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ES2623024T3 - Preparación de enzima que produce un sabor puro - Google Patents

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ES2623024T3
ES2623024T3 ES11189291.5T ES11189291T ES2623024T3 ES 2623024 T3 ES2623024 T3 ES 2623024T3 ES 11189291 T ES11189291 T ES 11189291T ES 2623024 T3 ES2623024 T3 ES 2623024T3
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ES
Spain
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arylsulfatase
lactase
milk
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ES11189291.5T
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English (en)
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Maximiliaan Peter Marie De Swaaf
Albertus Alard Van Dijk
Luppo Edens
Petrus Jacobus Theodorus Dekker
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DSM IP Assets BV
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Publication date
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Abstract

Un procedimiento para producir una lactasa mediante un método que comprende (a) cultivar una célula hospedante deficiente en arilsulfatasa en un medio nutriente, en condiciones que conduzcan a la expresión de la lactasa, en el que dicha célula hospedante deficiente en arilsulfatasa es una cepa recombinante deficiente en arilsulfatasa obtenida perturbando un gen que codifica actividad de arilsulfatasa, insertando un gen marcador en un gen que codifica actividad de arilsulfatasa, o eliminando parte o toda la región codificante de arilsulfatasa del genoma, (b) expresar la lactasa en dicha célula hospedante, y (c) recuperar la lactasa del medio nutriente o de la célula hospedante.

Description

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DESCRIPCION
Preparacion de enzima que produce un sabor puro Campo de la invencion
La invencion se refiere a un procedimiento para producir una lactasa.
Antecedentes de la invencion
El uso de enzimas para mejorar la naturaleza qmmica, ffsico-qmmica u organoleptica de productos de grado alimentario esta ampliamente extendido. Tambien en el procesamiento de leche de vaca y otros sustratos derivados de animales, el uso de enzimas anade un valor significativo al producto final. Los ejemplos son incubaciones con lactasa para hacer a la leche aceptable a individuos intolerantes a la lactosa, la hidrolisis proteolftica de casema y protemas del suero de la leche para aliviar alergenicidades y mejorar las caractensticas de espuma, la modificacion de fosfolfpidos del huevo usando fosfolipasa A2 para mejorar el comportamiento de coccion y estabilizar las mayonesas, el uso de transglutaminasa en productos de carne y de pescado para mejorar la dureza y elasticidad, asf como la eliminacion de oxfgeno de los productos de huevo o queso rayado anadiendo glucosa oxidasa. Adicionalmente, los tratamientos enzimaticos se estan usando para potenciar el sabor de diversos productos alimentarios derivados de animales. Por ejemplo, las proteasas estan siendo usadas para acelerar el desarrollo de sabor en extractos de pescado y de carne. Ademas, la aceleracion del desarrollo del sabor en queso es una diana bien conocida. Mientras que el EMC (queso modificado con enzimas) es un producto consolidado en el que se usan principalmente diversas lipasas, la aceleracion de los cambios de sabor sutiles implicados en el envejecimiento de los quesos al anadir pequenas cantidades de exoproteasas, lipasas o esterasas es un desarrollo mas reciente.
La invencion se refiere a lactasa. La lactasa o p-galactosidasa (E.C: 3.2.1.23) es una enzima que cataliza la hidrolisis de lactosa (un disacarido) en sus componentes monosacaridos glucosa y galactosa. La lactosa esta presente en productos lacteos, y mas espedficamente la leche, leche desnatada, nata y otros productos lacteos. La ruptura de la lactosa se produce en la pared intestinal del cuerpo humano (y de otros mairnferos) por la presencia natural de lactasa.
Los problemas nutricionales y funcionales provocados por la lactosa en la mayona de poblaciones que carecen de lactasa son bien conocidos y estan descritos. Los miembros de tales poblaciones no pueden hidrolizar la lactosa, que en tales casos pasa al intestino grueso, donde produce deshidratacion, pobre absorcion de calcio, diarrea, flatulencia, eruptacion y calambres, y, en casos graves, incluso diarrea acuosa explosiva.
Una aplicacion industrial importante de la lactasa es en la produccion de productos lacteos con lactosa hidrolizada para individuos intolerantes a la lactosa. Tales productos lacteos hidrolizados incluyen leche pasteurizada, leche UHT y leche reconstituida de todos o de parte de sus constituyentes originales con o sin etapas de procesamiento intermedias tales como hidrolisis proteica. El tratamiento con lactasa se puede realizar antes o despues del tratamiento termico de la leche. El tratamiento con lactasa se puede realizar anadiendo la enzima a la leche. Las propiedades de solubilidad de la lactosa son tales que pueden conducir a su cristalizacion, conduciendo a una textura arenosa o grumosa. Tal textura indeseada se puede encontrar en algunos productos lacteos tales como leche condensada, leche evaporada, leche seca, leche congelada, helado, y en productos de pastelena con un contenido elevado de leche. La hidrolisis completa o parcial de la lactosa por lactasa elimina este problema, proporcionando productos con una textura homogenea y, como resultado, una mayor aceptacion por el consumidor.
Otra aplicacion industrial de la lactasa es para incrementar el sabor dulce en productos que contienen lactosa, como la leche o el yogur. La hidrolisis de la lactosa en tales productos da como resultado un mayor sabor dulce como resultado de la produccion de glucosa. Otra aplicacion industrial de lactasa es la hidrolisis de productos de lactosa que contienen componentes lacteos, tales como el pan. La lactosa se anade en tales productos para potenciar el sabor, retener la humedad, proporcionar un color pardo y mejorar las propiedades de tostado. Los jarabes de lactosa hidrolizada son prometedores en terminos de, por ejemplo, potenciar el desarrollo del color de la corteza, mejorar el sabor y el aroma, modificar la textura, prolongar el penodo de caducidad, y robustecer la estructura de la hogaza.
La hidrolisis de la lactosa por lactasa en productos lacteos fermentados, tales como yogur, aumentara el sabor dulce. Sin embargo, cuando se anade la lactasa antes del comienzo del proceso fermentativo, puede incrementar la velocidad de desarrollo de acido, y reducir de este modo los tiempos de procesamiento. El tratamiento con lactasa de leche o productos derivados de la leche tales como el suero hace a tales productos adecuados para la aplicacion en piensos para animales y alimentos para mascotas para aquellos animales intolerantes a la lactosa, tales como gatos. La hidrolisis de la lactosa permite la fabricacion de suero lacteo mas concentrado y, al mismo tiempo, evita problemas del intestino, similares a los descritos previamente para pacientes con deficiencia de lactosa. El suero lacteo con lactosa hidrolizada se concentra para producir un jarabe que contiene 70-75% de solidos, y se usa como ingrediente alimentario en helado, productos de panadena y de pastelena.
Las lactasas se han descrito para y aislado de una gran variedad de organismos, incluyendo microorganismos. La lactasa es a menudo un componente intracelular de microorganismos como Kluyveromyces y Bacillus. Kluyveromyces y especialmente K. fragilis y K. lactis, y otras levaduras tales como aquellas de los generos Candida,
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Torula y Torulopsis, son una fuente habitual de lactasas enzimaticas de levaduras, mientras que B. coagulans o B. circulans son fuentes bien conocidas para lactasas bacterianas. Existen varias preparaciones de lactasa comerciales, derivadas de estos organismos, tales como Maxilact® (de K. lactis, producida por DSM, Deflt, Pafses Bajos). Todas estas lactasas son denominadas lactasas neutras, puesto que tienen un optimo de pH entre pH = 6 y pH = 8. Varios organismos tales como Aspergillus niger y Aspergillus oryzae pueden producir lactasa extracelular, y la patente US 5.736.374 describe un ejemplo de tal lactasa, producida por Aspergillus oryzae. Las propiedades enzimaticas de lactasas como optimo de pH y de temperaturas vanan entre especies. En general, sin embargo, las lactasas que son excretadas muestran un menor optimo de pH de pH = 3,5 a pH = 5,0; las lactasas intracelulares muestran habitualmente un mayor optimo de pH en la region de pH = 6,0 a pH = 7,5, pero se producen excepciones a estas reglas generales. La eleccion de una lactasa neutra o acida depende del perfil de pH en la aplicacion. En aplicaciones con pH neutro, habitualmente se prefieren lactasas neutras; tales aplicaciones incluyen leche, helado, suero lacteo, queso, yogur, leche en polvo, etc. Las lactasas acidas son mas adecuadas para aplicaciones en el intervalo acido. La concentracion apropiada de lactasa depende de la concentracion inicial de lactosa, del grado requerido de hidrolisis, del pH, la temperatura y del tiempo de hidrolisis.
Aunque dirigido a mejorar la funcionalidad y/o perfiles de sabor del producto alimentario, ocasionalmente un tratamiento enzimatico puede tener efectos secundarios inesperados e indeseables. Un ejemplo de un efecto secundario indeseable es el desarrollo de un sabor rancio como resultado del tratamiento enzimatico.
Mettall et. al, The Australian Journal of Dairy Technology, (1991), 46-48, describen el problema del desarrollo de un sabor rancio cuando la leche es tratada con lactasa. Segun esta publicacion, niveles elevados de proteasa daran como resultado el desarrollo rapido de sabores rancios. Por lo tanto, los procedimientos de produccion se optimizan para minimizar actividades secundarias proteoltticas, a fin de reducir el riesgo de la formacion de sabor rancio. En el documento WO 02/081673 se describe un ejemplo de un procedimiento de purificacion para lactasa derivada de K. lactis.
Se encuentra que incluso las preparaciones de lactasa con baja actividad de proteasa pueden todavfa dar lugar a la formacion de un sabor rancio. Este es especialmente el caso para las lactasas neutras, derivadas del citoplasma de levadura. La formacion del sabor rancio que esta asociada con el uso de preparaciones de lactasa es especialmente cntica para leche UHT con lactosa hidrolizada. Las lactasas que se usan en este caso son lactasas neutras debido a su optimo de pH favorable para la leche. La leche UHT ha recibido un tratamiento con mucho calor para obtener un penodo de caducidad de varios meses a temperatura ambiente. Los tiempos de almacenamiento prolongados fuera del frigonfico hacen a estos productos especialmente tendentes a formar un sabor rancio: incluso una velocidad de formacion de sabor rancio muy baja puede dar lugar a una formacion importante de sabor rancio despues de varios meses de almacenamiento, haciendo al producto poco atractivo para el consumo.
Sumario de la invencion
Sorprendentemente, ahora se encuentra que la presencia de arilsulfatasa como actividad secundaria contaminante en preparaciones enzimaticas, incluso a niveles muy bajos, puede conducir a un fuerte desarrollo de sabor rancio en un producto cuando un sustrato se trata con la preparacion, y que el uso de una preparacion enzimatica que no tiene actividad de arilsulfatasa, o tiene actividad reducida de arilsulfatasa, da como resultado una fuerte reduccion del desarrollo del sabor rancio.
En consecuencia, la invencion proporciona un procedimiento para producir una lactasa mediante un metodo que comprende
(a) cultivar una celula hospedante deficiente en arilsulfatasa en un medio nutriente, en condiciones que conduzcan a la expresion de la lactasa, en el que dicha celula hospedante deficiente en arilsulfatasa es una cepa recombinante deficiente en arilsulfatasa obtenida perturbando un gen que codifica actividad de arilsulfatasa, insertando un gen marcador en un gen que codifica arilsulfatasa, o eliminando parte o toda la region codificante de arilsulfatasa del genoma,
(b) expresar la lactasa en dicha celula hospedante, y
(c) recuperar la lactasa del medio nutriente o de la celula hospedante.
Se puede obtener lactasa que comprende menos de 40 unidades de actividad de arilsulfatasa por NLU de actividad de lactasa.
La preparacion de lactasa puede usarse ventajosamente en productos alimentarios y de piensos para hidrolizar lactosa sin la formacion de compuestos de sabor rancio.
Sorprendentemente, se ha encontrado que la aril-sulfatasa es una actividad enzimatica crucial, responsable de la formacion del sabor rancio. Se han encontrado pruebas confirmatorias anadiendo aril-sulfatasa a leche UHT, y que dio como resultado que esta enzima individual es capaz de imitar el sabor rancio observado a menudo en leche UHT tratada con lactasa.
Sin desear estar atados por ninguna teona cientffica, se cree que la hidrolisis de conjugados metabolicos, en particular alquilfenoles sustituidos con un grupo sulfato, mediante las arilsulfatasas es un mecanismo que da como resultado el desarrollo de sabor rancio. En consecuencia, las preparaciones enzimaticas son particularmente ventajosas para el tratamiento de sustratos que contienen un alquilfenol sustituido con un grupo sulfato.
5 Descripcion detallada de la invencion
En un aspecto, la invencion proporciona un procedimiento para producir una lactasa mediante un metodo que comprende
(a) cultivar una celula hospedante deficiente en arilsulfatasa en un medio nutriente, en condiciones que conduzcan a la expresion de la lactasa, en el que dicha celula hospedante deficiente en arilsulfatasa es una
10 cepa recombinante deficiente en arilsulfatasa obtenida perturbando un gen que codifica actividad de
arilsulfatasa, insertando un gen marcador en un gen que codifica arilsulfatasa, o eliminando parte o toda la region codificante de arilsulfatasa del genoma,
(b) expresar la lactasa en dicha celula hospedante, y
(c) opcionalmente recuperar la lactasa del medio nutriente o de la celula hospedante.
15 Se puede obtener lactasa que comprende menos de 40 unidades de actividad de arilsulfatasa por NLU de actividad de lactasa. Preferiblemente, la lactasa comprende menos de 30 unidades de actividad de arilsulfatasa por NLU de actividad de lactasa, mas preferiblemente menos de 20 unidades de actividad de arilsulfatasa por NLU de actividad de lactasa, y lo mas preferible menos de 10 unidades de actividad de arilsulfatasa por NLU de actividad de lactasa. Las unidades de aril-sulfatasa se definen en el ejemplo 2, y estan normalizadas para la actividad de lactasa 20 expresada en NLU, y tambien se define en el ejemplo 2.
La lactasa puede ser una lactasa producida intracelularmente o extracelularmente. En una realizacion preferida, la lactasa es lactasa producida intracelularmente.
En una realizacion preferida, la lactasa es una lactasa neutra. La lactasa neutra puede tener un optimo de pH entre pH = 6 y pH = 8.
25 Las preparaciones de lactasas neutras derivan habitualmente del citoplasma de microorganismos. Su produccion incluye la fermentacion (a gran escala) del microorganismo, seguido del aislamiento de la lactasa. Esto ultimo requiere la destruccion de la pared celular a fin de liberar la enzima del citoplasma. Se pueden usar varias tecnicas para obtener la lisis celular, incluyendo la permeabilizacion de la pared celular por disolventes organicos tales como octanol, tratamiento con ultrasonidos o prensa francesa. Otras enzimas, ademas de la lactasa, son liberadas al 30 mismo tiempo del citoplasma, incluyendo proteasas.
La lactasa puede tener menos de 0,5 RFU/min. de actividad de proteasa por NLU de actividad de lactasa.
Las lactasas intracelulares que se pueden purificar como se describe aqrn se han descrito y aislado de una gran variedad de organismos, incluyendo microorganismos. La lactasa es a menudo un componente intracelular de microorganismos como Kluyveromyces y Bacillus. Kluyveromyces y especialmente K. lactis, K. marxinus y K. fragilis, 35 y otras levaduras tales como aquellas del genero Candida, Torula y Torulopsis, son una fuente habitual de lactasas enzimaticas de levadura, mientras que B. coagulans o B. circulans son fuentes bien conocidas para lactasas bacterianas. Existen varias preparaciones de lactasa comerciales, derivadas de estos organismos, tales como Maxilact® (procedente de K. lactis, producida por DSM). Todas estas lactasas son lactasas denominadas neutras, puesto que tienen un optimo de pH entre pH = 6 y pH = 8.
40 Las lactasas intracelulares se han descrito para diversas especies, y para varias de ellas se conocen sus secuencias de aminoacidos y/o sus secuencias de ADN. La informacion de secuencia esta disponible publicamente en bases de datos de secuencias, por ejemplo en GenBank (Bethesda, Maryland USA), European Molecular Biology Laboratory's European Bioinformatics Institute (EMBL-Bank en Hinxton, UK), el DNA Data Bank of Japan (Mishima, Japon) y el Swissprot (Suiza). Las lactasas se pueden identificar en genomas basandose en homologfa en las secuencias 45 genicas y/o proteicas. Las preparaciones brutas de enzimas intracelulares se caracterizan por la presencia de varias enzimas que solo aparecen en el citoplasma de la celula, tal como las enzimas implicadas en el metabolismo central de la celula, incluyendo aquellas implicadas en la glucolisis.
Tambien se han descrito lactasas extracelulares. Generalmente se reconocen como enzimas extracelulares debido a que contienen una secuencia peptfdica denominada secuencia lfder. Esta secuencia lfder es reconocida en cierta 50 manera por la celula que produce las enzimas como una senal de que la enzima debena ser exportada fuera de la celula. Durante la secrecion, habitualmente se elimina la secuencia lfder. Las lactasas extracelulares se han descrito para diversas especies, por ejemplo Aspergillus oryzae. Las preparaciones brutas de lactasas extracelulares se caracterizan por la presencia de enzimas intracelulares y la presencia de enzimas extracelulares tfpicas como proteasas. El tipo de enzimas extracelulares encontrado vana con el organismo, y son tfpicos para ese organismo.
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Debido a la lisis celular durante la fermentacion o el procesamiento, se pueden encontrar niveles bajos de enzimas intracelulares en tales preparaciones de enzimas extracelulares.
Las enzimas lactasa se pueden clasificar de este modo como extracelulares o intracelulares basandose en la comparacion de su secuencia de aminoacidos con aquellas de otras lactasas conocidas. En principio, una lactasa intracelular puede estar provista de una secuencia lfder. Esto podna dar como resultado la excrecion de la lactasa desde la celula al medio. Las preparaciones brutas de tales enzimas se caracterizanan por una lactasa, clasificada como intracelular en base a su secuencia de aminoacidos, en presencia de enzimas extracelulares tfpicas y ausencia de niveles, o niveles bajos, de enzimas intracelulares tipicas.
Las lactasas intracelulares preferidas usadas en la presente invencion son: lactasa de K. lactis que tiene una secuencia de aminoacidos como se describe en
http://www.ebi.uniprot.org/entry/BGAL_KLULA, o una lactasa que tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos 90%, preferiblemente al menos 95% identica a la secuencia de aminoacidos de K. lactis. La lactasa de K. marxianus que tiene una secuencia de aminoacidos como se describe en
http://www.ebi.uniprot.org/entry/Q6QTF4_KLUMA, o una lactasa que tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos 90%, preferiblemente al menos 95% identica a la secuencia de aminoacidos de K. lactis. La lactasa de B. circulans que tiene una secuencia de aminoacidos como se describe en
http://www.ebi.uniprot.org/uniprot- srv/uniProtview.do?proteinId=O31341_BACCI&pager.offset=0
http://www.ebi.uniprot.ora/uniprot-
srv/uniProtView.do?proteinId=Q45092 BACCI&pager.offset=0
http://www.ebi.uniprot.org/uniprot-
srv/uniProtView.do?proteinId=Q45093 BACCI&pager.offset=0, o una lactasa que tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos 90%, preferiblemente al menos 95% identica a la secuencia de aminoacidos de B. circulans.
Las expresiones “homologfa” o “porcentaje de identidad” se usan aqrn de forma intercambiable. Se define aqrn que, a fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos o de dos secuencias de acido nucleico, las secuencias se alinean con fines de comparacion optima (por ejemplo, se pueden introducir saltos en la secuencia de la primera secuencia de aminoacidos o de acido nucleico para el alineamiento optimo con una segunda secuencia de aminoacidos o de acido nucleico). Entonces se comparan los restos de aminoacidos o nucleotidos en las posiciones de aminoacidos o posiciones nucleotfdicas correspondientes. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo resto de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = numero de posiciones identicas/numero total de posiciones (es decir, posiciones que solapan) x 100). Preferiblemente, las dos secuencias tienen la misma longitud. La persona experta estara al tanto del hecho de que existen varios programas de ordenador diferentes para determinar la homologfa entre dos secuencias. Por ejemplo, una comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr usando un algoritmo matematico. En una realizacion preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en
http://www.gcg.com), usando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y el peso de salto de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. La persona experta apreciara que todos estos parametros diferentes produciran resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se ve alterado significativamente cuando se usan algoritmos diferentes.
La preparacion de lactasas intracelulares requiere la destruccion de las celulas para liberar la enzima lactasa. Al mismo tiempo, se liberan otras enzimas citoplasmicas. La calidad de una preparacion industrial de la lactasa se determina mediante la relacion de actividades secundarias a actividad de lactasa. Especialmente las proteasas son enzimas secundarias cnticas, puesto que se sabe que conducen a efectos secundarios indeseados en la aplicacion, tal como la coagulacion de la leche o la formacion de un sabor rancio en la leche. La formacion de un sabor rancio es especialmente cntica en productos con un penodo de caducidad prolongado y que se almacenan a temperaturas ambiente. Uno de tales productos es la leche UHT, y la formacion del sabor rancio es un problema conocido para la leche UHT con lactosa hidrolizada. La leche UHT es muy sensible a la formacion de sabor rancio; cuando una preparacion de lactasa no genera un sabor rancio en la leche UHT, tampoco generara habitualmente un sabor rancio en otras aplicaciones. Los compuestos asociados con la formacion del sabor rancio en la leche, y especialmente leche UHT, estan relacionados tanto con la reaccion de proteolisis como la reaccion de Maillard (Valero et al (2001) Food Chem. 72, 51-58). Cualesquiera proteasas presentes como actividades secundarias en preparaciones de lactasa realzan potencialmente la formacion del sabor rancio; no esta claro que niveles de proteasas son necesarios, pero podnan ser importantes con tiempos de almacenamiento de varios meses incluso actividad proteolftica muy baja. La leche UHT es muy sensible a la formacion de sabor rancio; cuando una preparacion de lactasa no genera sabor rancio en leche UHT, distinto de los sabores rancios descritos (por ejemplo, como se describe en Valero et al (2001) Food Chem. 72, 51-58), habitualmente tampoco generara un sabor rancio en otras aplicaciones. La aplicacion de UHT es por lo tanto un buen metodo para evaluar la calidad de las preparaciones de lactasa con respecto a su potencial para la formacion de un sabor rancio. Puesto que las proteasas se consideraron al menos parcialmente responsables de la formacion del sabor rancio, los esfuerzos se han enfocado en reducir los niveles de proteasa de los productos de lactasa. Sin embargo, se ha encontrado que una reduccion de los niveles de proteasa
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no conduce a la eliminacion total de la formacion del sabor rancio en leche UHT. Sorprendentemente, se ha encontrado que la aril-sulfatasa es una actividad enzimatica crucial, responsable de la formacion del sabor rancio. Hemos encontrado pruebas confirmatorias anadiendo aril-sulfatasa a leche UHT, lo cual dio como resultado que esta enzima individual fuese capaz de imitar el sabor rancio observado a menudo en leche UHT tratada con lactasa.
Se describe un procedimiento cromatografico para eliminar la aril-sulfatasa de la enzima lactasa, que puede derivar de K. lactis.
Se realizo un analisis sensorial detallado de diversas muestras de leche UHT que o bien no conteman un sabor rancio o bien conteman niveles significativos de sabor rancio (ejemplo 1). Estos analisis sensoriales se combinaron con analisis detallados de la composicion qmmica de las muestras. Se identificaron diversos compuestos como compuestos de aroma claves, y la mayona de ellos se habfan descrito previamente como asociados con leche UHT. Sorprendentemente, tambien se identifico a p-cresol como un compuesto clave de sabor rancio. Este compuesto no habfa sido descrito previamente entre los compuestos de sabor rancio en leche UHT (Valero et al (2001) Food Chem. 72, 51-58). Se puede generar mediante aril-sulfatasa a partir de su conjugado de sulfato que esta presente en cantidades muy pequenas (niveles de ppb) en la leche ((V. Lopez, R.C. Lindsay J Agric. Food Chem. (1993), 41, 446-454; M. Killic y R.C. Lindsay, J Dairy Sci (2005) 88, 7-12; M Kilic y R.C. Lindsay J Agric Food Chem (2005) 53, 1707-1712). Sorprendentemente se ha encontrado que aril-sulfatasa es una actividad enzimatica en preparaciones de lactasa y responsable de la formacion del sabor rancio. Se confirmo esto anadiendo aril-sulfatasa a leche UHT, y se encontro que esta unica enzima es de hecho capaz de imitar el sabor rancio observado a menudo en leche UHT tratada con lactasa. Subsiguientemente se desarrollo un procedimiento cromatografico para eliminar la aril-sulfatasa de la enzima lactasa, que deriva de K. lactis. Se encontro que la eliminacion de aril-sulfatasa tambien da como resultado la eliminacion de la formacion del sabor rancio en leche UHT, como se concluye de los ensayos con paneles de gusto. Los niveles de aril-sulfatasa en el producto de lactasa final son <20 unidades de aril-sulfatasa, preferiblemente <10 unidades de aril-sulfatasa, incluso mas preferiblemente <8 unidades de aril-sulfatasa, y lo mas preferible 0 unidades de aril-sulfatasa. Las unidades de aril-sulfatasa se definen en el ejemplo 2 y se normalizan para la actividad de lactasa expresada en NLU y tambien se define en el ejemplo 2). Se han descrito varias rutas de purificaciones para lactasas (por ejemplo en el documento WO 02/081673), pero estos procedimientos de purificacion no estaban dirigidos a eliminar la aril-sulfatasa. Los presentes resultados muestran que aril-sulfatasa y lactasa, ambas derivadas de K. lactis, tienen un comportamiento de elucion muy similar en cromatograffa de intercambio ionico (Q-sefarosa) y de interaccion hidrofoba (butil-sefarosa). Por lo tanto, se espera que las rutas de la tecnica anterior descritas no daran como resultado preparaciones de lactasa libres de actividad de aril-sulfatasa.
Ademas de la reduccion de los niveles de aril-sulfatasa en preparaciones de lactasa mediante cromatograffa, hay otras maneras para reducir o eliminar la actividad de aril-sulfatasa de la preparacion de lactasa. Estas son 1) la adicion de sulfato al medio de crecimiento. Se sabe que el sulfato reprime la expresion de aril-sulfatasa (Beil et al. (1995) Eur. J. Biochem. 229, 385-394), y por lo tanto se espera que la adicion de sulfato al medio reduzca los niveles de aril-sulfatasa; 2) la eliminacion o destruccion del gen para aril-sulfatasa a partir del genoma del organismo mediante tecnicas de mutagenesis al azar o mediante un enfoque dirigido usando, por ejemplo, tecnologfas de biologfa molecular conocidas por la persona experta en la tecnica, 3) el cribado y seleccion de una cepa que es una productora baja natural o no productora de actividad de aril-sulfatasa; 4) la adicion de un inhibidor de la enzima. Se sabe, por ejemplo, que ciertas clases de aril-sulfatasas son inhibidas por iones fosfato.
Los conjugados metabolicos, tales como sulfatos, glucuronidos y fosfatos, estan presentes en la leche procedente de diversas especies, incluyendo leche de vaca (Lopez et al (1993) J Agric Food Chem. 41, 446-454; Killic et al (2005) J Dairy Sci 88, 7-12). La conjugacion metabolica es un medio universalmente aceptado de destoxificacion y potenciacion de la solubilidad acuosa de sustancias extranas en mairnferos. Los conjugados se forman muy eficazmente por el tngado y el rinon, y circulan en el torrente sangumeo antes de la eliminacion principalmente en la orina y bilis. Se han encontrado conjugados de alquilfenoles y una variedad de otros compuestos en la leche procedente de, por ejemplo, vaca, cabra y oveja (Lopez et al (1993) J Agric Food Chem. 41, 446-454). La naturaleza y diversidad de los conjugados metabolicos es muy amplia, e incluyen conjugados de tiofenoles, fenoles, o-cresol y p-cresol. La conjugacion puede dar como resultado la union de grupos sulfato, fosfato o glucuronido. Estos grupos pueden ser liberados del conjugado mediante enzimas como aril-sulfatasas, fosfatasas y glucuronidasas, dando como resultado la liberacion del compuesto toxico. Se ha demostrado la presencia de varios tipos de conjugados en la leche de vaca, oveja y cabra; la abundancia relativa de los conjugados vana entre las preparaciones, y esta relacionada al menos parcialmente con la especie (Lopez et al (1993) J Agric Food Chem. 41, 446-454). En leche de vaca, se demostro que los conjugados de sulfato son los conjugados mas abundantes, pero en leche de oveja los conjugados de fosfato son mas abundantes que los sulfatos (Lopez et al (1993) J Agric Food Chem. 41,446-454).
En la presente solicitud se demuestra que los conjugados que estan presentes en la leche son el sustrato para actividades secundarias en preparaciones de lactasa neutra. Se sabe que los niveles de concentracion de estos conjugados pueden variar para una especie con el tiempo (Kilic et al, (2005) J dairy Sci 88, 7-12) y entre especies (Lopez et al (1993) J Agric Food Chem. 41, 446-454). Se anticipa que esto puede afectar a los requisitos para la preparacion de lactasa. Por ejemplo, se anticipa que, para leche de oveja, en la que los conjugados de fosfato son muy abundantes, la tolerancia para los niveles de fosfatasa en preparaciones de lactasa es mucho menor en comparacion con la situacion en la que la misma preparacion de lactasa se usa en leche de vaca, que tiene niveles
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muy bajos de conjugados de fosfato. A este respecto, no hay diferencia entre preparacion de lactasa intracelular o preparaciones de lactasa extracelular.
Se describe ademas un procedimiento para tratar un sustrato con una preparacion enzimatica. La preparacion enzimatica esta preferiblemente libre de forma sustancial de aril-sulfatasa.
Como se usa aqm, una preparacion enzimatica sustancialmente libre de arilsulfatasa puede englobar cualquier preparacion enzimatica en la que la actividad de arilsulfatasa no esta presente o esta presente en un nivel suficientemente bajo que, con la dosificacion eficaz de la actividad enzimatica pretendida en el procedimiento de produccion relevante, no se produce en dicho procedimiento de produccion ninguna descomposicion observable de alquilfenoles sulfatados con efectos organolepticos negativos asociados como se describe anteriormente.
Como se usa aqm, una preparacion enzimatica sustancialmente libre de arilsulfatasa puede englobar una preparacion enzimatica en la que la relacion de la actividad de arilsulfatasa dividida entre la actividad de la enzima de interes esta por debajo de un valor espedfico. Las relaciones preferidas pueden variar dependiendo de la enzima y de la aplicacion usada.
Por actividad de arilsulfatasa se quiere decir la actividad de ester sulfurico hidrolasa para escindir un sulfato de fenol en el resto de fenol y de sulfato como se describe para EC 3.1.61. La definicion para la unidad de arilsulfatasa se proporciona en la seccion de Materiales y Metodos (y en el ejemplo 2) de la presente solicitud. Las definiciones para las actividades de las otras enzimas tambien se pueden encontrar en la seccion de Materiales y Metodos de la presente solicitud.
En un aspecto adicional, se describe una preparacion enzimatica que comprende una lactasa (neutra), preparacion enzimatica la cual comprende menos de 40 unidades (ASU) de actividad de arilsulfatasa por NLU de actividad de lactasa. Preferiblemente, la preparacion enzimatica comprende menos de 30 unidades de actividad de arilsulfatasa por NLU de actividad de lactasa, mas preferiblemente menos de 20 unidades de actividad de arilsulfatasa por NLU de actividad de lactasa, y lo mas preferible menos de 10 unidades de actividad de arilsulfatasa por NLU de actividad de lactasa.
En un aspecto adicional, se describe una preparacion enzimatica que comprende una lactasa (acida), preparacion enzimatica la cual comprende menos de 400 unidades (ASU) de actividad de arilsulfatasa por ALU de actividad de lactasa.
Preferiblemente, la preparacion enzimatica comprende menos de 100 unidades (ASU) de actividad de arilsulfatasa, preferiblemente 30 unidades de actividad de arilsulfatasa por ALU de actividad de lactasa, mas preferiblemente menos de 20 unidades de actividad de arilsulfatasa por ALU de actividad de lactasa, y lo mas preferible menos de 10 unidades de actividad de arilsulfatasa por ALU de actividad de lactasa.
El tratamiento de un sustrato con una preparacion enzimatica sustancialmente libre de arilsulfatasa tambien puede englobar el tratamiento de un sustrato en el que el nivel de arilsulfatasa en el sustrato durante dicho tratamiento esta por debajo de un valor espedfico.
Se describe adicionalmente un procedimiento para tratar un sustrato con una preparacion enzimatica, en el que el nivel de arilsulfatasa en el sustrato durante dicho tratamiento es como maximo 500*10E3 unidades de arilsulfatasa por litro de sustrato, preferiblemente como maximo 250*10E3, preferiblemente como maximo 100*10E3, preferiblemente como maximo 50*10E3, preferiblemente como maximo 25*10E3 unidades de arilsulfatasa por litro de sustrato. Se encontro que el mantenimiento del nivel de arilsulfatasa por debajo de los valores mencionados anteriormente es particularmente ventajoso cuando el sustrato es leche, preferiblemente leche de vaca.
Una preparacion enzimatica sustancialmente libre de arilsulfatasa tambien puede englobar cualquier preparacion enzimatica obtenida purificando una preparacion de enzima bruta que contiene una enzima de interes y arilsulfatasa, en la que la arilsulfatasa se separa de la enzima de interes.
Tambien se describe un procedimiento para preparar una preparacion enzimatica, procedimiento el cual comprende purificar una preparacion de enzima bruta que contiene una enzima de interes y arilsulfatasa, en el que la arilsulfatasa se separa de la enzima de interes. El procedimiento puede comprender ventajosamente tratar un sustrato con la preparacion enzimatica purificada.
La etapa de purificacion tiene el efecto de que se reduce la actividad de arilsulfatasa con respecto a la actividad de la enzima de interes. Preferiblemente, la purificacion da como resultado una reduccion de la actividad de arilsulfatasa de al menos 50%, preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90%, mas preferiblemente al menos 95%, mas preferiblemente al menos 99%. La persona experta apreciara que se entiende que esto significa que preferiblemente (aAS,pur/aenz,pur)/(aAS,bruta/aenz,bruta) < 0,5, preferiblemente < 0,2, preferiblemente < 0,1, preferiblemente < 0,05, preferiblemente < 0,01, en el que
aAS,pur = actividad de arilsulfatasa en la preparacion de enzima purificada (unidad/ml)
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aenz,pur = actividad de la enzima de interes en la preparacion de enzima purificada (unidad/ml)
aAs,bruta = actividad de arilsulfatasa en la preparacion de enzima bruta (unidad/ml)
aenz,bruta = actividad de la enzima de interes en la preparacion de enzima bruta (unidad/ml)
La purificacion se puede efectuar de cualquier manera adecuada. En una realizacion preferida, la purificacion es mediante cromatograffa. Los procedimientos para purificar preparaciones enzimaticas usando cromatograffa son conocidos per se. La seleccion de los metodos de separacion cromatografica mas apropiados depende de las caractensticas moleculares tanto de la enzima relevante como de la actividad de arilsulfatasa relevante presente. Las caractensticas moleculares relevantes son el punto isoelectrico, la hidrofobia, la distribucion de cargas de superficie molecular, el peso molecular de la enzima relevante, y la actividad secundaria, asf como otras varias propiedades qmmicas de la protema. Se puede encontrar un antecedente practico sobre el uso de estas caractensticas a la hora de seleccionar el procedimiento de separacion cromatografica apropiado en el Protein Purification Handbook (publicado por Amersham Pharmacia Biotech, actualmente GE Healthcare Bio-Sciences, Diegem, Belgica). Los metodos de separacion cromatografica adecuados comprenden cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de exclusion de tamanos, cromatograffa de interaccion hidrofoba, y otros. Para la presente invencion, se prefiere la cromatograffa de intercambio ionico o la cromatograffa de interaccion hidrofoba.
En una realizacion preferida, la purificacion se realiza en una unica etapa de separacion cromatografica. El hecho de que la actividad enzimatica se puede separar eficazmente de la actividad de arilsulfatasa contaminante en una unica etapa cromatografica es particularmente ventajoso para la aplicabilidad industrial del procedimiento segun la invencion.
Los esquemas internacionalmente reconocidos para la clasificacion y nomenclatura de todas las enzimas se proporcionan mediante IUMB. Un texto de IUMB actualizado para los numeros EC se puede encontrar en el sitio de internet:
http://www.chem.qmw/ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/11/. En este sistema, las enzimas se definen por el hecho de que catalizan una unica reaccion. Esto implica que varias protemas diferentes se describen todas ellas como la misma enzima, y una protema que cataliza mas de una reaccion es tratada como mas de una enzima.
La lactasa (EC 3.2.1.23), una beta-galactosidasa microbiana capaz de descomponer la lactosa, es de particular relevancia dentro del alcance de la presente solicitud.
Las preparaciones enzimaticas de grado alimentario, industrialmente disponibles, se obtienen ffpicamente de tejido de mairfffero, por ejemplo tripsina del pancreas, o de material vegetal, por ejemplo papama de frutas de papaya. En una realizacion preferida, la enzima se obtiene de una cepa microbiana, por ejemplo bacterias, por ejemplo especie Bacillus, o levaduras, por ejemplo Saccharomyces, Kluyveromyces o Pichia, u hongos filamentosos. Los hongos filamentosos que se sabe que producen preparaciones enzimaticas de grado alimentario son, por ejemplo, Aspergillus, Rhizomucor, Rhizopus, Trichoderma y Talaromyces. La preparacion enzimatica se puede producir mediante o puede derivar de un hongo filamentoso, por ejemplo Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. Como se usa aqrn, tales preparaciones enzimaticas tambien engloban preparaciones enzimaticas autoclonadas producidas por A. niger o por A. oryzae.
La enzima de interes se puede producir mediante procedimientos de fermentacion microbiana usando hongos que producen y segregan preferiblemente la proteasa de interes en el caldo de fermentacion. En la tecnica, tales procedimientos de fermentacion son conocidos; vease, por ejemplo, el documento WO 02/45524. En los procedimientos de la tecnica anterior, la enzima se puede recuperar del caldo de fermentacion mediante tecnicas tambien conocidas en la tecnica. Como una primera etapa, las celulas del organismo de produccion se pueden separar del caldo mediante centrifugacion o filtracion. El caldo libre de celulas se puede concentrar, mediante ultrafiltracion, y subsiguientemente se puede purificar cromatograficamente. Las cepas fungicas producen ffpicamente mas de una actividad de arilsulfatasa, de manera que la separacion cromatografica de la enzima relevante a partir de estas actividades de arilsulfatasa en una unica etapa no es trivial. Una complicacion adicional es que las diferentes actividades enzimaticas segregadas por un microorganismo espedfico, es decir, la actividad enzimatica buscada, asf como las diversas actividades de arilsulfatasa, tienen puntos isoelectricos muy proximos entre sf. Con la separacion cromatografica de la actividad enzimatica deseada y las actividades de arilsulfatasa contaminantes, se puede estabilizar la preparacion enzimatica purificada asf obtenida.
En el caso en el que la enzima no se segregue por el microorganismo sino que siga siendo intracelular, el organismo de produccion se puede recuperar mediante filtracion o centrifugacion, despues de lo cual las celulas retenidas se pueden lisar para liberar la actividad enzimatica relevante. Despues de otra etapa de filtracion o centrifugacion para eliminar el desecho celular, la fraccion ffquida se puede concentrar y estabilizar como se describe anteriormente para la enzima segregada.
Las preparaciones enzimaticas purificadas y ffquidas se pueden concentrar y mezclar con estabilizantes conocidos, tales como glicerol u otros polioles. Como alternativa, se pueden obtener preparaciones solidas a partir de disoluciones enzimaticas concentradas mediante etapas conocidas de precipitacion y/o evaporacion, seguido de tecnicas de secado (por pulverizacion) bien conocidas.
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Se puede tratar un sustrato con la preparacion enzimatica. El sustrato puede ser cualquier sustrato adecuado. Preferiblemente, el sustrato es un sustrato proteinoso. El sustrato proteinoso puede ser cualquier sustrato que comprenda protema. En una realizacion preferida, el sustrato contiene protema de la leche, por ejemplo casema y/o protema del suero de la leche. Los ejemplos de sustratos preferidos son leche, productos derivados de la leche, productos de leche fermentada (por ejemplo yogur), suero lacteo y/o hidrolizados. El sustrato tambien puede comprender carne.
Como hidrolizado, se puede usar cualquier producto que se forme mediante hidrolisis enzimatica de una protema de sustrato proteinoso, preferiblemente una protema de sustrato derivada de animal. Se prefieren hidrolizados de protema del suero lacteo, hidrolizados de casema e hidrolizados de leche desnatada.
El sustrato puede contener un alquilfenol sustituido con un grupo sulfato. Por alquilfenol se quiere decir un grupo fenol del cual se ha sustituido al menos un proton aromatico por un grupo alquilo. La longitud del grupo alquilo puede variar, y puede estar ramificado o sustituido. Los alquilfenoles preferidos son metil- y etilfenoles.
Por alquilfenol sulfatado se quiere decir un alquilfenol que esta conjugado en el grupo hidroxilo mediante sulfatacion.
Arilsulfatasa (EC 3.1.6.1) es una ester sulfurico hidrolasa capaz de escindir un sulfato de alquilfenol en el resto alquilfenol y en el resto sulfato.
El tratamiento del sustrato puede implicar cualquier procedimiento en el que un sustrato se pone en contacto con la preparacion enzimatica. El tratamiento puede implicar cualquier procedimiento en el que el sustrato se incuba en presencia de la preparacion enzimatica. La preparacion enzimatica se puede anadir al sustrato de cualquier manera adecuada.
El procedimiento puede ser cualquier procedimiento en el que se produzca un producto, por ejemplo un producto nutritivo, preferiblemente un producto lacteo. Como se usa aqrn, un producto lacteo engloba cualquier composicion que contenga protema de la leche, por ejemplo casema y/o protema de suero lacteo. Los ejemplos son leche, productos derivados de la leche, productos de leche fermentada (por ejemplo yogur), leche condensada, leche evaporada, leche seca, leche congelada, helado, suero lacteo; y/o queso. El producto tambien puede ser un hidrolizado.
La preparacion enzimatica se puede usar para preparar cualquier producto adecuado, por ejemplo un producto nutritivo, preferiblemente un producto lacteo.
La preparacion enzimatica se puede usar para evitar o reducir el desarrollo de un sabor rancio.
Se describe un procedimiento para producir una celula hospedante que es una cepa deficiente en arilsulfatasa, que comprende someter un cultivo que produce arilsulfatasa a condiciones tales que parte del cultivo se modifica para formar la celula hospedante que es deficiente en arilsulfatasa, y aislar la celula hospedante.
Se pueden usar tecnicas de manipulacion genetica recombinante, preferiblemente destruccion genica de una etapa, insercion de marcador, mutagenesis dirigida al sitio, supresion, interferencia de ARN, ARN antisentido. Tambien se describe un procedimiento para producir un polipeptido mediante un metodo que comprende:
(a) transformar una celula hospedante deficiente en arilsulfatasa con un vector de expresion, en el que el vector expresa el polipeptido,
(b) cultivar la celula hospedante en un medio nutriente en condiciones que conduzcan a la expresion del polipeptido,
(c) expresar el polipeptido en la celula hospedante,
(d) opcionalmente recuperar el polipeptido del medio nutriente o de la celula hospedante.
El polipeptido puede ser una enzima. Se describe un procedimiento para preparar una preparacion enzimatica, comprendiendo dicho procedimiento preparar una enzima mediante un procedimiento como se describe aqrn, y recuperar una preparacion enzimatica a partir del medio nutriente o de la celula hospedante.
Mas abajo se da una descripcion adicional.
Tecnicas de ADN recombinante
Usando tecnologfa de ADN recombinante, se pueden construir cepas de produccion industrial que tienen una cantidad reducida de actividad de arilsulfatasa. En la tecnica se describen varias tecnicas para la inactivacion genica o destruccion genica, tal como la destruccion genica de una etapa, insercion de marcadores, mutagenesis dirigida al sitio, supresion, interferencia de ARN, ARN antisentido, y otras, y todas se pueden usar para reducir, inhibir o interrumpir la smtesis de la actividad de arilsulfatasa a fin de obtener una cepa de produccion industrial con menor actividad de arilsulfatasa. Tambien es parte de la presente invencion la inactivacion de arilsulfatasa alterando la
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secuencia o secuencias de control que dirigen la expresion del gen de arilsulfatasa. Un ejemplo de esto es la reduccion de la actividad promotora por interrupcion del gen.
Usando tecnicas de modificacion genetica modernas, se puede obtener una cepa recombinante deficiente en arilsulfatasa, preferiblemente interrumpiendo un gen que codifica la actividad de arilsulfatasa, mas preferiblemente insertando un gen marcador en un gen que codifica la actividad de arilsulfatasa, muy preferiblemente mediante eliminacion del genoma de parte o de toda la region codificante de arilsulfatasa. Los metodos para llevar a cabo tales inactivaciones genicas se han descrito para muchos microorganismos diferentes, y se conocen por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, el documento EP357127) y tambien se describen en el Ejemplo 8. De ese modo, se puede reducir o eliminar la expresion de arilsulfatasas en la celula mutante. Dependiendo de la cepa hospedante que se modifique usando estas tecnicas, el procedimiento se debena repetir varias veces para eliminar todas o la mayona de las secuencias codificantes de arilsulfatasa.
La modificacion o inactivacion de un gen hospedante tal como arilsulfatasa se puede realizar mediante tecnicas antisentido bien consolidadas, usando una secuencia nucleotidica complementaria a la secuencia nucleotidica del gen. Mas espedficamente, la expresion del gen se puede reducir o eliminar introduciendo una secuencia nucleotidica complementaria a la secuencia nucleotfdica, que se puede transcribir en la celula y es capaz de hibridarse al ARNm producido en la celula. De este modo, en condiciones que permiten que la secuencia nucleotidica antisentido complementaria se hibride al ARNm, se reduce o elimina la cantidad de protema traducida. Los ejemplos para expresar un ARN antisentido se proporcionan por Ngiam et al. (Appl. Environ. Microbiol. 66:775782, 2000) y Zrenner et al. (Planta 190:247-252, 1993).
La modificacion, disminucion o inactivacion de un gen hospedante se puede obtener via tecnicas de interferencia de ARN (RNAi) (FEMS Microb. Lett. 237:317-324, 2004). Mas espedficamente, la expresion del gen mediante una celula fungica filamentosa se puede reducir o eliminar clonando porciones sentido y antisentido identicas de la secuencia nucleotfdica, expresion que se va a efectuar, detras de cada una con un espaciador nucleotidico entremedias, insertando en un vector de expresion e introduciendo el vector de expresion en la celula en la que el ARN bicatenario (dsRNA) se puede transcribir y despues procesar a un siRNA mas corto que es capaz de hibridarse a ARNm diana. Despues de que se transcribe el dsRNA, la formacion de pequenos fragmentos de siRNA nucleotfdicos (21-23) conducira a la degradacion seleccionada del ARNm, que se va a efectuar. La eliminacion del ARNm espedfico se puede hacer en diversos grados. Las tecnicas de interferencia de ARN descritas en los documentos WO 2005/05672 y WO 2005/026356 se pueden usar para la modificacion, disminucion o inactivacion del gen hospedante.
La cepa deficiente en arilsulfatasa, que se ha modificado o inactivado por cualquiera de los metodos descritos anteriormente y produce menor actividad de arilsulfatasa que la celula progenitora cuando se cultiva en condiciones identicas segun se mide usando los mismos ensayos como se definen anteriormente, puede poseer otra secuencia nucleotidica.
Tales cepas de produccion industrial con actividad de arilsulfatasa disminuida, aisladas o construidas mediante tecnicas geneticas clasicas o tecnologfa de ADN recombinante, se pueden usar para procedimientos industriales relevantes que requieren que el producto final carezca de un sabor rancio. Preferiblemente, estas cepas se usan para la produccion de enzimas industrialmente relevantes. Mas preferiblemente, estas cepas se usan para la produccion de enzimas que se usan en la industria alimentaria, incluso mas preferiblemente estas enzimas se usan en el procesamiento de productos lacteos. Muy preferiblemente, tales cepas de produccion industrial con actividad de arilsulfatasa disminuida se usan para la produccion de lactasa.
Cepas hospedantes
Las cepas hospedantes industriales adecuadas son preferiblemente microorganismos procariotas tales como bacterias, o mas preferiblemente organismos eucariotas, por ejemplo hongos, tales como levaduras u hongos filamentosos, o celulas vegetales. Las bacterias del genero Bacillus son muy adecuadas como hospedantes debido a su capacidad para segregar protemas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como hospedantes son aquellas de los generos Streptomyces y Pseudomonas. Una celula hospedante de levadura preferida para la expresion de una secuencia de aDn que codifica la enzima de interes es aquella del genero Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, o Schizosaccharomyces. Mas preferiblemente, una celula hospedante de levadura se selecciona del grupo que consiste en la especie Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (tambien conocida como Kluyveromyces marxianus var. lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, y Schizosaccharomyces pombe.
Las mas preferidas para la expresion de la enzima son, sin embargo, celulas hospedantes fungicas filamentosas. Las celulas hospedantes fungicas filamentosas preferidas se seleccionan del grupo que consiste en los generos Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, y Talaromyces. Mas preferiblemente, una celula hospedante fungica filamentosa es de la especie Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae o Aspergillus nidulans, o es de una especie del grupo de Aspergillus niger (como se define por Raper y Fennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, p. 293-344, 1965). Estas incluyen, pero no se limitan a, Aspergillus niger, Aspergillus awamori,
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Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae y Aspergillus ficuum, y tambien aquellas de la especie Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum y Thielavia terrestris.
Los ejemplos de cepas de produccion industrial preferidas dentro del alcance de la presente invencion son hongos tales como especies de Aspergillus (en particular aquellas descritas en los documentos EP-A-184.438 y EP-A- 284.603) y especies de Trichoderma; bacterias tales como especies de Bacillus (en particular aquellas descritas en los documentos EP-A-134.048 y EP-A-253.455), especialmente Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, especies de Pseudomonas; y levaduras tales como las especies de Kluyveromyces (en particular aquellas descritas en el documento EP-A-096.430, tal como Kluyveromyces lactis, y en el documento EP-A- 301.670), especies de Saccharomyces, tales como Saccharomyces cerevisiae, o Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida utilis o Yarrowia lipolytica. La actual invencion se refiere muy preferiblemente a la produccion de lactasa que carece de actividad de arilsulfatasa por Kluyveromyces lactis.
Se han aislado cepas deficientes en arilsulfatasa adecuadas para la produccion de un polipeptido o enzima dados en un marco industrial, en el que sorprendentemente la cepa deficiente en arilsulfatasa produce al menos la misma cantidad de polipeptido o enzima que la cepa de tipo salvaje de la que originan, en las mismas condiciones de cultivo.
Preferiblemente, las cepas deficientes en arilsulfatasa de la invencion son cepas que tienen menos de 50% de la actividad de arilsulfatasa intracelular o extracelular detectable, segun se detecta en una reaccion modelo (vease informacion experimental en el Ejemplo 2). Mas preferiblemente, las cepas deficientes en arilsulfatasa de la invencion son cepas que tienen menos del 50% de la actividad de arilsulfatasa intracelular. Mas preferiblemente, las cepas deficientes en arilsulfatasa de la invencion son cepas que tienen una actividad de arilsulfatasa intracelular, que es menor que 25% de la actividad de arilsulfatasa intracelular de la cepa de tipo salvaje de la que se originan, segun se detecta en una reaccion modelo, preferiblemente menor que 10%, mas preferiblemente menor que 5%, mas preferiblemente menor que 1%, y lo mas preferible, la actividad de arilsulfatasa es indetectable en las cepas deficientes en arilsulfatasa.
En esta solicitud, la cepa CBS 2359 de K. lactis se toma como referencia de niveles de arilsulfatasa de tipo salvaje obtenibles en un cultivo de K. lactis, como una referencia del nivel de polipeptido de tipo salvaje obtenible en un cultivo de K. lactis, y como una referencia de actividad de arilsulfatasa intracelular obtenible en un cultivo de K. lactis. Las cepas de K. lactis deficientes en arilsulfatasa se definen como cepas que producen actividad de arilsulfatasa menor que la cepa CBS 2359 de K. lactis en las mismas condiciones de cultivo. Preferiblemente, la cepa deficiente en arilsulfatasa es una cepa de K. lactis que tiene menos del 50% de la actividad de arilsulfatasa intracelular de la cepa CBS 2359 de K. lactis, segun se detecta en una reaccion modelo. Mas preferiblemente, las cepas de K. lactis deficientes en arilsulfatasa de la invencion son cepas que tienen una actividad de arilsulfatasa intracelular que es menor que 25% de la actividad de arilsulfatasa intracelular de la cepa de K. lactis CBS 2359 de la que se originan, segun se detecta en una reaccion modelo, preferiblemente menor que 10%, mas preferiblemente menor que 5%, mas preferiblemente menor que 1%, y lo mas preferible, la actividad de arilsulfatasa es indetectable en las cepas de K. lactis deficientes en arilsulfatasa. Segun una realizacion preferida de la invencion, la cepa de K. lactis deficiente en arilsulfatasa usada se ha obtenido aplicando el metodo definido mas tarde en esta solicitud.
La persona experta conoce una gran variedad de sistemas para la deteccion de un polipeptido. Los sistemas de deteccion incluyen cualquier ensayo posible para la deteccion de un polipeptido o de actividad enzimatica. A tftulo de ejemplo, estos sistemas de ensayo incluyen, pero no se limitan a, ensayos basados en ensayos colorimetricos, fotometricos, fluorometricos, turbidimetricos, viscosimetricos, inmunologicos, biologicos, cromatograficos, y otros ensayos disponibles.
Preferiblemente, si el polipeptido producido es una enzima, la cantidad de enzima activa producida se determina midiendo su actividad en una reaccion modelo (vease el ejemplo 2).
Segun una realizacion preferida adicional, la cepa deficiente en arilsulfatasa se caracteriza por el hecho de que, cuando esta cepa se ha transformado con un constructo de expresion que comprende un gen que codifica un polipeptido, dicha cepa produce al menos la cantidad del polipeptido que producina la cepa de tipo salvaje de la que se origina en las mismas condiciones de cultivo, cuando la cepa de tipo salvaje tambien se ha transformado con el mismo constructo de expresion que la cepa deficiente en arilsulfatasa. Preferiblemente, las cepas deficientes en arilsulfatasa son cepas que producen la misma cantidad o mas de un polipeptido dado que la cepa de tipo salvaje de la que se originan, en las mismas condiciones de cultivo. Mas preferiblemente, la cepa deficiente en arilsulfatasa produce mas de un polipeptido dado que la cepa de tipo salvaje de la que se origina, en las mismas condiciones de cultivo.
Produccion de otros polipeptidos nativos u heterologos y otras secuencias
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Se describen aqrn metodos para transcribir una secuencia nucleotidica en una celula hospedante, en los que la secuencia transcrita codifica un polipeptido deseado o es una molecula de acido nucleico funcional, que comprenden:
(a) cultivar, en un medio nutriente, una celula hospedante que comprende (i) un promotor, (iv una secuencia nucleotfdica en direccion 3' que codifica un polipeptido, (iii) una senal de parada traduccional, y (iv) una senal de parada transcripcional,
(b) expresar el polipeptido en la celula hospedante, y
(c) opcionalmente, recuperar el polipeptido del medio nutriente o de la celula hospedante.
El polipeptido producido puede ser sensible a la degradacion con proteasas. En este caso, se usara una celula hospedante mutante que es deficiente en proteasa. La cepa deficiente en arilsulfatasa se produce preferiblemente segun un metodo como se describe aqrn. La cepa deficiente en arilsulfatasa se puede hacer crecer o se puede mantener en un medio nutriente adecuado para la produccion del polipeptido deseado usando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, las celulas se pueden colocar sobre un sustrato solido, se pueden agitar en un matraz, se pueden cultivar en fermentacion a pequena escala o a gran escala (incluyendo fermentacion continua, discontinua, discontinua alimentada, o en estado solido) en fermentadores de laboratorio o industriales en un medio adecuado y en condiciones que permiten que se exprese y/o aisle el polipeptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrogeno y sales inorganicas, usando procedimientos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Bennett & LaSure, eds., More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Los medios adecuados estan disponibles de proveedores comerciales, o se pueden preparar usando composiciones publicadas (por ejemplo, en catalogos de la American Type Culture Collection). Si el polipeptido se segrega al medio nutriente, el polipeptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipeptido no se segrega, se puede recuperar de lisados celulares.
El polipeptido resultante se puede aislar mediante metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el polipeptido se puede aislar del medio nutriente mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, centrifugacion, filtracion, extraccion, secado por pulverizacion, evaporacion, o precipitacion. El polipeptido aislado se puede purificar entonces adicionalmente mediante una variedad de procedimientos conocidos en la tecnica, incluyendo, pero sin limitarse a, cromatograffa (por ejemplo, intercambio ionico, afinidad, hidrofoba, cromatoenfocado, o de exclusion de tamanos), electroforesis (por ejemplo, enfoque isoelectrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitacion con acetona o con sulfato de amonio), o extraccion (por ejemplo, caotropo, sal, o pH). Vease, por ejemplo, Janson & Ryden, eds., Protein Purification, VCH Publishers, Nueva York, 1989.
El polipeptido se puede detectar usando metodos conocidos en la tecnica que son espedficos para el polipeptido. Estos metodos de deteccion pueden incluir el uso de anticuerpos espedficos, la formacion de un producto enzimatico, la desaparicion de un sustrato enzimatico, o SDS-PAGE. Por ejemplo, se puede usar un ensayo enzimatico para determinar la actividad del polipeptido. Los procedimientos para determinar la actividad enzimatica son conocidos en la tecnica para muchas enzimas.
El polipeptido puede ser cualquier polipeptido, ya sea nativo o heterologo a la cepa deficiente en arilsulfatasa. La expresion “polipeptido heterologo” se define aqrn como un polipeptido que no es producido por una cepa de tipo salvaje. El termino “polipeptido” no significa aqrn que se refiere a una longitud espedfica del producto codificado, y por lo tanto engloba peptidos, oligopeptidos y protemas. La secuencia nucleotfdica que codifica un polipeptido heterologo se puede obtener a partir de cualquier procariota, eucariota, u otra fuente, y puede ser un gen sintetico. La expresion “obtenido de”, como se usa aqrn en relacion con una fuente dada, significara que el polipeptido es producido por la fuente o por una celula en la que se ha insertado un gen procedente de la fuente.
El polipeptido deseado puede ser un anticuerpo o una porcion del mismo que se une a un antfgeno, un antfgeno, un factor de coagulacion, una enzima, una hormona peptfdica o su variante, un receptor o su porcion de union a ligando, una protema reguladora, una protema estructural, un informador, una protema de transporte, una protema intracelular, una protema implicada en un proceso secretor, una protema implicada en un proceso de plegamiento, una chaperona, un transportador de aminoacidos peptfdico, un factor de glucosilacion, o un factor de transcripcion. El polipeptido se puede segregar extracelularmente al medio de cultivo.
No hay limitacion con respecto a la enzima espedfica. Las enzimas preferidas se describen en el resto de la memoria descriptiva y en los ejemplos.
Como alternativa, el polipeptido puede ser una protema o enzima intracelular, tal como, por ejemplo, una chaperona, una proteasa, o un factor de transcripcion. Un ejemplo de esto se describe por Punt et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 50:447-454, 1998). Esto se puede usar, por ejemplo, para mejorar la eficiencia de una celula hospedante como productora de protema si se sabe que este polipeptido, tal como una chaperona, proteasa, o factor de transcripcion, es un factor limitante en la produccion de protema.
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En los metodos de la presente invencion, la cepa deficiente en arilsulfatasa tambien se puede usar para la produccion recombinante de polipeptidos, que son nativos a la celula. Los polipeptidos nativos se pueden producir recombinantemente, por ejemplo, colocando un gen que codifica el polipeptido bajo el control de un promotor diferente para potenciar la expresion del polipeptido, para acelerar la exportacion de un polipeptido nativo de interes fuera de la celula mediante el uso de una secuencia senal, y para incrementar el numero de copias de un gen que codifica el polipeptido producido normalmente por la celula. La presente invencion tambien engloba, dentro del alcance de la expresion “polipeptido heterologo” tal produccion recombinante de polipeptidos nativos a la celula, hasta el grado de que tal expresion implica el uso de elementos geneticos no endogenos a la celula, o el uso de elementos de secuencias endogenas que se han manipulado para funcionar de manera que no se produzcan normalmente en la celula fungica filamentosa. Las tecnicas usadas para aislar o clonar una secuencia nucleotidica que codifica un polipeptido heterologo son conocidas en la tecnica, e incluyen el aislamiento a partir de ADN genomico, preparacion a partir de ADNc, o una combinacion de los mismos.
En los metodos de la presente invencion, los polipeptidos heterologos tambien pueden incluir un polipeptido fusionado o tubrido, en el que otro polipeptido se fusiona al termino N o al termino C del polipeptido o su fragmento. Un polipeptido fusionado se produce fusionando una secuencia nucleotidica (o una porcion de la misma) que codifica un polipeptido a una secuencia nucleotidica (o una porcion de la misma) que codifica otro polipeptido.
Las tecnicas para producir polipeptidos de fusion son conocidas en la tecnica, e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipeptidos de manera que esten en el marco y que la expresion del polipeptido fusionado este bajo control del mismo promotor o promotores y terminador. Los polipeptidos tubridos pueden comprender una combinacion de secuencias polipeptfdicas parciales o completas obtenidas de al menos dos polipeptidos diferentes, en los que uno o mas pueden ser heterologos a la celula fungica mutante. Una secuencia nucleotfdica aislada que codifica un polipeptido heterologo de interes se puede manipular de muchas maneras para proporcionar la expresion del polipeptido. Se entendera que expresion incluye cualquier etapa implicada en la produccion del polipeptido, incluyendo, pero sin limitarse a, la transcripcion, la modificacion post-transcripcional, la traduccion, la modificacion post-traduccional, y la secrecion. La manipulacion de la secuencia nucleotidica que codifica un polipeptido antes de su insercion en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresion. Las tecnicas para modificar secuencias nucleotidicas que utilizan metodos de clonacion son bien conocidas en la tecnica.
La secuencia de ADN que codifica el polipeptido a producir se puede enlazar operablemente a regiones reguladoras de ADN apropiadas para asegurar un nivel elevado de expresion de dicha secuencia de ADN, y preferiblemente un nivel elevado de secrecion de dicho polipeptido. Si el polipeptido a producir es nativo a la cepa deficiente en arilsulfatasa, preferiblemente se usa su senal de secrecion nativa. Como alternativa, si el polipeptido a producir no es nativo a la cepa deficiente en arilsulfatasa, preferiblemente se obtiene un constructo de fusion que comprende por ejemplo el gen de glucoamilasa de Aspergillus niger fusionado al gen heterologo a producir. Segun una realizacion preferida de la invencion, se usan las regiones reguladoras del gen de alfa amilasa de Aspergillus oryzae. Segun una realizacion mas preferida de la invencion, se usan las regiones reguladoras del gen de glucoamilasa de A. niger. Segun una realizacion mas preferida de la invencion, se usan las regiones reguladoras del gen de lactasa de K. lactis. El constructo de ADN tambien puede comprender un marcador seleccionable. Como alternativa, el marcador seleccionable puede estar presente en un segundo constructo de ADN. A tttulo de ejemplo, estos marcadores incluyen, pero no se limitan a, amdS (genes de acetamidasa), genes marcadores auxotroficos tales como argB, trpC, o pyrG, y genes de resistencia a antibioticos que proporcionan resistencia frente a, por ejemplo, bleomicina, higromicina B o G418. Preferiblemente, el gen marcador es un gen de acetamidasa procedente de Aspergillus nidulans. Mas preferiblemente, el gen de acetamidasa procedente de Aspergillus nidulans se fusiona al promotor gpdA. Mas preferiblemente, el gen de acetamidasa procedente de Aspergillus nidulans se fusiona al promotor ADH1 de Saccharomyces cerevisiae.
Se desarrollo un metodo para obtener una cepa deficiente en arilsulfatasa que es adecuado para producir grandes cantidades de un polipeptido y que se puede usar como productores de polipeptido en un marco industrial. El polipeptido puede ser homologo o heterologo para dicha cepa deficiente en arilsulfatasa. En el caso de un polipeptido o enzima heterologos, la cepa de tipo salvaje sobre la que se aplica el metodo de la invencion se puede haber transformado previamente para expresar un gen que codifica tal polipeptido o enzima como ya se ha descrito previamente en la descripcion. Tales cepas deficientes en arilsulfatasa producen al menos la cantidad de polipeptido que producen las cepas de tipo salvaje de las que se origina, en las mismas condiciones de cultivo. Como alternativa, la construccion de la cepa deficiente en arilsulfatasa se puede realizar antes de la transformacion con un gen que codifica tal polipeptido o enzima como ya se ha descrito previamente en la descripcion.
Segun una realizacion de la invencion, los polipeptidos son producidos consiguientemente en una celula hospedante de la presente invencion con un fenotipo de arilsulfatasa reducido, celula la cual es un mutante de una celula progenitora util para la produccion de enzimas utiles en la industria alimentaria, en el que la celula progenitora comprende una o mas secuencias nucleotidicas que codifican arilsulfatasas, y la celula mutante produce menos actividad de arilsulfatasa que la celula progenitora cuando se cultivan en las mismas condiciones.
Las caractensticas preferidas descritas para un aspecto de la invencion tambien son aplicables a otros aspectos de la invencion.
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La invencion se elucidara ahora con referencia a los siguientes ejemplos sin sin embargo estar limitados a ellos. Leyenda de las figuras
Figura 1: Clonacion del flanco 5' del gen de arilsulfatasa de K. lactis en el vector TOPO
Figura 2: Clonacion del flanco 3' del gen de arilsulfatasa de K. lactis en el vector TOPO
Figura 3: Clonacion del flanco 3' del gen de arilsulfatasa de K. lactis, que carece del sitio SacII, en el vector TOPO
Figura 4: Combinacion del flanco 5' y del casete de seleccion amdS en un plasmido Figura 5: Combinacion del flanco 5', del flanco 3' y del casete de seleccion amdS en un plasmido Figura 6: Construccion final del constructo genosuprimido para arilsulfatasa Figura 7: Muestra el perfil de endoproteasas usando como sustrato Dabcyl-Edans Materiales y Metodos
Ensayo de actividad de arilsulfatasa: La actividad de arilsulfatasa se determino usando como sustrato sulfato de p-
nitrofenilo (obtenido de Sigma). Para las medidas de la actividad, se mezclaron 0,5 ml de disolucion de sustrato (20
mM de sulfato de p-nitrofenilo en 100 mM de tampon NaPi pH 6,5) con 0,5 ml de disolucion de muestra que contiene la actividad de arilsulfatasa. La disolucion se incubo a 37°C durante 3 horas. Despues, la reaccion se detuvo anadiendo 1,5 ml de NaOH 0,5 M. La OD a 410 nm se determino (longitud de recorrido 1 cm) frente a un experimento en blanco en el que se anade agua en lugar de disolucion de muestra. Como referencia, se preparo una disolucion en la que la enzima se anadio despues de que la reaccion se detuvo con NaOH. La OD410 de esta disolucion de referencia se resto de la OD410 determinada para la disolucion en la que la enzima fue activa durante tres horas. Una unidad de arilsulfatasa (ASU) se expresa como el cambio en OD410*10E6/h. Para productos lfquidos, la actividad de arilsulfatasa se puede expresar como el cambio en OD410*10E6/h por ml de producto. Para productos solidos, la actividad de arilsulfatasa se puede expresar como el cambio en OD410*10E6/h por g de producto. Cuando se conoce la actividad de la enzima de interes, la actividad de arilsulfatasa tambien se puede expresar como el cambio en OD410*10E6/h por unidad de actividad de enzima de interes.
Ensayo de actividad de lactasa acida: Se incuba lactasa acida durante 15 minutos con o-nitrofenil-beta-D- galactopiranosido (Fluka 73660) a pH 4,5 y 37 grados C para generar o-nitrofenol. La incubacion se detuvo anadiendo carbonato de sodio al 10%. La extincion del o-nitrofenol generado se mide a una longitud de onda de 420 nm, y cuantifica la actividad de la lactasa acida. Una unidad de lactasa acida (ALU) es la cantidad de enzima que, en las condiciones de ensayo, genera 1 micromol de o-nitrofenol por minuto.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Identificacion de compuestos productores de sabor rancio en leche UHT
Se anadio Maxilact LG5000 (DSM, Pafses Bajos) en condiciones esteriles a leche UHT semidesnatada (Friesche Vlag, Pafses Bajos) hasta niveles de 10.000 y 40.000 NLU por litro, y se incubo durante 4 dfas a temperatura ambiente. En el experimento de referencia, no se anadio Maxilact. Antes de la evaluacion de las muestras mediante un panel de gusto, se preparo una muestra de leche hidrolizada con lactasa reciente anadiendo 40.000 NLU por litro de leche semidesnatada, y se incubo durante 18 horas a temperatura ambiente. El analisis de las muestras se llevo a cabo en NIZO Food Research (Pafses Bajos) usando el procedimiento SOIR, que es un procedimiento habitual en el NIZO Food Research y que incluye un analisis sensorial y qmmico. El analisis sensorial se realizo directamente en las muestras preparadas, y se congelaron alfcuotas de cada muestra de leche a -25°C en pequenas porciones para el analisis qmmico posterior.
El analisis sensorial se realizo por un panel entrenado de 9 miembros. La muestra de referencia se describio como cocida, y las otras muestras se clasificaron como leches UHT no estandar. Los atributos principales que describieron el sabor rancio fueron qmmico, medicinal, orina/no limpio y establo/estiercol.
Se aislaron los compuestos volatiles con una destilacion a alto vacfo simultanea proxima a la temperatura ambiente, creando un extracto acuoso de la muestra. Los compuestos volatiles se aislaron subsiguientemente del extracto acuoso usando un espacio de cabeza dinamico, y se recogieron en un absorbente. Los compuestos aislados se inyectaron en un cromatografo de gases haciendo uso de una desorcion termica, y se separaron en una columna de GC. El efluente de GC se evaluo por dos evaluadores entrenados (GC-sniff), y se describio en terminos del olor (olfatometna). Se llevaron a cabo analisis de GC-Sniff duplicados muy concentrados y poco concentrados usando dos tiempos de purga diferentes (30 minutos y 24 horas) durante la toma de muestras del espacio de cabeza dinamico. Subsiguientemente, los picos (compuestos) indicados durante el analisis de olfatometna como
correspondientes a las caractensticas del sabor rancio de las muestras UHT tratadas con lactasa se identificaron mediante espectrometna de masas. Los compuestos de interes que pueden explicar la causa del sabor rancio se identificaron como 1) esteres (butanoato de etilo); 2) compuestos azufrados (sulfuro de dimetilo, trisulfuro de dimetilo y benzotiazol); 3) esteres de azufre (tioacetato de metilo, tiobutirato de metilo); 4) 1-octen-3-ol; 5) 2-nonenal; 6) p5 damascenona; 7) borneol y 8) p-cresol. El p-cresol se pudo originar de conjugados en la leche. El unico compuesto que se asocio con el atributo sensorial mas agresivo “medicinal” fue p-cresol. La concentracion de p-cresol en las muestras se determino usando analisis mediante GC mediante adicion de cantidades estandar de p-cresol a las muestras. La concentracion de p-cresol en la muestra de leche UHT (incubacion durante 4 dfas) se estimo a 12 |ig por litro. Esto esta claramente por encima del umbral de sabor de 1 ppb y 2 ppb para el aire y el agua, 10 respectivamente (Ha et al, (1991) J Dairy Sci 74, 3267-3274). Tambien esta en el intervalo de concentraciones de p- cresol encontradas habitualmente en leche de vacas. Los resultados se confirmaron mediante experimentos de recombinacion en leche, confirmando que p-cresol es responsable del sabor rancio medicinal en leche UHT tratada con lactasa.
Ejemplo 2
15 Determinacion de la actividad de aril-sulfatasa y de p-galactosidasa.
La actividad de arilsulfatasa se determino usando sulfato de p-nitrofenilo (obtenido de Sigma) como sustrato. Para las medidas de actividad, se mezclaron 0,5 ml de disolucion de sustrato (20 mM de sulfato de p-nitrofenilo en 100 mM de tampon NaPi pH 6,5) con 0,5 ml de disolucion de muestra que contiene la actividad de arilsulfatasa. La disolucion se incubo a 37°C durante 3 horas. Despues, la reaccion se detuvo mediante adicion de 1,5 ml de NaOH 20 0,5M. La OD a 410 nm se determino (longitud de recorrido 1 cm) frente a un experimento en blanco en el que se
anade agua en lugar de disolucion de muestra. Como referencia, se preparo una disolucion en la que la enzima se anadio despues de que la reaccion se detuvo con NaOH. La OD410 de esta disolucion de referencia se resto de la OD410 determinada para la disolucion en la que la enzima fue activa durante tres horas. La actividad de sulfatasa se expresa como el cambio en OD410*10E6/h y por NLU. La actividad de lactasa (NLU) para la disolucion de muestra se 25 determino como se da mas abajo.
La actividad de lactasa se determino como unidades de lactasa neutra (NLU) usando o-nitrofenil-p-D- galactopiranosido (ONPG) como sustrato, segun el procedimiento descrito en FCC (cuarta ed., julio de 1996, p. 801802: Lactase (neutral) p-galactosidase activity).
Ejemplo 3
30 Adicion de aril-sulfatasa a leche UHT
El ensayo de sabor rancio en la leche se realizo con arilsulfatasa comercialmente disponible (Sigma, Aerobacter aerogenes, tipo VI; 4,9 mg de protema/ml; 3,9 unidades de arilsulfatasa como se define mediante Sigma/mg de protema). En el experimento, se incubaron 50 ml de leche UHT (Campina, Pafses Bajos) con 1 ml de disolucion enzimatica a 30°C. El desarrollo del sabor rancio fue seguido mediante aspiracion de la muestra. El olor rancio tfpico 35 que tambien se describio en el ejemplo 1 para la leche UHT incubada con lactasa fue claramente perceptible despues de 2 horas de incubacion. El olor fue mas intenso despues de 17 horas de incubacion. Aparentemente, la aril-sulfatasa genero un sabor rancio similar como la lactasa. Basandose en los hallazgos, descritos en el ejemplo 1, esto se puede explicar por la liberacion de p-cresol a partir del conjugado sulfato de p-cresilo en la leche. Tambien se realizaron experimentos en los que se anadieron fosfatasa acida (germen de trigo, Sigma, 6 unidades de 40 fosfatasa como se define por Sigma en 40 ml de leche) o glucuronidasa (procedente de E. coli, Sigma, 6350 unidades de glucuronidasa como se define por Sigma por 40 ml de leche) en lugar de arilsulfatasa. En estas incubaciones, no se desarrollo el sabor rancio tfpico. Esto sugiere que los conjugados de sulfato son los conjugados mas importantes para la formacion del sabor rancio en leche de vacas. Esto es consistente con los hallazgos de la bibliograffa (Lopez et al (1993) J Agric Food Chem. 41, 446-454). Los resultados no excluyen completamente la 45 presencia de otros compuestos de sabor rancio, que se podnan generar por glucuronidasa o fosfatasa acida, pero aparentemente estos compuestos no alcanzan los niveles que son mayores que los umbrales de sabor.
Ejemplo 4
Ensayo de sabor rancio de leche UHT: procedimiento
Se incubo leche UHT semidesnatada (Campina, Pafses bajos) con 20.000 NLU/l de leche durante 48 horas a 30°C. 50 La lactasa se anadio via un filtro esteril en condiciones esteriles para evitar la infeccion bacteriana. La leche se probo despues de 48 horas por un panel entrenado del gusto y se comparo con la disolucion de leche que se incubo en condiciones identicas pero sin la adicion de lactasa. Se preparo una disolucion de referencia brevemente antes de la prueba del gusto anadiendo 5000 NLU/l de leche e incubando durante 2 horas a 30°C. Esta leche dulce se uso como la disolucion de referencia por el panel del gusto. El sabor rancio se puntuo por el panel segun lo siguiente: la 55 leche del blanco se establecio como “-”. A los productos con un bajo sabor rancio que contienen un sabor rancio perceptible pero ligero se les da “+”, mientras que los productos que contienen mayores cantidades de sabor rancio se expresan como “++” o “+++”. La indicacion “+++” indica un nivel elevado de sabor rancio, percibido como muy
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desagradable. Los terminos usados para caracterizar el sabor rancio fueron los mismos que los descritos en el ejemplo 1.
Ejemplo 5
Purificacion de lactasa de K. lactis: eliminacion de actividad de aril-sulfatasa.
Se diluyo 10 veces con agua Maxilact LX5000 (DSM, Pafses Bajos), una lactasa de K. lactis comercialmente disponible, y se aplico a una columna de Q-sefarosa (Amersham Biosciences), equilibrada en 55 mM de KPi (pH
7.0) . La carga se continuo hasta que se detecto la actividad de lactasa en la fraccion de descarte de la columna. La columna se lavo subsiguientemente con 4 volumenes de columna de 55 mM de KPi (pH 7,0), seguido de la elucion de lactasa con 65 mM de KPi (pH 7,0) que contiene NaCl 0,16 M. Las fracciones se recogieron y se evaluaron para determinar la actividad de lactasa. Las fracciones que contienen lactasa se reunieron, y se cargaron en una columna de butil-Sefarosa (Amersham Biosciences), equilibrada en 55 mM de KPi (pH 7,) que contiene NaSO41M. La lactasa se aplico a la columna en presencia de NaSO4 1M (pH 7,0) hasta que se detecto la lactasa en la fraccion de descarte de la columna. La columna se lavo con 4 volumenes de columna de 55 mM de KPi (pH 7,) que contiene NaSO4 1M. La lactasa se eluyo usando 15 volumenes de columna de un gradiente lineal desde 55 mM de KPi (pH
7.0) que contiene NaSO41M hasta 55 mM de KPi (pH 7,0). El perfil de elucion se monitorizo mediante deteccion con UV (280 nm). Las fracciones se recogieron y se evaluaron para determinar la actividad de lactasa. Se reunieron las fracciones que contienen lactasa, con omision de aquellas fracciones que se recogieron despues de que el pico de lactasa (OD 280 nm) hubo disminuido hasta 50% del valor del pico maximo. La omision de estas fracciones es cntica para evitar contaminacion de la preparacion de lactasa con aril-sulfatasa. La elucion de lactasa solapa parcialmente con la elucion de arilsulfatasa. El producto se concentro y se desalo mediante ultrafiltracion en un filtro de 10 kdalton, y se conservo mediante adicion de glicerol a 50% p/p.
Ejemplo 6
Niveles de proteasa en lactasa purificada
La actividad de proteasa se determino usando una serie de sustratos con la formula general Glu(EDANS)-Ala-Ala- Xxx-Ala-Ala-Lys(DABCYL). (Xxx: cualquiera de los 20 aminoacidos naturales). Los sustratos se obtuvieron de PEPSCAN (Lelystad, Pafses Bajos), y son sustratos fluorescentes internamente desactivados. Cuando tales sustratos peptfdicos se escinden, esto da como resultado una senal fluorescente. Por lo tanto, la aparicion de fluorescencia senala la presencia de actividad de endoproteasa. La actividad de endoproteasa se determino en placas de microtitulacion de 96 pocillos anadiendo 50 |il de disolucion enzimatica a 200 |il de disolucion que contiene 50 |iM del sustrato en 100 mM de Tris-Bis (pH 6,7). La mezcla de reaccion se incubo durante 10 minutos a 40°C en un lector de placas de microtitulacion TECAN Genius usando un software Magellan4. El desarrollo de fluorescencia fue seguido en el tiempo (filtro de excitacion: 340 nm, filtro de emision: 492 nm). La actividad de proteasa se cuantifico como la pendiente de la recta de fluorescencia, expresada como RFU/minuto/NLU. (RFU: unidades fluorescentes relativas, como se da por el equipo de Genius). Las unidades NLU de la muestra enzimatica se determinan como se da en el ejemplo 2. La Figura 7 muestra la enorme reduccion en la actividad de proteasa cuando LX5000 se purifica sobre la columna de Q-Sefarosa. Las fracciones reunidas tras Q-sefarosa (ejemplo 4) tienen un factor de al menos 5-10 veces menos de actividad de proteasa en comparacion con el material de partida (LX5000). Las muestras de lactasa en las que RFU/min./NLU es <0,5 para cada uno de los sustratos usados (vease la fig. 1) se definen como preparaciones que tienen niveles bajos de actividad de proteasa.
Ejemplo 7
Comparacion de lactasa no purificada y purificada
Varias preparaciones de lactasa se sometieron al ensayo de sabor rancio que se describe en el ejemplo 4. Las preparaciones de lactasa difirieron en el contenido de aril-sulfatasa. Para cada preparacion, se usaron al menos dos muestras; las muestras individuales variaron en actividad de aril-sulfatasa, y los intervalos de actividad se indican en la columna derecha de la tabla 1. Los resultados del ensayo de sabor rancio se dan en la tabla 1. Claramente, los niveles de actividad de arilsulfatasa estan correlacionados con la formacion del sabor rancio. Niveles bajos de aril- sulfatasa (19 o menos, vease la tabla 1) no provocan la formacion de sabor rancio, mientras que mayores niveles conducen a una mayor formacion de sabor rancio. Tambien esta claro que la preparacion de lactasa tras Q-Sefarosa todavfa muestra desarrollo de sabor rancio, incluso aunque los niveles de proteasa son bajos (vease el ejemplo 5).
Tabla 1: Desarrollo de sabor rancio para diversas preparaciones de lactasa. 1: Fraccion con elevada actividad de aril-sulfatasa, seleccionada de las fracciones de elucion de Q-Sefarosa descritas en el ejemplo 4. 2: el nivel de 8 unidades de arilsulfatasa (como se define en el ejemplo 2) es el lfmite de deteccion del ensayo. <8 significa que no se observo actividad de arilsulfatasa.
Preparacion de lactasa
Nivel de formacion de sabor rancio Actividad de arilsulfatasa en preparacion delta OD * 10E6/h por NLU
Leche sin adicion
- 0
Lactasa despues de Q-Sefarosa (fracciones reunidas; ejemplo 4)
+ a ++ 100-300
Lactasa GODO YNL-2 (GODO, Japon)
+ 40-120
Lactasa despues de butil-Sefarosa (fracciones reunidas; ejemplo 4)
<8 -192
Lactasa con alto contenido en arilsulfatasa1
+ + + 723
Ejemplo 8
Diferentes preparaciones enzimaticas comerciales contienen actividad de arilsulfatasa
5 Diversos productos enzimaticos producidos a partir de diferentes fuentes y recuperados mediante diferentes rutas de procesamiento se recogieron y se analizaron en busca de la actividad de arilsulfatasa usando el ensayo especificado en la seccion de Materiales y Metodos. A partir de los resultados obtenidos (vease la Tabla 2), esta claro que las preparaciones enzimaticas obtenidas a partir de diversos microorganismos, tales como Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis, Rhizomucor miehei, Talaromyces emersonii y Trichoderma harzianum, pueden contaminarse 10 seriamente con actividad de arilsulfatasa.
Estas preparaciones enzimaticas se pueden purificar ventajosamente mediante el procedimiento segun la invencion. Tabla 2. Actividad de arilsulfatasa en diversas preparaciones enzimaticas comerciales
Producto enzimatico
Proveedor Codigo del lote Organismo prod. Actividad de arilsulfatasa (en delta OD * 10E6/h por g o ml de preparacion enzimatica)
Sumizyme FP (proteasas microbianas)
Shin-Nihon U-ES29 (chem syst.) A. oryzae 39300*10E3 U/g
Sumizyme LP (proteasas microbianas)
Shin-Nihon S-9906-02 A. oryzae 14950*10E3 U/g
Maxilact LG2000
DSM AE0050 K. lactis 283*10E3 U/ml
Lactasa acida
Amano LAFD10505 08 (20 mg) * 3,3 h de reaccion A. oryzae 12550*10E3 U/g
Lipase F-AP15 (lipasas)
Amano LFB 1251507 A. oryzae 1230*10E3 U/g
Piccantase A (esterasa/lipasa microbiana)
DSM F5583 (20 mg) R. miehei 250*10E3 U/g
Filtrase BR-X p-glucanase (hemicelulasas microbianas)
DSM AF0392 T. emmersonii 513*10E3 U/ml
Oenozyme Elevage p- glucanase (hemicelulasas microbianas)
DSM KM616001 T. harzianum 1985*10E3 U/g
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EJEMPLOS 9-10
En los ejemplos descritos aqu mas abajo, se realizaron tecnicas estandar de clonacion molecular, tales como aislamiento y purificacion de acidos nucleicos, electroforesis de acidos nucleicos, modificacion enzimatica, escision y/o amplificacion de acidos nucleicos, transformacion de E. coli, etc., como se describe en la bibliograffa (Sambrook et al. (2000) “Molecular Cloning: a laboratory manual”, tercera edicion, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York, e Innis et al. (eds.) (1990) “PCR protocols, a guide to methods and applications” Academic Press, San Diego).
Ejemplo 9
Construccion de una cepa genosuprimida para arilsulfatasa de Kluyveromyces lactis Aislamiento de ADN cromosomico de Kluyveromyces lactis
Un matraz de agitacion de 100 ml con YEPD (1% de extracto de levadura; 1% de bacto-peptona; 2% de glucosa) se inoculo con una unica colonia de K. lactis CBS 2359 y se cultivo durante 24 horas a 30°C agitando a 280 rpm. La cantidad de celulas se conto usando una camara de recuento, y se uso una cantidad de cultivo que corresponde a 4,1*108 celulas. La extraccion del ADN cromosomico se realizo usando el Fast DNA Spin Kit suministrado por Q- BlOgene (n° de Catalogo 6540-600). Se uso el protocolo de levadura: se uso una etapa de homogeneizacion que usa el homogeneizador Fastprep FP120 (BIO101 Savant) de 40 segundos al ajuste de velocidad 6,0. Subsiguientemente, la muestra se enfrio en hielo y se homogeneizo subsiguientemente de nuevo usando las mismas condiciones.
La pureza y el rendimiento del ADN genomico extrafdo se determino usando el espectrofotometro Nanodrop ND1000. Se encontro que la concentracion del extracto fue 114 nanogramos/microlitro. Se encontro que la relacion A260/280 y A260/230 fueron respectivamente 1,57 y 0,77.
Amplificacion mediante PCR de los flancos 5' y 3' de arilsulfatasa:
cebadores de arilsulfatasa del flanco 5':
DFS-15289 (5'^3'): TCG CCG CGG TTG TCA ACT ATA TTA ACT ATG
DFS-15290 (5'^3'): GAT AGA TCA TAG AGT AAC AAT TGG
arilsulfatasa del flanco 3':
DFS-15291 (5'^3'): GCA ACT GAA GGT GGT ATC AAT TG DFS-15292 (5'^3'): CAC CCG CGG CAC CAG ATA ATG GAG GTA G arilsulfatasa Sacll- del flanco 3':
DFS-15291 (5'^3'): GCA ACT GAA GGT GGT ATC AAT TG DFS-15340 (5'^3'): CGG CAC CAG ATA ATG GAG GT
Los flancos de arilsulfatasa se amplificaron usando Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, (Finnzymes, Espoo Finlandia). El ADN genomico de K. lactis CBS 2359 se diluyo 100 veces con agua Milli-Q, y se usaron 5 |il como molde en una mezcla de PCR de 50 |il, segun las instrucciones de los proveedores. Un bloque Hybaid MBS 0.2G PCR usa los siguientes programas:
Programa de PCR arilsulfatasa flanco 5':
Etapa 1 (1 ciclo) 98°C
30 s
Etapa 2 (30 ciclos) 98°C
10 s
60°C 30 s
72°C 30 s
Etapa 3 (1 ciclo) 72°C
10 min
4°C Mantener
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Programa de PCR arilsulfatasa flanco 3':
Etapa 1 (1 ciclo) 98°C
30 s
Etapa 2 (30 ciclos) 98°C
10 s
72°C 30 s
72°C 30 s
Etapa 3 (1 ciclo) 72°C
10 min
4°C Mantener
Programa de PCR arilsulfatasa SacII-
flanco 3':
Etapa 1 (1 ciclo) 98°C
30 s
Etapa 2 (30 ciclos) 98°C
10 s
65°C 30 s
72°C 30 s
Etapa 3 (1 ciclo) 72°C
10 min
4°C Mantener
Construccion de un vector genosuprimido de arilsulfatasa:
Los fragmented de PCR de los flancos 5', 3', y 3' SacII- arilsulfatasa obtenidos se clonaron en el vector pCR-Blunt II- TOPO usando el kit de clonacion de PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen; numero de referencia 45-0245), segun las instrucciones del proveedor. Las reacciones de clonacion de TOPO se transformaron a One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli (Invitrogen; numero de referencia 44-0301) segun las instrucciones del proveedor. Los clones correctos se seleccionaron basandose en el analisis del patron de restriccion usando MunI, SacII, XcmI, and DraI; MunI, SacII, EcoRI y EcoRV; MunI, EcoRI, EcoRV y SacII para respectivamente, 5' TOPO, 3' TOPO y 3' SacII" TOPO.
El casete amdS se aislo del vector pKLACI (New England Biolabs). El plasmido pKLACI se transformo a celulas de E. coli dam-/dcm- qmmicamente competentes (New England Biolabs; numero de catalogo C2925H), y se aislo el plasmido sin metilar.
Los lotes de ADN plasmfdico grandes de 5' TOPO, 3' TOPO, 3' SacII- TOPO y del vector pKLACI se aislaron de cultivos LBC nocturnos que contienen 50 |ig/ml de kanamicina usando el kit GeneElute Plasmid MidiPrep (Sigma; numero de catalogo NA0200).
El vector pKLACI se digirio con SalI y XbaI y el vector 5' TOPO se digirio con XbaI y XhoI. Las digestiones se purificaron usando el kit Nucleospin ExtractII (Machery Nagel) segun las instrucciones del proveedor.
El casete amdS digerido con SalI/XbaI se ligo en el vector 5' TOPO digerido con XbaI/XhoI usando el kit de ligacion Quick (New England Biolabs; numero de catalogo M2200S) segun las instrucciones del proveedor. La mezcla de ligacion se transformo a One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli (Invitrogen; numero de referencia 44-0301) segun las instrucciones del proveedor. Se selecciono un clon correcto basandose en el analisis del patron de restriccion usando MunI, EcoRI y SacI. Esto dio como resultado el siguiente vector: vector 5’amdS TOPO (Figura 1).
Se aislo un gran lote del plasmido 5'amdS TOPO de cultivos LBC nocturnos que contienen 50 |ig/ml de kanamicina usando el kit GeneElute Plasmid MidiPrep Kit (Sigma; numero de catalogo NA0200) segun las instrucciones del proveedor. El vector 5'amdS TOPO se digirio con MunI y ^scI, y el vector 3' SacII- TOPO se digirio con MunI y EcoRI.
El fragmento MunI/EcoRI 3' SacII- TOPO se aislo y purifico por medio de extraccion en gel. Se realizo una electroforesis en 1% de agarosa en tampon de TAE que contiene SYBR Safe DNA Stain (Invitrogen; numero de catalogo S33102), segun las instrucciones del proveedor. El fragmento se visualizo usando el transiluminador lector en la oscuridad (Clare Chemical Research; numero de catalogo DR-45M), se corto del gel y se extrajo de la agarosa usando el kit Nucleospin ExtractII (Machery, Nagel; numero de catalogo 740 609.250) segun el protocolo de extraccion en gel del proveedor.
El vector 5'amdS TOPO se digirio con MunI y con AscI, y se purifico usando el kit Nucleospin ExtractII (Machery Nagel) segun el protocolo de purificacion de PCR del proveedor. Subsiguientemente, el vector 5'amdS TOPO
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digerido con Munl/AscI se desfosforilo usando fosfatasa alcalina de gamba (Roche; numero de catalogo 1.758.250) segun las instrucciones del proveedor.
El fragmento Munl/EcoRI 3' Sacll- TOPO se ligo al vector 5' amdS TOPO digerido con Munl/AscI desfosforilado usando el kit de ligacion Quick (New England Biolabs; numero de catalogo M2200S) segun las instrucciones del proveedor. La mezcla de ligacion se transformo a celulas E. coli dam-/dcm- qmmicamente competentes (New England Biolabs; numero de catalogo C2925H) segun las instrucciones del proveedor. Se selecciono un clon correcto basandose en el analisis del patron de restriccion usando EcoRI y EcoRV. Esto dio como resultado el siguiente vector: vector 5' amdS 3' SacII- TOPO.
Se aislo un gran lote de vector 5' amdS 3' SacII- TOPO de cultivos LBC nocturnos que contienen 50 pg/ml de kanamicina usando el kit GeneElute Plasmid MidiPrep Kit (Sigma; numero de catalogo NA0200) segun las instrucciones del proveedor.
El vector 5'amdS 3'SacII- se digirio con XbaI. El vector 3' TOPO se digirio con XbaI y SpeI. Las digestiones se purificaron usando el kit Nucleospin ExtractII Kit (Machery Nagel) segun las instrucciones del proveedor. El fragmento XbaI/SpeI 3' TOPO se aislo por medio de extraccion en gel, como se describe anteriormente. El vector 5'amdS 3'SacII- digerido con XbaI se desfosforilo usando fosfatasa alcalina de gamba, Roche (numero de catalogo 1.758.250), segun las instrucciones del proveedor. El fragmento XbaI/SpeI 3' se ligo en el vector 5' amdS 3' SacII" digerido con XbaI desfosforilado usando el kit de ligacion Quick (New England Biolabs; numero de catalogo M2200S) segun las instrucciones del proveedor. La mezcla de ligacion se transformo a One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli (Invitrogen; numero de referencia 44-0301). Se selecciono un clon correcto basandose en el analisis del patron de restriccion usando MfeI, KpnI, EcoRI, Sacll, ScaI. Esto dio como resultado el vector genosuprimido de arilsulfatasa de K. lactis final (figura 3).
Se aislo un gran lote del vector genosuprimido de arilsulfatasa de cultivos LBC nocturnos que contienen 50 pg/ml de kanamicina usando el kit GeneElute Plasmid MidiPrep Kit (Sigma; numero de catalogo NA0200) segun las instrucciones del proveedor. El vector genosuprimido de arilsulfatasa de K. lactis se digirio con SacII, de manera que se obtendna el casete genosuprimido lineal, que carece de la parte del vector TOPO. La digestion se purifico usando el kit Nucleospin ExtractII Kit (Machery Nagel) segun las instrucciones del proveedor.
Transformacion de K. lactis CBS 2359 con vector genosuprimido de arilsulfatasa
Se incubo un cultivo de 100 ml de YEPD de K. lactis CBS2359 a 30°C, agitando a 280 rpm durante 24 horas. Este cultivo se uso para inocular un cultivo de 100 ml de YEPD que se hizo crecer en las mismas condiciones hasta que se alcanzo una OD610 entre 0,5 y 0,8.
Las celulas se cosecharon por medio de centrifugacion durante 5 minutos a 1559 g y 4°C. El pelete celular se lavo con 50 ml de tampon de electroporacion (EB) esteril: 10 mM de Tris pH 7,5, 9,2% (p/v) de sacarosa, 1 mM de MgCh a 4°C. El pelete celular se resuspendio en 50 ml de YEPD que contiene 25 mM de DTT y 20 mM de tampon de HEPES pH 8,0 a temperatura ambiente. Las celulas se incubaron 30 minutos a 30°C sin agitacion. Las celulas se cosecharon por medio de centrifugacion durante 5 minutos a 1559 g y 4°C, y se lavaron con 10 ml de EB enfriado con hielo. Las celulas se peletizaron nuevamente por medio de centrifugacion durante 5 minutos a 1559 g y 4°C, y se resuspendieron en 0,1 ml de EB enfriado con hielo. La suspension celular se distribuyo en alfcuotas de 40 microlitros en tubos eppendorf de 1,5 ml. A una alfcuota de celulas, se anadieron 0,2-1,0 microgramos (1-5 microlitros) del constructo genosuprimido lineal, se mezclo pipeteando, y se incubo en hielo durante 15 minutos. La mezcla de celula y ADN se anadio a una cubeta de electroporacion congelada con un tamano de espacio de 2 mm (BTX; numero de referencia 45-0125). La electroporacion se llevo a cabo en un electroporador BioRad compuesto de un Gene Pulser (BioRad, Modelo numero 1652077) y un Pulse Controler (BioRad, Modelo numero: 1652098) usando los siguientes ajustes: 1000 V, 400 Ohm y 25 pF. Inmediatamente tras la electroporacion, se anadio 1 ml de YEPD, y las celulas se transfirieron a un tubo esteril de 12 ml y se incubaron durante 2 horas en una incubadora de agitacion a 30°C. Las celulas se peletizaron durante 5 minutos a 1559 g, y se lavaron en disolucion salina fisiologica (cloruro de sodio al 0,85% (p/v)). Las celulas se peletizaron nuevamente y se resuspendieron en 1 ml de disolucion salina fisiologica. Se colocaron en placas varias alfcuotas de 25 pl, 50 pl y 100 pl sobre placas de agar amdS selectivas: 1,25% (p/v) de agar, 1,17% (p/v) de base de carbono de levadura, 30 mM de tampon de fosfato pH 6,8, y 5 mM de acetamida. Las placas se incubaron durante 2 dfas a 30°C, seguido de una incubacion de 2 dfas a temperatura ambiente. Las colonias se seleccionaron y purificaron rallandolas en placas de agar YEPD, de manera que aparecieran colonias individuales, y se incubaron a 30°C durante 24 horas. Estas colonias individuales se ensayaron para la integracion dirigida del constructo genosuprimido usando una PCR de colonia con oligonucleotidos dirigidos contra el casete amdS y en direccion 3' del constructo genosuprimido integrado. El material de colonia se suspendio en 20 mM de NaOH, 0,2% (p/v) y se incubo durante 5' a 98°C. La suspension celular se diluyo 2 veces con agua, y se usaron 2,5 microlitros directamente como molde en una reaccion de PCR de 25 microlitros usando Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes; Espoo Finlandia; codigo del producto F- 530S) segun las instrucciones del proveedor.
Directo 3' amdS: GAC AAT TGA TAC CAC CTT CAG TTG
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Inverso en direccion 3': CTG GGA AAT GTG GTG ACT CCA TA Programa dirigido a PCR:
Etapa 1 (1 ciclo)
98°C 30 s
Etapa 2 (30 ciclos)
98°C 10 s
68°C 30 s
72°C 30 s
Etapa 3 (1 ciclo)
72°C 10 min
4°C Mantener
La PCR se analizo en geles de agarosa al 1%, y se seleccionaron los transformantes deseados que muestran una banda amplificada clara. Las cepas genosuprimidas de arilsulfatasa se denominaron 2359 Aary1-10, y se almacenaron hasta un uso posterior.
Ejemplo 10
Deteccion de actividad de arilsulfatasa en 2359 AARY
La cepa madre CBS 2359 y la cepa 2359 AARY se cultivaron todas ellas en un matraz de agitacion en 100 ml de YEP + 2% de galactosa durante 3 dfas a 30°C. La biomasa se recogio mediante centrifugacion durante 5 minutos a 1559 g y 4°C. La biomasa se lavo dos veces con agua enfriada con hielo, para eliminar los componentes del medio. La biomasa de levadura se trato con el reactivo de extraccion de protema de levadura (Y-PER) segun las instrucciones del fabricante (Pierce), para extraer enzimas intracelulares como arilsulfatasa. Estara claro para los expertos en la tecnica que se pueden usar otros protocolos de lisis de levaduras para extraer la actividad de arilsulfatasa, como cizallamiento mecanico con perlas de vidrio, o tratamiento enzimatico para disolver la pared celular con, por ejemplo, Zymolyase (vease, por ejemplo, Glover y Hames, DNA cloning 2 - a practical approach, IRL Press 1995).
La arilsulfatasa se midio en el extracto usando el metodo descrito en el Ejemplo 2. A partir de este experimento, esta claro que mientras que la cepa madre contema una cantidad apreciable de actividad de arilsulfatasa, no se pudo detectar tal actividad en la cepa 2359 AARY. Cuando la actividad de p-galactosidasa (lactasa) se midio en este extracto segun el Ejemplo 2, no se pudo detectar ninguna diferencia en la actividad de lactasa entre la cepa de tipo salvaje CBS 2359 y la cepa mutante 2359 AARY, mostrando que la cepa mutante esta espedficamente perturbada en la actividad de arilsulfatasa.
La cepa mutante se puede usar para obtener una preparacion de lactasa a escala industrial, principalmente desprovista de actividad de arilsulfatasa.

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para producir una lactasa mediante un metodo que comprende
    (a) cultivar una celula hospedante deficiente en arilsulfatasa en un medio nutriente, en condiciones que conduzcan a la expresion de la lactasa, en el que dicha celula hospedante deficiente en arilsulfatasa es una cepa recombinante deficiente en arilsulfatasa obtenida perturbando un gen que codifica actividad de arilsulfatasa, insertando un gen marcador en un gen que codifica actividad de arilsulfatasa, o eliminando parte o toda la region codificante de arilsulfatasa del genoma,
    (b) expresar la lactasa en dicha celula hospedante, y
    (c) recuperar la lactasa del medio nutriente o de la celula hospedante.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha lactasa es heterologa a dicha cepa deficiente en arilsulfatasa.
  3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha celula hospedante es una bacteria.
  4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 3, en el que dicha celula hospedante es del genero Bacillus.
  5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 4, en el que dicha celula hospedante es de la especie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis o Bacillus amyloliquefaciens.
  6. 6. Procedimiento segun cualquier reivindicacion anterior, comprendiendo dicho procedimiento recuperar una preparacion de lactasa a partir del medio nutriente o a partir de la celula hospedante.
  7. 7. Procedimiento para preparar un producto lacteo, comprendiendo dicho procedimiento llevar a cabo el procedimiento segun la reivindicacion 6 y usar dicha preparacion de lactasa para preparar el producto lacteo.
  8. 8. Procedimiento segun la reivindicacion 7, en el que dicho producto lacteo contiene protema de la leche.
  9. 9. Procedimiento segun la reivindicacion 7 u 8, en el que dicho producto lacteo se selecciona del grupo que consiste en leche, productos derivados de la leche, productos de leche fermentados, yogur, leche condensada, leche evaporada, leche seca, leche congelada, helado, suero lacteo y queso.
  10. 10. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicho producto lacteo es leche.
  11. 11. Procedimiento segun la reivindicacion 10, en el que dicha leche es leche de vaca.
  12. 12. Procedimiento segun la reivindicacion 10 u 11, en el que dicha leche es leche UHT.
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