ES2625861T3 - Citocromo p450 y su uso para la oxidación enzimática de terpenos - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos en un 85 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o 2 y que tiene una actividad de citocromo P450 caracterizado porque el polipéptido es capaz de oxidar al menos un compuesto de terpeno seleccionado entre monoterpenos y sesquiterpenos mono o policíclicos.

Description

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DESCRIPCION

Citocromo p450 y su uso para la oxidacion enzimatica de terpenos Campo de la Invencion

La presente invencion proporciona las secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos de un citocromo P450 capaz de oxidar moleculas de terpeno. Tambien proporciona un procedimiento de oxidacion de moleculas de terpeno que comprende poner en contacto el citocromo P450 de la invencion con la molecula del terpeno que se pretende oxidar. En particular, dicho procedimiento puede realizarse in vitro o in vivo para producir moleculas de terpeno oxidadas, que pueden utilizarse en campos tecnicos diferentes tales como por ejemplo la perfumena y la industria de los aromatizantes. La presente invencion tambien proporciona un vector de expresion que contiene el acido nucleico. Tambien es un objeto de la invencion un organismo hospedador no humano o una celula transformada con el acido nucleico.

Antecedentes de la invencion

Los terpenos se encuentran en la mayona de los organismos (microorganismos, animales y plantas). Estos compuestos estan compuestos de cinco unidades de carbono llamadas unidades de isopreno y se clasifican por el numero de estas unidades presente en su estructura. De este modo, los monoterpenos, los sesquiterpenos y los diterpenos, son terpenos que contienen 10, 15 y 20 atomos de carbono respectivamente. Los diterpenos, por ejemplo, se encuentran ampliamente en el reino vegetal y se han descrito mas de 2500 estructuras de diterpeno (Connolly y Hill, Dictionary of terpenoids, 1991, Chapman & Hall, London). Las moleculas de terpeno y sus derivados oxidados han sido de interes durante miles de anos debido a sus propiedades de fragancia y sabor y a sus efectos cosmeticos, medicinales y antimicrobianos. Los extractos vegetales obtenidos por diferentes medios tales como la destilacion en fase vapor o la extraccion con disolventes se utilizan como una fuente de derivados oxidados de moleculas de terpeno. Como alternativa, las moleculas de terpeno que se encuentran en los extractos vegetales u obtenidas por procedimientos biosinteticos se oxidan utilizando procedimientos qmmicos y enzimaticos.

La oxidacion enzimatica de los terpenos involucra frecuentemente las enzimas llamadas citocromos P450 (P450), que normalmente son capaces de catalizar la transformacion de un sustrato hidrofobo, tal como una molecula de terpeno, en uno mas hidrofilo. Las enzimas del Citocromo P450 forman una superfamilia de hemoprotemas que se encuentran en las bacterias, las arqueas y los eucariotas. En una de las actividades mas comunes, el citocromo P450 actua como una monooxigenasa, por la insercion de un atomo de oxfgeno del oxfgeno molecular en una molecula del sustrato, mientras que el otro atomo de oxfgeno se reduce a agua.

Esta reaccion catalttica requiere dos electrones para la activacion del oxfgeno molecular. Los P450 de los eucariotas utilizan el NADPH como reductor externo y fuente de electrones. Los dos electrones se transfieren uno a la vez al sitio activo del citocromo P450 y esta transferencia requiere una protema donadora de electrones, una citocromo P450 reductasa (CPR). Una CPR no es espedfica para un citocromo P450. Una CPR es la protema donadora de electrones para varios P450 en un organismo dado. Ademas, una CPR de un organismo puede actuar como la protema donadora de electrones para los P450 de otros organismos. En algunos casos los P450 tambien pueden acoplarse a una protema del citocromo b5 que puede actuar como la protema donadora de electrones o puede mejorar la eficiencia de la transferencia de electrones desde la CPR al P450. En las celulas eucarioticas y particularmente en las plantas, los P450 y las CPR son generalmente protemas unidas a la membrana y estan asociadas al retmulo endoplasmatico. Estas protemas se fijan a la membrana por una helice transmembrana N- terminal.

Muchos P450 tienen una especificidad baja de sustrato y por tanto son capaces de catalizar la oxidacion de muchas estructuras diversas tales como por ejemplo diferentes moleculas de terpeno. La mayona de estas enzimas tienen una regio y estereoselectividad particular con un sustrato dado pero con frecuencia producen una mezcla de diversos productos de un sustrato particular. Dichos P450 estan implicados por lo general en el desdoblamiento y la destoxificacion de las moleculas tales como los xenobioticos y generalmente se encuentran en las bacterias y los animales. Por otra parte, los P450 implicados en las rutas biosinteticas muestran por lo general una especificidad hacia ciertos tipos de sustratos y regio y estereoselectividad. Este es el caso para la mayona de los P450 de plantas.

Puede encontrarse un gran numero de P450 en la naturaleza y en particular en las plantas. Un genoma de una planta puede contener varios cientos de genes que codifican los P450. Muchos P450 de las plantas se han caracterizado pero considerando el numero extremadamente grande de P450 presente en las plantas, la mayona de sus funciones permanecen desconocidas.

Por tanto, es deseable buscar nuevos P450 capaces de catalizar nuevas reacciones enzimaticas, para proporcionar una produccion enzimatica de nuevos compuestos oxigenados o para producir compuestos oxigenados a traves de diferentes tipos de reacciones, por ejemplo de diferentes sustratos, que pueden ser mas facilmente accesibles.

Ya se han caracterizado varios P450. En particular, se han notificado citocromos P450 que tienen un cierto porcentaje de identidad de secuencia con el citocromo P450 de la presente invencion que utilizan moleculas de terpeno como sustratos.

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Los P450 mas cercanos a los de la presente invencion son los P450 del sorgo bicolor, entre los cuales la secuencia mas cercana comparte el 67 % de identidad con las secuencias de aminoacidos que se describen en el presente documento (Numero de Referencia EER94164).

Entre los terpenos oxigenados producidos por el citocromo P450 de la presente invencion, algunos son muy utiles en el campo de la perfumena y de los aromatizantes. En particular el kusimol, que es producido por la hidroxilacion del zizaeno, es uno de los componentes claves del aceite de vetiver y por sf mismo es un ingrediente perfumante valioso. La oxidacion del zizaeno utilizando el citocromo P450 de la presente invencion proporciona una alternativa ventajosa al aislamiento del kusinol del aceite de vetiver, que es un procedimiento diffcil y costoso. Hasta donde se tiene conocimiento, no se conoce ningun procedimiento enzimatico para la produccion de kusimol. Varios otros ingredientes perfumantes y aromatizantes, para los que no se conoce ninguna smtesis enzimatica hasta la fecha, pueden prepararse utilizando el citocromo p450 de la presente invencion como se describira a continuacion.

Otros terpenos oxigenados producidos por el citocromo P450 de la presente invencion son utiles para otros fines tales como farmacos o productos agroqmmicos. El citocromo P450 de la presente invencion, por tanto, abre una nueva via biosintetica para diversas moleculas que tienen propiedades interesantes utiles en varios campos de la industria y que son difmiles o incluso imposibles de aislar de la naturaleza y difmiles o imposibles de producir por smtesis organica.

Es un objetivo de la presente invencion proporcionar procedimientos para fabricar terpenos oxigenados, en particular kusimol, de una manera economica. En consecuencia, la presente invencion tiene el objetivo de producir terpenos oxidados que al mismo tiempo tengan pocos desechos, un procedimiento mas eficiente en cuanto a recursos y energfa que al mismo tiempo reduzca la dependencia de los combustibles fosiles. Es un objetivo adicional proporcionar enzimas capaces de oxidar moleculas de terpeno, siendo utiles dichos productos oxidados como ingredientes de perfumena y/o aromaticos.

Abreviaturas utilizadas

pb pares de bases

DMAPP difosfato de dimetilalilo

ADN acido desoxirribonucleico

ADNc ADN complementario

CPR citocromo P450-reductasa

dNTP desoxi nucleotido trifosfato

DTT ditiotreitol

EDTA acido etilendiamintetraacetico

FAD dinucleotido de flavina adenosina

FMN mononucleotido de flavina

FPP pirofosfato de farnesilo

CG cromatograffa de gases

IPP difosfato de isopentenilo

IPTG isopropil-D-tiogalacto-piranosido

LB caldo para lisogenia

EM espectrometro de masa

mvaKI mevalonato cinasa

MvaK2 mevalonato difosfato cinasa

NADP fosfato de dinucleotido de nicotinamida adenina

NADPH fosfato de dinucleotido de nicotinamida adenina, forma reducida

P450 citocromo P450

PCR reaccion en cadena de la polimerasa

3'-/5'-RACE amplificacion rapida 3' y 5' de extremos del ADNc

RMCE intercambio del casete mediado por recombinasa

RT-PCR transcripcion inversa - reaccion en cadena de la polimerasa

ARN acido ribonucleico

ARNm acido ribonucleico mensajero

RBS sitio de union al ribosoma.

Descripcion de la invencion

La presente invencion proporciona un procedimiento para oxidar enzimaticamente terpenos de una manera economica, confiable y reproducible.

Como se pretende en la presente solicitud, todos los compuestos citados en la presente solicitud se definen por medio de su formula como se representa en la figura 1.

Un "citocromo P450" o un "polipeptido que tiene una actividad de citocromo P450" se pretende para el fin de la presente solicitud como un polipeptido capaz de catalizar la oxidacion de una molecula de terpeno para formar un

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compuesto oxigenado tal como un alcohol, un aldehudo, una cetona o un acido carboxflico. De acuerdo con una realizacion preferida, el citocromo P450 actua como una mono-oxigenasa por la adicion solamente de un atomo de ox^geno a un compuesto de terpeno. La capacidad de un polipeptido para catalizar la oxidacion de un terpeno particular puede confirmarse simplemente mediante la realizacion del ensayo enzimatico como se detalla en el Ejemplo 8.

De acuerdo con la presente invencion, los "polipeptidos" tambien pretenden incluir polipeptidos truncados a condicion de que los mismos mantengan su actividad citocromo p450 como se define en cualquiera de las realizaciones de la invencion y que compartan al menos el porcentaje de identidad definido con el fragmento correspondiente de la SEQ. ID NO: 1 o 2.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias peptfdicas o nucleotidicas es una funcion del numero de restos de aminoacidos o de acidos nucleicos que son identicos en las dos secuencias cuando se ha generado una alineacion de estas dos secuencias. Los restos identicos se definen como restos que son iguales en las dos secuencias en una posicion dada de la alineacion. El porcentaje de identidad de secuencia, como se utiliza en el presente documento, se calcula a partir de la alineacion optica tomando el numero de restos identicos entre dos secuencias dividiendolo entre el numero total de restos en la secuencia mas corta y multiplicando por 100. La alineacion optima es la alineacion en la que el porcentaje de identidad es el mas elevado posible. Pueden introducirse huecos en una o ambas secuencias en una o mas posiciones de la alineacion para obtener la alineacion optima. Estos huecos entonces se tienen en cuenta como restos no identicos para el calculo del porcentaje de identidad de secuencia.

La alineacion con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoacidos o de acidos nucleicos puede conseguirse de varias maneras utilizando programas de ordenador y, por ejemplo, programas de ordenador disponibles publicamente en Internet. Preferentemente, puede utilizarse el programa BLAST (Tatiana y col., FEMS Microbiol Lett., 1999, 174:247-250, 1999) ajustado a los parametros por defecto, disponible del National Center por Biotechnology Information (NCBI) en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/b12seq/wblast2.cgi, para obtener una alineacion optima de las secuencias peptfdicas o nucleotidicas y para calcular el porcentaje de identidad de secuencia.

Un objeto de la presente invencion es un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos identica en al menos el 85% a la SEQ. ID NO: 1 o 2 y que tiene una actividad de citocromo P450, caracterizado porque el polipeptido capaz de catalizar la oxidacion de al menos un compuesto de terpeno seleccionado entre monoterpenos y sesquiterpenos mono o polidclicos.

En una realizacion preferida, dicho sesquiterpeno o monoterpeno comprende al menos un grupo de metilo como sustituyente sobre un resto dclico. De acuerdo con una realizacion mas preferida, el citocromo p450 de la invencion oxida dicho sustituyente de metilo para proporcionar un alcohol primario.

De acuerdo con una realizacion preferida, el compuesto de terpeno se selecciona entre el grupo que consiste en zizaeno, alfa-cedreno, alfa-longipineno, alfa-funebreno, tujopseno, valenceno, beta-chamigreno, aloaromadendreno, alfa-neocloveneno, isosativeno, ledeno, s-limoneno, alfa-humuleno, alfa-gurjuneno, alfa-pineno, beta-funebreno, R- limoneno y beta-pineno. Mas preferentemente, dicho compuesto de terpeno se selecciona entre zizaeno, alfa- cedreno, alfa-funebreno, valenceno y tujopseno. Mucho mas preferentemente, dicho compuesto de terpeno es zizaeno.

En una realizacion preferida, un atomo de oxfgeno se anade al grupo metilo para proporcionar un alcohol primario, un aldehudo y/o un acido carboxflico. En una realizacion mucho mas preferida, el zizaeno se oxida al kusimol, zizanal y/o acido zizanoico.

En el caso en el que se forma un aldehudo y/o un acido carboxflico, dicho aldehudo y/o un acido carboxflico se forma por oxidacion adicional del alcohol primario ya sea por el P450 de la invencion por una o mas enzimas de otras familias tales como por ejemplo las alcohol deshidrogenasas, las aldehudo reductasas, las aldehudo oxidasas. Estas ultimas enzimas estan presentes por ejemplo en cualquier organismo hospedador o celula en los que se pueda expresar el polipeptido de la invencion.

De acuerdo con una realizacion preferida, el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos al menos el 89%, preferentemente al menos el 90%, mas preferentemente al menos el 95% e incluso mas preferentemente al menos el 98% identica a la SEQ. ID NO: 1 o 2. De acuerdo con una realizacion mas preferida, el polipeptido comprende la SEQ. ID NO: 1 y 2. Incluso mas preferentemente comprende la SEQ. ID NO: 1 y 2.

En una realizacion preferida de la invencion la secuencia tambien comprende una secuencia de fijacion a la membrana. La secuencia representada por la SEQ. ID NO: 1 o 2, o el derivado de la misma que tenga el porcentaje requerido de identidad, es la parte del polipeptido que proporciona la actividad de P450. La secuencia de fijacion a la membrana no esta implicada en la actividad catalttica de la enzima. La secuencia de fijacion permite la union a la membrana. Las secuencias de fijacion adecuadas dependen del organismo en el que el polipeptido se expresa y las secuencias disenadas para tipos conocidos de organismos hospedadores son conocidas para los expertos en la materia. Cualquier secuencia de fijacion adecuada puede utilizarse en combinacion con el polipeptido de la presente invencion. Por tanto, de acuerdo con una realizacion preferida, el polipeptido comprende la SEQ. ID NO: 1 o 2,

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combinada con una secuencia de fijacion a la membrana.

Mas preferentemente, el polipeptido de la invencion consiste en la SEQ. ID NO: 1 o 2, opcionalmente combinada con una secuencia de fijacion a la membrana.

Cuando el polipeptido no se combina con una secuencia de fijacion, dicho polipeptido no se unira a la membrana de la celula. En este caso, el polipeptido de la SEQ. ID NO: 1 o 2 puede modificarse preferentemente con el fin de mejorar su solubilidad en el citoplasma.

De acuerdo con otra realizacion preferida, el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos que es una variante de la SEQ. ID NO: 1 o 2 obtenida por ingeniena genetica. En otros terminos, dicho polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de nucleotidos que se ha obtenido mediante la modificacion de la SEQ. ID NO: 3, 4 o el complemento de las mismas. De acuerdo con una realizacion mas preferida, el polipeptido que tiene una actividad de citocromo P450 consiste en una secuencia de aminoacidos que es una variante de la SEQ. ID NO: 1 o 2 obtenida por ingeniena genetica, es decir una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de nucleotidos que se ha obtenido por la modificacion de una cualquiera de las SEQ. ID NO: 3, 4 o el complemento de las mismas.

Los polipeptidos codificados por un acido nucleico obtenido por mutacion natural o artificial de un acido nucleico de la invencion, como se describe a continuacion, tambien estan abarcadas por la invencion.

Las variantes del polipeptido que son resultado de una fusion de las secuencias de peptidos adicionales en los extremos amino y carboxilo terminales tambien estan abarcadas por los polipeptidos de la invencion. En particular, una fusion de este tipo puede mejorar la expresion de los polipeptidos, puede ser util en la purificacion de la protema, puede mejorar la manera en la que el polipeptido puede fijarse a una membrana o puede mejorar la actividad enzimatica del polipeptido en un entorno o sistema de expresion deseado. Dichas secuencias peptfdicas adicionales pueden ser un peptido senal, por ejemplo. En consecuencia, la presente invencion abarca las variantes de los polipeptidos de la invencion, tales como las obtenidas por la fusion con otros oligo o polipeptidos y/o las que se unen a peptidos senal. Los polipeptidos que son resultado de una fusion con otra protema funcional, tal como una protema de la via de la biosmtesis del terpeno, preferentemente una terpeno sintasa, tambien estan abarcados por los polipeptidos de la invencion. Un ejemplo preferido en particular del polipeptido de la invencion es una variante que es resultado de la fusion con una secuencia peptfdica que es un polipeptido de fusion que comprende tanto un polipeptido de la invencion (que tiene una actividad de citocromo P450) como un CPR.

De acuerdo con otra realizacion, el polipeptido se afsla de Vetiveria zizanioides (L.) Nash.

Tambien es un objeto de la presente invencion un acido nucleico que codifica un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.

De acuerdo con una realizacion preferida, el acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos al menos el 70 %, preferentemente al menos el 75 %, preferentemente al menos el 80 %, preferentemente al menos el 85 %, preferentemente al menos el 90 %, preferentemente al menos el 93 %, mas preferentemente al menos el 95 % e incluso mas preferentemente al menos el 98 %, identica a la SEQ. ID NO: 3, 4 o al complemento de las mismas. De acuerdo con una realizacion mas preferida, el acido nucleico comprende la SEQ. ID NO: 3, 4 o el complemento de las mismas. De acuerdo con una realizacion incluso mas preferida, el acido nucleico consiste en la SEQ. ID NO: 3, 4 o el complemento de las mismas, opcionalmente junto con una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de fijacion a la membrana.

De acuerdo con otra realizacion, el acido nucleico se afsla de Vetiveria zizanioides (L.) Nash.

El acido nucleico de la invencion puede definirse como que incluye polfmeros de desoxirribonucleotido o de ribonucleotido en la forma ya sea de una sola cadena o de doble cadena (ADN y/o ARN). Tambien se ha de entender que la expresion "secuencia de nucleotidos" comprende una molecula de polinucleotido o una molecula de oligonucleotido en la forma de un fragmento separado o como un componente de un acido nucleico mas grande. Los acidos nucleicos de la invencion tambien abarcan ciertas secuencias de nucleotidos aisladas incluyendo las que estan substancialmente libres del material endogeno contaminante. El acido nucleico de la invencion puede estar truncado, a condicion de que el mismo codifique un polipeptido abarcado por la presente invencion, como se ha descrito anteriormente.

De acuerdo con una realizacion mas preferida, al menos un acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de nucleotidos que se ha obtenido modificando la sEq. ID NO: 3, 4 o el complemento de las mismas. Preferentemente, el acido nucleico consiste en una secuencia de nucleotidos que se ha obtenido modificando la SEQ. ID NO: 3, 4 o el complemento de las mismas.

Los acidos nucleicos que comprenden una secuencia obtenida por la mutacion de la SEQ. ID NO: 3, 4 o el complemento de las mismas, estan abarcados por la invencion, a condicion de que las secuencias que ellos comprenden compartan al menos el porcentaje definido de identidad con los fragmentos correspondientes de la SEQ. ID NO: 3, 4 o el complemento de las mismas y a condicion de que los mismos codifiquen un polipeptido que

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tenga una actividad de citocromo P450, como se ha definido en cualquiera de las realizaciones anteriores. Las mutaciones pueden ser cualquier clase de mutaciones de estos acidos nucleicos, tales como mutaciones puntuales, mutaciones de delecion, mutaciones de insercion y/o mutaciones del marco de lectura. Puede prepararse una variante de acido nucleico para adaptar su secuencia de nucleotidos a un sistema de expresion espedfico. Por ejemplo, se sabe que los sistemas de expresion bacterianos expresan mas eficientemente los polipeptidos si los aminoacidos son codificados por un codon preferido. Debido a la degeneracion del codigo genetico, en el que mas de un codon puede codificar el mismo aminoacido, las secuencias de ADN multiples pueden codificar el mismo polipeptido, estando abarcada la totalidad de estas secuencias de aminoacidos por la invencion.

La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para oxidar al menos un compuesto de terpeno que comprende

a) poner en contacto dicho compuesto de terpeno con al menos un polipeptido de la invencion en presencia de una citocromo P450 reductasa (CPR);

b) opcionalmente, aislar el terpeno oxidado producido en la etapa a).

El compuesto de terpeno oxidado por el polipeptido de la invencion y el propio polipeptido de la invencion son como se han definido en cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.

El procedimiento puede realizarse in vitro asf como in vivo, como sera explicara detalladamente mas adelante.

Cuando el procedimiento se realiza in vitro, el polipeptido de la invencion que se va a poner en contacto con el compuesto de terpeno y el CPR puede obtenerse por extraccion a partir de cualquier organismo que lo exprese, utilizando tecnologfas convencionales de extraccion de protemas o enzimas. Si el organismo hospedador es un organismo unicelular o celula que libera el polipeptido de la invencion en el medio de cultivo, por ejemplo cuando ninguna fijacion a la membrana esta presente, el polipeptido simplemente puede recolectarse del medio de cultivo, por ejemplo por centrifugacion, seguida opcionalmente de las etapas de lavado y la resuspension en soluciones tampon adecuadas. Si el organismo o celula acumula el polipeptido dentro de sus celulas, el polipeptido puede obtenerse por ruptura o lisis de las celulas y la extraccion adicional del polipeptido del lisado celular. Cuando los P450 y las CPR comprenden una secuencia de fijacion a la membrana, tales como los P450 y las CPR naturales en las plantas, los mismos se asocian a las membranas y por tanto estan localizados en la fraccion de la membrana de los lisados celulares. La fraccion de la membrana (microsomas) puede separarse facilmente de las otras fracciones de la protema por centrifugaciones diferenciales del lisado celular en bruto utilizando los procedimientos conocidos.

Para el procedimiento in vitro, el polipeptido de la invencion y la CPR pueden proporcionarse independientemente en forma aislada o como parte de un extracto de protema y se suspende en una solucion tampon a un pH optimo. Si es adecuado, pueden anadirse sales, DTT, NADPh, NADH, FAD, FMN, y otras clases de cofactores enzimaticos, para optimizar la actividad de la enzima. Las condiciones apropiadas se describen en mas detalle en los Ejemplos mas adelante.

El compuesto de terpeno se anade despues a la suspension o solucion, que despues se incuba a la temperatura optima, por ejemplo entre 15 y 40 °C, preferentemente a entre 25 y 35 °C, mas preferentemente a 30 °C. Despues de la incubacion, el terpeno oxidado producido puede ser aislado de la solucion incubada por procedimientos de aislamiento convencionales, tales como la extraccion con disolventes y destilacion, opcionalmente despues de la retirada de los polipeptido de la solucion.

La CPR debe estar presente mientras que el P450 y el compuesto de terpeno estan en contacto.

De acuerdo con otra realizacion preferida, el procedimiento para oxidar los compuestos de terpeno se realiza in vivo. En este caso, la etapa a) del procedimiento descrito anteriormente comprende cultivar un organismo hospedador no humano o celula transformada para expresar al menos un polipeptido de la invencion en presencia de un compuesto de terpeno que se va a oxidar en condiciones conductoras para la oxidacion del compuesto de terpeno, expresando dicho organismo o celula adicionalmente una CPR.

El compuesto de terpeno y el polipeptido son como se definen en cualquier realizacion de la presente invencion.

En una realizacion de dicho procedimiento, el compuesto de terpeno que se va a oxidar es producido por el organismo o la celula hospedadores que expresan el polipeptido de la invencion. En este caso, el compuesto de terpeno es producido en el organismo o la celula hospedadores por una terpeno sintasa capaz de catalizar la formacion del compuesto de terpeno a partir de un precursor de terpeno adclico. La terpeno sintasa puede ser producida ya sea naturalmente por el organismo o la celula hospedadores, o cuando el organismo o la celula hospedadores no expresan la terpeno sintasa naturalmente, el mismo puede ser transformado para hacerlo.

En una realizacion alternativa, en el caso en el que se utiliza una celula hospedadora o cuando el organismo hospedador es un microorganismo, el compuesto de terpeno que se va a oxidar puede anadirse al medio de cultivo de la celula o microorganismo. El compuesto de terpeno penetrara a traves de la membrana de la celula o microorganismo, estando disponible de este modo para la reaccion con el polipeptido de la invencion expresado por el microorganismo o celula hospedadora.

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De acuerdo con una realizacion mas preferida, el procedimiento comprende adicionalmente, antes de la etapa a), transformar un organismo o una celula no humanos con al menos un acido nucleico de la invencion, de manera que el organismo o celula exprese al menos un polipeptido de la invencion. El polipeptido y el acido nucleico son como se han definido en cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.

Realizar el procedimiento in vivo es en particular ventajoso puesto que es posible realizar el procedimiento sin aislar previamente el polipeptido. La reaccion se produce directamente dentro del organismo o celula transformada para expresar el polipeptido.

Para la actividad catalftica, los P450 deben utilizarse en combinacion con una P450-reductasa (CPR) que es capaz de transferir electrones desde la NADPH (Fosfato del dinucleotido de nicotinamida adenina, forma reducida) al sitio activo del P450, para reconstituir la actividad de P450. La CPR debe estar presente para realizar el procedimiento tanto in vitro como in vivo. Cuando el procedimiento se realiza in vivo, la CPR puede estar presente ya sea naturalmente en el organismo o la celula hospedadores, o dicho organismo o celula pueden transformarse para expresar una CPR antes, simultaneamente o despues de la transformacion para expresar el polipeptido de la invencion. En una realizacion preferida de la invencion, el organismo o la celula hospedadores se transforman con un polipeptido de fusion que comprende tanto el polipeptido de la invencion como la CPR.

En otra realizacion preferida, la CPR es una CPR vegetal. Mas preferentemente la misma deriva de una CPR de Arabidopsis thaliana.

El organismo o la celula no humanos puede transformarse ventajosamente de manera adicional con al menos un gen que codifica un polipeptido implicado en el metabolismo de produccion de los precursores de terpeno acnlico tales como el pirofosfato de geranilo, el pirofosfato de farnesilo o el pirofosfato de geranilogeranilo. Dichos polipeptidos incluyen por ejemplo las enzimas de la via de MEP, de la via de MVA y/o de las prenilos transferasas.

La transformacion de un organismo o una celula no humanos con un polipeptido que tiene una actividad de citocromo P450 y con una CPR, o con un polipeptido de fusion que comprende los dos, en presencia de un compuesto de terpeno que se va a oxidar, como se ha descrito en cualquiera de las realizaciones de la invencion, es suficiente para que la oxidacion del terpeno se realice. Sin embargo, la transformacion adicional con al menos una enzima implicada en la produccion de un precursor de terpeno adclico y/o del difosfato de isopentenilo (IPP) o difosfato de dimetilalilo (DMAPP), tiene la ventaja de incrementar la cantidad de compuesto de terpeno disponible para que se oxide.

El organismo o celula tiene por objeto "expresar" un polipeptido, a condicion de que el organismo o celula se transforme para alojar un acido nucleico que codifica el polipeptido, este acido nucleico se transcribe en ARNm y el polipeptido se encuentra en el organismo ola celula hospedadores. El termino "expresa" abarca "expresa heterologamente" y "sobreexpresa", este ultimo que hace referencia a los niveles de ARNm, a la actividad del polipeptido y/o la enzima por encima y por debajo de lo que se mide en un organismo o celula no transformada. Una descripcion mas detallada de procedimientos adecuados para transformar un organismo o una celula hospedadores no humanos se describe a continuacion en la parte de la especificacion dedicada a dichas celulas u organismos hospedadores no humanos transformados como los objetos espedficos de la presente invencion y en los Ejemplos.

Los procedimientos para transformar los organismos, por ejemplo microorganismos, de modo que los mismos expresen una terpeno sintasa son conocidos en la tecnica. Dichos procedimientos pueden encontrarse por ejemplo en el documento WO 2010/134004, que describe la transformacion de diversas celulas y organismos hospedadores con una zizaeno sintasa, es decir una enzima capaz de catalizar la produccion de zizaeno a partir del pirofosfato de farnesilo.

Para realizar la invencion in vivo, el organismo o la celula hospedadores se cultivan en condiciones que conducen a la produccion del terpeno oxidado. Dichas condiciones son cualesquiera condiciones que conduzcan al crecimiento del organismo o la celula hospedadores. Preferentemente, dichas condiciones estan disenadas para el crecimiento optimo del organismo o la celula hospedadores. En consecuencia, si el elemento hospedador es una planta transgenica, se proveen las condiciones del crecimiento optimas, tales como las condiciones de la luz, del agua y de los nutrientes, optimas, por ejemplo. Si el elemento hospedador es un organismo unicelular, las condiciones que conducen a la produccion del terpeno oxidado pueden comprender la adicion de los cofactores adecuados al medio de cultivo del elemento hospedador. Ademas, puede seleccionarse un medio de cultivo, para maximizar la oxidacion del terpeno. Las condiciones optimas del cultivo son conocidas por el experto en la materia y no son espedficas para la presente invencion. Los ejemplos de las condiciones adecuadas se describen de una manera mas detallada en los siguientes Ejemplos.

Los organismos hospedadores no humanos para realizar el procedimiento de la invencion in vivo pueden ser cualesquiera organismos unicelulares o multicelulares no humanos. En una realizacion preferida, el organismo hospedador no humano utilizado para realizar la invencion in vivo es una planta, un procariota o un hongo. Se puede utilizar cualquier planta, procariota u hongo. Las plantas particularmente utiles son aquellas que producen naturalmente cantidades elevadas de terpenos. En una realizacion mas preferida, la planta se selecciona entre la familia Solanaceaee, Poaceae, Brassicaceae, Fabaceae, Malvaceae, Asteraceae o Lamiaceae. Por ejemplo, la

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planta se selecciona entre los generos Nicotiana, Solanum, Sorghum, Arabidopsis, Brassica (colza), Medicago (alfalfa), Gossypium (algodon), Artemisia, Salvia y Mentha. Preferentemente, la planta pertenece a las especies de Nicotiana tabacum.

En una realizacion mas preferida, el organismo hospedador no humano utilizado para realizar el procedimiento de la invencion in vivo es un microorganismo. Puede utilizarse Cualquier microorganismo pero de acuerdo con una realizacion incluso mas preferida, el microorganismo es una bacteria o un hongo. Preferentemente, el hongo es la levadura. Mas preferentemente, la bacteria es E. coli y la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

Varios de estos organismos no producen el terpeno que se va a oxidar de manera natural. Para que sean adecuados para realizar el procedimiento de la invencion, estos organismos tienen que ser transformados para producir el terpeno. Los mismos pueden ser transformados de este modo ya sea antes, simultaneamente o despues de la transformacion con el acido nucleico descrito de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, como se ha explicado anteriormente.

Tambien pueden utilizarse celulas eucarioticas superiores aisladas, en lugar de organismos completos, como elementos hospedadores para realizar el procedimiento de la invencion in vivo. Las celulas eucarioticas adecuadas pueden ser cualquier celula no humana, pero preferentemente son celulas vegetales.

Una herramienta importante para transformar los organismos o las celulas hospedadores para realizar el procedimiento de la invencion in vivo es un vector de expresion que comprende un acido nucleico de acuerdo con cualquier realizacion de la invencion. Por tanto, un vector de este tipo tambien es un objeto de la presente invencion, en la que el vector esta en forma de vectores virales, bacteriofagos y plasmidos.

Un "vector de expresion" como se utiliza en el presente documento incluye vectores virales, bacteriofagos y plasmidos. El experto es capaz de seleccionar un vector adecuado de acuerdo con el sistema de expresion. En una realizacion, el vector de expresion incluye el acido nucleico de la invencion enlazado operativamente al menos a una secuencia reguladora, la cual controla la transcripcion, la traduccion, el inicio y la terminacion, tal como un promotor, operador o potenciador transcripcional, o un sitio de union ribosomico al ARNm y, opcionalmente, incluyendo al menos un marcador de seleccion. Las secuencias de nucleotidos estan "enlazadas operativamente" cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con el acido nucleico de la invencion.

Los vectores de expresion de la presente invencion pueden utilizarse en los procedimientos para preparar un organismo y/o una celula hospedadores transformados geneticamente, en organismos o celulas hospedadores que alojan los acidos nucleicos de la invencion y en los procedimientos para producir o fabricar los polipeptidos de la invencion, como se desvela adicionalmente a continuacion. Una planta o una celula vegetal que comprenden un vector de expresion son tambien un objeto de la presente invencion. Los organismos y las celulas hospedadores no humanos recombinantes que comprenden al menos un acido nucleico de acuerdo con cualquier realizacion de la presente invencion tambien son herramientas muy utiles para realizar el procedimiento de la invencion. Dichos organismos y celulas hospedadores no humanos son, por tanto, otro objeto de la presente invencion. En una realizacion preferida, dicho organismo o celula hospedadores expresan o sobre-expresan heterologamente un polipeptido de acuerdo con cualquier realizacion de la presente invencion.

De acuerdo con una realizacion preferida, el organismo o la celula hospedadores no humanos expresan adicionalmente una P450-reductasa (CPR), como se ha descrito anteriormente. La CPR puede estar presente ya sea naturalmente en el organismo o la celula hospedadores o dicho organismo o celula puede transformarse para expresar una CPR antes, simultaneamente o despues de la transformacion para expresar el polipeptido de la invencion. En una realizacion preferida de la invencion, el organismo o la celula hospedadores se transforman para expresar un polipeptido de fusion que comprende tanto el polipeptido de la invencion como la CPR.

En otra realizacion preferida, el organismo o celula es capaz de producir el terpeno que se va a oxidar. Este es el caso cuando el organismo o celula expresa una terpeno sintasa capaz de catalizar la transformacion del terpeno. En el caso en el que el organismo o la celula hospedadores no expresen dicha terpeno sintasa de manera natural, esta puede transformarse antes, simultaneamente o despues de la transformacion con el polipeptido que tiene una actividad de P450.

El organismo o la celula no humanos pueden transformarse ventajosamente de manera adicional con al menos un gen que codifica un polipeptido implicado en el metabolismo de produccion del precursor de terpeno adclico tal como el pirofosfato de geranilo, el pirofosfato de farnesilo o el pirofosfato de geranilogeranilo. Dichos polipeptidos incluyen por ejemplo las enzimas de la via de MEP, de la via de MVA y/o las prenilo transferasas. La transformacion de un organismo o una celula no humanos capaz de producir un compuesto de terpeno con un polipeptido de la invencion y con una CPR, o con un polipeptido de fusion que comprende ambos, como se describe en cualquiera de las realizaciones de la invencion, es suficiente para que la oxidacion del terpeno se realice. Sin embargo, la transformacion adicional con al menos una enzima implicada en la produccion de un precursor de terpeno adclico y/o del difosfato de isopentenilo (IPP) o el difosfato de dimetilalilo (DMAPP), tiene la ventaja de incrementar la cantidad del terpeno disponible para que se oxide.

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Los tipos de organismos o celulas hospedadores no humanos de la invencion son un procariota, un hongo o un microorganismo como se describen en el procedimiento para oxidar un compuesto del terpeno.

El termino "transformado" se refiere al hecho de que el elemento hospedador se sometio a ingeniena generica para comprender una, dos o mas copias de cada uno de los acidos nucleicos requeridos en cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. Preferentemente, el termino "transformado" se refiere a hospedadores que expresan heterologamente los polipeptidos codificados por el acido nucleico con el que se transforman, asf como la sobre-expresion de los polipeptidos. En consecuencia, en una realizacion, la presente invencion proporciona un organismo transformado, en el cual los polipeptidos se expresan en una cantidad mas elevada que en el mismo organismo no transformado de este modo.

Existen diversos procedimientos conocidos en la tecnica para la creacion de celulas u organismos hospedadores transgenicos tales como plantas, hongos, procariotas o cultivos de las celulas eucarioticas superiores. Los vectores de clonacion y de expresion apropiados para su uso con hospedadores celulares bacterianos, fungicos, de levadura, de plantas y de mairnferos, se describen por ejemplo, en Pouwels y col., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Elsevier, lNueva York y Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los vectores de clonacion y expresion para las plantas y/o las celulas vegetales superiores estan disponibles en particular para el experto. Vease por ejemplo Schardl y col. Gene 61:1-11, 1987.

Los procedimientos para la transformacion de celulas u organismos hospedadores para alojar acidos nucleicos transgenicos son familiares para el experto. Para la creacion de plantas transgenicas, por ejemplo, los procedimientos habituales incluyen: la electroporacion de los protoplastos de plantas, la transformacion mediada por liposomas, la transformacion mediada por agrobacterium, la transformacion mediada por polietilenglicol, el bombardeo por partfculas, la microinyeccion de celulas vegetales y la transformacion utilizando virus.

En una realizacion, el ADN transformado se integra en un cromosoma del organismo y/o la celula hospedadores no humanos de modo que de como resultado un sistema recombinante estable. Cualquier procedimiento de integracion cromosomica conocido en el arte puede utilizarse en la practica de la invencion, incluyendo pero sin limitacion el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE), la insercion cromosomica espedfica para el sitio viral, la inyeccion de adenovirus y pronuclear.

Una "variante polipeptfdica" como se denomina en el presente documento, significa un polipeptido capaz de catalizar la oxidacion de un compuesto de terpeno de la Formula (I) y que tiene un porcentaje suficiente de identidad de secuencia de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores. Dichos polipeptidos variantes son codificados por las secuencias nucleotfdicas que han padecido una o mas deleciones, inserciones o sustituciones.

Las variantes pueden comprender las secuencias sustituidas conservadoramente, significando que un resto de aminoacido dado es reemplazado por un resto que tiene caractensticas fisicoqmmicas semejantes. Los ejemplos de las sustituciones conservadoras incluyen la sustitucion de un resto alifatico por otro, tal como Ile, Val, Leu, o Ala por otro, o sustituciones de un resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Vease Zubay, Biochemistry, Addison-Wesley Pub. Co., (1983). Los efectos de dichas sustituciones pueden calcularse utilizando las matrices de evaluacion de la sustitucion tales como PAM-120, PAM-200, y PAM-250 como se analizo en Altschul, (J. Mol. Biol. 219:555-65, 1991). Otras sustituciones conservadoras de este tipo, por ejemplo las sustituciones de regiones completas que tienen caractensticas de hidrofobia semejantes, son bien conocidas. Los polipeptidos de la invencion tambien pueden ser sometidos a sustituciones no conservadoras, para generar variantes mas diversas, a condicion de que dichas variantes conserven la actividad de citocromo P450. Las variantes tambien pueden ser producidas por la delecion e insercion del o de los nucleotidos en las secuencias de acidos nucleicos que codifican el polipeptido variante.

Las variantes de los polipeptidos de la invencion pueden utilizarse para lograr por ejemplo la actividad enzimatica potenciada o reducida deseada, la regioqmmica o la estereoqmmica modificadas o la utilizacion del sustrato alterado o la distribucion del producto, la afinidad incrementada hacia el sustrato, la especificidad mejorada para la produccion de uno o mas compuestos deseados, la velocidad incrementada de la reaccion de la enzima, la actividad o estabilidad mas elevada en un entorno espedfico (pH, temperatura, disolvente, etc.), o el nivel de la expresion mejorado en un sistema de expresion deseado. Se puede fabricar una variante o mutante dirigido al sitio por cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Las variantes y derivados de los polipeptidos naturales pueden obtenerse mediante el aislamiento de las variantes que estan presentes de manera natural, o la secuencia de nucleotidos de las variantes, u otras o las mismas especies o estirpes de plantas, o programando artificialmente mutaciones de las secuencias de nucleotidos que codifiquen para los polipeptidos de la invencion. Las alteraciones de la secuencia de aminoacidos naturales pueden conseguirse por cualquiera de un numero de procedimientos convencionales.

Las variantes de los polipeptidos que son resultado de una fusion de las secuencias de peptidos adicionales en los extremos amino y carboxilo terminales de los polipeptidos de la invencion pueden utilizarse para potenciar la expresion de los polipeptidos, pueden ser utiles en la purificacion de la protema o pueden mejorar la actividad enzimatica del polipeptido en un sistema de expresion o entorno deseados. Dichas secuencias peptfdicas adicionales pueden ser peptidos senal, por ejemplo. En consecuencia, la presente invencion abarca las variantes de

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los polipeptidos de la invencion, tales como las obtenidas por la fusion con otros oligo o polipeptidos y/o las que se unen a peptidos senal.

Todas las publicaciones mencionadas en la presente solicitud desvelan y describen los procedimientos y/o materiales en relacion con los cuales se citan las publicaciones.

Descripcion de las figuras

Figura 1: Estructuras de los compuestos citados.

Figura 2 Alineacion de las secuencias de aminoacidos de monooxigenasas de P450 seleccionadas con actividad de terpeno hidroxilasa definida (tecnica anterior). Las regiones conservadas encontradas en todas las enzimas de P450 estan subrayadas. Las seis regiones utilizadas para disenar los oligonucleotidos espedficos de la terpeno hidroxilasa estan subrayadas con flechas. La direccion de las flechas indica la orientacion de los oligonucleotidos.

Figura 3: Modificaciones N-terminales (fijacion a la membrana) introducidas en los dos P450 de vetiver para una expresion heterologa mejorada en E. coli.

Figura 4: Espectro diferencial de CO representativo obtenido con la protema recombinante de VzP521-11.

Figura 5: Secuencia de la region espaciadora entre el P450 y la CPR en las construcciones bi-cistronicas. Las secuencias del ADN y de los aminoacidos al final del P450 y al inicio de CPR se muestran.

Figura 6: Analisis por CGEM de la byconversion de (+)-zizaeno con el E. coli que expresa el VzP521-16 de P450 de vetiver y de una CPR de arabidopsis (tcATRI). A. Cromatograma de iones totales. B. Espectro de masas del sustrato (1) y los productos (2 a 4) con la identidad y la estructura de los compuestos correspondientes.

Figura 7: Esquema que muestra las etapas sucesivas de la oxidacion enzimatica del zizaeno.

Figura 8: Cromatograma de iones totales del analisis de CGEM de la byconversion de varias moleculas de terpeno por el P450 del vetiver. Los picos que corresponden al sustrato estan indicados y los pesos moleculares de los productos estan indicados.

Figura 9: Esquema que muestra la byconversion por los P450 de vetiver de varias moleculas de terpeno para las cuales los productos fueron identificados.

Figura 10: Organizacion del operon artificial disenado para la co-expresion en E. coli de los P450 de vetiver, una CPR y la zizaeno sintasa.

Figura 11: Cromatograma de iones totales de un analisis de CGEM del sesquiterpeno producido por las celulas de E. coli que expresan la (+)-zizaeno sintasa, el VzP521-16-1 de P450 de vetiver y la CPR de arabidopsis, junto con las enzimas para la produccion de FPP utilizando una via de mevalonato heterologa.

Realizaciones especificas de la invencion o ejemplos

La invencion se describira ahora en mas detalle por medio de los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Extraccion del ARN y construccion de la biblioteca de ADNc

Se obtuvieron plantas de vetiver (Vetiveria Zizanioides (L.) Nash) de un vivero de plantas (The Austral Plants Company, Les Avirons, Isla Reunion, Francia). Las plantas se cultivaron en macetas en un invernadero (Lullier Agronomy research Station, Ginebra, Suiza) y se propagaron vegetativamente por la division de grupos de seis meses hasta un ano de edad. Para la recoleccion de las rafces, las plantas se retiraron de las macetas y se aclararon con agua del grifo.

Para la extraccion del ARN, se combinaron las rafces de varias plantas: plantulas (de 4 a 6 meses despues de la propagacion), plantas viejas con un sistema de rafces denso bien desarrollado (de 1 a 2 anos despues de la propagacion) y plantulas secadas a temperatura ambiente durante 24 a 36 horas despues de ser retiradas de las macetas. Las rafces se cortaron de la parte aerea de las plantas y se congelaron en nitrogeno lfquido. Las rafces se recortaron primero toscamente en nitrogeno lfquido utilizando un aparato Waring Blendor (Waring Laboratory, Torrington, EE.UU.) y luego se molieron hasta un polvo fino utilizando un mortero y la mano del mortero. El ARN total se extrajo siguiendo el procedimiento descrito en Kolosova y col. (Kolosova N, Miller B, Ralph S, Ellis BE, Douglas C, Ritland K, y Bohlmann J, Isolation of high-quality rNa from gymnosperm and angiosperm trees. J Biotechniques, 36(5), 821-4, 2004) con las siguientes modificaciones. Un volumen de 20 ml del tampon de extraccion se utilizo para 2 gramos del tejido molido y el tampon de la extraccion se suplemento con 2 % (p/v) de la

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PVP (polivinilpirrolidona, Sigma-Aldrich). Para la extraccion del CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio, Sigma- Aldrich), el sedimento de acido nucleico se resuspendio en 2 ml del tampon de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM) y la extraccion se efectuo con 2 ml de NaCl 5 M y 1 ml de CTAB al 10%. Para la precipitacion del isopropanol, el sedimento del acido nucleico se disolvio en 500 pl de TE. El sedimento del ARN final se resuspendio en 50 pl de agua.

La biblioteca de ADNc de doble cadena ligada al adaptador se preparo a partir de 1 pg de ARNm utilizando el Kit de Amplificacion de ADNc Marathon™ (Clontech, Takara Bio Europe) siguiendo el protocolo del fabricante.

Ejemplo 2

Diseno de los oligonucleotidos especificos para P450

Para disenar los oligonucleotidos espedficos para los P450 de la planta con actividad de terpeno hidroxilasa, se seleccionaron secuencias de aminoacidos de los P450 de hidroxilacion del terpeno conocidos: una limoneno 6- hidroxilasa de hierbabuena (GenBank, n.° de referencia AAD44150), dos limoneno 3-hidroxilasas de menta (GenBank, n.° de referencia AAD44152 y AAD44151), una epi-aristolocheno hidroxilasa del tabaco (Genbank, n.° de referencia AAK62343), una premnaspirodieno hidroxilasa de Hyoscyamus muticus (GenBank, n.° de referencia ABS00393), dos limoneno hidroxilasas de la hierbabuena escocesa (Genbank acccess, n.° de referencia y AAQ18708), una diterpeno hidroxilasa del tabaco (Genbank, n.° de referencia AAD47832) y dos miembros de la familia CYp71D, Cyp71D4 de la patata (Genbank, n.° de referencia CAC24711) y CYP7D6 de la patata silvestre (Genbank, n.° de referencia P93530). Las secuencias se alinearon con el programa ClustalW (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J. (1994); CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice; Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680). La alineacion se representa en la figura 2.

Para disenar los oligonucleotidos que se utilizaron para las amplificaciones de los fragmentos de los ADNCs de P450 homologos, las regiones conservadas se seleccionaron en esta alineacion. Se tuvieron en cuenta parametros tales como la conservacion de los aminoacidos a traves de todas las secuencias y la presencia de los aminoacidos con una degeneracion baja del codon, en la seleccion de estas regiones. Ademas, debido a que los genomas de las plantas contienen un gran numero de P450 implicados en muchos metabolismos diferentes, las regiones relacionadas con las funciones comunes para todos los P450 se evitaron deliberadamente. Estas regiones incluyen por ejemplo el dominio de union a hemo que flanquea el resto de cistema perfectamente conservado que se une covalentemente al hierro hemo por medio de su cadena lateral de tiolato (motivo PFGxGRRICPG en la alineacion de la invencion), el asf llamado "meandro" (motivo FxPERF en la alineacion de la invencion) implicado presumiblemente en la interaccion con la protema del companero redox y en la estabilizacion de la asociacion de la protema hemo, y la region de la helice I localizada en el sitio activo sobre el lado distal del hemo (motivo (A/G)GTETSS) y estan implicadas en la transferencia del proton y la activacion del oxfgeno. De este modo se seleccionaron seis regiones conservadas supuestamente caractensticas de las terpeno monooxigenasas de la planta (subrayadas con flechas en la figura 1).

Se disenaron cebadores hubridos que contienen un nucleo generado 3' y un pinzamiento zonal de consenso 5' a partir de estas regiones siguiendo la estrategia para los Cebadores de Oligonucleotidos Hfbridos Degenerados por Consenso (CODEHOP, del ingles Consensus-Degenerated Hybrid Oligonucleotide Primers) (Rose T.M., Schultz E.R., Henikoff J.G, Pietrokovski S., McCallum C.M., y Nenikoff S.; 1998; Consensus-degenerated hybrid oligonucleotide primers for amplification of distantly related sequences; Nucleic Acids Research 26(7), 1628-1635) y utilizando la interfaz en lmea del programa de ordenador disponible en
http://blocks.fhere.org/blocks/codehop.html. Los oligonucleotidos se disenaron para que tuvieran un nucleo degenerado de 11 a 14 bases con una degeneracion maxima de 192 y una temperatura de hibridacion de entre 60 y 64 °C. Utilizando este procedimiento se disenaron tres cebadores de sentido (P450-terp-F1 a F3 (SEQ ID NO: 5 a 7)) y cuatro cebadores antisentido (P450-Terp-RI a R4 (SEQ ID NO: 8 a 11) a partir de las seis regiones conservadas mostradas en la Figura 1 (Tabla 1).

Tabla 1. Oligonucleotidos especificos para la terpeno-hidroxilasa. La secuencia del nucleo degenerado de cada cebador esta indicado con letras minusculas y el pinzamiento zonal de consenso esta indicado con mayusculas. Las secuencias de nucleotidos estan indicadas del extremo 5' al 3' para los cebadores directos y del extremo 3' al 5' para los cebadores inversos. La degeneracion en las secuencias de nucleotidos se indica utilizando el codigo de una letra de la IUPAC.

Nombre del cebador

Secuencia de nucleotidos y secuencia de aminoacidos de consenso correspondiente

450-terp-F1 (SEQ ID NO: 5)

GPVMHVQLGE 5'-GGCCCGGTGATGCACGTGcarytnggnga-3'

P450-terp-F2 (SEQ ID NO: 6)

PYGDHWRQMR 5'-CCGTACAGCGACCACTGGmrncaratgmg-3'

P450-terp-F3 (SEQ ID NO: 7)

SMTCRAAFG 5'-GCTCCATGACCTGCCGGdsngcnttygg-3'

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(continuacion)

Nombre del cebador

Secuencia de nucleotidos y secuencia de aminoacidos de consenso correspondiente

P450-terp-R1 (SEQ ID NO: 8)

VIKETMRMH 3'-cannanttyctCTGGTACGCCTACGT-5'

P450-terp-R2 (SEC-ID-NO:9)

ETMRMHPP 3’-ctytgndankcCTACGTGGGCGGG-5'

P450-terp-R3 (SEQ ID NO: 10)

FGLANVYLP 3'-aarccnrancgGTTGCAGATGGAGGGC-5'

P450-terp-R4 (SEQ ID NO: 11)

HFDWKLPTG 3'-gtraarctraccttyGACGGCTTCCC-5'

Ejemplo 3

Amplificacion de PCR de los ADNc del P450 de vetiver

Los cebadores descritos en el Ejemplo 2 se utilizaron para la amplificacion de los fragmentos del ADNc de P450 por PCR de la biblioteca del ADNc del vetiver. Las PCR se realizaron utilizando la Mezcla de Polimerasa Advantage® 2 (Clontech, Takara Bio Europe). Cada una de las mezclas de PCR contema, en un volumen total de 50 pl, 5 pl del tampon de PCR Advantage® 2, dNTPs 200 pM, 200 nM de cada cebador del oligonucleotido, 5 pl de aDnc diluido 200 veces, 1 pl de la Mezcla de la Polimerasa Advantage® 2. Las siguientes condiciones se utilizaron para las amplificaciones:

- 3 minutos de desnaturalizacion a 94 °C;

- 15 ciclos de

o 1 minuto de desnaturalizacion a 94 °C,

o 1 minuto de hibridacion a 65 °C para el primer ciclo y menos de un grado para cada ciclo siguiente, y

o 2 minutos de extension a 72 °C;

- 20 ciclos de

o 1 minuto de desnaturalizacion a 94 °C, o 1 minuto de hibridacion a 58 °C y o 2 minutos de extension a 72 °C; y

- finalmente 10 minutos de extension a 72 °C.

Se realizaron diferentes PCR con las posibles combinaciones de los cebadores sentido y antisentido espedficos para la terpeno-hidroxilasa. Los amplicones con el tamano esperado se clonaron en el vector pCR®2.1-TOPO utilizando el Kit de clonacion TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA), los insertos se sometieron a secuenciacion del ADN y la secuencia se comparo frente a la base de datos de protemas no redundantes del GenBank (NCBI) utilizando el algoritmo BLASTXn (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., y Lipman, D.J. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410).

Varias combinaciones de cebadores (P450-terp-F1 (SEQ ID NO: 5) con P450-terp-R2 (SEQ ID NO: 9), P450-terp-F3 (SEQ ID NO: 7) con P450-terp-R3 (SEQ ID NO: 10), y P450-terp-F1 (SEQ ID NO: 5) con P450-terp-R4 (SEQ ID NO: 11)) proporcionaron fragmentos del ADN con el tamano esperado y con las secuencias que mostraban homologfa con respecto a las secuencias de P450. Solamente se conservaron los fragmentos que mostraban homologfa con las terpeno monooxigenasas caracterizadas (aproximadamente el 50 % de los fragmentos secuenciados). Las secuencias de ADN seleccionadas se alinearon y se dedujo una secuencia del ADN de consenso de 1167 pb (CA521 (SEQ ID NO: 12)). La secuencia de aminoacidos deducida de CA521 mostro una identidad tan elevada como el 45 % con las terpeno monooxigenasas de la planta conocidas.

Se obtuvieron secuencias de longitud total con la tecnica de Amplificacion Rapida de los Extremos del ADNc (RACE, del ingles Rapid Amplification of cDNA Ends). El Kit de Amplificacion del ADNc de Marathon™ (Clontech, Takara Bio Europe) se utilizo para todos los experimentos de RACE. Las mezclas de la reaccion de RACE tfpicas contienen, en un volumen final de 50 pl, 5 pl del tampon de PCR Advantage® 2 (Clontech, Takara Bio Europe), 200 pM de cada dNTP, 1 pl de la Mezcla de la Polimerasa Advantage® 2 (Clontech, Takara Bio Europe), 200 pM del cebador espedfico para el adaptador, 200 pM del cebador espedfico para el ADNc y 5 pl del ADNc de las rafces de vetiver unidas al adaptador diluido 200 veces. La amplificacion se realizo sobre una maquina cicladora termica de Eppendorf Mastercycler Gradiant. Las condiciones de ciclacion termica fueron como se indica a continuacion: 1 min a 94 °C; 5 ciclos de 20 s a 94 °C y 3 min a 72 °C, 5 ciclos de 30 s a 94 °C y 3 min a 72 °C, 20 ciclos de 30 s a 94 °C y 3 min a 68 °C. Cuando fue necesario, se realizo una segunda vuelta de amplificacion utilizando los oligonucleotidos encajados. Los amplicones con el tamano esperado se clonaaron en el vector pCR®2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad,

CA) y los insertos se sometieron a la secuenciacion de ADN y la secuencia se comparo frente a la base de datos de la protema no redundante de Genbank (NCBI) utilizando el algoritmo de BLASTX (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., y Lipman, D.J. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410).

Para la amplificacion de los extremos de CA-521, se dedujeron oligonucleotidos de sentido y antisentido de los 5 fragmentos del ADN generados por PCR y se utilizaron en 3'RACE y 5'RACE: CA521-F1 (SEQ ID NO: 13), CA521- F2 (SEQ ID NO: 14), CA521-R1 (SEQ ID NO: 15) y CA521-R2 (SEQ ID NO: 16). Utilizando los oligonucleotidos de sentido, se obtuvo un fragmento de 500 pb (CA635 (SEQ ID NO: 17)), que compartfa un solapamiento de 176 restos identicos con el fragmento de CA251. Este fragmento de CA635 contema una region codificante de 138 pb, incluyendo el codon de terminacion, seguido de una region 3' sin traducir. El 5'RACE proporciono un fragmento de 10 426 pb (CA884 (SEQ. ID NO:18)) que contema la region codificante de 243 pb faltante en el extremo 5'.

Se disenaron oligonucleotidos a partir de las regiones de inicio y de terminacion de la secuencia de la longitud total reconstituida, CA251-inicio (SEQ. ID NO: 19), CA521-terminacion (SEQ. ID NO: 20), y se utilizaron como cebadores para la amplificacion del ADNc de longitud completa. Esta amplificacion se realizo utilizando la Pfu ADN polimerasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.), en un volumen final de 50 pl que contema 5 pl del tampon 10X de la Pfu ADN 15 polimerasa, 200 pM de cada dNTP, 0,4 pM de cada cebador, 2,9 unidades de la Pfu ADN polimerasa y 2,5 pl del ADNc de vetiver diluido 200 veces. Las condiciones de ciclacion termica fueron como se indica a continuacion: 1,5 min a 95 °C; 30 ciclos de 45 s a 95 °C, 30 s a 64 °C y 4 min a 72 °C; y 10 min a 72 °C. Los productos de la PCR se clonaron en el vector pCR®2.1-TOPO utilizando el Kit de clonacion TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se controlo la secuencia del ADN. A partir de la secuenciacion de varios clones, se conservaron dos secuencias del 20 ADN distintas (VzP521-11 (SEQ. ID NO: 21) y VzP521-16 (SEQ. ID NO: 22)) que compartfan el 93 % de identidad de secuencia. Las secuencias de aminoacidos deducidas, compuestas de 513 y 514 restos respectivamente, compartieron el 89% de identidad. La identidad de secuencia de aminoacidos de VzP521-11 (SEQ. ID NO: 23) y VzP521-16 (SEQ. ID NO: 24) con la correspondencia mas cercana en las bases de datos de la secuencia se enumeran a continuacion.

Numeros de referencia, denominacion, organismo

VzP521-11 VzP521-16

EER94164, protema hipotetica, Sorghum bicolor

68 % 67 %

ACF87848, protema desconocida, Zea mays

67 % 67 %

EER96012, protema hipotetica, Sorghum bicolor

65 % 65 %

ACF86186, protema desconocida, Zea mays

65 % 64 %

EER96013, protema hipotetica, Sorghum bicolor

65 % 64 %

EER92230, protema hipotetica, Sorghum bicolor

63 % 61 %

EAY78666, protema hipotetica, Oryza sativa

61 % 61 %

AAP53961, protema de la familia del citocromo P450, Oryza sativa

61 % 60 %

BAD17264, citocromo P450 supuesto, Oryza sativa

59 % 58 %

25

Las identidades de las secuencias de aminoacidos con las protemas caracterizadas funcionalmente y disponibles publicamente, mas cercanas, se enumeran en la tabla a continuacion:

Numeros de referencia, denominacion, organismo

VzP521-11 VzP521-16

AAD44151, AAQ18706, AAD44152, AAT39473, AAQ18708M, limoneno hidroxilasa, especies de Mentha.

43 al 45 % 43 al 45 %

AAK62432, premnaspirodieno oxigenasa, Hyoscyamus muticus

50 % 48 %

AAK62432, epi-aristolocheno oxidasa, Nicotiana tabacum

46 % 45 %

ADF43083, germacreno A oxidasa, Bernadesia spinosa

44 % 44 %

ADM86719, valenceno oxidasa, Chicorium intybus

45 % 46 %

AF43081, germacreno A oxidasa, Saussura costus

43 % 44 %

Los polipeptidos VzP521-11 (SEQ. ID NO: 23) y VzP521-16 (SEQ. ID NO: 24) comprenden una parte que es una 30 fijacion a la membrana y una region activa que es responsable de la actividad catalttica de P450. Las regiones activas de VzP521-11 y VzP521-16 se representan en la SEQ. ID NO: 1 y 2, respectivamente. La secuencia de acidos nucleicos que codifican para estas secuencias activas se representa en la SEQ. ID NO: 3 y 4,

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respectivamente.

Ejemplo 4

Expresion heterologa de los P450 de vetiver en bacterias

En las monooxigenasas de P450 de eucariotas, la secuencia N-terminal de la protema constituye una fijacion a la membrana esencial para la localizacion en la membrana de estas enzimas. Esta parte de la protema, delimitada por un dominio rico en prolina (PPGP en 521-11 (SEQ ID NO: 23) y 521-16 (SEQ ID NO: 24)), no es esencial para el control de la especificidad de la actividad enzimatica. Esta region puede modificarse, de este modo, por delecion, insercion o mutacion, sin efecto sobre la actividad catalftica. Sin embargo, se ha demostrado que la modificacion espedfica de la region N-terminal de los P450 de eucariotas, incluyendo los P450 de plantas, tiene un efecto positivo sobre los niveles de protemas recombinantes detectadas, cuando se expresan en los microorganismos (Halkier y col. (1995) Arch. Biochem. Biophys. 322, 369-377; Haudenschield y col. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 379, 127136). De este modo, basandose en estas observaciones previas las regiones de fijacion a la membrana de los P450 VzP521-11 y VzP521-16 se disenaron para introducir la modificacion mostrada en la figura 3.

Los ADNc modificados se obtuvieron por PCR como se indica a continuacion. Un primer segmento que corresponde a la region de fijacion a la membrana se amplifico utilizando los cebadores Pfus-Ndel (SEQ ID NO: 25) y 521_fus_r (SEQ ID NO: 26) (con el plasmido P2-2-48 (Haudenschield y col. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 379, 127-136) como molde. Se amplificaron otros dos fragmentos utilizando el ADNc de los cebadores 521-fus-f (SEQ ID NO: 27) y 521-Hind (SEQ ID NO: 28) y ya sea el VzP521-11 (SEQ ID NO: 21) o VzP521-16 (SEQ ID NO: 22) como molde. Se realizo una segunda vuelta de PCR utilizando como modelo el primer producto de PCR y cualquiera de los dos ultimos productos de PCR y como cebadores Pfus-NdeI (SEQ ID NO: 25) y 521-Hind (SeQ ID nO: 28). Todas las PCR se realizaron con la Pfu ADN polimesasa (Promega, Madison, WI, USA), en un volumen final de 50 pl que contema 5 pl del tampon 10X de la Pfu ADN polimerasa, 200 pM de cada dNTP, 0,4 pM de cada cebador, 2,9 unidades de la Pfu ADN polimerasa y 2,5 pl del ADNc de vetiver diluido 200 veces. Las condiciones de ciclacion termica fueron como se indica a continuacion: 1,5 min a 95 °C; 30 ciclos de 45 s a 95 °C, 30 s a 64 °C y 4 min a 72 °C; y una etapa final de 10 min a 72 °C. Los dos productos de la PCR, VzP521-11-1 (SEQ. ID NO: 37) y VzP521- 16-1 (SEQ. ID NO: 38), se digirieron con las enzimas de restriccion de NdeI y HindIII y se unieron en el plasmido de expresion de pCWori (Barnes H.J. (1996) Method Enzymol, 272, 3-14) proporcionando los plasmidos pCW-218-521- 11 y pCW-218-521-16 que conteman respectivamente el ADNc que codificaba los P450 de VzP521-11-1 y VzP521- 16-1 modificados N-terminalmente (secuencias de aminoacidos de los VzP521-11-1 (SEQ. ID NO: 35) y VzP521-16- 1 (SEQ. ID NO: 36)).

Para la expresion heterologa, las celulas de E. coli JM109 se transformaron con los plasmidos de expresion 218521-11 y 218-521-16. Se utilizaron colonias individuales de transformantes para los cultivos inoculados de 5 ml del medio LB que contema ampicilina 50 pg/ml. Las celulas se cultivaron durante 10 a 12 horas a 37 °C. Los cultivos se utilizaron despues para inocular 250 ml del Medio TB (Terrific Broth) suplementado con ampicilina 50 pg/ml y HCl de Tiamina 1 mM. Los cultivos se incubaron a 28 °C durante 3-4 h con agitacion moderada (200 rpm) antes de anadir acido 8-aminolevulmico 75 mg/l (sigma) y IPTG (Isopropil-p-D-1-tiogalactopiranosido) 1 mM, y los cultivos se mantuvieron a 28 °C durante 24-48 h con agitacion a 200 rpm.

La expresion de las enzimas de P450 puede evaluarse cuantitativamente y cualitativamente mediante la medicion del espectro de union de CO (Omura, T. y Sato, R. (1964) J. Biol. Chem. 239, 2379-2387) en las fracciones de protema de E. coli. Para la extraccion de la protema, las celulas se centrifugaron (10 min, 5000 g, 4 °C) y se resuspendieron en el tampon 1 enfriado con hielo (Tris-HCl 100 mM pH 7,5, glicerol al 20%, EDTA 0,5 mM). Se anadio un volumen de 0,3 mg/ml de lisozima (de la clara del huevo de pollo, Sigma-Aldrich) en agua y la suspension se dejo 10-15 minutos a 4 °C con agitacion. La suspension se centrifugo durante 10 minutos a 7000 g y 4 °C y el sedimento se resuspendio en 20 ml del tampon 2 (KPO4 25 mM pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 0,1 mM, glicerol al 20 %). La suspension se sometio a un ciclo de congelamiento-descongelamiento a -80 °C, se anadio PMSF 0,5 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo, Sigma-Aldrich) y la suspension se sometio a ultrasonidos 3 veces durante 20 segundos. La suspension se centrifugo 10 minutos a 10000 g (para retirar los desechos de las celulas) y el sobrenadante se recupero y se centrifugo durante 2 horas a 100.000 g. El sedimento (fraccion de la protema de membrana) se resuspendio en 2-3 ml de tampon 3 (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, EDTA 1 mM, glicerol al 20%). Para medir el espectro de CO, la fraccion de la protema se diluyo (1/10) en el tampon 3 a un volumen final de 2 ml. Se anadieron algunos cristales del ditionito de sodio (Na2S2O4), la muestra se dividio en dos cubetas y el valor basal se registro entre 370 y 500 nm. Despues, la cubeta de la muestra se saturo con monoxido de carbono y se registro la diferencia del espectro. La concentracion de la enzima de P450 puede estimarse a partir de la amplitud del pico a 450 nm utilizando el coeficiente de extension para el complejo de CO reducido de 91 mM'1»cirr1 (Omura, T. y Sato, R. (1964) J. Biol. Chem. 239, 2379-2387).

Siguiendo este procedimiento, se midieron espectros de CO tfpicos con una absorbancia maxima a 450 nm para las protemas recombinantes VzP521-11-1 (SEQ ID NO: 35) y VzP52116-1 (SEQ ID NO: 36), atestiguando un plegado apropiado en las enzimas de P450 funcionales (Figura 4).

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Ejemplo 5

Expresion heterologa de las P450-reductasas de plantas en bacterias

Para reconstituir la actividad de los P450 de planta, la presencia de una segunda protema de membrana es esencial. Esta protema, la P450-reductasa (CPR), esta implicada en la transferencia de electrones desde NADPH (fosfato del dinucleotido de nicotinamida adenina, forma reducida) al sitio activo de P450. Se ha demostrado que una CPR de una planta puede complementar la actividad de la enzima de P450 de otra planta (Jensen y Moller (2010) Phytochemsitry 71, 132-141).

Se han notificado varias secuencias nucleotidicas que codifican la PCR de diferentes fuentes de plantas. Por ejemplo, se han identificado dos CPR distintos, ATR1 y ATR2 (NCBI, n.° de referencia CAA46814.1 y CAA46815), en Arabidopsis thaliana (Urban y col. (1997) J. Biol. Chem. 272(31) 19176-19186). Se ha demostrado que estas CPR complementan varias enzimas de P450 de varias especies de plantas. Se sintetizo un ADNc (secuencia tcATR1-opt (SEQ ID NO: 29) que codificaba para una version truncada de ATR1 (delecion de 17 aminoacidos N- terminales) utilizando un codon de uso optimo para la expresion en E. coli (DNA 2.0, Menlo Park, CA, EE.UU.) e incluyendo los sitios de restriccion de Ncol y BamHI en el extremo 5' y el extremo 3', respectivamente. Este ADNc se unio en el plasmido pJ206 (DNA 2.0, Menlo Park, CA, EE.UU.) proporcionando el plasmido pJ206-tcATR1-opt. El inserto se digirio a partir del plasmido pJ206-tcATR1-opt con las enzimas de restriccion de Ncol y BamHI y se unieron entre los sitios de restriccion correspondientes del plasmido de expresion de pACYDuet-1 (Novagen, Merck Chemicals) proporcionando el plasmido pACYC-tcATR1-opt. La expresion funcional de las CPR en las celulas de E. coli puede estimarse despues de la reduccion enzimatica del citocromo C. El plasmido pACYC-tcATR1-opt se utilizo para transformar las celulas B121(DE3) (Novagen) o JM109(DE3) (Promega, Madisson, Wl, EE.UU.) de E. coli. Las condiciones del cultivo, la expresion de la protema y la preparacion de la protema libre de celulas se hicieron como se describio en el Ejemplo 4. Las protemas se diluyeron en 1 ml de Tris pH 7,4 suplementado con FAD 5 pM, FMN 5 pM, citocromo C 40 mM (Sigma-Aldrich), MgCh 1 mM. La reaccion se inicio mediante la adicion de 0,12 mmoles de NADPH (Sigma). La reduccion del citocromo C se registro por la medicion del incremento de DO a 550 nm durante 0,5 a 2 minutos. La actividad espedfica de la reductasa (en mUnidades/pl) se calculo utilizando la siguiente formula: (D0end-D0strat)/21/tiempo(seg)/Vol(pl)X60000 (en mUnidades/pl). Normalmente, la actividad medida con el ATR1 recombinante vario entre 7 y 10 Unidades/pl.

Ejemplo 6

Co-expresion de un P450 y una P450 reductasa utilizando dos plasmidos

Para una biotransformacion celular completa utilizando P450 de planta, se requiere la co-expresion de las protemas P450 y CPR en una sola celula hospedadora. Esta co-expresion puede obtenerse utilizando dos plasmidos. Por ejemplo, se co-transformaron celulas de E. coli de BL21 StarTM(DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA) con el pACYC- tcATR1-opt y el plasmido pCW-218-521-11 o pCW-218-521-16. Las celulas transformadas se seleccionaron sobre placas de LB-agarosa de carbenicilina (50 pg/ml) y cloranfenicol (34 pg/ml). Se utilizaron colonias individuales para inocular 5 ml del medio de LB lfquido suplementado con los mismos antibioticos. El cultivo se incubo toda la noche a 37 °C. El siguiente dfa se inocularon de 2 a 250 ml del medio TB suplementado con los mismos antibioticos y HCl de Tiamina 1 mM con 0,2 ml del cultivo toda la noche. Despues de 6 horas de incubacion a 37 °C, el cultivo se enfrio gradualmente a 28 °C y se anadieron IPTG 1 mM y acido 8-aminolevulmico 75 mg/l. El cultivo se mantuvo de 24 a 36 horas. Se prepararon fracciones de protema como se describio en el ejemplo 4 y la expresion del P450 y CPR recombinantes evaluo utilizando el procedimiento descrito en los ejemplos 4 y 5, respectivamente.

Ejemplo 7

Co-expresion de un P450 y una P450 reductasa a partir de un solo plasmido

Se prepararon plasmidos de expresion con una construccion bi-cistronica que comprendfa un ADNc que codificaba un P450 del vetiver y un ADNc que codificaba PCR. Las construcciones se disenaron para la insercion entre las dos regiones de codificacion de una secuencia espaciadora que inclma un sitio de union al ribosoma (RBS) (vease la figura 5).

El ADNc del tcATR1-opt (SEQ ID NO: 29) sintetizado con el uso del codon optimo de E. coli (DNA 2.0, Menlo Park, CA, EE.UU.) se modifico para anadir al extremo 5', antes del codon de inicio, una extension de 30 pb que contema la secuencia espaciadora (SEQ ID NO: 30) y la secuencia de RBS. El ADNc del tcATR1-opt se amplifico utilizando los cebadores 2390-CPR-F2 (SEQ ID NO: 31) y 2390-CPR-R2b (SEQ ID NO: 32) utilizando la Pfu ADN polimerasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.), en un volumen final de 50 pl que contema 5 pl del tampon 10X de la Pfu ADN polimerasa, 200 pM de cada dNTP, 0,4 pM de cada cebador, 2,9 unidades de la Pfu ADN polimerasa y 2,5 pl del plasmido pJ206-tcATR1-opt. Las condiciones de ciclacion termica fueron como se indica a continuacion: 1,5 min a 95 °C; 30 ciclos de 45 s a 95 °C, 30 s a 60 °C y 4 min a 72 °C; y 10 min a 72 °C. Despues de la purificacion sobre un gel de agarosa, el producto de la PCR se unio en los plasmidos pCW-218-521-11 y pCW-218-521-16 digeridos por HindIII utilizando el Kit de Clonacion de PCR In-Fusion® Dry-Down (Clontech, Takara Bio Europe) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los dos plasmidos resultantes pCW-218-521-11 y pCW-218-521-16 conteman las construcciones bi-cistronicas de las secuencias de VzP521-11-1 y VzP521-16-1 respectivamente, seguidas de la

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secuencia de tcATRI-opt.

Se transformaron celulas de E. coli con uno de estos dos plasmidos y las fracciones de la protema de membrana se prepararon como se describio en el Ejemplo 4. La expresion de P450 y CPR se verifico siguiendo los espectros de union de CO y los ensayos de reduccion de NADPH como se describio en los Ejemplos 4 y 5.

Ejemplo 8

Bioconversion de zizaeno a kusimol utilizando celulas enteras de E. coli que expresan P450 de vetiver y CPR

La oxidacion de (+)-zizaeno puede ser realizarse utilizando celulas enteras que expresan P450 de vetiver y una CPR (bioconversion). El zizaeno se preparo utilizando celulas E. coli disenadas siguiendo el procedimiento descrito en la patente WO 2010/134004 y utilizando la sesquiterpeno sintasa con la secuencia de numero de referencia HI931369.

En resumen, se transformaron celulas de E. coli de BL21StarTM (DE3) (Invitrogen, Ltd) con el plasmido pACYC-4506 y el plasmido pETDuet-VzZS-opt. El plasmido pACYC-4506 contema los genes que codifican para las cinco enzimas de una ruta biosintetica que convierte el acido mevalonico en FPP: una mevalonato cinasa (MvaKI), una fosfomevalonato cinasa (MvaK2), una mevalonato difosfato descarboxilasa (MvaD), una isopentenilo difosfato isomerasa (idi) y la farnesilo difosfato sintasa (FPS). Para construir este plasmido, el gen FPS se amplifico a partir de ADN genomico de S. cerevisiae y se unio en el primer sitio de clonacion multiple (MCS, del ingles multiple cloning site) del pACYDuet-1 y se amplifico el operon que codificaba los genes para un MvaKI, un MvaK2, un MvaD, y un idi a partir del ADN genomico de Streptococcus pneumoniae (ATCC BAA-334) y se unio en el segundo MCS. El pETDuet-VzZS-opt contema una version optimizada del codon de la (+)-zizaeno sintasa de vetiver (como se describio en la sEq ID NO: 11 del documento WO 2010/134004).

Se utilizaron colonias individuales de las celulas transformadas para inocular 5 ml del medio de LB suplementado con carbenicilina (50 mg/ml) y cloranfenicol (34 |jg/ml). Los cultivos se incubaron toda la noche a 37 °C. El siguiente dfa se inoculo 1 l del medio Terrific Broth (TB) suplementado con los mismos antibioticos con 1/100 volumenes del cultivo toda la noche. Despues de 6 horas de incubacion a 37 °C, los cultivos se enfriaron gradualmente a 28 °C y se anadieron IPTG 1 mM, acido mevalonico 2 g/l preparado por disolucion de mevalonolactona (sigma-Aldrich) en NaOH 0,5 N a una concentracion de 1 g/ml y la incubacion de la solucion durante 30 minutos a 37 °C), y 100 g/l de resina de Amberlite™ XADTM-4 (Rhom and Haas) a los cultivos. Despues de 48 h de incubacion, la resina se recupero, se aclaro con agua y se eluyo con 3 volumenes de eter dietflico. El disolvente se retiro y el producto purificado por cromatograffa ultrarrapida en gel de sflice utilizando n-hexano como disolvente. Las fracciones que conteman el (+)zizaeno se agruparon, el disolvente se retiro por destilacion y el resto se utilizo como sustrato para los ensayos de oxidacion.

Se transformaron celulas de E. coli (BL21StarTM(DE3) (Invitrogen, Ltd) o JM109(DE3) (Promega)) con los plasmidos pCW-218-521-11 o pCW-218-521-16 o las celulas se o-transformaron con los plasmidos pCW-218-521-11 o pCW- 218-521-16 y pACYC-tcATR1-opt y se cultivaron en un medio de TB suplementado con un 3 % de glicerol o el medio de LB suplementado con un 1 % de glucosa. Los cultivos se incubaron a 37 °C hasta que alcanzaron una densidad optica de 1. Despues, los cultivos se transfirieron a 28 °C, se anadieron IPTG 1 mM y acido 8-aminolevulmico 74 mg/l y el cultivo, y se incubaron durante 24 horas.

Las celulas se recogieron en la fase del crecimiento exponencial, se centrifugaron y se resuspendieron en 0.5 volumenes del tampon de fosfato de potasio 50 mM pH 7,0 suplementado con un 5 % de glicerol o un 3 % de glucosa. El sustrato ((+)-zizaeno) se anadio a una concentracion final de 0,5 mg/ml como una mezcla compuesta de 10 mg de Tween® 20 (sigma-Aldrich), 10 mg de antiespumante (Erol DF, PMC Ouvrie, Lesquin, Francia), 20 mg de (+)-zizaeno y 1 ml de agua. La conversion se dejo proceder durante 24 horas a 20 °C con agitacion moderada. Los medios se extrajeron con 2 volumenes de acetato de etilo y los extractos se analizaron por CGEM sobre un sistema de la Serie GC de Agilent 6890 conectado a un detector de masas de Agilent 5975. La CG se equipo con una por una columna capilar SPB-1 de diametro interno de 0,25 mm por 30 m (Supelco, Bellefonte, PA). El gas vetuculo fue He a un flujo constante de 1 ml/min. La temperatura inicial del horno fue de 50 °C (1 min de retencion) seguida de un gradiente de 10 °C/min a 300 °C. La identificacion de los productos se baso en la comparacion de los espectros de masa y los indices de retencion con los patrones autenticos y las bases de datos internas.

En estas condiciones, la oxidacion del (+)-zizaeno se observo con celulas que conteman las protemas recombinantes VzP521-11-1 y VzP521-16-1. Estos productos se observaron y se analizaron por analisis por CGEM: kusimol, zizanal y acido zizanoico, que fueron resultado de la oxidacion sucesiva del (+)-zizaeno (figura 6). Las enzimas VzP521-11-1 y VzP521-16-1 catalizan de este modo la oxidacion del (+)-zizaeno a kusimol. La oxidacion adicional del kusimol a zizanal y al acido zizanoico podna ser catalizada por los P450 recombinantes o por las actividades enzimaticas de E. coli endogenas (figura 7).

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Ejemplo 9

Bioconversion de otras moleculas de monoterpeno y sesquiterpeno utilizando las celulas enteras de E. coli que expresan P450 de vetiver y CPR

Se prepararon celulas de E. coli que expresan los P450 de vetiver y una PCR, se cultivaron y las bioconversiones se realizaron utilizando celulas en reposo en un tampon de fosfato de potasio como se describio en el Ejemplo 8.

Se realizaron ensayos con varias moleculas de terpeno y la formacion de moleculas de terpeno oxigenado se evaluo utilizando analisis por CGEM como se describe en el Ejemplo 8. Ademas del (+)-zizaeno, se observo la bioconversion con las siguientes moleculas: (+)-limoneno, (-)-limoneno, alfa-pineno, alfa-cedreno, alfa-longipineno, alfa-funebreno, tujopseno, valenceno, beta-chamigreno, aloaromadendreno, alfa-neocloveneno, isosativeno, ledeno, alfa-humuleno, alfa-gurjuneno, gamma-gurjuneno, beta-funebreno, alfa-copaeno, alfa-gurjuneno y beta-pineno. Las estructuras de estas moleculas se muestran en la figura 1. Se muestran ejemplos de los cromatogramas de analisis por GMCS de estas bioconversiones en la figura 8. Para algunos de los sustratos ensayados, los productos podnan identificarse y se muestran en la figura 9.

Ejemplo 10

Oxidacion in-vitro de compuestos que utilizan P450 de vetiver

La oxidacion del sesquiterpeno utilizando P450 del vetiver tambien puede realizarse in-vitro utilizando lisados celulares o protema purificada parcialmente.

Se transformaron celulas de E. coli (BL21StarTM(DE3) (Invitrogen, Ltd) o JM109(DE3) (Promega)) con los plasmidos pCW-218-521-11 o pCW-218-521-16 o las celulas se co-transformaron con los plasmidos pCW-218-521-11 o pCW- 218-521-16 y pACYC-tcATR1-opt. Las condiciones del cultivo de las celulas, la expresion de las protemas y la preparacion de las protemas de la membrana fueron como se describio en los Ejemplos 4 y 5. Estas fracciones de la protema se utilizaron para la conversion in-vitro del (+)-zizaeno o las moleculas de terpeno enumeradas en el Ejemplo 9. Los ensayos tfpicos estan compuestos de 20 a 50 pl de protemas, 0,4 mg de nAdPH (sigma), FAD 5 pM (dinucleotido de flavina adenina, Sigma), FMN 5 pM (mononucleotido de flavina, Sigma), 0,05 mg de (+)-zizaeno en un volumen total de 1 ml del tampon Tris 100 mM de pH 7.4. En algunos ensayos, se anadio un sistema de reconstitucion de NADPH y consistio en 6-fosfato de glucosa 25 mM (Sigma) y 6 mUnidades de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (Sigma). Los ensayos se incubaron de 2 a 12 horas a 30 °C. Despues, las muestras se extrajeron dos veces con un volumen de acetato de etilo y se analizaron por CGEM como se describio en el ejemplo 8.

Utilizando su enfoque, se obtienen los mismos productos que cuando se utilizan las celulas de E. coli completas como se describio en los ejemplos 8 y 9.

Ejemplo 11

Produccion in-vivo de kusimol en celulas disenadas por ingenieria genetica

Los productos oxidados de (+)-zizaeno tambien pueden producirse en las celulas de E. coli disenadas por ingeniena genetica para producir sesquiterpenos a partir de una fuente de carbono tal como la glucosa o el glicerol. Se prepararon plasmidos que consistfan en el plasmido pCWori (Barnes H.J (1996) Method Enzymol. 272, 3-14) que contema un operon compuesto del P450, la P450-reductasa y la terpeno sintasa. Se prepararon dos plasmidos de este modo, mediante la insercion de una secuencia de RBS y la secuencia optimizada que codificaba para la (+)- zizaeno sintasa (VzZS) despues del codon de terminacion de la secuencia de CPR en el pCW-2391-521-11 o pCW- 2392-521-16.

El VzZS se amplifico a partir del plasmido pETDuet-VzZS-opt (como se describe en el documento WO 2010/134004) utilizando los cebadores 2401-VzZS-F (SEQ ID NO: 33) y 2401-VzZS-R (SEQ ID NO: 34). La PCR se realizo utilizando la Pfu ADN polimerasa (Promega, Madison, WI, Ee.UU.), en un volumen final de 50 pl que contema 5 pl del tampon 10X de la Pfu ADN polimerasa, 200 pM de cada dNTP, 0,4 pM de cada cebador, 2,9 unidades de la Pfu ADN polimerasa y 50 ng del molde. Las condiciones de ciclacion termica fueron como se indica a continuacion: 1,5 min a 95 °C; 30 ciclos de 45 s a 95 °C, 30 s a 60 °C y 4 min a 72 °C; y 10 min a 72 °C. Los productos de la PCR se purificaron y se unieron en los plasmidos pCW-218-521-11 o pCW-218-521-16 digeridos con las enzimas de restriccion de HindIII y EcorI. Esta union se realizo utilizando el Kit de Clonacion de PCR In-Fusion® Dry-Down (Clontech, Takara Bio Europe) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los plasmidos resultantes pCW-218-521- 11 y pCW-218-521-16 conteman un inserto que consistfa en las secuencias VzP521-11-1 o VzP521-16-1 respectivamente, la secuencia tcATR1-opt (P450 reductasa) y la secuencia VzZs ((+)-zizaeno sintasa) (figura 10).

Se preparo otro plasmido de expresion que contema dos operones que consistfan en los genes que codifican las enzimas para una via de mevalonato completa. Se sintetizo qmmicamente un primer operon sintetico que consistfa en los genes de una acetoacetil-CoA tiolasa de Escherichia coli (atoB), una HMG-CoA sintasa de Staphylococcus aureus (mvaS), una HMG-CoA reductasa de Staphylococcus aureus (mvaA) y una FPP sintasa de Saccharomyces cerevisiae (ERG20), (DNA2.0, Menlo Park, CA, eE.UU.) y se unio en el vector pACYCDuet-1 digerido con NcoI-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

BamHI (Invitrogen) produciendo el pACYC-29258. Los genes de este plasmido codificaban las enzimas necesarias para la conversion de la acetil-CoA en mevalonato y para una FPP sintasa. El segundo operon contema los genes que codifican las cuatro enzimas necesarias para la conversion del mevalonato en IPP y DMAPP y se amplifico a partir del plasmido pACYC-4506 (ejemplo 8) utilizando los siguientes cebadores: 5'- AAGGAGATATACATATGACAAAAAAAAGTTGGTGTCGGTCAGG-3' (directo) y 5'-

CTTTACCAGACTCGAGTTACGCCTTTTTCATCTGATCCTTTGC-3' (inverso). El amplicon resultante se clono en el vector pACYC-29258 digerido con NcoI-XhoI utilizando el Kit de Clonacion de PCR In-Fusion® Dry-Down (Clontech) proporcionando el vector pACYC-29258-4506.

Se co-transformaron celulas de E. coli de OverExpress™ C43(DE3) (Lucigen® Corporation) con el plasmido pACYC- 29258-4506 y el plasmido pCW-2401-521-11 o el plasmido pCw-2402-521-16. Se utilizaron colonias individuales de celulas transformadas para inocular 5 ml del medio de LB suplementado con carbenicilina (100 pg/ml) y cloranfenicol (17 pg/ml). Los cultivos se incubaron toda la noche a 37 °C y se utilizaron para inocular el medio M9 suplementado con 2 g/l de extracto de levadura, glicerol al 3 %, FeSO410 pM, carbenicilina 100 pg/ml y cloranfenicol 17 pg/ml. Los cultivos se incubaron 6h a 37 °C, se enfriaron gradualmente a 25 °C y se anadieron IPTG 1 mM, acido 8- aminolevulmico 74 pg/ml y 1/10 volumenes de dodecano. Despues de 48 horas, los cultivos se extrajeron con 2 volumenes de eter metil terc-butflico (MTBE) y los extractos se analizan por CGEM como se describio en el Ejemplo 8, excepto por la temperatura del horno que se fijo inicialmente a 80 °C con un minuto de retencion, seguido de un gradiente de 10 °C/min a 300 °C.

Se detectaron el sesquiterpeno (+)-zizaeno y el alcohol y el aldehfdo derivados (kusimol y zizanal). Tambien se encontro el acido zizanoico como producto minoritario (figura 11). Este experimento demuestra que, en las celulas disenadas por ingeniena genetica, el sesquiterpeno (+)-zizaeno es producido y es oxidado por el complejo de P450 y CPR heterologo.

Este ejemplo demuestra que una celula de E. coli transformada para expresar un polipeptido de acuerdo con la invencion es capaz de oxidar compuestos de terpeno tales como zizaeno, a condicion de que se utilice en combinacion con una P450 reductasa. Las otras enzimas con las que se transforma la celula de E. coli no son esenciales para dicha oxidacion. De hecho, el terpeno oxidado tambien se produce cuando se transforma una celula de E. coli con el citocromo P450, la reductasa y la terpeno sintasa solamente, pero en una cantidad inferior. Dichas otras enzimas con las que se transforma la celula de E. coli, se anaden con el fin unico de aumentar la cantidad de terpeno disponible como sustrato para el citocromo P450.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Firmenich SA

<120> Citocromo P450

<130> 8520-PCT

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211>472 <212> PRT

<213> Vetiveria zizanoides <400> 1

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos al menos en un 85 % identica a la SEQ ID NO: 1 o 2 y que tiene una actividad de citocromo P450 caracterizado porque el polipeptido es capaz de oxidar al menos un compuesto de terpeno seleccionado entre monoterpenos y sesquiterpenos mono o polidclicos.
2. 2. El polipeptido de la reivindicacion 1, caracterizado porque el monoterpeno o sesquiterpeno mono o polidclico comprende al menos un grupo metilo como sustituyente en una porcion dclica.
3. 3. El polipeptido de la reivindicacion 2, caracterizado porque el monoterpeno o sesquiterpeno mono o polidclico se selecciona entre el grupo que consiste en zizaeno, alfa-cedreno, alfa-longipineno, alfa-funebreno, tujopseno, valenceno, beta-chamigreno, aloaromadendreno, alfa-neocloveno, isosativeno, ledeno, S-limoneno, alfa-humuleno, alfa-gurjuneno, alfa-pineno, beta-funebreno, R-limoneno y beta-pineno.
4. 4. El polipeptido de la reivindicacion 3, caracterizado porque el monoterpeno o sesquiterpeno mono o polidclico se selecciona entre el grupo que consiste en zizaeno, alfa-cedreno, alfa-funebreno, valenceno y tujopseno.
5. 5. Un acido nucleico que codifica el polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. 6. El acido nucleico de la reivindicacion 5, que comprende una secuencia de nucleotidos al menos en un 90 % identica, en su longitud completa, a la SEQ ID NO: 3, 4 o el complemento de las mismas.
7. 7. Un vector de expresion que comprende el acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6 en el que el vector esta en la forma de un vector viral, un bacteriofago o un plasmido.
8. 8. Un organismo o una celula hospedadores no humanos que comprenden al menos un acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, o un vector de expresion de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que el organismo hospedador no humano es un procariota, un hongo o un microorganismo.
9. 9. El organismo hospedador no humano de la reivindicacion 8, en el que dicho microorganismo es una bacteria o levadura.
10. 10. El organismo hospedador no humano de la reivindicacion 9, en el que dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.
11. 11. Una planta o celula vegetal que comprende un vector de expresion de acuerdo con la reivindicacion 7.
12. 12. Un procedimiento para oxidar al menos un compuesto de terpeno que comprende:

    a) poner en contacto dicho compuesto de terpeno con al menos un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en presencia de una P450 reductasa (CPR);

    b) opcionalmente, aislar el terpeno oxidado producido en la etapa a).
13. 13. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que dicho compuesto de terpeno se selecciona entre monoterpenos y sesquiterpenos mono o polidclicos.
14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 13, en el que dicho compuesto de terpeno se selecciona entre el grupo que consiste en zizaeno, alfa-cedreno, alfa-longipineno, alfa-funebreno, tujopseno, valenceno, beta-chamigreno, aloaromadendreno, alfa-neocloveno, isosativeno, ledeno, S-limoneno, alfa-humuleno, alfa-gurjuneno, alfa-pineno, beta-funebreno, R-limoneno y beta-pineno.
15. 15. El procedimiento de la reivindicacion 14, caracterizado porque el compuesto de terpeno se selecciona entre el grupo que consiste en zizaeno, alfa-cedreno, alfa-funebreno, valenceno y tujopseno.

    imagen1

    Figura 1

    (+)-zizaeno

    kusimol

    zizanal acido zizanoico

    alfa-cedreno longipineno

    beta-funebreno

    alfa-funebreno

    tujopseno

    valenceno aloaromadendreno chamigreno

    alfa-neocloveno isosativeno alfa-copaeno alfa-gurieneno

    alfa-humuleno

    -)-hmoneno (+)-limoneno

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    gamma-gurjuneno alfa-pineno beta-pineno

    Figura 2

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    Figura 2 (continuacion)

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    Afcundancia

    Figura 6

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    Abundancia Abundancia Abundancia

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    Figura 9

    alfa-cedreno

    tujopseno

    limoneno

    alfa-pineno

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    Figura 11

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