ES2630761T3 - Uso de un anticuerpo o una inmunotoxina que se une selectivamente a CD123 para dañar las células progenitoras de cáncer hematológico - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une selectivamente a CD123 y mata células madre leucémicas para uso en un método de tratamiento de un paciente humano que tiene una leucemia, en el que dicha leucemia es síndrome mielodisplásico.

Description

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DESCRIPCION

Uso de un anticuerpo o una inmunotoxina que se une selectivamente a CD123 para danar las celulas progenitoras de cancer hematologico

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere generalmente a danar las celulas progenitoras de cancer hematologico o a tratar cancer hematologico tomando como diana un marcador de la superficie celular espedfico para celulas progenitoras de cancer hematologico. La presente especificacion tambien esta relacionada con un metodo para diagnosticar cancer hematologico.

Antecedentes de la invencion

Las celulas madre se encuentran comunmente en una variedad de sistemas tisulares de mairnferos. Aunque los criterios por los que se definen dichas celulas vanan dependiendo del contexto espedfico, dos propiedades se consideran generalmente como caractensticas centrales de las poblaciones de celulas madre: (1) las celulas madre deben presentar alguna capacidad de auto-replicacion o auto-renovacion, y (2) las celulas madre deben ser capaces de diferenciarse en linajes apropiados (Potten CS: Stem Cells. Londres, Academic Press, 1997). Las celulas de esta naturaleza se han descrito para un numero de tejidos incluyendo sistemas hematopoyetico, embrionario, neural, muscular y hepatico (Lemischka IR. Clonal, in vivo behavior of the totipotent hematopoietic stem cell. Semin Immunol 1991, 3: 349-55; Morrison SJ, et al., The biology of hematopoietic stem cells. Annu.Rev.Cell Dev.Biol. 1995, 11: 3571; Robertson EJ., Using embryonic stem cells to introduce mutations into the mouse germ line. Biol Reprod 1991, 44: 238-45; Gage FH., Mammalian neural stem cells. Science 2000, 287: 1433-8; y, Alison M, et al., Hepatic stem cells. J Hepatol 1998, 29: 676-82). Asf, quiza no es sorprendente que celulas similares se hayan documentado recientemente en el contexto de poblaciones malignas (Bonnet D, et al., Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat.Med. 1997, 3: 730-737; Blair A, et al., Most acute myeloid leukemia progenitor cells with long-term proliferative ability in vitro and in vivo have the phenotype CD34(+)/CD71(-)/HLA-dR-. Blood 1998, 92: 4325-35; Cobaleda C, et al., A primitive hematopoietic cell is the target for the leukemic transformation in human Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000, 95: 100713). De hecho, una celula madre es en algunos aspectos la diana ideal para la transformacion maligna ya que se requiere un cambio biologico relativamente pequeno. Como las celulas madre ya poseen la programacion genetica necesaria para ser altamente proliferativas y plasticas desde un punto de vista de desarrollo, se puede imaginar que perturbaciones relativamente pequenas podnan ser suficientes para inducir enfermedad.

Un ejemplo de neoplasia que surge de celulas madre malignas se ha documentado recientemente en el sistema hematopoyetico en el caso de leucemia mielogena aguda (AML). Esta enfermedad se caracteriza por la parada prematura del desarrollo mieloide y la acumulacion posterior de grandes numeros de blastos leucemicos no funcionales. Aunque las celulas de blastos leucemicos tienen frecuentemente un origen clonal y presentan caractensticas relativamente homogeneas, se ha demostrado que dichas poblaciones estan organizadas de una manera jerarquica, analoga a los progenitores hematopoyeticos normales. Asf, existe una poblacion de celulas madre leucemica fenotfpicamente definida que es suficiente para propagar los blastos leucemicos tanto in vitro como in vivo en modelos de raton xenogenico de AML humana (Bonnet D, et al., Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat.Med. 1997, 3: 730-737; Blair A, et al., Most acute myeloid leukemia progenitor cells with long-term proliferative ability in vitro and in vivo have the phenotype Cd34(+)/CD71(-)/HlA-DR-. Blood 1998, 92: 4325-35; Cobaleda C, et al., A primitive hematopoietic cell is the target for the leukemic transformation in human Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000, 95: 1007-13; Blair A, et al. Lack of expression of Thy-1 (CD90) on acute myeloid leukemia cells with long-term proliferative ability in vitro and in vivo. Blood 1997, 89: 3104-12). El concepto de una celula madre leucemica (LSC) se vuelve cnticamente importante cuando se considera la etiologfa de la enfermedad humana. Claramente, con el fin de conseguir la remision duradera, sera necesario suprimir espedficamente la poblacion de LSC primitiva o progenitora. Sin embargo, estudios previos (Terpstra W, et al., Fluorouracil selectively spares acute myeloid leukemia cells with long-term growth abilities in immunodeficient mice and in culture. Blood 1996, 88: 1944-50), asf como los datos de nuestro grupo, sugieren que las LSC son biologicamente distintas de los blastos leucemicos mas maduros y pueden no responder a regfmenes quimioterapeuticos convencionales. Esta observacion es consistente con el perfil clmico observado frecuentemente para AML, en el que una mayona de pacientes puede conseguir una remision completa aparente, pero en la mayor parte de los casos recaeran (Schiller GJ., Treatment of resistant disease. Leukemia 1998, 12 Supl 1: S20-4; Paietta E., Classical multidrug resistance in acute myeloid leukemia. Med Oncol 1997, 14: 53-60). Si las LSC son mas refractarias a quimioterapia que los blastos, es atractivo proponer que las celulas madre supervivientes son un factor contribuyente principal para la recafda leucemica. Asf, las estrategias que toman como diana espedficamente celulas de leucemia progenitoras pueden proporcionar un tratamiento mas efectivo para los pacientes con leucemia. En 1997, Bonnet y Dick describieron el fenotipo para las LSC como CD34+/CD38- (Bonnet D, et al., Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat.Med. 1997, 3: 730-737). Reportamos que la cadena alfa del receptor de IL-3 (CD123) esta altamente expresada en celulas leucemicas, pero no en celulas hematopoyeticas normales CD34+/CD38-. A la vista de este estado de la tecnica, existe una necesidad en la tecnica de proporcionar un metodo de diagnostico para detectar leucemia en un estadio temprano, asf como metodos mas efectivos para tratar esta

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enfermedad.

et al. (Blood 1996, 88: 1445-1456) describio la reactividad de una toxina de fusion con citoquina murina, toxina de difteria390-interleuquina-3 murina (DT390-mIL-3) con celulas progenitoras de medula osea.

WO 97/24373 describe un anticuerpo monoclonal anti-cadena alfa del receptor de IL-3 producido por una lmea celular de hibridoma designado 7G3, que actua como un antagonista de IL-3 in vitro y se une de forma competitiva a IL-3. WO 97/24373 describe ademas que el tratamiento con este anticuerpo o un fragmento de este, antagonizando IL-3, puede ser adecuado para tratar leucemias mieloides, linfomas tales como linfomas de celulas B foliculares, o el alivio de alergias.

Sun et al. (Blood 1996, 87: 83-82) tambien describio el anticuerpo monoclonal 7G3 y sugirio que este anticuerpo puede tener significancia clmica para antagonizar IL-3 en afecciones patologicas tales como algunas leucemias mieloides, linfoma de celulas B folicular y alergia.

Koubek et al. (Eur. J. Haematol. 1999; 63: 1-10) describen la expresion de receptores de citoquina en diferentes celulas leucemicas linfoides.

Rosenblum et al. (Clin. Cancer Res. 1999, 5: 865-874) describieron inmunotoxinas recombinantes dirigidas frente al producto del oncogen c-erb-2(HER2/neu y el estudio de su citotoxicidad in vitro, farmacocinetica y eficacia in vivo en modelos de xenoinjerto.

Por ejemplo, Jordan et al. (Blood, Vlo. 94, No. 10, Supl. No. 1 (parte 1 de 2). pagina 67a, Resumen No. 288) describen que CD123 se expresa en una poblacion de celulas de AML CD34+/CD38- y concluye que la presencia de CD123 proporciona un marcador unico por el que las celulas leucemicas primitivas CD34+/CD38- pueden distinguirse de las celulas CD34+/CD38- normales. Jordan et al. describen ademas que CD123 puede tener utilidad diagnostica o proporcionar una diana para la intervencion inmunoterapeutica.

Compendio de la invencion

La presente invencion se refiere generalmente al uso de compuestos que se unen a la molecula CD123 humana (ectopeptido CD123), en el diagnostico y tratamiento de canceres hematologicos (por ejemplo, leucemias y trastornos linfoproliferativos malignos). Los compuestos y mimeticos espedficos de CD123 tienen una utilidad particular como farmaceuticos y reactivos para la terapia de cancer hematologico o estados patologicos malignos y para el diagnostico de estados patologicos de cancer hematologico.

En un aspecto, la presente invencion se refiere a danar una celula progenitora de cancer hematologico que comprende poner en contacto la celula con un compuesto que se une selectivamente a CD123 en una cantidad efectiva para danar la celula de cancer hematologico progenitora. Esta etapa de contacto puede ocurrir en varios entornos, incluyendo in vitro e in vivo en el cuerpo de un animal, incluyendo un ser humano. Espedficamente, la invencion proporciona un anticuerpo que se une selectivamente a CD123 y mata las celulas madre leucemicas para uso en un metodo de tratamiento de un paciente humano que tiene una leucemia, en el que la leucemia es smdrome mielodisplasico (MDS). Asf, en el contexto del aspecto terapeutico de la presente invencion, la referencia a un compuesto espedfico de CD123 debe entenderse como una referencia a un anticuerpo que se une selectivamente a CD123. En una realizacion, las celulas madre leucemicas son celulas madre AML CD34+/CD38-. En una realizacion adicional, las celulas madre AML CD34+/CD38- son ademas CD131-. En una realizacion adicional, las celulas madre leucemicas son de la medula osea del paciente.

A lo largo de esta solicitud, se hara referencia espedficamente a leucemia para describir determinados aspectos de la presente invencion. En el contexto de la presente invencion, la referencia a leucemia debe entenderse como referencia a MDS. Sin embargo, la descripcion de la presente solicitud no esta limitada solo al diagnostico y tratamiento de leucemia o trastornos linfoproliferativos malignos, sino a cualquier enfermedad en la que las celulas cancerosas expresan selectivamente CD123, que incluyen el genero de cancer hematologico.

En otro aspecto, la presente invencion esta dirigida a un metodo para detectar la presencia de CD123 en una celula progenitora de leucemia. Asf, la invencion tambien esta dirigida a un metodo para diagnosticar leucemia. Se entiende que mediante el uso de un ligando marcado para unirse a CD123, es posible detectar la presencia de celulas progenitoras de leucemia. Asf, tambien es posible diagnosticar la probabilidad del inicio de leucemia en pacientes que poseen dichas celulas progenitoras de leucemia que expresan CD123. El ligando de union a CD123 puede ser un anticuerpo frente a CD123, o puede ser cualquiera de una variedad de moleculas que se unen espedficamente a CD123. Ademas, el marcador puede elegirse de cualquiera de una variedad de moleculas, incluyendo, pero no limitado a, compuestos enzimaticos, o compuestos no enzimaticos que sirven como un informador de la presencia del ligando que se ha unido a la molecula CD123. Los ejemplos de dichos marcadores incluyen aquellos que son, por ejemplo, radiactivos, fluorescentes, quimioluminiscentes o basados en absorbente, o una combinacion de los anteriores. En una realizacion, se proporciona un ensayo para detectar la presencia de celulas progenitoras de leucemia en una muestra mediante la deteccion de la presencia de CD123 en la muestra, que puede conseguirse mediante la introduccion de un compuesto que se une selectivamente a CD123 y determinacion de si el compuesto se une a un componente de la muestra.

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La presente solicitud tambien describe compuestos o moleculas que mimetizan (mimeticos) la estructura tridimensional de parte o todo de los compuestos tales como peptidos, anticuerpos, carbohidratos, Kpidos o acidos nucleicos que se unen a CD123, y en el caso de anticuerpos, de los bolsillos de union de los anticuerpos, o de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR).

La presente solicitud tambien describe preparaciones farmaceuticas que comprenden un veldculo farmaceuticamente aceptable; y uno cualquiera o mas de los compuestos y mimeticos espedficos para CD123 descritos anteriormente.

La presente solicitud tambien describe un metodo para el tratamiento de leucemia, que comprende administrar a un sujeto humano u otro animal que necesita dicho tratamiento una cantidad terapeuticamente efectiva de los compuestos o sus composiciones farmaceuticas mimeticas descritas anteriormente.

La presente invencion tiene como objetivo purgar selectivamente celulas madre leucemicas de la medula osea. Estas celulas madre pueden dar lugar a celulas progenitoras de leucemia, o pueden ser las celulas progenitoras, que pueden danarse por el metodo de la invencion usando un anticuerpo anti-CD123 que puede ponerse en contacto bien con una muestra de medula osea o inyectarse en una medula osea de un individuo, destruyendo de esta manera al menos algunas de las celulas madre leucemicas en la medula osea.

Descripcion breve de los dibujos

La presente invencion se entendera mas completamente a partir de la descripcion detallada proporcionada en la presente memoria a continuacion, y los dibujos adjuntos que se proporcionan solo como ilustracion, y asf no son limitantes de la presente invencion, y en los que:

Las Figuras 1 A y 1 B muestran la expresion de CD123 en celulas hematopoyeticas normales y leucemicas. Se proporcionan ejemplos representativos de marcaje de CD123 en celulas derivadas de medula osea normal (panel A) o sangre periferica de AML primaria (panel B). El polfgono insertado en el panel A (representacion de puntos a la izquierda) indica el porcentaje de medula osea total que es positiva para expresion de CD123 (7%). La ventana rectangular mas pequena indica la proporcion de medula total fuertemente positiva para CD123 (1%). La representacion de puntos del centro en el panel A muestra la medula osea que se enriquecio para celulas CD34+ por seleccion en una columna de inmunoafinidad (veanse metodos). Las ventanas indican la poblacion CD34+ total y la poblacion CD34+/CD38-. Los histogramas indican el marcaje de CD123 para las dos poblaciones seleccionadas. El panel B muestra el mismo analisis para la muestra de AML primaria. Los marcadores M1 en los histogramas indican los niveles de expresion que son mayores de 99% de las muestras de control de isotipo. Para cada muestra, se analizaron 50.000-100.006 eventos.

La Figura 2 muestra la expresion de CD123 en cinco poblaciones AML primitivas. Las cinco muestras de AML primaria se marcaron con CD34, CD38, y CD123 y se analizaron por citometna de flujo. La figura muestra el marcaje de CD123 para las poblaciones seleccionadas CD34+/CD38- de cada muestra. Las secciones oscuras indican tincion de CD123 y las secciones claras indican marcaje paralelo con un anticuerpo de control de isotipo. Los marcadores M1 en los histogramas indican los niveles de expresion que son mayores de 99% de las muestras de control de isotipo. Para cada muestra, se analizaron 50.000-100.000 eventos.

Las Figuras 3A y 3B muestran el prendimiento de celulas AML CD123+ en ratones NOD/SCID. Las celulas de AML primaria CD34+/CD123+ seleccionadas se trasplantaron en un raton NOD/SCID irradiado. Seis semanas despues del trasplante, las celulas de la medula osea se aislaron y analizaron para la presencia de celulas leucemicas (CD45+) humanas. El panel A muestra el perfil de CD34 frente a CD45 de una muestra injertada usando anticuerpos que son espedficos para celulas humanas. El panel B muestra el perfil de CD34 frente a CD123 de la poblacion de celulas humanas CD45+ seleccionada. Para cada muestra, se analizaron 50.000 eventos.

La Figura 4 muestra el analisis por inmunotransferencia de CD123 y CD131 de muestras de AML primaria. Se obtuvieron cinco muestras de aMl primaria de sangre periferica y se separaron para aislar la poblacion CD34+, asegurando asf una muestra leucemica virtualmente pura. Ademas, se incluyeron la lmea celular leucemica TF-1 (TF-1) y celulas de medula normales CD34+ (CD34+ normales) como controles. Se prepararon lisados de cada poblacion, se sometieron a PAGE desnaturalizante y se analizaron por inmunotransferencia con un anticuerpo anti- CD123 (panel superior) o un anticuerpo anti-CD131 (panel inferior). La cabeza de flecha a la izquierda de cada panel indica la posicion de las cadenas IL-3Ra (CD123) e lL-3Rp (CD131), respectivamente.

Las Figuras 5A, 5B y 5C muestran la fosforilacion de componentes de la transduccion de la senal en respuesta a IL-3. Se obtuvieron tres muestras de AML primaria (Carriles 1-3) de sangre periferica y se separaron para aislar la poblacion CD34+. Las muestras se trataron con (+) o sin (-) 20 ng/ml de IL-3 durante 15 minutos, se lisaron y se sometieron a PAGE. Cada gel se electrotransfirio y las membranas se ensayaron con anticuerpos espedficos para la protema total o fosforilada para Akt (A), Stat5 (B), y Mek-1 (C). El carril marcado C en cada transferencia es un anticuerpo control y se obtiene de celulas NIH 3T3 tratadas +/- 50 ng/ml de PDGF (A y C), o celulas TF-1 tratadas +/- 25 ng/ml de GM-CSF (B).

Las Figuras 6A, 6B y 6C muestran la expresion de CD123 en ALL primaria. Analisis por citometna de flujo de la

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expresion de CD123 en tres muestras independientes de ALL (leucemia linfoide aguda) primaria. El marcaje de CD123 se muestra por las representaciones llenas (oscuras) y los controles se muestran por representaciones abiertas.

Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran la expresion de CD123 en CML primaria. Analisis por citometna de flujo de la expresion de CD123 en tres muestras independientes de CML (leucemia mielogena cronica) primaria. El marcaje de CD123 se muestra por las representaciones llenas (oscuras) y los controles se muestran por representaciones abiertas.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones

Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "anticuerpo" significa una molecula de inmunoglobulina, o un fragmento de una molecula de inmunoglobulina, que tiene la capacidad de unirse espedficamente a un antigeno particular. Los anticuerpos son muy conocidos por los expertos en la ciencia de la inmunologfa. Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "anticuerpo" significa no solo moleculas de anticuerpo intactas sino tambien fragmentos de moleculas de anticuerpo que retienen la capacidad de union a antigeno. Dichos fragmentos tambien son muy conocidos en la tecnica y se emplean regularmente tanto in vitro como in vivo. En particular, tal y como se usa en la presente memoria, el termino "anticuerpo" significa no solo moleculas de inmunoglobulina intactas sino tambien los fragmentos activos muy conocidos F(ab')2, Fab, Fv, Fd, Vh y Vl.

Tal y como se usan en la presente memoria, los terminos "se unen" o "se une" significaran cualquier interaccion, ya sea por medio directo o indirecto, que afecta el receptor o subunidad de receptor especificada.

Tal y como se usan en la presente memoria, los terminos "se une selectivamente a" significaran que el compuesto, composicion, formulacion, etc. no se une significativamente a la cadena beta de IL3R, pero sf se une a la cadena alfa de IL3R.

Tal y como se usan en la presente memoria, los terminos "CD123", "subunidad alfa de IL3R" e "IL3Ra" se usaran indistintamente para significar un determinante antigenico que es detectable en celulas precursoras de leucemia como se describe en la presente memoria, pero que no es detectable en celulas normales como se describe en la presente memoria.

Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "compuesto" significara cualquier pureza de ingrediente activo, incluyendo formulaciones, composiciones, plantas o animales naturales, etc. El compuesto puede incluir moleculas que son naturales, tales como proternas, acidos nucleicos, acidos nucleicos monocatenarios, lfpidos, carbohidratos, y anticuerpos. Sin embargo, pueden prepararse versiones sinteticas de estas moleculas naturales, siempre que se unan a CD123. Los compuestos pueden comprender mas de un componente. Por ejemplo, un compuesto puede ser un anticuerpo monoclonal unido a una toxina. O, puede ser un lfpido unido a una etiqueta. Los compuestos pueden comprender ademas mimeticos, y aptameros, pero que todos retienen su especificidad para CD123.

Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "danar" significara cualquier disminucion en la funcionalidad o actividad (incluyendo actividad de crecimiento o proliferativa).

Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "cancer hematologico" se refiere a un cancer de la sangre, e incluye leucemia y trastornos linfoproliferativos malignos, entre otros. "Leucemia" se refiere a un cancer de la sangre, en el que se producen demasiadas celulas blancas de la sangre que son inefectivas para luchar contra la infeccion, desplazando de esta manera las demas partes que forman la sangre, tales como plaquetas y celulas rojas de la sangre. Se entiende que los casos de leucemia se clasifican como agudos o cronicos. Las celulas cancerosas en leucemias agudas se bloquean en un estadio inmaduro. Sin embargo, continuan multiplicandose. Consecuentemente, hay una gran acumulacion de celulas inmaduras no funcionales y la perdida concomitante de celulas funcionales. Las leucemias cronicas progresan mas lentamente, con las celulas cancerosas desarrollandose hasta madurez completa. Ademas, las celulas blancas de la sangre pueden ser mielogenas o linfoides. Asf, determinadas formas de leucemia pueden ser, como ejemplo, leucemia linfotica (o linfoblastica) aguda (ALL); leucemia mielogena aguda (AML); leucemia linfodtica cronica (CLL); o leucemia mielogenica cronica (CML); y smdrome mielodisplasico. Los "trastornos linfoproliferativos malignos" puede referirse a un linfoma, tal como mieloma multiple, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, y linfoma folicular (de celulas pequenas y de celulas grandes), entre otros. Para los propositos de esta invencion, al menos algunas de las celulas de cancer hematologico se caracterizan por celulas que expresan CD123. Tambien, para los propositos de esta solicitud, siempre que se mencionan leucemia o trastornos linfoproliferativos malignos, el metodo de diagnostico y tratamiento se aplica generalmente a cancer hematologico.

Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "introducir" significara cualquier medio de administracion, ya sea in vivo o in vitro, incluyendo simple contacto.

Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "mimetico" significa un compuesto o molecula que mimetiza las estructuras tridimensionales de un sitio en CD123 al que puede unirse un compuesto, o el compuesto puede ser

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una molecula que mimetiza una molecula que se une a CD123. En el caso de un sitio de union de un anticuerpo anti-CD123, o paratopo, o sitio activo, "mimetico" significa un compuesto que mimetiza la estructura tridimensional de cualquier combinacion de los bucles hipervariables o regiones determinates de la complementariedad (CDR) del anticuerpo.

Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "mimetiza" significa el posicionamiento tridimensional de atomos del mimetico de manera que existen fuerzas ionicas, fuerzas covalentes, fuerzas de van der Waal u otras fuerzas similares, y complementariedad de carga , o complementariedad electrostatica, similar, entre los atomos del mimetico y los atomos del sitio de union del compuesto tal como un peptido o un anticuerpo de manera que el mimetico tiene una afinidad de union similar para CD123 que el compuesto parental y/o de manera que el mimetico tiene un efecto similar en la funcion de CD123 in vitro o in vivo.

En el caso de los anticuerpos anti-CD123, en la parte de union a antfgeno de un anticuerpo, como es muy conocido en la tecnica, existen regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que interaccionan directamente con el epftopo del antigeno, y regiones marco (FR), que mantienen la estructura terciaria del paratopo. Tanto en el fragmento Fd de cadena pesada como en la cadena ligera de las inmunoglobulinas IgG, hay cuatro regiones marco (FR1 a FR4) separadas respectivamente por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3). Las CDR, y en particular las regiones CDR3, y mas particularmente la CDR3 de cadena pesada, son en gran medida responsables de la especificidad del anticuerpo.

Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "normal" significa cualesquiera celulas o condiciones no patogenicas o no relacionadas con patologfa.

Tal y como se usan en la presente memoria, los terminos "primitivo" y "progenitor" seran intercambiables.

Tal y como se usa en la presente memoria, respecto a polipeptidos y anticuerpos, el termino "sustancialmente puro" significa que los polipeptidos carecen sustancialmente de otras sustancias con las que pueden encontrarse en la naturaleza o en sistemas in vivo hasta un grado practico y apropiado para su uso pretendido. En particular, los polipeptidos son lo suficientemente puros y carecen sustancialmente de otros constituyentes biologicos de sus celulas huesped como para ser utiles, por ejemplo, en la generacion de anticuerpos, secuenciacion, o produccion de preparaciones farmaceuticas. Por tecnicas muy conocidas en la tecnica, pueden producirse polipeptidos sustancialmente puros a la luz de las secuencias de acido nucleico y aminoacidos descritas en la presente memoria. Debido a que un polipeptido sustancialmente purificado puede mezclarse con un vehnculo farmaceuticamente aceptable en una preparacion farmaceutica, el polipeptido puede comprender solo un pequeno porcentaje en peso de la preparacion. El polipeptido es sin embargo sustancialmente puro ya que se ha separado sustancialmente de sustancias con las que puede estar asociado en los sistemas vivos.

Tal y como se usa en la presente memoria, respecto a compuestos o mimeticos, el termino "sustancialmente puro" significa que los compuestos carecen sustancialmente de otras sustancias con las que pueden encontrarse en la naturaleza, en sistemas in vivo, o como resultado de smtesis qmmica u otra, hasta un grado practico y apropiado para su uso pretendido. En particular, los compuestos son lo suficientemente puros y carecen sustancialmente de otros constituyentes biologicos de sus celulas huesped, o constituyentes qmmicos o ffsicos de sus smtesis, como para ser utiles en la produccion de preparaciones farmaceuticas. Por tecnicas muy conocidas en la tecnica (Patente de los Estados Unidos 5648379; Colman, P.G. Protein Science 3: 1687-1696, 1994; Malby, et al., Structure 2: 733746, 1994; McCoy et al., J. Molecular Biol. 268: 570-584, 1997), pueden disenarse compuestos o mimeticos sustancialmente puros. Debido a que un compuesto sustancialmente purificado puede mezclarse con un vehnculo farmaceuticamente aceptable en una preparacion farmaceutica, el compuesto puede comprender solo un pequeno porcentaje en peso de la preparacion. El compuesto es sin embargo sustancialmente puro ya que se ha separado sustancialmente de sustancias con las que puede estar asociado en los sistemas vivos, qmmicos u otros.

Mimeticos que se unen a CD123

Pueden encontrarse compuestos que tienen como diana CD123. Pueden usarse bibliotecas de exposicion en fago para determinar el ADN que codifica el polipeptido que se une a CD123. Los principios de esta estrategia se describen en la Patente U.S. No. 5.837.500.

Otras moleculas no peptfdicas que pueden unirse a CD123 incluyen acidos nucleicos, y liposomas. Tambien pueden usarse carbohidratos para tomar como diana CD123. Es posible que el compuesto pueda no ser una molecula biologica natural. Dichos qmmicos pueden prepararse por bibliotecas combinatorias que son muy conocidas en la tecnica, siendo el objetivo del ensayo la union del compuesto qmmico a CD123. Los liposomas pueden acomodar determinadas toxinas u otras sustancias daninas para las celulas o pueden usarse compuestos de formacion de imagenes celulares para tomar como diana CD123. Se contemplan por el metodo de la invencion numerosas variaciones y combinaciones de compuestos como agentes de direccionamiento, siempre que CD123 sea la diana, con el conocimiento de que se mantiene en mente la deteccion de la leucemia y el tratamiento de la leucemia.

Mimeticos de anticuerpos anti-CD123

Tambien es posible usar la tecnologfa de anti-idiotipo para aislar o cribar compuestos o mimeticos que mimetizan un

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epftopo. As^ un anticuerpo monoclonal anti-idiotfpico que es la imagen del epftopo unido por el primer anticuerpo monoclonal, ya que actua efectivamente como un antigeno, puede usarse para aislar mimeticos de una biblioteca qmmica combinatoria, u otras bibliotecas, de compuestos qmmicos u otros compuestos, tal como bibliotecas de exposicion en fago de peptidos (Scott y Smith, Science 249: 386-390, 1990; Scott y Craig, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 40-48 , 1992; Bonnycastle et al., J. Mol. Biol. 258: 747-762, 1996). Por lo tanto, pueden clonarse peptidos o peptidos constrenidos que mimetizan protemas u otros compuestos, incluyendo aquellos con restos de acido nucleico, ftpido, carbohidrato u otros restos (Harris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94: 2454-2459, 1997).

Pueden disenarse moleculas puramente sinteticas, que pueden no aparecer en la naturaleza y, por lo tanto, son mas resistentes a catabolismo, excrecion o degradacion, por el posicionamiento tridimensional de atomos, de manera que existen fuerzas ionicas, fuerzas covalentes, fuerzas de van der Waal u otras fuerzas similares, y complementariedad de carga, o complementariedad electrostatica, similar, entre los atomos del mimetico y los atomos del sitio de union antigenico o epftopo. Estos mimeticos pueden cribarse para union de alta afinidad a CD123 y detectar y/o danar la celula que porta CD123 in vitro o in vivo, como se describe con mas detalle mas adelante.

Preparaciones de diagnostico y farmaceuticas

La descripcion tambien se refiere a un metodo para preparar composiciones de diagnostico o farmaceuticas que comprenden el compuesto de union a CD123 y sus mimeticos. La preparacion farmaceutica incluye un vetftculo farmaceuticamente aceptable. Dichos veldculos, tal y como se usa en la presente memoria, significan materiales no toxicos que no interfieren con la eficacia de la actividad biologica de los ingredientes activos. El termino "fisiologicamente aceptable" se refiere a un material no toxico que es compatible con un sistema biologico tal como una celula, cultivo celular, tejido, u organismo. Las caractensticas del vetftculo dependeran de la ruta de administracion. Los vehftculos fisiologicamente y farmaceuticamente aceptables incluyen diluyentes, materiales de relleno, sales, tampones, estabilizantes, solubilizantes, y otros materiales que son muy conocidos en la tecnica.

Los anticuerpos anti-CD123 y mimeticos pueden marcarse por una variedad de medios para uso en aplicaciones de diagnostico y/o farmaceuticas. Hay diferentes marcadores y metodos de marcaje conocidos para los expertos en la tecnica. Los ejemplos de tipos de marcadores que pueden usarse en la presente invencion incluyen enzimas, radioisotopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes, y compuestos bioluminiscentes. Los expertos en la tecnica conoceran otros marcadores adecuados para unirse al compuesto de union a CD123, tales como anticuerpos monoclonales, o mimeticos de estos, o seran capaces de averiguarlo tal como, usando experimentacion rutinaria. Ademas, la union de estos marcadores a los compuestos espedficos para CD123 o sus mimeticos puede hacerse usando tecnicas estandar comunes para los expertos en la tecnica.

En el caso de anticuerpos, otra tecnica de marcaje que puede resultar en una mayor sensibilidad consiste en acoplar los anticuerpos o mimeticos a haptenos de bajo peso molecular. Estos haptenos pueden alterarse espedficamente mediante una segunda reaccion. Por ejemplo, es comun usar haptenos tales como biotina, que reacciona con avidina, o dinitrofenol, piridoxal, o fluorescema, que puede reaccionar con anticuerpos anti-hapteno espedficos.

Kits de diagnostico y tratamiento

Los materiales para uso en el ensayo de la invencion son adecuados idealmente para la preparacion de un kit. Dicho kit puede comprender un medio vehicular que esta compartimentalizado para recibir en confinamiento cercano uno o mas medios de contenedor tales como viales, tubos y semejantes, comprendiendo cada medio de contenedor uno de los elementos separados que se van a usar en el metodo. Por ejemplo, uno de los medios de contenedor puede comprender un compuesto que se une a CD123, tal como un anticuerpo monoclonal, o un mimetico de este, que esta, o puede estar, marcado de forma detectable con un marcador que es adecuado para propositos de diagnostico o si desea tratamiento, un agente citotoxico o danino. En el caso de un kit de diagnostico, el kit tambien puede tener contenedores que contienen tampon o tampones y/o un contenedor que comprende un medio informador, tal como una protema de union a biotina, tal como avidina o estreptavidina, unido a una molecula informadora, tal como un marcador enzimatico o fluorescente. Ademas del material qrnmico, se incluye por supuesto un medio de instrucciones para usar el kit, preferiblemente bien para diagnosticar leucemia, o tratar leucemia. Los medios de instrucciones pueden estar escritos en el vial, tubo y semejantes, o escritos en un papel separado, o en la parte exterior o interior del contenedor. Las instrucciones tambien pueden estar en la forma de un formato multimedia, tal como CD, disco de ordenador, video etc.

Preparacion de inmunotoxinas

Aunque la preparacion de inmunotoxinas es muy conocida, en general, en la tecnica (veanse, por ejemplo, las Pat. U.S. Nos. 4.340.535 y EP 44167), los inventores son conscientes de que pueden conseguirse determinadas ventajas mediante la aplicacion de una determinada tecnologfa preferida, tanto en la preparacion de las inmunotoxinas como en su purificacion para la administracion clrnica posterior. Por ejemplo, aunque las inmunotoxinas basadas en IgG presentaran ftpicamente una mejor capacidad de union y un aclaramiento de la sangre mas lento que sus equivalentes Fab', las inmunotoxinas basadas en el fragmento Fab' presentaran generalmente una mejor capacidad de penetrar en los tejidos comparadas con inmunotoxinas basadas en IgG.

Ademas, aunque se conocen numerosos tipos de conectores que contienen enlace disulfuro que pueden emplearse

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con exito para conjugar el resto de toxina con el agente de union, se preferiran generalmente determinados conectores sobre otros conectores, sobre la base de diferentes caractensticas y capacidades farmacologicas. Por ejemplo, se prefieren los conectores que contienen un enlace disulfuro que esta "impedido" estericamente, debido a su mayor estabilidad in vivo, evitando de esta manera la liberacion del resto de toxina antes de su union al sitio de accion.

Los reactivos de entrecruzamiento se usan para formar puentes moleculares que unen conjuntamente grupos funcionales de dos protemas diferentes (por ejemplo, una toxina y un agente de union). Para unir dos protemas diferentes de una manera por etapas, pueden usarse entrecruzadores hetero bifuncionales que eliminan la formacion no deseada de homopolfmeros. Un entrecruzador hetero bifuncional ejemplar contiene dos grupos reactivos: uno que reacciona con grupo amina primaria (por ejemplo, N-hidroxi-succinimida) y el otro que reacciona con un grupo tiol (por ejemplo, disulfuro de piridilo, maleimidas, halogenos, etc.). A traves del grupo reactivo amina primaria, el entrecruzador puede reaccionar con el o los residuos de lisina de una protema (por ejemplo, el anticuerpo o fragmentos seleccionado) y a traves del grupo reactivo tiol, el entrecruzador, ya unido a la primera protema, reacciona con el residuo de cistema (grupo sulhidrilo libre) de la otra protema (por ejemplo, dgA).

El brazo espaciador entre estos dos grupos reactivos de cualesquiera entrecruzadores puede tener varias longitudes y composiciones qmmicas. Un brazo espaciador mas largo permite una mejor flexibilidad de los componentes del conjugado mientras algunos componentes particulares en el puente (por ejemplo, grupo benceno) pueden prestar una estabilidad extra al grupo reactivo o una resistencia incrementada de la union qmmica a la accion de varios aspectos (por ejemplo, enlace disulfuro resistente a agentes reductores).

El reactivo de entrecruzamiento mas preferido es SMPT, que es un entrecruzador bifuncional que contiene un enlace disulfuro que esta "impedido estericamente" por un anillo benceno adyacente y grupos metilo. Se cree que el impedimento esterico del enlace disulfuro cumple una funcion de proteger el enlace del ataque por aniones tiolato tal como glutation que pueden estar presentes en tejidos y sangre, y de esta manera ayuda a evitar el desacoplamiento del conjugado antes de su administracion al sitio de accion por el agente de union. El reactivo de entrecruzamiento SMPT, como con muchos otros reactivos de entrecruzamiento conocidos, presta la capacidad de entrecruzar grupos funcionales tales como el SH de cistema o aminas primarias (por ejemplo, el grupo amino epsilon de lisina). Otro tipo posible de entrecruzador incluye fenilazidas fotoreactivas hetero-bifuncionales que contienen un enlace disulfuro escindible tal como sulfosuccinimidil-2-(p-azido salicilamido) etil-1,3'-ditiopropionato. El grupo N-hidroxi-succinimidilo reacciona con los grupos amino primarios y la fenilazida (despues de fotolisis) reacciona de forma no selectiva con cualquier residuo de aminoacido.

Aunque los entrecruzadores "impedidos" se preferiran generalmente en la practica de la invencion, pueden emplearse conectores no impedidos y se averiguaran no obstante las ventajas segun esto. Otros entrecruzadores utiles, que no se considera que contienen o generan un disulfuro protegido, incluyen SATA, SPDP y 2-iminotiolano. El uso de dichos entrecruzadores se entiende bien en la tecnica.

Una vez conjugado, sera importante purificar el conjugado de manera que se eliminen los contaminantes tales como cadena A o agente de union no conjugado. Es importante eliminar la cadena A no conjugada debido a la posibilidad de toxicidad incrementada. Ademas, es importante eliminar el agente de union no conjugado para evitar la posibilidad de competicion para el antfgeno entre las especies conjugadas y no conjugadas. En cualquier evento, se describen varias tecnicas de purificacion en los Ejemplos siguientes que se ha encontrado que proporcionan conjugados con un grado suficiente de pureza para convertirlos en clmicamente utiles. En general, la tecnica mas preferida incorporara el uso de Sefarosa Azul con una etapa de filtracion en gel o permeacion en gel. La Sefarosa Azul es una matriz de columna compuesta por Cibacron Azul 3GA y agarosa, que se ha encontrado que es util en la purificacion de inmunoconjugados. El uso de Sefarosa Azul combina las propiedades de intercambio ionico con union de cadena A para proporcionar una buena separacion de la union conjugada de la no conjugada.

La Sefarosa Azul permite la eliminacion del agente de union libre (no conjugado) (por ejemplo, el anticuerpo o fragmento) de la preparacion de conjugado. Para eliminar la toxina libre (no conjugada) (por ejemplo, dgA), se prefiere una etapa de cromatograffa por exclusion molecular usando bien un procedimiento convencional de filtracion en gel o cromatograffa lfquida de alto rendimiento.

Despues de que se haya preparado un conjugado suficientemente purificado, se deseara prepararlo en una composicion farmaceutica que pueda administrarse parenteralmente. Esto se hace mediante el uso para la ultima etapa de purificacion de un medio con una composicion farmaceutica adecuada.

Las composiciones farmaceuticas adecuadas segun la invencion comprenderan generalmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg del conjugado deseado mezclado con un diluyente o excipiente farmaceutico aceptable, tal como una disolucion acuosa esteril, para proporcionar una concentracion final de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 2,5 mg/ml respecto al conjugado. Dichas formulaciones incluiran tfpicamente tampones tales como disolucion salina tamponada con fosfato (PBS), o aditivos adicionales tales como excipientes farmaceuticos, agentes estabilizantes tales como BSA o HSA, o sales tales como cloruro de sodio. Para la administracion parenteral, es deseable generalmente convertir ademas dichas composiciones en farmaceuticamente aceptables asegurando su esterilidad, no inmunogenicidad y no pirogenicidad. Dichas tecnicas son generalmente

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muy conocidas en la tecnica como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed. Mack Publishing Company, 1980.

Se apreciara que la contaminacion por endotoxinas debe mantenerse mmimamente a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de protema. Ademas, para la administracion a seres humanos, las preparaciones deben cumplir con los estandares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza segun requiere la Oficina de la FDA de Estandares Biologicos.

Una formulacion parenteral preferida de las inmunotoxinas segun la presente descripcion es 0,25 a 2,5 mg de conjugado/ml en disolucion acuosa 0,15M de NaCl a pH 7,5 a 9,0. Las preparaciones pueden almacenarse congeladas a -100C a -700C durante al menos 1 ano.

Se contempla que la mayor parte de las aplicaciones terapeuticas de la presente invencion implicaran el direccionamiento de un resto de toxina (agente citotoxico) al marcador de leucemia CD123. Esto se debe a la capacidad mucho mayor de la mayor parte de las toxinas de administrar un efecto que mata a las celulas comparado con otros agentes potenciales.

Sin embargo, hay muchas circunstancias tales como cuando el antfgeno diana no se internaliza por una ruta consistente con la intoxicacion eficiente por inmunotoxinas, en las que se deseara dirigir agentes quimioterapeuticos tales como citoquinas, antimetabolitos, agentes alquilantes, hormonas, y semejantes. Las ventajas de estos agentes sobre sus equivalentes no conjugados con anticuerpo es la selectividad anadida proporcionada por el anticuerpo. Se podnan mencionar, como ejemplo, agentes tales como esteroides, citosina arabinosido, metotrexato, aminopterina, antraciclinas, mitomicina C, alcaloides de vinca, demecolcina, etoposido, mitramicina, y semejantes. Esta lista es, por supuesto, meramente ejemplar ya que la tecnologfa para unir agentes farmaceuticos a anticuerpos para la administracion espedfica a tejidos esta bien establecida.

Un resto citotoxico preferido para uso en la presente invencion es un radioisotopo, que puede acoplarse a o conjugarse con, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD123. Los radioisotopos preferidos incluyen emisores a tales como, por ejemplo, 211Astatina, 212Bismuto y 213Bismuto, asf como emisores B tales como, por ejemplo, 131Yodo,

90 •r77 J 1 153 109 J ' 211 131

Itrio, Lutecio, Samario y Paladio. Los radioisotopos particularmente preferidos son Astatina y Yodo.

Se propone que los beneficios particulares tambien pueden conseguirse a traves de la aplicacion de la invencion a la formacion de imagenes celulares. Se cree que la formacion de imagenes de celulas leucemicas proporciona una ventaja importante cuando se compara con las tecnicas de formacion de imagenes disponibles, ya que las celulas son facilmente accesibles.

Ademas, la tecnologfa para unir iones paramagneticos, radiactivos e incluso fluorogenicos a anticuerpos esta bien establecida. Muchos de estos metodos implican el uso de un complejo de quelato metalico empleando, por ejemplo, un agente quelante organico tal como DTPA unido al anticuerpo (vease, por ejemplo, Pat. U.S. No. 4.472.509). En el contexto de la presente invencion, el ion seleccionado se dirige asf al area cancerosa por el anticuerpo, permitiendo que la formacion de imagenes continue por medio del ion unido.

En una realizacion preferida, en el metodo de la invencion, los anticuerpos tambien pueden fusionarse a una molecula proteica efectora por medios recombinantes tal como a traves del uso de tecnicas de ADN recombinante para producir un acido nucleico que codifica tanto el anticuerpo como la molecula efectora y expresar la secuencia de aDn en una celula huesped tal como E. coli. El ADN que codifica la protema quimerica puede clonarse en ADNc o en forma genomica por cualquier procedimiento de clonacion conocido para los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989).

La fusion o conjugacion de anticuerpos a varios marcadores produce un marcador detectable altamente espedfico que puede usarse para detectar la presencia o ausencia de celulas o tejidos que portan la molecula particular con la que el anticuerpo se detecta. Alternativamente, los anticuerpos pueden conjugarse o fusionarse qmmicamente con una molecula efectora que otro resto de union espedfico, por ejemplo, un ligando tal como los descritos anteriormente. En esta forma, la composicion actuara como un conector bifuncional altamente espedfico. Este conector puede actuar para unir y aumentar la interaccion entre celulas o componentes celulares a los que se une la protema de fusion. Asf, por ejemplo, cuando la protema de fusion es un factor de crecimiento unido a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento Fv de un anticuerpo), el anticuerpo puede unirse espedficamente a celulas cancerosas positivas para el antfgeno mientras el factor de crecimiento se une a receptores en la superficie de celulas inmunes. La protema de fusion puede actuar asf para aumentar y dirigir una respuesta inmune frente a las celulas cancerosas diana.

Deteccion y diagnostico in vitro

El metodo de usar los compuestos que se unen a CD123 y sus mimeticos es adecuado para uso in vitro, por ejemplo, en inmunoensayos en los que pueden utilizarse en fase lfquida o unidos a un vehmulo en fase solida. Ademas, los anticuerpos monoclonales en estos inmunoensayos pueden marcarse de forma detectable de varias maneras. Los ejemplos de tipos de inmunoensayos que pueden utilizar los anticuerpos monoclonales y sus mimeticos son inmunoensayos competitivos y no competitivos bien en formato directo o indirecto. Los ejemplos de

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dichos inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA) y el ensayo en sandwich (inmunometrico). La deteccion de antigenos usando los anticuerpos monoclonales y sus mimeticos puede hacerse utilizando inmunoensayos que se operan bien en modos directo, inverso o simultaneo, incluyendo ensayos inmunohistoqmmicos en muestras fisiologicas. Los expertos en la tecnica conoceran, o pueden averiguar facilmente, otros formatos de inmunoensayo sin experimentacion excesiva.

Los compuestos que se unen a CD123 y mimeticos pueden unirse a muchos vehfculos diferentes y usarse para detectar la presencia de celulas de leucemia que portan CD123, incluyendo celulas progenitoras. Los ejemplos de vehuculos muy conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nilon, amilasa, celulosa natural y modificada, poliacrilamida, agarosa y magnetita. La naturaleza del vehuculo puede ser bien soluble o insoluble para los propositos de la invencion. Los expertos en la tecnica conoceran otros vehuculos adecuados para unir varios compuestos, o seran capaces de averiguarlo, usando experimentacion rutinaria.

Para los propositos de la invencion, CD123 puede detectarse por los compuestos y sus mimeticos cuando esta presente en fluidos y tejidos biologicos. Puede usarse cualquier muestra que contiene una cantidad detectable de ectopeptido CD123. Una muestra puede ser un lfquido tal como orina, saliva, fluido cerebroespinal, sangre, suero o semejantes; un solido o semi-solido tal como tejidos, heces, o semejantes; o, alternativamente, un tejido solido tal como los usados comunmente en diagnostico histologico.

Deteccion in vivo de CD123

Mediante el uso de los compuestos de union a CD123 y mimeticos para la deteccion in vivo de CD123, el compuesto marcado de forma detectable o su mimetico se proporciona en una dosis que es diagnosticamente efectiva. El termino "diagnosticamente efectiva" significa que la cantidad de compuesto marcado de forma detectable, tal como anticuerpo monoclonal o mimetico, se administra en una cantidad suficiente como para permitir la deteccion de las celulas de leucemia para las que son espedficos los compuestos o mimeticos.

La concentracion de compuesto marcado de forma detectable o mimetico que se administra debera ser suficiente de manera que la union a CD123 o celulas de leucemia que portan CD123, es detectable comparado con el fondo. Ademas, es deseable que el compuesto marcado de forma detectable o mimetico se aclare rapidamente del sistema circulatorio con el fin de proporcionar la mejor relacion de senal diana a fondo.

Como regla, la dosificacion de compuesto marcado de forma detectable o mimetico para el diagnostico in vivo variara dependiendo de factores tales como edad, sexo, y grado de enfermedad del individuo. La dosificacion del compuesto puede variar de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg, preferiblemente aproximadamente

0,1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, lo mas preferiblemente aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Dichas dosificaciones pueden variar, por ejemplo, dependiendo de si se proporcionan multiples inyecciones, del tejido que se esta ensayando, y otros factores conocidos para los expertos en la tecnica.

Para la formacion de imagenes de diagnostico in vivo, el tipo de instrumento de deteccion disponible es un factor importante en la seleccion de un radioisotopo apropiado. El radioisotopo elegido debe tener un tipo de desintegracion que es detectable para el tipo de instrumento dado. Otro factor importante mas en la seleccion de un radioisotopo para el diagnostico in vivo es que la vida media del radioisotopo sea lo suficientemente larga de manera que sea aun detectable en el momento de la captacion maxima por la diana, pero lo suficientemente corta de manera que sea aceptable la radiacion perjudicial respecto al huesped. Idealmente, un radioisotopo usado para la formacion de imagenes in vivo carecera de una emision de partfculas, pero producira un gran numero de fotones en el rango 140-250 keV, que puede detectarse facilmente por camaras gamma convencionales.

Para el diagnostico in vivo, los radioisotopos pueden unirse al compuesto bien directamente o indirectamente mediante el uso de un grupo funcional intermedio. Los grupos funcionales intermedios que se usan frecuentemente para unir radioisotopos que existen como iones metalicos son los agentes quelantes bifuncionales tales como acido dietilentriaminopentacetico (DTPA) y acido etilendiaminotetra-acetico (EDTA) y moleculas similares. Los ejemplos tfpicos de iones metalicos que pueden unirse a anticuerpos monoclonales son 111In, 97Ru, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr, 99Tc, 123I y 201TI.

En el metodo de diagnostico de la descripcion, los compuestos y mimeticos tambien pueden marcarse con un isotopo paramagnetico para propositos de diagnostico in vivo, como en formacion de imagenes por resonancia magnetica (MRI) o resonancia por spin electronico (ESR). En general, puede utilizarse cualquier metodo convencional para visualizar la formacion de imagenes de diagnostico. Usualmente, se usan radioisotopos emisores gamma o de positrones para la formacion de imagenes de camara e isotopos paramagneticos para MRI. Los elementos que son particularmente utiles en dichas tecnicas incluyen 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr y 56Fe.

En el metodo de monitorizacion de celulas de la invencion, los compuestos y mimeticos pueden usarse in vitro e in vivo para monitorizar el curso de la terapia frente a la enfermedad leucemica. Asf, por ejemplo, mediante la medicion del incremento o disminucion de las moleculas biologicas asociadas con dichas enfermedades o cambios en la concentracion de ectopeptido CD123 o celulas de leucemia que portan CD123 presentes en el cuerpo o en varios fluidos corporales, sena posible determinar si es efectivo un regimen terapeutico particular que tiene el objetivo de

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mejorar la enfermedad leucemica anterior.

Profilaxis y terapia de leucemia

Los compuestos espedficos para CD123 tambien pueden usarse terapeuticamente para el tratamiento de leucemia tanto en seres humanos como en otros animales. El termino, "terapeuticamente" o "terapia" tal y como se usa en la presente memoria en conjuncion con el metodo de la invencion esta dirigido al uso de compuestos de union a CD123, tales como anticuerpos monoclonales anti-CD123 y sus mimeticos, lo que indica la administracion profilactica asf como terapeutica y la inmunizacion pasiva con productos polipeptidicos sustancialmente purificados, y mimeticos, asf como la terapia genica por transferencia de secuencias polinucleotidicas que codifican el producto o parte de este. Asf, los compuestos y mimeticos pueden administrarse a sujetos de alto riesgo con el fin de disminuir la probabilidad y/o gravedad de recidiva de leucemia, o administrarse a sujetos que ya evidencian enfermedad de leucemia activa.

Para determinadas aplicaciones, se considera que los agentes farmacologicos serviran como agentes utiles para la union a los compuestos, particularmente agentes citotoxicos o anticelulares de otra manera que tienen la capacidad de matar o suprimir el crecimiento o division celular de las celulas de leucemia. En general, la invencion contempla el uso de cualquier agente farmacologico que pueda conjugarse con un compuesto de union a CD123 y administrarse en forma activa a la celula diana. Los agentes anticelulares ejemplares incluyen agentes quimioterapeuticos, radioisotopos asf como citotoxinas. En el caso de agentes quimioterapeuticos, los inventores proponen los agentes tales como una hormona tal como un esteroide; un antimetabolito tal como citosina arabinosido, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina; una antraciclina; mitomicina C; un alcaloide de vinca; demecolcina; etoposido; mitramicina; caliqueamicina, CC-1065 y derivados de este, o un agente alquilante tal como clorambucilo o melfalan, seran particularmente preferidos. Otras realizaciones pueden incluir agentes tales como un coagulante, una citoquina, factor de crecimiento, endotoxina bacteriana o el resto de lfpido A de endotoxina bacteriana. En cualquier evento, se propone que los agentes tales como estos pueden conjugarse con exito a anticuerpos de una manera que permitira su direccionamiento, internalizacion, liberacion o presentacion a los componentes de la sangre en el sitio de las celulas de leucemia diana segun se requiere usando tecnologfa de conjugacion.

En determinadas realizaciones preferidas. los agentes citotoxicos para aplicacion terapeutica incluiran generalmente una toxina derivada de planta, hongo, o bacteria, tal como toxinas de cadena A, una protema inactivadora de ribosomas, a-sarcina, aspergilina, restirictocina, una ribonucleasa, toxina de difteria o exotoxina de pseudomonas, por mencionar solo unos pocos ejemplos. El uso de construcciones toxina-anticuerpo es muy conocido en la tecnica de inmunotoxinas, como lo es su union a anticuerpos. De estas, una toxina particularmente preferida para la union a anticuerpos sera la cadena A de ricina desglicosilada. La cadena A de ricina desglicosilada se prefiere debido a su extrema potencia, vida media mas larga, y debido a que es economicamente factible de fabricar un grado y escala clmico.

En otras realizaciones preferidas, el agente citotoxico puede ser un radioisotopo. Los radioisotopos preferidos incluyen emisores a tales como, por ejemplo, 211Astatina, 212Bismuto y 213Bismuto, asf como emisores p tales como, por ejemplo, 131Yodo, 90Itrio, 177Lutecio, 153Samario y 109Paladio.

Tal y como se usa en la presente memoria, una "cantidad terapeuticamente efectiva" de un compuesto es una dosificacion lo suficientemente alta como para producir el efecto deseado en el que los smtomas de la leucemia o la probabilidad del inicio de la leucemia estan disminuidos. Una cantidad terapeuticamente efectiva no es, sin embargo, una dosificacion tan alta como para causar efectos secundarios adversos, tales como smdromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, fallo cardiaco congestivo, y semejantes. Generalmente, una cantidad terapeuticamente efectiva puede variar con la edad, condicion, y sexo del sujeto, asf como el grado de la enfermedad en el sujeto y puede ser determinada por un experto en la tecnica. La dosificacion puede ajustarse por el medico o veterinario del individuo en el evento de cualquier complicacion. Una cantidad terapeuticamente efectiva puede variar de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, lo mas preferiblemente de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, en una o mas administraciones de dosis diariamente, durante uno o varios dfas.

Los compuestos y sus mimeticos pueden administrarse por inyeccion o por infusion gradual con el tiempo. La administracion de los compuestos y sus mimeticos puede ser, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, subcutanea, o transdermica.

Las preparaciones para administracion parenteral incluyen disoluciones, suspensiones, y emulsiones esteriles acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilen glicol, polietilen glicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehnculos acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones alcoholicas/acuosas, incluyendo disolucion salina o medios tamponados. Los vehnculos parenterales incluyen disolucion de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactato o aceites fijados. Los vehnculos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y semejantes. Tambien pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, anti- oxidantes, agentes quelantes, y gases inertes y semejantes.

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Dependiendo del estado clmico espedfico de la enfermedad, la administracion puede hacerse a traves de cualquier sistema de administracion sistemica aceptado, por ejemplo, a traves de la ruta oral o ruta parenteral tal como ruta intravenosa, intramuscular, subcutanea o percutanea, o ruta vaginal, ocular o nasal, en formas de dosificacion solidas, semi-solidas o lfquidas, tales como, por ejemplo, comprimidos, supositorios, pfldoras, capsulas, polvos, disoluciones, suspensiones, crema, gel, implante, parche, pesario, aerosoles, colirio, emulsiones o semejantes, preferiblemente en formas de dosificacion unitarias adecuadas para la administracion facil de dosificaciones fijadas. Las composiciones farmaceuticas incluiran un transportador o veldculo convencional y un compuesto de union a CD123 y, ademas, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmaceuticos, vehfculos, adyuvantes, etc.

Si se desea, la composicion farmaceutica que se va a administrar tambien puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no toxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH y semejantes, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina, etc.

Los compuestos se administran generalmente como una composicion farmaceutica que comprende un vehfculo farmaceutico en combinacion con un compuesto de union a CD123. La cantidad del farmaco en una formulacion puede variar en el intervalo completo empleado por los expertos en la tecnica, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 por ciento en peso (% en peso) a aproximadamente 99,99% en peso del farmaco basado en la formulacion total y aproximadamente 0,01% en peso a 99,99% en peso de excipiente.

El modo preferido de administracion, para las condiciones mencionadas anteriormente, es la administracion oral usando un regimen de dosificacion diario conveniente que puede ajustarse segun el grado de la afeccion. Para dicha administracion oral, una composicion farmaceuticamente aceptable, no toxica, se forma por la incorporacion del compuesto de union a CD123 seleccionado en cualquiera de los excipientes usados actualmente, tales como, por ejemplo, grados farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio, y semejantes. Dichas composiciones toman la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, pfldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y semejantes. Dichas composiciones pueden contener entre aproximadamente 0,01% en peso y 99,99% en peso del compuesto activo segun esta invencion.

Preferiblemente, las composiciones tendran la forma de una pfldora o comprimido recubierto con azucar y asf contendran, junto con el ingrediente activo, un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato de dicalcio, y semejantes; un disgregante tal como almidon o derivados de este; un lubricante tal como estearato de magnesio y semejantes; y un aglutinante tal como almidon, polivinilpirrolidona, goma arabiga, gelatina, celulosa y derivados de esta, y semejantes.

Se entiende que por "composicion farmaceutica", se quiere decir que el compuesto de union a CD123 se formula en una sustancia que es para administrarse con el proposito de diagnosticar o tratar la leucemia en el individuo. Y, por "composicion farmaceutica", se excluye aquellas composiciones que se usan para administrar a individuos como compuestos de ensayo para un proposito distinto de como un agente de diagnostico o tratamiento para la leucemia.

Varios estudios recientes han sugerido la presencia e importancia de celulas madre tanto en la genesis como en la perpetuacion de AML. Fenotfpicamente, las celulas descritas como CD34+/CD38- o CD34+/HLA-DR- parecen jugar un papel central en el desarrollo de las poblaciones leucemicas (Bonnet D, et al., Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat.Med. 1997, 3: 730-737; Blair A, et al., Most acute myeloid leukemia progenitor cells with long-term proliferative ability in vitro and in vivo have the phenotype Cd34(+)/CD71(-)/HlA-DR-. Blood 1998, 92: 4325-35). Ademas, hay evidencias que sugieren que dichas celulas pueden ser relativamente resistentes a farmacos quimioterapeuticos, y consecuentemente, contribuir al fenomeno de recidiva (Terpstra W, et al., Fluorouracil selectively spares acute myeloid leukemia cells with long-term growth abilities in immunodeficient mice and in culture. Blood 1996, 88: 1944-50). Asf, una mejor comprension de la biologfa de LSC y la caracterizacion de antfgenos de LSC unicos es esencial para el desarrollo de mejores tratamientos para AML.

Aunque los varios subtipos de AML presentan una diversidad considerable respecto a caractensticas de desarrollo, fenotipo, respuesta a citoquinas, etc., parece que hay un grado marcado de conservacion funcional a nivel de las celulas leucemicas mas primitivas. Esta caractenstica se ha demostrado por el trabajo de Bonnet et al., en el que se mostro que una subpoblacion CD34+/CD38- era suficiente para establecer leucemia en ratones NOD/SCID (Bonnet D, et al., Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat.Med. 1997, 3: 730-737). Estudios similares por otros han corroborado la existencia de celulas madre leucemicas tanto para AML como CML y confirmaron su fenotipo y capacidad funcional relativamente homogeneos (Blair A, Hogge et al., Most acute myeloid leukemia progenitor cells with long-term proliferative ability in vitro and in vivo have the phenotype CD34(+)/CD71 (-)/HLA-dR-. Blood 1998, 92: 4325-35; Holyoake T, et al., Isolation of a highly quiescent subpopulation of primitive leukemic cells in chronic myeloid leukemia. Blood 1999, 94: 2056-64). Sin embargo, hasta la fecha, ningun estudio ha identificado una caractenstica antigenica de LSC mieloides que pueda permitir su identificacion o direccionamiento diferencial para terapia ablativa. En este trabajo, hemos identificado un aspecto en comun adicional entre las celulas madre de AML CD34+/CD38-, la expresion de CD123, lo que facilita su discriminacion de las celulas madre hematopoyeticas normales. Aunque el antfgeno CD123 se detecto facilmente a altos niveles en celulas AML, la cadena p del receptor de IL-3, CD131, no se detecto.

Nuestros experimentos indican que el factor de transcripcion IRF-1 (factor regulador de interferon 1) esta sobreexpresado (en 6 de 6 muestras de AML primaria examinadas). Estudios previos por Korpelainen et al., han mostrado que el tratamiento de celulas endoteliales con IFN-y resulta en la regulacion al alza de CD123 (Korpelainen EI, et al., Interferon-gamma upregulates interleukin-3 (IL-3) receptor expression in human endothelial 5 cells and synergizes with IL-3 in stimulating major histocompatibility complex class II expression and cytokine production. Blood 1995, 86: 176-82). De forma similar, nuestros propios estudios han mostrado que el tratamiento de celulas de AML primaria con IFN-y incrementa la expresion de CD123 (datos no mostrados). Asf, la expresion aberrante de moleculas reguladoras de interferon podna jugar un papel en el control de la expresion de CD123 en celulas de AML.

10 La expresion del antfgeno CD123 demuestra formalmente que las LSC son biologicamente distintas de sus equivalentes de celulas madre normales. Como CD123 no se encuentra facilmente en celulas madre hematopoyeticas normales, proporciona un marcador unico que puede usarse para identificar tejido maligno. Esta caractenstica puede ser util para propositos de investigacion, asf como en estudios de enfermedad residual minima (MRD). Ademas, el epftopo de CD123 representa una diana a la que pueden dirigirse estrategias terapeuticas. 15 Estudios clmicos previos han usado anticuerpos monoclonales tanto frente a los antfgenos CD33 como CD45 como un medio para administrar radioisotopos a celulas de AML in vivo (Appelbaum FR., Antibody-targeted therapy for myeloid leukemia. Semin Hematol 1999, 36: 2-8.). Ademas, varios otros estudios recientes han mostrado resultados excitantes usando anticuerpos monoclonales espedficos para antfgenos en celulas malignas tales como CD20, CD52, y Her-2 (Maloney DG., Advances in immunotherapy of hematologic malignancies. Curr Opin Hematol 1998; 5: 20 237-43; Sikic BI., New approaches in cancer treatment. Ann Oncol 1999, 10 Supl 6: 149-53). Los anticuerpos frente

a CD123 pueden ser utiles en un paradigma similar y seran capaces de administrar una diana citotoxica que tiene como diana espedficamente la poblacion de celulas madre leucemicas.

Hemos mostrado que CD123 representa un marcador antigenico unico para la identificacion de celulas leucemicas primitivas a partir de un amplio rango de muestras humanas a lo largo de un amplio rango de enfermedades 25 leucemicas. Nuestros estudios muestran que CD123 se expresa generalmente a altos niveles y puede ser indicativo de aspectos no caracterizados previamente de la biologfa de la leucemia.

La presente invencion se ilustrara adicionalmente en los Ejemplos siguientes no limitativos. Los Ejemplos son solo ilustrativos y no limitan la invencion reivindicada respecto a los materiales, condiciones, parametros del proceso y semejantes recitados en la presente memoria.

30 Ejemplos

Ejemplo 1. - Materiales y metodos: procesamiento celular

Las celulas de AML primaria se obtuvieron de la sangre periferica o medula osea de pacientes. La medula osea normal se obtuvo como material de desecho despues de analisis patologico, recogida quirurgica de medula, o del National Disease Research Interchange (NDRI). Las celulas de medula se deplecionaron de eritrocitos por 35 suspension en 150mM NH4Cl + 10mM NaHCO3 durante 5 minutos, seguido de dos lavados con disolucion salina tamponada con fosfato (PBS). Las celulas sangumeas se sometieron a separacion en gradiente de densidad Ficoll- Paque (Pharmacia) para aislar el compartimento de celulas sangumeas blancas mononucleares. Los leucocitos resultantes de medula o sangre se usaron para seleccion por inmunoafinidad, y/o analisis o separacion por citometna de flujo. Para la seleccion de celulas CD34+, se uso el dispositivo de inmunoafinidad Miltenyi (varioMACs) 40 segun las instrucciones del fabricante. En algunos casos, los leucocitos se crioconservaron a una concentracion de 5 x 107 celulas/ml en medio de congelacion que consistio en medio de Dulbecco modificado por Iscoves (IMDM), 40% suero fetal bovino (FBS) y 10% dimetilsulfoxido (DMSO).

Ejemplo 2. - Citometna de flujo

Los receptores de citoquina se detectaron marcando con los anticuerpos monoclonales siguientes: CD114-biotina, 45 CD116-FITC, CD123-PE, CD131-biotina (todos de Pharmingen), CD117-PE (Coulter), y CD135-PE (Caltag). Los anticuerpos biotinilados se visualizaron por marcaje posterior con estreptavidina-PE (SA-Pe, Becton Dickinson). Las subpoblaciones de AML primitivas se identificaron usando CD34-FITC o CD34-PE en combinacion con CD38-APC (Becton Dickinson). Las celulas de AML primaria se identificaron en ratones NOD/SCID usando CD45-PE (Pharmingen) espedfico para celulas humanas. Para analizar las celulas trasplantadas en ratones NOD/SCID, se 50 recogio medula osea a las 6-8 semanas despues del trasplante. Las celulas se bloquearon con el anticuerpo antireceptor Fc 2.4G2 y 25% de suero humano, seguido de un doble marcaje con anticuerpos espedficos de CD34- FITC y CD45-PE humanos. Las muestras control consistieron en celulas de medula de ratones no trasplantados. En algunos casos, las celulas tambien se marcaron con CD123-PE para asegurar una expresion sostenida del antfgeno CD123. Para cada muestra, se analizaron 50.000-100.000 eventos. Usando esta estrategia, las celulas humanas 55 pudieron detectarse de forma fiable hasta una frecuencia tan baja como 0,1%. Cualquiera de los analisis que se encontro por debajo de 0,1% de celulas positivas se considero negativo.

Ejemplo 3. - Inmunotransferencias

Las muestras de celulas se lisaron a una concentracion de 2 x 107 celulas/ml en PBS que contema: 1% NP-40, 0,5%

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

deoxicolato, 0,1% dodecil sulfato de sodio (SDS), 1mM vanadato de sodio (Na3VO4), 30jl de aprotinina (Sigma), 1mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (Sigma), 1jg/ml pepstatina, y 1|jg/ml leupeptina (Oncogene Research); se incubo en hielo durante 30 minutos, y se centrifugo a 15.0o0 xg durante 10 minutos para eliminar los restos celulares. El lisado de protema resultante se alicuoto y se almaceno a -80°C. Para el analisis de inmunotransferencia, los lisados de protema se descongelaron y se mezclaron con tampon de muestra y agente reductor (Novex, San Diego, CA., segun las instrucciones del fabricante), y se calento a 70°C durante 10 minutos. Las muestras se analizaron inmediatamente por PAGE desnaturalizante (Novex, geles 4-12% Bis-Tris o 7% Tris-Acetato) usando el equivalente a 4 x 105 celulas por carril. Despues de la electroforesis, las muestras se electro-transfirieron a una membrana Immobilon-P (Millipore) y se ensayaron con los anticuerpos indicados. Para detectar CD123 (cadena alfa de IL-3R), se usaron los anticuerpos S-12 (Santa Cruz Biotech) o 9F5 (Pharmingen). Para el analisis de Mek y Akt, se usaron anticuerpos policlonales de conejo espedficos de protema y espedficos de fosfoprotema de New England Biolabs. Se usaron anti-Stat5 policlonal (Transduction Labs) y anti-fosfo-Stat5 (New England Biolabs) para analizar el estado de fosforilacion de Stat5. Todos los anticuerpos primarios se detectaron usando anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina (Santa Cruz Biotechnology) y el reactivo ECF (Pharmacia Biotech) segun las instrucciones del fabricante. Las transferencias se visualizaron usando un sistema STORM 860 de Molecular Dynamics y software Imagequant™.

Ejemplo 4. - Ensayos en ratones NOD/SCID

Se expusieron ratones NOD/SCID (Jackson Laboratories. Bar Harbor, Maine) a 225 rads de irradiacion y de una fuente de 137Cs. Las celulas que se iban a ensayar se resuspendieron en 0,25 mls de HBSS (disolucion salina equilibrada de Hanks, Gibco) con 2% FBS y se inyectaron IV en la vena de la cola. Para el analisis de algunas poblaciones seleccionadas, se co-inyectaron como veldculo 1 x 106 celulas de medula osea de raton irradiadas (2.500 Rads). Despues de 6-8 semanas, los animales se sacrificaron y la medula osea se analizo para la presencia de celulas humanas usando citometna de flujo (vease anteriormente).

Ejemplo 5. - Resultados

El analisis de los receptores de citoquina demuestra una fuerte expresion de CD123 en celulas leucemicas primitivas pero no en celulas normales. Se uso citometna de flujo con multiples parametros para analizar la expresion de receptores de citoquina implicados previamente en el crecimiento de celulas hematopoyeticas malignas. Aunque varios receptores presentaron patrones interesantes de marcaje de anticuerpo, la caractenstica mas llamativa observada fue un nivel notablemente alto y bien conservado de expresion de CD123 (cadena alfa de IL-3R) entre las muestras de AML primaria. La Figura 1 muestra ejemplos representativos del marcaje de CD123 en tejido normal y leucemico. En la Figura 1A se muestran medula normal total asf como subconjuntos mas primitivos respecto a la expresion de CD123. La medula total tiene generalmente aproximadamente 7% de celulas positivas para CD123, pero solo aproximadamente el 1% de la poblacion expresa el antfgeno a altos niveles (vease la insercion en la Figura 1A). La poblacion CD34+ de la medula normal tambien tiene una expresion facilmente evidente de CD123 (12% en la Figura 1A, histograma derecho), como se esperana para una poblacion que se sabe que contiene progenitores hematopoyeticos. El perfil de marcaje mostrado esta de acuerdo con estudios previos por Sato et. al. que tambien han examinado los niveles de IL-3Ra en celulas humanas CD34+ (Sato N, et al., Expression and factor- dependent modulation of the interleukin-3 receptor subunits on human hematopoietic cells. Blood 1993, 82: 752-61.). Sin embargo, el compartimento CD34+/CD38- mas primitivo no muestra una expresion significativa de CD123 (<1%). Por el contrario, las celulas de AML primaria (Figura 1B) presentaron altos niveles de CD123. Tanto en la poblacion global CD34+, como en el compartimento CD34+/CD38- mas primitivo, mas del 99% de las celulas fueron positivas para CD123. La Figura 2 muestra cinco ejemplos adicionales de marcaje de CD123 en celulas de AML CD34+/CD38-, lo que demuestra adicionalmente la fuerte expresion de este antfgeno en poblaciones leucemicas. La Tabla 1 resume los experimentos realizados hasta la fecha en el tipo celular de AML, y muestra los niveles de CD123 para celulas primitivas de los subtipos de AML M1, M2, y M4. De las 18 muestras de AML primaria examinadas, CD123 se expreso fuertemente en las celulas de leucemia primitivas en todos los casos excepto dos. Las dos muestras que tuvieron menores niveles de CD123 (muestras AML-11 y AML-14, Tabla 1) presentaron ambas un desplazamiento uniforme en la expresion de CD123, pero tuvieron una intensidad de marcaje global que fue mas debil que la mayor parte de las muestras ensayadas. En muchos casos (9 de 18), las celulas negativas para CD123 fueron virtualmente indetectables (0% o menos de 1%). A la inversa, la expresion de CD123 no se detecto en 3 de 5 muestras normales de celulas CD34+/CD38- y fue apenas detectable en dos muestras adicionales (<1%). Estos analisis de citometna de flujo se confirmaron usando dos anticuerpos monoclonales anti-CD123 diferentes para asegurar que los resultados no eran un artefacto causado por el uso de un anticuerpo particular.

El alto nivel de expresion de CD123 encontrado en todos los subtipos de AML examinados implica que IL-3Ra podna jugar un papel central en la creacion o mantenimiento del estado leucemico. Para formar el receptor de alta afinidad para IL-3, tanto las cadenas a como p (CD123 y CD131, respectivamente) son necesarias. Asf, la expresion de CD131 tambien se examino por citometna de flujo en las muestras de AML. De forma interesante, aunque se observo alguna expresion en poblaciones a granel de AML, en 15 de 15 muestras CD131 no se detecto nunca en el compartimento CD34+ (datos no mostrados).

Los datos adicionales que demuestran la expresion de CD123 en celulas de ALL primaria y CML primaria, asf como linfoma no de Hodgkin, se discuten en los Ejemplos 8 y 10.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Ejemplo 6. - Propiedades de prendimiento in vivo de celulas leucemicas humanas CD123+ en ratones NOD/SCID.

Dada la fuerte expresion de CD123 observada en la gran mayona de celulas que engloban fenotipicamente la poblacion LSC, pareda probable que CD123 fuera util como un marcador de las LSC. Por lo tanto, para establecer la capacidad funcional de celulas CD123+, se realizaron estudios de trasplante usando el sistema de modelo de ratones NOD/SCID. Se ensayaron tres muestras de AML primaria (AML-2, 5 y 15 de la Tabla 1) separando por citometna de flujo las celulas CD34+/CD123+ y trasplantandolas en ratones NOD/SCID irradiados. Ademas, las celulas remanentes en la poblacion (CD34-/CD123+/-) tambien se separaron y se trasplantaron en paralelo. Los datos en la Figura 3 son un ejemplo representativo de una muestra que mostro un prendimiento fuerte de celulas leucemicas a las seis semanas despues del injerto. El panel A muestra las celulas de medula osea totales marcadas con anticuerpos espedficos para CD34 y CD45 humanos. El perfil de citometna de flujo indica claramente que una gran poblacion de celulas humanas (CD45+) esta presente en la medula. Ademas, la poblacion se divide entre subconjuntos CD34+ y CD34-, de manera similar a las proporciones de marcaje de CD34 observadas en la muestra leucemica original. El panel B muestra la misma muestra de medula separada solo en las celulas CD45+. Los datos indican que todas las celulas que han proliferado in vivo son positivas para CD123. La Tabla 2 resume los datos para las tres muestras ensayadas. En todos los casos, las celulas CD123+ fueron capaces de prendimiento en los animales NOD/SCID. Ademas, en todos los casos excepto uno, las poblaciones CD123- no contribuyeron a la repoblacion in vivo. Asf, como se define por el modelo NOD/SCID, concluimos que CD123 se expresa en las LSC

Finalmente, como un medio independiente para confirmar el origen leucemico de las celulas positivas para CD123, se uso citometna de flujo para separar celulas CD34+/CD123+ de dos muestras leucemicas. Estas muestras se cultivaron durante cuatro dfas, se sincronizaron y se recogieron para analisis citogenetico. El examen de las propagaciones de cada muestra mostro que 20 de 20 metafases eran positivas para la translocacion espedfica de leucemia.

Ejemplo 7. - Papel biologico de la expresion de CD123 en celulas de leucemia.

Para corroborar adicionalmente los datos obtenidos por citometna de flujo, se realizaron estudios de inmunotransferencia para analizar los componentes de la transduccion de la senal de IL-3R. Para estos estudios, cada muestra de AML se derivo de una muestra de sangre periferica y se separo para aislar la poblacion CD34+, asegurando asf una muestra leucemica virtualmente pura. En primer lugar, se examino la expresion tanto de las cadenas a como p de IL-3R. Respecto a CD123, los datos mostrados en la Figura 4 (panel superior) demuestran claramente la expresion en todas las muestras leucemicas ensayadas. Las celulas CD34+ derivadas de medula normal (carril 2, CD34+) tambien muestran una senal debil. Esto es consistente con los datos en la Figura 1A, que muestran que las celulas CD34+ normales contienen frecuentemente un pequeno subconjunto de celulas CD123+. Sin embargo, la expresion de CD123 no se detecto por citometna de flujo en el subconjunto mas primitivo CD34+/CD38- de celulas normales (Figura 1A y Tabla 1). Debido a su baja frecuencia, no fue posible obtener suficientes celulas CD34+/CD38- ni de origen normal ni de AML para analisis directo por inmunotransferencia. No obstante, la deteccion de una senal clara en la poblacion CD34+ global corrobora la senal fuerte observada por citometna de flujo para celulas de AML. Otro punto a indicar es que el peso molecular de la banda CD123 parece variar ligeramente entre las muestras de AML. Hemos realizado analisis de huellas de RT-PCR de las mismas muestras y no hemos observado aberraciones obvias (datos no mostrados). Asf, parece que grados variados de modificacion posterior a la traduccion son la explicacion mas probable para esta observacion. Consistente con estos resultados obtenidos por citometna de flujo, la expresion de CD131 no se detecto (Figura 4, panel inferior).

Para empezar a explorar un papel funcional potencial para CD123, examinamos la respuesta de celulas de AML primaria a IL-3. Tfpicamente, la estimulacion de celulas hematopoyeticas con IL-3 da lugar a varios eventos de transduccion de la senal intracelulares bien caracterizados (Hara T, et al., Function and signal transduction mediated by the interleukin 3 receptor system in hematopoiesis. Stem Cells 1996, 14: 605-18). Entre estos eventos es prevalente la fosforilacion de Mek-1, Akt, y Stat-5 (Songyang Z, et al., Interleukin 3-dependent survival by the Akt protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94: 11345-50; Yagisawa M, et al., Signal transduction pathways in normal human monocytes stimulated by cytokines and mediators: comparative study with normal human neutrophils or transformed cells and the putative roles in functionality and cell biology. Exp Hematol 1999, 27: 1063-76; Sutor SL, et al., A phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway that differentially regulates c-Raf and A-Raf. J Biol Chem 1999, 274: 7002-10; de Groot RP, et al., Regulation of proliferation, differentiation and survival by the IL-3/IL-5/GM- CSF receptor family. Cell Signal 1998, 10: 619-28). Consecuentemente, se realizaron estudios de

inmunotransferencia en estas protemas para evaluar el grado de fosforilacion, tanto en presencia como ausencia de estimulacion con IL-3. Los datos, mostrados en la Figura 5, muestran ausencia de una fosforilacion detectable de Akt y Stat5 en ausencia de IL-3, y solo un nivel moderado de fosforilacion para Mek-1. Ademas, en respuesta a la estimulacion con IL-3, no se observa un incremento apreciable en la fosforilacion para ninguna de las protemas ensayadas. Estos resultados sugieren que CD123 presente en la superficie de celulas de AML primaria no contribuye significativamente a la transduccion de la senal a traves de las rutas mediadas por IL-3 convencionales.

Ejemplo 8. - Expresion de CD123 en celulas de ALL primaria y CML primaria.

Se siguio un protocolo experimental similar como se describe en los Ejemplos 1 a 4, y se ensayo la expresion de CD123 en celulas de ALL primaria y CML primaria por citometna de flujo. Los resultados fueron consistentes con los

5

10

15

20

25

resultados obtenidos con la expresion de CD123 en AML primaria en el Ejemplo 5. Las Figuras 6A, 6B, y 6C muestran de manera reproducible que las celulas de ALL primaria expresan CD123. Ademas, las Figuras 7A, 7b, y 7C muestran de manera reproducible que las celulas de cMl primaria tambien expresan CD123.

Ejemplo 9. - Ensayo de muerte por complemento dirigido a CD123.

Mediante el uso de un ensayo de muerte por complemento, "Current protocols in Immunology" Editado por John Coligan, Ada Kruisbeek, David Margulies, Ethan Shevach, y Warren Strober, John Wiley and Sons publishing, 1992, este experimento demuestra que las celulas CD123+ se toman como diana de forma preferente. En este experimento, comparamos una muestra de AML tfpica (es decir, CD123+) con una muestra de medula osea normal. Para cada muestra, hay un control no tratado, una muestra tratada con complemento solo, y una muestra tratada con complemento anti-CD123+. Como se muestra en la Tabla 3, hay un efecto de muerte por complemento sustancial en la muestra de AML, pero no hay efecto en la medula normal. Esto es cierto tanto para la muestra global, como para las celulas CD34+ mas primitivas. De acuerdo con esto, este experimento demuestra que hay una diferencia entre el efecto en celulas normales y leucemicas respecto a la especificidad para CD123.

Ejemplo 10. - Expresion de CD123 en celulas de linfoma.

Los analisis inmunohistoqmmicos de secciones de tejido mostraron que el "linfoma de celulas B grandes difuso" es fuertemente positivo para expresion de CD123. Esta es la forma mas comun de linfoma no de Hodgkin. Asf, en un cancer derivado de celulas B, la expresion de CD123 es consistente con la observacion de que CD123 tambien se observo en celulas de ALL (es decir, otro tipo de cancer de celulas B). Esta observacion identifica directamente los linfomas de celulas B como una diana para terapias y diagnostico usando CD123.

Tabla 1: Expresion de CD123 en celulas leucemicas primitivas y normales

Muestra

AML

AML-1

AML-2

AML-3

AML-4

AML-5

AML-6

AML-7

AML-8

AML-9

AML-10

AML-11

AML-12

AML-13

AML-14

AML-15

AML-16

AML-17

AML-18

Medula Normal

BM-1

BM-2

BM-3

BM-4

BM-5

FAB

% celulas CD123+ en la poblacion CD34+/CD38-

MDS/AML

100%

M1

100%

M1

95,2%

M4

98,1 %

M2

99,7%

M4

99,5%

nd

100%

M4

99,7%

M4

99,8%

M2

100%

MDS/AML

70,2%

nd

92,5%

M1

97,5%

M4

51,1 %

M4

98,1%

M1

95,3%

M1

98,9%

M4

100%

na

0

na

<1%

na

0

na

0

na

<1%

FAB = sistema de clasificacion frances, americano, britanico MDS/AML = smdrome mielodisplasico progresando a AML na = no aplicable

Tabla 2: Prendimiento de poblaciones CD123+ en ratones NOD/SCID.

Exp Muestra Poblacion Ensayada (N) Celulas lnv./raton

1 AML-2 CD34+/CD123+ (3)

CD34-/CD123+/- (3)

2 AML-5 CD34+/CD123+ (4)

CD34-/CD123+/- (3)

3 AML-15 CD34+/CD123+ (5)

CD34-/CD123+/- (3)

%celulas CD45+/recep 42%

18%

67% nd

0,2%

0,1%

15%

6%

1%

12% nd nd nd

2,1%

0,2%

0,8%

1,1%

0,9%

2,4 X 10e6 nd

nd nd

4,9 X 10e6

7,5 X 10e5

2,5 x 10e6

2,5 x 10e6

2,1 X 10e6

N = numero de ratones ensayados nd = no detectable

5 Tabla 3: Ensayo de muerte por complemento espedfico de Cd123

Viabilidad

Muestra de AML primaria

Celulas Totales CD34+

control no tenido

68,53% 73,29%

complemento solo

67,76% 77,17%

complemento anti-CD123+

21,31% 33,25%

BM normal primaria

Celulas Totales CD34+

control no tenido

80,20% 78,20%

complemento solo

79,42% 80,33%

complemento anti-CD123+

80,46% 81,51%

5

10

15

20

25

30

35

La solicitud describe inter alia los items siguientes:

1. Un metodo para tratar cancer hematologico en un paciente que necesita dicho tratamiento, que comprende administrar a dicho paciente un compuesto que se une selectivamente a CD123 en una cantidad efectiva para causar dano en las celulas progenitoras del cancer hematologico.

2. El metodo del item 1, en el que dicho compuesto comprende un anticuerpo.

3. El metodo del item 2, en el que dicho compuesto comprende ademas un agente citotoxico.

4. El metodo del item 3, en el que dicho agente citotoxico es un radioisotopo.

5. El metodo del item 4, en el que dicho radioisotopo se selecciona del grupo que consiste en Astatina y Yodo.

6. El metodo del item 1, en el que dicho dano es muerte celular.

7. El metodo del item 1, en el que dicho cancer hematologico es leucemia o trastornos linfoproliferativos malignos.

8. El metodo segun el item 7, en el que dicha leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielogena aguda, leucemia mielogena cronica, smdrome mielodisplasico, leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide cronica, y smdrome mielodisplasico.

9. El metodo segun el item 7, en el que dicho trastorno linfoproliferativo maligno es linfoma.

10. El metodo segun el item 9, en el que dicho linfoma se selecciona del grupo que consiste en mieloma multiple, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, y linfoma folicular (de celulas pequenas y de celulas grandes).

11. Un metodo para danar una celula progenitora de cancer hematologico que comprende poner en contacto dicha celula con un compuesto que se une selectivamente a CD123 en una cantidad efectiva para causar dano en dicha celula.

12. El metodo del item 11, en el que dicho compuesto comprende un anticuerpo.

13. El metodo del item 12, en el que dicho compuesto comprende ademas un agente citotoxico.

14. El metodo del item 13, en el que dicho agente citotoxico es un radioisotopo.

15. El metodo del item 14, en el que dicho radioisotopo se selecciona del grupo que consiste en 211Astatina y

131Yodo.

16. El metodo del item 11, en el que dicho dano es muerte celular.

17. Un compuesto que se une selectivamente a CD123 y dana las celulas progenitoras de cancer hematologico.

18. El compuesto del item 17, en el que dicho compuesto comprende un anticuerpo.

19. El compuesto del item 18, en el que dicho compuesto comprende ademas un agente citotoxico.

20. El compuesto del item 19, en el que dicho agente citotoxico es un radioisotopo.

21. El compuesto del item 20, en el que dicho radioisotopo se selecciona del grupo que consiste en 211Astatina y

131Yodo.

22. Un ensayo para detectar la presencia de celulas progenitoras de cancer hematologico en una muestra, que comprende detectar la presencia de CD123 en dicha muestra.

23. El ensayo del item 22, en el que la presencia de CD123 se detecta introduciendo un compuesto que se une selectivamente a CD123 y determinando si el compuesto se une a un componente de dicha muestra.

El contenido de la invencion se define por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo que se une selectivamente a CD123 y mata celulas madre leucemicas para uso en un metodo de tratamiento de un paciente humano que tiene una leucemia, en el que dicha leucemia es smdrome mielodisplasico.
2. 2. El anticuerpo para uso de la reivindicacion 1, en el que las celulas madre leucemicas son celulas madre de 5 leucemia mieloide aguda (AML) CD34+/CD38-.
3. 3. El anticuerpo para uso de la reivindicacion 2, en el que las celulas madre de AML CD34+/CD38- son ademas CD131-
4. 4. El anticuerpo para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las celulas madre leucemicas son de la medula osea del paciente.

   10 5. Metodo para detectar celulas progenitoras de leucemia en un paciente humano que tiene una leucemia, en el que

   dicha leucemia es smdrome mielodisplasico, en el que el metodo comprende usar un ligando marcado que se une a

   CD123.
5. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el ligando marcado es un ligando marcado con una enzima, un radioisotopo, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente, un

   15 compuesto basado en adsorbente, o un metal coloidal.
6. 7. El metodo de la reivindicacion 5 o 6, en el que el ligando es un anticuerpo o un fragmento de este que se une selectivamente a CD123.
7. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
8. 9. El metodo de la reivindicacion 7, en el que el fragmento es F(ab)2, Fab, Fv o Fd, Vh o Vl.

   20

   C0I2J-SE

   imagen1

   imagen2

   imagen3

   imagen4

   imagen5

   Fit. £

   Expresion de CD123 en ALL Primaria

   o

   CM

   O

   lD

   imagen6

   CD123 PE

   o :

   -

   imagen7

   Analisis por citometna de flujo de la expresion de CD123 en tres muestras independientes de ALL (leucemia linfoide aguda) primaria. El marcaje de CD123 se muestra por los graficos llenos (oscuros) y los controles se muestran por los graficos vados.

   imagen8

   Analisis por citometna de flujo de la expresion de CD123 en tres muestras independientes de CML (leucemia mielogena cronica) primaria. El marcaje de CD123 se muestra por los graficos llenos (oscuros) y los controles se muestran por los graficos vados.