ES2623149T3 - Parvovirus atenuado vivo - Google Patents

Abstract

Parvovirus CPV2 atenuado vivo, caracterizado por que dicho CPV2 comprende un gen de la cápside de los serotipos 2a, 2b o 2c de CPV2 que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside y/o un aminoácido distinto de Glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside, y caracterizado por que un fragmento de ADN de una parte de la región de no cápside de dicho CPV2 está reemplazado por un fragmento de ADN homólogo de una parte de la región de no cápside derivado de un segundo parvovirus, en donde dicho fragmento de ADN homólogo de dicho segundo parvovirus lleva una mutación atenuante.

Description

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Ganancia de peso %

Días -4 a 0

Días 0 a +7 Días +7 a +14

Grupo 1 630att

7 13 11

Por lo tanto, se concluyó que las vacunas basadas en el clon 630att verdaderamente se comportan atenuadas cuando se comparan con el clon 630, y tienen un excelente perfil de seguridad. 5

Ejemplo 2: generación de un virus recombinante que tiene una mutación atenuante fuera del gen de la cápside

La cepa 154att se obtuvo a partir de un Nobivac Parvo C comercialmente disponible (Intervet Schering-Plough 10 Animal Health) y la cepa Jess era un aislado de campo de un virus tipo 2c.

Los virus se cultivaron en células de riñón caninas o felinas adherentes (por ejemplo, A72 y CrFK) usando medio M6B8 que contenía suero fetal bovino al 5 %. El ADN de forma replicativa (RF) se preparó a partir de cultivos de célula infectada usando una modificación del método “Hirt” estándar (McMaster y col. 1891).

15 El ADN de RF preparado a partir de la cepa 154att se digirió con la enzima de restricción Pstl y los fragmentos se separaron por electroforesis en gel de agarosa. La banda de 3.055 pares de bases (pb) (correspondiente al extremo a la izquierda del CPV) se escindió del gel y se purificó usando columnas de extracción en gel Qiagen Qiaquick. El ADN de RF aislado de las células infectadas por CPV Jess se digirió con la enzima de restricción Xmnl. De nuevo se

20 separaron los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa seguido de una purificación de una banda de aproximadamente 2.750 pb (correspondiente al extremo a la derecha del CPV que incluye la secuencia de la cápside) usando columnas de extracción en gel Qiagen Qiaquick.

Los fragmentos de 3.055 pb y 2.750 pb purificados de 154att y Jess se combinaron y se sometieron a transfección

25 dentro de células A72 y CrFK en cultivo. Las transfecciones se realizaron usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) con aproximadamente 3 µg de cada fragmento, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Después de la transfección, las células se sometieron a subcultivo y a seguimiento mediante el ensayo de hemaglutinación (HA). El virus se detectó por HA en el subcultivo 4. La determinación de la secuencia de ADN de los

30 virus híbridos se realizó usando los protocolos de secuenciación de ADN estándares que usan o bien modelos de fragmento de PCR o ADN de RF. El virus se purificó mediante dilución limitante en células caninas o felinas susceptibles adherentes.

Ejemplo 3: Virus recombinante construido a partir del ADN vírico clonado

35 El virus recombinante se generó a partir de fragmentos clonados. El genoma de la cepa 154att de virus se clonó dentro del vector de clonación estándar pBluescript (Stratagene inc.). Para mantener las secuencias terminales palindrómicas intactas el plásmido se propagó en el hospedador bacteriano DL795 que es defectuoso en un número de sistemas de recombinación.

40 La clonación de genomas de parvovirus se ha descrito en la bibliografía y las técnicas requeridas son conocidas por algunos expertos en la técnica.

El clon de 154att obtenido (p154att) se digirió con la enzima de restricción Pac I de manera que no se permitió que la

45 digestión llegara a finalización, es decir, la digestión de la enzima de restricción era solamente parcial. A continuación, los fragmentos digeridos se sometieron a digestión con la enzima de restricción Xmn I. A continuación, los fragmentos de ADN digeridos se separaron por electroforesis en gel de agarosa y el fragmento indicado en el diagrama de más adelante se escindió del gel y se purificó usando columnas de extracción en gel Qiagen Qiaquick. Los sitios Pac a la derecha y Xmn I flanquean la región de la cápside en el genoma de parvovirus. El gen de la

50 cápside de 154att se reemplazó por el gen de la cápside de una cepa virulenta de CPV como sigue. El sitio Xmn I y el Pac I a la derecha indicados en la figura 8 caen fuera de las fronteras del gen de la cápside. La secuencia de aproximadamente 110 pb entre el sitio Pac I y el extremo del gen de la cápside difiere significativamente entre la cepa 154att y los aislados virulentos. Hasta ahora no hay cambios de secuencia registrados en la secuencia corta (55 pb) entre el sitio Xmn I y el comienzo del gen de la cápside. Por lo tanto, para limitar el intercambio de material

55 justo a la secuencia de la cápside; se sintetizó químicamente la secuencia de la cápside de CPV virulenta y se mantuvo la secuencia específica a vacuna entre el sitio PacI y la señal de parada de la cápside.

A continuación, se muestra la secuencia químicamente sintetizada que contiene el gen de la cápside de CPV. La secuencia como se muestra a continuación se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 3.

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