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ES2623464T3 - Nuevo factor de viabilidad neuronal y su uso para tratar la distrofia de conos - Google Patents

Nuevo factor de viabilidad neuronal y su uso para tratar la distrofia de conos Download PDF

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ES2623464T3
ES2623464T3 ES08760606.7T ES08760606T ES2623464T3 ES 2623464 T3 ES2623464 T3 ES 2623464T3 ES 08760606 T ES08760606 T ES 08760606T ES 2623464 T3 ES2623464 T3 ES 2623464T3
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José-Alain Sahel
Céline JAILLARD
Olivier Poch
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

Compuesto para su uso en terapia seleccionado del grupo que consiste en: i) un polipéptido que comprende la secuencia de amino ácidos expuesta en SEC ID NO:10; ii) un polinucleótido que codifica dicho polipéptido; iii) un vector que comprende dicho polinucleótido; y iv) una célula huésped modificada por ingeniería genética que expresa dicho polipéptido.

Description

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A continuación, la invención se describe con mayor detalle en relación con las secuencias de aminoácidos, las secuencias de ácidos nucleicos y los ejemplos.
Ejemplos
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1) Identificación de RdCVF2, un gen parálogo a RdCVF
El gen RdCVF de ratón se localiza en el cromosoma 8 y contiene tres exones y puede transcribirse en dos variantes de corte y empalme distintas que corresponden a RdCVF-L (larga) y RdCVF-S (corta), respectivamente.
En la figura 1, panel a, se describe la estructura de ambas variantes de corte y empalme de RdCVF. El ARNm de RdCVF-L (NM_145598, cromosoma 8 de ratón, cadena negativa, de 70’033’763 a 70’027’717) se compone de tres exones (1-3) de 348, 687 y 1751 pb. El ARNm de RdCVF-S (BC017153, de 70’033’785 a 70’032’615) se compone de un exón (1172 pb). Las regiones codificantes y no codificantes están representadas en gris oscuro y en gris claro
15 respectivamente. La región genómica que rodea el codón de terminación en el extremo del primer exón codificante y las secuencias ortólogas correspondientes en 12 genomas de otros vertebrados están alineadas. Los triángulos negros indican el extremo del primer exón codificante de RdCVF-L. Los codones de terminación conservados están en color rojo. Al final, se ofrecen las longitudes de las regiones codificantes (CDS) y de las regiones no traducidas (UTR, por las siglas untranslated regions) terminales.
La variante de corte y empalme de RdCVF-L se compone de tres exones, cuya variante codifica una proteína en la que los últimos 109 amino ácidos se denominan "cap" (caperuzón).
La variante de corte y empalme de RdCVF-S se compone de un único exón en el que la secuencia codificante es la
25 misma que el primer exón de la forma larga extendida por un codón seguido de un codón de terminación (TGA) y finalmente una región 3' (UTR) no traducida.
En consecuencia, el "cap" (es decir, los últimos 109 amino ácidos) de RdCVF-L faltan en RdCVF-S.
Una búsqueda BLAST en las bases de datos permitió la identificación de un gen parálogo denominado RdCVF2.
En la figura 1, panel b, se describe la estructura de ambas variantes de corte y empalme de RdCVF2. El ARNm de RdCVF2-L (AK015847, cromosoma 13 de ratón, cadena positiva, de 50’202’630 a 50’206’797) se compone de dos exones (1-2) de 603 y 564 pb. El ARNm de RdCVF2-S (BC016199, de 50’202’667 a 50’205’571) se compone de un
35 exón (2904 pb). Las regiones codificantes y no codificantes están representadas en gris oscuro y en gris claro respectivamente. La región genómica que rodea el codón de terminación en el extremo del primer exón codificante y las secuencias ortólogas correspondientes en 12 genomas de otros vertebrados están alineadas. Los triángulos negros indican el extremo del primer exón codificante de RdCVF2-L. Los codones de terminación conservados están en color rojo. Al final, se ofrecen las longitudes de las regiones codificantes (CDS) y de las regiones no traducidas (UTR) terminales.
Este análisis permite localizar el gen RdCVF2 en el cromosoma 13 y demostrar que las secuencias de RdCVF y RdCVF2 y las estructuras genéticas son muy similares entre ambas. De hecho, parece que RdCVF2 también codifica, tanto la proteína de tipo tiorredoxina (156 aa, SEQ ID NO.12), como una forma más corta (101 aa, SEQ ID
45 NO.2) denominadas RdCVF2-L y RdCVF2-S, respectivamente.
Finalmente, el análisis secuencial ha revelado que el grado de homología entre RdCVF y RdCVF2 es del 58,0 % para las isoformas largas y del 53,5 % para las isoformas cortas.
2) Conservación de la estructura genética de RdCVF y RdCVF2 durante la evolución
La viabilidad de los conos se relaciona con la producción de la forma RdCVF-S y, por extensión, con la presencia del codón de terminación en el extremo del primer exón requerido para obtener tal isoforma.
55 Para evaluar aún más la conservación de dicho codón de terminación, el servidor del buscador BLAT de genoma UCSC (HINRICHS et al., Nucleic Acids Revs., vol. 34 (publicación de la base de datos): D590-598, 2006; KENT, Genome Res., vol. 12(4): 656-664, 2002) se usó para mapear los genes RdCVF y RdCVF2 de ratón de todos los genomas de vertebrados disponibles y para extraer las secuencias genómicas correspondientes.
Los resultados han mostrado que ambos locus se hallaron en 13 vertebrados. Todos estos organismos manifestaron ambos genes exceptuando Takifugu rubripes y Tetraodon nigroviridis, en los que RdCVF se duplicó en la misma ubicación cromosómica (RdCVF a y b) con un intrón adicional insertado en el primer exón codificante de estos locus. Merece la pena destacar que el codón de terminación en el extremo del primer exón se conserva estrictamente en su gran mayoría (figura 1, paneles a y b).
65 Finalmente, esta observación implica la posible existencia de isoformas cortas de RdCVF en la mayoría de los
8
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se crearon usando el paquete de modelización por homología Builder (KOEHL y DELARUE, J. Mol. Biol., vol. 239(2): 249-275, 1994; KOEHL y DELARUE, Nat. Struct. Biol., vol. 2(2): 163-170, 1995; KOEHL y DELARUE, Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 6(2): 222-226, 1996). Los modelos finales se volvieron a perfeccionar mediante minimización de energía, usando ENCAD (LEVITT et al., Computer Physics Comm., vol. 91: 215-231,1995). En cada modelo se
5 aplicaron 1000 etapas de minimización en gradiente conjugado. La mutación E146(1EWX)→P146(RdCVF-L) obliga a que la conformación de la cadena principal local en la estructura del molde se adapte para ajustarse a la prolina. Builder muestrea simultáneamente la conformación de los bucles en las cinco inserciones/supresiones y en la región de mutación E→P, y la conformación de cadenas laterales, usando un enfoque de campo medio autoconsistente. PyMOL (www.pymol.org) se usó para reproducir las estructuras finales.
La figura 2 (panel b) muestra las estructuras de TRYX-I (1EWX y RdCVF(-L/2-L).
La figura 2 presenta las estructuras secundarias de 1EWX (lámina β y hélice α) debajo del alineamiento múltiple (panel a) y en la estructura 3D de TRYX-I (panel b).
15 La modelización estructural muestra que las inserciones 1, 2 y 3 corresponden respectivamente a: un aumento del tamaño de las láminas β1.1-β1.2, una extensión de un giro en la hélice α2, y una región estructural más grande que contiene la extensión αsup-βsup y α3 específica de TRYX. Los dos restos (96-97) que pertenecen a la inserción 3 en las proteínas RdCVF corresponden a un bucle contraído mayor delante de la cadena βsup y permiten discriminar estas proteínas de los miembros de TRYX. Merece la pena destacar que la ubicación sobre la proteína plegada donde se colocalizan las tres inserciones está en el lado opuesto del supuesto sitio catalítico (C44XXC47) en RdCVF (figura 2, panel b).
Finalmente, la región C-terminal ausente en las proteínas RdCVF(-S/2-S) (en lo sucesivo, denominada "cap" y
25 representada en verde en la figura 2, panel b) está fijada posicionalmente relativa al sitio catalítico. La región "cap" en las proteínas TXN interactúa con la enzima de reciclaje tiorredoxina reductasa [7, 13] y su ausencia podría afectar a la actividad de la tiorredoxina en TRX80 y RdCVF(-S/2-S) [4, 13].
Una característica llamativa de estos modelos estructurales es la clara proximidad espacial de los restos de las tres inserciones. Esta coincidencia apunta a un posible sitio de interacción novedoso en RdCVF(-L/2-L). Como se esperaba, la conformación de la cadena principal del modelo perfeccionado de RdCVF(-S/2-S) es la misma que su equivalente en las formas largas, con menores modificaciones observadas en las cadenas laterales en la interfaz entre las regiones de "cap" y sin "cap". Debería destacarse que la ausencia del "cap" produce la aparición de un parche hidrófobo mayor en la superficie de RdCVF(-S/2-S). Como consecuencia, la parte hidrófoba del área de
35 superficie accesible de las proteínas RdCVF aumenta de 2394 Å2 en la forma larga a 3157 Å2 en la forma corta.
4) RdCVF-S, RdCVF2-S y RdCVF2-L se expresan en la retina dependiendo de los bastones
El ARN total de la retina neural de ratones de tipo silvestre (C57BL/6@N) y rd1 mutante (C3H/He@N) de 8, 15 y 35 días de vida y del epitelio olfativo (Balb/c) se purificó mediante gradiente en cesio (CHIRGWIN et al., Biochemistry, vol. 18(24): 5294-5299, 1979).
El ADNc bicatenario se sintetizó a partir de 5 μg de ARN total usando Superscript Choice System (INVITROGEN), los ADNc se produjeron por estimulación aleatoria y se normalizaron de acuerdo con el ARNm de la glucosa-6
45 fosfato deshidrogenasa (GAPDH). La primera cadena de ADNc (0,2 μl) se amplificó por triplicado usando 2 μM de los cebadores específicos. Los cebadores 5’- CATCAC- CAACAAAGGGCGGAAG -3’ (SEQ ID NO.13) y 5’-CATTCCTCAGCAGAGAAGGGAAC -3’ (SEQ ID NO.14) se usaron para RdCVF2-S; los cebadores 5’-CCGTGCTATTGTTTCAGAGCCCTTAACTTTCTATC -3’ (SEQ ID NO.15) y 5’- CT- GACACTCCAATCGTAAAAGGCAGAAAACGC -3’ (SEQ ID NO.16) se usaron para RdCVF2-L. Los cebadores 5’-AAGCCGAT- GAGCAACTTCC-3’(SEQ ID NO.17) y 5’-TCATCTCCCAGTGGATTCTT-3’ (SEQ ID NO.18) se usaron para la rodopsina en un LigthCycler (Roche, Basel, Suiza).
Para llevar a cabo análisis de transferencia Northern, se usaron 2 μg de ARNm poli-A y la membrana se hibridó con una sonda correspondiente al exón 1 del gen RdCVF2 usando un método convencional.
55 La ausencia de contaminación de ADN se comprobó omitiendo la transcriptasa inversa. Los resultados se presentan como factor de diferencia en comparación con la expresión más baja.
La figura 3, panel a, muestra los resultados de RT-PCR en la retina de los ratones de tipo silvestre y rd1 en el día 35 posparto para las isoformas cortas (RdCVF2-S, fragmento 176 pb) y largas (RdCVF2-L, fragmento 170 pb) de RdCVF2.
La figura 3, panel b, muestra la expresión de los transcritos de RdCVF2 en el cerebro, testículos, retina normal (ts), retina degenerada (rd1) y en todo el embrión del ratón en el día embrionario 12,5 (ED12,5). 65 Los resultados establecieron que RdCVF2-S y -L se expresan en la retina del ratón de tipo silvestre (figura 3, panel
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Claims (1)

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