ES2633190T3 - Un citomegalovirus de replicación condicional como vacuna para el CMV - Google Patents

Abstract

Un citomegalovirus (CMV) de replicación condicional defectuosa que comprende: (a) un complejo gH pentamérico que comprende UL128, UL130, UL131, gH y gL; y (b) un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión entre una proteína esencial y una proteína desestabilizante, en donde la proteína esencial se selecciona del grupo que consiste en IE1/2, UL51, UL52, UL79 y UL84, en donde la proteína desestabilizante es la proteína de unión a FK506 (FKBP) o un derivado de FKBP, en donde el derivado de FKBP es FKBP que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: F15S, V24A, H25R, F36V, E60G, M66T, R71G, D100G, D100N, E102G, K105I y L106P, y en donde la proteína esencial de tipo silvestre ya no está presente.

Description

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2003, Vaccine 21:915; O’Hagen, 2001, Curr. Drug Target Infect. Disord. 1:273).

En algunas realizaciones, no se usan adyuvantes de base oleosa incluyendo, aunque sin limitación, adyuvante incompleto de Freund y MF59, en las composiciones de la invención.

En otras realizaciones, se usan adyuvantes particulados incluyendo, aunque sin limitación, adyuvante ISCOMATRIX® y/o adyuvante de fosfato de aluminio en las composiciones de la invención.

Composiciones farmacéuticas

Una característica adicional de la invención es el uso de un CMV recombinante descrito en este documento en una composición, preferiblemente una composición inmunogénica o vacuna, para tratar a pacientes con una infección por CMV y/o reducir la probabilidad de una infección por CMV. Adecuadamente, la composición comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se entiende que un "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un relleno líquido, diluyente o sustancia de encapsulación que puede usarse de forma segura en la administración sistémica. Dependiendo de la vía particular de administración, pueden usarse diversos vehículos farmacéuticamente aceptables, bien conocidos en la técnica. Estos vehículos pueden seleccionarse de un grupo que incluye azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato cálcico, aceites vegetales, aceites sintéticos, polioles, ácido algínico, soluciones tamponadas con fosfato incluyendo solución salina tamponada con fosfato, emulsionantes, solución salina isotónica y agua apirógena. En particular, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener diferentes componentes tales como un tampón, agua estéril para infección, solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato, sacarosa, histidina, sales y polisorbato. Las expresiones tales como "fisiológicamente aceptable", "diluyente" o "excipiente" pueden usarse de forma intercambiable.

Los procedimientos para las formulaciones de vacuna se describen, por ejemplo, en New Generation Vaccines (1997, Levine et al., Marcel Dekker, Inc. Nueva York, Basilea, Hong Kong), que se incorpora en este documento por referencia.

Formulaciones

En algunas realizaciones, el rdCMV de la invención se administra a un paciente para provocar una respuesta inmunitaria. Es deseable minimizar o evitar la pérdida de la potencia de la composición de rdCMV durante el almacenamiento de la composición inmunogénica. Las condiciones para mantener dicho objetivo incluyen, aunque sin limitación, (1) estabilidad mantenida en almacenamiento, (2) resistencia a ciclos acentuados de congelacióndescongelación, (3) estabilidad a temperaturas ambientales durante hasta una semana, (4) mantenimiento de inmunogenicidad, (5) compatibilidad con estrategia adyuvante. Las condiciones que afectan a la estabilidad del rdCMV incluyen, aunque sin limitación, pH del tampón, fuerza iónica del tampón, presencia/ausencia de excipientes particulares y temperatura. Las composiciones comprenden tampones para aumentar la estabilidad de las partículas víricas de rdCMV purificadas adecuadas como composición de vacuna.

La conservación de la integridad de las partículas víricas puede evaluarse por ensayos de inmunogenicidad en ratones y/o ensayos de entrada de virus. Los eventos de entrada de virus dependen de la integridad y de las funciones de las glucoproteínas víricas, incluyendo el complejo gH pentamérico. El complejo gH pentamérico también proporciona la inmunogenicidad sustancial de rdCMV, por tanto, las dos propiedades están vinculadas.

En algunas realizaciones, el rdCMV se almacena en tampón que comprende histidina 15-35 mM y NaCl 100-200 mM a un pH entre 5 y 7. En una realización más específica, el tampón comprende histidina 25 mM y NaCl 150 mM a pH

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En otras realizaciones, pueden añadirse azucares para proporcionar estabilidad adicional, tales como polioles (incluyendo, aunque sin limitación, manitol y sorbitol); monosacáridos (incluyendo, aunque sin limitación, glucosa, manosa, galactosa y fructosa); disacáridos (incluyendo, aunque sin limitación, lactosa, maltosa, sacarosa, lactulosa y trehalosa) y trisacáridos (incluyendo, aunque sin limitación, rafinosa y melecitosa). En una realización más específica, el azúcar es sacarosa. En una realización incluso más específica, la sacarosa está entre un 5-15 %.

En realizaciones preferidas, el rdCMV se almacena en tampón que comprende histidina 25 mM, NaCl 150 mM, sacarosa al 9 % a pH 6.

Administración

Un rdCMV descrito en este documento puede formularse y administrarse a un paciente usando las directrices proporcionadas en este documento junto con técnicas bien conocidas en la técnica. Las directrices para la administración farmacéutica en general se proporcionan en, por ejemplo, Vaccines Eds. Plotkin and Orenstein, W.B. Sanders Company, 1999; Remington’s Pharmaceutical Sciences 20.ª Edición, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 2000;

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CD4+. El virus de fusión doble IE1/2-UL51 puede provocar respuestas de células T de los fenotipos tanto CD4+ como CD8+, similares a las habitualmente observadas en sujetos sanos con infección por HCMV. Se compararon diferentes formulaciones del virus de fusión doble IE1/2-UL51 con sales de aluminio para su capacidad de generar anticuerpos neutralizantes en macacos de la India (figura 10). Se formularon 30 µg/dosis de virus de fusión doble IE1/2-UL51 con HNS (tampón base), sulfato de hidroxilfosfato de aluminio amorfo (AAHS) o adyuvante de fosfato de aluminio de Merck (MAPA) y se administraron a las semanas 0 y 8. Las muestras de suero recogidas en la semana 12 mostraron que, aunque MAPA potenciaba la inducción de anticuerpos neutralizantes, la potenciación no era estadísticamente significativa (ensayo t bilateral para datos independientes).

Ejemplo 5: Identificación de tampones para almacenamiento

El virus CMV en HBSS (solución salina equilibrada de Hank) y almacenada a -70 ºC hasta usarse se diluyó ~ 10x con el tampón apropiado. Los componentes residuales del tampón HBSS en cada muestra incluían cloruro de potasio 0,533 mM, fosfato de potasio monobásico 0,044 mM, fosfato sódico dibásico 0,034 mM, cloruro sódico 13,79 mM, bicarbonato sódico 0,417 mM y glucosa al 0,1 % p/v. Las muestras después se almacenaron a temperatura ambiente o entre temperaturas de 2 ºC-8 ºC durante 4 días o se congelaron-descongelaron. Para la congelacióndescongelación, la muestra se almacenó a -70 ºC durante al menos una hora y se descongeló a TA durante 30 minutos para uno o tres ciclos. La estabilidad de las muestras se ensayó en el día 4 usando un ensayo de entrada de virus. En resumen, el ensayo se realizó usando varias diluciones de muestra diferentes para obtener una curva de respuesta y se obtuvieron valores de CE50 (µg/ml) de los resultados del ensayo de entrada del virus por ajuste de curva no lineal. Los valores de CE50 inferiores representan una mejor estabilidad. Los valores de CE50 de las muestras de estabilidad se compararon frente a una muestra de control congelada a -70 ºC.

El ensayo de entrada de virus mide la capacidad de CMV de infectar células ARPE-19 y expresar IE1 (proteína 1 temprana inmediata). El ensayo se realiza en placas transparentes de 96 pocillos. Los anticuerpos primarios específicos de IE1 y los anticuerpos secundarios biotinilados se usan para detectar proteínas diana en células fijas y se cuantifica la señal fluorescente de cada pocillo usando un colorante IR 800CW de estreptavidina junto con Sapphire 700/DRAQ5 (para la normalización de introducción de células). Los resultados se representan como la relación de intensidad integrada a 800/700 (relación integrada) frente a la concentración de CMV (proteína total, µg/ml). Los valores de CE50 también se obtuvieron de los resultados del ensayo de infectividad usando ajuste de curva no lineal. Como la infección vírica de células ARPE-19 depende de la integridad de los antígenos glucoproteicos víricos, en particular el complejo gH pentamérico, los valores de CE50 reflejan lo bien que se conservan las partículas víricas en estas condiciones.

Como se muestra en la figura 11, el CMV pierde infectividad cuando se almacena durante cuatro días en HBSS a TA. Además, 3 ciclos de congelación-descongelación en HBSS dieron lugar a pérdida completa de infectividad cuando se ensayaban por ensayo de entrada de virus. Por tanto, HBSS no era un tampón óptimo para almacenamiento de CMV.

Se examinó el efecto del pH sobre la estabilidad de CMV a temperatura ambiente usando el intervalo de pH de 3 a

8. Se utilizaron los siguientes tampones: tampón citrato (25 mM), pH 3,0; tampón acetato (25 mM), pH 4; tampón acetato (25 mM), pH 5; tampón histidina (25 mM), pH 6; tampón HEPES (25 mM), pH 7; solución salina equilibrada de Hank (HBSS), pH 7,5 y tampón Tris (25 mM), pH 8.

Las muestras se prepararon por dilución de la masa de virus 10 veces con el tampón apropiado. Las muestras se almacenaron a TA (25 ºC) durante 4 días. En el día 4, se midió la estabilidad de las muestras utilizando el ensayo de entrada de virus. El CMV en HBSS almacenado congelado a -70 ºC se trató como control. Se obtuvieron los espectros UV-Vis para cada una de las muestras a tiempo 0 y en el día 4 para examinar los cambios estructurales y la agregación que se producía durante el almacenamiento.

Como se muestra en la figura 12, el tampón histidina pH 6 proporcionaba mejor estabilidad para CMV manteniendo mayor infectividad a TA en comparación con otros pH ensayados. La segunda derivada de los espectros UV indicó un perfil estructural similar del virus a todos los pH (datos no mostrados). No se observó agregación significativa a ninguno de los pH ensayados medida por densidad óptica a 350 mm (datos no mostrados).

El efecto de la urea en solitario o en combinación con cloruro sódico sobre la estabilidad del virus CMV se ensayó en tampón histidina 25 mM, pH 6. La adición de urea al 2 % en solitario no tenía efecto sobre la estabilidad de CMV. Sin embargo, la combinación de urea al 2 % con NaCl 150 mM mejoraba la estabilidad de CMV a TA (figura 13).

Se examinó el efecto de la fuera iónica sobre la estabilidad de CMV a pH 6. Se añadieron concentraciones crecientes de NaCl (0 mM, 75 mM, 150 mM y 320 mM de NaCl) a tampón histidina 25 mM a pH 6. La estabilidad de CMV era dependiente de la fuera iónica donde una fuerza iónica mayor conducía a mejor estabilidad (figura 14). La presencia de urea no tuvo efecto o tuvo efecto mínimo sobre la estabilidad de CMV (datos no mostrados).

Adicionalmente, se exploraron otros varios excipientes (sacarosa, sorbitol, glicerol y prolina) para su efecto sobre la estabilidad de CMV que expresa gH a temperatura ambiente. Los excipientes a ensayar se añadieron a CMV en

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