ES2626674T3

ES2626674T3 - Péptido AP-9 para su uso en el tratamiento de daños cardíacos tras isquemia/reperfusión

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Publication number: ES2626674T3
Application number: ES11845312.5T
Authority: ES
Inventors: Carlos ZARAGOZA SÁNCHEZ; Mónica GÓMEZ PARRIZAS; Begoña LAVÍN PLAZA; Carlos TARÍN CEREZO
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-12-02
Filing date: 2011-12-01
Publication date: 2017-07-25
Anticipated expiration: 2031-12-01
Also published as: US20140148396A1; EP2668960B1; EP2668960A2; EP2668960A4; WO2012072850A3; WO2012072850A2; US9644019B2

Abstract

La presente invención se relaciona con el uso de un inhibidor de EMMPRIN para la prevención y/o tratamiento de daños cardiacos producidos tras un proceso de isquemia seguida de reperfusión. Los autores de la presente invención han observado que la expresión de EMMPRIN se encuentra elevada en sujetos sometidos a isquemia/reperfusión y han comprobado que un inhibidor de EMMPRIN es capaz de disminuir los daños cardiacos causados tras isquemia seguida de reperfusión, tanto in vitro como in vivo.

Description

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En el contexto de la presente divulgación, cuando se usa la expresión "reducción o tratamiento de los daños cardíacos" se refiere a una reducción de dichos daños en un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, o incluso un 50 % de reducción de los daños cardíacos provocados por isquemia/reperfusión. Como alternativa la disminución o reducción puede ser del 60%, 70% u 80%.

5 El inhibidor de EMMPRIN se administra a un sujeto, ya sea solo o en combinación con otros compuestos, y comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho inhibidor. Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de inhibidor de EMMPRIN, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de

10 dicho inhibidor y el efecto terapéutico a conseguir. Por tanto, la cantidad administrada y la duración del tratamiento son eficaces para minimizar el tamaño y/o la gravedad del daño cardíaco en el sujeto, medido, por ejemplo, como un aumento de la fracción de eyección en el corazón, menos muerte celular en el miocardio o una reducción del edema miocárdico asociado a la isquemia. La cantidad y la duración del tratamiento son determinadas por un experto en la materia. El inhibidor de EMMPRIN puede administrarse durante el proceso isquémico. Como alternativa, se puede

15 administrar después de que se haya producido la isquemia, pero antes de que se produzca la reperfusión o, como alternativa, tras la isquemia y durante la reperfusión, o tras la isquemia y tras la reperfusión.

Los inhibidores de EMMPRIN pueden administrarse por cualquier vía adecuada, incluyendo, pero sin limitación, por vía oral, por inhalación, por vía rectal, por vía subcutánea, por vía intradérmica, por vía intravenosa, por vía

20 intramuscular, por vía intrarterial, por vía intramedular, por vía intratecal, por vía intraventricular, por medio de angioplastia coronaria transluminal percutánea (con un globo o ATCP), por medio de una endoprótesis vascular, por vía transdérmica, por vía subcutánea, por vía intraperitoneal o por vía intranasal. Puede encontrarse una revisión de las distintas formas de dosificación en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993.

25 En una realización particular, la divulgación se refiere al uso de un inhibidor de EMMPRIN, en la que dicho inhibidor se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo anti-EMMPRIN, un ARNip, un modulador de la glucosilación, un péptido inhibidor, un inhibidor de la unión ciclofilina-EMMPRIN, una estatina, un activador de p53, un antagonista de PPAR-alfa, un oligonucleótido no codificante, una ribozima, un aptámero y un espiegélmero.

30 Otros agentes inhibidores de la expresión de EMMPRIN adecuados para su uso en la presente divulgación son, por ejemplo, la cinaropicrina (número de CAS 35730-78-0), que modula la producción de óxido nítrico, como se describió por Cho et al. (Biophysical Research Communications, 2004; 313:954-961), polinucleótidos con actividad señuelo, es decir, con capacidad para unirse de forma específica a un factor de transcripción importante para la expresión del

35 gen, de manera que la expresión del gen de interés, en este caso EMMPRIN, se inhiba, y moléculas orgánicas que se unan a EMMPRIN inhibiendo su actividad, etc.

En una realización particular, la divulgación contempla el uso de un inhibidor de EMMPRIN en combinación con una terapia dirigida al tratamiento de los daños provocados por la isquemia/reperfusión, que será determinada por un

40 experto en la materia. Son tratamientos que se pueden combinar con el uso del inhibidor de EMMPRIN, pero no se limitan a, la administración de sulfuro de hidrógeno (Elrod J.W et al. Circulation 2006; 114: 1172), la terapia trombolítica, la intervención coronaria percutánea, la revascularización quirúrgica, la administración de agentes antiagregantes plaquetarios, agentes anticoagulantes, etc. (Cannon RO. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2005; 2:88).

45 Anticuerpos anti-EMMPRIN

En el contexto de la presente divulgación por "anticuerpo anti-EMMPRIN" se entiende cualquier anticuerpo que sea capaz de unirse a EMMPRIN de forma específica provocando la inhibición de una o más funciones de EMMPRIN. Es también cualquier anticuerpo que sea capaz de unirse a EMMPRIN de forma específica y bloquear la

50 oligomerización de EMMPRIN o los sitios de unión de EMMPRIN con otras proteínas. Los anticuerpos anti-EMMPRIN se dirigen de forma específica contra epítopos de la proteína esenciales para desempeñar su función o contra la proteína completa. Los anticuerpos pueden prepararse usando cualquiera de los métodos conocidos para el experto en la materia. Por tanto, se preparan anticuerpos policlonales por medio de la inmunización de un animal con la proteína que se ha de inhibir. Se preparan anticuerpos monoclonales usando el método descrito por Kohler,

55 Milstein et al. (Nature, 1975, 256: 495). En el contexto de la presente invención los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos intactos que comprende una región variable de unión a antígeno y una región constante, "Fab", "F(ab´)2" y "Fab`", fragmentos Fv y scFv, anticuerpos biespecíficos y diacuerpos.

Puede usarse cualquier anticuerpo dirigido a la proteína EMMPRIN como inhibidor. En una realización particular, el

60 anticuerpo reconoce de forma específica el extremo N-terminal de EMMPRIN, que corresponde al dominio extracelular. En una realización aún más preferida, el anticuerpo anti-EMMPRIN se ha generado frente al extremo Nterminal de EMMPRIN. En una realización aún más preferida, el anticuerpo anti-EMMPRIN se ha generado usando el tercer dominio similar a Ig, como se describió por Hanna, S.M. et al. (BMC Biochemistry, 2003 4:17) formado, en el caso de CD147 humano, por la secuencia

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ARNip de la invención

Los ARN de interferencia pequeños o ARNip son agentes que son capaces de inhibir la expresión de un gen diana por medio de la interferencia del ARN. Un ARNip se puede sintetizar químicamente, se puede obtener por medio de

5 transcripción in vitro o se puede sintetizar in vivo en la célula diana. Normalmente, los ARNip consisten en un ARN bicatenario de entre 15 y 40 nucleótidos de longitud que puede contener una región saliente 3' y/o 5' de 1 a 6 nucleótidos. La longitud de la región saliente es independiente de la longitud total de la molécula de ARNip. Los ARNip actúan por medio de la degradación o el silenciamiento post-transcripcional del mensajero diana.

Los ARNip pueden ser los denominados ARNhc (ARN horquillado corto) caracterizados porque las cadenas antiparalelas que forman el ARNip están conectadas por una región bucle u horquilla. Estos ARNip están compuestos de una secuencia no codificante corta (de 19 a 25 nucleótidos), seguida de un bucle de entre 5 y 9 nucleótidos de longitud seguido de la cadena codificante. Los ARNhc pueden ser codificados por plásmidos o virus y estar controlados por promotores tales como el promotor U6 de la ARN polimerasa III.

15 Los ARNip de la divulgación son sustancialmente homólogos al ARNm de EMMPRIN o a la secuencia genómica que codifica dicha proteína. Por "sustancialmente homólogos" se entiende que tienen una secuencia que es suficientemente complementaria o similar al ARNm diana de forma que el ARNip sea capaz de provocar la degradación de éste por interferencia de ARN. Los ARNip adecuados para provocar dicha interferencia incluyen ARNip formados por ARN, así como ARNip que contienen distintas modificaciones químicas tales como:

 ARNip en los que los enlaces entre los nucleótidos son distintos de los que se encuentran en la naturaleza, tales como enlaces fosforotioato.  Conjugados de la cadena de ARN con un reactivo funcional, tal como un fluoróforo. 25  Modificaciones de los extremos de las cadenas de ARN, en particular el extremo 3' mediante la modificación con distintos grupos funcionales del hidroxilo en posición 2'.  Nucleótidos con azúcares modificados tales como restos O-alquilados en posición 2' tales como 2'-Ometilribosa-p-2'-O-fluorosibosa.  Nucleótidos con bases modificadas tales como bases halogenadas (por ejemplo 5-bromouracilo y 5yodouracilo), bases alquiladas (por ejemplo 7-metilguanosina).

Los ARNip y ARNsh se pueden obtener usando una serie de técnicas conocidas para el experto en la materia. Por ejemplo, el ARNip puede sintetizarse químicamente a partir de ribonucleósidos protegidos con forsforamiditas en un sintetizador de ADN/ARN convencional. Como alternativa, los ARNip pueden producirse de forma recombinante a

35 partir de vectores plasmídicos y virales en cuyo caso la región que codifica la cadena, o cadenas, que forman los ARNip se encuentran bajo el control operativo de promotores de ARN polimerasa III. En las células, la ARNasa Dicer procesa los ARNsh en ARNip funcionales.

La región de EMMPRIN que se usa como base para diseñar los ARNip no es limitante y puede contener una región de la secuencia codificante (entre el codón de iniciación y el codón de terminación) o, como alternativa, puede contener secuencias de la región no traducida 5' o 3', tiene preferentemente entre 25 y 50 nucleótidos de longitud y en cualquier posición en posición 3' con respecto al codón de iniciación. Una forma de diseñar un ARNip implica la identificación de los motivos AA(N19)TT, en los que N puede ser cualquier nucleótido en la secuencia de EMMPRIN y mediante la selección de aquellos que presenten un alto contenido en G/C. Si no se encuentra dicho motivo, es

45 posible identificar el motivo NA(N21), en el que N puede ser cualquier nucleótido.

Los ARNip específicos para EMMPRIN que se pueden usar incluyen cualquier ARNip dirigido de forma específica a la proteína EMMPRIN de la especie que se ha de inhibir. Los ejemplos de ARNip incluyen, pero no se limitan a, los ARNip sintetizados por medio del kit de construcción Silencer siRNA de Ambion Research Inc., tal como el ARNip de secuencia 5' AAGACCTTGGCTCCAAGATACCCTGTCTC 3'-AAGTATCTTGGAGCCAAGGTCCCTGTCTC (Kulandaivelu et al. J Biol Chem. 2008; 283(28):19489–19498), el ARNip de secuencia 5'-GUUCUUCGUGAGUUCCUCdTdT-3'-3' dTdTCAAGAAGCACUCAAGGAG 5' (Chen et al. Cancer Letters 278 (2009) 113–121), el ARNip de secuencia 5' GGUUCUUCGUGAGUUCCUCtt 3' – 3' GAGGAACUCACGAAGAACCtg 5' (Qian et al. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 2008, 27:50), ARNips de secuencia 5'

55 GUAGGACCGGCGAGGAAUA 3', 5' GACCUUGGCUCCAAGAUAC 3', 5' GUCGUCAGAACACAUCAAC 3', 5' GAUCACUGACUCUGAGGAC 3', 5' UGACAAAGGCAAGAACGUC 3', 5' GUUGGGUUUUCUCCAUUCA 3', descritos en la solicitud de patente WO06039343A, etc. La divulgación contempla el uso de otros ARNip tales como los siguientes, sintetizados por Qiagen:

(1): Codificante: r(GGG AAU GCU CCA AAC GAC A)dTdT. No codificante: r(UGU CGU UUG GAG CAU UCC C)dTdT.

(2) Codificante: r(GGA UCA AGG UCG GAA AGA A)dTdT. No codificante: r(UUU UUU CCG ACC UUG AUC C)dTdT.

(3) Codificante r(GAG CCU UAC CUU ACA GAA A)dTdT. No codificante: r(UUU CUG UAA GGU AAG GCU C)dTdT 65 (4) Codificante r(GCA GUG ACC CAG ACC GCA A)dTdT. No codificante: r(UUG CGG UCU GGG UCA CUG C)dTdT

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Si las nanopartículas se han de usar para el tratamiento de cualquier patología en la que se sobreexprese EMMPRIN, dichas nanopartículas comprenden, además de los elementos mencionados anteriormente, un compuesto de interés terapéutico que modula la actividad de EMMPRIN. Un experto en la materia entenderá que el agente o agentes para la detección de las nanopartículas no son necesarios en el caso de que las nanopartículas de

5 la invención se utilicen con fines terapéuticos, aunque se pueden usar. El compuesto de interés terapéutico que modula la actividad de EMMPRIN preferentemente se une a la cubierta exterior, aunque también puede incluirse en el núcleo central de la nanopartícula. Los ejemplos ilustrativos de compuestos de interés terapéutico comprendidos en la nanopartícula incluyen, pero no se limitan a, a un péptido inhibidor de EMMPRIN, tal como el péptido AP-9, un anticuerpo anti-EMMPRIN, un modulador de glucosilación, un activador de p53, un antagonista de PPAR-alfa, un ARNip, un ligando de ciclofilina, una estatina, un oligonucleótido no codificante específico para EMMPRIN, una ribozima específica para EMMPRIN, un aptámero y un espiegélmero específicos para EMMPRIN.

Las nanopartículas de la invención también se pueden utilizar para el diagnóstico de una patología en la que se sobreexprese EMMPRIN. Los ejemplos ilustrativos de dicha patología incluyen, pero no se limitan a, cualquier daño

15 cardíaco, daños cardíacos que surgen tras la isquemia seguida de reperfusión, infarto cardíaco, remodelación miocárdica ventricular adversa, varios tipos de cáncer (cáncer cervical, cáncer de próstata, etc.), córneas ulceradas, artritis reumatoide, etc.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben considerarse como limitantes del alcance de la misma.

Ejemplos

MATERIALES Y MÉTODOS

25 Reactivos

Los reactivos de cultivo celular eran de BD Biosciences (España), el suero fetal era de Bio Whittaker (Verviers, Bélgica), los medios de cultivo y los antibióticos eran de Sigma (San Luis, MO, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios conjugados eran de GE Health Care (España). El cóctel de inhibidores de proteasas era de Roche (España). El medio Optimem y la Lipofectamina eran de GIBCO-BRL (BD), el DETA-NO, el SNAP y el 1400W eran de Alexis (Alexis Biochemicals, EE.UU.). El Rp-8-Br-PET-cGMPs era de Biolog (Germany). Los anticuerpos anti-MMP-9 y anti-MMP-2 eran de BD Transduction Laboratories (BD Biosciences, España), mientras que el anticuerpo anti-EMMPRIN (EMMPRIN anti ratón de rata, clon OX114) y el anti-EMMPRIN control eran de Serotec.

35 Ratones

Los ratones nuligénicos para el gen iNOS y sus correspondientes controles de tipo silvestre se adquirieron a The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EE.UU.), no habiéndose detectado diferencias ni de tamaño ni de peso en los mismos. Todos los animales se estabularon en el animalario en habitaciones aisladas y sin contaminación microbiológica. La presente investigación se realizó de acuerdo con las directrices de cuidado y uso de animales de laboratorio, publicadas por los NIH estadounidenses (Publicación de los NIH estadounidenses N.º 85-23, revisada en 1996).

45 Células

La estirpe celular de cardiomiocitos HL1 fue donada por el Dr. Antonio Bernad y cultivada como se describió [Ruiz-Meana M et al. Cardiovascular research 2006; 71:715-724]. La estirpe de macrófagos murinos RAW 274 se cultivó como se describió [Tarin C et al. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 2009; 29:27-32].

Isquemia/reperfusión de la arteria coronaria

La isquemia se indujo por medio de la ligadura de la arteria coronaria de la forma que se detalla a continuación: se anestesiaron ratones de doce semanas de edad de forma intraperitoneal mediante el uso de ketamina/xilazina 55 (100 mg/kg/10 mg/kg, respectivamente), se intubaron con un tubo de acero de 1 mm y se ventilaron (2 ml, 80 pulsaciones/minuto). Después de este proceso, el tórax de los ratones se abrió entre las costillas segunda y tercera, manteniéndose abierto mediante la ayuda de un separador para ratones. Después se abrió el pericardio para posteriormente ligar temporalmente la arteria coronaria izquierda en una región cercana a su bifurcación, mediante el uso de un hilo de sutura de seda de 6-0, y por un periodo de 30 minutos. La evidencia de la oclusión coronaria se puso de manifiesto mediante la decoloración del ventrículo izquierdo tras la ligadura arterial. Después de 30 minutos, la ligadura se retira, el tórax se cierra y la piel se sutura. Adicionalmente, se incluyó un grupo de animales control (grupo quirúrgico de referencia) en los ensayos, en los que se realizó el mismo método con excepción de la oclusión de la arteria coronaria. Para inhibir iNOS in vivo, a los ratones de tipo silvestre para iNOS se les inyectaron en la vena de la cola 2 mg/kg/día del inhibidor farmacológico de iNOS, 1400W, 30 minutos antes de la isquemia y 24 65 horas tras la isquemia/reperfusión. Para la neutralización in vivo de EMMPRIN, se realizó una dosis respuesta de la administración de anticuerpo anti-EMMPRIN o IgG de control, administrados por inyección intravenosa. La dosis

eficaz de anti-EMMPRIN utilizada finalmente fue de 250 micromol/l/kg, siendo ésta la dosis a la que se observa una reducción de MMP-9 superior al 50 % en comparación con el control de IgG. Para evaluar el efecto de anti-EMMPRIN en el proceso isquémico/reperfusión, la administración intravenosa de los anticuerpos se realizó durante cuatro días antes del procedimiento quirúrgico, tiempo después del cual se evaluaron el tamaño del infarto, la

5 función cardíaca y la expresión de EMMPRIN y MMP-9.

Ensayo de nitritos

La concentración de nitritos en las muestras se determinó por medio de una modificación del ensayo de Griess como se describió anteriormente [Zaragoza C et al. J Clin Invest 1997; 100:1760-1767]. En resumen, se incubaron 50 µl de muestra y de patrones de nitritos a un volumen igual con el reactivo de Griess (sulfanilamida al 1 %, naftil etilen diamina al 0,1 % y H3PO4 al 2,5 %), durante 10 minutos a temperatura ambiente, tiempo tras el cual se evaluó la absorbancia de cada muestra a una longitud de onda de 540 nm en un lector de microplacas.

15 Ecocardiografía

Los corazones de los ratones se visualizaron por medio de ecocardiografía a lo largo del tiempo, usando un equipo de micro-ultrasonido de alta frecuencia (Vevo 770, Visual Sonics, Toronto, Canadá). Para ello, los animales se anestesiaron usando gas isofluorano (1,5 %), dando como resultado una frecuencia cardíaca de aproximadamente 300 latidos/minuto. Los ratones se depositaron en una mesa acoplada a un sistema de raíles, en la que adicionalmente se controla y regula la temperatura a la que se realiza el experimento. El pelo de los ratones se retiró para evitar imágenes artefactuales y para la toma de imágenes se aplicó gel de transmisión ecocardiográfica. Cada animal de experimentación se utilizó para la obtención de imágenes cardíacas del eje corto paraesternal en modo B a una frecuencia de 30 MHz, lo cual permitió obtener imágenes en modo M, para determinar de esta forma el

25 diámetro y el volumen del ventrículo izquierdo al final de la diástole, la fracción de eyección y la fracción de acortamiento cardíaco, como resultado del uso del software de análisis cardíaco suministrado en el equipo.

Histología e inmunohistoquímica

El corazón de los animales se incluyó en parafina para la posterior obtención de secciones de 4 micrómetros de grosor como se describió previamente [Tarin et al. citado anteriormente]. La morfología del corazón se visualizó mediante tinción con eosina-hematoxilina, mientras que la deposición de colágeno se controló mediante tinción de tricrómico de Masson. Para la detección inmunohistoquímica de EMMPRIN, MMP-9 y MMP-2, las muestras se incubaron con los correspondientes anticuerpos primarios y se visualizaron mediante microscopía confocal tras su

35 incubación con los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con reactivos fluorescentes como se describió previamente [Lopez-Rivera E et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102:3685-3690].

Zimografía en gelatina

Para evaluar la presencia de MMP en los lisados celulares, estos últimos se resolvieron en geles DTS-PAGE al 8,510 % en presencia de 1 mg/ml de gelatina. Los geles se incubaron en tampón de renaturalización durante 30 minutos (Triton X-100 al 2,5 %) y posteriormente se incubaron 16 horas en tampón de revelado (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 200 mM, CaCl2 10 mM, Brj35 al 0,02 %). Posteriormente, los geles se incubaron en presencia de azul de Coomassie durante 1 hora y la actividad gelatinolítica se detectó tras la incubación con solución de aclarado

45 (metanol:ácido acético:agua, 50:10:4).

Clonación de la región reguladora de EMPRIN murina

Para la clonación del promotor de EMMPRIN de ratón, se utilizó el cromosoma comercial BAC CH29-603O5 (que contiene parte del cromosoma 10 murino), de CHORI (Children's Hospital Oakland Research Institute), como molde en reacciones de PCR con los siguientes oligonucleótidos:

Directo-5´-CGGGGTACCAGCACTCCATCCAAAGGCAGA-3´ (SEQ ID NO: 3).

Inverso-5´-GGAAGATCTGTCGCCTCGTCCAGGAGC-3´ (SEQ ID NO: 4).

55 El fragmento de PCR resultante se clonó en el vector pGL3-Basic (Promega) en posición 5' al gen indicador luciferasa (denominado en lo sucesivo en el presente documento pEMMPRIN-WT).

Mutagénesis del promotor de EMMPRIN

Con el fin de realizar la mutación de los restos específicos del promotor, se usó pEMMPRIN como molde en reacciones de PCR para de esta forma crear deleciones seriadas del promotor como se detalla a continuación:

p1000 = pEMMPRIN-WT.

65 p500: plásmido que contiene las primeras 500 pb del promotor de EMMPRIN. p250: plásmido que contiene las primeras 250 pb del promotor de EMMPRIN.

p1000-500: plásmido que contiene las 500 pb distales del promotor de EMMPRIN. p1000-750: plásmido que contiene las 250 pb distales del promotor de EMMPRIN. p875-750: plásmido que contiene la región distal del promotor de EMMPRIN comprendida entre las bases 750 y 875 del mismo.

5 También se generó un mutante para el sitio de unión al factor de transcripción E2F, localizado en la posición -790 del promotor de EMMPRIN, por medio del uso del kit de mutagénesis dirigida de Stratagene, de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante, y utilizando los siguientes oligonucleótidos (con las mutaciones de sustitución indicadas en letra minúscula) en reacciones de PCR. Los oligonucleótidos utilizados para ello son los

10 siguientes:

Directo: 5´-GGGGTTAGAAGCCTtCtCtACAGTGCACGACCTTCAAA-3´ (SEQ ID NO: 5)

Inverso: 5´-TTTGAAGGTCGTGCACTGTaGaGaAGGCTTCTAACCCC-3 (SEQ ID NO: 6)

15 Transfección transitoria

Los experimentos de transfección de DNA transitoria se realizaron por medio del uso del reactivo Lipofectamina 2000 como se describió previamente por el fabricante. En las células transfectadas el contenido de luciferasa se midió como se describió previamente [Zaragoza C et al. Molecular pharmacology 2002; 62:927-935]. En resumen,

20 las células se transfectaron transitoriamente con 1 microgramo de DNA y 10 µl de Lipofectamina 2000 en medio de cultivo OptiMEM, durante 4 horas, tiempo tras el cual se lavaron e incubaron con medio de cultivo recién preparado (MEM/FCS al 10 %) durante 16 horas. Además, como control, las células se cotransfectaron con un plásmido que contenía el promotor constitutivamente activo del citomegalovirus fusionado con el gen R-Luciferasa (Renilla), utilizado como control. Por tanto, cada muestra se evaluó para determinar el contenido tanto de P-luciferasa

25 (luciérnaga) como de R-luciferasa. La P-luciferasa es un sustrato del producto del gen indicador fijado al promotor que se ha de evaluar y la R-luciferasa es un sustrato del producto génico del gen indicador del plásmido control cotransfectado. Los resultados se normalizaron para el contenido de R-Luciferasa.

Ensayo de estabilidad del RNAm

30 Para este ensayo se incubaron células en pocillos de 2 mm de diámetro y se incubaron en presencia de 10 µM de actinomicina D durante 16 horas, tiempo tras el cual, las células se trataron con dietilenetriamina-NO (DETA-NO) a distintos tiempos. El RNA de los distintos tiempos de experimentación se aisló y, tanto para EMMPRIN como para GAPDH (como control), se evaluaron sus ARNm mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real.

35 Análisis estadístico

Los datos se expresan como el valor medio ± la desviación típica de la muestra. Los ensayos de cultivos celulares se realizaron 3 veces, y cada una de las condiciones se evaluó por duplicado o triplicado. En el caso de la

40 experimentación animal, esto se realizó por triplicado y el número de animales/réplica se especificó en el texto. En el caso de comparaciones hechas con un control común, las comparaciones se hicieron por medio del análisis de la varianza seguido de la modificación Dunnett del ensayo de T-Student. El nivel de significación estadística se definió como p<0,05. Las barras de error representan ±DT.

45 EJEMPLO 1

El infarto de miocardio es mayor en ratones nuligénicos para iNOS.

La relevancia de iNOS en la cardioprotección se evidenció por medio de su detección en ensayos de

50 isquemia/reperfusión coronaria, por inmunotransferencia Western y por la medición de los niveles de NO en los corazones de los ratones de tipo silvestre (WT) (Figura 1A), junto con la observación de un descenso en el tamaño de los infartos (Figura 1B) y fracción de eyección (Figura 1C), cuando se compararon con los respectivos valores obtenidos en los animales nuligénicos para iNOS. Cabe destacar, no obstante, que no puede excluirse la contribución de eNOS en el fenómeno, debido a que otros investigadores también han sido capaces de encontrar

55 niveles de eNOS significativamente elevados como resultado del infarto (de Waard MC et al. J Mol Cell Cardiol. 2010; 48:1041-9 y Yin C et al. Circ Res 2009; 104:572-575), y los niveles de NO detectados en la presente investigación no excluyen la posible implicación de eNOS en este contexto. El resumen de los parámetros evaluados en estos ensayos se muestra en la Tabla 1.

WT Control WT IR iNOS Control iNOS IR

LVDS (mm): 3,07 ± 0,3 3,50 ± 0,6 3,06 ± 0,28 4,10 ± 0,12

LVDD (mm): 4,17 ± 0,40 4,66 ± 0,11 4,24 ± 0,29 5,56 ± 0,49

VS (ul): 37,24 ± 3,07 53,00 ± 6,91 34,43 ± 6,94 59,78 ± 3,82

VD (ul): 57,43 ± 2,08 68,63 ± 4,81 59,45 ± 10,42 88,60 ± 15,28*

WT Control WT IR iNOS Control iNOS IR

SV (ul): 20,19 ± 4,01 15,63 ± 6,47 25,02 ± 3,62 28,82 ± 6,39*

EF (%): 51,26 ± 3,70 42,49 ± 4,62 51,9 ± 4,15 30,53 ± 3,35*

FS (%): 25,55 ± 2,21 20,66 ± 4,81 26,30 ± 1,98 14,94 ± 2,51*

Latido cardíaco: 326 ± 11,77 339 ± 23,33 355 ± 8,98 343 ± 60,80

(bpm)

Peso (mg): 120 ± 6,59 132 ± 6,12 110 ± 9,09 165 ± 19,25

Tabla 1. Parámetros de ultrasonidos. LVDS: Diámetro del ventrículo izquierdo sistólico. LVDD: Diámetro del ventrículo izquierdo diastólico. VS: Volumen sistólico. DS: Volumen diastólico. SV: Diferencias de volumen sístole/diástole. EF: Fracción de eyección. FS: Fracción de acortamiento. *p<0,05 WT IR frente a iNOS IR.

5 EJEMPLO 2

La expresión de EMMPRIN se induce en ratones nuligénicos para iNOS

10 Las MMP están implicadas de forma significativa en la digestión de la matriz extracelular cardíaca durante el infarto de miocardio y su inductor, EMMPRIN, se ha visto implicado de forma similar en la inducción de MMP en células cardíacas [Schmidt R et al. Circulation 2006; 113:834-841]. Con el fin de evaluar la contribución de iNOS en este contexto, los autores de la presente investigación detectaron que en animales nuligénicos para iNOS los niveles de EMMPRIN están significativamente aumentados, y el infarto de miocardio tiende a aumentarlos adicionalmente con

15 respecto a los animales de fenotipo silvestre, proceso detectado por medio de inmunotransferencia Western. Tanto MMP-9 como MMP-2, dos de las MMP más representativas presentes durante el infarto y dianas de EMMPRIN, también se sobreexpresan en ratones nuligénicos para iNOS, detectado tanto por medio de inmunotransferencia Western (Figura 2A izquierda) como por medio de zimografía (Figura 2A derecha).

20 EJEMPLO 3

La inhibición de iNOS implica un aumento del daño cardíaco y la expresión de EMMPRIN en ratones de tipo silvestre para iNOS

25 Para adquirir más conocimiento acerca del efecto de iNOS sobre el corazón, los autores de la invención descubrieron que en ratones de tipo silvestre para iNOS, la administración del inhibidor farmacológico de iNOS 1400W, tiende a aumentar de forma significativa el tamaño del infarto (Figura 2C, cuadro), junto con el aumento de los niveles de EMMPRIN (Figura 2B paneles inferiores de la izquierda) y MMP-9 con respecto a los ratones de control (Figura 2B paneles inferiores de la derecha, WT 1400WC frente a WT 1400W), rescatando el mismo fenotipo

30 detectado en los animales nuligénicos para iNOS. Para evaluar en mayor grado este efecto del NO, en ratones nuligénicos para iNOS, se administró el donador de NO nitroprusiato sódico (20 microgramos/kg/día) por vía intravenosa, dos días antes de la isquemia/reperfusión (I/R NO), detectando una reducción significativa en los niveles de EMMPRIN en comparación con ratones control (I/R) (Figura 2D, izquierda). Adicionalmente, se detectó nitración por medio del uso de anti-3-Nitrotirosina en secciones aisladas de esos mismos animales, confirmando que

35 el NO aportado de forma exógena estaba presente en los corazones de los animales tratados durante el tiempo del experimento (Figura 2D, derecha). Todos estos resultados indican que la inhibición de EMMPRIN puede ser una vía de señalización utilizada por el NO en su efecto cardioprotector.

EJEMPLO 4

40 iNOS regula la transcripción de EMMPRIN en cardiomiocitos

Para investigar la capacidad del NO de regular EMMPRIN en los corazones murinos, se evaluó la expresión del ARNm de EMMPRIN en ratones de tipo silvestre y ratones nuligénicos para iNOS mediante RT-PCR cuantitativa, 45 detectando cómo la isquemia/reperfusión induce un incremento significativo del ARNm en los ratones nuligénicos para iNOS, en comparación con el de ratones de tipo silvestre (Figura 3A). De forma adicional, se pudo detectar cómo los niveles de ARNm se redujeron significativamente en cardiomiocitos en cultivo en presencia del donador de NO DETA-NO (Figura 3B), mientras que en la estirpe celular de macrófagos RAW, el NO no indujo ningún efecto significativo sobre la expresión génica de EMMPRIN (Figura 3C), indicando de este modo un papel para el NO en la 50 trascripción de EMMPRIN en cardiomiocitos. Para investigar adicionalmente el efecto de iNOS en la expresión de EMMPRIN, se realizó la inhibición de la síntesis de novo del RNA en la estirpe celular de cardiomiocitos mediante el uso de actinomicina D. En este contexto, se evaluaron los niveles del ARNm de EMMPRIN mediante RT-PCR cuantitativa a lo largo del tiempo, siendo capaces, de este modo, de detectar una reducción significativa en la estabilidad del ARNm por el NO (Figura 3D, izquierda). Por el contrario, al igual que sucede con la expresión del

55 ARNm, el NO no tuvo ningún efecto sobre la estabilidad en macrófagos (Figura 3D, derecha).

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Claims

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