ES2622908T3 - Ensayo de Neisseria gonorrhoeae - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de detección de una secuencia diana de Neisseria gonorrhoeae que comprende: (a) en una muestra, amplificar la secuencia diana usando un primer cebador de amplificación que tiene una secuencia que comprende la secuencia de unión a diana de al menos una de las SEQ ID NO: 1 o 2, en la que la secuencia de unión a diana para la SEQ ID NO:1 es AATCAAAAGCGAATGCG y la secuencia de unión a diana de la SEQ ID NO:2 es CTTCTTCATCTTTTGC, en presencia de cebadores amortiguadores que consisten en las SEQ ID NO:3 y 4; y (b) detectar la secuencia diana amplificada.
Description
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10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Ensayo de Neisseria gonorrhoeae Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a procedimientos de amplificacion de acido nucleico para la deteccion y/o cuantificacion de secuencias de acido nucleico de Neisseria gonorrhoea. La presente divulgacion proporciona oligonucleotidos que son complementarios o que se hibridan con secuencias de acido nucleico de Neisseria gonorrhoeae para la amplificacion y/o deteccion del mismo. La presente divulgacion tambien proporciona controles internos de amplificacion (IAC, del ingles, internal amplification controls) que se pueden usar en las reacciones de amplificacion de acidos nucleicos para determinar si las condiciones del ensayo son permisibles para la amplificacion y/o deteccion de una secuencia diana. La presente invencion proporciona un ensayo de amplificacion por desplazamiento de hebra (SDA) diplex para la amplificacion y/o deteccion de secuencias de acido nucleico de Neisseria gonorrhoea en presencia de un IAC.
Antecedentes de la invencion
La gonorrea es la enfermedad transmisible mas prevalente notificada en los Estados Unidos, con 2,5 millones de casos estimados notificados anualmente. Vease Lee y col., Current Medical Diagnosis and Treatment, 37a ed., 1998, Appleton & Lange. La gonorrea esta causada por Neisseria gonorrhoeae, un diplococo gram negativo que se encuentra tfpicamente en el interior de las celulas polimorfonucleares, y que se transmite comunmente durante las relaciones sexuales. Esta bacteria puede infectar el tracto genital, la boca y el recto. En las mujeres, la apertura al utero, el cuello uterino, es el primer lugar de infeccion. El penodo de incubacion de la bacteria es normalmente de 2-8 dfas (vease Tierney y col., Current Medical Diagnosis and Treatment, 37a ed., 1998, Appleton & Lange). La gonorrea es una causa importante de uretritis en los hombres y cervicitis en las mujeres. La gonorrea puede diseminarse en el utero y en las trompas de Falopio, dando lugar a la enfermedad pelvica inflamatoria ("EPI") y, de hecho, aproximadamente del 20 % al 40 % de las EPI y el 14 % de la infertilidad tubarica se puede atribuir a las infecciones gonococicas. Vease Chan y col., 2000, Arch. Pathol. Lab. Med. 124:1649-1652.
El diagnostico tradicional de laboratorio de la gonorrea se realiza mediante un cultivo durante toda la noche de un frotis (por ejemplo, de orina o del cuello uterino) obtenido de un sujeto seguido de una identificacion bioqmmica y/o microscopica de Neisseria gonorrhoea.
Recientemente, los ensayos de amplificacion de acido nucleico se han utilizado ampliamente para la deteccion y/o el diagnostico. Actualmente, los ensayos de amplificacion de ADN de Neisseria gonorrhoea disponibles en el mercado incluyen la PCR (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ), y la amplificacion por desplazamiento de hebra (SDA; Becton Dickinson, Sparks, MD). Las tecnicas de amplificacion de acido nucleico in vitro proporcionan herramientas potentes para la deteccion y el analisis de los acidos nucleicos, especialmente cuando los acidos nucleicos diana estan presentes en pequenas cantidades. La sensibilidad de tales procedimientos los hace particularmente adecuados en areas tales como el diagnostico medico (por ejemplo, la deteccion de agentes infecciosos como bacterias y virus, el diagnostico de enfermedades geneticas hereditarias y adquiridas, y el establecimiento del tipo de tejido), el aislamiento de genes, y la medicina forense (es decir, ensayos forenses para la deteccion de acidos nucleicos espedficos en las investigaciones criminales).
Las tecnicas de amplificacion de acidos nucleicos se clasifican tradicionalmente de acuerdo con los requisitos de temperatura del procedimiento de amplificacion. Las amplificaciones isotermicas se realizan a una temperatura constante, a diferencia de las amplificaciones que requieren ciclos entre temperaturas altas y bajas. Son ejemplos de tecnicas de amplificacion isotermica: la amplificacion por desplazamiento de hebra (SDA; Walker y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396; Walker y col., 1992, Nuc. Acids. Res. 20:1691-1696; y el documento EP 0 497 272), la replicacion de secuencia autosostenida (3SR; Guatelli y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), el sistema de Qp replicasa (Lizardi y col., 1988, Biotechnology 6:1197-1202), y las tecnicas desveladas en el documento WO 90/10064 y el documento Wo 91/03573. Son ejemplos de tecnicas que requieren ciclos de temperatura: la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki y col., 1985, Science 230:1350-1354), reaccion en cadena de la ligasa (LCR; Wu y col., 1989, Genomics 4:560-569; Barringer y col., 1990, Gene 89:117-122; Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), amplificacion basada en la transcripcion (Kwoh y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177) y amplificacion por restriccion (Patente de Estados Unidos n.° 5.102.784).
Los ensayos de amplificacion de acidos nucleicos actualmente disponibles para Neisseria gonorrhoea, sin embargo, carecen de un mecanismo de control interno para ensayar cualquier condicion de reaccion inhibidora o errores humanos que estan presentes en las pruebas y son por lo tanto propensos a resultados falsos negativos. Por lo tanto, existe la necesidad de un ensayo que disminuya la posibilidad de resultados falsos negativos.
Neisseria gonorrhoeae comparte un alto grado de homologfa con otras especies de Neisseria emparentadas muy estrechamente. Por lo tanto, existe claramente la necesidad del desarrollo de nuevos procedimientos y oligonucleotidos que son capaces de confirmar los resultados de los ensayos existentes y/o aumentar la especificidad y/o sensibilidad de una prueba para detectar Neisseria gonorrhoea.
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La presente invencion proporciona un ensayo de amplificacion de acido nucleico diplex que se puede usar como alternativa frente al ensayo actual monoplex de Neisseria gonorrhoeae (es dedr, sin control de amplificacion interno en la misma mezcla de reaccion con una secuencia diana). La presente divulgacion tambien proporciona oligonucleotidos que se pueden usar en ensayos de amplificacion de acido nucleico tanto diplex como monoplex, disenados para amplificar y/o detectar acidos nucleicos de Neisseria gonorrhoeae.
La cita o el analisis de una referencia en el presente documento no debe interpretarse como la admision de que esta es tecnica anterior para la presente invencion.
Sumario de la invencion
La presente divulgacion proporciona un procedimiento para detectar de forma cualitativa y/o de forma cuantitativa la presencia o ausencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento: (a) amplificar la secuencia diana usando un primer cebador de amplificacion que tiene una secuencia que consiste esencialmente en la secuencia de union diana de cualquier cebador de amplificacion desvelado en el presente documento y (b) detectar la secuencia diana amplificada. La presente invencion tambien comprende el uso de un segundo cebador de amplificacion que consiste esencialmente en la secuencia de union diana de cualquier cebador de amplificacion desvelado en el presente documento.
La presente divulgacion tambien proporciona secuencias de control de amplificacion interna con el fin de disminuir la aparicion de resultados falsos negativos.
La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para detectar la secuencia diana de Neisseria gonorrhoea que comprende: (a) hibridar uno o mas cebadores de amplificacion desvelados en el presente documento con una secuencia diana y (b) detectar dicho cebador de amplificacion hibridado.
La presente divulgacion tambien proporciona oligonucleotidos que son utiles en la amplificacion y deteccion de Neisseria gonorrhoea. La presente divulgacion tambien proporciona kits que comprenden tales oligonucleotidos.
Descripcion detallada de la invencion
Cualquiera de las definiciones proporcionadas son por razones de claridad y no debenan considerarse limitantes. Excepto donde se indique, los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto habitual en la materia a la cual se refiere la invencion.
La presente invencion se refiere a procedimientos de amplificacion de acido nucleico y ensayos para la deteccion y/o cuantificacion de secuencias de acido nucleico de Neisseria tal como se define en las reivindicaciones adjuntas 1-5. La presente divulgacion proporciona uno o mas oligonucleotidos que son complementarios o que hibridan con secuencias de acido nucleico de Neisseria gonorrhoeae para la amplificacion y/o deteccion de dichas secuencias. La presente divulgacion ademas proporciona un control de amplificacion interno (IAC) que puede usarse en ensayos de amplificacion de acido nucleico de la invencion para determinar si las condiciones del ensayo son permisibles para la amplificacion y/o deteccion de una secuencia diana. Los oligonucleotidos pueden usarse en todos los tipos de reacciones de amplificacion, tales como, por ejemplo, la amplificacion por desplazamiento de hebra (SDA), la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccion en cadena de la ligasa, la amplificacion basada en secuencia de acido nucleico (NASBA), la replicacion por cfrculo rodante (RCA), la amplificacion mediada por transcripcion (TMA), y la amplificacion mediada por Qp replicasa.
Los procedimientos de la invencion son particularmente ventajosos sobre los procedimientos tradicionales usados para la deteccion de la gonorrea, ya que reducen los resultados falsos negativos mediante, por ejemplo, la inclusion de controles internos de amplificacion.
La sensibilidad de un ensayo se refiere a la tolerancia frente a falsos negativos. Un resultado de ensayo es un falso negativo si el ensayo se muestra negativo, pero la muestra realmente contiene la secuencia diana. Cuanto mas pequena es la cantidad de la secuencia diana que puede detectar el ensayo, mayor sensibilidad tiene el ensayo.
La especificidad de un ensayo se refiere a la tolerancia frente a falsos positivos. Un resultado de ensayo es un falso positivo si la prueba se muestra positiva, pero la muestra realmente no contiene la secuencia diana. Por lo tanto, un ensayo mas espedfico debe tener un nivel mas bajo de falsos positivos.
De acuerdo con la presente invencion, se puede interpretar un resultado de un ensayo para detectar Neisseria gonorrhoeae en una muestra que utiliza un IAC tal como se describe en la tabla 1.
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Tabla 1. Interpretacion de un ensayo SDA diplex
- Resultado
- IAC
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- Secuencia diana para Neisseria gonorrhoea
- + +
- Presencia o ausencia de Neisseria gonorrhoea
- ausencia presencia presencia reaccion inhibidora, el ensayo necesita repetirse o modificarse
De acuerdo con la presente invencion, se puede usar un IAC en lugar de, y/o ademas de, un control de amplificacion convencional (AC, de las siglas amplification control). Se entiende por un experto en la materia que la reaccion AC convencional se realiza en una mezcla de reaccion separada de la muestra a ensayar. Una reaccion AC convencional comprende reactivos de amplificacion y ADN diana. Si la amplificacion y/o deteccion del ADN diana en la reaccion AC se suprime, se puede atribuir una indicacion de que la secuencia diana esta ausente en una muestra de ensayo a las senales inhibidoras en la reaccion. Aunque esta forma de reaccion de control es eficaz, no es la mas deseable. Ya que la reaccion AC se realiza de forma separada, no puede reflejar exactamente las condiciones de las reacciones que contienen la muestra de ensayo. Los procedimientos de la invencion son particularmente utiles porque tienen un IAC y la reaccion de control se realiza en identicas condiciones de espacio y tiempo que la amplificacion y/o deteccion de la secuencia diana, minimizando asf el error humano.
La presente divulgacion tambien proporciona cebadores de amplificacion que se hibridan con una secuencia diana (es decir, una secuencia de Neisseria gonorrhoea) y/o una secuencia IAC. En algunas realizaciones de la divulgacion, un cebador amortiguador o un oligonucleotido adaptador o su respectiva secuencia de union a diana descrita en la tabla 2, la tabla 3 o la figura 1 se puede usar como un cebador de amplificacion. En algunas realizaciones de la divulgacion, se selecciona un cebador de amplificacion de los cebadores de amplificacion descritos en la tabla 2, en la tabla 3 o en la figura 1, tal como se desvela en el presente documento. En otra realizacion de la invencion, se selecciona un cebador de amplificacion de las secuencias de union a diana de cebadores de amplificacion descritos en la tabla 2, en la tabla 3 o en la figura 1, tal como se desvela en el presente documento. En otra realizacion de la divulgacion, los cebadores de amplificacion comprenden GCINT3- APL2 (SEQ ID NO:1) y GCINT3-APR1 (SEQ ID NO: 2).
La presente divulgacion ademas proporciona oligonucleotidos adaptadores y sondas de deteccion que se pueden usar en un ensayo de amplificacion de acido nucleico para la deteccion de secuencias de acido nucleico de Neisseria gonorrhoeae. En algunas realizaciones de la divulgacion, el oligonucleotido adaptador es un oligonucleotido monocatenario que comprende la SEQ ID NO:5, 6, 18, 20 o 21. En otras realizaciones de la invencion, la sonda de deteccion es un oligonucleotido monocatenario que comprende la SEQ ID NO: 7, 8, 22 o 23, y un par donador/desactivador fluorescente unido al oligonucleotido.
Procedimientos de amplificacion
Los oligonucleotidos desvelados en el presente documento se pueden usar en cualquier procedimiento de amplificacion de acido nucleico conocido en la materia.
Los procedimientos de amplificacion adecuados incluyen, pero no se limitan a, la reaccion en cadena de la polimerasa ("PCR"; vease las Patentes de Estados Unidos n.° 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; y 4.965.188), la amplificacion por desplazamiento de hebra ("SDA"; vease Birren y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:392 (1992); Walker y col., Nucl. Acids Res. 20:1691 (1992); y la Patente de Estados Unidos n.° 5.270.184), la amplificacion termofflica por desplazamiento de hebra ("tSDA"; vease el documento EP 0 684 315), la replicacion de secuencia autosostenida ("3SR"; vease Birren y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:1874-78 (1990)), la amplificacion basada en secuencia de acido nucleico ("NASBA"; vease la Patente de Estados Unidos n.° 5.130.238), el sistema replicasa Qp (vease Lizardi y col., Biotechnology 6:1197 (1988)), la reaccion en cadena de la ligasa ("LCR"; vease la Patente de Estados Unidos n.° 5.427.930); la replicacion por cfrculo rodante (vease Lizardi y col., Nat Genet 19:225-232 (1998)) y la amplificacion basada en la transcripcion (vease Kwoh y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:1173-77 (1989)). Los cebadores de amplificacion de la presente divulgacion se pueden usar para llevar a cabo PCR, SDA o tSDA.
La SDA generalmente procede del siguiente modo. En primer lugar, los cebadores de amplificacion se unen a la secuencia diana o a un producto de extension monocatenario desplazado que se ha polimerizado previamente. En segundo lugar, una polimerasa deficiente en exonucleasa 5'-3' incorpora un a-tiodesoxinucleosido trifosfato ("a-tio dNTP") en un producto de extension. Si el a-tio dNTP es un a-tio dCTP, por ejemplo, se incorpora al producto de extension donde haya un resto G complementario en el molde. La incorporacion de un a-tio dNTP en el producto de extension en un sitio de reconocimiento de una endonucleasa de restriccion crea un sitio hemimodificado, es decir, un sitio modificado solo en la hebra del producto de extension. Una endonucleasa de restriccion entonces corta el sitio de restriccion bicatenario hemimodificado. A continuacion, la endonucleasa de restriccion se disocia del sitio de corte. Finalmente, una polimerasa que es deficiente en la actividad exonucleasa 5'-3' se extiende desde el extremo 3' del
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corte y desplaza la hebra corriente abajo de ADN. El corte, la extension de la hebra y el desplazamiento de la hebra tienen lugar de manera concurrente y de forma continua porque la extension del corte regenera otro sitio de restriccion que se puede cortar. Cuando un par de cebadores de amplificacion se usa de manera que cada uno hibrida con una de las dos hebras de un duplex bicatenario que comprende una secuencia diana, la amplificacion es exponencial porque tanto la hebra codificante como la no codificante sirven como moldes en cada ronda de amplificacion. Cuando se usa un unico cebador de amplificacion, la amplificacion es lineal porque solo una hebra sirve como molde para la extension del cebador. Los ejemplos de endonucleasas de restriccion que cortan sus sitios de reconocimiento bicatenarios cuando se incorpora un a-tio dNTP y que son adecuados para la SDA incluyen BsoB1, BsrI, BstNI, BsmAI, BstOI, BslI, Aval, HincII y NciI. La SDA se describe adicionalmente en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.270.184, n.° 5.455.166 y n.° 5.648.211. Un ensayo de SDA puede ser, pero no se limita a, una SDA tradicional (o convencional) (tal como se describe en Walker y col., PNAS (1992) 89:392-396, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.962.273, 5.712.124 y 5.744.311), una SdA termofflica (tal como se describe en Walker y col., Nuc. Acids Res. (1992) 20:1691-1696, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.648.211 y 5.744.311), y una SDA termofflica flourescente homogenea en tiempo real (tal como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 6.379.888).
La contaminacion cruzada con productos de amplificacion trasladados de reacciones de amplificacion previas en reactivos, dispositivos de pipeteo y superficies de laboratorio se puede reducir incorporando diversos restos a los productos de extension. Por ejemplo, la timina se puede sustituir con 2'-desoxiuridina 5' trifosfato ("dU"), tal como se ensena en el documento EP 0 624 643. La escision del dU que se incorpora a los productos de amplificacion se cataliza con uracil ADN glicosilasa ("UDG"), que hace que los productos de amplificacion que contienen dU sean incapaces de amplificarse adicionalmente. El propio UDG puede desactivarse cuando sea apropiado para continuar la amplificacion.
En el caso de la tSDA, los cebadores y sus secuencias diana preferentemente se seleccionan de manera que su contenido en GC sea menos del 70 % del total de la composicion de nucleotidos para minimizar la estructura secundaria y las interacciones cebador-cebador que pueden limitar la eficacia de la amplificacion diana. Un cebador de amplificacion adecuado para la tSDA comprende, en orden desde el extremo 3' de la sonda hasta el extremo 5', una secuencia de union a la diana, un sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restriccion, y una "cola." La secuencia de union a la diana se hibrida de forma espedfica con una secuencia complementaria de un acido nucleico diana. El sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restriccion se reconoce mediante una endonucleasa de restriccion que corta una hebra de ADN duplex cuando se hemimodifica el sitio de reconocimiento, tal como se describe en Walker y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:392 (1992) y Kim y col., Nucl. Acids. Res. 20:1691 (1992). La cola 5' funciona como un sitio de recebado de la polimerasa cuando el resto del cebador de amplificacion se corta y se desplaza durante la tSDA. La funcion de recebado de la cola sostiene la reaccion tSDA y permite la smtesis de multiples amplicones de una sola molecula diana. La longitud y la secuencia de la region de la cola pueden variar, siempre que la cola permanezca hibridada con la diana despues del corte y que la cola no contenga secuencias que hibriden, ya sea con la secuencia de union a la diana o con otros cebadores.
Algunos procedimientos de amplificacion, tales como la tSDA, usan un "cebador amortiguador" o un "cebador externo" para desplazar los productos de extension del cebador. Un "cebador amortiguador" o un "cebador externo" es un cebador que se usa para desplazar un cebador de amplificacion y su producto de extension en una reaccion de amplificacion. Un cebador amortiguador hibrida con una secuencia diana cadena arriba de un cebador de amplificacion, de manera que la extension del cebador amortiguador desplaza el cebador de amplificacion cadena abajo y su producto de extension. Los productos de extension del cebador pueden desplazarse como alternativa mediante calor. Los cebadores amortiguadores usados en las reacciones de SDA y tSDA no necesitan hibridar de manera espedfica con acidos nucleicos de enterovirus. Mas bien, los cebadores amortiguadores pueden hibridar con cualquier secuencia diana que este cadena arriba de los cebadores de amplificacion y que este lo suficientemente cerca del sitio de union del cebador de amplificacion como para desplazar el producto de extension del cebador de amplificacion tras la extension del cebador amortiguador. Las faltas de coincidencias entre la secuencia del cebador amortiguador y su secuencia diana generalmente no afectan a la eficacia de la amplificacion, siempre que el cebador amortiguador todavfa hibride con su secuencia diana. Asimismo, la especificidad del sistema SDA para la amplificacion de la secuencia diana en preferencia a otros acidos nucleicos no depende de la especificidad del cebador amortiguador o los cebadores amortiguadores para la hibridacion con el acido nucleico diana. La especificidad de un sistema SDA por la secuencia diana proviene de la fidelidad de hibridacion de los cebadores de SDA y sondas u oligonucleotidos usados para la deteccion de productos amplificados.
Cuando una reaccion de amplificacion usada de acuerdo con la invencion es una reaccion tSDA, las polimerasas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, exo_ Vent (New England Biolabs), exo- Deep Vent (New England Biolabs), Bst (BioRad), exo- Pfu (Stratagene), Bca (Panvera), y Sequencing Grade Taq (Promega). Otros pueden ser identificados de forma rutinaria usando el ensayo de extension anterior. Las polimerasas Tth (Boehringer), Tfi (Epicentre), REPLINASE (DuPont) y REPLITHERM (Epicentre) son capaces de desplazar una banda desde un corte, pero tambien tienen actividad exonucleasa 5'-3'. Estas polimerasas son utiles en los procedimientos de la invencion despues de la retirada de la actividad exonucleasa, por ejemplo, mediante ingeniena genetica. Como la termoestabilidad de las endonucleasas de restriccion termofflicas se limita generalmente a menos de 65 °C, las polimerasas termofflicas con actividad optima alrededor de esta temperatura o por debajo (por ejemplo, Bst y Bca) son mas compatibles con las endonucleasas de restriccion termofflicas en la reaccion.
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Los componentes de la presente divulgacion pueden optimizarse a una forma donde cada componente puede secarse y rehidratarse cuando se necesite usando cualquier tecnica conocida en la materia. (Vease Little y col., Clinical Chemistry 45(6):777-784 (1999)).
Diseno del cebador
Un "cebador de amplificacion" es un oligonucleotido para la amplificacion de una secuencia diana mediante la extension del oligonucleotido despues de hibridarse a una secuencia diana o mediante el ligamiento de multiples oligonucleotidos que estan adyacentes cuando hibridan con la secuencia diana. Al menos una porcion del cebador de amplificacion hibrida con la secuencia diana. Esta porcion se denomina la secuencia de union a diana y determina la especificidad por la diana del cebador. Debe entenderse que las secuencias de union a diana ejemplificadas en la presente invencion tambien pueden usarse en una diversidad de formas para la deteccion de Neisseria gonorrhoea. Por ejemplo, las secuencias de union a diana desveladas en el presente documento pueden usarse como alternativa como sondas de hibridacion para la deteccion directa de Neisseria gonorrhoeae, bien sin amplificacion previa o en un ensayo tras la amplificacion. Tales procedimientos de hibridacion se conocen bien en la materia y tipicamente emplean un marcador detectable asociado con o unido a la secuencia de union a diana para facilitar la deteccion de la hibridacion.
El diseno de los cebadores de amplificacion puede optimizarse para cada procedimiento de amplificacion. Como no se requieren secuencias o estructuras especiales para impulsar la reaccion de amplificacion, los cebadores de amplificacion para una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), pueden consistir solo en secuencias de union a molde. Sin embargo, otras reacciones de amplificacion requieren secuencias de nucleotidos especializadas, ademas de la secuencia de union a diana, para que se produzca la reaccion. Por ejemplo, un cebador de amplificacion para su uso en un ensayo de SDA ademas comprende sitio 5' de reconocimiento de la endonucleasa de restriccion a la secuencia de union a diana (vease la Patente de Estados Unidos n.° 5.455.166 y 5.270.184). El cebador de amplificacion tambien puede comprender un grupo 3'- OH, que se puede extender mediante la ADN polimerasa cuando la secuencia de union al molde del cebador de amplificacion hibrida con la secuencia diana. Los cebadores de amplificacion para la replicacion de secuencia autosostenida (3SR) y el ensayo basado en la secuencia de acido nucleico (NASBA), por el contrario, comprenden un promotor de ARN polimerasa cerca del extremo 5'. (se describen ensayos 3SR en Guatelli y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878). El promotor se anade a la secuencia de union a diana y sirve para impulsar la reaccion de amplificacion dirigiendo la transcripcion de multiples copias de ARN del molde. Tales secuencias adicionales a la secuencia de union diana que son necesarias para una reaccion de amplificacion particular se conocen bien en la materia. un promotor reconocido por la ARN polimerasa para ensayos de replicacion autosostenidos
En el diseno de los cebadores de amplificacion y los cebadores amortiguadores de la presente divulgacion, se deben tener en cuenta las preocupaciones generales conocidas en la materia. Por ejemplo, cuando se usa una secuencia diana que comprende un gran numero de repeticiones de GC y AT para disenar un cebador, debe tenerse cuidado para minimizar las interacciones potenciales de dfmeros para evitar la autohibridacion de los cebadores. Los cebadores que pueden formar cuatro o mas uniones consecutivas consigo mismos, u ocho o mas uniones intercatenarias con otros cebadores se deben evitar de manera general. Los cebadores que pueden formar dfmeros 3' debenan evitarse especialmente, porque la hibridacion en los extremos 3' del cebador, incluso de manera transitoria, conduciran a la extension del cebador debido a la accion de la polimerasa y a arruinar al cebador. Determinados programas informaticos (por ejemplo, Oligo™, National Biosciences, Inc., Plymouth, Minn) se pueden usar en el diseno de los cebadores para evitar problemas. Las combinaciones de cebadores tambien se exploran con respecto a las condiciones optimas.
Tal como se sabe en la materia, el alineamiento o hibridacion de secuencias de acido nucleico complementarias y parcialmente complementarias tambien se puede obtener mediante el ajuste de las condiciones de la reaccion para aumentar o disminuir la rigurosidad (por ejemplo, el ajuste de la temperatura o el contenido en sales del tampon). La presente divulgacion abarca tales modificaciones de las secuencias desveladas y cualquier ajuste necesario de las condiciones. La informacion referida a las condiciones del tampon se puede encontrar en Experimental Design in Biotechnology, por Dr. Perry Haaland (Marcell Dekker, NY, 1989).
En una reaccion de amplificacion diplex, se disena un cebador de amplificacion que es capaz de hibridar tanto con una secuencia diana de Neisseria gonorrhoeae como con una secuencia de un IAC y amplificar la secuencia con la que esta hibridado. Esto se logra usando una secuencia de acido nucleico compartida entre la secuencia diana de Neisseria gonorrhoea y la secuencia de un IAC para disenar un cebador de amplificacion. Otras secuencias, como las requeridas para la realizacion de una reaccion de amplificacion seleccionada, se pueden anadir opcionalmente a un cebador de amplificacion tal como se desvela en el presente documento.
A modo de ejemplo, pero sin limitacion, los cebadores de amplificacion para su uso en un ensayo SDA generalmente comprenden una secuencia 3' de union a molde, un sitio 5' de reconocimiento de endonucleasa de restriccion que se puede cortar en la secuencia de union a molde, y una secuencia de cola de aproximadamente 10-25 nucleotidos de longitud 5' hasta el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restriccion. Tal cebador de amplificacion puede contener un sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restriccion SsoBI, que se corta durante la reaccion SDA. Sera evidente para un experto en la materia que otros sitios de reconocimiento de endonucleasas de restriccion que se
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pueden cortar se pueden sustituir por el sitio de reconocimiento SsoBI. El cebador de amplificacion tambien puede contener una secuencia de cola (desde 5' hasta el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restriccion). La secuencia de cola no debe contener el sitio de restriccion usado para la SDA ni las secuencias que se hibridaran bien con su propia secuencia de union a diana o con los otros cebadores (por ejemplo, cebadores amortiguadores).
En algunas realizaciones, se usa un par de cebadores de amplificacion, cada uno de los cuales se hibrida con una de las dos cadenas de una secuencia diana bicatenaria o una secuencia IAC. En este caso, la amplificacion es exponencial porque tanto la hebra codificante como la no codificante sirven como moldes para el cebador opuesto en posteriores rondas de amplificacion. Cuando se usa un unico cebador de amplificacion, la amplificacion es lineal porque solo una hebra sirve como molde para la extension del cebador.
En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente divulgacion abarcan un cebador de amplificacion que comprende una secuencia de nucleotidos que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 1, 2, 10, 11, 12, 13 o sus respectivas secuencias de union a diana. En otras realizaciones, los procedimientos de la presente divulgacion abarcan al menos dos cebadores de amplificacion, en los que un primer cebador de amplificacion comprende una secuencia de nucleotidos que consiste esencialmente en la SEQ iD NO: 1, 10, 11 o sus respectivas secuencias de union a diana; y un segundo cebador de amplificacion comprende una secuencia de nucleotidos que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 2, 12, 13 o sus respectivas secuencias de union a diana.
En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente divulgacion abarcan uno o mas cebadores amortiguadores. Un cebador amortiguador es un cebador usado para desplazar un cebador de amplificacion y su producto de extension en una reaccion de amplificacion. Un cebador amortiguador se hibrida con una secuencia diana cadena arriba de un cebador de amplificacion, de manera que la extension del cebador amortiguador desplaza el cebador de amplificacion cadena abajo y su producto de extension. Un cebador amortiguador tambien puede funcionar como un cebador de amplificacion. En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente divulgacion abarcan uno o mas cebadores amortiguadores. En determinadas realizaciones, el cebador amortiguador comprende un oligonucleotido que tiene la secuencia que comprende la SEQ ID NO: 3, 4, 14, 15, 16 o 17. En una realizacion, un cebador amortiguador comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia parcial o completa de la SEQ ID NO: 3, 4, 14, 15, 16 o 17. En otra realizacion, los procedimientos de la presente divulgacion abarcan al menos dos cebadores amortiguadores, en los que un primer cebador comprende una secuencia de nucleotidos que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 3, 14 o 15, y un segundo cebador comprende una secuencia de nucleotidos que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 4, 16 o 17.
Secuencias diana
Con "diana" o "secuencia diana" se refiere a una secuencia de acido nucleico de Neisseria gonorrhoeae a amplificar y/o detectar. Una diana o secuencia diana incluye la secuencia de acido nucleico de Neisseria gonorrhoea a amplificar y cualquier segunda hebra complementaria. En algunas realizaciones, la secuencia diana puede ser monocatenaria o bicatenaria, en cuyo caso, bien una o ambas hebras se pueden unir a un cebador de amplificacion. Una diana o secuencia diana tambien puede comprender una secuencia de nucleotidos que se reconoce mediante un oligonucleotido adaptador (es decir, una secuencia que se une al adaptador).
Los cebadores de la presente divulgacion estan disenados para hibridarse con una region de ADN genomico de Neisseria gonorrhoea (vease la Patente de Estados Unidos n.° 5.962.273).
Control de amplificacion interno
Con "control de amplificacion interno", "IAC" o "secuencia IAC" se refiere a una secuencia de acido nucleico que comprende una secuencia que hibrida con un cebador de amplificacion y una secuencia que se puede detectar de forma separada de la secuencia diana. Se puede emplear cualquier procedimiento de deteccion conocido en la materia.
De acuerdo con la presente invencion, una secuencia de IAC se disena para compartir secuencias de acido nucleico con una secuencia diana de Neisseria gonorrhoea, por tanto, el(los) mismo(s) cebador(es) de amplificacion puede amplificar tanto una secuencia IAC como una secuencia diana si esta presente en una muestra. Tambien se disena una secuencia IAC para tener algunas secuencias de acido nucleico que difieren de la secuencia diana de Neisseria gonorrhoea, de manera que la deteccion de la secuencia IAC y la secuencia diana puede diferenciarse. Ya que una secuencia IAC se amplifica y/o detecta en la misma mezcla de reaccion que la secuencia diana, los ensayos diplex tienen la ventaja de detectar el error humano o una condicion inhibidora de la reaccion, por ejemplo, la presencia de un inhibidor o la ausencia de un reactivo cntico. La presencia de un IAC en la misma reaccion que la muestra a ensayar elimina la necesidad de separar las reacciones de control de amplificacion tal como se requiere en los ensayos actuales SDA monoplex.
Aunque sin pretender ligarse a un mecanismo particular de accion, la presencia de un IAC en la misma reaccion que la secuencia diana permite al ensayo de la presente invencion detectar la presencia de inhibidores de la reaccion y/o condiciones que pueden indicar un resultado falso negativo. Tal como se usa en el presente documento, un resultado falso negativo se refiere a un resultado que indica no deteccion de una secuencia diana, sin embargo, tal indicacion no se debe a la ausencia de la secuencia diana en la muestra, sino que se debe a un error humano o a una condicion de
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la reaccion, por ejemplo, la ausencia de un elemento cntico en la reaccion, o la existencia de un inhibidor en la reaccion, o un error al realizar el ensayo.
Se usa un procedimiento de deteccion en el que tal procedimiento diferencia los productos de amplificacion de una secuencia diana de los productos de amplificacion de una secuencia IAC. En una realizacion, los productos de amplificacion de la secuencia diana y el IAC se pueden detectar mediante diferentes sondas de deteccion marcadas con colorante. En otra realizacion, se usa fluorescema para detectar los productos de amplificacion de la secuencia diana y se usa fluorescencia de rodamina para detectar productos del IAC.
En algunas realizaciones, se disena una secuencia IAC de manera que sus extremos 3' o 5' contienen una secuencia en comun con una secuencia de ADN de Neisseria gonorrhoea. En algunas otras realizaciones, se disena un IAC de manera que tanto el extremo 3' como el 5' contengan secuencias en comun con una secuencia de ADN de Neisseria gonorrhoeae para que se una un cebador de amplificacion.
Tambien se disena una secuencia del IAC para comprender una secuencia de acido nucleico que es diferente de la secuencia diana de Neisseria gonorrhoeae a amplificar, de manera que la deteccion de los productos de la amplificacion del IAC y de la secuencia diana pueda diferenciarse.
En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente invencion utilizan un IAC que comprende una secuencia de nucleotidos que consiste en la SEQ ID NO: 9 o 19.
Deteccion de los acidos nucleicos
Los productos de amplificacion generados usando uno o mas cebadores de la divulgacion se pueden detectar mediante cualquier procedimiento conocido en la materia. Tal como se usa en el presente documento, los productos de la amplificacion incluyen tanto las secuencias diana amplificadas como las secuencias IAC amplificadas. Los productos de amplificacion se pueden detectar mediante la hibridacion a una sonda marcada usando tecnicas convencionales, por ejemplo, una que hibrida los acidos nucleicos amplificados a una secuencia que esta entre los cebadores de amplificacion. Como alternativa, los productos de amplificacion se pueden detectar por su tamano caractenstico, por ejemplo, mediante electroforesis seguida de una tincion de bromuro de etidio para visualizar los acidos nucleicos. En una alternativa adicional, se usa un cebador de amplificacion marcado. En un aspecto adicional mas, se extiende un cebador de amplificacion / sonda interna marcada en la secuencia diana, tal como se describe en Walker y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:392 (1992); o Walker y col., Nucl. Acids Res. 20:1691 (1992). En otra realizacion, la deteccion se acompana directamente de una hibridacion y extension de una sonda indicadora marcada tal como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 5.928.869 y la Patente de Estados Unidos n.° 5.958.700. Los procedimientos de deteccion tambien incluyen un procedimiento quimioluminiscente en el que los productos amplificados se detectan usando una sonda de captura biotinilada y una sonda detectora conjugada con enzimas, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 5.470.723. Tras la hibridacion de estas dos sondas en diferentes sitios entre los dos sitios de union de cebador de amplificacion, el complejo se captura en una placa de microtitulacion recubierta de estreptavidina, y la senal quimioluminiscente se desarrolla y se lee en un luminometro.
En una realizacion de la presente invencion, el procedimiento de deteccion puede detectar los productos de amplificacion tanto de la diana como del IAC, y diferenciar entre los productos de amplificacion detectados. Se puede usar cualquier procedimiento conocido en la materia capaz de lograr este proposito. Por ejemplo, los procedimientos de deteccion que se desvelan en Walker y col., Nucl. Acids Res., (1992) 20:1691-1696, en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.648.211, 5.962.273, 5.814.490, 5.928.869, 6.316.200, y en la Patente Europea EP 0 678 582 se puede usar de acuerdo con la presente invencion. En otra realizacion, se usan las sondas universales y los procedimientos de deteccion de acidos nucleicos (vease la Patente de Estados Unidos n.° 6.379.888).
En una realizacion, el procedimiento de deteccion universal emplea un oligonucleotido adaptador y una sonda de deteccion para la deteccion de una secuencia diana (una secuencia diana, una secuencia IAC o productos de extension de las mismas). El oligonucleotido adaptador comprende una secuencia 3' de union a diana y una secuencia 5'. El complemento de la secuencia 5', producido por amplificacion, hibridara y se extendera fuera de la sonda de deteccion. Tal hibridacion se puede detectar entonces como una indicacion del exito de la reaccion de amplificacion.
Se pueden usar al menos dos oligonucleotidos adaptadores diferentes para detectar de manera simultanea diferentes secuencia diana (por ejemplo, productos de amplificacion de una secuencia diana y productos de amplificacion de una secuencia IAC). En este caso, la secuencia 5' adaptadora del oligonucleotido adaptador es diferente para cada molde a detectar. Mediante sondas de deteccion marcadas que indican la presencia de la secuencia diana e IAC con diferentes marcadores fluorescentes (por ejemplo., diferentes pares de colorantes donador/desactivador), se puede determinar la presencia de cada uno detectando cambios en el grado de desactivacion de la fluorescencia en cada sonda de deteccion.
En algunas realizaciones, los nucleotidos adaptadores y las sondas de deteccion se usan para la deteccion de los productos de amplificacion de una secuencia IAC y una secuencia diana. La porcion de la secuencia IAC que se puede reconocer mediante un oligonucleotido adaptador se disena para ser diferente de la porcion de la secuencia diana que se puede reconocer mediante un oligonucleotido adaptador, es decir, el oligonucleotido adaptador que reconoce la secuencia IAC y el oligonucleotido adaptador que reconoce la secuencia diana tienen, entre otras cosas, diferentes
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secuencias de union a molde. La especificidad de los oligonucleotidos adaptadores (con respecto a la secuencia IAC y la secuencia diana) conduce finalmente a la deteccion de diferentes productos de amplificacion (de una secuencia de IAC o de una secuencia diana) mediante diferentes sondas de deteccion.
En una realizacion, se pueden emplear, si se desea, multiples oligonucleotidos adaptadores por hebra de molde, cada hibridacion con la secuencia diana cadena abajo de la otra en la misma hebra, con todos los oligonucleotidos adaptadores hibridados cadena abajo del cebador de amplificacion. De este modo, cada oligonucleotido adaptador se desplaza mediante la extension del oligonucleotido adaptador cadena arriba y el oligonucleotido adaptador que esta mas en 5' se desplaza mediante el cebador de amplificacion. El uso de multiples oligonucleotidos adaptadores tiene la ventaja de aumentar o amplificar la senal generada por secuencia diana, con un aumento de la sensibilidad del ensayo.
Muchos pares de colorantes donador/desactivador conocidos en la materia son utiles en la presente invencion. Estos incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, isotiocianato de fluorescema (FITC)/isotiocianato de tetrametilrodamina (TRlTc), FITC/Texas Red.TM. (Molecular Probes), FITC/1-pirenobutirato de N-hidroxisuccinimidilo (PYB), FITC/isotiocianato de eosina (EITC), 1-pirenosulfonato de N-hidroxisuccinimidilo marcado (PYS)/FITC, FITC/Rodamina X, FITC/tetrametilrodamina (TAM- RA), y otros. La seleccion de un par de coloracion donador/desactivador no es cntica. Para los mecanismos de desactivacion por transferencia de energfa solo es necesario que las longitudes de onda de emision del fluoroforo donador se superpongan a las longitudes de onda de excitacion del desactivador, es decir, debe haber suficiente solapamiento entre los dos tintes para permitir suficiente transferencia de energfa, cambio de carga o desactivacion de la fluorescencia. El acido P-(dimetil aminofenilazo) benzoico (DABCYL) es un colorante desactivador no fluorescente que desactiva de forma eficaz la fluorescencia de un fluoroforo adyacente, por ejemplo, fluorescema o 5-(2'-aminoetil) aminonaftaleno (EDANS). Cualquier par de colorantes que produzca la desactivacion de la fluorescencia en la sonda de deteccion de la invencion se puede usar en los procedimientos de la invencion, independientemente del mecanismo mediante el que tenga lugar la desactivacion. Los procedimientos de marcado terminal e interno tambien se conocen en la materia y pueden usarse de manera rutinaria para unir el donador y el desactivador en sus respectivos sitios en la sonda de deteccion.
En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente divulgacion utilizan un oligonucleotido adaptador que comprende una secuencia de oligonucleotidos que consiste esencialmente SEQ ID NO: 5, 6, 18, 20 o 21.
La presente divulgacion proporciona sondas de deteccion que son oligonucleotidos monocatenarios que comprenden la SEQ ID NO: 7, 8, 22 o 23, y un marcador. En determinadas realizaciones, el marcador comprende al menos un par donador/desactivador fluorescente unido al oligonucleotido, en el que el resto fluorescente es rodamina, fluorescema o dabcil.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona una SDA termofflica (tSDA) fluorescente en tiempo real homogenea diplex. Una SDA termofflica fluorescente en tiempo real y homogenea es una tSDA modificada que detecta secuencias diana de acido nucleico mediante mecanismos de desactivacion de fluorescencia (vease(vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 6.379.888). Por ejemplo, en una realizacion, una sonda de deteccion puede comprender un par donador/aceptor fluorescente, de manera que la desactivacion de la fluorescencia tiene lugar en ausencia de la secuencia diana. Aunque sin pretender ligarse a un mecanismo particular de accion, en ausencia de hibridacion de la sonda de deteccion con un segundo oligonucleotido (que se produce mediante amplificacion de una secuencia diana), la sonda adopta una conformacion que lleva al donador y al desactivador a una cercana proximidad espacial y da como resultado la desactivacion de la fluorescencia del donador. La sonda puede plegarse en una estructura secundaria ordenada (por ejemplo, un cuadruplex G, una horquilla o una triple helice), en un bucle aleatorio, o en cualquier otra conformacion que lleva al donador y al desactivador lo suficientemente cerca como para producir la desactivacion de la fluorescencia. Sin embargo, cuando la sonda de deteccion hibrida con un segundo oligonucleotido, la estructura secundaria emparejada de forma intramolecular de la sonda de deteccion se despliega o linealiza, lo que aumenta la distancia entre el donador y el desactivador y, por tanto, reduce o elimina la desactivacion de la fluorescencia. Como alternativa, la sonda de deteccion puede disenarse como una sonda de deteccion lineal(es decir, que no se pliega en una estructura secundaria), en la que la distancia entre el donador y el desactivador es lo suficientemente corta como para producir desactivacion de la fluorescencia. En este caso (y opcionalmente en casos en los que se use la sonda de deteccion no lineal descrita en el presente documento), la sonda de deteccion tambien contiene un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restriccion (RERS) entre el par fluorescente donador/desactivador. El emparejamiento intermolecular entre la sonda de deteccion y un segundo oligonucleotido da lugar al RERS bicatenario y por tanto se puede escindir o cortar mediante una endonucleasa de restriccion. Aunque no se pretenda unir mediante un mecanismo particular de accion, la escision o el corte mediante la endonucleasa de restriccion separa el donador y el aceptor en fragmentos de acido nucleico separados, lo que lleva a una disminucion de la desactivacion.
Un cambio asociado en un parametro de fluorescencia (por ejemplo, un aumento en la intensidad de fluorescencia del donador, una disminucion en la intensidad de la fluorescencia del aceptor o una proporcion de las intensidades de las fluorescencias del donador y el aceptor) se puede controlar de acuerdo con los procedimientos de la invencion para detectar y/o controlar la presencia de la secuencia diana. Generalmente se prefiere el control de un cambio en la fluorescencia del donador, ya que este cambio es ffpicamente mayor que el cambio en la intensidad de la fluorescencia del aceptor. Tambien se pueden controlar otros parametros de fluorescencia tales como un cambio en el tiempo de
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vida de la fluorescencia, de acuerdo con la invencion.
Kits
La presente divulgacion tambien proporciona kits para la amplificacion y/o deteccion de acidos nucleicos de Neisseria gonorrhoeae que comprenden uno o mas cebadores de amplificacion que consisten esencialmente en las SEQ ID NO: 1,2, 10, 11, 12, 13 o sus respectivas secuencias de union a diana y al menos un envase que contiene tales cebadores. El kit puede incluir de manera opcional uno cualquiera o mas de: un IAC, oligonucleotidos adaptadores, o sondas de deteccion. El kit puede incluir adicionalmente otros componentes y reactivos para realizar una hibridacion o una reaccion de amplificacion, tal como una hibridacion de Southern, una hibridacion por transferencia puntual, una PCR, o una SDA. Para la deteccion mediante hibridacion, se puede incluir una solucion apropiada para realizar la hibridacion, por ejemplo, NaCl 0,3 M, citrato de sodio 0,03 M, SDS al 0,1 %. Se pueden incluir en el kit componentes para los procedimientos de deteccion, por ejemplo, una segunda sonda, un radiomarcador, un sustrato enzimatico, un anticuerpo, y similares. Tambien se pueden incluir reactivos apropiados para su uso en un procedimiento de amplificacion de acido nucleico. Los componentes del kit se envasan juntos en un envase comun, incluyendo tipicamente las instrucciones para llevar a cabo realizaciones espedficas seleccionadas de los procedimientos desvelados en el presente documento.
Ejemplos
Ejemplo 1: Diseno de conjuntos de cebadores SDA
Se ha secuenciado y caracterizado para su direccionamiento mediante ensayos de amplificacion una porcion del genoma de Neisseria gonorrhoeae (vease la Patente de Estados Unidos n.° 5.962.273). Para el fin de este ensayo, se selecciono para el direccionamiento una porcion del genoma de Neisseria gonorrhoeae que no habfa sido direccionado previamente para ensayos de amplificacion. Esta subregion del genoma de Neisseria gonorrhoeae se analizo en las bases de datos actuales GenBank y SeqWeb para la especificidad de Neisseria gonorrhoeae.
Los cebadores de amplificacion se disenaron para amplificar tanto las secuencias diana de Neisseria gonorrhoeae como un IAC. Se disenaron multiples versiones de los cebadores, tal como se muestra en la tabla 2 y 3. Las posiciones de las regiones del genoma de Neisseria gonorrhoeae con las que se hibridan los oligonucleotidos seleccionados (cebadores de amplificacion, cebadores amortiguadores y oligonucleotidos adaptadores) se ilustran en la figura 1.
Claims (5)
- 510152025REIVINDICACIONES1. Un procedimiento de deteccion de una secuencia diana de Neisseria gonorrhoeae que comprende:(a) en una muestra, amplificar la secuencia diana usando un primer cebador de amplificacion que tiene una secuencia que comprende la secuencia de union a diana de al menos una de las SEQ ID NO: 1 o 2, en la que la secuencia de union a diana para la SEQ ID NO:1 es AATCAAAAGCGAATGCG y la secuencia de union a diana de la SEQ ID NO:2 es CTTCTTCATCTTTTGC, en presencia de cebadores amortiguadores que consisten en las SEQ ID NO:3 y 4; y(b) detectar la secuencia diana amplificada.
- 2. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que la secuencia diana se amplifica usando un primer y un segundo cebador de amplificacion, teniendo el primer cebador de amplificacion una secuencia que comprende la secuencia de union a diana de la SEQ ID NO:1, en la que la secuencia de union a diana para la SEQ ID NO:1 es AATCAAAAGCGAATGCG, y comprendiendo el segundo cebador de amplificacion la secuencia de union a diana de la SEQ ID NO:2, en la que la secuencia de union a diana de la SEQ ID NO:2 es CTTCTTCATCTTTTGC.
- 3. El procedimiento de la reivindicacion 2 en el que:(a) el primer cebador de amplificacion comprende la secuencia de union a diana de la SEQ ID NO:1, y(b) el segundo cebador de amplificacion comprende la secuencia de union a diana de la SEQ ID NO:2.
- 4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicha reaccion de amplificacion se selecciona del grupo que consiste en la deteccion directa, la reaccion de amplificacion por desplazamiento de hebra (SDA), la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la hibridacion in situ, la amplificacion mediada por transcripcion (TMA), la replicacion de secuencia autosostenida (SSR), la amplificacion por drculo rodante o la amplificacion basada en secuencia de acido nucleico (NASBA).
- 5. Un procedimiento de deteccion de una secuencia diana de Neisseria gonorrhoeae que comprende:(a) hibridar uno o mas cebadores de amplificacion que tienen una secuencia que comprende la secuencia de union a diana de las SEQ ID NO: 1 o 2, en la que la secuencia de union a diana para la SEQ ID NO:1 es AATCAAAAGCGAATGCG y la secuencia de union a diana para la SEQ ID NO:2 es CTTCTTCATCTTTTGC, en presencia de un control de amplificacion interno que consiste en las SEQ ID NO:9 o 19 y cebadores amortiguadores que consisten en las SEQ ID NO:3 y 4, y amplificar dicho control de amplificacion interno; y(b) detectar al menos uno de dichos cebador de amplificacion hibridado y control de amplificacion interno.
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