ES2630755T3

ES2630755T3 - Sensor in vitro para el punto de cuidado y procedimiento de utilización

Info

Publication number: ES2630755T3
Application number: ES11816753.5T
Authority: ES
Inventors: Maria Peshkova; Armand Krikorian; Sumitha Nair; Punkaj Ahuja; Miklos Gratzl
Original assignee: Case Western Reserve University
Current assignee: Case Western Reserve University
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2011-07-11
Publication date: 2017-08-23
Anticipated expiration: 2031-07-11
Also published as: EP2591355A2; US8790591B2; WO2012021239A2; EP2591355A4; EP2591355B1; US20130109040A1; WO2012021239A9; WO2012021239A3

Abstract

Sensor in vitro para la detección en el punto de cuidado (POC (point-of-care)) de como mínimo un analito o producto de reacción, comprendiendo dicho sensor: un sustrato inerte impermeable que incluye una primera superficie transparente dispuesta frente a una segunda superficie, y unas primera y segunda cavidades, definiendo cada una de dichas primera y segunda cavidades una abertura en dicha segunda superficie; estando dicho sustrato compuesto de plástico y/o vidrio: un sistema detector dispuesto en dicha primera cavidad, comprendiendo dicho sistema detector una membrana de optodo de detección de analito, que incluye como mínimo un material indicador que experimenta un cambio de color en respuesta al analito o a un producto de reacción, una membrana permeable al analito y una pluralidad de microesferas no transparentes que tienen un diámetro medio de 0,5-100 μm y están en contacto con dicha membrana de optodo de detección de analito y/o dicha membrana permeable al analito, estando dicha membrana permeable al analito dispuesta a modo de capa sobre dicha membrana de optodo de detección de analito y cubriendo dicha membrana permeable al analito una abertura de dicha primera cavidad; y un sistema de refrencia dispuesto en dicha segunda cavidad.

Description

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DESCRIPCION

Sensor in vitro para el punto de cuidado y procedimiento de utilizacion

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a sensores in vitro y mas en particular a sensores in vitro en el punto de cuidado (POC (point-of-care testing)) para pruebas de perfiles metabolicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El estado metabolico de pacientes cnticos en la unidad de cuidados intensivos (UCI) es de una importancia cntica y requiere un control frecuente. Por ejemplo, se ha comprobado que el control glucemico en pacientes cnticos repercute positivamente tanto en la morbilidad como en la mortalidad. Esto ha demostrado ser cierto tanto si los pacientes tienen diabetes preexistente como si no. Los estandares actuales de atencion para pacientes hiperglucemicos en el marco de los cuidados intensivos implican el uso de infusiones de insulina y control de la glucemia a intervalos regulares (por ejemplo una vez por hora, 24 horas al dfa).

En la mayona de los pacientes, el control metabolico se limita a una medicion de la glucosa en sangre extrafda mediante un pinchazo en el dedo y un analisis subsiguiente utilizando monitores de glucosa electroqmmicos existentes en el mercado, tales como los sistemas ONETOUCH (LifeScan, Inc., Milpitas, CA) o ACCU-CHEK (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN). La hipoglucemia es la complicacion mas frecuente de la utilizacion de infusiones de insulina, siendo tambien la mas limitativa y potencialmente perjudicial para la seguridad del paciente. Sin embargo, la precision de los medidores disponibles en el mercado disminuye considerablemente en los niveles de glucemia situados dentro del intervalo de la hipoglucemia (es decir, por debajo de 60 mg/dl).

El unico parametro metabolico que los glucometros disponibles en el mercado pueden determinar es la glucemia. El control de otros parametros fundamentales, tales como pH, bicarbonato, K+ o lactato, tambien es deseable en algunas situaciones. En concreto se sabe que con la terapia de insulina se producen cambios en el potasio entre el espacio intracelular y el espacio extracelular. Dado que la sepsis y la insuficiencia ventilatoria son razones comunes para la admision en la UCI, se requieren mediciones de pH de cabecera frecuentes, que actualmente se realizan mediante una toma de muestras de sangre arterial y una gasometna en un laboratorio central. Esto, junto con las numerosas tiras de ensayo desechables necesarias para la atencion al paciente, aumenta los costes, ya altos, de la atencion en la UCI.

En el estado actual de la tecnica se conocen varios sensores para el analisis de fluidos biologicos. La publicacion n° US 2003/132406 describe un elemento sensor para detectar opticamente analitos qmmicos o bioqmmicos que pueden estar contenidos en diferentes muestras. Es particularmente adecuado para evaluar un gran numero de muestras preparadas de diferentes maneras, tal como pueden utilizarse con volumenes de muestra mmimos. La publicacion n° US 2010/012511 describe un sensor disenado para determinar la cantidad y la concentracion de un analito en una muestra con un volumen inferior a aproximadamente 1 [mu]l. El sensor tiene un electrodo detrabajo revestido con un mediador redox no lixiviable. La publicacion n° US 2007/056858 describe un sensor electroqmmico in vitro para proporcionar un analisis preciso y repetible de una muestra de fluido biologico. Este permite ensayar para el nivel del analito, de un modo preciso y reproducible, volumenes de muestra de tan solo 0,03 [mu]l. La publicacion n° US 2009/260985 describe un sensor, y procedimientos de fabricacion, para determinar la concentracion de un analito en un fluido biologico tal como sangre o suero, utilizando tecnicas tales como culombimetna, amperometna y potenciometna. El sensor incluye un electrodo de trabajo y un contraelectrodo y puede incluir una traza de control para determinar el posicionamiento correcto del sensor en un conector. La publicacion n° US 2002/115224 describe un procedimiento para preparar un dispositivo sensor (bio)qmmico optico que comprende una pluralidad de puntos de sensor (bio)qmmicos polimericos. P. Ahuja y col., “Disposable optical slide provides a snapshot of metabolic parameters from a drop of blood at the bed side”, Point-of-care Healthcare Technologies (PHT), 2013 IEEE, P-310-313, describen un portaobjetos optico reutilizable de bajo costo que puede proporcionar una instantanea metabolica de diversos parametros en el punto de cuidado a partir de una unica gota de sangre. El portaobjetos incluye zonas de deteccion basadas en optodos, que cambian de color en funcion de las concentraciones de los analitos respectivos.

SUMARIO DE LA INVENCION

Segun un aspecto de la presente invencion, un sensor in vitro para la deteccion en el punto de cuidado (POC (point-of-care)) de como mmimo un analito o producto de reaccion comprende un sustrato impermeable inerte, un sistema detector y un sistema de referencia. El sustrato incluye una primera superficie transparente

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dispuesta frente a una segunda superficie y unas primera y segunda cavidades. Cada una de las primera y segunda cavidades define una abertura en la segunda superficie. El sistema detector esta dispuesto en la primera cavidad y comprende una membrana de optodo de deteccion de analito, una membrana permeable al analito y una pluralidad de microesferas no transparentes asociadas a la membrana de optodo de deteccion de analito y/o la membrana permeable al analito. La membrana permeable al analito esta dispuesta a modo de capa sobre la membrana de optodo de deteccion de analito y cubre la abertura de la primera cavidad. El sistema de referencia esta dispuesto en la segunda cavidad.

Segun otro aspecto de la presente invencion se proporciona un procedimiento para detectar como mmimo un analito o producto de reaccion en una muestra de fluido biologico tomada de un individuo en un POC. Un paso del procedimiento incluye proporcionar el sensor in vitro arriba mencionado, que comprende un sustrato, un sistema detector y un sistema de referencia. El sustrato incluye unas primera y segunda cavidades. El sistema detector esta dispuesto en la primera cavidad y el sistema de referencia esta dispuesto en la segunda cavidad. El sistema detector comprende una membrana de optodo de deteccion de analito, una membrana permeable al analito y una pluralidad de microesferas no transparentes asociadas a la membrana de optodo de deteccion de analito y/o la membrana permeable al analito. La membrana permeable al analito esta dispuesta a modo de capa sobre la membrana de optodo de deteccion de analito y cubre la abertura de la primera cavidad. Despues de proporcionar el sensor, se obtiene una muestra de fluido biologico del individuo y esta se pone en contacto con como mmimo una parte de la membrana permeable al analito. A continuacion, se detecta un cambio de color dentro del sistema detector.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIG.S

Para el experto en la materia a la que se refiere la presente invencion se hara evidente lo anterior y otras caractensticas de la presente invencion al leer la descripcion siguiente con referencia a las Fig.s adjuntas, en las que:

Fig. 1A:

Fig. 1B: Fig. 2A: Fig. 2B:

Fig. 3A:

Fig. 3B:

Fig. 4A:

Fig. 4B:

Fig. 4C:

Fig. 5A: Fig. 5B:

Fig. 6A: Fig. 6B:

vista en seccion transversal de un sensor in vitro que comprende un sustrato, un sistema detector para la deteccion en el punto de cuidado (POC) de como mmimo un analito o producto de reaccion, y un sistema de referencia construido segun un aspecto de la presente invencion;

vista superior del sensor mostrado en la Fig. 1A;

vista en seccion transversal ampliada del sistema detector mostrado en la Fig. 1A;

vista en seccion transversal ampliada que muestra una forma de realizacion alternativa del sistema detector de la Fig. 2A;

vista en seccion transversal ampliada del sistema detector de la Fig. 1A que muestra una conFig.cion alternativa de una membrana permeable al analito (zona sombreada con rayas);

vista en seccion transversal del sistema detector de la Fig. 3A que muestra una conFig.cion alternativa de la membrana permeable al analito, con una conFig.cion multicapa;

vista en seccion transversal ampliada que muestra una forma de realizacion alternativa del sistema detector de la Fig. 1A, incluyendo una pluralidad de microesferas dispersadas por toda una membrana de optodo de deteccion de analito (zona punteada);

vista en seccion transversal ampliada que muestra una forma de realizacion alternativa del sistema detector de la Fig. 4A;

vista en seccion transversal ampliada que muestra otra forma de realizacion alternativa del sistema detector de la Fig. 4A;

vista en seccion transversal ampliada del sistema de referencia de la Fig. 1A;

vista en seccion transversal ampliada que muestra una forma de realizacion alternativa del sistema de referencia de la Fig. 5A;

vista en seccion transversal que muestra un ejemplo del sensor in vitro de la Fig. 1A; vista superior del sensor de la Fig. 6A;

Fig. 7:: diagrama de flujo de proceso que ilustra un procedimiento para detectar como mmimo un analito o producto de reaccion en una muestra de fluido biologico tomada de un individuo en un POC segun otro aspecto de la presente invencion;

Fig. 8: 5: ilustracion esquematica que muestra la colocacion de una muestra de fluido biologico de un individuo en un recipiente de muestras;

Fig. 9:: vista en seccion transversal que muestra el sensor de las Fig. 6A-B colocado sobre la muestra de fluido biologico de la Fig. 8;

Fig. 10:: vista en seccion transversal que muestra la aplicacion de luz (hv) al sensor de la Fig. 9 y la deteccion de como mmimo un analito o producto de reaccion mediante un detector;

10 Fig. 11A-B:: serie de fotograffas que muestran dos puntos de deteccion para el pH y dos puntos inertes de referencia en un sustrato de vidrio;

Fig 12:: fotograffa que muestra un sustrato de mayor espesor hecho de plastico (a diferencia del sustrato de vidrio de las Fig. 11A-B);

Fig. 13: 15: fotograffa que muestra un sensor de la presente invencion con un punto de glucosa (izquierda), dos puntos de pH (derecha) y una referencia de blanco (arriba) en un sustrato de vidrio (no en solucion);

Fig. 14:: fotograffa que muestra un dispositivo acoplado por carga (CCD (charge coupled device)) basado en LED (rojo, verde y azul) para detectar cambios de color en el sensor de la presente invencion;

20 Fig. 15:: serie de fotograffas en escala de grises utilizando el CCD de la Fig. 14, que destacan la distribucion de color con una determinada concentracion de analito;

Fig. 16:: ilustracion esquematica que muestra un sensor de pH construido segun otro aspecto de la presente invencion;

Fig. 17: 25: grafico de pH vs. intensidad nR/nB que muestra la respuesta al pH en suero utilizando el sensor de la Fig. 16;

Fig. 18:: serie de imagenes que muestran la respuesta al pH del sensor de la Fig. 16 en suero (a: pH 6; b: pH 7; c: pH 8);

Fig. 19:: grafico de pH vs. intensidad nR/nB que muestra la respuesta al pH en suero utilizando el sensor de la Fig. 16 durante dos dfas;

30 Fig. 20:: grafico de pH vs intensidad nR/nB que muestra la respuesta al pH en sangre utilizando el sensor de la Fig. 16;

Fig. 21:: serie de imagenes que muestran la respuesta al pH del sensor de la Fig. 16 en sangre (a: pH 6; b: pH 6,8; c: pH 7,4; d: pH 8);

Fig. 22: 35: grafico de pH vs. intensidad nR/nB que muestra la respuesta al pH en sangre (fuera de la sangre) utilizando el sensor de la Fig. 16;

Fig. 23:: serie de imagenes que muestran la respuesta al pH del sensor de la Fig. 16 inmediatamente despues de haber retirado el sensor de la muestra de sangre (a: pH 6; b: pH 6,8; c: pH 7,4; d: pH 8);

Fig. 24: 40: ilustracion esquematica que muestra un sensor de glucosa construido segun otro aspecto de la presente invencion;

Fig. 25:: imagen de un conjunto ordenado de sensores con dos sensores de glucosa como los mostrados en la Fig. 24 (arriba), un punto de referencia de blanco (abajo, izda.) y un punto detector de pH (abajo, dcha.);

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Fig. 26: grafico de concentracion de glucosa (mg/dl) vs. intensidad nR/nB que muestra la respuesta a

la glucosa en suero del sensor de la Fig. 24;

Fig. 27: serie de imagenes que muestran un conjunto ordenado de sensores multiparametrico con dos

sensores de glucosa como los mostrados en la Fig. 24 (izda., arriba y abajo), la respuesta en suero a distintas concentraciones de glucosa (a: 0 mg/dl, b: 100 mg/dl, c: 200 mg/dl);

Fig. 28: grafico de concentracion de glucosa (mg/dl) vs. intensidad nR/nB que muestra la respuesta a

la glucosa en sangre del sensor de la Fig. 24;

Fig. 29: serie de imagenes que muestran la respuesta del sensor de glucosa (Fig. 24) en sangre con

distintas concentraciones de glucosa (a: 0 mg/dl, b: 100 mg/dl, c: 200 mg/dl);

Fig. 30: grafico de concentracion de glucosa (mg/dl) vs. intensidad nR/nB que muestra la respuesta a

la glucosa en sangre inmediatamente despues de haber retirado el sensor de la sangre (Fig. 24); y

Fig. 31: serie de imagenes que muestran la respuesta del sensor de glucosa (Fig. 24) en sangre con

distintas concentraciones de glucosa (a: 0 mg/dl, b: 100 mg/dl, c: 200 mg/dl).

DESCRIPCION DETALLADA

La presente invencion se refiere a sensores in vitro y mas en particular a sensores in vitro para pruebas en el punto de cuidado (POC) de perfiles metabolicos. Como ejemplo de un aspecto de la presente invencion, las Fig. 1A-B muestran un sensor in vitro 10 para pruebas POC de perfiles metabolicos, que comprende un sustrato 12, un sistema detector 14, para detectar como mmimo un analito o producto de reaccion, y un sistema de referencia 16. El sensor in vitro 10 de la presente invencion proporciona una instantanea del estado metabolico global de un individuo a partir de una unica gota de sangre en tiempo real. Dado que el sensor 10 es reversible y no requiere reactivos para funcionar, un mismo sensor puede reutilizarse muchas veces, de manera que con un unico sensor se cubre todo el periodo de atencion de un individuo en un entorno de cuidado cntico. Esto no se parece a las actuales tecnologfas electroqmmicas basadas en tiras de ensayo utilizadas para medir analitos (por ejemplo glucosa) a partir de muestras de sangre, en las que cada tira debe desecharse despues de una medida. La presente invencion proporciona ventajosamente un sensor in vitro 10 sencillo, integrado y reutilizable, que puede utilizar la misma muestra de fluido biologico (por ejemplo una gotita de sangre) para medir varios parametros metabolicos vitales en paralelo en un POC con el fin de permitir un mejor control metabolico de individuos cnticos.

Un aspecto de la presente invencion puede incluir un sensor in vitro 10 para pruebas POC de perfiles metabolicos que comprende un sustrato 12, un sistema detector 14, para detectar como mmimo un analito o producto de reaccion, y un sistema de referencia 16. La forma y las dimensiones del sensor 10 no son de importancia esencial y pueden variar en funcion del procedimiento de fabricacion o del uso previsto para el sensor. Por ejemplo, el sensor 10 puede tener forma circular con un diametro de aproximadamente 5 mm. Se entiende que el sensor 10 puede tener otras formas, tales como una forma rectangular, cuadrada, ovoide, etc. El sensor 10 puede fabricarse mediante una o una combinacion de tecnicas de fabricacion, tales como tecnologfas de microfabricacion y MEMS. Estas tecnicas pueden combinarse con una o mas tecnicas electroqmmicas, tecnologfa de fabricacion de membranas, inmovilizacion de enzimas y/o de colorantes opticos, etc. para fabricar el sensor 10.

Como se muestra en las Fig. 1A-B, el sustrato 12 puede incluir una primera superficie 18 dispuesta frente a una segunda superficie 20. Toda o una parte de la primera superficie 18 puede ser transparente. Como se explica mas abajo con mayor detalle, esto permite que el o los cambios de color del sistema detector 14 sean visibles a traves del sustrato 12. Alternativamente, todo o una parte del sustrato 12 puede tener una superficie opaca, reflectora o coloreada para que ofrezca un contraste al o a los cambios de color del sistema detector 14. El sustrato 12 puede estar formado por uno o una combinacion de materiales inertes e impermeables, tales como plastico, vidrio, ceramica o similares. Por ejemplo, el sustrato 12 puede estar formado por uno o mas de los materiales siguientes: polimetilmetacrilato (pMmA), 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA) y vidrio. En un ejemplo de la presente invencion, el sustrato 12 puede estar hecho de vidrio.

El sustrato 12 puede incluir tambien una pluralidad de cavidades 22. Por ejemplo, el sustrato 12 puede incluir una primera y una segunda cavidades 24 y 26, cada una de las cuales define una abertura 28 en la segunda superficie 20. Aunque las primera y segunda cavidades 24 y 26 se muestran en la Fig. 1B con una forma circular en seccion transversal, se entiende que las cavidades pueden tener otras formas en seccion transversal (por ejemplo ovoide, cuadrada, etc.). Las dimensiones de las primera y segunda cavidades 24 y 26 pueden

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cambiarse segun sea necesario. Para las primera y segunda cavidades 24 y 26 mostradas en las Fig. 1A-B, por ejemplo, las cavidades pueden tener cada una un diametro de aproximadamente 1 mm y una profundidad de aproximadamente 300 pm. La primera cavidad 24 y/o la segunda cavidad 26 pueden tener bases blancas o reflectoras y pueden formarse mediante perforacion (por ejemplo con un laser), grabado qmmico o similares. Dependiendo de la aplicacion concreta a la que este destinado el sensor 10, se entiende que en el sustrato 12 puede incluirse cualquier numero de cavidades 22.

En otro aspecto de la presente invencion, el sensor 10 puede comprender un sistema detector 14 para detectar como mmimo un analito o producto de reaccion. Como se muestra en la Fig. 2A, el sistema detector 14 puede estar dispuesto, como mmimo parcialmente, en la primera cavidad 24 del sustrato 12. En general, el sistema detector 14 puede percibir o detectar una propiedad optica, tal como un cambio de color de un colorante de absorcion o una emision por parte de un colorante fluorescente que cambie con un cambio de concentracion del analito o producto de reaccion.

El sensor 10 puede incluir cualquier numero y variedad de sistemas detectores 14. Entre estos se incluyen sistemas detectores 14 para la deteccion de glucosa, lactato, oxfgeno, urea, creatinina, bicarbonato, potasio, sodio y otras especies bioqmmicas. Por ejemplo, la enzima glucosa oxidasa puede utilizarse para la deteccion de glucosa, la enzima lactasa puede utilizarse para la deteccion de lactosa, la enzima galactosa oxidasa puede utilizarse para la deteccion de galactosa, la enzima urato oxidasa puede utilizarse para la deteccion de acido urico, y la enzima creatinina amidohidrogenasa puede utilizarse para la deteccion de creatinina. En el sensor 10 pueden incluirse tambien sistemas detectores 14 para la deteccion de pH, temperatura, iones vitales, tales como K+, Na+ y similares.

Para un unico analito o producto de reaccion pueden preverse multiples sistemas detectores 14, con el fin de conseguir redundancia o prever diferentes intervalos de sensibilidad, por ejemplo un primer sistema detector para altas concentraciones y un segundo sistema detector para intervalos de baja concentracion. Los sistemas detectores 14 para diferentes analitos o productos de reaccion pueden alojarse en un unico sensor 10. Asf es posible asociar a un unico sensor 10 varios sistemas detectores 14 diferentes.

Como se muestra en la Fig. 2A, el sistema detector 14 puede comprender una membrana de optodo de deteccion de analito 30, una membrana permeable al analito 32 y como mmimo una microesfera no transparente 34 que esta en contacto con la membrana de optodo de deteccion de analito y/o la membrana permeable al analito. La membrana de optodo de deteccion de analito 30 puede disponerse en la primera cavidad 24 y comprende un material de matriz, tal como un polfmero plastificado (por ejemplo PVC plastificado). Como se describe mas abajo con mayor detalle, la membrana de optodo de deteccion de analito 30 no funciona en base a ningun equilibrio de fijacion; mas bien, la membrana de optodo de deteccion de analito funciona en base a un equilibrio de carga entre iones absorbidos o liberados. El sistema detector 14 puede transducir concentraciones ionicas indicadas por la membrana de optodo de deteccion de analito 30 en una concentracion del analito.

En general, la membrana de optodo de deteccion de analito 30 puede incluir uno o mas materiales indicadores, tales como un colorante sensible al pH que experimente un cambio qmmico o ffsico en respuesta a un analito a detectar o a un producto de reaccion de este. Adicionalmente, la membrana de optodo de deteccion de analito 30 puede incluir uno o mas materiales de deteccion. En general, el material de deteccion puede reaccionar con un analito o catalizar una reaccion de un analito para producir un producto de reaccion detectable. O la reaccion/catalisis puede tener como resultado un producto de reaccion intermedio que se someta a una reaccion/catalisis adicional con un segundo o subsiguiente material de deteccion para formar un producto detectable. Por ejemplo, un primer material de deteccion puede reaccionar con o catalizar la reaccion de un analito para producir un producto de reaccion intermedio. Un segundo material de deteccion puede a continuacion reaccionar con o catalizar la reaccion del producto de reaccion intermedio para producir un producto detectable.

El material de deteccion puede comprender generalmente una enzima que reaccione con el analito y/o catalice la reaccion de un analito para producir un producto de reaccion detectable. En el caso de la glucosa, por ejemplo, puede emplearse como material de deteccion glucosa oxidasa, glucosa deshidrogenasa u otra enzima que catalice una reaccion de glucosa. Adicionalmente, en caso de una deteccion de lactato, puede utilizarse lactasa.

El material indicador, como se menciona mas arriba, puede ser un material sensible al pH (por ejemplo un colorante) que sea sensible a un cambio de pH inducido por un analito o, mas comunmente, un producto detectable mediante la produccion de un cambio de color (es decir un cambio en la longitud de onda de absorcion, que puede incluir longitudes de onda fuera del rango visible, por ejemplo en el rango IR), fluorescencia o similares. El cambio de color es reversible, dependiendo de la concentracion del o de los analitos. Entre los ejemplos de materiales indicadores tales como colorantes pueden incluirse rojo Congo, rojo

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neutro, rojo de fenol, rojo de metilo, lacmoide, tetrabromofenolftalema, a-naftolfenol y similares. Un colorante puede estar disuelto en un disolvente organico, tal como NPOE (2-nitrofenil octil eter), BEHS (sebacato de bis(2-etilhexilo)), DBE (dibencil eter), DOP (dioctilftalato) o similares.

En un ejemplo de la presente invencion, el material indicador puede comprender un colorante fotoabsorbente sensible al pH que experimente un cambio de color en respuesta a un analito o a un producto de reaccion de este. Por ejemplo, el material indicador puede comprender un colorante que sea sensible a los iones hidrogeno (es decir pH) y sea reversible (es decir que vuelva a su color anterior cuando el pH vuelva a su nivel anterior). Entre los ejemplos de colorantes sensibles al pH pueden incluirse en general ionoforos, aniones lipofilos y colorantes sensibles al ion hidrogeno lipofilos (denominados aqrn tambien cromoionoforos). Se entiende que cuando hayan de detectarse iones distintos al ion hidrogeno pueden utilizarse otros colorantes. En general, el procedimiento de utilizar un colorante sensible al ion hidrogeno lipofilo en combinacion con un ionoforo juntos en un disolvente o una membrana se denomina aqrn tecnica de optodo. En tal disposicion, el ionoforo puede extraer el ion a detectar y el colorante sensible al hidrogeno lipofilo puede mostrar un cambio de color correspondiente.

Optimizando la composicion de una membrana de optodo sensible al pH puede obtenerse el maximo cambio de color en el intervalo de pH deseado, normalmente entre aproximadamente pH 5,0 y 8,0 en presencia de un electrolito en concentraciones aproximadamente iguales a las existentes en una muestra de fluido biologico (por ejemplo sangre o suero).

Como ejemplos de cromoionoforos pueden incluirse uno o mas de los siguientes:

cromoionoforo I (9-(dietilamino)-5-(octadecanoilimino)-5H-benzo[a]fenoxazina), denominado ETH5249; cromoionoforo II (9-dimetilamino-5-[4-(16-butil-2,14-dioxo-3,15-ioxaeicosil)-fenilimino]benzo[a]fenoxazina), denominado ETH2439;

cromoionoforo III (9-(dietilamino)-5-[(2-octildecil)imino]benzo[a]fenoxazina), denominado ETH 5350;

cromoionoforo IV (5-octadecanoiloxi-2-(4-nitrofenilazo)fenol), denominado ETH2412;

cromoionoforo V (9-(dietilamino)-5-(2-naftoilimino)-5H-benzo[a]fenoxazina);

cromoionoforo VI (octadecil ester de 4’,5’-dibromofluorescema), denominado ETH7075;

cromoionoforo XI (octadecil ester de fluorescema), denominado ETH7061; y combinaciones de los mismos

(tengase en cuenta que ETF es la denominacion del Swiss Federal Institute of Technology).

Entre los ejemplos de aniones lipofilos pueden incluirse KTpCIPB (tetraquis(4-clorofenil)borato de potasio), NaHFPB (tetraquis[3,5-bis(1,1,3,3,3-hexafluor-2-metoxi-2-propil)fenil]borato de sodio), tetraquis[3,5- bis(trifluorometil)fenil]borato de sodio, tetraquis(4-fluorofenil)borato de sodio, combinaciones de los mismos, y similares.

Entre los ionoforos pueden incluirse ionoforos de sodio, ionoforos de potasio, ionoforos de calcio. Entre los ejemplos de ionoforos de sodio pueden incluirse:

bis[(12-corona-4)metil]2-dodecil-2-metilmalonato, denominado ETH227; N,N’,N"-triheptil-N,N’,N"-trimetil-4,4’,4"-propilidintris(3-oxabutiramida), denominado ETH157; N,N’-dibencil-N,N’-difenil-1,2-fenilendioxidiacetamida, denominado ETH2120; N,N,N’,N’-tetraciclohexil-1,2-fenilendioxidiacetamida, denominado ETH4120;

4-octadecanoiloximetil-N,N,N’,N’-tetraciclohexil-1,2-fenilendioxidiacetamida), denominado DD-16-C-5; 2,3:11,12-didecalino-16-corona-5), bis(benzo-15-corona-5); y combinaciones de los mismos.

Entre los ejemplos de ionoforos de potasio pueden incluirse:

bis(benzo-15-corona-5)-4’-metil]pimelato, denominado BME 44;

2-dodecil-2-metil-1,3-propanodil-bis[N-{5’-nitro(benzo-15-corona-5)-4’-il]carbamato], denominado ETH1001; y combinaciones de los mismos.

Entre los ejemplos de ionoforos de calcio pueden incluirse:

(-)-(R,R)-N,N’-bis[11-(etoxicarbonil)undecil]-N,N’-4,5-tetrametil-3,6-dioxaoctan-diamida), denominado ETH129; N,N,N’,N’-tetraciclohexil-3-oxapentandiamida, denominado ETH5234; N,N-diciclohexil-N’,N’-dioctadecil-3-oxapentandiamida), denominado K23E1;

10,19-bis[(octadecilcarbamoil)metoxiacetil]-1,4,7,13,16-pentaoxa-10,19-diazacicloheneicosano); y

combinaciones de los mismos.

En un ejemplo de la presente invencion, la membrana de optodo de deteccion de analito 30 puede tener la siguiente composicion: aproximadamente 50 mmol de cromoionoforo ETH5350 (L); aproximadamente 360 mmol de ionoforo de sodio Na IV (I); aproximadamente 55 mmol de NaHFPB; y aproximadamente 0,65 de

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cloruro de polivinilo:bis(2-etilhexil)sebacato. En este caso, el equilibrio de tal membrana de optodo de deteccion de analito 30 puede representarse mediante la ecuacion siguiente:

L(m) + INa+(m) + H+ LH+(m) + I(m) + Na+(aq).

En otro ejemplo de la presente invencion, la membrana de optodo de deteccion de analito 30 puede configurase para detectar la presencia y/o concentracion de glucosa. En general, la membrana de optodo de deteccion de analito 30 puede comprender, por ejemplo, un polfmero plastificado, un cromoionoforo, un ionoforo y un anion lipofilo. Como se muestra en la Fig. 2B, la membrana de optodo de deteccion de analito 30 puede comprender ademas una membrana cargada con enzimas 36, tal como una membrana cargada con glucosa oxidasa. En la membrana cargada con glucosa oxidasa 36 puede producirse la siguiente reaccion enzimatica:

Glucosa oxidasa

Glucosa + O2 + H2O---------------------------^ Acido gluconico + H2O2

Dado que la enzima arriba indicada produce acido gluconico, el pH en la membrana de optodo de deteccion de analito 30 cambia con el cambio de la concentracion de glucosa. El color (es decir el espectro de absorcion) del colorante indicador de pH presente en o sobre la membrana cargada con enzimas 36 o la membrana de optodo de deteccion de analito 30 cambiara como consecuencia del cambio de pH en la o las membranas. Es este cambio en el espectro lo que se detecta y se utiliza para determinar la concentracion de glucosa. Tal sistema detector de glucosa puede detectar ventajosamente glucosa en el intervalo hipoglucemico (por ejemplo por debajo de aproximadamente 60 mg/dl).

En otro aspecto de la presente invencion, la membrana permeable al analito 32 puede disponerse a modo de capa sobre la membrana de optodo de deteccion de analito 30 y cubrir la abertura 28 de como mmimo la primera cavidad 24. En general, la membrana permeable al analito 32 puede comprender una o mas capas esencialmente hidrofilas que sea/sean permeables para seleccionar moleculas y desempene(n) un papel tanto protector como funcional. Por ejemplo, la membrana permeable al analito 32 puede disponerse a modo de capa sobre la membrana de optodo de deteccion de analito 30 para retener la membrana de optodo de deteccion de analito dentro de la primera cavidad 24 y al mismo tiempo proteger la membrana de optodo de deteccion de analito contra los danos. Toda o parte de la membrana permeable al analito 32 puede ser transparente. Como se muestra en las Fig. 2A-B, la membrana permeable al analito 32 puede disponerse dentro de la primera cavidad 24; sin embargo, se entiende que la membrana permeable al analito puede extenderse, como alternativa, por la segunda superficie 20 del sustrato 12 (es decir cubriendo como mmimo la abertura 28 de la primera cavidad 24) y, opcionalmente, las aberturas de otras cavidades 22 (Fig. 3A).

Funcionalmente, la membrana permeable al analito 32 puede controlar la difusion del o de los analitos objetivo y asf llevar a una mejora de la linealidad y el margen dinamico de la respuesta del sensor 10 (por ejemplo proporcionar mas sensibilidad y selectividad). Por ejemplo, la membrana permeable al analito 32 puede excluir aniones, cationes, lfpidos y/o protemas. La composicion de la membrana permeable al analito 32 puede influir en la difusion de iones cargados a la primera cavidad 24. Por ejemplo, a traves de la membrana permeable al analito 32 pueden difundirse iones fosfato de una muestra de fluido biologico y aumentar asf la capacidad de tamponacion del sistema detector 14. Si se disminuye la velocidad de difusion mediante la seleccion de los materiales utilizados para formar la membrana permeable al analito 32 es posible mantener la capacidad de tamponacion dentro de la primera cavidad 24 en un nivel bajo y, asf, aumentar la sensibilidad. La composicion de la membrana permeable al analito 32 puede influir tambien en el tiempo de respuesta del sistema detector 14. Por ejemplo, una gran permeabilidad al analito puede permitir un tiempo de respuesta muy corto.

En un ejemplo de la presente invencion, la membrana permeable al analito 32 puede comprender un gel hidrofilo con carga negativa que incluya como mmimo un polianion para reducir la capacidad de tamponacion del sistema detector 14. La capacidad de tamponacion es la capacidad de los componentes del sistema detector 14 para tamponar el pH de un medio. Si la capacidad de tamponacion es alta, se requiere mas acido para reducir el pH que si la capacidad de tamponacion es baja. Como consecuencia, los sistemas detectores basados en un cambio en el pH se vuelven menos sensibles. Si la capacidad de tamponacion es grande, el cambio de pH se minimiza y el sistema es menos sensible (por ejemplo se necesita mas acido para alcanzar un determinado cambio de pH). Por tanto, un elemento permeable al analito 32 que comprenda un gel hidrofilo con carga negativa permite ajustar la sensibilidad del sistema detector 14.

Como se ha mencionado, la estructura de la membrana permeable al analito 32 permite tambien controlar la difusion de especies de analito a traves de la membrana permeable al analito, lo que permite controlar la sensibilidad del sistema detector. Por ejemplo, si deben medirse concentraciones bajas de glucosa, la membrana permeable al analito 32 (y/u otros aspectos del sistema detector 14) puede(n) disenarse para que sea(n) particularmente sensible(s). Si deben medirse concentraciones altas de glucosa, puede ser deseable

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una menor sensibilidad. La sensibilidad de la membrana permeable al analito 32 a la concentracion de glucosa puede controlarse, por ejemplo, modificando la hidrofobicidad relativa de la membrana permeable al analito.

Dependiendo de las caractensticas de proteccion y/o funcionales deseadas, la membrana permeable al analito 32 puede estar formada por cualquier material polimerico, material formador de matriz y/o material de hidrogel o por una combinacion de estos. Por ejemplo, la membrana permeable al analito 32 puede consistir en cualquiera o una combinacion de los siguientes: celulosa con carga positiva, celulosa con carga negativa, seroalbumina bovina (BSA)-glutaraldehndo, PEG, quitosano, acetato de celulosa (CA) o acetato-ftalato de celulosa (CAP)-heparina, quitosano-heparina, poliuretano, polivinilpirrolidona, poliester acnlico, fluorocarburos, caucho siliconico, agar, hEmA (hidroxietilmetacrilato) y similares. En un ejemplo de la presente invencion, la membrana permeable al analito 32 puede comprender una pelmula de poliuretano.

La membrana permeable al analito 32 puede tener una estructura multicapa. Como se muestra en la Fig. 3B, por ejemplo, la membrana permeable al analito 32 puede comprender tres capas: una capa exterior 38, una capa central 40 y una capa interior 42. La capa exterior 38, que se expone a una muestra de fluido biologico, puede hacer las veces de capa protectora y tener un espesor de aproximadamente 2-3 pm. La capa central 40 puede servir para regular y limitar la difusion de un analito (o analitos) a la primera cavidad 24 y estar compuesta, por ejemplo, de poliuretano, polivinilpirrolidona, poliesteres acnlicos, resinas vimlicas, fluorocarburos, siliconas, cauchos, HEMA o combinaciones de estos. El poliuretano, por ejemplo, puede ser eficaz para reducir la velocidad de difusion de la glucosa en relacion con la del oxfgeno y disminuir los niveles de glucosa por debajo de la constante de Michaelis-Menten, haciendo que la respuesta total sea casi lineal. La capa central 40 puede tener un espesor de aproximadamente 5-20 pm.

La capa interior 42 puede comprender una capa con carga negativa para reducir la salida de un producto de reaccion (por ejemplo acido gluconico) del interior de la primera cavidad 24. Este control puede llevar a una mejora adicional en la sensibilidad a la glucosa, debido a la reduccion de la salida de acido gluconico a traves de la membrana con carga negativa 42. La capa interior 42 puede estar compuesta de un material polimerico y/o un material formador de matriz o una mezcla de estos, tales como CA y CAP, segun la sensibilidad deseada del sistema detector 14. En un ejemplo de la presente invencion, la capa interior 42 puede estar compuesta de una combinacion de CA y CAP en una relacion que permita controlar la velocidad de difusion de iones cargados a y/o desde la primera cavidad 24. Por ejemplo, a traves de la capa interior 42 pueden difundirse iones fosfato aumentando la capacidad de tamponacion. Si se disminuye la velocidad de difusion mediante la seleccion de los materiales de la capa interior 42 es posible mantener la capacidad de tamponacion dentro de la primera cavidad 24 en un nivel bajo y aumentar la sensibilidad. Asf, la velocidad de difusion, y por tanto la sensibilidad, puede controlarse cambiando la relacion de CA con respecto a CAP en la capa interior 42.

En otro aspecto de la presente invencion, el sistema detector 14 puede comprender como mmimo una microesfera esencialmente no transparente 34 (Fig. 4A-C) u otra partmula discreta esencialmente no transparente. Una o mas microesferas 34 pueden estar coloreadas y/o hechas de un material o una combinacion de materiales que facilite la reflectancia difusa dentro del sistema detector 14. Para facilitar la reflectancia difusa, las microesferas 34 pueden filtrar el color de una muestra de fluido biologico subyacente (por ejemplo suero o sangre). Las microesferas 34 pueden tener el mismo diametro medio o diametros medios diferentes. Por ejemplo, una o mas microesferas 34 pueden tener un diametro medio de aproximadamente 0,5100 pm. Se entiende que no todas las microesferas 34 deben ser no transparentes; mas bien solo es necesario que un numero suficiente de las microesferas sean no transparentes para facilitar la reflectancia difusa.

Una o mas de las microesferas 34 pueden estar compuestas de un material o una combinacion de materiales que facilite la reflectancia difusa. Por ejemplo, una o mas de las microesferas 34 pueden estar hechas de PVC, Ca, CAP, vidrio, Teflon y/o combinaciones de estos. Se entiende que todas las microesferas 34 pueden estar compuestas del mismo material o, como alternativa, como mmimo una de las microesferas puede estar compuesta de un material diferente del material utilizado para formar las demas microesferas.

Las microesferas 34 pueden estar en contacto con la membrana permeable al analito 32 y/o la membrana de optodo de deteccion de analito 30. Como se muestra en la Fig. 4A, por ejemplo, las microesferas 34 pueden estar dispersas (por ejemplo aleatoriamente o uniformemente) por toda la membrana de optodo de deteccion de analito 30. Como alternativa, las microesferas 34 pueden formar una capa 44 (Fig. 4B). La capa 44 de microesferas 34 puede estar compuesta enteramente de microesferas o, opcionalmente, incluir un material de soporte (por ejemplo PEG) para suspender las microesferas en el mismo. Las microesferas 34 pueden tambien estar dispersas (por ejemplo uniformemente o aleatoriamente) por toda la membrana permeable al analito 32. En un ejemplo de la presente invencion, una pluralidad de microesferas de vidrio 34 pueden estar dispersas por toda una membrana permeable al analito 32 compuesta de poliuretano.

En otro aspecto de la presente invencion, el sensor in vitro 10 puede incluir como mmimo un sistema de referencia 16 (Fig. 5A-B) para eliminar respuestas de fondo y/o proporcionar un color estandar que sirva de

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referencia, mediante el cual puedan compararse el o los cambios de color del sistema detector 14. Como mmimo una parte del sistema de referencia 16 puede estar dispuesta en la segunda cavidad 26. Como se muestra en la Fig. 5A, el sistema de referencia l6 puede comprender un material solido (por ejemplo plastico endurecido) coloreado 46 que este firmemente asentado dentro de la segunda cavidad 26. El material utilizado para formar el sistema de referencia 16 puede ser blanco, negro o de cualquier otro color, dependiendo de la aplicacion prevista para el sensor 10. Como se muestra en la Fig. 5B, el sistema de referencia 16 puede comprender alternativamente una o mas microesferas no transparentes 34 (por ejemplo blancas u opacas) dispersas en un material de soporte (por ejemplo PEG). En este caso, la membrana permeable al analito 32 puede cubrir la abertura 28 de la segunda cavidad 26. Se entiende que, en funcion del uso deseado del sensor 10, la membrana permeable al analito 32 puede cubrir tambien la abertura 28 de la segunda cavidad 26 mostrada en la Fig. 5A.

Las Fig. 6A-B ilustran un ejemplo de la presente invencion que comprende un sensor in vitro 48 para detectar multiples analitos en un entorno POC. El sensor 48 puede comprender un sustrato de vidrio 50 con una primera superficie transparente 52 dispuesta frente a una segunda superficie 54. El sustrato transparente 50 puede incluir tambien cinco cavidades 56, cada una de las cuales tiene una abertura 58 definida por la segunda superficie 54. El sustrato de vidrio 50 puede tener una forma esencialmente circular (Fig. 6B) y cada una de las cavidades 56 puede tener una profundidad de aproximadamente 300 pm y un diametro de aproximadamente 1 mm. El diametro del sensor 48 puede ser de aproximadamente 5 mm.

Como se muestra en la Fig. 6A, el sensor 48 puede incluir un primer, un segundo, un tercer y un cuarto sistema detector 60, 62, 64 y 66, asf como un sistema de referencia 68. El sensor 48 puede incluir tambien una membrana permeable al analito 70 compuesta de poliuretano. La membrana permeable al analito 70 puede estar en contacto con la segunda superficie 54 del sustrato 50 y cubrir la abertura 58 de cada una de las cavidades 56. En general, cada uno de los sistemas detectores 60, 62, 64 y 66 puede comprender tambien una membrana de optodo de deteccion de analito 72, que comprenda, por ejemplo, aproximadamente 50 mmol de cromoionoforo ETH5350, aproximadamente 360 mmol de un ionoforo, aproximadamente 55 mmol de NaHFPB y aproximadamente 0,65 de cloruro de polivinilo:bis(2-etilhexil)sebacato. Adicionalmente, cada uno de los sistemas detectores 60, 62, 64 y 66 puede incluir una o mas microesferas de vidrio 74 dispersas aleatoriamente por toda la membrana del optodo de deteccion de analito 72.

El primer sistema detector 60 puede estar dispuesto, al menos en parte, en una primera cavidad 76 del sustrato 50 y puede utilizarse para detectar la presencia y/o concentracion de glucosa. El primer sistema detector 60 puede comprender una membrana de optodo de deteccion de analito 70 (como se describe mas arriba), asf como una membrana cargada con enzimas 36, tal como una membrana cargada con glucosa oxidasa.

El segundo sistema detector 62 puede estar dispuesto, al menos en parte, en una segunda cavidad 78 del sustrato 50 y utilizarse para detectar los niveles de pH. El segundo sistema detector 62 puede comprender una membrana de optodo de deteccion de analito 70 que comprenda aproximadamente 50 mmol de cromoionoforo ETH5350, aproximadamente 360 mmol de ionoforo de sodio Na IV, aproximadamente 55 mmol de NaHFPB y aproximadamente 0,65 de cloruro de polivinilo:bis(2-etilhexil)sebacato.

El tercer sistema detector 64 puede estar dispuesto, al menos en parte, en una tercera cavidad 80 del sustrato 50 y utilizarse para detectar el nivel de iones de potasio. El tercero sistema detector 64 puede comprender una membrana de optodo de deteccion de analito 70 que comprenda aproximadamente 50 mmol de cromoionoforo ETH5350, aproximadamente 360 mmol de un ionoforo de potasio (por ejemplo BME 44), aproximadamente 55 mmol de NaHFPB y aproximadamente 0,65 de cloruro de polivinilo:bis(2-etilhexil)sebacato.

El cuarto sistema detector 66 puede estar dispuesto, al menos en parte, en una cuarta cavidad 82 del sustrato 50 y utilizarse para detectar el nivel de iones sodio. El cuarto sistema detector 66 puede comprender una membrana de optodo de deteccion de analito 70 que comprenda aproximadamente 50 mmol de cromoionoforo ETH5350, aproximadamente 360 mmol de ionoforo de sodio Na iV, aproximadamente 55 mmol de NaHFPB y aproximadamente 0,65 de cloruro de polivinilo:bis(2-etilhexil)sebacato.

El sistema de referencia 68 puede comprender un material solido coloreado 84 que este firmemente asentado dentro de una quinta cavidad 86 del sustrato 50. Por ejemplo, el sistema de referencia 68 puede comprender una pieza solida de PVC de color blanco.

Aunque los sistemas detectores 60, 62, 64 y 66 y el sistema de referencia 68 mostrados en la Fig. 6B estan dispuestos en una configuracion en cruz, se entiende que los sistemas detectores y el sistema de referencia pueden disponerse en cualquier configuracion deseada.

La Fig. 7 ilustra otro aspecto de la presente invencion, que comprende un procedimiento 88 para detectar como mmimo un analito o un producto de reaccion en una muestra de fluido biologico tomada de un individuo en un

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POC. En el presente documento, el termino “individuo” puede referirse a cualquier organismo de sangre caliente, incluyendo, pero sin limitarse a los mismos, seres humanos, ratas, ratones, perros, cabras, ovejas, caballos, monos, simios, cerdos, conejos, ganado, etc. La muestra de fluido biologico puede incluir cualquier fluido corporal obtenido de un individuo (por ejemplo un humano), tal como los fluidos corporales perifericos, que puede o no contener celulas (por ejemplo sangre, orina, plasma, mucosa, bilis, jugo pancreatico, fluido sobrenadante y suero). Los terminos “POC” o “pruebas POC” pueden referirse a pruebas de diagnostico junto a o cerca del lugar en que se atiende al individuo. En un ejemplo de la presente invencion, las pruebas POC pueden realizarse en un entorno de cuidados cnticos, tal como una UCI o una sala de urgencias.

Como se describe mas abajo, el procedimiento 88 y el sensor 10 de la presente invencion aprovechan reacciones basadas en enzimas, a diferencia de los sistemas detectores del estado actual de la tecnica, que normalmente incluyen analisis de fijacion, que tienen diversas desventajas comparados con la presente invencion. Por ejemplo, las reacciones basadas en enzimas no solo incluyen el paso del reconocimiento selectivo, sino que tambien anaden un paso de amplificacion en forma de reaccion bioqmmica catalizada por enzimas (por ejemplo la fijacion y oxidacion de glucosa mediante glucosa oxidasa). En cambio, los analisis de fijacion son susceptibles a interferencias causadas por otras moleculas de estructura qrnmica similar. Ademas, los analisis de fijacion tienden a mostrar poca reversibilidad y precision despues de la exposicion a fluidos corporales, debido a la fijacion parasita de moleculas qmmicamente similares (pero funcionalmente diferentes) distintas al analito deseado. El procedimiento 88 y el sensor 10 de la presente invencion permiten ventajosamente una amplificacion, dado que el material de deteccion (por ejemplo una enzima) no solo proporciona un reconocimiento selectivo de una molecula de analito, sino que tambien convierte el analito en un producto (o en productos) de reaccion.

Un aspecto del procedimiento 88 puede incluir proporcionar un sensor in vitro 10 en el paso 90. En general, el sensor in vitro 10 puede comprender un sustrato 12 que tenga una primera y una segunda superficies 18 y 20, un sistema detector 14 dispuesto como mmimo parcialmente en una primera cavidad 24, y un sistema de referencia 16 dispuesto como mmimo parcialmente en una segunda cavidad 26. Como se explica mas arriba, el sistema detector 14 puede incluir una membrana permeable al analito 32, una membrana de optodo de deteccion de analito 30 y como mmimo una microesfera no transparente 34 en contacto con la membrana permeable al analito y/o la membrana de optodo de deteccion de analito. La configuracion concreta del sensor 10 dependera de su aplicacion prevista. Por ejemplo, el numero de sistemas detectores 14 y la composicion de la o las membranas permeables al analito 32 y la o las membranas de optodo de deteccion de analito 30 dependeran del analito y/o producto de reaccion concreto a detectar.

En un ejemplo del procedimiento 88, el sensor in vitro 10 puede estar configurado como se muestra en las Fig. 6A-B y utilizarse para detectar la presencia de iones sodio, iones potasio, pH y glucosa en una muestra de sangre obtenida de un individuo en una UCI.

En el paso 92 puede obtenerse la muestra de fluido biologico del individuo utilizando un medio o una combinacion de medios ya conocidos en el estado actual de la tecnica. Para obtener una muestra de sangre, por ejemplo, puede utilizarse una jeringa para sacar sangre de una vena del individuo. Como alternativa, si se desea, puede separarse una muestra de sangre (por ejemplo mediante centrifugacion) para aislar y obtener una muestra de suero. Una muestra de sangre puede obtenerse adicional u opcionalmente pinchando ligeramente uno de los dedos del individuo (por ejemplo con una aguja esteril) y recogiendo a continuacion el volumen deseado de sangre.

En un ejemplo del procedimiento puede recogerse del individuo una cantidad de tan solo 1 pl de sangre utilizando una aguja hipodermica.

Despues de recoger la muestra de fluido biologico, la muestra de fluido biologico puede colocarse en un recipiente de muestras 98 configurado para alojar el sensor 10. El recipiente de muestras 98 puede comprender, por ejemplo, un recipiente de plastico o vidrio con una parte entrante (por ejemplo un pocillo) adaptada para recibir el sensor 10. En un ejemplo del procedimiento puede pincharse el dedo 100 del individuo (por ejemplo utilizando una aguja esteril) y a continuacion recogerse un volumen deseado de sangre 102 en el recipiente de muestras (Fig. 8).

En el paso 94 puede disponerse el sensor 10 en el recipiente de muestras 98 de manera que la muestra de fluido biologico entre en contacto con como mmimo una parte de la membrana permeable al analito 32. Como se muestra en la Fig. 9, por ejemplo, el sensor 48 puede colocarse en el recipiente de muestras 98 de manera que la muestra de fluido biologico (por ejemplo sangre 102) quede interpuesta entre el fondo del recipiente, la segunda superficie 54 del sustrato 50 y la membrana permeable al analito 70. Con la muestra biologica en contacto con al menos una parte de la membrana permeable al analito 32, uno o mas analitos pueden difundirse a traves de la membrana permeable al analito para entrar en contacto con la membrana de optodo de deteccion de analito 30. Dependiendo de la composicion concreta del sistema detector 14, el o los materiales indicadores

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y/o materiales de deteccion pueden reaccionar con (o ante) los analitos y provocar asf un cambio de color en el sistema detector.

En un ejemplo del procedimiento 88, el sensor 48 mostrado en las Fig. 6A-B puede colocarse en un recipiente de muestras de vidrio 98 (Fig. 9). Cuando el sensor 48 se coloca en el recipiente de muestras 98, la sangre 102 puede entrar en contacto con la membrana permeable al analito 70 que cubre los sistemas detectores primero, segundo, tercero y cuarto 60, 62, 64 y 66. En el primer sistema detector 60, por ejemplo, puede producirse la reaccion enzimatica arriba descrita en la membrana cargada con enzimas 36 (es decir membrana cargada con glucosa oxidasa). Dado que la reaccion enzimatica produce acido gluconico, el pH en la membrana de optodo de deteccion de analito 72 puede reflejar (y cambiar con) la concentracion de glucosa en la muestra de sangre 102. El color (es decir el espectro de absorcion) del colorante indicador de pH cambiara debido al cambio de pH en la o las membranas 36 y 72.

En el segundo, el tercer y el cuarto sistemas detectores 62, 64 y 66 pueden tener lugar tambien reacciones en cierto modo similares. En el segundo sistema detector 62, por ejemplo, el material indicador en la membrana de optodo de deteccion de analito 72 puede cambiar de color dependiendo de la concentracion de iones hidrogeno en la muestra de sangre 102. Adicionalmente, el tercer y el cuarto sistemas detectores 64 y 66 pueden cambiar de color dependiendo de la concentracion de iones potasio y sodio, respectivamente, en la muestra de sangre 102.

Despues de poner en contacto la muestra de fluido biologico con al menos una parte de la membrana permeable al analito 32, puede detectarse un cambio (o pueden detectarse cambios) de color en el paso 96. Como se indica mas arriba, el cambio de color puede producirse como resultado de una propiedad optica cambiada en el sistema detector 14, tal como un cambio de color de un colorante de absorcion o una emision por parte de un colorante fluorescente. El cambio de color puede detectarse mediante un detector 104 (Fig. 10). El detector 104 puede detectar cambios de color que se produzcan y determinar la concentracion de analito tomando como referencia cuadros de calibracion, tablas de consulta o similares. El detector 104 puede incluir cualquier tipo de dispositivo de barrido, tal como un dispositivo acoplado por carga (CCD) (por ejemplo una camara CCD) o un espectrofotometro que pueda registrar la longitud de onda de la luz emitida por cada uno de los sistemas detectores 14 y/o su intensidad. En un ejemplo del procedimiento 88, el detector 104 puede comprender una camara CCD en color que reconozca automaticamente los componentes del detector 10, tal como los sistemas detectores 14 y el sistema de referencia 16, mediante un procesamiento de imagenes.

Alternativamente, el detector 104 puede incluir un ojo humano. Un examen visual permite en general una evaluacion cualitativa o semicuantitativa mas que una evaluacion cuantitativa de la concentracion de analito. Sin embargo, en muchos casos, una evaluacion asf es suficiente para la gestion de individuos.

En un ejemplo de la presente invencion, el material indicador (por ejemplo un colorante sensible al pH) inmovilizado sobre (o en) la membrana de optodo de deteccion de analito 30 puede cambiar de color (es decir longitud de onda de absorcion) dependiendo de la concentracion de la clase de analito que se este controlando. El color puede reconocerse mediante el detector 104, utilizando una fuente de luz (que puede ser parte integrante del detector) y un dispositivo de medicion de color adecuado, tal como un espectrofotometro con una unidad de procesamiento de datos digital. Por ejemplo, un espectrofotometro puede detectar la absorbancia de luz en una o mas longitudes de onda o uno o mas intervalos de longitudes de onda en las/los que el material indicador absorba. Con el aumento de la concentracion del analito, la absorbancia en la longitud de onda seleccionada bien aumenta o bien disminuye, dependiendo de si la absorbancia se debe a una forma protonizada o una forma no protonizada del material indicador. A continuacion, puede correlacionarse la absorbancia con la concentracion de glucosa, por ejemplo, utilizando un algoritmo o una tabla de consulta basada en una calibracion previa con soluciones de concentraciones de glucosa conocidas que cubran el intervalo de concentraciones a medir.

Si se utiliza una camara CCD u otro dispositivo similar para detectar el cambio de color, se entiende que el detector 104 puede comunicarse con un procesador informatico (no mostrado), de manera que pueden utilizarse tecnicas de medida ratiometricas (por ejemplo reconocimiento de forma espectral para identificar el “color”) para un control preciso y cuantitativo del analito. En un sistema detector mas avanzado, por ejemplo, puede utilizarse un reconocimiento de formas. En tal sistema, la senal que lleva la informacion buscada es el color de los diferentes puntos de deteccion. Por tanto, se representa, en terminos ffsicos, en forma de un espectro. Este puede ser un espectro reflejado, un espectro retrodispersado o incluso un espectro de transmitancia, pero una caractenstica importante es que el color para un instrumento detector sea equivalente a un espectro. Mas exactamente, lo que interesa es la forma del espectro y, por tanto, es independiente de la intensidad.

Este no es el caso para otros planteamientos existentes. Por ejemplo, los procedimientos electroqmmicos transducen la concentracion en intensidad de corriente, que es una unica variable. Los procedimientos basados

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en la fluorescencia transducen la concentracion en intensidad de fluorescencia, que tambien es una unica variable. En el presente procedimiento, el color real indica concentracion, lo que significa que la concentracion se transduce en la forma de un espectro. Este espectro puede ser de intensidad transmitida o reflejada o retrodispersada, o alguna variable derivada como la absorbancia, en funcion de la longitud de onda o la frecuencia de la luz. El espectro puede obtenerse mediante barrido por un intervalo determinado de longitudes de onda o frecuencias de luz. El resultado es una funcion que consiste en varios pares de valores, tales como pares de intensidad y frecuencia. El numero de estos pares puede ser 3, 4 o incluso cientos, dependiendo de la resolucion y el intervalo. Asf, un valor de concentracion esta representado por un gran numero de puntos de datos independientes. Esto significa un alto grado de redundancia, que puede utilizarse para mejorar enormemente la calidad estadfstica y la fiabilidad de la concentracion determinada. Esto difiere de las tecnicas basadas en la intensidad, en las que un valor se obtiene de solamente otro valor, es decir la concentracion. Para hacer uso de la gran cantidad de informacion disponible en forma de un espectro, puede utilizarse la forma para la calibracion del sensor 10 versus la concentracion, asf como para recuperar concentraciones desconocidas a partir de la calibracion.

Existen diversos procedimientos para cuantificar la forma del espectro. Entre estos se incluyen enfoques de reconocimiento de formas, analisis factorial y tecnicas de ajuste de curvas. En un ejemplo del procedimiento 88, la forma se identifica con la direccion de un vector construido a partir de los pares de datos que componen el espectro en un espacio multidimensional. Esto hace posible identificar concentraciones utilizando la similitud en la direccion del vector de datos real y la de algun vector estandar o basado en una calibracion. El parecido de las dos direcciones esta asegurado cuando el angulo entre dos de tales vectores es pequeno y esta proximo a cero.

Entre las ventajas de utilizar un analisis de forma pueden incluirse: independencia de las longitudes reales del camino optico, que tienden a afectar a la intensidad, pero no afectan a la forma del espectro; un alto grado de independencia del ruido aleatorio, dado que basta con identificar la forma global del espectro (es decir sus componentes de frecuencia inferiores para identificar la concentracion que la ha causado); extrema robustez del planteamiento en terminos de una gran inmunidad frente a fuentes de error potenciales, tales como los errores aleatorios y algunos errores no aleatorios; y que el potencial para la autocomprobacion esta asegurado porque es imposible o improbable que las formas puedan reconocerse facilmente. En general, en las tecnicas de evaluacion convencionales no se dispone de estas ventajas.

En un ejemplo de la presente invencion puede utilizarse un CCD en color para detectar la concentracion de glucosa, el pH, el potasio y el sodio. Para detectar la concentracion de glucosa, por ejemplo, puede utilizarse procesamiento de imagen para restar el fondo entre los espectros del primer sistema detector 60 y el sistema de referencia 68. Un software en un procesador informatico puede realizar la sustraccion del fondo utilizando informacion del sistema de referencia 68 y proporcionar una medicion de la concentracion de glucosa (o de otros analitos). La camara CCD puede detectar luz emitida en dos o mas longitudes de onda (por ejemplo como mmimo diez longitudes de onda) dentro del intervalo emitido/absorbido por el material indicador u otro material cromogeno. De este modo, el software puede reconocer la forma de la curva de distribucion de longitudes de onda (por ejemplo un grafico de intensidad vs. longitud de onda) a partir de la relacion entre las intensidades de las longitudes de onda detectadas, que es una constante para el color concreto y, por tanto, la identifica con el color de la luz emitida/absorbida. Este reconocimiento de color, mas que la intensidad de la luz del elemento detector, reduce la influencia de variables, tales como la longitud del camino optico, en la deteccion del analito.

El sistema es particularmente util cuando hay una pluralidad de sistemas detectores 14 que generan cada uno un cambio de color con una concentracion diferente del analito. El software puede proporcionar entonces una sencilla deteccion sf/no para cada sistema detector 14, dependiendo de que color se genere. Esto es en gran medida independiente de la longitud del camino optico y de otros factores que afectan a la intensidad luminosa, como la longitud de onda o la intensidad de la luz ambiental o de otra luz que incida en el sistema detector 14. Como medida de la concentracion de analito puede utilizarse entonces el numero de sistemas detectores 14 que cambien de color.

A diferencia de otros dispositivos y procedimientos para pruebas en el punto de cuidado (POC), la presente invencion proporciona ventajosamente una tecnologfa de optodo reversible de bajo costo, que convierte concentraciones de analito en colores que pueden detectarse utilizando dispositivos sencillos (por ejemplo LED y fotodiodos). La presente invencion puede ajustarse a diferentes analitos, de manera que puedan detectarse mas analitos en funcion de las necesidades clmicas del individuo. Dado que el sensor 10 de la presente invencion es reversible y no necesita energfa ni reactivos para funcionar, un unico sensor puede reutilizarse muchas veces, de manera que con un solo sensor puede cubrirse todo el periodo de atencion de un individuo (por ejemplo en la UCI). Asf, a diferencia de las tiras de ensayo de analito POC convencionales, la presente invencion proporciona una instantanea en tiempo real del estado metabolico global de un individuo a partir de una unica muestra de fluido biologico en el POC.

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Los ejemplos siguientes tienen solo fines ilustrativos y no estan destinados a limitar el alcance de las reivindicaciones que se adjuntan a este documento.

Ejemplo 1: Calibracion de sensores de pH basados en HEMA en suero y sangre

Estructura del sensor

Como se muestra en la Fig. 16, un sensor de pH que tema los siguientes componentes se construyo de la siguiente manera: un sustrato de vidrio (inerte, transparente e impermeable); una capsula de HEMA de 3 capas; y esferas blancas inertes para suprimir la interferencia optica de la muestra dispuestas a modo de capa encima de la membrana detectora. La capsula de HEMA tema la siguiente configuracion: una capa para la union al sustrato de vidrio (~17 pm de espesor); una capa de capsula de membrana (~150 pm de espesor); y una capa permeable delgada para la membrana de analito y para proteger la estructura de la corrosion biologica. La composicion de la membrana tema tambien los siguientes componentes: cromoionoforo ETH350 (50 mmol); ionoforo de sodio Na IV (360 mmol); sitio ionico NaHFPB (55 mmol); y PVC:DOS (0,65).

En todos los casos, el pH se ajusto anadiendo pequenas partes alfcuotas de KOH o HCl al suero o la sangre.

Calibracion de sensor de pH basado en HEMA en suero

Calibracion de suero para sensores de pH: Se anadio KOH o HCl a suero fetal bovino (fetal bovine serum (FBS)) para ajustar el pH a los valores deseados. Se colocaron sensores en soluciones de FBS durante 10 minutos. La Fig. 17 muestra la respuesta al pH en FBS de los sensores. La Fig. 18 muestra un punto de deteccion de pH real en soluciones de FBS. La Fig. 19 muestra la respuesta al pH en FBS del sensor despues de 1 y 2 dfas de exposicion. Todas las calibraciones utilizan razon de intensidad de color de rojo normalizado:azul normalizado.

Calibracion de sensor basado en HEMA en sangre

Calibracion de sangre humana para sensores de pH: Se anadio 1x de muestra de sangre humana a 10x de tampon fosfato salino (phosphate buffered saline (PBS)). Inicialmente se habfa anadido KOH o HCl al PBS para ajustar el pH a los valores deseados. Se colocaron sensores en soluciones de sangre humana + PBS durante 10 minutos. La Fig. 20 muestra la respuesta de los sensores mientras aun estaban en la sangre. La Fig. 21 muestra un punto de deteccion de pH en la muestra de sangre con diversos niveles de pH. La Fig. 22 muestra la respuesta al pH de los sensores inmediatamente despues de retirar el sensor de la muestra de sangre. La Fig. 23 muestra un punto de deteccion de pH inmediatamente despues de retirar el sensor de la muestra de sangre. Todas las calibraciones utilizan razon de intensidad de color de rojo normalizado:azul normalizado.

Ejemplo 2: Calibracion de sensores de glucosa basados en HEMA en suero y sangre

Se construyo un sensor de glucosa como se muestra en la Fig. 24. La capsula detectora de glucosa contema una membrana de deteccion de pH y una solucion de GOX. Se disolvieron 2 mg de GOX en 200 pl de PBS. Se anadio a cada capsula detectora de glucosa 1 pl de la solucion de GOX. El sensor permanecio expuesto al aire durante la noche para permitir la formacion de la membrana de GOX.

Se produjeron sensores que consistfan en un punto de deteccion de pH, 2 puntos de deteccion de glucosa y una referencia optica blanca para crear un conjunto ordenado de sensores multiparametrico. El sensor consta de una membrana de HEMA de 3 capas + un sustrato de vidrio, como se ha descrito en el Ejemplo 1. La Fig. 25 muestra el conjunto ordenado de sensores.

En todos los casos, el nivel de glucosa se ajusto anadiendo pequenos pesos de monohidrato de glucosa a suero o sangre humana.

Calibracion de sensor de glucosa basado en HEMA en suero

Calibracion de suero para sensores de glucosa: Se anadio monohidrato de glucosa a FBS para ajustar los niveles de glucosa deseados. Se colocaron sensores en las soluciones de FBS durante 10 minutos. La Fig. 26 muestra la respuesta a la glucosa en FBS de los sensores. La Fig. 27 muestra un punto de deteccion de glucosa real en soluciones de FBS. Todas las calibraciones utilizan razon de intensidad de color de rojo normalizado:azul normalizado.

Calibracion de sensor de glucosa basado en HEMA en sangre

Calibracion de sangre humana para sensores de glucosa: Se anadio 1 volumen de muestra de sangre humana a 10 volumenes de PBS. Se anadio monohidrato de glucosa al PBS para ajustarlo a los niveles de glucosa deseados. Se colocaron sensores en soluciones de sangre humana + glucosa durante 10 minutos. La Fig. 28 muestra la respuesta de los sensores mientras aun estaban en la sangre. La Fig. 29 muestra los puntos de deteccion de glucosa en la muestra de sangre con diversos niveles de pH. La Fig. 30 muestra la respuesta a la glucosa de los sensores inmediatamente despues de retirar el sensor de la muestra de sangre. La Fig. 31 muestra un punto de pH glucosa inmediatamente despues de retirar el sensor de la muestra de sangre. Todas las calibraciones utilizan razon de intensidad de color de rojo normalizado:azul normalizado.

De la descripcion anterior de la invencion, el experto en la materia podra deducir mejoras, cambios y modificaciones. Tales mejoras, cambios y modificaciones son conocidos por el experto en la materia y la intencion es que queden cubiertos por las reivindicaciones adjuntas.

Claims

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Reivindicaciones

Sensor in vitro para la deteccion en el punto de cuidado (POC (point-of-care)) de como mmimo un analito o producto de reaccion, comprendiendo dicho sensor:

un sustrato inerte impermeable que incluye una primera superficie transparente dispuesta frente a una segunda superficie, y unas primera y segunda cavidades, definiendo cada una de dichas primera y segunda cavidades una abertura en dicha segunda superficie; estando dicho sustrato compuesto de plastico y/o vidrio:

un sistema detector dispuesto en dicha primera cavidad, comprendiendo dicho sistema detector una membrana de optodo de deteccion de analito, que incluye como mmimo un material indicador que experimenta un cambio de color en respuesta al analito o a un producto de reaccion, una membrana permeable al analito y una pluralidad de microesferas no transparentes que tienen un diametro medio de 0,5-100 pm y estan en contacto con dicha membrana de optodo de deteccion de analito y/o dicha membrana permeable al analito, estando dicha membrana permeable al analito dispuesta a modo de capa sobre dicha membrana de optodo de deteccion de analito y cubriendo dicha membrana permeable al analito una abertura de dicha primera cavidad; y un sistema de refrencia dispuesto en dicha segunda cavidad.

Sensor segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicho sustrato esta compuesto de plastico comprendediendo polimetilmetacrilato y/o 2-hidroxietilmetacrilato.

Sensor segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicho sustrato esta oscurecido.

Sensor segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha membrana de optodo de deteccion de analito incluye como mmimo un material de deteccion que reacciona con el analito para producir el producto de reaccion.

Sensor segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha membrana permeable al analito es transparente.

Sensor segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha membrana permeable al analito comprende una capa esencialmente hidrofila que es permeable para seleccionar moleculas.

Sensor segun la reivindicacion 6, caracterizado porque dicha membrana permeable al analito excluye al menos uno de aniones, lfpidos y/o protemas para mejorar la selectividad y/o la sensibilidad.

Sensor segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha membrana permeable al analito tiene multiples capas, que comprenden:

una capa exterior en contacto con una muestra de fluido biologico;

una capa central para regular y limitar la difusion de moleculas a dicha como mmimo una cavidad; y

una capa interior con carga negativa que esta en contacto con dicha membrana de optodo de deteccion de analito.

Sensor segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha pluralidad de microesferas no transparentes estan dispersas dentro de dicha membrana de optodo de deteccion de analito y/o dicha membrana permeable al analito.

Sensor segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha pluralidad de microesferas no transparentes comprenden una capa dispuesta entre dicha membrana de optodo de deteccion de analito y dicha membrana permeable al analito.

Procedimiento para detectar como mmimo un analito o producto de reaccion en una muestra de fluido biologico tomada de un individuo en el punto de cuidado (POC (point-of-care)), comprendiendo dicho procedimiento los pasos de:

proporcionar el sensor in vitro de la reivindicacion 1, que comprende un sustrato que tiene unas primera y segunda cavidades, un sistema detector dispuesto como mmimo parcialmente en la primera cavidad, una superficie, estando como mmimo una parte de dicho sustrato compuesta de plastico y/o vidrio, y un sistema de referencia dispuesto como mmimo parcialmente en la segunda cavidad, comprendiendo el sistema detector una membrana de optodo de deteccion de analito que incluye como mmimo un material indicador que experimenta un cambio de color en respuesta al analito o a un producto de reaccion, una membrana permeable al analito y una pluralidad de microesferas no transparentes que tienen un diametro medio de 0,5-100 pm y estan en contacto con la membrana de

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optodo de deteccion de analito y/o la membrana permeable al analito, estando la membrana permeable al analito dispuesta a modo de capa sobre la membrana de optodo de deteccion de analito y cubriendo la membrana permeable al analito una parte de la primera cavidad; poner en contacto una muestra de fluido biologico previamente obtenida con la membrana permeable al analito; y

detectar un cambio de color en el sistema detector.
12. Procedimiento segun la reivindicacion 11, caracterizado porque dicho paso de puesta en contacto comprende ademas los pasos de:

proporcionar un recipiente de muestras configurado para alojar el sensor; colocar la muestra de fluido biologico en el recipiente de muestras; y

colocar el sensor en el recipiente de muestras de manera que la muestra de fluido biologico entre en contacto con al menos una parte de la membrana permeable al analito.
13. Procedimiento segun la reivindicacion 11, caracterizado porque dicho paso de deteccion comprende ademas el paso de utilizar un dispositivo acoplado por carga para detectar el cambio de color y, opcionalmente, comprende ademas el paso de transformar el cambio de color detectado en una lectura cuantitativa.
14. Procedimiento segun la reivindicacion 11, caracterizado porque el POC es un entorno de cuidados cnticos, siendo el entorno de cuidados cnticos opcionalmente una unidad de cuidados intensivos.
15. Procedimiento segun la reivindicacion 11, caracterizado porque dicho sustrato es inerte e impermeable.