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ES2623786T3 - Procedimiento de purificación de una muestra de anticuerpo H38C2 - Google Patents

Procedimiento de purificación de una muestra de anticuerpo H38C2 Download PDF

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ES2623786T3
ES2623786T3 ES12816137.9T ES12816137T ES2623786T3 ES 2623786 T3 ES2623786 T3 ES 2623786T3 ES 12816137 T ES12816137 T ES 12816137T ES 2623786 T3 ES2623786 T3 ES 2623786T3
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Gopinath Vedachalam ANNATHUR
Palani Balu
Rory Francis Finn
Jie Huang
Olivier Alexandre Laurent
Nancy Jane Levin
Nicholas Gary Luksha
Joseph Patrick MARTIN Jr
Haim Moskowitz
Moorthy Sitharamaiah Suriyanarayana Palanki
Mark John Pozzo
Gregory Allan WASZAK
Jin Xie
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Covx Technologies Ireland Ltd
Pfizer Corp SRL
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Pfizer Corp Belgium
Covx Technologies Ireland Ltd
Pfizer Corp SRL
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Abstract

Un procedimiento de purificación de una muestra de anticuerpo h38C2 o una variante del mismo, en el que ambos sitios de unión al antígeno están completamente disponibles para la unión al antígeno en al menos aproximadamente el 85 % de los anticuerpos de la muestra, que comprende: (i) equilibrar una columna de HIC (cromatografía de interacción hidrófoba) con un lavado de equilibrado previo a la carga que comprende un tampón base que comprende entre aproximadamente 15 mM y aproximadamente 100 mM de fosfato de sodio, fosfato de potasio o fosfato de amonio, HEPES, Tris y bis-Tris, a entre aproximadamente pH 6,5 y aproximadamente 7,5, y que comprende además una sal seleccionada del grupo que consiste en NaCl, KCl y citrato monosódico, a una primera concentración de entre aproximadamente 0,5 M y 1,5 M; en el que la columna de HIC comprende perlas de resina conjugadas con fenilo inferiores a aproximadamente 50 μm de diámetro y que comprenden poros de al menos aproximadamente 500 Å; (ii) cargar la columna con una muestra de h38C2 a entre aproximadamente 4 y aproximadamente 80 g/l en tampón de carga que comprende el tampón base y que comprende además la sal a la primera concentración; (iii) lavar la columna con lavado de equilibrado posterior a la carga que comprende el tampón base y la sal a la primera concentración; (iv) lavar la columna con un gradiente de sal, que comprende el tampón base y que comprende además un gradiente de concentración lineal de aproximadamente 1,5 M a aproximadamente 0,25 M de la sal, caracterizado porque la concentración de sal disminuye entre aproximadamente 90 mM y 100 mM por volumen de columna (VC); (v) lavar la columna con un lavado en meseta de sal, que comprende entre aproximadamente 4 VC y aproximadamente 8 VC de la sal a entre aproximadamente 0,25 M y aproximadamente 0,4 M en el tampón base; (vi) lavar la columna con un lavado de tampón que comprende el tampón base; (viii) eluir el h38C2 con un tampón de elución, que comprende el tampón base y un gradiente de concentración lineal de 1,6-hexanodiol que comienza a una concentración de entre aproximadamente 0 y aproximadamente 1 % de 1,6-hexanodiol y termina en un límite superior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 13 %, aproximadamente 14 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 16 %, aproximadamente 17 %, aproximadamente 18 %, aproximadamente 19 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 21 % y aproximadamente 22 % de 1,6-hexanodiol para entre aproximadamente 0,5 VC y aproximadamente 3 VC o hasta que se recoja la combinación de elución; (viii) opcionalmente, realizar una etapa de elución adicional que comprende el tampón base y 1,6-hexanodiol a una concentración seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 13 %, aproximadamente 14 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 16 %, aproximadamente 17 %, aproximadamente 18 %, aproximadamente 19 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 21% % y aproximadamente 22 %, para hasta 5 VC o hasta que se recoja la combinación de elución; en el que el anticuerpo h38C2 o una variante del mismo comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL de la secuencia de VL mostrada en SEQ ID NO: 27; y preferentemente como se expone en SEQ ID NO: 27, y una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH de la secuencia de VH mostrada en SEQ ID NO: 28, y preferentemente como se expone en SEQ ID NO: 28.

Description

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en la que n = 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, y m está presente o ausente; n puede ser 1,2, 3, 4, 5 o 6; n puede ser 1,2, 3
o 4; n puede ser 1; n puede ser 2; n puede ser 3; n puede ser 4. En algunos aspectos, Xs comprende una de las siguientes fórmulas:
imagen8
(ilustrada en L1 y L2)
imagen9
Xp se selecciona idealmente para permitir una estrategia de unión covalente direccional específica al resto de unión a proteínas de la proteína FGF21 y/o al resto de unión a péptidos del homólogo de Exendina4. Por ejemplo, cuando 15 el resto de unión comprende un grupo nucleófilo, Xp puede ser un grupo electrófilo y viceversa. Por ejemplo, si la cadena lateral de restos de unión comprende un grupo amina, tal como K, H, Y, ornitina, Dap o Dab, Xp puede ser COOH, u otro electrófilo reactivo similar. Si el resto de unión es D o E, Xp puede comprender un grupo nucleófilo, tal como un grupo amina. Cualquiera de estas estrategias permite que se forme un enlace covalente entre el grupo Xp y el resto de unión mediante estrategias de formación de enlaces amida. Cuando el resto de unión comprende un
20 grupo amina, Xp puede comprender la fórmula:
imagen10
Cuando el resto de unión es C, homólogos de C u otros restos que contienen grupos tiol tales como K(SH), Xp puede comprender un grupo maleimida (o similar) que permita una estrategia de reacción de adición de tiolmaleimida para unir covalentemente el grupo Xp al resto de unión. En algunos aspectos, Xp también puede
25 comprender un grupo tiol, que permite la formación de un puente disulfuro entre el resto de unión y el grupo Xp. En algunos aspectos, Xp puede ser maleimida.
8
imagen11
imagen12
Cuando L2 se conjuga con el PLR, el complejo de L2-PLR puede comprender una de las siguientes fórmulas:
imagen13
Cuando L2 se conjuga con el anticuerpo y el PLR, el complejo de anticuerpo-L2-PLR puede comprender una de las siguientes fórmulas:
imagen14
En algunas realizaciones, el engarce puede ser el Engarce-3 (L3):
imagen15
Cuando L3 se conjuga con el PLR, el complejo de L3-PLR puede comprender una de las siguientes fórmulas:
imagen16
Cuando L3 se conjuga con el anticuerpo y el PLR, el complejo de anticuerpo-L3-PLR puede comprender la fórmula:
11
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imagen18
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covalente con una cadena lateral portadora de tiol en el resto de unión a proteínas y/o el resto de unión a péptidos.
En algunas realizaciones, el resto de unión a proteínas comprende una cadena lateral portadora de amino o de tiol. En algunas realizaciones, el resto de unión a proteínas comprende lisina o cisteína. En algunas realizaciones, el resto de unión a proteínas comprende cisteína.
5 En algunas realizaciones, el resto de unión de proteínas se encuentra en uno de los restos número 56, 59, 69, 79, 86, 122, 125 y 129, de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la molécula de FGF21 comprende SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, la molécula de FGF21 comprende SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, el resto de unión a péptidos se encuentra en una de las posiciones de 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 21,24, 26, 27, 28, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO:
10 60.
En algunas realizaciones, el primer y segundo engarce son iguales. En algunas realizaciones, el primer y segundo engarce comprenden L1.
En algunos aspectos, la estructura del resto de unión a proteínas [S-PLR] y/o el resto de unión a péptidos [S-PLR] cuando está unido al anticuerpo es de fórmula:
imagen20
en la que v es 1 o 2, t es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, y es 0, 1 o 2; s es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, y q es 1, 2, 3, 4, o 5. En algunos aspectos, v es 2, t es 2, y es 1, s es 0 y q es 2.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un compuesto de fórmula:
imagen21
20 en la que cada uno independientemente de v1 y v2 es 1 o 2, cada uno independientemente de t1 y t2 es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9 o 10, cada uno independientemente de y1 e y2 es 0, 1 o 2; cada uno independientemente de s1 y s2 es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, y cada uno independientemente de q1 y q2 es 1, 2, 3, 4 o 5. En algunos aspectos, v1 y v2 son ambos 2. En algunos aspectos, t1 y t2 son ambos 2. En algunos aspectos, y1 e y2 son ambos 1. En algunos aspectos s1 y s2 son ambos 0. En algunos aspectos q1 y q2 son ambos 2.
25 En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición de fórmula:
15
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5
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15
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25
30
35
40
45
50
55
equilibrada, de modo que el engarce en exceso permanezca en la resina de la columna Zeba.
La conjugación de FGF21 con el primer engarce puede llevarse a cabo a una proporción de entre aproximadamente
1:1 a aproximadamente 1:4. En algunas realizaciones, la conjugación entre FGF21 y el primer engarce puede llevarse a cabo en un intervalo de proporciones, en el que el límite inferior se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:1,25, aproximadamente 1:1,5, aproximadamente 1,75, aproximadamente 1:2, y el límite superior se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:2,25, aproximadamente 1:2,5, aproximadamente 1:2,75, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:3,5 y aproximadamente 1:4. En algunos aspectos, la cantidad de engarce puede aumentarse hasta un exceso de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 veces en base equivalente en comparación con FGF21. La mayor cantidad del primer engarce puede ayudar a agilizar el tiempo de conjugación. Sin embargo, la adición de engarce en exceso superior a aproximadamente 4 veces no produce ningún aumento adicional en la formación del producto ni en el tiempo de reacción. En un exceso de aproximadamente 2 veces del primer engarce es preferible que proporcione el material de engarce a FGF21. La reducción de la cantidad de primer engarce hasta menos de 1 equivalente da como resultado una cantidad reducida de formación del producto. A medida que se reduce la cantidad de engarce hasta aproximadamente 0,9 equivalentes, y aproximadamente 0,8 equivalentes, 0,7 equivalentes, y así sucesivamente, la cantidad de producto formado disminuye. La cantidad más alta de producto formado es cuando la proporción de FGF21 y el primer engarce está entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1: 2.
Conjugación de [FGF21-primer engarce] a anticuerpo
En algunos aspectos, [FGF21-primer engarce] se conjuga con el anticuerpo en un tampón de MES o de fosfato, a una concentración de entre aproximadamente 25 mM y aproximadamente 150 mM, con un intervalo de pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5, o de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0, a entre aproximadamente 0 ºC y 37 C, y preferentemente entre aproximadamente 4 ºC y aproximadamente la temperatura ambiente. En algunos aspectos, [FGF21-primer engarce] se conjuga con el anticuerpo en un tampón de fosfato 100 mM con un intervalo de pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,5 a temperatura ambiente. El [FGF21-primer engarce] puede conjugarse con el anticuerpo en una reacción llevada a cabo durante un tiempo seleccionado del grupo que consiste en al menos 30 minutos, al menos aproximadamente 60 minutos, al menos aproximadamente 90 minutos, al menos aproximadamente 2 horas, al menos aproximadamente 3 horas, al menos aproximadamente cuatro horas, al menos aproximadamente 6 horas, al menos aproximadamente 12 horas, al menos aproximadamente 18 horas y al menos aproximadamente 24 horas.
Extracción de Ab-[FGF21-primer engarce]
En algunos aspectos, es ventajoso extraer moléculas de Ab-[FGF21-primer engarce]1 de la mezcla formada en (ii) por cromatografía de fase inversa. En parte, la divulgación se basa en la aplicación sorprendente de la cromatografía de fase inversa para aislar Ab-[FGF21-primer engarce]1 con alta pureza.
En algunos aspectos, la cromatografía de fase inversa se realiza sobre una columna de butilo de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). La resina de HIC normalmente comprende perlas (por ejemplo, de polímero metilacrilado hidroxilado) unidas covalentemente a ligandos de butilo (-OCH2CH2CH2CH3). En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento de extracción de Ab-[FGF21-primer engarce]1 de una mezcla de anticuerpo no conjugado, [FGF21-primer engarce], Ab-[FGF21-primer engarce]1 y Ab-[FGF21-primer engarce]2, mediante cromatografía de fase inversa sobre una columna de butilo.
El tamaño de partícula de las perlas de columna puede ser inferior a aproximadamente 50 μΜ. El tamaño de partícula de las perlas de columna puede ser inferior a aproximadamente 40 μM. El tamaño de partícula de las perlas de columna puede ser de entre aproximadamente 50 µM y aproximadamente 20 μM. El tamaño de partícula de las perlas de columna puede ser de entre aproximadamente 40 µM y aproximadamente 30 µM. El tamaño de partícula de las perlas de columna puede ser de aproximadamente 35 µM. En algunos aspectos, se puede usar una columna de butilo de grado "S".
En algunos aspectos, las perlas pueden comprender poros de al menos aproximadamente 500 Å. En algunos aspectos, las perlas pueden comprender poros de al menos aproximadamente 750 Å. En algunos aspectos, las perlas pueden comprender poros de al menos aproximadamente 1.000 Å. En algunos aspectos, las perlas pueden comprender poros de entre aproximadamente 450 Å y 1.050 Å. En algunos aspectos, las perlas pueden comprender poros de entre aproximadamente 950 Å y 1.050 Å.
En algunos aspectos, la columna de HIC puede comprender perlas de resina conjugada con butilo de aproximadamente 35 μΜ que comprenden poros de entre aproximadamente 1.000 Å. En algunos aspectos, la columna puede ser una columna de butilo 650 S.
Esto puede estar a una temperatura de entre aproximadamente 0 ºC y 37 ºC. Esto puede estar a temperatura ambiente (de aproximadamente 15 ºC a aproximadamente 25 ºC). Esto puede estar a una temperatura de entre aproximadamente 15 ºC y aproximadamente 20 ºC. Esto puede estar a temperatura de aproximadamente 16 ºC a aproximadamente 18 ºC. En algunos aspectos de la divulgación, una temperatura demasiado alta puede dar lugar a
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especies de Ab-[FGF21-primer engarce]2 en exceso, mientras que una temperatura demasiado baja, hace que no quede atrapada suficiente especie Ab-[FGF21-primer engarce]1 por la columna.
En algunos aspectos, la columna de butilo puede someterse a una etapa de lavado isocrática que comprende 1,6hexanodiol a una concentración del aproximadamente 2 % al aproximadamente 3 %, preferentemente de entre aproximadamente el 2,2 % y aproximadamente el 2,6 %, y lo más preferentemente del aproximadamente 2,4 %. El tampón de lavado puede estar entre aproximadamente pH 6,5 y aproximadamente pH 7,5, y puede ser aproximadamente pH 7,0. El tampón de lavado puede comprender fosfato de sodio 50 mM. En algunos aspectos, el 1,6-hexanodiol puede estar sustituido con un diol orgánico alternativo, tal como propilenglicol o nonoxol. Los alcoholes tales como el isopropanol no proporcionaron resultados satisfactorios.
Las columnas de HIC normalmente se pasan sobre una concentración de sal decreciente a un ritmo constante. La presente invención se basa en parte en el sorprendente descubrimiento de ventajas particulares asociadas con el funcionamiento de un tampón de elución de concentración de sal relativamente baja con una concentración creciente de diol en el aislamiento de especies de AB-[FGF21-primer engarce]1 de la reacción de conjugación.
En algunos aspectos, la elución en la columna de butilo puede realizarse usando un gradiente lineal con un tampón que comprende 1,6-hexanodiol. El gradiente lineal de elución puede progresar desde una concentración inicial de entre aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 3 %, y preferentemente de entre aproximadamente el 2,2 % y aproximadamente el 2,6 %, y lo más preferentemente del aproximadamente 2,4 %.
La elución de diol se puede hacer pasar sobre un gran volumen de columna (al menos 20, preferentemente al menos 25 volúmenes de columna (VC). En dichas realizaciones, aunque la concentración inicial de diol puede ser como se ha descrito anteriormente, la concentración final del gradiente lineal puede ser superior al 20 % y puede ser del aproximadamente 25 %. En algunas realizaciones, la etapa de elución se ejecuta entre 5 y 15 VC, preferentemente entre 8 y 13 VC, más preferentemente entre 10 y 12 VC, más preferentemente 11 VC. En dichas realizaciones, puede ser ventajoso limitar la concentración final del gradiente lineal a entre aproximadamente el 6 % y aproximadamente el 10 %, preferentemente entre aproximadamente el 7 % y aproximadamente el 9 %, más preferentemente entre aproximadamente el 7,5 % y aproximadamente el 8,5 %, lo más preferentemente aproximadamente el 8 %. El tampón de elución puede estar entre aproximadamente pH 6,5 y aproximadamente pH 7,5, y puede ser aproximadamente pH 7,0. El tampón de elución puede comprender fosfato de sodio entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 mM. El tampón de elución puede comprender fosfato de sodio entre aproximadamente 20 mM y aproximadamente 80 mM. El tampón de elución puede comprender fosfato de sodio entre aproximadamente 40 mM y aproximadamente 60 mM. El tampón de elución puede comprender fosfato de sodio 50 mM.
Este material se puede entonces someter a diafiltración en tampón adecuado (por ejemplo, lactato de sodio 30 mM, pH 4,8 o glutamato de sodio 20 mM, pH 4,5).
Generación de [segundo engarce-Ex4]
En algunos aspectos, el homólogo de Exendina4 y el segundo engarce se pueden mezclar entre sí a una proporción de entre aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2 para formar el complejo [segundo engarce-Ex4]. En algunos aspectos, la mezcla del homólogo de Exendina4 y el segundo engarce entre sí se puede hacer a una proporción de aproximadamente 1,5:1, para formar el complejo [segundo engarce-Ex4]. En algunos aspectos, la mezcla del homólogo de Exendina4 y el segundo engarce entre sí se puede hacer a una proporción de aproximadamente 1:1, para formar el complejo [segundo engarce-Ex4]. En algunos aspectos, la mezcla del homólogo de Exendina4 y del segundo engarce entre sí se puede hacer a una proporción de aproximadamente 1:1,5, para formar el complejo [segundo engarce-Ex4]. En algunos aspectos, la mezcla del homólogo de Exendina4 y del segundo engarce entre sí se puede hacer a una proporción de aproximadamente 1:2, para formar el complejo [segundo engarce-Ex4].
En algunos aspectos, los homólogos de Exendina4 comprenden un resto de unión a péptidos cuya cadena lateral comprende un grupo tiol. En algunas realizaciones, este grupo tiol puede entonces experimentar una reacción de Michael o adiciones de conjugación al anillo de maleimida de ciertos engarces desvelados en el presente documento.
Las adiciones de conjugación entre los homólogos de Exendina4 adecuados y los segundos engarces se pueden llevar a cabo en una amplia selección de disolventes que incluyen dimetilsulfóxido, dimetilformamida, diclorometano, agua, etanol, acetonitrilo, acetona, propilenglicol y cualquier combinación de los anteriores disolventes. En algunos aspectos, el disolvente para la reacción de Exendina4/segundo engarce se selecciona del grupo que consiste en dimetilsulfóxido, dimetilformamida y agua. La reacción de conjugación también puede realizarse en un sistema disolvente mixto tal como acetonitrilo-agua, dimetilsulfóxido-agua y dimetilformamida-agua. Se prefiere el uso de dimetilsulfóxido, dimetilformamida, disolventes de agua-acetonitrilo debido a la facilidad de solubilidad de los péptidos de Exendina4 y el segundo engarce, la eficacia de la reacción de conjugación y la posterior facilidad de purificación del producto. El criterio clave es la solubilidad de los homólogos de Exendina4 a concentraciones que serían adecuadas para la conjugación y la eficacia de la conjugación con productos secundarios mínimos. Si el péptido Exendina4 y el segundo engarce son escasamente solubles (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,1
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M), entonces se reducirá la eficacia de conjugación.
La presencia de una base orgánica o base inorgánica facilita en gran medida la formación de anión tiolato en péptidos de Exendina4 y la posterior conjugación a un segundo engarce. En general, no se prefieren las aminas primarias ni las aminas secundarias debido a su reactividad con el engarce. Sin embargo, se pueden usar aminas primarias o aminas secundarias en ciertas realizaciones, con la condición de que reaccionen mal con el engarce, aminas terciarias tales como trimetilamina, trietilamina, dietilmetilamina, diisopropilmetilamina, dietilisopropilamina, triisopropilamina, tributilamina, N-metilmorfolina y N-metilpiperidina en las reacciones de conjugación. La mayoría de las bases de amina mencionadas anteriormente son adecuadas para la reacción de conjugación. Sin embargo, la eficacia de la reacción es diferente entre diferentes bases. Algunas bases son más resistentes a reaccionar con el engarce que otras. En general, se prefieren bases más voluminosas, ya que estas bases no reaccionan fácilmente con el engarce. Se prefieren bases tales como diisopropiletilanina, triisopropilamina y dietilisopropilamina, ya que ofrecen un buen equilibrio de casi ninguna reactividad con el engarce y la formación eficiente del producto.
Las reacciones también pueden llevarse a cabo en un sistema acuoso usando bases inorgánicas tales como bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de potasio, carbonato de potasio, bicarbonato de litio, carbonato de litio, siempre que estas bases no reaccionen con el engarce o el péptido. Las reacciones también pueden llevarse a cabo en sistemas acuosos tamponados con o sin un codisolvente orgánico. La adición de tiol a un doble enlace se logra más fácilmente cuando el pH es de aproximadamente 7 y superior. La reacción de conjugación es más lenta a pH < aproximadamente 7. Las reacciones de conjugación entre la Ex4 y el engarce pueden tener lugar, en general, entre pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. Sin embargo, en condiciones más básicas, los engarces son menos estables. El pH más cercano al nivel neutro ofrece tanto eficiencia como estabilidad. Se puede usar una amplia selección de tampones para facilitar las reacciones. Muchos tampones son adecuados para las reacciones de conjugación, incluyendo, pero sin limitación, tampón fosfato, tampón citrato, tampón glicina/histidina, tampón 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol, ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinoetanosulfónico y ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico.
Conjugación de [segundo engarce-Ex4] a Ab-[FGF21-engarce]1
En algunos aspectos, Ab-[FGF21-primer engarce]1 y [segundo engarce-Ex4] se pueden combinar a una proporción de aproximadamente Ab-[FGF21-enlace]1:[segundo engarce-Ex4] de entre aproximadamente 0,7:1 a aproximadamente 2:1. En algunos aspectos, la proporción es de aproximadamente 1,1:1 a aproximadamente 1,7:1. En algunos aspectos, la proporción es de aproximadamente 1,3:1 a aproximadamente 1,5:1. La proporción puede ser de aproximadamente 1,4:1.
En algunos aspectos, Ab-[FGF21-primer engarce]1 y [segundo engarce-Ex4] se pueden combinar a un pH de entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 6,5. En algunos aspectos, Ab-[primer FGF21-engarce]1 y [segundo engarce-Ex4] se pueden combinar a un pH de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 6,5. En algunos aspectos, Ab-[FGF21-primer engarce]1 y [segundo engarce-Ex4] se pueden combinar a un pH de aproximadamente 6,3.
En algunos aspectos, Ab-[FGF21-primer engarce]1 y [segundo engarce-Ex4] se pueden combinar a temperatura ambiente. En algunos aspectos, Ab-[FGF21-primer engarce]1 y [segundo engarce-Ex4] se pueden combinar entre aproximadamente 17 ºC y aproximadamente 22 ºC. En algunos aspectos, Ab-[FGF21-primer engarce]1 y [segundo engarce-Ex4] se pueden combinar a aproximadamente 19 ºC.
En algunos aspectos, Ab-[FGF21-primer engarce]1 y [segundo engarce-Ex4] se pueden combinar después de una reacción de al menos 6 horas. En algunos aspectos, Ab-[FGF21-primer engarce]1 y [segundo engarce-Ex4] se pueden combinar después de una reacción de al menos 8 horas. En algunos aspectos, Ab-[FGF21-primer engarce]1 y [segundo engarce-Ex4] se pueden combinar después de una reacción de al menos 12 horas. De acuerdo con otra realización de un procedimiento de generación de compuestos de la divulgación, el procedimiento comprende las etapas:
(i)
mezclar Ex4 y el segundo engarce entre sí en una proporción de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2 para formar el complejo [segundo engarce-Ex4];
(ii)
mezclar el [segundo engarce-Ex4] y Ab entre sí a una proporción de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:3 para formar una mezcla que contenga [Ab], [Ab]-[segundo engarce-Ex4]1 y [Ab]-[segundo engarce-Ex4]2;
(iii) extraer las moléculas de [Ab]-[segundo engarce][Ex4]1 de la mezcla formada en (ii);
(iv)
mezclar FGF21 y el primer engarce entre sí a una proporción de entre aproximadamente 1:4 y aproximadamente 1:1 para formar el complejo [FGF21-primer engarce];
(v)
mezclar [FGF21-primer engarce] con [Ab]-[segundo engarace-Ex4]1 a una proporción de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2 para formar una mezcla que contenga [FGF21-primer engarce]1[Ab]-[segundo engarce-Ex4]1.
[FGF21-primer engarce] y [Ex4-segundo engarce] se pueden preparar como se ha descrito anteriormente.
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Generación de [Ex4-segundo engarce]1-Ab
En algunas realizaciones, [segundo engarce-Ex4] y Ab se pueden conjugar entre sí a una proporción de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 1:3 para formar [Ab]-[segundo engarce-Ex4]1. En algunas realizaciones, la proporción puede ser de aproximadamente 0,6:1. En algunas realizaciones, la proporción puede ser de aproximadamente 0,7:1. En algunas realizaciones, la proporción puede ser de aproximadamente 0,75:1. En algunas realizaciones, la proporción puede ser de aproximadamente 0,8:1. En algunas realizaciones, la proporción puede ser de aproximadamente 0,9:1. En algunas realizaciones, la proporción puede ser de aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la proporción puede ser de aproximadamente 1,1:1. En algunas realizaciones, la proporción puede ser de aproximadamente 1,2:1. En algunas realizaciones, la proporción puede ser de aproximadamente 0,5:1. En algunas realizaciones, la proporción puede ser de aproximadamente 0,7:1.
En algunas realizaciones, en las que la proporción de [segundo engarce-Ex4] y Ab es de aproximadamente 1:1, esto proporciona la cantidad máxima de especies de [Ab]-[segundo engarce-Ex4]1, con respecto a Ab no conjugado y [Ab]-[segundo engarce-Ex4]2. Cuando la proporción es de aproximadamente 1:1, se observa una distribución favorable del aproximadamente 40-50 % de [Ab]-[segundo engarce-Ex4]1, junto con aproximadamente el 25 % de Ab no conjugado y aproximadamente el 25 % de Ab-[segundo engarce-Ex4]2. Sin embargo, para purificar [Ab]-[segundo engarce-Ex4]1 de la mezcla, es ventajoso tratar de reducir al mínimo la cantidad de [Ab]-[segundo engarce-Ex4]2, ya que estas especies pueden interferir con la extracción de Ab-[segundo engarce-Ex4]1. Además, [Ab]-[segundo engarce-Ex4]2 representa el material que no se puede reciclar. Por lo tanto, también es ventajoso reducir al mínimo la formación de Ab-[segundo engarce-Ex4]2. Para hacer esto, la cantidad de [segundo engarce-Ex4] se puede reducir de aproximadamente 1 equivalente a aproximadamente 0,7 equivalentes, o incluso tanto como y 0,5 equivalentes (en comparación con el anticuerpo). Al reducir la cantidad de [segundo engarce-Ex4] en comparación con Ab, se puede reducir al mínimo la formación de especies de [Ab]-[segundo engarce-Ex4]2.
Mientras que la reducción de la proporción de [segundo engarce-Ex4] con respecto al Ab puede ayudar a mejorar el equilibrio de los productos formados para favorecer Ab-[segundo engarce-Ex4]1 en relación con [Ab]-[segundo engarce-Ex4]2, esto debe compensarse con la necesidad de que la reacción proporcione un rendimiento tolerable, y se reduzca al mínimo la cantidad de anticuerpo no conjugado y, por lo tanto, estrictamente innecesario, al final de la reacción. Por lo tanto, la reducción de la proporción de [segundo engarace-Ex4]:[Ab] por debajo de aproximadamente 0,5:1 puede reducir el rendimiento global de Ab-[segundo engarce-Ex4]. Se ha encontrado sorprendentemente que la proporción óptima de [segundo engarce-Ex4]:[Ab] está entre aproximadamente 0,5:1 y aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la proporción de reacción puede estar dentro de un intervalo de dos proporciones definidas por un límite inferior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 0,5:1, aproximadamente 0,6:1, aproximadamente 0,7:1, aproximadamente 0,8:1, aproximadamente 0,9:1 y un límite superior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 0,6:1, aproximadamente 0,7:1, aproximadamente 0,8:1, aproximadamente 0,9:1 y aproximadamente 1:1. En algunos aspectos, la proporción está entre aproximadamente 0,6:1 y aproximadamente 0,8: 1. En algunos aspectos, la proporción es de aproximadamente 0,7:1.
Las proporciones ventajosas de [segundo engarce-Ex4]:[Ab] ayudan a reducir al mínimo la formación de [Ab][segundo engarce-Ex4]2 mientras se mantiene la cantidad de formación de [Ab]-[segundo engarce-Ex4]1. Al reducir la cantidad de [segundo engarce-Ex4], el péptido puede conservarse mientras se mantienen los rendimientos. Al aumentar la cantidad de [segundo engarce-Ex4] más allá de 1 equivalente (por ejemplo, [segundo engarce-Ex4]: [Ab] = aproximadamente 1,25:1 a aproximadamente 2:1), la formación de la especie Ab-[segundo engarce-Ex4]2 aumenta espectacularmente y reduce la cantidad de Ab-[segundo engarce-Ex4]1, el producto deseado. Mayores cantidades de [segundo engarce-Ex4] en comparación con Ab (en base equivalente) dan lugar a una caída dramática de la cantidad de formación de Ab-[segundo engarce-Ex4]1.
La formación de [Ab]-[segundo engarce-Ex4]1 entre el péptido Ex4 y el anticuerpo puede ocurrir a un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8. En algunas realizaciones, especialmente en las que el segundo engarce es L1, el engarce conectado a Ex4 es relativamente más estable en condiciones ácidas que en condiciones básicas. Sin embargo, en condiciones ácidas, la reacción de conjugación es más lenta. En condiciones básicas (pH > aproximadamente 7), la reacción de conjugación es más rápida; sin embargo, el engarce unido a Ex4 puede sufrir hidrólisis. Por lo tanto, es fundamental identificar una condición que muestre una estabilidad razonable y una conjugación eficiente.
Las condiciones más cercanas al pH neutro (aproximadamente 6,5-aproximadamente 7,5) muestran la mayor estabilidad para el engarce con una eficacia de reacción concomitante. Mientras que la conjugación funciona a pH aproximadamente 7, parece que la estabilidad del engarce y la eficacia de la conjugación son mejores a pH de aproximadamente 6,5.
Aunque la reacción es viable en agua pura, es mucho más deseable tener un sistema tamponado en el que el pH pueda mantenerse para mejorar la eficacia de conjugación. Varios sistemas tampón incluyendo el tampón de formulación (compuestos de glicina, histidina, sacarosa), tampón de ácido (4-(2-hidroxietil)-1piperazinoetanosulfónico), tampón de ácido N-ciclohexil-3-aminopropanosulfónico, tampón de ácido 3-(N
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(Continuación)
SEQ ID NO:
Descripción Secuencia
2
FGF21Δ H H1 ausente, L146.
3
Género mutante Cys de FGF21 1 x1= H o ausente, x79 = D o C, x125 = H o C, x129 = A o C,
x146= P o L
4
Género mutante Cys de FGF21 2 x1= H o ausente, x125 = C o H, x129 = A o C, x146 = L o P
5
Género H125C de FGF21 X1= H o ausente,H125C,x146 = L o P
6
FGF21ΔH-H125C-L146 H1 ausente H125C P146
7
FGF21ΔH-H125C H1 ausente H125C L146
8
Género A129C de FGF21 x1= H o ausente,A129C, x146 = L o P
9
FGF21ΔH-A129C-L146H1 ausente, A129C, P146
10
FGF21Δ H-A129C H1 ausente, A129C, L146
11
Género D79C de FGF21 x1= H o ausente,D79C, x146 = P o L
34
(Continuación)
SEQ ID NO:
Descripción Secuencia
12
FGF21ΔH-D79CH1 ausente, D79C, L146
13
FGF21ΔH-D79C-L146H1 ausente, D79C, P146
14
FGF21ΔH-L86CH1 ausente, L86C, L146
15
FGF21ΔH-T40CH1 ausente, T40C, L146
16
FGF21Δ H-H1C H1C, L146
17
Género mutante Lys de FGF21 x1 = ausente o H, x56, x59, x69, x122= K o R, R69, x146=L o P
18
FGF21Δ H-K56-K59R-K69RK122R-L146
19
FGF21ΔH-K59 K56R-K69RK122R-L146
20
FGF21ΔH-K69 K56R-K59RK122R-L146
21
FGF21ΔH-K122 K56R-K59R-K69R-L146
35
(Continuación)
SEQ ID NO:
Descripción Secuencia
22
FGF21ΔH-Knull-P2 K56R-K59R-K69R-K122R-L146
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FGF21Δ H-Knull-H1K H1K-K56R-K59R-K69R-K122R-L146
24
FGF21ΔH-Knull-S181K K56RK59R-K69R-K122R-L146-S181K
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Cadena ligera de h38C2 imagen36
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Cadena pesada de h38C2
27
VL h38C2
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VH h38C2
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VL m38C2 imagen37
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VH m38C2
31
(Gly4 Ser)3
32
FGF21 líder
36
(Continuación)
SEQ ID NO:
Descripción Secuencia
33
Secuencia de 209 restos de FGF21, isoforma L174 (L146)
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Glp-1 (1227)
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Exendina4 imagen38
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Homólogo de Ex4 x2 = Aib
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Homólogo de Ex4 x40 (PLR) = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina,
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Homólogo de Ex4 x2 es Aib x40 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina, o está ausente
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Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x38 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
40
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x36 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
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Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x34 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina imagen39
42
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x32 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
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Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x28 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
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Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x27 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
45
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x26 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
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Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x24 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
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Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x23 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
37
(Continuación)
SEQ ID NO:
Descripción Secuencia
48
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x21 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
49
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x20 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
50
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x19 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
51
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x17 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
52
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x16 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
53
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x14 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
54
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x13 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
55
Homólogo de Ex4 x2 es AibPLRx@12 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina imagen40
56
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLRx@11 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina,
57
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x31 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina imagen41
58
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x21 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
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Homólogo de Ex4 x1 es d-His, x2 es Aib PLR@x14 = K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S, homoserina
38
(Continuación)
SEQ ID NO:
Descripción Secuencia
60
Homólogo de Ex4 x2 es Aib x40 cuando está presente es cualquier aminoácido y está unido a través del extremo carboxi-terminal o una cadena lateral a un engarce, y cuando x40 está ausente, uno de x12, x14, x19, x20, x21 es un PLR seleccionado del grupo K, KSH, KSMAL, Dap, Dab, R, Y, C, T, homocisteína S y homoserina, y cuando no es un PLR, x12 = K, x14 = M, x19 = V, x20 = R, x21 = L
61
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@12 = K
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Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@x12 = KSH; [u = 2].
63
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@14 = K; [u = 2].
64
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@14 = KSH; [u = 2].
65
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@19 = K; [u = 2].
66
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@19 = KSH; [u = 2].
67
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@20 = K; [u = 2].
68
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@20 = KSH; [u = 2].
69
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@21= K; [u = 2].
70
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@21= KSH; [u = 2].
71
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@40= K; [u = 2]. imagen42
72
Homólogo de Ex4 x2 es Aib PLR@40= KSH; [u = 2].
73
Género P171C de FGF21 x1= H o ausente,x146 = L o P
74
FGF21Δ H-P171C X1 = H o ausente, L146, P171C
39
(Continuación)
SEQ ID NO:
Descripción Secuencia
75
FGF21Δ H-P171C X1 = H o ausente, P146, P171C,
76
HC de h38C2-IgG2:
77
Homólogo de Ex4 X1 es C(O)CH3 x3 es Aib x15 = PLR@15=KSH; [u=2]. X41=NH2
78
Género de región constante de h38C2-IgG1lC x46=V o A, x84=V o L
79
Región constante de h38C2-IgG1lC Km(1)
80
Región constante de h38C2-IgG1lC Km(1,2)
81
Región constante de h38C2-IgG1lC Km(3)
82
Región constante de HC de H38C2 IgG1
La SEQ ID NO: 1 muestra la proteína expresada en el resto 181, en la que H1 es opcional y el resto 146 puede ser L
o P. Las posiciones de los restos ensayadas para la conjugación están subrayadas y en negrita. La numeración para SEQ ID NO: 1 se usa en todas partes.
5 También se muestran la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y pesada (SEQ ID NO: 25 y 26, respectivamente) de una realización de una lgG1 38c2 humanizada. Las regiones variables (VC y VH) están subrayadas y las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se presentan en negrita. La lisina 99, cuya cadena lateral se combina covalentemente con los engarces descritos en el presente documento, está adyacente a CDR3 de HC.
10
40
imagen43
imagen44
(Continuación)
Aminoácido
Número de resto Área superficial Fracción expuesta Aminoácido Número de resto Área superficial Fracción expuesta
ARG
19 78,6 0,31528 ARG 96 92,6 0,37144
ALA
26 93,9 0,8067 LEU 98 114 0,57576
GLN
27 126,5 0,66861 LEU 99 113,2 0,57172
GLN
28 169,4 0,89535 GLU 101 182,1 0,97276
THR
29 64,2 0,43349 ASP 102 94,6 0,60875
GLU
30 103,9 0,55502 GLY 103 56,1 0,66865
GLU
37 117,1 0,62553 GLN 108 72,6 0,38372
ASP
38 90,5 0,58237 GLU 110 132,4 0,70727
THR
40 49,8 0,33626 ALA 111 62,7 0,53866
GLY
43 38,1 0,45411 GLY 113 56,8 0,677
ALA
45 93,6 0,80412 LYS 122 164,4 0,79229
ASP
46 95 0,61133 PRO 124 67,4 0,46547
PRO
49 82,4 0,56906 HIS 125 168,4 0,84836
GLN
54 66,8 0,35307 ARG 126 131,4 0,52708
LYS
56 73 0,35181 PRO 128 91,3 0,63053
ALA
57 46,6 0,40034 ALA 129 78,8 0,67698
LEU
58 82,7 0,41768 ARG 131 225,5 0,90453
LYS
59 117,2 0,56482 GLY 132 65,8 0,78427
PRO
60 153,8 1,06215 PRO 133 84,9 0,58633
GLY
61 27,9 0,33254 ARG 135 106,2 0,42599
VAL
68 58,8 0,36229 GLY 141 30,4 0,36234
LYS
69 91 0,43855 LEU 142 69,1 0,34899
SER
71 69 0,54893 PRO 143 71,4 0,49309
ARG
77 129,4 0,51905 ALA 145 86,4 0,74227
PRO
78 98,9 0,68301 LEU 146 123,3 0,62273
ASP
79 109,8 0,70656 PRO 147 131,1 0,90539
TYR
83 84,4 0,35418 GLU 148 67,3 0,35951
LEU
86 119,4 0,60303 PRO 149 170 1,17403
HIS
87 104,8 0,52796
Ejemplo 2. Generación de proteínas y mutantes de FGF21
El ADNc de FGF21 se adquirió de la ATCC. Los vectores de expresión de mamíferos y bacterianos se construyeron
5 usando pcDNA3.1 (Invitrogen® y pET21 b (EMD), respectivamente. Para las variantes mutacionales de FGF21, se introdujeron mutaciones en los vectores de expresión usando un kit de mutagénesis dirigida QuikChange® (Stratagene®). La presencia de las mutaciones deseadas se verificó mediante secuenciación de ADN.
Para la expresión de mamíferos, se transfectaron células HEK293F (Invitrogen®) con el vector de expresión de mamífero de FGF21 usando reactivo de 293fectina (Invitrogen®) y se cultivaron en medio exento de suero. Se 10 sometieron a diálisis los medios acondicionados filtrados en condiciones estériles contra el tampón A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) y se cargaron en una columna HiTrap Q (GE Healthcare®) preequilibrada con tampón A. Se eluyó la proteína FGF21 con un gradiente lineal desde el tampón A hasta el tampón B (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, y NaCl
43
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a través de una resina de exclusión de tamaño. Se dispuso la proteína FGF21ΔH-A129C conjugada se a + 4 ºC para el almacenamiento de estabilidad. Se retiraron alícuotas a t = 0 (antes del almacenamiento de estabilidad) y a t = 1, 3, 8 y 14 días. Se realizó el análisis de la estabilidad del engarce mediante análisis de EMCL para determinar la cantidad relativa de proteína no conjugada, de conjugación de proteína + engarce y de eventos de hidrólisis simple y 5 doble de la proteína conjugada + engarce.
La hidrólisis del engarce es la variable analítica crítica en este experimento. La hidrólisis se monitorizó observando la subsiguiente adición de H2O al complejo de FGF21-engarce. Una sola adición de H2O, +(1) H2O, indica probablemente la hidrólisis del grupo AZD activo que está presente en los 4 engarces. La adición de una segunda molécula de H2O, +(2) H2O, es un indicador potente de hidrólisis (por ejemplo, inestabilidad química) en el engarce.
10 L1 es particularmente susceptible debido a la presencia de un grupo funcional maleimida.
Los resultados experimentales de la Tabla 4 que se presenta a continuación demuestran que L1 sufre el mayor incremento en + (2) H2O. A t = 0, cada uno de L1-L4 tenía un valor medido de +(2) H2O entre 6-8 % de la proteína total medida. Durante las 2 semanas, se monitorizaron estas muestras, el +(2) H2O observado en L1 había aumentado hasta el 18 % mientras que el valor para cada uno de los restantes engarces L2-L4 era constante al 6
15 8 %. Estos datos sugieren que L1 es relativamente inestable en comparación con L2-L4.
Tabla 4. Análisis de hidrólisis de L1-L4 conjugado con FGF21
Engarce
Tiempo (horas) 0 engarces 1 engarce +(1) H2O +(2) H2O
L1
0 13 49 30 8
L1
24 14 41 34 11
L1
72 14 40 35 11
L1
168 10 33 40 18
L1
336 12 28 41 18
L2
0 22 45 27 6
L2
24 23 43 26 8
L2
72 24 37 32 8
L2
168 24 40 29 7
L2
336 26 38 28 8
L3
0 19 45 30 6
L3
24 18 47 27 8
L3
72 19 43 30 8
L3
168 19 43 29 8
L3
336 20 43 29 8
L4
0 20 46 28 6
L4
24 20 46 27 7
L4
72 21 42 30 7
L4
168 21 41 32 6
L4
336 22 41 31 6

Ejemplo 43. Ab-FGF21ΔH-A129C conjugado con L1-L4
L2-L4 había demostrado previamente ser más estable que L1 con conjugaciones de glutatión en diversas 20 condiciones (véanse las Tablas 3A-C) y FGF21 (Tabla 4). Se fusionaron los enlaces de maleimida modificados L2-L4 a FGF21ΔH-A129C (eficacias de conjugación mostradas en la Tabla 5), y mostraron actividad en el ensayo Taqman de Glut1 (Tabla 5): los valores de CE50se normalizaron contra el valor relativo paraFGF21ΔH).
59
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imagen61
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Ab-FGF21ΔH-A129C resultó mejorar la tolerancia a la glucosa y reducir la ganancia de peso corporal, debido al aumento del gasto energético evidenciado por el aumento de la expresión de Ucp1 en el tejido adiposo blanco (WAT), e invierte la esteatosis hepática en ratones ob/ob (Figuras 6E, 6F, 6G, 6H y Tabla 12). Para la expresión de Ucp1, se homogenizaron muestras de WAT viscerales congeladas recogidas de los estudios de eficacia in vivo. Se 5 extrajo el ARN total de los tejidos homogenizados, y se midió la expresión de ARNm de Glut1 y GAPDH usando un kit de RT-PCR de Quantitect Probe, y se realizó una reacción de PCR cuantitativa en tiempo real en una máquina Taqman (Applied Biosystems). Se determinó el efecto del tratamiento mediante un cambio en los niveles de ARNm de Glut1 normalizados por los niveles de ARNm de GAPDH de cada muestra. Ab-FGF21ΔH-A129C causó pérdida de peso corporal debido al aumento del gasto energético, como sugiere el aumento de la expresión de Ucp1 en
10 WAT, la disminución de los triglicéridos en suero y de los niveles de ácidos grasos en ratones DIO y la disminución del peso hepático (Figuras 7A, 7B, 7C, 7D, 7E y Tabla 13). También se observó una reducción en el peso del hígado en ratones ob/ob (Figura 7F y Tabla 14). Ensayos adicionales en ratones ob/ob demostraron una reducción de los niveles de ARN de la estearil-coenzima A desaturasa-1 (SCD1) y monoacilglicerol O-aciltransferasa (MOGAT2), y un aumento en los niveles de ARN de la caja forkhead A2 (FoxA2) (Figuras 7G, 7H y 7i y Tabla 15).
15 Tabla 12. Resultados tras una sola inyección SC de Ab-FGF21ΔH-A129C el día 6 en ratones ob/ob; véanse las Figuras 6E, 6F, 6G, 6H *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 frente al vehículo mediante ANOVA de una vía con ensayos posteriores de Dunnett Los valores de ETM se proporcionan entre paréntesis.
Tratamiento
AUC de glucosa durante el OGTT, 3 mg/kg (% de control de vehículo) Expresión de ARNm de UCP1 en WAT 10 mg/kg, (ETM) Contenido de triglicéridos en hígado, 10 mg/kg (ETM) Cambio en el peso corporal (g) el día 6 con respecto al día 1, 10 mg/kg (ETM)
Vehículo
100 1,0(0,1) 35,7 (4,2) 6,2 (0,2)
FGF21ΔH 1 mg/kg una vez al día
67*** 2,6 (0,4) 37,0(2,3) 4,7 (0,3)
Ab-FGF21ΔH-A129C, día 0
80* 2,4 (0,3) 22,2 (2,1)* 4,2 (0,4)**
Ab-FGF21ΔH-A129C,día 1
68*** 2,6 (0,7) 22,1 (5,6)* 3,8 (0,3)***
Ab-FGF21ΔH-A129C,día 2
68*** 2,1 (0,6) 22,2 (2,4)* 3,8 (0,4)***
Ab-FGF21ΔH-A129C,día 3
57*** 2,5 (0,5) 27,7 (4,3) 4,0 (0,4)**
Control de delgados (vehículo)
57*** - 9,3 (1,4)*** 1,1 (0,6)***

Tabla 13. Resultados del 10 tras una repetición de la inyección SC DE Ab-FGF21ΔH-A129C A 10 mg/kg él día 0 y 7 en ratones DIO (véanse las Figuras 7A, 7B, 7C, 7D, 7E). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 frente al vehículo mediante ANOVA de una vía con ensayos posteriores de Dunnett Los valores de ETM se proporcionan entre paréntesis.
Tratamiento
AUC de glucosa durante el OGTT (% de control de vehículo) Cambio en el peso corporal (g) el día 10 con respecto al día 1, (ETM) Expresión de ARNm de UCP1 en WAT (ETM) Valores medios de lípidos en suero
TG (mg/dl) (ETM)
NEFA (mM) (ETM)
Vehículo
100 -0,2 (0,9) 1,2 (0,3) 133 (7,0) 0,61 (0,06)
FGF21ΔH 1 mg/kg una vez al día
75*** -1,6 (0,8) 1,6(0,2) 92 (9,6)** 0,40 (0,04)
Ab-FGF21Δ H-A129C, d 0 y 7
83* -2,4 (0,7) 4,8 (1,1)** 69 (6,4)*** 0,36 (0,04)*
Control alimentado con pienso (vehículo)
78** + 1,2 (0,4) 0,5 (0,1) 104 (9,2)* 0,52 (0,10)
63
imagen63
imagen64
imagen65
imagen66
(Continuación)
Conc. de [Ab]-[segundo engarce-Ex4]1, (mg/ml)
Proporción de [primer engarce-FGF21]: [Ab]-[segundo engarce-Ex4]1 % de [FGF21-primer engarce]1-[Ab][segundo engarce-Ex4]1
1,63
6 : 1 66
0,99
6 : 1 63
0,55
6 : 1 51
0,30
6 : 1 39
Se estudió la concentración de TCEP requerida para romper el enlace inter-disulfuro entre el dímero FGF21ΔH-A129C sin afectar el enlace intra-disulfuro dentro de FGF21ΔH-A129C. Los resultados se muestran en la Tabla 21. Se trató una muestra que contenía FGF21ΔH-A129C en Tris 20 mM, NaCl 50 mM, pH = 7 (aproximadamente 2
5 mg/ml) con diversas concentraciones de TCEP durante 30 minutos. Las muestras se analizaron por EMCL. Basándose en los datos, 0,3 mM de TCEP es la concentración óptima para romper el enlace inter-disulfuro entre la proteína FGF21ΔH-A129C sin afectar el enlace intra-disulfuro.

Tabla 21. Análisis de la formación de FGF21ΔH-A129C dimérica
TCEP (mM)
% de FGF21Δ H-A129C monomérica % de FGF21ΔH-A129C monomérica de intradisulfuro reducido % de FGF21Δ H-A129C dimérica
0,00
34,5 0,0 61,5
0,04
75,8 0,0 24,2
0,06
90,2 0,0 9,8
0,08
94,8 0,0 5,2
0,10
95,9 0,0 4,1
0,12
96,4 0,0 3,6
0,15
96,4 0,0 3,6
0,20
96,4 0,0 3,6
0,30
95,5 0,0 3,5
0,50
92,9 3,6 3,5
0,75
91,3 3,3 5,4
1,00
87,8 3,3 8,9
Se siguió la reducción del enlace inter-disulfuro usando HPLC durante 140 minutos usando tres concentraciones
10 diferentes de TCEP. Todos los enlaces inter-disulfuro se escindieron usando TCEP en el transcurso de 30 a 40 minutos. Estos experimentos sugieren que el enlace inter-disulfuro puede escindirse usando TCEP 0,3 mM en 30 minutos (Tabla 22).
Tabla 22. Efecto de diferentes relaciones molares de TCEP
Relación molar de TCEP
Tiempo (min) % de FGF21 % de impureza deFGF21 reducida % de FGF21 dimérica
mg/ml de FGF21
6,8 7,3 6,8 7,3 6,8 7,3 6,8 7,3
Relación molar de 0,1 de TCEP:rFGF21 0,03 mg/ml de TCEP
0 0 28,9 33,4 0,0 0,0 69,8 65,4
0
0
27,1 31,1 0,0 0,0 71,5 67,7
4
6,5 36,1 43,4 0,0 0,0 63,9 56,6
27
29,5 63,5 70,3 0,0 0,3 36,5 29,4
50
52,5 68,0 76,5 0,0 0,3 32,0 23,2
73
75,5 70,2 79,8 0,0 0,4 29,8 19,8
96
98,5 72,2 82,9 0,0 0,3 27,8 16,8
68 (Continuación)
Relación molar de TCEP
Tiempo (min) % de FGF21 % de impureza deFGF21 reducida % de FGF21 dimérica
119
121,5 72,9 82,6 0,0 0,3 27,1 17,1
142
144,5 73,8 81,8 0,0 0,0 26,2 18,2
Relación molar de 0,3 de TCEP:rFGF21 0,09 mg/ml de TCEP
0 0 28,9 33,4 0,0 0,0 69,8 65,4
0
0
27,1 31,1 0,0 0,0 71,5 67,7
4
8 45,9 59,3 0,0 0,0 54,1 40,7
27
31 94,2 93,7 1,0 1,0 4,8 5,3
50
54 96,5 94,4 1,4 1,3 2,2 4,3
73
77 96,6 95,1 1,4 1,4 2,0 3,5
96
100 96,6 94,7 1,6 1,6 1,7 3,7
119
123 96,3 94,3 1,9 2,0 1,8 3,7
142
146 96,0 94,9 2,1 2,3 1,8 2,8
Relación molar de 0,5 de TCEP:rFGF21 0,14 mg/ml de TCEP
0 0 28,9 33,4 0,0 0,0 69,8 65,4
0
0
27,1 31,1 0,0 0,0 71,5 67,7
4
11 55,7 69,5 0,0 0,0 44,3 30,5
27
34 96,4 95,2 1,4 1,3 2,3 3,5
50
57 96,4 95,2 1,8 1,7 1,8 3,1
73
80 96,1 94,2 2,1 2,0 1,8 3,8
96
103 95,5 94,9 2,4 2,2 2,1 2,9
119
126 95,4 94,2 3,0 3,0 1,6 2,8
142
149 94,9 93,6 3,5 3,6 1,6 2,8

Ejemplo 52. Generación de conjugados bifuncionales asimétricos (Estrategia 1)
Reacción de H38C2 + Exendina 4: se trataron 2,76 g de h38C2 (SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26) (en histidina 10 mM, glicina 10 mM, sacarosa al 2 %, pH 6,5, 136 ml) con 62,3 mg de péptido Ex4 (SEQ ID NO: 64 con K(SH)
5 como resto de enlace a péptido) conjugado al engarce L1 en 1,29 ml (concentración de 10 mM) de agua desionizada, y se dejó a temperatura ambiente durante una noche. Se analizó una pequeña cantidad de material usando cromatografía líquida de alto rendimiento dotada de columna de HIC-butilo y espectroscopia de masas para monitorizar la formación de Ab-[L1-SEQ ID NO: 64]1.
Extracción de especies de 1FA de Ab-Exendina 4: se diluyó una mezcla de reacción en bruto que contenía una
10 mezcla de anticuerpo, Ab-[L1-SEQ ID NO: 64]1 y Ab-[L1-SEQ ID NO: 64]2 (2,7 g en 136 ml de tampón hecho de histidina 10 mM, glicina 10 mM, sacarosa al 2 %, pH = 6,5) con 409 ml de tampón (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 1 M, pH = 7,0) y se cargó sobre una columna rellena con 681 ml de resina CM sefarosa. Se eluyó el producto fraccionadamente usando un gradiente de disolvente B (fosfato de sodio 50 mM, pH = 7,0 + isopropanol al 20 %) en A (sulfato de amonio 0,75 M y fosfato de sodio 50 mM, pH = 7,0). Se combinaron las fracciones que
15 contenían Ab-[L1-SEQ ID NO: 64]1. Se desinfectó un dispositivo de ultrafiltración-diafiltración (1.100 ml) dotado de una membrana de 50 KD con hidróxido de sodio 1 N y se equilibró con un tampón que contenía 2-amino-2hidroximetil-propano-1,3-diol 20 mM, cloruro de sodio 50 mM a pH = 7,0. La fracción combinada anterior que contenía Ab-[L1-SEQ ID NO: 64]1 se intercambió con tampón usando tris(hidroximetil)aminometano 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, pH = 7,0, y se concentró hasta 62 ml y se filtró a través de un filtro de 0,2 μm, dando 1,02 g de Ab
20 [L1-SEQ ID NO: 64]1 en tris (hidroximetil)aminometano 20 mM + cloruro de sodio 50 mM a pH = 7,0.
La separación por cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) se basa en la interacción entre la fase estacionaria y las características hidrófobas de las moléculas. El anticuerpo h38C2 es menos hidrófobo que Ab-[L1-SEQ ID NO: 64]1, que es menos hidrófobo que Ab-[L1-SEQ ID NO: 64]2. Durante la elución, el anticuerpo sin reaccionar se eluye antes, seguido de Ab-[L1-SEQ ID NO: 64]1. Ab-[L1-SEQ ID NO: 64]2 se eluye al final. Mediante el ajuste de la
25 proporción del anticuerpo con respecto al péptido, el % de los tres compuestos diferentes mencionados anteriormente puede variar.
69
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imagen77
Tabla 35. Resultados de fracciones de carga y columna de la SEC para la serie n.º 132
Conc. (mg/ml)
Agregados grandes % de agregados % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]2 % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]1 % de Ab
B3
0,19 0,0 1,4 83,3 13,0 2,2
B2
0,32 0,1 0,8 85,6 11,2 1,8
B1
0,20 0,0 0,9 80,9 15,8 2,5
C1
0,22 0,0 2,0 79,1 16,9 3,1
C5
0,27 0,0 2,1 10,2 37,2 50,6
C6
0,36 0,0 1,6 5,6 71,1 21,2
C8
0,58 0,0 2,7 3,5 89,8 5,1
C10
0,29 0,0 4,7 3,9 83,1 10,3
C11
0,20 0,0 5,8 5,3 64,4 25,5
C12
0,18 0,0 8,2 5,6 52,6 35,9
D12
0,15 0,0 5,6 4,9 39,2 47,7
D9
0,21 0,0 3,4 1,1 8,1 85,1
D8
0,28 0,0 1,4 0,6 2,8 93,2
Serie n.º 138: Después, se realizó un experimento con lavado isocrático de 1,6-hexanodiol al 2,4 % (es decir, serie de columna n.º 138) seguido de un gradiente de elución del 2,4 % al 18 % en 30 VC con una densidad de carga de 5 mg/ml. La Tabla 36 muestra el perfil de elución de esta serie con el ensayo de SEC de las fracciones. Se obtuvo una
5 separación mejorada usando la etapa de lavado al 2,4 % que precedió al gradiente de elución observado en este perfil de elución. Basándose en esto, se determinó que el 12 % del Tampón B y el Tampón A al 88 % proporcionan una concentración inicial adecuada de 1,6-hexanodiol a la elución en gradiente lineal de más de 30 VC, mientras que la serie de la columna n.º 134 pareció retirar mediante lavado inicialmente mucho Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]1 debido a la concentración de 1,6-hexanodiol ligeramente superior.
10 Tabla 36. Resultados de fracciones de carga y columna de la SEC para la serie n.º 138
Conc. (mg/ml)
% de agregados grandes % de agregados % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]2 % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]1 % de Ab
A5
0,20 0,0 0,7 9,6 84,6 5,1
A10
0,15 0,0 1,0 83,6 11,5 3,8
A12
0,17 0,1 0,8 87,9 9,4 1,8
C8
0,10 0,2 0,7 9,9 11,1 78,2
C11
0,11 0,2 1,7 11,9 34,0 52,1
C12
0,12 0,2 2,0 10,0 53,1 34,8
D1
0,15 0,1 2,0 7,1 72,4 18,3
D5
0,39 0,1 0,9 1,5 93,3 4,2
D8
0,27 0,0 1,5 2,3 89,7 6,4
D9
0,24 0,1 2,2 3,0 86,0 8,7
E2
0,13 0,2 5,6 3,2 34,1 56,9
E4
0,10 0,2 7,9 1,4 21,9 68,5
E9
0,28 0,0 0,3 0,0 0,0 99,7
81
Efecto de la temperatura y del pH
Serie n.º 148: se ha demostrado que la temperatura y el pH son importantes parámetros del procedimiento que influyen en el rendimiento de la columna y en la resolución de las diversas especies conjugadas. Se evaluó el impacto de la temperatura inferior en la serie de columna n.º 148 para la separación de la especie Ab-[SEQ ID NO: 5 10-L1]1 de otras especies en este estudio. Para este experimento, la columna y los tampones se almacenaron y se operaron a 17 ºC en un refrigerador a temperatura controlada. La columna se cargó hasta 5 mg/ml, y se lavó y se eluyó usando un protocolo similar a la serie de columna n.º 138. La reducción de la temperatura de 22 ºC a 17 ºC produjo una capacidad de unión enormemente reducida para la especie Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]2. Se encontró que el funcionamiento de la columna a la temperatura reducida (es decir, aproximadamente 17 ºC) mejoró la separación de 10 la especie Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]2 en la etapa de lavado y mejoró la resolución del producto Ab-[SEQ ID NO: 10L1]1 como es evidente en el perfil mostrado en la Tabla 37.
Tabla 37. Resultados de fracciones de carga y columna de la SEC para la serie n.º 148 a 17 ºC
Conc. (mg/ml)
% de agregados grandes % de agregados % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]2 % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]1 % de Ab
Carga de la columna
4,00 1,1 6,7 24,0 43,8 24,4
A3
0,24 0,0 0,0 8,2 17,3 74,5
A5
0,50 0,0 3,6 46,3 45,5 4,6
A7
0,38 0,0 3,1 81,5 10,6 4,8
A9
0,16 0,0 2,9 70,0 17,3 9,8
B11
0,05 0,0 0,0 30,0 32,9 37,1
C3
0,07 0,0 3,6 11,4 18,1 66,9
C7
0,12 0,0 3,6 3,5 27,0 65,9
C11
0,24 0,0 2,7 3,2 68,1 26,0
D3
0,32 0,0 1,2 1,8 91,6 5,4
D7
0,19 0,0 2,2 2,7 89,3 5,8
D11
0,12 0,0 7,0 4,6 74,3 14,1
E5
0,12 0,0 3,5 0,0 12,9 83,6
E9
0,10 0,0 6,1 0,0 2,2 91,8
F1
0,25 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0
F5
0,14 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

Tabla 38. Resultados de fracciones de carga y columna de la SEC para la serie n.º 152
Serie n.º 152: se encontró que el equilibrado de la columna a un pH inferior, de 6,5, pero realizando la elución a un pH superior, de 7,0, fue perjudicial para el rendimiento de separación en 152. Se observó que la especie Ab-[SEQ ID
15 NO: 10-L1]2 se une fuertemente a la columna a un pH inferior y se observó un cambio en el perfil de elución a la derecha resultando en una mala separación entre la especie Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]2 y la especie Ab Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]1 (Tabla 38).
Conc. (mg/ml)
% de agregados grandes % de agregados % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]2 % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]1 % de Ab
A3
0,15 0,0 0,0 0,0 0,0 5,7
A9
0,09 0,0 0,0 8,6 87,4 3,2
B9
0,05 0,0 0,6 74,7 15,5 8,8
C1
0,06 0,0 0,4 81,1 14,4 3,9
C5
0,12 0,0 0,6 86,6 10,5 2,1
C9
0,11 0,0 0,6 73,7 22,4 3,1
82 (Continuación)
Conc. (mg/ml)
% de agregados grandes % de agregados % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]2 % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]1 % de Ab
D1
0,11 0,0 1,2 29,2 49,5 20,0
D5
0,13 0,0 1,8 13,1 25,7 59,5
D9
0,29 0,0 1,6 3,4 84,0 11,0
E1
0,31 0,0 1,3 2,0 93,7 2,9
E5
0,12 0,2 6,7 4,1 74,1 14,8
E8
0,13 0,0 5,9 2,0 24,5 67,5
E9
0,13 0,0 6,1 1,9 19,5 72,6
F1
0,13 0,0 4,1 0,6 1,5 93,8
F5
0,20 0,0 0,4 0,0 0,1 99,5
F9
0,08 0,0 0,9 0,0 0,0 99,1
Desarrollo de las condiciones finales y demostración de la uniformidad del procedimiento
Serie n.º 156: la combinación seleccionada de las condiciones operativas, es decir, pH, temperatura, condiciones de ´lavado y elución en gradiente lineal usadas en la serie de columna n.º 148 proporcionaron la resolución adecuada 5 de la especie Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]1 de la especie Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]2. Se exploró una mejora adicional en la separación para lograr la resolución de la especie Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]1 de la especie de mAb en la serie de columna n.º 156 usando una etapa de retención isocrática de 1,6-hexanodiol al 8 % durante la elución en gradiente. Con 1,6-hexanodiol al 8 %, se eluye la mayor parte de la especie Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]1 de la columna dejando una gran proporción de la especie de mAb aún unida a la columna. La especie de mAb se eluyó posteriormente 10 durante la etapa de regeneración con un lavado isocrático de 1,6-hexanodiol al 100 %. Los resultados de la SEC de las fracciones de la serie de columna n.º 156 realizada a 5 mg/ml de densidad de carga de columna se muestran en la Tabla 39. El máximo de elución observado a mitad de la etapa de gradiente está enriquecido en especie Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]1 con niveles muy bajos de especie Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]2 y algunas especies de mAb. Se preparó una combinación representativa a partir de las fracciones n.º C8-D6, produciendo una concentración de proteína de
15 la combinación de 0,225 mg/ml correspondiente a un rendimiento de proteína de la columna del 24 %.

Tabla 39. Resultados de fracciones de carga y columna de la SEC para la serie n.º 156
Conc. (mg/ml)
% de agregados grandes % de agregados % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]2 % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]1 % de Ab
A3
0,22 0,0 1,6 32,5 63,0 2,9
A4
0,44 0,0 2,9 62,9 33,3 0,8
A5
0,13 0,1 3,0 83,5 12,8 0,6
C6
0,13 0,0 3,5 3,0 58,9 34,6
C8
0,21 0,0 2,0 2,1 82,1 13,8
C10
0,30 0,0 1,2 1,7 92,3 4,9
D3
0,22 0,0 1,2 1,4 94,7 2,7
D5
0,13 0,0 2,4 2,2 91,9 3,5
D6
0,10 0,0 3,7 3,0 88,2 5,1
E9
1,32 0,9 9,0 0,0 3,3 86,8
E10
0,80 0,8 4,7 2,0 2,1 90,4
Serie n.º 160: se evaluó el rendimiento del aumento a escala en la serie de columna n.º 160 usando una columna de 103 ml rellena usando una columna XK de 2,6 cm de diámetro rellena hasta una altura del lecho de 20 cm. La columna se cargó hasta 5 mg/ml, y se lavó y se eluyó usando un protocolo similar a la serie de columna n.º 156. Los 20 resultados de la SEC de fracciones de la serie de columna n.º 160 realizada a una densidad de carga de columna de 5 mg/ml se muestran en la Tabla 40. El máximo de elución de la etapa de gradiente lineal contenía fracciones de alta pureza enriquecidas en la especie Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]1. Se preparó una combinación de elución combinando las
83 Tabla 40. Resultados de fracciones de carga y columna de la SEC para la serie n.º 160

fracciones D2 -F1 contenía 36,4 % de proteína total, correspondiente a > 85 % de recuperación de la especie +1 cargada en la columna.
Conc. (mg/ml)
% de agregados grandes % de agregados % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]2 % de Ab-[FGF21ΔHA129C-L1]1 % de Ab
C7
0,13 0,0 2,4 5,1 56,1 36,4
D1
0,16 0,0 2,2 4,4 68,6 24,9
D2
0,22 0,0 1,8 3,4 81,6 13,1
D3
0,33 0,0 1,4 2,6 89,9 6,0
D5
0,49 0,0 0,9 1,7 95,5 1,8
D7
0,54 0,0 0,8 1,3 96,1 1,8
E3
0,39 0,0 0,8 1,5 95,9 1,8
E5
0,27 0,0 1,1 1,4 95,4 2,1
E7
0,11 0,0 1,9 2,2 93,0 2,8
F1
0,11 0,0 2,6 2,5 90,6 4,2
F2
0,11 0,0 2,0 82,9 14,6 0,5
F3
0,11 0,7 6,4 0,0 4,0 88,8
Se realizaron varias series de columnas (n.º 178, n.º 180 y n.º 182) en condiciones idénticas para ensayar la reproducibilidad del rendimiento a una carga de 5 mg/ml. Se preparó una combinación de elución para cada serie, y los perfiles de las combinaciones de elución de las 3 series realizadas en las mismas condiciones operativas se muestran en la Tabla 41, y los resultados han indicado resultados uniformes.
Tabla 41. Reproducibilidad de varias series de aumento a escala
% de agregados grandes
% de agregados % de Ab-[FGF21ΔH-A129CL1]2 % de Ab-[FGF21ΔH-A129CL1]1 % de Ab
Combinación final n.º 156
0,0 0 7,2 84,9 7,9
Combinación final n.º 160
0,0 1,3 1,7 94,3 2,7
Combinación final n.º 178
0 1,5 2,9 92,7 2,9
Combinación final n.º 180
0 1,5 1,6 93,4 3,4
Combinación final n.º 182
0 1,4 2,1 92,2 4,3
Conclusiones: Se escogió Butilo 650 S como la resina candidata preferida para la etapa de purificación cuando el
10 procedimiento de conjugación se llevó a cabo con la proteína FGF-21 acoplada al mAb primero seguido por el péptido Exendina4. La resina proporcionó una buena capacidad de unión de 5 mg/ml en ausencia de sal liotrópica. La elución del producto unido se realizó usando un gradiente de 1,6-hexanodiol a pH 7,0. La especie conjugada única Ab-[SEQ ID NO: 10-L1]1 se enriqueció y se eluyó selectivamente usando una estrategia de elución secuencial, es decir, etapa de lavado isocrático con hexanodiol al 2,4 % seguida de una elución de gradiente lineal de
15 hexanodiol al 2,4 %-8 %. Se obtuvo un rendimiento de más del 85 % para la especie mAb +1 FGF21 cargada en la columna.
Se encontró que la concentración de hexanodiol durante el paso de lavado, la densidad de carga de la columna, el pH y la temperatura eran parámetros importantes que influían en la capacidad de unión, la resolución y el rendimiento de la columna. Se aumentó a escala la etapa de purificación satisfactoriamente hasta la escala de 100
20 ml en el laboratorio y se realizó sistemáticamente en ensayos repetidos.
84
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(Configuración)
ID
Formulación % de HMW inicial % de HMW tras 1 semana a 30 ºC % de HMW tras 2 semanas a 25 ºC % de HMW tras 2 semanas a 30 ºC
D
Ácido glutámico 20 mM, pH 4,2 2,5 2,2 2,2 2,0
E
Ácido glutámico 20 mM, pH 4,5 2,6 2,4 2,3 2,3
F
Ácido glutámico 20 mM, pH 4,8 2,7 2,7 2,6 2,7
G
Ácido láctico 20 mM, pH 4,2 2,6 3,1 2,6 2,8
H
Ácido láctico 20 mM, pH 4,5 2,6 3,0 2,5 2,6
I
Ácido succínico 20 mM, pH 4,2 2,6 2,6 2,3 2,6
J
Ácido succínico 20 mM, pH 4,5 2,7 3,1 2,8 3,2
K
Ácido succínico 20 mM, pH 4,8 2,9 3,6 3,3 3,9
L
Ácido succínico 20 mM, pH 5,3 3,1 4,0 3,8 4,4

Tabla 60. Datos de alta concentración de [FGF21]-[primer engarce]-[Anticuerpo][segundo engarce]-[Ex4]
Además, se usó también la formulación de ácido glutámico a pH 4,5 para evaluar si los conjugados son solubles en disolventes acuosos tamponados a alta concentración y para evaluar la estabilidad a alta concentración. Se observó un aumento relacionado con la concentración (A280) en el % de HMW tras el almacenamiento. Los resultados se muestran en la Tabla 60.
Muestra
A280 Turbidez NTU % de HMW % de HMW de 1 semana a 2-8 ºC
Inicial
8,9 - 2,4 2,4
17 min
32,3 9,6 2,4 2,7
27 min
48,9 11,2 2,5 2,8
42 min
90 18,6 2,5 3,0

Ejemplo 70. Formulaciones liofilizadas de [FGF21]-[primer engarce]-[Anticuerpo]-[segundo engarce]-[Ex4]
Aunque se pueden usar formulaciones líquidas con los compuestos de la divulgación, las formulaciones liofilizadas
pueden proporcionar una mayor longevidad de la estabilidad. Los Ejemplos 68 y 69 muestran que las formulaciones
de [FGF21]-[primer engarce]-[Anticuerpo]-[segundo engarce]-[Ex4] solo con ácido glutámico, aunque superiores a 10 otros tampones tales como la histidina, pueden no proporcionar una estabilidad adecuada para el uso deseado a
largo plazo (todos los experimentos usaron ABC-1). La combinación de ácido glutámico con diversos tipos de
estabilizadores tales como un azúcar o poliol, que actúan como crioprotector y lioprotector (por ejemplo, trehalosa,
sacarosa, manitol) y un tensioactivo para la estabilidad a la agitación (por ejemplo, polisorbato 80, polisorbato 20,
poloxámero) y un agente quelante (por ejemplo, EDTA, DTPA) proporciona una mejora sinérgica de la estabilidad. 15 Por lo tanto, las combinaciones potencian claramente la estabilidad de [FGF21]-[primer engarce]-[Anticuerpo]
[segundo engarce]-[Ex4].
Las formulaciones se prepararon mediante intercambio de tampón y la adición de excipiente con una concentración
de proteína diana que varió entre las formulaciones (todos los experimentos usaron ABC-1). Las formulaciones
preparadas se filtraron usando un filtro de 0,2 µm y se envasaron en viales de vidrio. Para preparar formulaciones 20 liofilizadas, se liofilizaron los viales, se detuvieron y se taparon. En los puntos de tiempo indicados, se ensayaron las
muestras mediante diversos procedimientos analíticos incluyendo la SEC, iCE y cGE reducida. Además, las
formulaciones líquidas también se evaluaron durante 4 semanas para evaluar la tendencia de la estabilidad de las
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obtuvieron rendimientos de hasta el 57-58 % y combinaciones de productos que contenían 92-95 % de máximo principal.
Ejemplo 75. Desarrollo de etapas de reducción de sal, de meseta y de lavado con tampón
Se evaluaron varios parámetros durante el desarrollo de tres etapas de lavado para aumentar al máximo el
5 rendimiento y la pureza del producto. Durante la etapa de gradiente lineal de reducción de sal, se ensayaron la pendiente, duración y la concentración final del lavado. Después de esto, fue necesario establecer la concentración óptima y la duración del lavado de la meseta, y la duración óptima del lavado con tampón. Los resultados de varias series experimentales importantes se muestran en la Tabla 68, comparando la Tabla 69 los datos del ensayo de HIC de dos estas series experimentales.
10 Tabla 68. Definición del protocolo de lavado de reducción de sal para la columna de Fenil 650 S. ND =-no disponible.*Este no fue un lavado de tampón base, también contenía NaCl como se enumera. **Esta serie usó fosfato de sodio 20 mM, 1,6-hexanodiol, pH 7,0, el resto se eluyó con IPA al 20 % IPA en tampón base
Serie
Gradiente salino (NaCl) VC Meseta VC Tampón VC Etapa 4 VC % de rendimien to % de rendimiento del máximo principal
140
1 M-0 M 10 0 M 2 - - 46 61
143
0,75 M-0 M 8 0 M 5 - - 11 15
152
1 M-0,3 M 7 0,30 M 3 *0,10 M 3 - - 53 71
155
1 M-0,35 M 3 0,35 M 3 - - - - 45 57
159
1 M-0,44 M 7 0,44 M 4 *0,3 M 4 0 M 2 50 ND
167
1 M-0,3 M 7 0,30 M 8 0 M 2 - - 47 65
171
1 M-0,33 M 7 0,33 M 6 0 M 2 - - 57 75
**177
1 M-0,30 M 7 0,30 M 2 0 M 4 - - 73 96
185
1 M-0,33 M 7 0,33 M 6 0 M 3 - - 58 76
Escala de 9,5 l
1 M-0,33 M 7 0,33 M 6 0 M 3 72 93
GLP de 33 l
1 M-0,33 M 7 0,33 M 6 0 M 2 75 94

Tabla 69. Datos del ensayo de HIC Los máximos 1 y 2 no son reactivos/son parcialmente activos. El máximo principal es completamente reactivo en las reacciones de conjugación *El patrón de referencia se ha medido al 73,583,3 % en el ensayo de HIC en diferentes días.
Serie -Fracción
Máximo 1 Máximo 2 Máximo principal
Patrón de referencia
1,2 19,4 *75,6
140 -Fracción 6
3 86,8 10,2
140 -Fracción 10
0 11,1 88,9
140 -Fracción 12
0 11,2 88,8
140 -Fracción 22
0 9,7 90,3
Patrón de referencia
1,8 19,2 75,2
152 -Fracción 10
2,3 66,2 31,5
152 -Fracción 14
0 9,5 90,5
152 -Fracción 20
0 5,9 94,1
152 -Fracción 22
0 2,9 97,1
152 -Fracción 24
0 8,1 91,9
Patrón de referencia
0,6 17,9 77,1
101
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luego se desarrolló un gradiente de 7 VC de NaCl 1 a 0,33 M en fosfato de sodio 20 mM, pH 7. El gradiente se mantuvo a NaCl 0,33 M en fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0 para 5 VC, y fue seguido por un lavado de 2 VC con el tampón base, fosfato de sodio 20 mM, pH 7. Las formas menos reactivas de h38C2 se eluyeron durante la aplicación de estas etapas de lavado. Para la fase de elución, se desarrolló un gradiente del 0 al 15 % de 1,6
5 hexanodiol sobre 1 VC y se mantuvo al 15 % hasta que se completó la elución. El producto de h38C2 completamente reactivo se recogió en forma de una combinación de aproximadamente 1-2 VC.
10 las operaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente (18-22 ºC). B: fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0.

Tabla 71. El procedimiento de columna de HIC de Fenil 650 S *La dirección del flujo es de abajo a arriba. Todas las demás etapas tienen una dirección de flujo de arriba abajo. La velocidad de alimentación fue limitada por una presión máxima del sistema de 300 kPa. La unión de proteína en estas condiciones de carga fue del 100 %. Todas
Etapa
Caudal lineal (cm/h) VC % de B Solución
Lavado abundante
60 3 - Milli -Q
Equilibrado
80 5 - Fosfato de sodio 20 mM a pH 7, NaCl 1 M
Carga
80 ND - ~10 g/l en fosfato de sodio 20 mM a pH 7, NaCl 1 M
Lavado
80 1 - Fosfato de sodio 20 mM a pH 7, NaCl 1 M
Gradiente salino
80 7 0-67 Fosfato de sodio 20 mM a pH 7, NaCl 1 M-0,33 M
Meseta salina
80 5 67 Fosfato de sodio 20 mM a pH 7, NaCl 0,33 M
Lavado con tampón
80 2 100 Fosfato de sodio 20 mM a pH 7
Elución
60 1 0-75 Fosfato de sodio 20 mM a pH 7, 1,6hexanodiol al 20 %
Elución
60 5 75 Fosfato de sodio 20 mM a pH 7, 1,6hexanodiol al 20 %
Lavado abundante
60 3 - H2O purificada (WFI: agua para inyección)
*Limpieza
60 3 - Hidróxido de sodio 0,5 M
Lavado abundante
60 3 - WFI
Almacenamiento
60 2 - Fosfato de sodio 20 mM a pH 7, etanol al 20 %
A continuación, se sometió la combinación de producto de Fenil 650 S que contenía h38C2 completamente reactivo al 90-95 % a diafiltración en histidina 10 mM (8 diavolúmenes) con una membrana Hydrosart de 30 kD (3 m2 por Sartorius) a 130-280 g de mAb/m2 de membrana. El material retenido de UF se ajustó a 25 g/l con la cantidad apropiada de enjuague UF de tampón UF. Se introdujo una solución madre que contenía una cantidad de 4-5 veces 15 de los excipientes restantes en la solución de proteína diafiltrada con el fin de establecer la formulación intermedia final de la sustancia farmacológica. La formulación final fue: histidina 10 mM, glicina 10 mM, sacarosa al 2 %, pH 6,5 ± 0,3. La solución de compuesto intermedio de DS formulada se hizo pasar a través de un filtro final de 0,45/0,2 µm y se almacenó en bolsas de Stedium de tamaño apropiado o el equivalente hasta seis meses a 2-8 ºC. Para un almacenamiento a largo plazo, se congeló el producto intermedio de DS a -70 ºC hasta -80 ForC en botellas de PET
20 de 1 l o 4 l.
Las Tablas 72 y 73 muestran los rendimientos de las series del procedimiento de grado GLP y GMP usando el procedimiento perfeccionado de Fenil 650S
104
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Tabla 58. Aspecto y datos de UV de [FGF21]-[primer engarce]-[Anticuerpo]-[segundo engarce]-[Ex4] (ABC-1)
Formulación
Aspecto (NTU) Concentración (mg/ml)
Inicial
1 semana 30ºC 2 semanas 25 ºC 2 semanas 30 ºC Inicial 1 semana 30ºC 2 semanas 25 ºC 2 semanas 30 ºC
A
Ácido cítrico 20 mM, pH 4,2 12 530 296 362 8,1 5,5 5,9 5,5
B
Ácido cítrico 20 mM, pH 4,5 84 519 580 528 8,4 5,0 5,3 4,8
C
Ácido cítrico 20 mM, pH 4,8 55 498 522 530 8,0 4,8 5,3 4,4
D
Ácido glutámico 20 mM, pH 4,2 7 6 5 3 8,4 8,3 8,6 8,5
E
Ácido glutámico 20 mM, pH 4,5 7 7 6 6 8,3 8,3 8,5 8,5
F
Ácido glutámico 20 mM, pH 4,8 6 58 17 34 8,3 8,4 8,7 8,6
G
Ácido láctico 20 mM, pH 4,2 6 5 6 5 8,3 8,4 8,7 8,6
H
Ácido láctico 20 mM, pH 4,5 8 9 7 9 8,4 8,4 8,7 8,6
I
Ácido succínico 20 mM, pH 4,2 6 4 7 7 8,3 8,4 8,6 8,5
J
Ácido succínico 20 mM, pH 4,5 7 13 9 13 8,3 8,5 8,6 8,7
K
Ácido succínico 20 mM, pH 4,8 6 315 39 291 8,3 8,2 8,6 8,2
L
Ácido succínico 20 mM, pH 5,3 6 390 12 368 8,2 8,1 8,5 8,1
113
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