espedfica alrededor de 1000 m2/g y el volumen muy alto de poro como se muestra por el patron de XRD en polvo (Figura 1) e isotermas de adsorcion-desorcion de nitrogeno (Figura 2). La funcionalizacion post-smtesis se lleva a cabo sobre el material compuesto de sflice-micelas antes de la eliminacion de tensioactivo de modo que el agente de modificacion se dirige preferentemente sobre la superficie externa de la partmula. El agente de modificacion tambien puede migrar a traves de las micelas y condensarse en las paredes de los poros internos como se ha demostrado en la literatura abierta para algun tipo de sflice mesoporosa.

[0061] La Tabla 1 muestra los resultados del analisis elemental sobre materiales de sflice mesoporosas 3- aminopropilo mesoporosos obtenidos de acuerdo con los procesos de B (directo) y D (modificacion post-smtesis) indicados como APSD y APSP, respectivamente.

Tabla 1

Muestra

C (% en peso) H (% en peso) N (% en peso)

APSD

24,06 4,10 1,01

APSP

11,00 3,02 2,99

[0062] La presencia de nitrogeno en los materiales confirma el anclaje covalente de grupos aminopropilo y sugiere que, en el caso de proceso de post-smtesis en tolueno a 110°C, una extraccion parcial de tensioactivo es posible. Espectro de 13C RMN-MAS de la muestra APSP se muestra en la Figura 3.

[0063] La Figura 4 muestra el patron de difraccion DRX en polvo de una muestra APSD-FOL-E obtenida despues de la union covalente de acido folico en la superficie de una sflice mesoporosa de 3-aminopropilo extrafda por agente tensioactivo (APSD-FOL). La unica reflexion en el patron de XRD (Figura 4) se mantiene durante los procesos de funcionalizacion y de extraccion de tensioactivo. El espectro de FT-IR de material APSD-FOL-E muestra bandas tfpicas de molecula de acido folico. La Figura 6 muestra las isotermas de nitrogeno de adsorcion-desorcion de muestra APSD-FOL (curva inferior) y APSD-FOL-E (curva superior). El procedimiento de extraccion produce un volumen de poro notable con mesoporos de tamano homogeneo.

[0064] La Tabla 2 muestra los datos del analisis elemental y la composicion modular de materiales APSD-FOL-E y APSP-FOL-E (moles/moles de sflice). Composicion modular se refiere al sistema supramolecular y en particular a las cantidades relativas de cada unidad que constituyen el sistema tnbrido.

[0065] La Figura 7 muestra la variacion de la relacion organica/SiO2 como una funcion de los procesos de extraccion y se hace referencia al material APSD-FOL.

Tabla 2

Muestra

Relacion molar (CH2)3- NH2/SO2 Relacion molar acido folico/SiO2 Relacion molar Nonfix 10/SiO2

APSD-FOL-E

0,0610 0,0138 0,0116

APSP-FOL-E

0,154 3,12 ■ 10-3 3,10 ■ 10-3

[0066] Proceso de smtesis A2, A3, A4, A5 y C se desarrollan con el fin de producir micelas de sflice compuestas con morfologfa controlada a la escala nanometrica. Estructuras mesoporosas a escala macroscopica se obtienen en la region interfacial utilizando sistemas de agua-aceite a pH acido. Mesoestructuras obtenidas reprodujero el tamano y la morfologfa de las esferas de petroleo porque los materiales inorganicos se condensan alrededor de ellos. La agitacion representa un mecanismo para controlar las propiedades de emulsion, ya que afecta las fuerzas hidrodinamicas de largo alcance. Agitacion lenta permite obtener morfologfa esencialmente fibrosa, mientras que al aumento de la velocidad de agitacion partmulas con morfologfas esfericas se producen. Un sistema de dos niveles bifasicos se utiliza para producir membranas autoportantes en la interfaz estatica entre las fases acuosa y organica [S. Schacht, P. Huo, IG-Martin Voigt, GD Stucky, F. Schuth, Science, 273, (1996) 768].

[0067] Mas recientemente, una pelmula mesoporosa se ha preparado a traves de la separacion de los reactivos en dos fases separadas, tanto en medio acido como en medio basico [L. Faget, A Bergman, O. Regev, Thin Solid Films, 386 (2001) 6].

[0068] En nuestros experimentos, smtesis se llevan a cabo a temperatura ambiente y la condensacion de sflice se produce en la region interfacial entre la solucion de agua-tensioactivo inferior y la fase organica superior que contiene la fuente de sflice que alimenta la formacion del material.

5

10

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20

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30

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[0069] En estas condiciones el tamano de partfculas es limitado debido a las partfculas recien formadas se mueven de la region interfacial y migran por la gravedad a la parte inferior del recipiente de smtesis donde s^lice no esta presente.

[0070] La carga de farmaco del medicamento contra el cancer cisplatino y oxaliplatino (procesa H y I) se llevan a cabo en dos cantidades diferentes, respectivamente, del material obtenido por proceso de extraccion de tensioactivo (APSD-FOL-E).

[0071] Las Tablas 3 muestran los resultados obtenidos a partir del analisis elemental de las muestras obtenidas por procesos de remojo H y I, (APSD-FOL-E/cisplatino y APSD-FOL-E/Oxaliplatino, respectivamente).

Tabla 3.

Muestra

Relacion molar Pt/SiO2

APSD-FOL-E/cisplatino

0,00485

APSD-FOL-E/oxaliplatino

0,0030

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   Reivindicaciones

   1. Micro o nano-sistemas constituidos de una matriz a base de oxido inorganico con porosidad normal controlada a traves del uso de un tensioactivo generico o mediante el uso de un mecanismo de impresion molecular, siendo micro o nano-sistemas adecuados para la orientacion activa de moleculas, atomos o iones con actividad biologica y dirigiendose a la liberacion local en compartimentos biologicos de interes terapeutico, caracterizado porque los poros contienen una sustancia biologicamente activa, que una sustancia dedicada a la orientacion y el reconocimiento molecular seleccionado de acido folico, un peptido, un anticuerpo, un glucosido, un carbohidrato o una protema se acopla selectivamente sobre la superficie externa de dichos micro o nano-sistemas, y que la sustancia acoplada selectivamente sobre la superficie externa no es la sustancia biologicamente activa contenida dentro de los poros.
2. 2. Procedimiento para la preparacion de un micro o nano-sistema hecho de una matriz a base de oxido inorganico con una porosidad regular de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior en el que los oxidos inorganicos estan provistos de una funcion qmmica introducida durante la smtesis de micro o nano-sistema o a traves de un proceso post-smtesis de injerto en la superficie externa del micro o nano-sistema mesoporoso, en el que la molecula dirigida a diana esta vinculada a la funcion qmmica a traves de enlace covalente o ionico y en el que las moleculas, atomos

   0 iones con actividad biologica se cargan en los poros del micro o nano-sistema despues de la molecula dirigida a diana esta vinculada a la funcion qmmica y despues de la eliminacion de agente tensioactivo, caracterizado porque el proceso de anclaje de acido folico como sustancia de orientacion, se produce con o sin un agente de condensacion de la siguiente manera: - 0,25 ml de trietilamina y 0,5 g de acido folico se disuelven en 15 ml de dimetilsulfoxido y, cuando la disolucion es completa, nitrometano y oxidos inorganicos activados previamente en el horno a 110°C durante 2 horas se anaden, se anade o no 2,27 mmoles de diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida y mezclas finalmente se agitan durante 30 horas en la oscuridad.
3. 3. Procedimiento para la preparacion de un micro o nano-sistema segun la reivindicacion 2 en el que la matriz basada en oxido inorganico se prepara usando los siguientes reactivos: isononilfenileter polioxietileno, silicato de sodio, HCl 37% y de acuerdo a los siguientes pasos: se anade sodio-silicato a una solucion de tensioactivo despues de la solubilizacion completa; se anade acido hidroclorico y el gel resultante se envejece durante 24 horas a temperatura ambiente y sucesivamente por otras 24 horas a 100°C en un autoclave de acero inoxidable recubierto de teflon, la suspension resultante se filtro, se lavo y se seco a 80°C.
4. 4. Procedimiento para la preparacion de un micro o nano-sistema segun la reivindicacion 2, en el que un oxido inorganico provisto de una funcion qmmica introducida durante la smtesis se prepara usando los siguientes reactivos: isononilfenileter polioxietileno, ortosilicato de tetraetilo, 3-aminopropiltrietoxisilano y agua, y de acuerdo con los siguientes pasos: un agente tensioactivo se disuelve en agua destilada, sucesivamente tetraetilortosilicato y 3-aminopropiltrietoxisilano se anaden, la mezcla se envejecio con agitacion lenta durante 8 dfas a temperatura ambiente, la suspension resultante se filtra, se lava y se seca a 80°C.
5. 5. Procedimiento para la preparacion de un micro o nano-sistema segun la reivindicacion 3 y 4 en el que la molecula dirigida a diana que es el acido folico esta vinculado, a traves de enlace covalente, a la funcion qmmica, introducido durante la smtesis o a traves de un proceso de post-smtesis de injerto, de oxido inorganico usando los siguientes reactivos: trietilamina, acido folico, dimetilsulfoxido, nitrometano, diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida, en el que trietilamina y acido folico se disuelven en dimetilsulfoxido, en el que, despues de la disolucion completa, nitrometano y oxidos inorganicos previamente activados en el horno a 110°C durante 2 horas, se anaden, y en el que, finalmente, se anade diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida, las mezclas se agitan durante 30 horas en la oscuridad.
6. 6. Procedimiento para la preparacion de un micro o nano-sistema segun la reivindicacion 5 en el que la molecula de focalizacion que es acido folico esta vinculada, a traves de enlace ionico, a la funcion qmmica, introducida durante la smtesis o a traves de un proceso de injerto de smtesis posterior, de oxido inorganico usando los siguientes reactivos: trietilamina, acido folico, dimetilsulfoxido, nitrometano, en el que trietilamina y acido folico se disuelven en dimetilsulfoxido, en el que despues de disolucion completa, se anaden nitrometano y oxidos inorganicos previamente activados en el horno a 110°C durante 2 horas, y en el que las mezclas se agitan durante 30 horas en la oscuridad.
7. 7. Procedimiento para la preparacion de un micro o nano-sistema segun la reivindicacion 5 o 6 en el que dicho tensioactivo se elimina de oxidos inorganicos provistos de una funcion qmmica vinculada con la molecula de focalizacion acido folico: el tensioactivo se elimina por ciclos consecutivos de extraccion con 3 gramos de material en

   1 litro de agua destilada a 30°C durante 12 horas con el fin de preservar la actividad biologica del acido folico.
8. 8. Procedimiento para la preparacion de un micro o nano-sistema segun la reivindicacion / en el que el cisplatino u oxaliplatino se carga en los poros del micro o nano-sistema despues de la eliminacion de agente tensioactivo: micro o nano-sistemas se suspenden durante 24 horas bajo agitacion continua a temperatura ambiente en una solucion de cisplatino u oxaliplatino en agua, sucesivamente, el solido se filtro, se lavo con agua bidestilada durante 2 horas y se seco a 50°C.