ES2625538T3 - Composiciones de proteínas estabilizadas basadas en alcanos semifluorados - Google Patents

Abstract

Composición que comprende un compuesto bioactivo y un vehículo líquido, en donde el vehículo líquido comprende un alcano semifluorado de la fórmula: RFRH en donde RF es un segmento de hidrocarburo perfluorado lineal de 4 a 12 átomos de carbono y en donde RH es un grupo alquilo lineal de 4 a 8 átomos de carbono; y en donde el compuesto bioactivo es un agente terapéutico o de diagnóstico o una vacuna, seleccionado de polipéptidos y proteínas que tienen un peso molecular de al menos 1.500 Da, en donde el compuesto bioactivo se suspende en el vehículo líquido y en donde la composición está en forma de una suspensión.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Composiciones de protemas estabilizadas basadas en alcanos semifluorados Campo

La presente invencion pertenece al campo de las composiciones de peptidos y protemas, en particular composiciones que son utiles como formulaciones farmaceuticas de polipeptidos o protemas para uso terapeutico o de diagnostico.

Antecedentes

En los ultimos anos han surgido clases nuevas de agentes biofarmaceuticos terapeuticos basados en peptidos y protemas dirigidos a enfermedades anteriormente intratables o incurables, como consecuencia de los muchos nuevos avances y desarrollos que han surgido en el campo de la biotecnologfa.

Sin embargo, debido a su deficiente biodisponibilidad oral y en general a sus cortas vidas medias in vivo, el metodo de suministro de muchas de las protemas y polipeptidos terapeuticos desarrollados hasta ahora ha sido restringido principalmente a la via parenteral. Todos los anticuerpos monoclonales humanos (una clase rapidamente creciente de agentes terapeuticos dirigidos) que estan aprobados actualmente requieren la administracion por inyeccion. Por ejemplo, adalimumab (Humira™, comercializada por Abbott), un anticuerpo monoclonal humano indicado primero para el tratamiento de la artritis reumatoide, se presenta en una jeringa pre-rellenada. En la actualidad solo estan disponibles comercialmente unas pocas composiciones terapeuticas orales, mucosales o inhalables, muchas de las cuales incorporan solo agentes de polipeptido de peso molecular relativamente mas bajo. Un ejemplo de un agente terapeutico de protema de peso molecular mas alto suministrado por via de inhalacion es dornase alfa (Pulmozyme™, distribuido por Roche), una disolucion de desoxirribonucleasa I humana recombinante, indicada para el tratamiento de la fibrosis qmstica.

El simple peso molecular y complejidad de las protemas y polipeptidos asf como la relativa facilidad para perder su actividad por dano en su integridad estructural, presentan un desaffo para el procesamiento, formulacion y suministro de estos tipos de agentes terapeuticos.

La actividad biologica de una protema es dictada por su estructura tridimensional de clase a unica; por sus estructuras secundaria y terciaria. Lo que contribuye a la estructura final de una protema plegada en su estado nativo es una combinacion espedfica y equilibrada de interacciones internas, tales como enlaces de hidrogeno, interacciones electrostaticas, fuerzas de van der Waals, interacciones hidrofobicas y enlaces covalentes entre los componentes de la cadena peptfdica que abarcan la protema. Los cambios marginales de estas interacciones pueden tener potencialmente un gran impacto sobre la integridad estructural de una protema. La funcion biologica precisa de una protema se basa en sus interacciones espedficas con otras macromoleculas relevantes y/o moleculas pequenas. Consecuentemente, se perdera la especificidad y por lo tanto la eficiencia terapeutica de una protema si las caractensticas tridimensionales esenciales son interrumpidas de cualquier manera.

La perdida de la estructura de protema nativa puede ocurrir por varias rutas de degradacion. Puede ocurrir agregacion por medio de eventos de union no covalente, tales como la autoasociacion de monomeros de protema nativa, o la asociacion de protemas parcialmente no plegadas para formar oligomeros no nativos. El deterioro y la agregacion de una protema tambien puede ocurrir mediante eventos qrnmicos covalentes irreversibles, tales como la formacion y/o intercambio de enlaces disulfuro de reticulacion, hidrolisis de enlaces de peptido, desamidacion, u oxidacion. El predominio de estos fenomenos no solo depende de las caractensticas inherentes de la protema, sino tambien de varias condiciones fisicoqmmicas ambientales tales como la temperatura, que incluyen condiciones de estres relacionadas como los ciclos de congelacion-descongelacion, pH, concentracion de protema, fuerza ionica, la presencia de aditivos qrnmicos desestabilizadores, sequedad y factores de estres mecanicos tales como cavitacion o cizalla, todos los cuales pueden tener un impacto negativo sobre la estructura plegada nativa de la protema.

La asociacion de la protema en tales formas oligomericas, frecuentemente de peso molecular alto, presenta un problema importante en la formulacion, suministro y almacenamiento a largo plazo de agentes terapeuticos de protema o polipeptido. La agregacion puede llevar a la perdida del farmaco de protema activa, resultando en dosificaciones poco fiables e ineficaces. En las formulaciones lfquidas, los agregados que pueden ser insolubles pueden precipitar y formar partmulas grandes que pueden impedir el flujo, lo que sena muy desfavorable para aplicaciones parenterales. Ademas, los agregados de protema pueden exhibir toxicidad y desencadenar respuestas inmunogenicas indeseables (Rosenberg, A.S., AAPS J, 2006, 8, E501). Asf, las caractensticas del medio elegido para una formulacion lfquida de protema o polipeptido pueden tener un impacto importante sobre la practicabilidad y longevidad de una formulacion.

Se sabe que un medio acuoso es importante en la mayona de los casos para el mantenimiento de la estructura y bioactividad de la protema, es decir, las moleculas de agua pueden ser esenciales o incluso la fuerza impulsora para el pliegue, y/o pueden tener una funcion directa en la actividad enzimatica. Por otra parte, un medio acuoso puede tener tambien un efecto adverso, dependiendo de la naturaleza de la composicion de la fase acuosa y varios parametros tales como el pH y la fuerza ionica. El agua puede actuar como un plastificante o servir como el medio

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

de reaccion, as^ como directamente como un componente de reaccion, tal como en la escision hidrolftica de enlaces de amida. De esta manera, un metodo que ha sido usado sustancialmente en el campo de la formulacion de agentes terapeuticos de protema es la liofilizacion (criodesecado), o el secado por pulverizacion de la protema para obtener una forma de polvo en estado solido. En este caso, la eliminacion de agua restringe la flexibilidad conformacional y movilidad difusiva de la macromolecula de protema para interactuar con otras, disminuyendo asf las probabilidades de agregacion. Consecuentemente, con las protemas en estado seco es factible un almacenamiento por un tiempo sustancialmente mas largo en comparacion con muchas formulaciones acuosas.

Sin embargo, debe senalarse que la degradacion y agregacion de la protema puede ocurrir muy facilmente durante el proceso mismo de liofilizacion, y asf, para disminuir la incidencia de estos eventos, el tiempo invertido y los costes para desarrollar el proceso de liofilizacion son necesariamente muy altos. Tambien, frecuentemente se anaden a la composicion, antes de la liofilizacion, estabilizadores adicionales tales como sacaridos, polioles y similares, que sirven para compensar el efecto de la perdida de enlaces de hidrogeno del agua. Estos excipientes, aunque son utiles durante el proceso de liofilizacion, pueden ser nocivos para la estabilidad en el tiempo de la protema en estado seco, por ejemplo por separacion de fases mediante cristalizacion. Tambien puede ser necesario incluir otros excipientes estabilizadores despues de la liofilizacion para sostener la mayor duracion en almacenamiento de la protema, anadiendose al numero de componentes que tienen que estar presentes en la formulacion final.

Tambien, a pesar de la eliminacion de agua, las composiciones de protema en estado seco no son inmunes a los efectos de los factores ambientales externos, tales como la temperatura y las reacciones de degradacion qmmica en donde el agua no es un reactivo clave, tales como desamidacion u oxidacion. Las temperaturas elevadas producen movilidad aumentada y consecuentemente una probabilidad mayor que reacciones inter-protema; de esta manera, muchas protemas liofilizadas todavfa tienen que ser almacenadas todo el tiempo en condiciones de refrigeracion. Tambien, los excipientes anadidos para hacer el pH y la tonicidad de la formulacion mas adecuados para el proceso de liofilizacion, pueden desestabilizar a la protema en el estado seco final. La introduccion de humedad puede ser un problema, y se debe poner atencion particular a los medios (y tambien el material) de almacenamiento de las protemas en estado solido seco.

Ademas, es necesaria la reconstitucion de la protema liofilizada en un medio acuoso como una etapa extra antes de la administracion real, y conlleva el riesgo de manejo/dosificacion inapropiada y contaminacion. La propia etapa de reconstitucion puede desencadenar la agregacion de protemas, si el pH o temperatura del medio acuoso no es optimo, o el tiempo para una rehidratacion apropiada es demasiado corto. De esta manera, tambien es necesario considerar y desarrollar apropiadamente una formulacion de un medio de reconstitucion adecuado. En general, desde un punto de vista economico, para el desarrollo del proceso y de una formulacion de protema liofilizada se tiene que invertir una cantidad significativamente grande de tiempo, esfuerzo y costes, en comparacion con las formulaciones lfquidas (Wang, W., Int. J. Pharm., 2000, 203, 1).

El uso de disolventes organicos como medios de vehmulo es otra opcion para formular agentes terapeuticos de protema. Sin embargo, se debena senalar que dichos disolventes no siempre tienen un efecto estabilizador sobre la estructura de la protema; en algunos casos es mas bien lo opuesto. Por ejemplo, a concentraciones mas altas, los disolventes fuertemente polares como DMSO o DMF, y los alcoholes como metanol o etanol, pueden actuar como desnaturalizantes, frecuentemente compitiendo con enlaces de hidrogeno de amida internos, lo que puede llevar a la perdida de las estructuras terciarias; incluso se puede alterar la proporcion de estructuras secundarias, llevando posiblemente a estructuras no nativas (Stevenson, C.L., Curr. Pharm. Biotech., 2000, 1, 165). Consecuentemente, estos disolventes pueden no ser ideales para el almacenamiento a largo plazo de agentes terapeuticos de protema. Similarmente, la tolerancia fisiologica de estos tipos de disolventes puede ser baja, y es necesario tener en consideracion aspectos adicionales en cuanto a la liberacion y adsorcion de la protema (tambien dependiendo del estado de su solubilidad en tales sistemas disolventes).

A menudo las formulaciones terapeuticas de protema en medios acuosos estan disponibles simplemente en forma de una disolucion. Por otra parte, las formulaciones que usan disolventes organicos requieren una consideracion adicional debido a la solubilidad general parcial o no parcial de la protema en tales medios, dependiendo de la polaridad del disolvente y las propiedades ffsicas de la protema. La combinacion de disolventes organicos hidrofobos y la protema sin agua (liofilizada) usualmente produce dispersiones o suspensiones. En estos casos, la estabilidad ffsica a largo plazo de la suspension tambien es una consideracion importante durante el desarrollo de la formulacion, junto con la estabilidad a largo plazo de la protema misma. Se ha informado del uso de disolventes no polares, tales como aceites y lfpidos, como vehmulos de suspension para protemas o polipeptidos para uso parenteral; sin embargo, la estabilidad de estos vehmulos a las temperaturas fisiologicas durante periodos prolongados ha sido cuestionada (Knepp, V.M., et al., Pharm. Res. 1998, 15, 1090). Ademas, estos compuestos pueden causar efectos secundarios, tales como dolor en el sitio de la inyeccion. Tambien, los aceites y lfpidos tienden a retardar fuertemente la liberacion del agente terapeutico. Esta puede ser una caractenstica util para hacer formulaciones inyectables de liberacion sostenida prolongada o de tipo de deposito, pero no si se desea una biodisponibilidad mas rapida e inmediata.

Tambien se han descrito composiciones basadas en polfmero, por ejemplo se han reportado formulaciones de suspension viscosas no acuosas de agentes de protema o peptido, adecuadas para usarse en conjunto con un dispositivo implantable, que comprende polivinilpirrolidona como componente polimerico y lactado de laurilo (o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

alcohol launlico) como disolvente (documentos de patente US7258869 y EP1152749). Se ha sugerido que estas composiciones son adecuadas para la liberacion sostenida de tales agentes terapeuticos.

Tambien se han usado compuestos perfluorados como vehmulos Kquidos no acuosos de protemas, polipeptidos y otros agentes biologicamente activos. Por ejemplo, el documento de patente US6458376 describe composiciones propuestas para aplicaciones oftalmicas (tales como gotas oftalmicas aplicadas topicamente) en las que los compuestos terapeuticos/de diagnostico, que incluyen oligopeptidos y factores de crecimiento de protema, se suspenden en perfluorocarburos y en presencia de por lo menos un agente tensioactivo. Sin embargo, no dice nada sobre el sujeto de la eleccion de agentes tensioactivos particulares que pueden ser adecuados para usarse en las composiciones que contienen compuestos terapeuticos de protema o peptido, y no hay discusion de la estabilidad qrnmica y ffsica a largo plazo de tales compuestos particulares en estas formulaciones en el tiempo.

El documento de patente EP0939655 (y US6730328) revela formulaciones termicamente estables en las que se usan vehmulos no acuosos, hidrofobos, no reactivos, tales como aceite mineral, perfluorodecalina, metoxifluorano, perfluorotributilamina o tetradecano, para composiciones en suspension que comprenden protemas, compuestos proteinaceos y acidos nucleicos. Las formulaciones se proponen para metodos de administracion parenteral, transdermica, mucosal, oral y enterica, asf como tambien su uso para la administracion continua a largo plazo y suministro por medio de un dispositivo implantable. Sin embargo, no se ha descrito la capacidad de estas composiciones en suspension para permanecer ffsicamente estables, es decir, uniformemente dispersas o redispersables despues de un periodo de tiempo. Tampoco ha sido demostrada la compatibilidad real tisular de estos tipos de composiciones.

El documento de patente US 2010/0008996 menciona el uso por inhalacion o instilacion de SFAs como vehmulos para el transporte de una sustancia activa a la membrana alveolar/regiones del pulmon de un paciente. Mas en detalle, el documento muestra disoluciones coloidales micelares de sustancias activas que exhiben solubilidad suficiente en SFAs, y cuyas moleculas tienen un tamano en la escala de 1 a 0,1 nm para facilitar el transporte a traves de la membrana del pulmon hacia la corriente sangumea. Describe composiciones basadas en SFA de los farmacos moleculares pequenos, ibuprofeno, alfa-tocoferol, palmitato de retinol, 5-fluorouracilo, bromohexina, oseltamivir y ambroxol, que se describe que son utiles para inhalacion o instilacion. En contraste, no describe ninguna composicion espedfica de una sustancia activa que sea una molecula mas grande, tal como una protema, o de una sustancia activa que no sea soluble en SFAs.

El documento de patente WO 2011/073134 describe similarmente disoluciones que comprenden ciclosporina, un polipeptido dclico con peso molecular de 1202,61 en un alcano semifluorado, opcionalmente en presencia de un codisolvente como etanol. Aunque tambien se mencionan suspensiones y emulsiones como alternativas opcionales, no hay divulgacion espedfica de tales tipos de composicion.

Kociok et al. (Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 2005, 243, 345-358) investigaron si la activacion de macrofago por medio de union a la membrana celular podna ser apoyada por gotitas emulsionadas de taponamiento de un cierto tamano de vesmula. Para este proposito, prepararon gotitas emulsionadas (referidas como vesmulas unilaminares) de F6H8 en una fase continua acuosa mediante la extrusion del alcano semifluorado a traves de membranas de filtro de policarbonato hacia una disolucion de PBS. Para determinar si la albumina de suero humano (HSA) tiene influencia sobre la activacion de neutrofilos de la sangre, algunas de las gotitas fueron recubiertas con HSA incluyendo HSA en la disolucion acuosa de PBS.

Un objeto de la presente invencion es presentar composiciones de protema o polipeptido nuevas que superan las limitaciones y desventajas asociadas con las formulaciones actualmente conocidas.

Compendio de la invencion

En un primer aspecto, la invencion proporciona composiciones novedosas de polipeptidos o protemas bioactivas en un vehmulo lfquido que comprende un alcano semifluorado de la formula RFRh, en donde RF es un segmento de hidrocarburo perfluorado lineal de 4 a 12 atomos de carbono, y en donde RH es un grupo alquilo lineal de 4 a 8 atomos de carbono.

El polipeptido o protema bioactiva tiene un peso molecular de al menos 1.500 Da, en particular al menos aproximadamente 2.000 Da, y se incorpora en la composicion para formar una suspension. El polipeptido o protema es un agente terapeutico o diagnostico o una vacuna.

El compuesto bioactivo es preferiblemente un polipeptido o protema que es sensible a la degradacion y/o agregacion. Los inventores han encontrado que el uso de un alcano semifluorado produce dispersiones o suspensiones de protemas mas estables tales como insulina, en comparacion con otros disolventes organicos. En conjunto, tambien se ha establecido que los alcanos semifluorados tienen un efecto estabilizador notable sobre tales compuestos, y que las protemas sensibles como la insulina incluso pueden ser sometidas a temperaturas sustancialmente elevadas sin perdida de bioactividad por agregacion y/o degradacion.

Los alcanos semifluorados particularmente utiles se seleccionan del grupo que consiste en F4H5, F4H6, F4H8, F6H4, F6H6, F6H8 y F6H10, de acuerdo con la terminologfa que se define mas abajo en la presente memoria. Estos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

alcanos semifluorados son bien tolerados por los tejidos, son capaces de disolver una gama amplia de excipientes adicionales que pueden ser requeridos en las composiciones farmaceuticas, y forman - probablemente debido a su anfifilicidad inherente - dispersiones o suspensiones farmaceuticamente ventajosas con polipeptidos y protemas.

En un aspecto, las composiciones de protema o polipeptido de la presente invencion son qmmica y ffsicamente estables a temperatura ambiente, e incluso a temperatura elevada (por ejemplo a alrededor de 37°C, o temperatura fisiologica), con lo cual es retenida la bioactividad del agente de protema o peptido y hay una agregacion insignificante del agente terapeutico. En un aspecto adicional, las composiciones en suspension de protema o polipeptido de la presente invencion tambien permanecen monodispersas y/o pueden ser facilmente redispersadas despues de almacenamiento a temperatura elevada (por ejemplo alrededor de 37°C, o la temperatura fisiologica).

Ademas, la invencion provee usos medicos de tales composiciones, asf como tambien metodos para estabilizar polipeptidos o protemas que son sensibles a la degradacion y/o agregacion, dichos metodos incluyen la incorporacion del polipeptido o protema en un vehmulo lfquido que comprende un alcano semifluorado como se define anteriormente.

Descripcion detallada de la invencion

En un primer aspecto, la invencion provee una composicion que comprende un compuesto bioactivo y un vehmulo lfquido. El compuesto bioactivo se selecciona de agentes terapeuticos o diagnosticos o vacunas que son polipeptidos y protemas. Preferiblemente, el polipeptido o protema tiene un peso molecular de por lo menos aproximadamente 1,500 Da, en particular por lo menos aproximadamente 2,000 Da. El vehmulo lfquido comprende un alcano semifluorado de la formula RFRH, en donde RF es un segmento de hidrocarburo perfluorado lineal de 4 a 12 atomos de carbono, y en donde RH es un grupo alquilo lineal de 4 a 8 atomos de carbono. Ademas, el compuesto bioactivo se incorpora en la composicion a fin de formar una dispersion o suspension; es decir, el compuesto bioactivo se dispersa o suspende en el vehmulo lfquido.

Los alcanos semifluorados son vehmulos muy ventajosos desde la perspectiva farmaceutica: en primer lugar, son sustancialmente no toxicos, es decir, son bien tolerados por varios tipos de tejido humano y animal despues de administracion topica o inyeccion. En segundo lugar, son qmmicamente inertes y muestran poca interaccion perjudicial con ingredientes activos o inactivos de las formulaciones farmaceuticas. En tercer lugar, probablemente debido a su grado inherente de anfifilicidad son capaces de disolver una amplia gama de compuestos, tales como ingredientes activos moleculares pequenos o muchos excipientes comunes que son utiles en las formulaciones farmaceuticas. En cuarto lugar, cuando se incorporan compuestos que no son solubles o solo son muy escasamente solubles en alcanos semifluorados (tales como muchos polipeptidos y protemas), forman dispersiones o suspensiones con propiedades ffsicas o farmaceuticas muy utiles, es decir, con poca o ninguna tendencia a formar sedimentos solidos, no dispersables.

Los inventores han encontrado que las dispersiones y suspensiones de protema en alcanos semifluorados son sorprendentemente estables. Permanecen finamente dispersos y homogeneos, y si se produce flotacion o sedimentacion, generalmente lo hace lentamente, dejando tiempo suficiente para que el paciente o asistente de salud retire una dosis despues de agitar el recipiente (por ejemplo, vial) que sostiene la formulacion. No se observa la formacion de agregados grandes escasamente redispersables, y despues de flotacion o sedimentacion las partmulas de protema se redispersan facilmente sin perdida significativa agitando suavemente, y parecen retener en buena parte su distribucion de tamano de partfcula original.

Esto esta en claro contraste con otros vehmulos lfquidos qmmicamente inertes, tales como perfluorocarburos, que se han propuesto como vehmulos para medicinas, por ejemplo en US 5,518,731 y US 6,458,376. Los inventores han encontrado que cuando se usan compuestos perfluorados como vehmulos lfquidos, tales como perfluorooctano o perfluorodecalina, u otros disolventes organicos como octano, las suspensiones tienden a ser significativamente mas inestables, es decir, se separan muy rapidamente por flotacion de la fase dispersa, o por su sedimentacion, dependiendo de las densidades relativas de la fase dispersa y de la fase continua. Esto va acompanado por una formacion rapida de agregados de partmulas que pueden ser densos y escasamente redispersables. La flotacion o sedimentacion rapida hace que la dosificacion precisa y reproducible sea un reto, si no imposible. Por ejemplo, si una suspension inyectable u oftalmica se sedimenta muy rapidamente despues de agitar, la primera dosis tomada de un recipiente lleno (por ejemplo, un vial), si no se retira inmediatamente despues de la agitacion, contendra un numero de partmulas de farmaco menor al deseado, a menos que el recipiente se mantenga boca abajo, en cuyo caso se dispensara mas de la cantidad deseada de partmulas de farmaco. Cuando el mismo recipiente esta casi vacfo y se dispensan las ultimas dosis, la dosis de farmaco retirada por volumen sera demasiado alta si fue baja al comienzo, y viceversa.

Ademas, la formacion de agregados de protemas grandes y escasamente redispersables en vehmulos perfluorados u otros disolventes organicos como octano conduce potencialmente a la obstruccion de las agujas finas de las inyecciones como las que se usan para inyeccion subcutanea. Existe el riesgo de que las partmulas grandes induzcan reacciones adversas en el cuerpo, en particular procesos de inflamacion.

Tambien se observo que las partmulas suspendidas en compuestos perfluorados u octano tienden a adherirse a las

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

paredes del recipiente vial de vidrio y/o la aguja-jeringa usada para retirar una dosis. Esto tambien llevana a interferir con la dosificacion precisa.

Las propiedades ventajosas de las suspensiones basadas en SFA dan como resultado una calidad farmaceutica y caractensticas de desempeno superiores. El grado de conveniencia para el paciente y/o proveedor de servicios de salud aumenta considerablemente. Mas importante, la exactitud de la dosificacion, es decir, la precision y reproducibilidad de la dosificacion, mejoran considerablemente sobre otros tipos de suspensiones farmaceuticas. Esto producira un efecto terapeutico mas fiable y un menor riesgo de efectos adversos resultantes de sobredosificacion.

Al mismo tiempo, los alcanos semifluorados tienen un efecto estabilizador notable sobre polipeptidos y protemas. Previenen o inhiben sustancialmente la agregacion de protema y reducen significativamente la degradacion qmmica. De hecho, se ha encontrado que algunas protemas sensibles son estabilizadas a tal grado que, cuando se incorporan dentro de un alcano semifluorado, se pueden exponer a temperaturas altas, tales como 50°C sin perdida de su bioactividad. Las ventajas clave de la presente invencion son producidas por la presencia de un alcano semifluorado en la composicion, que funciona como un vehmulo lfquido. Los alcanos semifluorados son alcanos lineales o ramificados algunos de cuyos atomos de hidrogeno han sido reemplazados por fluor. En los alcanos semifluorados (SFAs) usados en la presente invencion, esta presente un segmento de hidrocarburo lineal no fluorado y un segmento de hidrocarburo lineal perfluorado. Asf, estos compuestos siguen la formula general F(CF2)n(CH2)mH. De acuerdo con la presente invencion, n se selecciona del intervalo de 4 a 12, y m se selecciona del intervalo de 4 a 8.

Una nomenclatura que se usa frecuentemente para SFAs designa un segmento de hidrocarburo perfluorado como RF, y un segmento no fluorado como RH. Alternativamente, los compuestos pueden ser referidos como FnHm y FnHm, respectivamente, en donde F significa un segmento de hidrocarburo perfluorado, H significa un segmento no fluorado. Nuevamente n y m definen el numero de atomos de carbono del segmento respectivo. Por ejemplo, F3H3 se usa para perfluoropropilpropano. Ademas, este tipo de nomenclatura usualmente se utiliza para compuestos que tienen segmentos lineales. Por lo tanto, a menos que se indique de otra manera, se debe asumir que F3H3 significa 1-perfluoropropilpropano, en lugar de 2-perfluoropropilpropano, 1-perfluoroisopropilpropano o 2- perfluoroisopropilpropano.

Los SFAs que son utiles en el contexto de la presente invencion tambien se describen en los documentos EP-A 965 334, EP-A 965329 y EP-A 2110126, haciendose referencia en la presente memoria a la divulgacion de tales documentos.

Los SFAs preferidos incluyen en particular los compuestos F4H5, F4H6, F4H8, F6H4, F6H6, F6H8 y F6H10. Para realizar la invencion se prefiere particularmente F4H5, F4H6, F6H6 y F6H8. En otra realizacion particularmente preferida, la composicion de la invencion comprende F6H8.

Opcionalmente, la composicion puede comprender mas de un SFA. Puede ser util combinar SFAs, por ejemplo para obtener una propiedad objetivo particular, tal como un cierto grado de densidad o viscosidad. Si se usa una mezcla de SFAs, se prefiere adicionalmente que la mezcla comprenda por lo menos uno de F4H5, F4H6, F6H4, F6H6, F6H8 y F6H10, y en particular uno de F4H5, F4H6, F6H6 y F6H8. En otra realizacion, la mezcla comprende por lo menos dos miembros seleccionados de F4H5, F4H6, F6H4, F6H6, F6H8 y F6H10, y en particular por lo menos dos miembros seleccionados de F4H5, F6H6 y F6H8.

Los SFAs lfquidos son qmmica y fisiologicamente inertes, incoloros y estables. Sus densidades tfpicas vanan de 1,1 a 1,7 g/cm3, y su tension superficial puede ser tan baja como 19 mN/m. Los SFAs del tipo RFRH son insolubles en agua pero tambien un poco anfifflicos, con lipofilicidad creciente que se correlaciona con un tamano creciente del segmento no fluorado.

Los SFAs lfquidos del tipo RFRH se usan comercialmente para desdoblar y reaplicar una retina, para taponamiento a largo plazo como sustituto del humor vttreo (H. Meinert et al., European Journal of Ophthalmology, volumen 10(3), p. 189-197, 2000), y como soluciones de lavado para aceite de silicon residual despues de cirugfa vftreo-retinal. Experimentalmente, tambien se han usado como sustitutos de sangre (H. Meinert et al., Biomaterials, Artificial Cells, and Immobilization Biotechnology, volumen 21(5), p. 583-95, 1993). Estas aplicaciones han establecido a los SFAs como compuestos fisiologicamente bien tolerados. Por otra parte, los SFAs no se han usado como excipientes en los productos farmaceuticos aprobados hasta la fecha.

La composicion de la invencion comprende un compuesto bioactivo seleccionado del grupo de polipeptidos o protemas. Los polipeptidos y protemas representan polfmeros de unidades de aminoacido que se unen entre sf mediante enlaces peptfdicos. Puesto que los lfmites de tamano que se usan frecuentemente para diferenciar entre polipeptidos y protemas son un poco arbitrarios, las dos expresiones para estas moleculas no debenan entenderse - dentro del contexto de la presente invencion - como mutuamente exclusivas: un polipeptido tambien puede ser referido como una protema, y viceversa. Tfpicamente, el termino “polipeptido” se refiere solamente a una sola cadena de polfmero, mientras que la expresion “protema” tambien se puede referir a dos o mas cadenas de polipeptido que estan unidas entre sf mediante enlaces no covalentes. El compuesto bioactivo de acuerdo con la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

invencion tiene un peso molecular de al menos 1.500 Da, en particular al menos aproximadamente 2.000 Da.

Como se describe anteriormente con mas detalle, la bioactividad de polipeptidos y protemas no solo reside en su estructura qmmica primaria, es dedr, su secuencia de aminoacidos, sino tambien en su estructura secundaria y terciaria, a menudo tambien en su estructura cuaternaria. A menudo la sensibilidad de un polipeptido o protema a la degradacion tambien esta relacionada con su estructura secundaria, terciaria o incluso cuaternaria. Los polipeptidos y protemas que se beneficiaran de las presentes invenciones incluyen compuestos tanto qmmicamente inestables, por ejemplo compuestos que son propensos a hidrolisis, como tambien compuestos que tienen la tendencia de perder rapidamente su estructura secundaria o superior, y/o desnaturalizarse. En particular, la composicion comprende un polipeptido o protema que es sensible a la degradacion y/o agregacion.

Tfpicamente tal sensibilidad significa que el compuesto respectivo no puede ser formulado como una formulacion lfquida en medios acuosos comunes (p. ej., lista para usarse por inyeccion), incluso cuando se incorporan excipientes estabilizadores (tales como disoluciones tampon, etc.), y almacenarse bajo condiciones normales. De esta manera, las formulaciones farmaceuticas de compuestos sensibles, para tener una duracion aceptable (tfpicamente de al menos 2 anos) se deben bien refrigerar durante el almacenamiento o se deben proveer en una forma seca de la que se reconstituyen antes de usarse. En particular, “sensible” significa que el compuesto respectivo pierde al menos aproximadamente 5% de su bioactividad en menos de 1 ano de almacenamiento en condiciones normales cuando se formula en un vehroulo acuoso optimizado.

En una realizacion preferida, el polipeptido o protema es un compuesto terapeutico o diagnostico o una vacuna. Como se usa en este documento, un compuesto terapeutico es un compuesto que es util para prevenir una enfermedad o afeccion, aliviar cualquier smtoma de una enfermedad o afeccion, mejorar cualquier enfermedad o afeccion, retrasar el avance de una enfermedad o afeccion, o similares. Un compuesto diagnostico es util para determinar el estado de un organismo, o para diagnosticar una enfermedad, afeccion, smtoma o fenotipo de un paciente. El compuesto terapeutico se debe administrar al paciente, mientras que el agente diagnostico se puede usar in vivo o in vitro, dependiendo del caso espedfico. Para evitar dudas, el compuesto terapeutico o diagnostico se incorpora dentro de la composicion de la invencion en una cantidad terapeuticamente o diagnosticamente eficaz.

Los inventores tambien han encontrado que el efecto estabilizador de los alcanos semifluorados sobre la actividad qmmica o biologica es muy pronunciado si el compuesto bioactivo es un polipeptido o protema en el intervalo de tamano molecular de bajo a medio para agentes terapeuticos y diagnosticos de esta clase. En una realizacion espedfica, el peso molecular del agente bioactivo esta en el intervalo de aproximadamente 2.000 Da a aproximadamente 100.000 Da. En una realizacion adicional, el peso molecular esta en la escala de aproximadamente 1.000 Da a aproximadamente 60.000 Da. En realizaciones adicionales, esta en la escala de aproximadamente 2.000 Da a aproximadamente 60.000 Da, o de aproximadamente 5.000 Da a aproximadamente 50.000 Da, respectivamente. Por otra parte, el beneficio de estabilidad ffsica y/o facil redispersabilidad de la dispersion o suspension tambien se obtiene facilmente con polipeptidos y protemas de peso molecular relativamente grande, tales como albumina de suero (aproximadamente 67 kDa), o incluso con protemas de mas de 100.000 Da. En una realizacion espedfica adicional, el agente bioactivo es una protema de un solo dominio o una protema de dos dominios. Esto se basa en el descubrimiento de los inventores de que el efecto estabilizador de los alcanos semifluorados tambien es muy pronunciado en combinacion con tales protemas que tienen solo uno o dos dominios. Como se usa en la presente memoria, un dominio de protema es una parte de la secuencia de aminoacidos de la protema que forma una estructura compacta tridimensional que puede evolucionar, funcionar y existir un poco independientemente del resto de la cadena de protema. Los dominios pueden variar sustancialmente de longitud; sin embargo, en la mayona de los casos comprenden de aproximadamente 25 a aproximadamente 500 monomeros de aminoacido.

Opcionalmente, el agente bioactivo puede ser una enzima, hormona o factor de crecimiento, o una protema estructural. La composicion puede comprender una hormona terapeutica que sirve para reemplazar o complementar una hormona natural deficiente en un paciente. Ademas, opcionalmente la composicion puede comprender mas de un polipeptido o protema bioactiva.

En una realizacion opcional adicional, el agente bioactivo puede ser una protema que es recombinante o una protema que puede ser de una fuente derivada naturalmente o un peptido sintetizado. La protema tambien puede ser un conjugado de protema o un analogo de una protema natural y/o endogena.

De acuerdo con una realizacion adicional, la composicion comprende una insulina como agente bioactivo, en particular una insulina humana recombinante. Se encontro sorprendentemente que la insulina dispersa en un alcano semifluorado es muy estable y no se agrega incluso cuando se almacena a temperaturas sustancialmente elevadas, tales como aproximadamente 50°C.

Como se menciono, el polipeptido o protema se incorpora en la composicion para formar una dispersion o suspension. En otras palabras, el polipeptido o protema se suspende en el vehroulo lfquido. Que se forme una suspension dispersando la protema en el vehroulo lfquido depende por ejemplo de la naturaleza de la protema, su concentracion en el vehroulo y los SFAs seleccionados.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Como se usa en el presente documento, una suspension se puede definir como un tipo de dispersion, es dedr, un sistema que tiene al menos una fase continua (o coherente) y al menos una fase discontinua (o interna) que se dispersa en la fase continua. En una suspension, la fase dispersa esta en estado solido. Las suspensiones utiles para poner en practica la invencion son Kquidos, por lo menos a la temperatura fisiologica, lo que significa que la fase continua es un lfquido. Tfpicamente, las suspensiones tambien son lfquidas a temperatura ambiente. Aparte de las suspensiones, se entiende que el termino dispersion incluye sistemas coloidales en los cuales una protema y polipeptido esta finamente disperso en la fase lfquida. En algunas realizaciones, el polipeptido o protema tambien al menos parcialmente esta solvatado.

En una realizacion particular, la composicion comprende solo el polipeptido o protema bioactiva y uno o mas SFAs, es decir, la composicion consiste en el polipeptido o protema bioactiva y uno o mas de los SFAs que se definen anteriormente.

En contraste con algunas otras suspensiones conocidas de la tecnica anterior, las formulaciones de la invencion no requieren agente tensioactivo, o solo cantidades pequenas de agente tensioactivo para su estabilizacion ffsica. Esta es una ventaja significativa, ya que los agentes tensioactivos tienen un potencial sustancial de irritacion y toxicidad local, especialmente cuando se administran por inyeccion subcutanea o intramuscular o por instilacion en el ojo. De acuerdo con una de las realizaciones preferidas, las composiciones de la invencion estan sustancialmente libres de agente tensioactivo. En una realizacion adicional, la cantidad total de agente o agentes tensioactivos, si se incorpora mas de uno, no es mayor que aproximadamente 10% en peso, en particular no mayor que aproximadamente 5% en peso, o de preferencia no mayor que aproximadamente 2% en peso, respectivamente. En realizaciones preferidas adicionales, la cantidad es no mayor que aproximadamente 1% en peso, o no mayor que aproximadamente 0,5% en peso, respectivamente. En este contexto, se entiende que los SFAs descritos en la presente memoria, aunque tienen algunas propiedades anfifflicas debido a su estructura qrnmica que incluye grupos alquilo (o alquileno) fluorados o no fluorados caracterizados por diferentes grados de lipofilicidad, no se consideran dentro de los agentes tensioactivos.

Los agentes tensioactivos que estan ausentes o solo estan presentes en pequenas cantidades incluyen agentes tensioactivos no ionicos, cationicos, anionicos y zwiterionicos, usados comunmente como excipientes en varios tipos de composiciones farmaceuticas, por ejemplo como agentes de humectacion, emulsionantes, agentes dispersantes, solubilizantes y similares. Ejemplos de agentes tensioactivos que se consideran potencialmente utiles incluyen tiloxapol, poloxameros tales como Pluronic F68LF o Lutrol F68, Pluronic L-G2LF y Pluronic L62D, polisorbatos tales como polisorbato 20 y polisorbato 80, derivados de aceite de ricino de polioxietileno, esteres de sorbitan, estearatos de polioxilo, lecitinas, fosfolfpidos purificados o sinteticos, y mezclas de dos o mas de los mismos.

Las composiciones de la invencion pueden comprender opcionalmente un lfquido organico no fluorado, por ejemplo para modificar las propiedades del vehuculo lfquido, tales como la viscosidad. Este otro lfquido puede ser un aceite seleccionado de aceites de glicerido, ceras lfquidas y parafina lfquida, o un disolvente organico que exhibe un alto grado de biocompatibilidad, o una mezcla de mas de un excipiente lfquido.

Ejemplos de excipientes oleosos potencialmente utiles que se pueden usar en combinacion con uno o mas SFAs incluyen aceites de triglicerido (es decir, aceite de soja, aceite de oliva, aceite de cartamo, aceite de algodon, aceite de ricino, aceite de almendras dulces), aceite mineral (es decir, petrolato y parafina lfquida), trigliceridos de cadena media (MCT), acidos grasos oleosos, miristato de isopropilo, alcoholes grasos oleosos, esteres de sorbitol y acidos grasos, esteres de sacarosa oleosos, o cualquier otra sustancia oleosa que sea fisiologicamente tolerada por el ojo.

Ejemplos de disolventes organicos potencialmente utiles incluyen glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y etanol. Preferiblemente, la concentracion del codisolvente debena ser baja con respecto a la del SFA o la mezcla de SFA. Si se usa un disolvente organico como etanol, es recomendable mantenerla por debajo de un nivel de aproximadamente 5% en peso. Mas preferiblemente, el contenido de etanol es de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 2% en peso, y lo mas preferiblemente no mayor que aproximadamente 1% en peso.

Desde luego, la composicion puede comprender excipientes farmaceuticos adicionales segun se requiera o sea de utilidad. Los excipientes potencialmente utiles incluyen acidos, bases, antioxidantes, estabilizadores, agentes sinergicos, agentes colorantes, agentes espesantes, y - si se requiere en un caso particular - un conservante. Generalmente, sin embargo, la invencion provee un medio para formular composiciones no acuosas que son microbiologicamente estables. Esto se debe al hecho de que los SFAs normalmente no son susceptibles de contaminacion microbiana. Por lo tanto, es posible formular composiciones sin conservantes para llenar recipientes de uso multiple. Las composiciones son conservantes son mejor toleradas por muchos pacientes y permiten reducir los costos de los productos finales.

Las suspensiones lfquidas de la invencion se pueden preparar mediante metodos convencionales. En principio, las partmulas solidas que comprenden el ingrediente activo se pueden dispersar en el vehmulo lfquido que comprende el SFA. Alternativamente, las partmulas se pueden precipitar in situ anadiendo al vehmulo basado en sFa una solucion -tfpicamente organica - del ingrediente activo (y opcionalmente uno o mas excipientes solidos), en condiciones controladas.

5

10

15

20

25

30

35

40

El tamano de partfcula de la fase dispersa se puede ajustar antes o despues que las partfculas se combinen con el vehnculo Uquido. En una de las realizaciones preferidas, se proveen partfculas del ingrediente activo que ya tienen el tamano de partfcula seleccionado apropiadamente. Los polvos que tienen tal tamano de partfcula seleccionado se pueden obtener directamente de la smtesis del compuesto respectivo mediante ingeniena cristalina, o despues de smtesis mediante metodos convencionales de molienda y pulverizacion usando equipo estandar tal como un molino de bolas, molino de martillo, molino de rodillos, molino coloidal, molino de chorro, o similares. Si el tamano de partmula se va a reducir despues de la preparacion de una suspension, se puede usar ultrasonidos asf como tambien diversos tipos de homogeneizadores, tales como los molinos coloidales u homogeneizadores de alta presion.

Las propiedades ffsicas superiores de las suspensiones de acuerdo con la invencion hacen a estas composiciones particularmente utiles para su administracion topica en el ojo, ofdo, nariz o pulmon de un paciente, o parenteralmente por medio de inyeccion. Los modos de inyeccion preferidos incluyen la inyeccion dermica, subcutanea, intramuscular y locorregional. Las vfas de administracion mas preferidas son la subcutanea e intramuscular.

Las realizaciones adicionales se haran obvias a partir de los siguientes ejemplos que ilustran la invencion en algunos de sus aspectos principales.

Ejemplo 1: estabilizacion de a-quimotripsinogeno A

Se prepararon 30 viales con almuotas de a-quimotripsinogeno A liofilizado (CHY) a partir de una solucion madre de la protema. A cada una de 10 almuotas se le agregaron 2,5 mL de solucion amortiguadora de fosfato de potasio (PPB, 50 mM, pH 8,0); a cada una de otras 10 almuotas se le anadieron 2,5 mL de F6H8. Los 10 viales restantes sirvieron como control. Los viales se purgaron con nitrogeno, se agitaron suavemente y se guardaron a 50°C. Los viales se retiraron a intervalos predeterminados, su contenido se extrajo y se analizo por medio de dicrcnsmo circular y un ensayo enzimatico.

Como resultado, se encontro que la actividad enzimatica de las muestras almacenadas en la solucion amortiguadora se redujo notablemente ya despues de un tiempo de almacenamiento de 1 dfa. La aglomeracion era visible. En contraste, la muestra de SFA retuvo actividad enzimatica sustancial durante un periodo de semanas. De hecho, la bioactividad de CHY almacenado en F6H8 fue muy similar a los viales de control. La tabla 1 muestra la actividad enzimatica encontrada en unidades/mL para cada muestra ensayada.

Con respecto a los resultados de dicrcnsmo circular, las muestras de CHY almacenadas en F6H8 fueron muy similares a los controles en todos los tiempos, mientras que las muestras de CHY almacenadas en PPS mostraron cambios significativos que indican desnaturalizacion sustancial.

Tabla 1

Dfas de almacenamiento

CHY en PPB CHY en F6H8 Controles de CHY

1

0,9 19,0 21,4

7

1,3 21,9 22,2

14

0,0 11,0 12,0

28

0,4 14,8 16,9

42

0,2 9,1 7,9

56

0,6 13,0 12,4

80

0,3 8,4 10,5

A alfcuotas de 2,5 mg de insulina bovina, se le agregaron 2,5 mL de F6H8 o 2,5 mL de acido clorhndrico acuoso muy diluido (0,04 M) y se agitaron suavemente. Las muestras se purgaron con nitrogeno u oxfgeno y despues se almacenaron a 37°C o 50°C, respectivamente. Los viales se retiraron a intervalos predeterminados, su contenido se extrajo y se analizo por dicrcnsmo circular y un ensayo de HPLC.

Ejemplo 2: estabilizacion de insulina bovina

Como resultado se encontro que la insulina era muy inestable cuando se almacenaba en acido clorhndrico acuoso, pero sustancialmente estable a ambos niveles de temperatura cuando se almacenaba en F6H8, sin importar si las muestras habfan sido purgadas con nitrogeno u oxfgeno. Esto se confirmo mediante ambos metodos analfticos. Los resultados del ensayo de HPLC (en % de insulina recuperada) se dan en la tabla 2 (almacenamiento a 37°C), y la tabla 3 (almacenamiento a 50°C).

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 2

Dfas de almacenamiento

Gas Insulina en HCl Insulina en F6H8

0

94,0 84,8

1

Nitrogeno 86,2 89,3

1

Oxfgeno 95,1 92,5

22

Nitrogeno 1,5 84,9

22

Oxfgeno 1,5 91,5

Tabla 3

Dfas de almacenamiento

Gas Insulina en HCl Insulina en F6H8

0

94,0 84,8

1

Nitrogeno 1,1 87,9

1

Oxfgeno 2,2 88,8

16

Nitrogeno 2,2 88,4

16

Oxfgeno 5,5 86,7

22

Nitrogeno 2,5 95,4

22

Oxfgeno 2,7 92,3

Ejemplo 3: estabilidad ffsica y redispersabilidad de suspensiones de insulina humana

En esta serie de experimented se evaluo la estabilidad ffsica y redispersabilidad de suspensiones de insulina humana (HI) en un SFA y otros lfquidos no acuosos. Como se ha mencionado, el grado de estabilidad ffsica y en particular la redispersabilidad son criterios importantes que determinan la conveniencia de un medio de suspension, por ejemplo para una composicion farmaceutica inyectable o topica.

Se determino fotometricamente la retencion de turbidez de suspensiones de insulina humana (HI) en F6H8, perfluorodecalina (PFD), perfluorooctano (PFO) y octano (OCT), midiendo la transmitancia a 350 nm a varios intervalos de tiempo durante un periodo total de 24 horas (figura 1).

La insulina humana (Sigma, 12643) se suspendio en cada uno de los ffquidos a una concentracion de 0,91 mg/mL. Las suspensiones se agitaron con vortice durante 3 segundos, despues se sometieron a sonicacion en un bano en hielo durante 5 minutos. Inmediatamente despues de la sonicacion, las suspensiones se transfirieron mediante pipeta a celdas de cuarzo de 3 mL con tapon. Se midio la transmitancia de cada una de las suspensiones a 350 nm usando un espectrofotometro UV, a intervalos de tiempo durante un periodo de 16 horas. Despues, las suspensiones se redispersaron durante 15 minutos usando un agitador de tubo de ensayo (Labinco) fijado a 10 rpm y un angulo de 45 grados. Despues de la redispersion se midio la transmitancia durante un periodo adicional de 8 horas. Los datos de transmitancia medidos a 350 nm se normalizaron contra una solucion de insulina humana a 0,91 mg/mL en HCl 0,04M, pH 1,6.

Como resultado, se observo que la separacion de fase ocurrio significativamente mas lentamente en la insulina humana suspendida en F6H8 (figura 1). Fue evidente una mayor estabilidad de la suspension de insulina humana en F6H8, en comparacion con las muestras en los disolventes perfluorados y octano a valores de turbidez mas altos (que se correlacionaban con valores mas bajos de % de transmitancia) retenidos durante un periodo mas largo. En contraste, las suspensiones en los disolventes perfluorados y el disolvente hidrocarburo octano, perdieron turbidez rapidamente y mostraron separacion de fases (p. ej., por flotacion o sedimentacion), como lo muestran los claros aumentos rapidos de transmitancia. Se podfa observar heterogeneidad en las celdillas de muestra de estos disolventes, incluso en la suspension formada inicialmente, haciendose rapidamente evidente con el tiempo una sedimentacion y/o flotacion adicional hacia la interfaz ffquido-aire.

Despues de un tiempo de reposo de 16 horas, la suspension redispersada de insulina humana en F6H8 tambien recupero aproximadamente el mismo grado de turbidez que cuando se formo inicialmente la suspension. En contraste, no se pudo recuperar el mismo grado de turbidez de las suspensiones de perfluorodecalina, perfluorooctano y octano despues de redispersion. De esta manera, solamente la suspension de la protema en SFA, pero no las suspensiones en PFD, PFO y OCT, mostraron propiedades ffsicas adecuadas para uso farmaceutico.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ejemplo 4: estabilidad ffsica y redispersabilidad de suspensiones de a-quimotripsina

La retencion de turbidez de suspensiones de a-quimotripsina (CHY) en F6H8, perfluorodecalina (PFD), perfluorooctano (PFO) y octano (OCT), se determino fotometricamente midiendo la transmitancia a 350 nm a varios intervalos de tiempo durante un periodo total de 24 horas.

Se suspendio a-quimotripsina (Sigma, C4129) en cada uno de los disolventes a una concentracion de 2 mg/mL. Las suspensiones se agitaron con vortice durante 3 segundos, despues se sometieron a sonicacion en un bano en hielo durante 5 minutos. Inmediatamente despues de la sonicacion, las suspensiones se transfirieron mediante pipeta a celdas de cuarzo de 3 mL con tapon. Se midio la transmitancia de cada una de las suspensiones a 350 nm usando un espectrofotometro UV, a intervalos de tiempo durante un periodo de 16 horas. Despues, las suspensiones se redispersaron durante 15-20 minutos usando un agitador de tubo de ensayo (Labinco) fijado a 10 rpm y un angulo de 45 grados. Despues de la redispersion se midio la transmitancia durante un periodo adicional de 8 horas. Los datos de transmitancia a 350 nm se normalizaron contra una solucion de a-quimotripsina (2 mg/mL) en solucion amortiguadora de fosfato de potasio 50 mM, pH 8.

Desde el principio, se observaron valores de transmitancia sustancialmente mas bajos para la suspension de a-quimotripsina en F6H8 en comparacion con las suspensiones respectivas en perfluorodecalina (figura 3), perfluorooctano (figura 4) y octano (figura 2), indicando una homogeneidad prolongada de esta suspension y una separacion de fases mas lenta (p. ej., por flotacion o sedimentacion) en el caso de la suspension de SFA. En particular, se observo que la a-quimotripsina suspendida en octano sedimenta rapidamente en el fondo de la celda de cuarzo, indicando caractensticas de suspension muy malas o ausentes (cerca de 100% de transmitancia). Tambien, despues de redispersion despues de dejar reposar durante un periodo de 16 horas, la suspension de a- quimotripsina en F6H8 fue claramente superior a las otras suspensiones ya que su turbidez original de la suspension (a t = 0) fue recuperada mayormente, en contraste con las otras suspensiones.

Ejemplo 5: cinetica de suspension de las suspensiones de albumina de suero bovino

De una manera similar a los ejemplos 3 y 4, se evaluo la cinetica de suspension de albumina de suero bovino (BSA) en F6H8, perfluorodecalina (PFD), perfluorooctano (PFO) y octano (OCT), midiendo la transmitancia a 350 nm a varios intervalos de tiempo durante un periodo de 2 horas.

La BSA se suspendio en cada uno de los disolventes a una concentracion de 5 mg/mL. Las suspensiones se agitaron con vortice durante 3 segundos, despues se sometieron a sonicacion en un bano en hielo durante 5 minutos. Inmediatamente despues de la sonicacion, las suspensiones se transfirieron por medio de una pipeta a celdas de cuarzo de 3 mL con tapon. Se midio la transmitancia a 350 nm usando un espectrofotometro UV en cada una de las suspensiones a intervalos de tiempo durante un periodo de 2 horas. Los datos de transmitancia a 350 nm se normalizaron contra una solucion de BSA (5 mg/mL) en solucion amortiguadora de fosfato de sodio, pH 7.

Como resultado, se observo que la suspension de BSA en F6H8 tema el valor de transmitancia inicial mas bajo (figura 5). Ademas, el aumento de transmitancia dentro de los primeros intervalos del analisis (5 y 10 minutos) fue relativamente bajo para la suspension basada en SFA, en comparacion con las otras suspensiones que ya estaban cercanas a sus valores estables en estos puntos temporales. Desde el punto de vista farmaceutico, estas diferencias se traducen en un tiempo prolongado disponible para administrar convenientemente una dosis de esta suspension de BSA en el SFA, p. ej., por inyeccion subcutanea, que tfpicamente se realiza en el transcurso de algunos minutos.

Ejemplo 6: cinetica de suspension de las suspensiones de calcitonina de salmon

La retencion de turbidez de suspensiones de calcitonina de salmon (sCT) en F6H8, perfluorodecalina (PFD), perfluorooctano (PFO) y octano (OCT) se determino fotometricamente midiendo la transmitancia a 350 nm a varios intervalos de tiempo durante un periodo de 2 horas.

Se suspendio calcitonina de salmon en cada uno de los disolventes a una concentracion de 5 mg/mL. Las suspensiones se agitaron con vortice durante 3 segundos, despues se sometieron a sonicacion en un bano en hielo durante 5 minutos. Inmediatamente despues de la sonicacion, las suspensiones se transfirieron mediante pipeta a celdas de cuarzo de 3 mL con tapon. Se midio la transmitancia de cada una de las suspensiones a 350 nm usando un espectrofotometro UV, a intervalos de tiempo durante un periodo de 2 horas. Los datos de transmitancia a 350 nm se normalizaron contra una solucion de calcitonina de salmon (5 mg/mL) en solucion salina amortiguadora de fosfato, pH 7,4.

Se observo que la suspension de sCT en F6H8 tema el valor de transmitancia inicial mas bajo, y tambien durante un periodo de 2 horas, indicando nuevamente propiedades de suspension sustancialmente superiores en comparacion con las suspensiones en PFD, PFO y OCT (figura 6).

Ejemplo 7: distribucion de tamano de la insulina humana en F6H8

Se tomaron mediciones de dispersion de luz dinamica (DLS) de muestras de insulina humana (Sigma Aldrich 10908) en F6H8 usando un instrumento Nanostar™ Wyatt Technology DLS. Las mediciones se tomaron usando cubetas

desechables de 4 pL. Las muestras se prepararon a concentraciones de 1 mg/mL y 10 mg/mL, y no se filtraron antes de tomar las mediciones.

Los resultados de las muestras a ambas concentraciones demuestran que hay algo de solvatacion de insulina humana en F6H8, con una fraccion significativa con un tamano de partmula que se correlaciona con las formas 5 monomericas de la protema (figura 7 -distribucion de tamano de insulina humana en la muestra de 1 mg/mL (corrida #1), y figura 8 -distribucion de tamano de insulina humana en la muestra de 10 mg/mL). Los inventores creen que la capacidad del SFA para solvatar la protema contribuye a las propiedades favorables de dispersion o suspension, e impide la formacion de agregados gruesos que no son redispersables.

Tabla 4

Muestra

Radio promedio (nm) % de masa de monomero de pico

1 mg/mL, ensayo #1

2,6 98,4

1 mg/mL, ensayo #2

3,5 100

10 mg/mL

4,3 99,4

10

Ejemplo 8

Distribucion de tamano de la calcitonina humana en F6H8

Se tomaron mediciones de dispersion de luz dinamica (DLS) de muestras de calcitonina humana (Bachem AG 4014409.00005) en F6H8 usando un instrumento Nanostar™ Wyatt Technology DLS. Las mediciones se tomaron 15 usando cubetas desechables de 4 pL. Se preparo una muestra a una concentracion de 1 mg/mL. La muestra no se filtro antes de tomar las mediciones.

Los resultados de la muestra demuestran que hay algo de solvatacion de calcitonina humana en F6H8, con una fraccion detectable con un tamano de partmula que se correlaciona con las formas monomericas de la protema (figura 9). Tambien se detectaron agregados pequenos. Nuevamente, se cree que la solvatacion de la protema por 20 SFA contribuye a las propiedades favorables de dispersion o suspension, e impide la formacion de agregados gruesos irreversibles.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1.- Composicion que comprende un compuesto bioactivo y un vehmulo Kquido, en donde el vehmulo Kquido comprende un alcano semifluorado de la formula:

   RFRH

   en donde RF es un segmento de hidrocarburo perfluorado lineal de 4 a 12 atomos de carbono y en donde RH es un grupo alquilo lineal de 4 a 8 atomos de carbono; y en donde el compuesto bioactivo es un agente terapeutico o de diagnostico o una vacuna, seleccionado de polipeptidos y protemas que tienen un peso molecular de al menos 1.500 Da, en donde el compuesto bioactivo se suspende en el vehmulo lfquido y en donde la composicion esta en forma de una suspension.
2. 2. - La composicion de la reivindicacion 1, en donde el compuesto bioactivo es sensible a la degradacion y/o agregacion.
3. 3. - La composicion de cualquier reivindicacion precedente, en donde el compuesto bioactivo es una protema de un solo dominio o una protema de dos dominios.
4. 4. - La composicion de cualquier reivindicacion precedente, en donde el compuesto bioactivo es una insulina.
5. 5. - La composicion de cualquier reivindicacion precedente, en donde el alcano semifluorado se selecciona de F4H5, F4H6, F4H8, F6H4, F6H6, F6H8 y F6H10.
6. 6. - La composicion de cualquier reivindicacion precedente, que esta sustancialmente libre de agua.
7. 7. - La composicion de cualquier reivindicacion precedente para uso como una medicina.
8. 8. - La composicion para uso como una medicina de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde la medicina es para administracion parenteral por medio de inyeccion subcutanea, dermica, intramuscular o locorregional.
9. 9. - La composicion para uso como una medicina de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde la medicina es para administracion topica en el ojo, ofdo, pulmon, piel o nariz de un paciente.
10. 10. -Metodo de preparacion de una composicion que comprende un agente bioactivo terapeutico o de diagnostico o una vacuna seleccionado de un polipeptido o protema que tiene un peso molecular de al menos 1.500 Da, que comprende la etapa de incorporar el polipeptido o protema bioactiva dentro de un vehmulo lfquido que comprende un alcano semifluorado de la formula:

    RFRH

    en donde RF es un segmento de hidrocarburo perfluorado lineal de 4 a 12 atomos de carbono y en donde RH es un grupo alquilo lineal de 4 a 8 atomos de carbono para formar una dispersion o suspension.
11. 11. - El metodo de la reivindicacion 10, en donde el polipeptido o protema bioactiva es sensible a la degradacion y/o agregacion.
12. 12. - El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en donde la composicion es estabilizada qrnmica y/o ffsicamente.

    % Transmitancia (a.u)

    100

    so

    60

    ,0 o 0 ° $ $ 8 JL* A A ! A A A

    f o*

    u

    40

    10

    r

    o

    300

    ....r.....

    600

    
    ,<*, o o ❖ ❖ O o

    
    AA A A A A A A

    
    oo o o o o o o

    A

    A

    900 ^ 1200

    Tiempo (min)

    1600

    -Men pons <.-Hien>Kj -Hien^o meni't Fig. 1

    en

    imagen1

    % Transmitancia (a.u)

    80

    ^doO g o o o 8 o

    oo o j » » i !

    ,0 P - of

    TO

    O

    £

    w

    0

    i

    o ;

    o f-

    i

    0 300 600

    Tiempo (min)

    .'•■■•enrGII8 cCHYen^,

    Fig. 3

    900 ^

    1200

    Re-dispersion

    100

    80 <>

    O *

    8 ® fi 9

    .2. 60

    01

    U

    C

    rtJ

    •M

    ±i 40

    E

    «/>

    c

    CD

    GX-

    i

    20

    300

    600

    900

    1200

    Tiempo (min)

    TW-en F6H8 O CHY en • - 7 - ‘ ; : :

    1500

    100

    so

    -

    o

    o

    Q

    O

    O

    O

    o

    
    3 0 4

    
    .5 i

    o

    « 0 i

    +-*

    
    £ ?

    (A

    C

    ra - ;

    5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

    Tiempo (min)

    if.. enFSHS o3S/enpfj o ESA .r^'-n jCT

    Fig. 5

    100

    so

    3

    ro

    (0 o c

    iH 40

    E w c

    (0

    so

    20

    1

    o

    o

    en

    4

    o

    O

    4

    en

    en

    en

    10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

    Tiempo (min)

    *

    A

    isCT en F6H8 o sCT en >FD 0 sCT en PFO * sCT en OCT Fig. 6

    % Masa

    imagen2

    Fig. 7

    imagen3

    Radio (nm)

    l.GE+3

    1.0E+4

    1.0E+4

    % Masa

    imagen4

    Radio (nm)

    Fig. 9