ES2626881T3

ES2626881T3 - Péptidos derivados del factor VIII para uso en el tratamiento de la hemofilia A

Info

Publication number: ES2626881T3
Application number: ES13795002.8T
Authority: ES
Inventors: David Wraith; Heather Streeter
Original assignee: Apitope International NV
Current assignee: Apitope International NV
Priority date: 2012-11-12
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2017-07-26
Anticipated expiration: 2033-11-11
Also published as: DK2917232T3; EP2917232A1; MX2015005973A; BR112015010625B1; EA201590927A1; CY1119164T1; CA2890835C; PH12015501033A1; RS56069B1; US20210346476A1; AU2013343024B2; CN104903347B; WO2014072958A1; HRP20170794T1; HK1209138A1; ZA201503127B; JP6247696B2; KR102165486B1; SI2917232T1; KR20150084852A

Abstract

Un péptido que comprende la secuencia derivada de FVIII DNIMVTFRNQASRPY, péptido que (a) tiene la fórmula: XXGDNIMVTFRNQASRPYGXX en la que X es bien lisina o ácido glutámico; y (b) tiene una de las siguientes secuencias: KKGDNIMVTFRNQASRPYGKK (SEQ ID NO: 17) KKGDNIMVTFRNQASRPYGKE (SEQ ID NO: 18) KKGDNIMVTFRNQASRPYGEK (SEQ ID NO: 19) KEGDNIMVTFRNQASRPYGKK (SEQ ID NO: 25) KEGDNIMVTFRNQASRPYGKE (SEQ ID NO: 26) KEGDNIMVTFRNQASRPYGEK (SEQ ID NO: 27) EKGDNIMVTFRNQASRPYGKK (SEQ ID NO: 29) EKGDNIMVTFRNQASRPYGKE (SEQ ID NO: 30) y EKGDNIMVTFRNQASRPYGEK (SEQ ID NO: 31).

Description

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El epítopo mínimo es el fragmento más corto que se puede derivar de un epítopo, que es capaz de unirse al surco de unión a péptidos de una molécula de MHC de clase I o II y ser reconocido por un linfocito T. Para una región inmunogénica dada, normalmente es posible generar un “conjunto anidado” de péptidos solapantes que actúan como epítopos, conteniendo todos ellos el epítopo mínimo, pero que difieren en sus regiones flanqueantes.

De igual modo, es posible identificar el epítopo mínimo para una determinada combinación de molécula de MHC: linfocito T midiendo la respuesta hacia péptidos truncado. Por ejemplo, si se obtiene una respuesta hacia el péptido que comprende los restos 1-15 en la biblioteca solapante, se pueden usar conjuntos que están truncados en ambos extremos (es decir 1-14, 1-13, 1-12, etc. y 2-15, 3-15, 4-15, etc.) para identificar el epítopo mínimo.

Los presentes inventores han determinado previamente que existe un vínculo entre la capacidad de un péptido para unirse a una molécula de MHC de clase I o II y presentarse a un linfocito T sin el procesamiento adicional del antígeno, y la capacidad del péptido para inducir tolerancia in vivo (documento WO 02/16410). Si un péptido es demasiado largo para unirse al surco de unión a péptidos de una molécula de MHC sin procesamiento adicional (por ejemplo, reducción), o se une en una configuración inapropiada, entonces no será tolerogénico in vivo. Si, por otro lado, el péptido es de un tamaño y una configuración adecuados para unirse directamente al surco de unión a péptidos MHC y presentarse a un linfocito T, entonces cabe predecir que este péptido será útil para la inducción de tolerancia.

Por lo tanto, es posible investigar la capacidad tolerogénica de un péptido investigando si puede unirse a una molécula de MHC de clase I o II y presentarse a un linfocito T sin el procesamiento adicional del antígeno in vitro.

Los péptidos de la presente invención son epítopos (epíTOPOS, independientes del procesamiento antigénico), en tanto en cuanto pueden unirse a una molécula de MHC de clase II y estimular una respuesta a partir de linfocitos T específicos del factor VIII sin el procesamiento adicional del antígeno. Puede predecirse que dichos epítopos provocan tolerancia a FVIII, siguiendo el método basado en normas descrito en el documento WO 02/16410.

Un péptido de la presente invención puede ser de cualquier longitud que pueda unirse a una molécula de MHC de clase I o II sin procesamiento adicional. Por lo general, el péptido de la presente invención puede unirse a MHC de clase II.

Los péptidos que se unen a moléculas de MHC de clase I normalmente son de 7 a 13, más habitualmente de 8 a 10 aminoácidos de longitud. La unión del péptido se estabiliza en sus dos extremos mediante contactos entre átomos de la cadena principal del péptido y sitios invariables del surco de unión a péptidos de todas las moléculas de MHC de clase I. Existen sitios invariables en ambos extremos del surco que se unen a los extremos amino y carboxi del péptido. Se adaptan variaciones de la longitud del péptido mediante un retorcimiento en la estructura principal del péptido, a menudo en los restos de prolina o glicina que permiten la flexibilidad necesaria.

Por lo general, los péptidos que se unen a moléculas de MHC de clase II son de entre 8 y 20 aminoácidos de longitud, más habitualmente de entre 10 y 17 aminoácidos de longitud, y pueden ser más largos (por ejemplo de hasta 40 aminoácidos). Estos péptidos se encuentran en una configuración extendida a lo largo del surco de unión a péptidos de MHC II que (a diferencia del surco de unión a péptidos de MHC de clase I) está abierto en ambos extremos. El péptido se mantiene en su lugar principalmente mediante contactos de átomos de la cadena principal con restos conservados que revisten el surco de unión a péptidos.

SECUENCIAS PEPTÍDICAS

La primera realización de la invención se refiere a un péptido que comprende una secuencia derivada de FVIII. Las secuencias derivadas de FVIII que se investigaron en los ejemplos tienen las siguientes secuencias:

SEQ ID NO: 1: Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys

SEQ ID NO: 2: Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Glu

SEQ ID NO: 3: Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys

SEQ ID NO: 4: Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Glu

SEQ ID NO: 5: Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys

SEQ ID NO: 6: Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Glu

SEQ ID NO: 7: Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys

SEQ ID NO: 8: Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Glu

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El péptido puede tener la SEQ ID NO: 1.

FACTOR VIII

Las secuencias DNIMVTFRNQASRPY y PRCLTRYYSSFVNME, que forman la parte central de los péptidos de la invención, pueden ambas derivarse del factor VIII.

El factor VIII participa en la vía intrínseca de la coagulación sanguínea; el factor VIII es un cofactor para el factor IXa que, en presencia de Ca+2 y fosfolípidos, convierte el factor X en la forma activada Xa.

El gen del factor VIII produce dos transcripciones sometidos a corte y empalme alternativamente. La variante de transcripción 1 codifica para una gran glicoproteína, la isoforma a, que circula en plasma y se asocia con el factor de von Willebrand en un complejo no covalente. Esta proteína se somete a múltiples escisiones. La variante de transcripción 2 codifica una supuesta proteína pequeña, la isoforma b, que consiste principalmente en el dominio de unión a fosfolípidos del factor VIIIc. Este dominio de unión es esencial para la actividad coagulante.

La secuencia completa de 186.000 pares de bases del gen del factor VIII humano se dilucidó a mediados de los años 80 del siglo pasado (Gitschier et al (1984) Nature 312, 326-330). Al mismo tiempo se usaron clones de ADN codificantes de la secuencia completa de 2.351 aminoácidos para producir el factor VIII biológicamente activo en células de mamífero cultivadas (Wood et al., (1984) Nature 312:330-337). La secuencia completa de 2.351 aminoácidos para el factor VIII humano se da en SEQ ID NO: 33.

SOLUBILIDAD

El péptido de la primera realización de la invención es una forma modificada de uno de los siguientes péptidos:

DNIMVTFRNQASRPY PRCLTRYYSSFVNME

Se ha demostrado que estos péptidos actúan como epítopos y son tolerogénicos in vivo (véanse los ejemplos y la solicitud de patente internacional n.º PCT/GB2008/003996).

Desde entonces, ha salido a la luz que la solubilidad es una consideración importante en la inducción de tolerancia mediada por péptidos.

Los presentes inventores han encontrado que la solubilidad puede mejorarse mediante la incorporación de un espaciador de glicina en ambos extremos, seguida de combinaciones de dos aminoácidos adicionales que pueden ser lisina (K) y/o ácido glutámico (E) tanto en el extremo N como C. La combinación posible en un extremo dado es, por tanto, KK, KE, EK o EE.

Por lo tanto, los péptidos modificados de la presente invención tienen 6 aminoácidos más (3 en cada extremo) que los péptidos DNIVM y PRCLT precursores.

Los péptidos de la presente invención tienen la fórmula general:

XXGDNIMVTFRNQASRPYGXX o XXGPRCLTRYYSSFVNMEGXX

en la que X es bien lisina o ácido glutámico.

El péptido modificado puede ser más soluble que el péptido precursor (no modificado). El péptido modificado puede tener una solubilidad de 2, 3, 4 o 5 veces superior que el péptido precursor. El péptido puede ser soluble a concentraciones de hasta 0,5 mg/ml, 1 mg/ml o 5 mg/ml.

TOLERANCIA

Los epítopos de linfocitos T desempeñan un papel fundamental en la respuesta inmunitaria adaptativa frente a cualquier antígeno, ya sea propio o foráneo. El papel fundamental desempeñado por los epítopos de linfocitos T en las enfermedades de hipersensibilidad (que incluyen alergia, enfermedades autoinmunitarias y rechazo de trasplantes) se ha demostrado a través del uso de modelos experimentales. Es posible inducir enfermedades inflamatorias o alérgicas mediante la inyección de péptidos sintéticos (basados en la estructura de los epítopos de linfocitos T) en combinación con adyuvante.

Por el contrario, se ha mostrado que es posible inducir la tolerancia inmunológica hacia determinados antígenos mediante la administración de epítopos peptídicos en forma soluble. La administración de antígenos peptídicos

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solubles ha demostrado ser un medio eficaz de inhibición de la enfermedad en la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE – un modelo de esclerosis múltiple (EM)) (Metzler y Wraith (1993) Int. Immunol. 5: 1159-1165; Liu y Wraith (1995) Int. Immunol. 7: 1255-1263; Anderton y Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251-1261); y modelos experimentales de artritis, diabetes y uveorretinitis (revisado en Anderton y Wraith (1998) como anteriormente). Esto también se ha demostrado como medio de tratamiento de una enfermedad en curso en la EAE (Anderton y Wraith (1998) como anteriormente).

La tolerancia es la ausencia de respuesta frente a un antígeno. La tolerancia a antígenos propios es una característica esencial del sistema inmunitario. Cuando esta se pierde, puede producirse una enfermedad autoinmunitaria. El sistema inmunitario adaptativo debe mantener la capacidad para responder a una enorme variedad de agentes infecciosos, evitando a la vez el ataque autoinmunitario de los antígenos propios contenidos dentro de sus propios tejidos. Esto se controla en gran medida por la sensibilidad de los linfocitos T inmaduros a la muerte celular apoptótica en el timo (tolerancia central). Sin embargo, no todos los antígenos propios se detectan en el timo, de modo que la muerte de los timocitos autorreactivos sigue siendo incompleta. Por lo tanto, también existen mecanismos mediante los que puede adquirirse tolerancia por los linfocitos T autorreactivos maduros en los tejidos periféricos (tolerancia periférica). Se facilita una revisión de los mecanismos de tolerancia central y periférica en Anderton et al., (1999) (Immunological Reviews 169: 123-137).

En la hemofilia A, los pacientes tienen un defecto en el gen del factor VIII. Esto significa que el factor VIII no se reconoce como un antígeno “propio” por el sistema inmunitario. Por lo tanto, cuando se administra factor VIII durante la terapia de reemplazo de factores de coagulación, se genera una respuesta aloinmunitaria hacia la proteína foránea, que conduce a la producción de anticuerpos inhibidores de FVIII.

Los péptidos de la presente invención pueden inducir tolerancia hacia el factor VIII de manera que cuando se administre FVIII profilácticamente, no se induzca una respuesta inmunitaria ni se desarrollen inhibidores de FVIII; y cuando se administre terapéuticamente, se reduzca o se inhiba la producción de inhibidor de FVIII en curso.

La hemofilia adquirida es una enfermedad autoinmunitaria en la que falla la tolerancia al factor VIII. En este caso, se pueden administrar péptidos de la presente invención para reinstaurar la tolerancia a esta proteína propia y restringir la respuesta inmunitaria patógena.

La tolerancia puede deberse a o caracterizarse por la inducción de anergia en al menos una parte de los linfocitos T CD4+. Para activar un linfocito T, un péptido debe asociarse con una APC “profesional” que pueda suministrar dos señales a los linfocitos T. La primera señal (señal 1) en enviada por el complejo MHC-péptido de la superficie celular de la APC y es recibida por el linfocito T a través del TCR. La segunda señal (señal 2) es enviada por moléculas coestimulantes de la superficie de la APC, tales como CD80 y CD86, y es recibida por CD28 en la superficie del linfocito T. Se cree que cuando un linfocito T recibe la señal 1 en ausencia de la señal 2, no se activa y, de hecho, se vuelve anérgico. Los linfocitos T anérgicos no responden a una exposición antigénica posterior, y pueden suprimir otras respuestas inmunitarias. Se cree que los linfocitos T anérgicos participan en la mediación de la tolerancia de los linfocitos T.

Sin el deseo de quedar ligados a teoría alguna, los presentes inventores predicen que los péptidos que requieren procesamiento antes de poderse presentar junto con moléculas de MHC no inducen tolerancia, porque tienen que ser manejados por células presentadoras de antígeno maduras. Las células presentadoras de antígeno maduras (tales como macrófagos, linfocitos B y células dendríticas) pueden procesar antígenos, pero también enviar ambas señales 1 y 2 a un linfocito T, lo que conduce a la activación de los linfocitos T. Los epítopos, por otro lado, podrán unirse a MHC de clase II en APC inmaduras. Por lo tanto, se presentarán a linfocitos T sin coestimulación, lo que conduce a tolerancia y anergia de linfocitos T.

Como es evidente, los epítopos también pueden unirse a moléculas de MHC en la superficie celular de las APC maduras. Sin embargo, el sistema inmunitario contiene una mayor abundancia de APC inmaduras que maduras (se ha sugerido que menos del 10 % de las células dendríticas se activan, Summers et al. (2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295). Por lo tanto, la posición por defecto hacia un epítopo será de anergia/tolerancia, más que de activación.

La inducción de tolerancia a FVIII puede controlarse in vivo examinando una reducción en el nivel de:

(i): anticuerpos inhibidores de FVIII;

(ii): linfocitos T CD4+ específicos de FVIII;

(iii) linfocitos B que pueden secretar anticuerpos inhibidores de FVIII mediante técnicas conocidas en la materia.

Por lo tanto, la inducción de la tolerancia también puede controlarse mediante diversas técnicas, entre las que se incluyen:

(a) la inducción de anergia en los linfocitos T CD4+ (que puede detectarse mediante la posterior exposición a FVIII in vitro);

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(b) cambios en la población de linfocitos T CD4+, incluyendo:

(i): reducción de la proliferación;

(ii): regulación negativa en la producción de IL-2, IFN-γ e IL-4; e

(iii) aumento en la producción de IL-10.

Como se usa en el presente documento, el término “tolerogénico” significa que puede inducir tolerancia.

COMPOSICIÓN

La presente invención también se refiere a una composición, tal como una composición farmacéutica, que comprende uno o más péptidos de acuerdo con la invención.

La composición puede comprender una forma modificada del péptido DNIMVTFRNQASRPY y una forma modificada del péptido PRCLTRYYSSFVNME.

El péptido puede comprender una pluralidad de péptidos, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis péptidos.

La composición de la presente invención puede ser para uso profiláctico o terapéutico.

Cuando se administra para uso profiláctico, la composición puede reducir o prevenir la generación de una respuesta inmunitaria hacia FVIII. El nivel de respuesta inmunitaria es inferior al que se habría obtenido en el paciente si no se hubiera tratado con la composición. El término “reducir” indica que se observa una reducción parcial en la respuesta inmunitaria, tal como una reducción del 50 %, 70 %, 80 % o 90 % en la respuesta en comparación con la que se habría observado en el paciente si no se hubiera tratado con la composición (o en la respuesta observada en un paciente no tratado a lo largo del mismo periodo de tiempo). El término “prevenir” indica que no se observa una respuesta inmunitaria apreciable hacia FVIII.

Cuando se administra para un uso terapéutico, la composición puede suprimir una respuesta inmunitaria ya en curso hacia FVIII. El término “suprimir” indica una reducción en el nivel de una respuesta inmunitaria en curso, en comparación con el nivel previo al tratamiento con el péptido, o el nivel que se habría observado en el mismo momento si no se hubiera administrado el tratamiento.

El tratamiento con la composición de la presente invención puede producir una reducción en los niveles de cualquiera o de todos de los siguientes:

(i): anticuerpos inhibidores de FVIII;

(ii): linfocitos T CD4+ específicos de FVIII;

(iii) linfocitos B secretores de anticuerpos inhibidores de FVIII.

La detección de todos estos factores puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas en la materia, tales como ELISA, citometría de flujo, ensayo de coagulación cromogénico, etc.

Además, o como alternativa, el tratamiento con la composición de la presente invención puede producir anergia en los linfocitos T CD4+ específicos de FVIII. La anergia puede detectarse, por ejemplo, mediante la posterior exposición a FVIII in vitro.

Es importante tener en cuenta que no todas las respuestas inmunitarias frente a FVIII son patógenas. Pueden encontrarse anticuerpos anti-FVIII no inhibidores en pacientes con hemofilia sin inhibidores (Moreau et al., (2000) “Blood” 95:3435-41) y aproximadamente el 15 % de los donantes de sangre sanos (Algiman et al., (1992) 89:37959).

Pueden detectarse los inhibidores de FVIII mediante la modificación de Nijmegen del ensayo de Bethesda de coagulación, en el que se ensaya la capacidad del plasma del paciente para inactivar FVIII en plasma normal. Una unidad Bethesda se define como la cantidad de anticuerpo que neutraliza el 50 % de la actividad de FVIII en plasma, y los títulos de 0,6 UB o superiores sugieren la presencia de anticuerpo.

En general, los inhibidores se clasifican como de bajo título si el nivel es < 5 UB y de alto título si es ≥ 5 UB.

El nivel de anticuerpos inhibidores contra FVIII circulantes puede reducirse hasta el 90 %, 75 %, 50 %, 20 %, 10 %, 5 % del nivel de anticuerpos en comparación con el que se habría observado si el paciente no hubiera recibido tratamiento.

El nivel de anticuerpos inhibidores contra FVIII circulantes puede reducirse hasta 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5 UB.

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KITS

De manera conveniente, si la composición comprende una pluralidad de péptidos, pueden administrarse juntos, en forma de una composición mixta o cóctel. Sin embargo, puede haber circunstancias en las que sea preferible proporcionar los péptidos por separado en forma de un kit, para la administración simultánea, separada, secuencial

o combinada.

El kit también puede comprender medios de mezclado y/o administración (por ejemplo, un vaporizador para la administración intranasal; o una jeringuilla y aguja para la dosificación subcutánea/intradérmica). El kit también puede comprender instrucciones para su uso.

La composición farmacéutica o el kit de la invención se pueden usar para tratar y/o prevenir una enfermedad.

En particular, la composición/el kit se pueden usar para tratar y/o prevenir la formación de inhibidor anti-FVIII en pacientes con hemofilia A o hemofilia adquirida. La composición/el kit se pueden usar para tratar la hemofilia afectada por la presencia de anticuerpos FVIII neutralizantes.

HEMOFILIA A

La hemofilia A (hemofilia clásica) está provocada por la deficiencia del factor VIII.

La hemofilia A tiene una incidencia estimada de 1 de cada 10.000 varones, mientras que se estima que la hemofilia B se da en uno de cada 40.000 varones. Aproximadamente 1 mujer de cada 5.000 es portadora de la hemofilia A, y 1 de cada 20.000 es portadora de la hemofilia B.

La hemofilia normalmente se divide en tres clases: grave, moderada y leve, basándose en el nivel del factor de coagulación en la sangre. En la hemofilia grave, existe menos del 1 por ciento de factor de coagulación normal. El grado de gravedad tiende a ser constante de una generación a otra.

En contra de la creencia popular, los cortes y las heridas menores no suelen representar una amenaza para las personas hemofílicas. En cambio, el mayor peligro procede de hemorragia espontánea que puede producirse en las articulaciones y en los músculos. Hay mayor probabilidad de que se produzca durante los años de crecimiento rápido, normalmente entre las edades de los 5 y los 15 años.

La hemorragia espontánea repetida en las articulaciones puede producir artritis, y se debilitan los músculos adyacentes. La presión sobre los nervios producida por la acumulación de sangre puede generar dolor, entumecimiento e incapacidad temporal para mover la zona afectada.

La hemofilia A se suele diagnosticar con un análisis de sangre para determinar la eficacia de la coagulación y para examinar si los niveles de factores de coagulación son anómalos.

El desarrollo de factores de coagulación purificados en los años 70 del siglo pasado, aislados de sangre de donantes, mejoró significativamente las perspectivas a largo plazo para las personas hemofílicas. Las personas con hemofilia de leve a moderada pueden usar el tratamiento con FVIII según sus necesidades, mientras que las personas con hemofilia grave pueden requerir tratamiento regular, indefinido.

Previamente, los pacientes recibían concentrados de factor VIII combinados de miles de donaciones de plasma. Esto conduce a importantes problemas de contaminación con patógenos virales, en particular, con el virus de la inmunodeficiencia humana y los virus de la hepatitis. Las técnicas de purificación de anticuerpos monoclonales, la inactivación por calor y el tratamiento con detergentes virucidas han hecho que los concentrados derivados de plasma sean relativamente seguros.

La tecnología de ADN recombinante ha proporcionado ahora una serie de productos sintéticos, tales como Recombinate™ y Kogenate™. Kogenate se prepara usando células de riñón de hámster neonato que expresan el factor VIII humano. El factor resultante está altamente purificado, eliminando cualquier posibilidad de transmisión de virus desde el plasma.

El péptido o la composición de la presente invención se pueden administrar antes y/o durante la terapia de reemplazo de factor VIII.

La hemofilia A es una enfermedad diana ideal para la terapia génica, dado que i) está causada por mutaciones en un solo gen identificado; ii) un ligero aumento en los niveles de factor de coagulación in vivo puede convertir una hemofilia grave en una enfermedad más leve; e iii) las terapias de reemplazo actuales se consideran subóptimas. Además, existe un amplio intervalo de seguridad si existe una “superación” del nivel deseado de actividad de coagulación.

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Péptido n.º: Secuencia SEQ ID NO:

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Tabla 2 -Péptidos derivados de DNIMV

Péptido n.º: Secuencia SEQ ID NO:

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Se expandieron los clones que produjeron IL-2 específicamente cuando se incubaron con péptido y se exploraron de nuevo con FVIII (a 1 ug/ml).

A continuación, se usaron los clones que produjeron IL-2 en respuesta tanto a FVIII como al péptido para evaluar si los péptidos modificados de DNIMV y PRCLT son epítopos, es decir, si son capaces de unirse a una molécula de MHC y ser presentados a un linfocito T por parte de APC tanto fijas como recién preparadas.

Se incubaron 5 x 104 células de hibridoma con 5 x 104 células MGAR recién preparadas o fijas, y 10 ug/ml de péptido, 1 ug/ml de FVIII o medio durante 48 horas. A continuación, se analizaron los sobrenadantes para determinar la IL-2 usando ELISA. Los resultados se muestran para PRCLT en la Figura 3a y para DNIMV en la Figura 3b.

Todos los péptidos marcados fueron capaces de ser presentados por células presentadoras de antígeno fijas, lo que indica que son todos epítopos como los péptidos precursores PRCLT y DNIMV.

Ejemplo 4: Tolerancia de linfocitos T ex vivo

Para determinar si los epítopos modificados eran capaces de regular las respuestas de los linfocitos T a péptidos precursores, se trataron ratones transgénicos HLA-DR2 macho con 3 x 100 µg de péptido (péptidos SEC ID NO: 1, 2, 17 o 18) o PBS como control, y luego se inmunizaron con 100 µg de cada uno de los péptidos precursores (PRCLT y DNIMV) en adyuvante completo de Freund. Diez días más tarde, se extirparon los ganglios linfáticos drenantes y los bazos, y se estimularon in vitro con PRCLT o DNIMV. Los resultados se muestran en las Figuras 4 (PRCLT) y 5 (DNIMV). El tratamiento con péptidos modificados SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 reduce las respuestas de los linfocitos T a PRCLT, y el tratamiento con péptidos modificados SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18 reduce las respuestas de los linfocitos T a DNIMV. Así pues, los péptidos modificados son capaces de reducir una respuesta inmune de ratones inmunizados con el péptido precursor.

Ejemplo 5: Tolerancia de los linfocitos T ex vivo

Para determinar si el efecto de los epítopos modificados sobre la regulación de las respuestas de los linfocitos T a los péptidos precursores se extendía a las respuestas reguladoras hacia FVIII, se trataron ratones transgénicos HLA-DR2 hembras con 3 x 100 µg de péptido (péptidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 17) y luego se estimularon con 100 µg de cada uno de los péptidos precursores (PRCLT y DNIMV) en adyuvante completo de Freund. Diez días más tarde, se extirparon los ganglios linfáticos drenantes, y se estimularon in vitro bien con PRCLT, DNIMV o FVIII recombinante. Los resultados se muestran en la Figura 6. El péptido SEQ ID NO: 1 redujo significativamente (p < 0,01) la respuesta de los linfocitos T al péptido PRCLT. El péptido SEQ ID NO: 17 redujo significativamente (p < 0,02) la respuesta de los linfocitos T hacia DNIMV.

El péptido SEQ ID NO: 1 reguló las respuestas hacia PRCLT y el péptido SEQ ID NO: 17 reguló las respuestas hacia DNIMV. También hubo alguna reducción, que no fue significativa, en respuesta a FVIII con péptidos individuales. Para potenciar la eficacia de los péptidos frente a las respuestas inmunitarias de FVIII, se usó una combinación de DNIMV modificado y PRCLT modificado en experimentos adicionales.

Ejemplo 6: Prevención de generación de anticuerpos con un aumento a escala de la dosis de una combinación de péptidos modificados con PRCLT y DNIMV

Se trataron ratones transgénicos HLA-DR2 macho con la combinación del péptido SEQ ID NO: 1 y el péptido SEQ ID NO: 17 tras un protocolo de aumento a escala de la dosis. Se administraron seis inyecciones de la combinación a la siguiente dosis: 0,1; 1,0; 10 y 3 x 100 µg (para cada péptido de la combinación).

A continuación, se estimularon los animales semanalmente con 1 µg de FVIII humano recombinante y un tratamiento concurrente (3 días después de la inmunización con rFVIII) con una combinación de péptidos SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 17 (100 µg de cada uno) y la generación de anticuerpos anti-FVIII analizados de muestras de sangre tomadas después de 4 y 8 inmunizaciones con FVIII (día 28, Figura 7a; día 56, Figura 7b, respectivamente). Se titularon y se analizaron los sueros mediante ELISA directo. El título de anticuerpos para los ratones no inmunizados fue negativo en todos los casos, mientras que el anticuerpo anti-FVIII se consideró presente en el suero de los ratones tratados, donde la relación de unión (usando sueros negativos para calcular la relación) fue superior a 1,9. Los resultados se muestran en la Figura 7 a y b para el día 28 y el día 56 del experimento, respectivamente.

Además, se midieron los anticuerpos FVIII neutralizantes el día 56. Los anticuerpos FVIII neutralizantes se determinaron usando un método cromogénico. En resumen, se mezclaron las muestras con 1 UI/ml de FVIII y se inició la coagulación mediante la adición de FIX, FX, trombina, CaCl2 y fosfolípidos. Tras la incubación, se determinó la cantidad de FXa generada mediante la adición del sustrato cromogénico S-2760 y se midió la señal de DO. La señal de DO es proporcional a la actividad de FVIII en las muestras, y se compara con muestras que contienen una cantidad conocida de FVIII y sin anticuerpos neutralizantes. Se calculó el % de actividad restante de la muestra de ensayo en comparación con las muestras de referencia y se expresó en unidades de tipo Bethesda, y se muestra en

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Claims

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