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ES2620748T3 - Nuevos agonistas del receptor de tipo toll 3 y procedimientos de su utilización - Google Patents

Nuevos agonistas del receptor de tipo toll 3 y procedimientos de su utilización Download PDF

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ES2620748T3
ES2620748T3 ES11820310.8T ES11820310T ES2620748T3 ES 2620748 T3 ES2620748 T3 ES 2620748T3 ES 11820310 T ES11820310 T ES 11820310T ES 2620748 T3 ES2620748 T3 ES 2620748T3
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ES
Spain
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tlr3
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oligoribonucleotide
domains
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ES11820310.8T
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English (en)
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Ekambar Kandimalla
Tao Lan
Victoria Jane Philbin
Sudhir Agrawal
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Aceragen Inc
Original Assignee
Idera Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Agonista de TLR3 sintético que comprende i) un primer oligorribonucleótido que presenta la estructura: 5'-Dominio A-Dominio B-3'; y ii) un segundo oligorribonucleótido que presenta la estructura: 5'-Dominio C-Dominio D-3', en el que el Dominio A es un primer dominio complementario, el Dominio B es un dominio de polirriboinosina, el Dominio C es un segundo dominio complementario y el Dominio D es un dominio de polirribocitidina, en el que el Dominio A y el Dominio C son complementarios entre sí, y en el que el primer oligorribonucleótido y el segundo oligorribonucleótido se unen entre sí mediante enlace de hidrógeno intermolecular entre (i) los dominios complementarios dejando un dominio de polirriboinosina libre y un dominio de polirribocitidina libre o (ii) entre los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina dejando un primer dominio complementario libre y un segundo dominio complementario libre, y en el que los primer y/o segundo oligorribonucleótidos adicionales pueden unirse a los dominios complementarios y/o de polirriboinosina o polirribocitidina libres, creando así una cadena de oligorribonucleótidos, en el que el dominio de polirriboinosina comprende opcionalmente uno o más sitios de unión de fuerza, en el que una o más guanosinas son sustituidas por inosina en el dominio de polirriboinosina.

Description

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DESCRIPCION
Nuevos agonistas del receptor de tipo toll 3 y procedimientos de su utilizacion. Antecedentes de la invencion Solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica los derechos de la solicitud provisional US n° de serie 61/358.543, presentada el 25 de junio de 2010; la solicitud provisional US n° de serie 61/419.488, presentada el 3 de diciembre de 2010; y la solicitud provisional US n° de serie 61/435.434, presentada el 24 de enero de 2011.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a la modulacion del sistema inmunitario. En particular, la invencion se refiere a compuestos basados en oligonucleotidos que estimulan selectivamente una respuesta inmunitaria mediante la union y la activacion del receptor de tipo Toll 3 (TLR3), y su utilizacion, sola o en combinacion con otros agentes, para tratar o prevenir enfermedades en las que la modulacion de la actividad de TLR3 serfa beneficiosa.
Sumario de la tecnica relacionada
Los receptores de tipo toll (TLR) estan presentes en muchas celulas del sistema inmunitario y se ha demostrado que participan en la respuesta inmunitaria innata (Hornung, V. et al., (2002) J. Immunol. 168:4531-4537). Los TLR son un medio clave por el que los mamfferos reconocen y generan una respuesta inmunitaria a las moleculas extranas y proporcionan tambien un medio por el cual se vinculan las respuestas inmunitarias innata y adaptativa (Akira, S. et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145). En los vertebrados, esta familia esta compuesta por lo menos por 11 protefnas denominadas TLR1 a TLR11, que es conocido que reconocen los patrones moleculares asociados a patogenos (PAMP) de bacterias, hongos, parasitos y virus, e inducen una respuesta inmunitaria mediada por una serie de factores de transcripcion.
Algunos TLR estan ubicados en la superficie celular para detectar e iniciar una respuesta a patogenos extracelulares y otros TLR estan ubicados dentro de la celula para detectar e iniciar una respuesta a patogenos intracelulares. La tabla 1 proporciona una representacion de los tLr, los agonistas por lo tanto conocidos y los tipos de celulas que es conocido que contienen el TLR (Diebold, S.S. et al. (2004) Science 303:1529-1531; Liew, F. et al. (2005) Nature 5:446-458; Hemmi H et al. (2002) Nat Immunol 3:196-200; Jurk M et al., (2002) Nat Immunol 3:499; Lee J et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6646-6651); (Alexopoulou, L. (2001) Nature 413:732-738).
Tabla 1:
Molecula de TLR
Agonista Tipos de celulas que contienen el receptor
TLR de la superficie celular:
TLR2
Lipopeptidos bacterianos • Monocitos/macrofagos • Celulas dendrfticas mieloides • Mastocitos
TLR4
Bacterias gramnegativas • Monocitos/macrofagos • Celulas dendrfticas mieloides • Mastocitos • Epitelio intestinal
TLR5
Bacterias moviles • Monocitos/macrofagos • Celulas dendrfticas • Epitelio intestinal
TLR6
Bacterias grampositivas • Monocitos/macrofagos • Mastocitos • Linfocitos B
TLR endosomal:
TLR3
Virus de ARN bicatenarios • Celulas dendrfticas • Linfocitos B
TLR7
Virus ARN monocatenarios; complejos ARN-inmunoglobulina • Monocitos/macrofagos • Celulas dendrfticas plasmocitoides • Linfocitos B
TLR8
Virus ARN monocatenarios; complejos ARN-inmunoglobulina • Monocitos/macrofagos • Celulas dendrfticas • Mastocitos
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Molecula de TLR
Agonista Tipos de celulas que contienen el receptor
TLR9
ADN que contiene motivos de "CpG" no metilados; complejos ADN- inmunoglobulina • Monocitos/macrofagos • Celulas dendrfticas plasmocitoides • Linfocitos B
La via de transduccion de senal mediada por la interaccion entre un ligando y un TLR es compartida por la mayorfa de los miembros de la familia de TLR, e implica un receptor toll/IL-1 (dominio TIR), el marcador de diferenciacion mieloide 88 (MyD88), la cinasa asociada a IL-1R (IRAK), el factor de regulacion del interferon (IRF), el factor asociado al receptor de TNF (TRAF), la cinasa1 activada por TGFp, las cinasas IkB, IkB y NF-kB (ver por ejemplo: Akira, S. (2003) J. Biol. Chem. 278:38105 y Geller et al. (2008) Curr. Drug Dev. Tech. 5:29-38). Mas especfficamente, para los TLR 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 11, esta cascada de senalizacion comienza con un ligando de PAMP que interactua y activa el TLR unido a la membrana, que existe como homodfmero en la membrana endosomal o en la superficie celular. Despues de la activacion, el receptor experimenta un cambio conformacional para permitir el reclutamiento del dominio TIR que contiene la protefna MyD88, que es una protefna adaptadora comun a todas las vfas de senalizacion de TLR, excepto TLR3. MyD88 recluta IRAK4, que fosforila y activa IRAK1. La IRAK1 activada se une a TRAF6, que cataliza la adicion de poliubiquitina a TRAF6. La adicion de ubiquitina activa el complejo TAK/TAB, que a su vez fosforila los IRF, dando como resultado la liberacion de NF-kB y el transporte al nucleo. NF-kB en el nucleo induce la expresion de genes proinflamatorios (vease, por ejemplo, Trinchieri y Sher (2007) Nat. Rev. Immunol. 7:179-190).
La senalizacion de TLR3 se produce a traves de una via de MyD88 independiente que comienza con el ligando TLR3 interactuando con TLR3, que existe como un homodfmero, y activandolo. Despues de la activacion, el TLR3 sufre un cambio conformacional que permite el reclutamiento del adaptador que contiene el dominio TIR inductor de interferon-p (TRIF), que activa la cinasa 1 que se une a TANK (TBK1). TBK1 fosforila y activa IRF-3, resultando en la activacion de interferones ay p y, en ultima instancia, generando una respuesta inmunitaria inflamatoria (vease por ejemplo: Miggin y O'Neill (2006) J. Leukoc. Biol. 80:220-226).
Como resultado de su participacion en la regulacion de una respuesta inflamatoria, los TLR han demostrado ejercer una funcion en la patogenesis de muchas enfermedades, incluyendo enfermedades autoinmunitarias, infecciosas e inflamacion (Papadimitraki et al. (2007) J. Autoimmun. 29: 310-318; Sun et al. (2007) Inflam. Allergy Drug Targets 6:223-235; Diebold (2008) Adv. Drug Deliv. Rev. 60:813-823; Cook, D.N. et al. (2004) Nature Immunol. 5:975-979; Tse y Horner (2008) Semin. Immunopathol. 30:53-62; Tobias & Curtiss (2008) Semin. Immunopathol. 30:23-27; Ropert et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:41-51; Lee et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:3-9; Gao et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:29-40; Vijay-Kumar et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:11-21).
La localizacion selectiva de los TLR y la senalizacion generada a partir de ellos, da una idea de la funcion que desempenan en la respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria implica tanto una respuesta innata como una respuesta adaptativa en funcion del subconjunto de celulas implicadas en la respuesta. Por ejemplo, los linfocitos T auxiliares (Th) implicados en las tfpicas funciones mediadas por celulas, como la hipersensibilidad de tipo retardado y la activacion de linfocitos T citotoxicos (LTC) son celulas Th1. Esta es la respuesta innata del organismo al antfgeno (por ejemplo, infecciones vfricas, patogenos intracelulares y celulas tumorales), y produce una secrecion de IFN gamma y una activacion concomitante de los LTC.
Es conocido que el TLR3 se localiza en endosomas dentro de la celula y que reconoce acidos nucleicos (ADN y ARN) y moleculas pequenas, como nucleosidos y metabolitos de acidos nucleicos. Se ha demostrado que el TLR3 reconoce y responde a los virus de ARN bicatenario (ARNbc) (Diebold, S.S., et al., (2004) Science 303:1529-1531). Ademas, se ha demostrado que las moleculas de ARN de interferencia pequeno (ARNip) y las moleculas de ARNbc no dirigidas pueden activar de forma no especffica el TLR3 (Alexopoulou et al. (2008) Nature 413:732-738). Sin embargo, se determino que esta activacion no especffica del TLR3 dependfa de una via MyD88, lo que indica que estas moleculas de ARNbc pueden generar respuestas inmunitarias que no son especfficas del TLR3.
Ademas de los ligandos naturales y sinteticos de ARNbc para el TLR3, se ha demostrado que otros analogos de oligonucleotidos sinteticos activan el TLR3. El complejo acido poli-inosfnico-policitidflico (poli(I:C)), una molecula de ARN bicatenario sintetica disenada para imitar el ARNbc vfrico, esta compuesto de una cadena larga de poli(I) alineada a una cadena larga de poli(C). Debido a la necesidad de cadenas largas, los compuestos de poli(I:C) se sintetizan rutinariamente mediante procesos enzimaticos. Como resultado de la sfntesis enzimatica, es conocido que el tamano de los compuestos y preparaciones de poli(I:C) varfa entre 0,2 kb y 8 kb. Se ha demostrado que el poli(I:C) induce interferon (Field et al. (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61:340). Tras este descubrimiento, se determino que poli(I:C) induce el interferon mediante la activacion del TLR3 y, en comparacion con las moleculas de ARNbc, el poli(I:C) es reconocido preferentemente por el TLR3 (Alexopoulou et al. (2001) Nature 413:732-738; Okahira et al. (2005) DNA Cell Biol. 24:614-623). Las propiedades inductoras de interferon de poli(I:C), asf como su union preferida al TLR3, hacen deseable el uso de la molecula del poli(I:C) para la induccion de interferon in vivo. Sin embargo, el poli(I:C) presenta lugar en forma de cadenas largas de acidos nucleicos que es conocido que forman estructuras indeseables de helice-bucle (Ichikawa et al. (1967) Bul. Chem. Soc. Japan 40:2272-2277) y que
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presentan propiedades toxicas cuando se administran in vivo (Absher y Stinebring (1969) Nature 223:1023; Lindsay et al. (1969) Nature 223:717; Adamson y Fabro (1969) Nature 223:718; Leonard et al. (1969) Nature 224:1023). Por lo tanto, el uso medico, terapeutico y profilactico del poli(I:C) es limitado.
Se ha intentado modificar la estructura de poli(I:C) para conservar sus propiedades inmunoestimuladoras, a la vez que se reduce su toxicidad (documento WO 2008109083). Estos compuestos insertan emparejamientos incorrectos en la cadena poli(I:C), reemplazando la citosina con uracilo en posiciones definidas a lo largo de la molecula bicatenaria. Los compuestos se denominan poli(I:C12U). Sin embargo, estos compuestos han tenido un exito terapeutico limitado debido a que su eficacia in vivo ha sido cuestionada y han sido rechazados por la U.S.A. Food and Drug Administration. (FDA)
Por lo tanto, serfa deseable disponer de un agonista selectivo del TLR3 que retuviera la actividad inmunoestimuladora y la actividad terapeutica de un oligonucleotido poli(I:C) sin la indeseada sfntesis enzimatica, sin estructuras helice-bucle, y que no careciera de la eficacia de los compuestos poli(I:C), poli-(I:C-i2U) y ARN bicatenario actualmente disponibles.
Breve sumario de la invencion
La presente invencion se refiere a compuestos agonistas del TLR3, las composiciones que comprenden dichos compuestos, y a su utilizacion para estimular una respuesta inmunitaria mediada por el TLR3.
En un primer aspecto, la invencion proporciona un agonista sintetico del TLR3 sintetico que comprende i) un primer oligorribonucleotido con la estructura: 5'-Dominio A-Dominio B-3'; y ii) un segundo oligorribonucleotido con la estructura: 5'-Dominio C-Dominio D-3', en el que el dominio A es un primer dominio complementario, el dominio B es un dominio de polirriboinosina, el dominio C es un segundo dominio complementario y el dominio D es un dominio de polirribocitidina, en el que el dominio A y el dominio C son complementarios entre si, y en el que el primer
oligorribonucleotido y el segundo oligorribonucleotido se unen entre si a traves de enlaces de hidrogeno
intermoleculares entre (i) los dominios complementarios, dejando un dominio de polirriboinosina libre y un dominio de polirribocitidina libre o (ii) entre los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina, dejando un primer dominio complementario libre y un segundo dominio complementario libre, en el que los primer y/o segundo oligorribonucleotidos adicionales pueden unirse a los dominios complementarios y/o de poliorriboinosina o polirribocitfnina libres, creando asf una cadena de oligorribonucleotidos, en el que el dominio de polirriboinosina comprende opcionalmente uno o mas sitios de union de fuerza, en el que una o mas guanosinas son sustituidas por inosina en el dominio de la polirriboinosina.
En el primer aspecto, la invencion proporciona asimismo un agonista sintetico del TLR3 que comprende i) un primer oligorribonucleotido con la estructura: 5'-Dominio B-Dominio A-3'; y ii) un segundo oligorribonucleotido con la estructura: 5'-Dominio D-Dominio C-3', en el que el dominio A es un primer dominio complementario, el dominio B es un dominio de polirriboinosina, el dominio C es un segundo dominio complementario y el dominio D es un dominio de polirribocitidina, en el que el dominio A y el dominio C son complementarios entre si, y en el que el primer
oligorribonucleotido y el segundo oligorribonucleotido se unen entre si a traves de enlaces de hidrogeno
intermoleculares entre (i) los dominios complementarios, dejando un dominio de polirriboinosina libre, y un dominio de polirribocitidina libre o (ii) entre los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina, dejando un primer dominio complementario libre y un segundo dominio complementario libre, y en el que los primer y/o segundo oligorribonucleotidos adicionales pueden unirse a los dominios complementarios y/o de poliorriboinosina o polirribocitidina libres, creando asf una cadena de oligorribonucleotidos, en el que el dominio de polirriboinosina comprende opcionalmente uno o mas sitios de union de fuerza, en el que una o mas guanosinas son sustituidas por inosina en el dominio de la polirriboinosina.
En una forma de realizacion, el dominio de polirriboinosina de un agonista TLR3 sintetico de la invencion comprende uno o mas sitios de union de fuerza. En una forma de realizacion, uno o mas atomos de hidrogeno del primer y/o del segundo oligorribonucleotido de un agonista del TLR3 de la invencion se reemplazan por un atomo de deuterio mediante intercambio de deuterio por hidrogeno. En una forma de realizacion, el primer y el segundo dominio complementario de un agonista del TLR3 de la invencion presentan de 10 a 20 nucleotidos de longitud, y los dominios de polirriboinosina y de polirribocitidina presentan una longitud de 30 a 40 nucleotidos, preferentemente el primer y segundo dominio complementario presentan 15 nucleotidos de longitud y los dominios de polirriboinosina y de polirribocitdina presentan una longitud de 35 nucleotidos.
En un segundo aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende un agonista del TLR3 de acuerdo al primer aspecto de la invencion y una o mas vacunas, antfgenos, anticuerpos, agentes citotoxicos, alergenos, antibioticos, oligonucleotidos antisentido, agonista del TLR, antagonista del TLR, ARNip, miARN, peptidos, protefnas, vectores de terapia genica, vacunas de ADN, adyuvantes, inhibidores de la cinasa, moleculas coestimuladoras.
En un tercer aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende un agonista del TLR3 de acuerdo con el primer aspecto de la invencion, o una composicion de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion y un
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portador fisiologicamente aceptable.
En un cuarto aspecto, la invencion proporciona un agonista del TLR3 de acuerdo con el primer aspecto de la invencion o una composicion de acuerdo al segundo o tercer aspecto de la invencion para su utilizacion en un procedimiento de estimulacion de la actividad del TLR3 que comprende poner en contacto el TLR3 con el agonista del TLR3 o con la composicion.
En un quinto aspecto, la invencion proporciona un agonista del TLR3 de acuerdo con el primer aspecto de la invencion o una composicion de acuerdo con el segundo o tercer aspecto de la invencion para estimular la actividad del TLR3 en un mamffero.
En un sexto aspecto, la invencion proporciona un agonista del TLR3 de acuerdo con el primer aspecto de la invencion o una composicion de acuerdo con el segundo o tercer aspecto de la invencion para estimular la respuesta inmunitaria mediada por TLR3 en un mamffero.
En un septimo aspecto, la invencion proporciona un agonista del TLR3 de acuerdo con el primer aspecto de la invencion o una composicion de acuerdo con el segundo o tercer aspecto de la invencion para tratar a un mamffero con una enfermedad o un trastorno cuyo tratamiento puede ser mediado por el TLR3.
En un octavo aspecto, la invencion proporciona un agonista del TLR3 de acuerdo con el primer aspecto de la invencion o una composicion segun el segundo o el tercer aspecto de la invencion para prevenir una enfermedad o trastorno, prevencion que puede ser mediada por el TLR3, en un mamffero con riesgo de contraer o desarrollar dicha enfermedad o trastorno.
En un noveno aspecto, la invencion proporciona una vacuna que comprende un agonista del TLR3 de acuerdo con el primer aspecto de la invencion, un antfgeno y un portador farmaceuticamente aceptable.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1A es un esquema sintetico de la sfntesis lineal de los agonistas del TLR3 de la invencion. DMTr = 4,4'- dimetoxitritilo; CE = cianoetilo.
La figura 1B es un esquema sintetico de la sfntesis paralela de los agonistas del TLR3 de la invencion. DMTr = 4,4'-dimetoxitritilo; CE = cianoetilo.
Las figuras 2A y 2B y la tabla 6 representan la actividad inmunoestimuladora de los agonistas del TLR3 ejemplificativos, de acuerdo con la invencion, en celulas HEK293 que expresan el TLR3 humano. Brevemente, las celulas HEK293 se trataron con agonistas del TLR3 de la invencion durante 18 horas, y los niveles de NF-kB resultantes se determinaron usando el ensayo SEAP (forma secretada de la fosfatasa alcalina embrionaria humana). Los datos demuestran la capacidad que presentan los agonistas del TLR3 ejemplificativos, de acuerdo con la invencion, para estimular la actividad del TLR3 de una manera dependiente de la dosis en celulas HEK293 cultivadas y tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2. De forma mas general, estos datos demuestran que los agonistas del TLR3 de la invencion pueden activar al TLR3 y generar una respuesta inmunitaria.
La figura 3 y las Tablas 7, 8, 9, 10 y 11 representan la actividad inmunoestimuladora de un agonista del TLR3 ejemplificativo de acuerdo con la invencion en macrofagos J774, que contienen TLR3 de manera natural. Brevemente, las celulas J774 se trataron con un agonista del TLR3 de la invencion durante 18 horas, y los niveles de IL-12 resultantes se determinaron mediante ELISA. Los datos demuestran la capacidad que presentan los agonistas del TLR3 ejemplificativos, de acuerdo con la invencion, para estimular la actividad del TLR3 de una manera dependiente de la dosis en celulas J774 cultivadas y tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2. De forma mas general, estos datos demuestran que los agonistas del TLR3 de la invencion pueden activar al TLR3 y generar una respuesta inmunitaria en celulas inmunitarias.
La figura 4 es una representacion grafica de la actividad inmunoestimuladora de un agonista del TLR3 ejemplificativo, de acuerdo con la invencion, en macrofagos J774, que contienen TLR3 de manera natural. Brevemente, las celulas J774 se trataron con un agonista del TLR3 de la invencion durante 18 horas, y los niveles de IL-6 resultantes se determinaron mediante ELISA. Los datos demuestran la capacidad que presentan los agonistas del TLR3 ejemplificativos, de acuerdo con la invencion, para estimular la actividad del TLR3 de una manera dependiente de la dosis en celulas J774 cultivadas y tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2. De forma mas general, estos datos demuestran que los agonistas del TLR3 de la invencion pueden activar al TLR3 y generar una respuesta inmunitaria en celulas inmunitarias.
La figura 5 es una representacion grafica de la actividad inmunoestimuladora de un agonista del TLR3 ejemplificativo, de acuerdo con la invencion, en macrofagos J774, que contienen TLR3 de manera natural. Brevemente, las celulas J774 se trataron con agonistas seleccionados del TLR3 de la invencion durante 18 horas, y los niveles de IFNp resultantes se determinaron mediante ELISA. Los datos demuestran la capacidad
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que presentan los agonistas del TLR3 ejemplificativos, de acuerdo con la invencion, para estimular la actividad del TLR3 de una manera dependiente de la dosis en celulas J774 cultivadas y tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2. De forma mas general, estos datos demuestran que los agonistas del TLR3 de la invencion pueden activar al TLR3 y generar una respuesta inmunitaria en celulas inmunitarias.
La figura 6 es una representacion grafica de la actividad inmunoestimuladora de un agonista del TLR3 ejemplificativo, de acuerdo con la invencion, en macrofagos J774, que contienen TLR3 de manera natural. Brevemente, las celulas J774 se trataron con agonistas del TLR3 de la invencion durante 18 horas, y los niveles de IL-6 resultantes se determinaron mediante ELISA. Los datos demuestran la capacidad que presentan los
agonistas del TLR3 ejemplificativos, de acuerdo con la invencion, para estimular la actividad del TLR3 de una
manera dependiente de la dosis en celulas J774 cultivadas y tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2. De forma mas general, estos datos demuestran que los agonistas del TLR3 de la invencion pueden activar al TLR3 y generar una respuesta inmunitaria en celulas inmunitarias.
La figura 7 es una representacion grafica de la actividad inmunoestimuladora de un agonista del TLR3 ejemplificativo, de acuerdo con la invencion, en macrofagos J774, que contienen TLR3 de manera natural. Brevemente, las celulas J774 se trataron con agonistas del TLR3 de la invencion durante 18 horas, y los niveles de IFNp resultantes se determinaron mediante ELISA. Los datos demuestran la capacidad que presentan los
agonistas del TLR3 ejemplificativos, de acuerdo con la invencion, para estimular la actividad del TLR3 de una
manera dependiente de la dosis en celulas J774 cultivadas y tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2. De forma mas general, estos datos demuestran que los agonistas del TLR3 de la invencion pueden activar al TLR3 y generar una respuesta inmunitaria en celulas inmunitarias.
La figura 8 y la tabla 14 representan la induccion de citocinas en suero en ratones C57BL/6 (n = 3) 2 horas despues de haber sido tratados y analizados segun el Ejemplo 3. Brevemente, a los ratones C57BL/6 se les inyecto por via subcutanea una dosis de 0 mg/kg o 25 mg/kg de agonistas del TLR3 y, 2 horas despues de la administracion del agonista, se analizaron los niveles de citocina inmunoestimuladora y se presentaron los niveles de IL-12. Los datos demuestran que la administracion in vivo de un agonista del TLR3 de la invencion genera un perfil distinto de citocinas mediado por el TLR in vivo.
La figura 9 es una representacion grafica de la induccion de citocinas en suero en ratones C57BL/6 (n = 3) 2 horas despues de haber sido tratados y analizados segun el Ejemplo 3. Brevemente, a los ratones C57BL/6 se les inyectaron por via subcutanea unas dosis de 0 mg/kg o 25 mg/kg de agonistas del TLR3 y, 2 horas despues de la administracion del agonista, se analizo el suero para determinar los niveles de citocinas y quimiocinas, y de IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IP-10, KC, MCP-1, MIG, MIP-1a, TNFa. Los datos demuestran que la administracion in vivo de un agonista del TLR3 de la invencion genera un perfil distinto de citocinas y quimiocinas mediadas por el TLR in vivo.
La figura 10 es una representacion grafica de la actividad inmunoestimuladora de los agonistas del TLR3 ejemplificativos, de acuerdo con la invencion, en celulas HEK293 que expresan TLR7 humano y que fueron tratadas y analizadas segun el ejemplo 2. Brevemente, las celulas HEK293 se trataron con agonistas del TLR3 de la invencion durante 18 horas, y los niveles de NF-kB resultantes se determinaron usando el ensayo SEAP (forma secretada de la fosfatasa alcalina embrionaria humana). Los datos demuestran la especificidad de los agonistas del TLR3 ejemplificaticos, de acuerdo con la invencion, ya que tales compuestos no estimulan el NF- kB mediado por el tLR7, que es conocido que es un TLR que responde a moleculas de ARN monocatenarias. De forma mas general, estos datos demuestran que los agonistas del TLR3 de la invencion inducen una respuesta inmunitaria especffica del TLR3.
La figura 11 es una representacion grafica de la actividad inmunoestimuladora de los agonistas del TLR3 ejemplificativos, de acuerdo con la invencion, en celulas HEK293 que expresan TLR8 humano y que fueron tratadas y analizadas segun el ejemplo 2. Brevemente, las celulas HEK293 se trataron con agonistas del TLR3 de la invencion durante 18 horas, y los niveles de NF-kB resultantes se determinaron usando el ensayo SEAP (forma secretada de la fosfatasa alcalina embrionaria humana). Los datos demuestran la especificidad de los agonistas del TLR3 ejemplificativos, de acuerdo con la invencion, ya que tales compuestos no estimulan el NF- kB mediado por el tLR8, que se sabe que es un TLR que responde a moleculas de ARN monocatenario. De forma mas general, estos datos demuestran que los agonistas del TLR3 de la invencion inducen una respuesta inmunitaria especffica del TLR3.
Las figuras 12 y 13 representan la induccion de citocinas en suero en ratones C57BL/6 (n = 2) 2 horas despues de haber sido tratados y analizados segun el Ejemplo 5. Brevemente, a los ratones C57BL/6 se les inyectaron por via subcutanea unas dosis de 10 mg/kg de agonistas del TLR3 y, 2 horas despues de la administracion del agonista, se analizo el suero para comprobar los niveles de citocinas inmunoestimuladoras y se presentan los niveles de IL-12. Los datos demuestran que la administracion in vivo de un agonista del TLR3 de la invencion genera un perfil distinto de citocinas mediado por el TLR in vivo.
La tabla 3 y la tabla 12 representan unas concentraciones de citocinas y quimiocinas a partir de PBMC humanas
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que se trataron y analizaron segun el ejemplo 2. Brevemente, se aislaron las PBMC de sangre humana recien extrafda de voluntarios sanos y se cultivaron con 250 pg/ml de agonistas del TLR3 ejemplificativos de la invencion durante 24 horas, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron los niveles de citocinas y quimiocinas mediante un ensayo multiplex con el sistema Luminex. Los datos demuestran que la administracion de un agonista del TLR3 de la invencion genera un perfil distintivo de citocina y quimiocina mediado por el TLR3 en celulas inmunitarias humanas.
La tabla 4 representa unas concentraciones de citocina y quimiocina a partir de celulas dendrfticas plasmacitoides humanas (pDC) que se aislaron, se trataron y se analizaron segun el ejemplo 2. Brevemente, los pDC se aislaron de PBMC de sangre humana recien extrafda de voluntarios sanos y se cultivaron con 250 pg/ml de dosis de agonistas del TLR3 de la invencion durante 24 horas, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron los niveles de citocinas y quimiocinas mediante un ensayo multiplex con el sistema Luminex. Los datos demuestran que la administracion de un agonista del TLR3 de la invencion genera un perfil distintivo de citocina y quimiocina mediado por el TLR3 en celulas inmunitarias humanas.
Las Tablas 5A, 5B, 5C y 5D representan la actividad inmunoestimuladora de los agonistas del TLR3 que no presentan la estructura preferida de los agonistas del TLR3 de la invencion y que se aislaron, trataron y analizaron de acuerdo con el ejemplo 2. Brevemente, las celulas HEK293 se trataron con agonistas del TLR3 que carecfan de la estructura preferida de los agonistas de TLR3 de la invencion durante 18 horas, y los niveles de NF-kB posteriormente producidos se determinaron mediante el ensayo SEAP (forma secretada de fosfatasa alcalina embrionaria humana). Los datos demuestran que los compuestos que carecen de la estructura preferida de los agonistas del TLR3 de la invencion no inducen una respuesta inmunitaria mediada por el TLR3.
La tabla 13 representa unas concentraciones de citocina y quimiocina a partir de celulas dendrfticas mieloides humanas (mDC) que se aislaron, se trataron y se analizaron segun el ejemplo 2. Brevemente, los pDC se aislaron de PBMC de sangre humana recien extrafda de voluntarios sanos y se cultivaron con 300 pg/ml de dosis de agonistas del TLR3 de la invencion durante 18 horas, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron los niveles de citocinas y quimiocinas mediante un ensayo multiplex con el sistema Luminex. Los datos demuestran que la administracion de un agonista del TLR3 de la invencion genera un perfil distintivo de citocina y quimiocina mediado por el TLR3 en celulas inmunitarias humanas.
La tabla 15 representa la induccion de citocinas en suero en ratones C57BL/6 (n = 3) 2 horas despues de haber sido tratados y analizados segun el Ejemplo 4. Brevemente, a los ratones C57BL/6 se les inyecto por via subcutanea una dosis de 0 mg/kg o 10 mg/kg de agonistas del TLR3 y, 2 horas despues de la administracion del agonista, se analizaron los niveles de citocina inmunoestimuladora y se presentaron los niveles de IL-12. Los datos demuestran que la administracion in vivo de un agonista del tLR3 de la invencion genera un perfil distinto de citocinas mediado por el TLR in vivo.
Descripcion detallada de las formas de realizacion preferidas
La invencion se refiere a compuestos agonistas del TLR3, a las composiciones que comprenden dichos compuestos, y a su utilizacion para estimular una respuesta inmunitaria mediada por el TLR3. Los agonistas del TLR3 segun la invencion son estables, especfficos y capaces de activar una respuesta inmunitaria innata, superandose asf los problemas de ciertos enfoques que se han intentado en el pasado para crear agonistas del TLR3. Tambien se proporcionan unas composiciones farmaceuticas y otras composiciones que comprenden compuestos de acuerdo a la invencion. Ademas, se proporcionan unos agonistas del TLR3 o composiciones de acuerdo con la invencion para su utilizacion en procedimientos de estimulacion de una respuesta inmunitaria mediada por el TLR3 en celulas o tejidos que implican el contacto de dichas celulas o tejidos con uno o mas de los compuestos del agonista del TLR3 o de sus composiciones, solos o en combinacion con otros compuestos o composiciones de indole profilactica o terapeutica.
La invencion proporciona unos compuestos del agonista del TLR3 que se han concebido para estimular el TLR3 de forma especffica y potente. Estos agonistas del TLR3 presentan unas estructuras unicas que se unen preferentemente por el TLR3, dando como resultado una estimulacion optima de una respuesta inmunitaria mediada por el TLR3.
Los agonistas del TLR3 de acuerdo con la invencion estimulan una respuesta inmunitaria en diferentes modelos experimentales in vitro e in vivo. Como tales, los agonistas del TLR3 o sus composiciones de acuerdo con la invencion son utiles como herramientas para estudiar el sistema inmunitario, asf como para comparar los sistemas inmunitarios de diferentes especies animales, como seres humanos y ratones.
Ademas, se proporcionan unos agonistas del TLR3 o composiciones de acuerdo con la invencion para su utilizacion en procedimientos de tratamiento de un animal, particularmente un ser humano, del que se sospecha que presenta o que es propenso a desarrollar una enfermedad o afeccion que se beneficiarfa de la estimulacion inmunitaria mediada por el TLR3, mediante la administracion de una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de uno o mas de los compuestos del agonista del TLR3 o de las composiciones de la invencion. Estos se pueden usar para
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aplicaciones de inmunoterapia, como el tratamiento del cancer, asma, alergia, inflamacion de las vfas respiratorias, trastornos inflamatorios, trastornos autoinmunitarios, trastornos de la piel, enfermedades causadas por patogenos y enfermedades infecciosas, asf como adyuvantes de vacunas en aplicaciones pediatricas y para adultos humanas y veterinarias.
Ademas, los oligonucleotidos del agonista del TLR3 de la invencion son utiles para la prevencion y/o el tratamiento de diversas enfermedades, ya sea por si mismos o en combinacion o coadministrados con otros farmacos o composiciones profilacticas o terapeuticas, por ejemplo, vacunas de ADN, antfgenos, anticuerpos , alergenos, antagonista del TLR (como TLR7 y/o TLR8), y/u otros agonistas del TLR; tambien en combinacion con agentes quimioterapeuticos, como los tratamientos tradicionales de quimioterapia y los modernos tratamientos dirigidos a la prevencion y el tratamiento de enfermedades.
Las patentes y publicaciones mencionadas en la presente memoria reflejan el nivel de conocimiento de la tecnica. Cualquier conflicto entre el contenido de estas patentes y las publicaciones y la presente memoria se resolvera en favor de esta ultima.
Los objetos anteriores y otros objetos de la presente invencion, las diversas caracterfsticas de la misma, asf como la propia invencion, se pueden comprender mejor a partir de la siguiente descripcion, a partir de las ilustraciones adjuntas, en las que:
El termino "sustituido en 2'-O" significa la sustitucion de la posicion 2' del resto pentosa con un grupo -O-alquilo inferior que contiene 1-6 atomos de carbono saturados o insaturados (por ejemplo, 2'-O-metilo), o con un grupo -O- arilo o alilo que presenta de 2 a 6 atomos de carbono, en donde dicho grupo alquilo, arilo o alilo puede no estar sustituido o estar sustituido (por ejemplo con grupos 2'-O-etoxi-metilo, halo, hidroxi, trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxilo, carbalcoxilo o amino); o con un grupo hidroxi, amino o halo, pero no con un grupo 2'-H. En algunas formas de realizacion, los oligonucleotidos de la invencion incluyen cuatro o cinco ribonucleotidos 2'-O- alquilados en su extremo 5' (es decir, ribonucleotidos 5' 2-O-alquilados) y/o cuatro o cinco ribonucleotidos 2'-O- alquilados en su extremo 3' (es decir, ribonucleotidos 3' 2-O-alquilados). En las formas de realizacion ejemplificativas, los nucleotidos de los oligonucleotidos sinteticos estan unidos por lo menos por un enlace internucleotido fosforotioato. Los enlaces fosforotioato pueden ser enantiomeros Rp y Sp mezclados, o pueden ser estereorregulares o sustancialmente estereorregulares en la forma Rp o Sp (ver Iyer et al. (1995) Tetrahedron Asymmetry 6:1051-1054).
El termino "3'", cuando se utiliza de manera direccional, generalmente se refiere a una region o posicion de un polinucleotido u oligonucleotido situado en el extremo 3' (hacia el extremo 3' del oligonucleotido) respecto de otra region o posicion del mismo polinucleotido u oligonucleotido.
El termino "5'", cuando se utiliza de manera direccional, generalmente se refiere a una region o posicion de un polinucleotido u oligonucleotido situado en el extremo 5' (hacia el extremo 5' del oligonucleotido) respecto de otra region o posicion del mismo polinucleotido u oligonucleotido.
El termino "aproximadamente" significa generalmente que el numero exacto no es crftico. De esta manera, los oligonucleotidos que presentan uno o dos restos nucleosidos menos, o de uno a varios restos nucleosidos adicionales, se consideran equivalentes de cada una de las formas de realizacion descritas anteriormente,
El termino "agonista" generalmente se refiere a una sustancia que se une a un receptor de una celula e induce una respuesta. Un agonista imita a menudo la accion de una sustancia natural, como un ligando.
El termino "inflamacion de las vfas respiratorias" incluye generalmente de manera no limitativa inflamacion en el tracto respiratorio producida por alergenos, incluyendo asma.
El termino "alergeno" se refiere generalmente a un antfgeno o porcion antigenica de una molecula, usualmente una protefna, que estimula una respuesta alergica tras exposicion a un sujeto. Normalmente el sujeto es alergico al alergeno como se indica, por ejemplo, mediante la prueba de roncha y eritema o cualquier procedimiento conocido en la materia. Se dice que una molecula es un alergeno aunque solo un pequeno subconjunto de sujetos presente una respuesta inmunitaria alergica (por ejemplo, IgE) tras su exposicion a la molecula.
El termino "alergia" incluye generalmente de manera no limitativa alergias alimentarias, alergias respiratorias y alergias cutaneas.
El termino "antfgeno" se refiere generalmente a una sustancia que es reconocida y se une selectivamente a un anticuerpo o a un receptor de antfgenos de los linfocitos T. Los antfgenos pueden incluir, entre otros, peptidos, protefnas, nucleosidos, nucleotidos y sus combinaciones. Los antfgenos pueden ser naturales o sinteticos e inducen generalmente una respuesta inmunitaria que es especffica de cada antfgeno.
El termino "antagonista" se refiere generalmente a una sustancia que atenua los efectos de un agonista.
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El termino "cancer" se refiere generalmente, entre otras cosas, a cualquier neoplasia o tumor maligno causado por la proliferacion o la division celular anormal o incontrolada. Los canceres pueden producirse en seres humanos y/o mamfferos y pueden surgir en cualquier tejido. El tratamiento de un paciente de cancer puede incluir la administracion de un compuesto, formulacion farmaceutica o vacuna, de acuerdo con la invencion, de modo que afecte la proliferacion y/o division celular anormal o incontrolada o metastasis.
El termino "portador" comprende generalmente cualquier excipiente, diluyente, carga, sal, amortiguador, estabilizante, solubilizante, aceite, lfpido, vesfcula contenedora de lfpidos, microesferas, encapsulamiento liposomico, u otro material bien conocido en la materia para la utilizacion en formulaciones farmaceuticas. Debe apreciarse que las caracterfsticas del portador, excipiente, o diluyente dependeran de la ruta de administracion para una aplicacion concreta. La preparacion de formulaciones farmaceuticamente aceptables que contienen estos materiales se describe en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edicion, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.
El termino "coadministracion" o "coadministrado" se refiere generalmente a la administracion de por lo menos dos sustancias diferentes suficientemente proximas en el tiempo para modular una respuesta inmunitaria. La coadministracion se refiere a la administracion simultanea, asf como separada por hasta varios dfas, de por lo menos dos sustancias diferentes en cualquier orden, ya sea en una dosis unica o en dosis separadas.
El termino "en combinacion con" generalmente significa la administracion de un agonista del TLR3 o una composicion del mismo de acuerdo con la invencion y otro agente util para tratar la enfermedad o afeccion que no suprime la actividad del agonista del TLR3 ni de su composicion en el transcurso del tratamiento de un paciente. Dicha administracion puede realizarse en cualquier orden, incluyendo la administracion simultanea y la espaciada temporalmente, desde unos pocos segundos hasta varios dfas. Dicho tratamiento combinado puede incluir tambien mas de una unica administracion del agonista del TLR3 o de su composicion, de acuerdo con la invencion y/o independientemente del otro agente. La administracion del agonista del TLR3 o de su composicion de acuerdo con la invencion y el otro agente puede realizarse por la misma via o por vfas diferentes.
El termino "individuo", "sujeto" o "vertebrado" se refiere generalmente a un mamffero, como un ser humano.
El termino "sfntesis lineal" se refiere generalmente a una sfntesis que se inicia en un extremo del oligonucleotido y progresa linealmente hasta el otro extremo. La sfntesis lineal permite incorporar unidades monomericas identicas o no identicas (en cuanto a longitud, composicion de bases y/o modificaciones qufmicas incorporadas) en un oligonucleotido.
El termino "mamffero" pretende comprender expresamente los animales vertebrados de sangre caliente, entre otros seres humanos, primates no humanos, ratas, ratones, gatos, perros, caballos, ganado, vacas, cerdos, ovejas y conejos.
El termino "nucleosido" se refiere generalmente a compuestos que consisten en un azucar, habitualmente una ribosa o desoxirribosa, y una base de purina o pirimidina.
El termino "nucleotido" generalmente se refiere a un nucleosido que comprende un grupo que contiene fosforo unido al azucar.
El termino "nucleosido modificado" es generalmente un nucleosido que incluye una base heterocfclica modificada, un resto azucarado modificado, o cualquiera de sus combinaciones. En algunas formas de realizacion, el nucleosido modificado es un nucleosido de pirimidina o purina no natural, como se describe en la presente memoria. En el contexto de la invencion, se puede utilizar de forma indistinta un nucleosido modificado, un analogo de pirimidina o purina o una pirimidina o purina que no se produce naturalmente y se refiere a un nucleosido que incluye una base que no se produce naturalmente y/o un resto azucarado que no se produce naturalmente. En el contexto de la invencion, se considera que una base no es natural si no es guanina, citosina, adenina, timina o uracilo, y se considera que un azucar no es natural si no es p-ribo-furanosuro o 2'-desoxiribo-furanosido. En el contexto de la invencion, un "nucleotido modificado" es un nucleosido modificado que comprende un grupo que contiene fosforo unido al azucar.
El termino "oligonucleotido modificado" tal como se utiliza en la presente memoria, describe un oligonucleotido en el que por lo menos dos de sus nucleotidos estan unidos covalentemente mediante un enlace sintetico, es decir, un enlace distinto de un enlace fosfodiester entre el extremo 5' de un nucleotido y el extremo 3' de otro nucleotido, o el extremo 5' de un nucleotido y el extremo 2' de otro nucleotido en el que el fosfato del nucleotido 5' ha sido sustituido por cualquier numero de grupos qufmicos. El termino "oligonucleotido modificado" tambien incluye oligonucleotidos que presentan por lo menos un nucleotido modificado.
El termino "acido nucleico" comprende una region genomica o una molecula de ARN transcrita a partir de ella. En algunas formas de realizacion, el acido nucleico es ARN mensajero (ARNm).
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El termino "enlace nucleotfdico" se refiere generalmente a un enlace qufmico que une dos nucleosidos a traves de sus azucares (por ejemplo, 3'-3', 2'-3', 2'-5', 3'-5') que consiste en un atomo de fosforo y un grupo cargado o neutro (por ejemplo, fosfodiester, fosforotioato, fosforoditioato o metilfosfonato) entre nucleosidos adyacentes.
En el contexto de la invencion, un "enlazador no nucleotfdico" es cualquier resto que puede estar enlazado a los oligonucleotidos mediante enlaces covalentes o no covalentes. Preferentemente, dicho enlazador presenta una longitud de 2 a 200 angstroms aproximadamente. A continuacion se indican algunos ejemplos de enlazadores preferidos. Los enlaces no covalentes incluyen de manera no limitativa interaccion electrostatica, interacciones hidrofobas, n-interacciones de apilamiento y enlaces de hidrogeno. El termino "enlazador no nucleotfdico" no pretende referirse a un enlace internucleosido, como se ha descrito anteriormente, esto es, un grupo funcional fosfodiester, fosforotioato o fosforoditioato que conecta directamente los grupos 3'-hidroxilo de dos nucleosidos.
El termino "oligonucleotido" se refiere a un polinucleosido formado a partir de varias unidades de nucleosido enlazadas. Las unidades de nucleosido pueden ser parte de virus, bacterias, residuos celulares o composiciones basadas en oligonucleotidos (por ejemplo, ARNip y micro ARN). Dichos oligonucleotidos tambien pueden obtenerse a partir de fuentes de acidos nucleicos existentes, con inclusion de ADN genomico o ADNc, pero se producen preferentemente mediante procedimientos sinteticos. En ciertas formas de realizacion, cada unidad de nucleosido incluye una base heterocfclica y un pentofuranosilo, trehalosa, arabinosa, nucleosido sustituido en 2'-desoxi-2', arabinosa sustituida en 2'-desoxi-2', arabinosa sustituida en 2'-O o un grupo de azucar hexosa. Los restos nucleosidos pueden acoplarse entre sf mediante cualquiera de los numerosos enlaces internucleosidos conocidos. Dichos enlaces internucleosidos incluyen de manera no limitativa fosfodiester, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, alquilfosfonato, alquilfosfonotioato, fosfotriester, fosforamidita, siloxano, carbonato, carboalcoxi, acetamidato, carbamato, morfolino, borano, tioeter, fosforamidato en forma de puente, metilenfosfonato en forma de puente, fosforotioato en forma de puente, y enlaces internucleosidos de sulfona. El termino "compuesto basado en oligonucleotidos" comprende tambien polinucleosidos que presentan uno o mas enlaces internucleosidos estereoespecfficos (por ejemplo, enlaces (Rp)-fosforotioato o (Sp)-fosforotioato, alquilfosfonato, o fosfotriester). Como se usa en la presente memoria, se pretende expresamente que los terminos "oligonucleotido" y "dinucleotido" incluyan polinucleosidos y dinucleosidos que presenten cualquiera de dichos enlaces internucleosidos, tanto si el enlace comprende, como si no, un grupo fosfato. En determinadas formas de realizacion de ejemplo, estos enlaces internucleosidos pueden ser enlaces fosfodiester, fosforotioato, o fosforoditioato, o sus combinaciones.
El termino "peptido" se refiere generalmente a polipeptidos que presentan una longitud y una composicion suficientes para influir en una respuesta biologica, por ejemplo, produccion de anticuerpos o actividad de citocinas, tanto si el peptido es un hapteno como si no. El termino "peptido" puede incluir aminoacidos modificados (ya sean naturales o no naturales) donde dichas modificaciones incluyen de manera no limitativa fosforilacion, glicosilacion, pegilacion, lipidizacion y metilacion.
El termino "farmaceuticamente aceptable" significa un material no toxico que no interfiere con la eficacia de un compuesto o con la actividad biologica de un compuesto de acuerdo con la invencion.
El termino "fisiologicamente aceptable" se refiere a un material no toxico que es compatible con un sistema biologico tal como una celula, un cultivo celular, un tejido o un organismo. Preferentemente, el sistema biologico es un organismo vivo, como un mamffero, particularmente un ser humano.
La expresion "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere generalmente a una cantidad suficiente para evitar o reducir el desarrollo de un efecto biologico no deseado.
El termino "cantidad terapeuticamente eficaz" o "cantidad farmaceuticamente eficaz" se refiere generalmente a una cantidad suficiente para influir en un efecto biologico deseado, tal como un resultado beneficioso, incluyendo la prevencion, reduccion, mejora o eliminacion de signos o sfntomas de una enfermedad o trastorno. De esta manera, la cantidad total de cada componente activo de la composicion farmaceutica o del procedimiento es suficiente para demostrar un beneficio significativo para el paciente. De esta manera, una "cantidad farmaceuticamente eficaz" dependera del contexto en el que se esta administrando. Una cantidad farmaceuticamente eficaz puede administrarse en una o mas administraciones profilacticas o terapeuticas. Cuando se aplica a un principio activo individual y es administrado solo, el termino se refiere unicamente a ese principio. Cuando se aplica a una combinacion, el termino se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que dan lugar al efecto terapeutico, ya sea administrados en combinacion, en serie o simultaneamente.
El termino "tratamiento" se refiere generalmente a un enfoque previsto para obtener un resultado beneficioso o deseado, que puede incluir el alivio de los sfntomas, o el retraso o la mejora en la progresion de una enfermedad.
La invencion proporciona un agonista del TLR3 sintetico que comprende un primer oligorribonucleotido que presenta la estructura: 5'-Dominio A-Dominio B-3' y un segundo oligorribonucleotido que presenta la estructura: 5'-Dominio C- Dominio D-3', en el que el dominio A es un primer dominio complementario, el dominio B es un dominio de polirriboinosina, el dominio C es un segundo dominio complementario y el dominio D es un dominio de
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polirribocitidina, en el que el dominio A y el dominio C son complementarios entre si. El primer oligorribonucleotido y el segundo oligorribonucleotido se unen entre si a traves de enlaces de hidrogeno intermoleculares entre los dominios complementarios, dejando un dominio de polirriboinosina libre y un dominio de polirribocitidina libre, o entre los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina, dejando un primer dominio complementario libre y un segundo dominio complementario libre. El primer y/o el segundo oligonucleotido adicional pueden unirse a los dominios de polirriboinosina o polirribocitdina complementarios y/o libres, creando asf una cadena de oligorribonucleotidos.
La invencion proporciona ademas un agonista del TLR3 sintetico que comprende un primer oligorribonucleotido que presenta la estructura: 5'-Dominio B-Dominio A-3' y un segundo oligorribonucleotido que presenta la estructura: 5'- Dominio D-Dominio C-3', en el que el dominio A es un primer dominio complementario, el dominio B es un dominio de polirriboinosina, el dominio C es un segundo dominio complementario y el dominio D es un dominio de polirribocitidina, en el que el dominio A y el dominio C son complementarios entre si. El primer oligorribonucleotido y el segundo oligorribonucleotido se unen entre si a traves de enlaces de hidrogeno intermoleculares entre los dominios complementarios, dejando un dominio de polirriboinosina libre y un dominio de polirribocitidina libre, o entre los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina, dejando un primer dominio complementario libre y un segundo dominio complementario libre. El primer y/o el segundo oligonucleotido adicional pueden unirse a los dominios de polirriboinosina o polirribocitidina complementarios y/o libres, creando asf una cadena de oligorribonucleotidos.
La invencion describe ademas un agonista del TLR3 sintetico que comprende un primer oligorribonucleotido que presenta la estructura: 5'-Dominio A-3'-3'-Dominio B-5' y un segundo oligorribonucleotido que presenta la estructura: 5'-Dominio C-3'-3'-Dominio D-5', en el que los dominios A y B y los dominios C y D estan unidos covalentemente a traves de un enlace directo nucleotido a nucleotido en sus extremos 3' a traves de las posiciones 3' de los azucares o a traves de un azucar modificado o una base nitrogenada modificada, en el que el dominio A es un primer dominio complementario, el dominio B es un dominio de polirriboinosina, el dominio C es un segundo dominio complementario y el dominio D es un dominio de polirribocitidina, en el que el dominio A y el dominio C son complementarios entre si. El primer oligorribonucleotido y el segundo oligorribonucleotido se unen entre si a traves de enlaces de hidrogeno intermoleculares entre los dominios complementarios, dejando un dominio de polirriboinosina libre y un dominio de polirribocitidina libre, o entre los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina, dejando un primer dominio complementario libre y un segundo dominio complementario libre. El primer y/o el segundo oligonucleotido adicional pueden unirse a los dominios de polirriboinosina o polirribocitidina complementarios y/o libres, creando asf una cadena de oligorribonucleotidos.
En algunas formas de realizacion, el agonista del TLR3 comprende por lo menos dos primeros oligorribonucleotidos que presentan la estructura: 5'-Dominio A-Dominio B-3' unido covalentemente a traves de un enlace directo nucleotido a nucleotido en sus extremos 3' a traves de las posiciones 3' de los azucares o a traves de un azucar modificado o una base nitrogenada modificada, o a traves de un enlazador no nucleotfdico en sus extremos 3' a traves de las posiciones 3' de los azucares o a traves de un azucar modificado o una base nitrogenada modificada y un segundo oligorribonucleotido que presenta la estructura: 5'-Dominio C-Dominio D-3', en el que el dominio A es un primer dominio complementario, el dominio B es un dominio de polirriboinosina, el dominio C es un segundo dominio complementario y el dominio D es un dominio de polirribocitidina, en el que el dominio A y el dominio C son complementarios entre sf. En una forma de realizacion adicional, por lo menos los dos primeros oligorribonucleotidos pueden presentar la estructura 5'-Dominio B-Dominio A-3' y el segundo oligorribonucleotido puede presentar la estructura 5'-Dominio D-Dominio C-3'.
En algunas formas de realizacion, el agonista de TLR3 comprende un primer oligorribonucleotido que presenta la estructura: 5'-Dominio A-Dominio B-3' y por lo menos dos segundos oligorribonucleotidos que presentan la estructura: 5'-Dominio C-Dominio D-3' covalentemente unido a traves de un enlace directo nucleotido a nucleotido en sus extremos 3' a traves de las posiciones 3' de los azucares o a traves de un azucar modificado o una base hidrogenada modificada o a traves de un enlazador no nucleotido en sus extremos 3' a traves de las posiciones 3' de los azucares o a traves de un azucar modificado o una base nitrogenada modificada, en la que el dominio A es un primer dominio complementario, el dominio B es un dominio de polirriboinosina, el dominio C es un segundo dominio complementario y el dominio D es un dominio de polirribocitidina, en el que el dominio A y el dominio C son complementarios entre sf. En una forma de realizacion adicional, el primer oligorribonucleotido puede presentar la estructura 5'-Dominio B-Dominio A-3' y por lo menos los dos segundos oligorribonucleotidos pueden presentar la estructura 5'-Dominio D-Dominio C-3'.
Como ejemplo no limitativo, el enlazador puede estar unido al 3'-hidroxilo. En dichas formas de realizacion, el enlazador comprende preferentemente un grupo funcional hidroxilo, que se une al hidroxilo 3' por medio de un tipo de enlace basado en fosfato, fosfodiester, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato o enlaces no basados en fosfato. Unos posibles sitios de conjugacion para el ribonucleotido se indican en la Estructura A, a continuacion, en la que B representa una base heterocfclica y en la que la flecha que apunta a P indica cualquier union al fosforo.
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Estructura A
imagen1
I
O'xrxnjx
En algunas formas de realizacion, el enlazador no nucleotido es una molecula pequena, macromolecula o biomolecula, incluyendo de manera no limitativa polipeptidos, anticuerpos, lfpidos, antfgenos, alergenos y oligosacaridos. En algunas formas de realizacion diferentes, el enlazador no nucleotfdico es una molecula pequena. En el contexto de la invencion, una molecula pequena es un resto organico que presenta un peso molecular de menos de 1000 Da. En algunas formas de realizacion, la molecula pequena presenta un peso molecular de menos de 750 Da.
En algunas formas de realizacion, la molecula pequena es un hidrocarburo alifatico o aromatico, cualquiera de los cuales puede incluir opcionalmente, tanto en la cadena lineal enlazando los oligorribonucleotidos o agregados a la misma, uno o mas grupos funcionales incluyendo de manera no limitativa hidroxi, amino, tiol, tioeter, eter, amida, tioamida, ester, urea, o tiourea. La molecula pequena puede ser dclica o adclica. Los ejemplos de enlazadores de molecula pequena incluyen de manera no limitativa aminoacidos, hidratos de carbono, ciclodextrinas, adamantano, colesterol, haptenos y antibioticos. Sin embargo, para describir el enlazador no nucleotidico, no se pretende que el termino "molecula pequena" incluya un nucleosido.
En algunas formas de realizacion, el enlazador no nucleotidico es un enlazador de alquilo o un enlazador de amino. El enlazador de alquilo puede ser ramificado o no ramificado, dclico o adclico, sustituido o no sustituido, saturado o no saturado, quiral, aquiral o mezcla racemica. Los enlazadores de alquilo pueden presentar de aproximadamente 2 a aproximadamente 18 atomos de carbono. En algunas formas de realizacion, dichos enlazadores de alquilo presentan entre aproximadamente 3 y aproximadamente 9 atomos de carbono. Algunos enlazadores de alquilo incluyen uno o mas grupos funcionales incluyendo de manera no limitativa hidroxi, amino, tiol, tioeter, eter, amida, tioamida, ester, urea y tioeter. Dichos enlazadores de alquilo pueden incluir de manera no limitativa enlazadores de 1,2-propanotriol, 1,2,3-propanotriol, 1,3-propanodiol, trietilenglicol hexaetilenglicol, glucoenlazadores de polietileno (por ejemplo, [-O-CH2-CH2-]n (n = 1-9)), enlazadores de metilo, enlazadores de etilo, enlazadores de propilo, enlazadores de butilo, o enlazadores de hexilo. En algunas formas de realizacion, dichos enlazadores de alquilo pueden incluir peptidos o aminoacidos.
En algunas formas de realizacion, el enlazador no nucleotido puede incluir, pero no esta limitado a, lo siguiente:
HO y OH OH
Glicerol (1,2,3-Propanotriol)
OH
HO
imagen2
OH
1,2,4-Butanotriol
Ha oh
OH
2-lhdiciroximetil)-1,3-propanodiol
HO
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OH
2-(hidooximetil)-1,4-butanediol
OH
HO
imagen4
1,3,5-Pentanotriol
HO
OH
HO^^^'OH O2N >
OH
1, l,1-Trii(hidromiimetil)nitrometano
HO
OH
OH
1,1,1-Tris(hidroximetil)propano
OH
imagen5
OH
1,2,6-Hexanotriol
//^OH
3 -Metil-1,3,5 -pentanoitriol
OH
imagen6
OH
1,2,3-Heptanotriol
HO X OH
NH2 OH
2 - A.inino-;--(hidr(irimeiOl) -1,3 -propanodiol
OH
1,1G-Tris(hidroximetil)etano
HO' "OH
O^ „NH
OH
IT- [T ris(hidroximetil)metil] accilamida
HOa
kOH
V
OH
'O 'Y' 'O'
OH
cis-1,3,5 -Ciclohexanotriol
1,3 -Di(hidroxietoxi)-2-hidroxil-prof)cmo
HO
OH
HO
O
O
X
OH
cis-1,3,5 -Tr^hihooximetil-ciclohexano
OH
1,3l;Di(llicrroxiJiropoxi)l2lhihhoxillJ^ropano
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1,3,5 -T rihihroxil-benceno
imagen8
HO
imagen9
OH
OH
1,5,5 ,-T r^hihroximetil-benceno
O OH
H
OH
OH
2-Desoxi-D-ribosa
OH
imagen10
1 ,2,4 ,tT rihihroxil-benceno
imagen11
OH
O
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OH
imagen13
2
1,6-Anhidro-p-D-Glucosa
4,6-Nitropirogalol
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^ /OH N
O^n"^
O
OH
Acido l,3,5-Tris(2-hidroxietil)-cianurico
imagen15
OH
OH O
imagen16
HO
OH
Etilenglicol
HO
'OH
1,3-Propanodiol
1,5-Pentanodiol
OH OH
2,4-Pentanodiol
HO
OH
1,2-Propanodiol
HO
OH
1,6-Hexanodiol
HO
OH
1,4-Butanodiol
HO
imagen17
OH
OH
HO
imagen18
1,3-Butanodiol
1,2-Hexanodiol
OH
imagen19
OH
1,5-Hexanodiol
OH
2,3-Butanodiol
HO
imagen20
OH
1,4-Butanodiol
OH
imagen21
OH
2,5-Hexanodiol
HO
'OH
1,7-Heptanodiol
HO'
.OH
1,8-Octanodiol
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NH2
2-(1 -Aminopropil)- 1,3-propanodiol
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1,9-Nonanodiol
HO
OH
1,12-Dodecanodiol
^O. .OH
Ha o
Trietilenglicol
Tetoaetilenglicol
Hexaetilenglicol
En algunas formas de realizacion, el enlazador de molecula pequena es glicerol o un homologo de glicerol de la formula HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OH, en la que o y p independientemente son numeros enteros de 1 a 5 aproximadamente 6, de 1 a aproximadamente 4, o de 1 a aproximadamente 3. En algunas formas de realizacion diferentes, el enlazador de molecula pequena es un derivado de 1,3-diamino-2-hidroxipropano. Algunos de dichos derivados presentan la formula HO-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-OH, en la que m es un numero entero de 0 a aproximadamente 10, de 0 a aproximadamente 6, de 2 a aproximadamente 6, o de 2 a aproximadamente 4.
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Algunos enlazadores no nucleotidos de acuerdo con la invencion permiten la union de mas de dos oligorribonucleotidos. Por ejemplo, el enlazador de molecula pequena glicerol presenta tres grupos hidroxilo a los cuales se pueden unir covalentemente oligorribonucleotidos. Algunos agonistas del TLR3 de acuerdo con la invencion, por lo tanto, comprenden dos o mas oligorribonucleotidos unidos a un enlazador nucleotido o no 15 nucleotido. Estos agonistas del TLR3 se denominan "ramificados".
Sin pretender vincularse a ninguna teorfa en particular, la formacion de una cadena de los primeros y segundos
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oligorribonucleotidos de la invencion presenta como resultado un poli(I:C) hfbrido que es un agonista especffico del TLR3. Especfficamente, el agonista del TLR3 poli(I:C) hfbrido de la invencion puede existir en forma de cadenas largas de acido nucleico que sin embargo presentan una reducida capacidad de formar estructuras indeseables helice-bucle y que no presentan propiedades toxicas ni carecen de eficacia en la administracion in vivo.
Como se utiliza en la presente memoria, el termino "complementario" significa que presenta la capacidad de hibridarse con un acido nucleico. Dicha hibridacion suele ser el resultado del enlace de hidrogeno entre cadenas complementarias, preferentemente para formar pares de bases Watson-Crick o Hoogsteen. Un enlace de hidrogeno intermolecular da como resultado la formacion de una molecula de acido nucleico bicatenaria.
En las formas de realizacion de la invencion, el primer dominio complementario, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un dominio que presenta una secuencia de bases que, con una alineacion adecuada con el segundo dominio complementario, puede formar una pareja de bases intermolecular entre pares “tambaleantes” (“wobble”) G-C, A-T, A-U y/o G-U. Por lo tanto, cuando se utiliza una pluralidad de primeros y segundos oligorribonucleotidos conjuntamente, los dominios complementarios de la pluralidad de primeros oligorribonucleotidos y los dominios complementarios de la pluralidad de segundos oligorribonucleotidos pueden hibridar juntos mediante enlaces de hidrogeno intermoleculares en condiciones de alta astringencia. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, el grado de complementariedad es de por lo menos 93 por ciento, por lo menos 95 por ciento, por lo menos 98 por ciento, o incluso 100 por cien. En las formas de realizacion preferidas, el grado de complementariedad es de 100%. Ademas, cuando se utiliza una pluralidad de primeros y segundos oligorribonucleotidos conjuntamente, los dominios de polirriboinosina de la pluralidad de primeros oligorribonucleotidos y los dominios de polirriboinosina de la pluralidad de los segundos oligorribonucleotidos pueden hibridar juntos.
Las "condiciones de astringencia" en las hibridaciones es un termino tecnico que hace referencia a las condiciones (como temperatura y concentracion del amortiguador) que permiten la hibridacion de un acido nucleico en particular con otro acido nucleico, en las que el primer acido nucleico puede ser perfectamente complementario con el segundo, o el primero y el segundo pueden compartir algun grado de complementariedad inferior a la perfeccion. Las "condiciones de alta astringencia" y las "condiciones de astringencia moderada" para las hibridaciones del acido nucleico se explican en las paginas 2.10.1-2.10.16 (ver en concreto 2.10.8-11) y en las paginas 6.3.1-6 de Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. et al., eds., Vol. 1, incluyendo suplementos hasta el Suplemento 29, 1995), contenido que se incorpora en la presente memoria como referencia. La hibridacion requiere que los dos acidos nucleicos contengan secuencias sustancialmente complementarias; en funcion de la astringencia de la hibridacion, sin embargo, se pueden tolerar emparejamientos incorrectos. La astringencia adecuada para hibridar acidos nucleicos depende de la longitud de los acidos nucleicos y del grado de complementariedad, variables bien conocidas en la tecnica.
En algunas formas de realizacion, aunque los primeros y segundos oligorribonucleotidos presentan el mismo numero de nucleotidos de longitud, los dominios complementarios no presentan necesariamente el mismo numero de nucleotidos que los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina. El unico requisito es que el primer dominio complementario y el segundo dominio complementario presenten la misma longitud y que los dominios de polirriboinosina y de polirribocitidina sean de la misma longitud. Por ejemplo, el primer y segundo dominios complementarios presentan aproximadamente de 10 a 20 nucleotidos de longitud, y los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina presentan aproximadamente de 30 a 40 nucleotidos de longitud. En algunas formas de realizacion, los primeros y segundos dominios complementarios presentan aproximadamente de 15 a 20 nucleotidos de longitud, y los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina presentan aproximadamente de 30 a 35 nucleotidos de longitud. En algunas formas de realizacion, los primeros y segundos dominios complementarios presentan 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleotidos de longitud y los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina presentan 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleotidos de longitud. En algunas formas de realizacion, los primeros y segundos dominios complementarios presentan una longitud de 20 nucleotidos y los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina presentan una longitud de 30 nucleotidos. En algunas formas de realizacion, los primeros y segundos dominios complementarios presentan una longitud de 15 nucleotidos y los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina presentan una longitud de 35 nucleotidos. Un experto en la materia apreciara que los diferentes dominios de los primeros y segundos oligorribonucleotidos pueden ser mas cortos o mas largos, siempre que el compuesto retenga la actividad estimuladora del TLR3 sin introducir las estructuras helice-bucle no deseadas ni propiedades toxicas.
En las formas de realizacion de la invencion, los primeros y segundos oligorribonucleotidos pueden presentar las siguientes estructuras ilustrativas. Las formas de realizacion que no estan comprendidas por las reivindicaciones se describen unicamente a tftulo comparativo.
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donde
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representa los dominios complementarios.
Un experto en la materia apreciara que las secuencias complementarias de los primeros y segundos dominios complementarios y/o la naturaleza complementaria de los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina permiten el enlace de hidrogeno intermolecular entre los primeros y segundos oligorribonucleotidos, que pueden presentar las siguientes estructuras bicatenarias ilustrativas:
Formula IX (esto es, Formulas I y II)
imagen26
Otros oligonucleotidos primeros y segundos pueden unirse entre si, creando de esta manera una cadena de oligoribonucleotidos de acuerdo con la invencion que puede presentar la siguiente estructura ilustrativa:
Formula X (esto es, cadena de Ffrmulas I y II)
imagen27
donde n es cualquier numero.
Como apreciara un experto en la materia, las estructuras bicatenarias y/o las cadenas de los primeros y segundos oligorribonucleotidos tambien se pueden preparar con las Formulas III y IV, las Formulas V y VI y las Formulas VII y VIII.
En algunas formas de realizacion, el agonista del TLR3 de acuerdo con la invencion puede comprender uno o mas sitios de union de fuerza. Mediante la sustitucion de una o mas guanosinas por inosina en el dominio de polirriboinosina, se obtiene un sitio de union de fuerza. Tal sitio de union de fuerza puede mejorar la alineacion de los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina y/o aumentar la fuerza del enlace entre los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina.
En algunas formas de realizacion de la invencion, ciertos atomos de hidrogeno en el primer y/o segundo oligorribonucleotido se reemplazan por un atomo de deuterio mediante un intercambio de hidrogeno y deuterio (tambien denominado H-D o H/D) Al sustituir un atomo de hidrogeno por un atomo de deuterio, se mejora la estabilidad del agonista del TLR3 de acuerdo a la invencion. Adicionalmente, este intercambio aumenta la resistencia de los agonistas del TLR3 a la oxidacion y/o a la degradacion.
En otras formas de realizacion, el agonista del TLR3 de acuerdo con la invencion puede comprender una caperuza
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5' y/o 3', donde el extremo 5' y/o 3' del agonista del TLR3 esta unido a otra molecula (por ejemplo, a un enlazador no nucleotfdico) o a si mismo, de modo que el extremo 5' y/o 3' no es accesible a la degradacion de la exonucleasa o para la hibridacion a otro agonista del TLR3 de la invencion. Dichas acciones de caperuza estabilizan aun mas el agonista del TLR3 y/o regulan el numero de los primeros y segundos oligorribonucleotidos que pueden unirse y, por lo tanto, permite al agonista del TLR3 presentar un tamano o una longitud en concreto.
En unas formas de realizacion siguientes, el agonista del TLR3 de acuerdo con la invencion puede comprender uno o mas intercambios de atomos de deuterio. Estos intercambios de deuterio proporcionarfan una mayor resistencia a la degradacion de la nucleasa y/o aumentarfan la estabilidad de la hibridacion entre los primeros y segundos oligorribonucleotidos y/o mejorarfa la estabilidad de la union por parte del TLR3. Ademas, estas moleculas deuteradas pueden comprender una caperuza 5' y/o 3'.
En otras formas de realizacion, la invencion proporciona una composicion que comprende uno o mas de los agonistas del TLR3 de acuerdo con la invencion y cualquier otro agente terapeutico o profilactico incluyendo de manera no limitativa una o mas vacunas, antfgenos, anticuerpos, agentes citotoxicos, alergenos, antibioticos, oligonucleotidos antisentido, agonista del TLR, antagonista del TLR, ARNip, miARN, peptidos, protefnas, vectores de terapia genica, vacunas de ADN, adyuvantes o inhibidores de cinasas para mejorar la especificidad o la magnitud de la respuesta inmunitaria o moleculas coestimuladoras como citocinas, quimiocinas, ligandos de protefna, factores transactivadores, peptidos y peptidos que comprenden aminoacidos modificados.
La invencion tambien proporciona una composicion que comprende un agonista del TLR3 de acuerdo con la invencion y un portador fisiologicamente aceptable.
En ciertas formas de realizacion, el agonista del TLR3 de acuerdo con la invencion se incluye en el vehfculo farmaceuticamente aceptable y en una cantidad suficiente para suministrar a un mamffero una cantidad farmaceuticamente eficaz sin causar efectos toxicos graves. El intervalo de dosificacion eficaz de los derivados farmaceuticamente aceptables puede calcularse tomando como base el peso del compuesto parental que se va a administrar, o por otros medios conocidos para los expertos en la materia.
En otras formas de realizacion, la composicion que comprende uno o mas de los agonistas del TLR3 de acuerdo con la invencion y un portador fisiologicamente aceptable, comprende ademas cualquier otro agente terapeutico o profilactico incluyendo de manera no limitativa una o mas vacunas, antfgenos, anticuerpos, agentes citotoxicos, alergenos, antibioticos, oligonucleotidos antisentido, agonista del TLR, antagonista del TLR (por ejemplo, antagonista TLR7 y/o TLR8), ARNip, miARN, peptidos, protefnas, vectores de terapia genica, vacunas de ADN, adyuvantes o inhibidores de cinasa para mejorar la especificidad o la magnitud de la respuesta inmunitaria o moleculas coestimuladoras como citocinas, quimiocinas, ligandos de protefnas, factores transactivadores, peptidos y peptidos que comprenden aminoacidos modificados. En una forma de realizacion preferida, la composicion que comprende uno o mas de los agonistas del TLR3 de acuerdo con la invencion y un vehfculo fisiologicamente aceptable, comprende ademas uno o mas antfgenos.
En un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria mediada por el TLR3 en mamfferos, se pone en contacto un agonista del TLR3 de acuerdo con la invencion con el TLR3 o se une in vitro, in vivo, ex vivo o en una celula. En el contexto de esta invencion, el termino "mamffero" incluye expresamente a humanos y a animales. En formas de realizacion preferidas, el compuesto, composicion o vacuna se administra a un vertebrado que necesita estimulacion inmunitaria.
En una forma de realizacion adicional, la invencion proporciona una vacuna. Las vacunas comprenden una composicion de acuerdo con la invencion, y comprenden ademas un antfgeno. Un antfgeno es una molecula que provoca una respuesta inmunitaria especffica. Dichos antfgenos incluyen, entre otros, protefnas, peptidos, acidos nucleicos, carbohidratos y complejos o combinaciones de cualquiera de los mismos. Los antfgenos pueden ser naturales o sinteticos e inducen generalmente una respuesta inmunitaria que es especffica de cada antfgeno. Cualquiera de estos antfgenos puede unirse opcionalmente a una protefna inmunogena, como hemocianina de lapa (KLH), la subunidad B de la toxina del colera o cualquier otra protefna portadora inmunogena.
Las vacunas segun la invencion pueden incluir ademas cualquiera de la pletora de adyuvantes conocidos, incluyendo, entre otros, adyuvante completo de Freund, hemocianina de lapa (KLH), monofosforil lfpido A (MPL), adyuvante de alumbre de Merck (MAA) y saponinas, que incluyen QS-21, imiquimod, R848, o combinaciones de los mismos.
La invencion tambien proporciona agonistas o composiciones del TLR3 de acuerdo con la invencion para su utilizacion en un procedimiento de estimulacion de la actividad del TLR3 en un mamffero, procedimiento que comprende administrar al mamffero un agonista o composicion del TLR3 de acuerdo con la invencion. En algunas formas de realizacion, el mamffero es un humano. En formas de realizacion preferidas, el agonista o la composicion del TLR3 de acuerdo con la invencion se administra a un mamffero que necesita estimulacion inmunitaria.
La invencion tambien proporciona agonistas o composiciones del TLR3 de acuerdo con la invencion para su
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utilizacion en un procedimiento de estimulacion de la respuesta inmunitaria mediada por TLR3 en un mamffero, procedimiento que comprende administrar al mamffero un agonista o composicion del TLR3 de acuerdo con la invencion. En algunas formas de realizacion, el mamffero es un humano. En formas de realizacion preferidas, el agonista o la composicion del TLR3 de acuerdo con la invencion se administra a un mamffero que necesita estimulacion inmunitaria.
La invencion tambien proporciona agonistas o composiciones del TLR3 de acuerdo con la invencion para su utilizacion en un procedimiento para tratar a un mamffero con una enfermedad o trastorno tratable mediante la activacion del TLR3 o la estimulacion inmunitaria mediada por TLR3, procedimiento que comprende administrar al mamffero un agonista o composicion del TLR3 segun la invencion en una cantidad farmaceuticamente eficaz. En algunas formas de realizacion, el mamffero es un humano. La invencion se refiere tambien a los agonistas y composiciones del TLR3 de acuerdo con la invencion para uso en procedimientos de tratamiento de enfermedades y afecciones, y como adyuvantes de vacunas.
La invencion tambien proporciona agonistas o composiciones del TLR3 de acuerdo con la invencion para su uso en procedimientos de prevencion de una enfermedad o trastorno o como adyuvantes de vacunas en un mamffero, particularmente en un humano en riesgo de contraer o desarrollar una enfermedad o trastorno prevenible por la activacion del TLR3 o por la estimulacion de la respuesta inmunitaria mediada por TLR3. Segun este aspecto el procedimiento comprende administrar al mamffero una cantidad profilacticamente eficaz de un agonista o composicion del TLR3 de acuerdo con la invencion.
Los agonistas y composiciones del TLR3 de acuerdo con la invencion tambien son utiles para examinar la funcion del gen TLR3 en una celula, en un mamffero de control, o en un mamffero afectado con una enfermedad asociada al TLR3 o a la estimulacion inmunitaria a traves del TLR3. En las formas de realizacion de este aspecto, se administra el agonista o la composicion del TLR3 de acuerdo con la invencion a la celula o al mamffero y se examina la actividad del TLR3.
En la tabla 2 siguiente se muestra una lista no exhaustiva de agonistas del TLR3. Todos los agonistas del TLR3 presentados en la tabla 2 no comprendidos en las reivindicaciones se describen a tftulo comparativo. En la tabla 2, los compuestos del agonista del TLR3 basados en oligonucleotidos presentan todos los enlaces fosfodiester (PO), excepto cuando se indica como un enlace fosforotioato (PS). Los expertos en la materia apreciaran, sin embargo, que puede utilizarse una combinacion de enlaces PS y PO. En la tabla 2 siguiente se presenta una lista de oligonucleotidos de control como los compuestos n° 8, 20-24, 64-67, 119-121, 124 y 125. En la tabla 2, los oligonucleotidos de control inactivos presentan en su totalidad enlaces fosfodiester (PO), excepto cuando se indica como un enlace fosforotioato (PS).
Tabla 2.
SEC ID n°
Long. del n° de compuesto Secuencia Long.
1
25 a 5'-GCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3' 40
2
b 3'-l 1111111111111111111111111111ICGUCAACUGU-5’ 40
3
27 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCCC-3’ 50
4
b 3'-l 111111111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
5
28 a 5'-CACUGGCAGUUGACACAGGUeCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCC'CCCC-3' 50
6
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGUGUCCA-5' 50
7
29 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCC-3’ 50
8
b 5'-UGUCAACUGCCAGUGIIIIIIIIIIGIII111111 Gil IIII HIGH II-3' 50
9
30 a S’-CACUGGCAGIJIJGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCCCC-3’ 50
10
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
11
31 a S’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCCCC-3’ 50
12
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5’ 50
13
32 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCCCC-X-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCAC AGUUGACGGUCAC-5 ’ 100
14
b 3'-l 1111111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
15 16
33 a 5 CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCACUGG CAGUUGACA-X-ACAGUUGACGGllCACCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCCCCCCCCCCCCC-5 ’ 100
b 3' -IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUGACCGUCAACUGU-5' 50
SEC ID n°
Long. del n° de compuesto Secuencia Long.
17
34 a 5 ’ -CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCC-3’ 50
18
b 5'-UGUCAACUGCCAGUGIIIIGIIIIIGIIIIGIIIIGIIIIGIIIIGIIII-3' 50
19
35 a S’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCC-3’ 50
20
b 5'-UGUCAACUGCCAGUGIIGIIGIIIIGIIGIIGIIIGIIGIIGIIIGIIII-3' 50
21
1 a 5'-CCUCCAGCCUUACAGCCAAGUAUGAGAGCU-3' 30
22
b 3'-GGAGGUCGGAAUGUCGGUUCAUACUCUCGA-5' 30
23
2 a 5'-GGGAGACAGGCCUGUUCCAUGGCCAACACGUUUGUCUCCC-3' 40
24
b 3'-CCCUCUGUCCGGACAAGGUACCGGUUGUGCAAACAGAGGG-5' 40
25
3 a 5'-CUGAACAUCUGCGGACGGACCUAGAUACGGAACCUUUGUU-3' 40
26
b 3'-GACUUGUAGACGCCUGCCUGGAUCUAUGCCUUGGAAACAA-5' 40
27
4 a 5'-ACAUCUGCGGACGGACCUAGAUACGGAACCUUUGUUGUUG-3' 40
28
b 3'-UGUAGACGCCUGCCUGGAUCUAUGCCUUGGAAACAACAAC-5' 40
29
5 a 5-XCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCX-3' 24
30
b 3'-XIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIX-5' 24
31
6 a 5'-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3' 30
32
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII-5' 30
33
7 a 5'-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3' 30
34
b s'-iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii-s' 30
35
8 a S’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCC-3’ 45
36
b s'-iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii-s' 45
37
9 a S’-CCUCCAGCCUUACAGCCAAGUAUGAYYYYYCCUCCAGCCU UACAGCCAAGUAUGA-3' 55
38
b 3'-GGAGGUCGGAAUGUCGGUUCAUACU-5' 25
39
10 a 5’-CCUCCAGCCUUACAGCCAAGUAUGAYYYYYYYYYYCCUCCA GCCUUACAGCCAAGUAUGA-3 ’ 60
40
b 3'-GGAGGUCGGAAUGUCGGUUCAUACU-5' 25
41
11 a 5'-CCUCCAGCCUUACAGCCAAGUAUGAYYYYYYYYYYYYYYYC CUCCAGCCU1JACAGCCAAGUAUGA-3’ 65
42
b 3'-GGAGGUCGGAAUGUCGGUUCAUACU-5' 25
43
12 a 5’-GGGAGACAAACGUGUUGGCCAUGGAACAGGCCUGUCUCCC -X-CCCUdJGUCCGGACAAGGUACCGGUUGUGCAAACAGAGGG-5’ 81
44
b 3'-CCCUCUGUUUGCACAACCGGUACCUUGUCCGGACAGAGGG-5' 40
45
13 a 3‘-CCCUCUGUCCGGACAAGGUACCGGUUGUGCAAACAGAGGG-X- GGGAGACAAACGUGUUGGCCAUGGAACAGGCCUGUCUCCC-3’ 81
46
b 5'-GGGAGACAGGCCUGUUCCAUGGCCAACACGUUUGUCUCCC-3' 40
47
14 5'-CCCIIICCCII-X-IICCCIIICCC-5' 23
48
15 5'-CCIICCIICCC-X-CCCIICCIICC-5' 23
49
16 5'-CCIICCIICCLCCIICCIICC-3' 23
50
17 a 5-XCCCCCCCCCCC-X-CCCCCCCCCCCX-3' 25
51
b 5'-XIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIX-3' 24
52
18 5'-IIIIIIIIIIIII-X-CCCCCCCCCCCCC-5' 27
53
19 5-ICICICICICICICI-X-ICICICICICICICI-5' 31
54
20 a 5'-CCCACACCC-3' 9
55
b 3'-IIIIIIUGU-5' 9
56
21 a 5'-CCCCCCACACCCCCC-3' 15
57
b 3'-IIIIIIIIIIIIUGU-5' 15
58
22 a 5'-IIIIIIIIIIIIIIIIC3GUGC-3' 20
59
b 3-GC3AC3GCCCCCCCCCCCCCCC-5' 20
60
23 a 5'-CCCCCCCCCCACACCCCCCCCCC-3' 23
61
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIUGU-5' 23
62
24 a 5'-GACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3' 34
63
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIICUGU-5' 34
SEC ID n°
Long. del n° de compuesto Secuencia Long.
64
26 a 5'-CACUGGCAGUUGACACAGGUUCCUCACUUCACAAAUCGUUC CCCCCCCCC-3’ 50
65
b 3 ’ -IIIimillGUGACCGUCAACUGUGUCCAAGGAGUGAAGUGUUU AGCAA-5’ 50
66
36 a 5’-CACUGGCAGUUGACACAGGUUCCUCACUUCACAAAUCGUUCA UCGCCCCC-3’ 50
67
b B’-IIIIIGUGACCGUCAACUGUGUCCAAGGAGUGAAGUGUUUAGCA AGUAGC-5’ 50
68
37 a S’-CACUGGCAGUUGACACAGGUUCCUCACUUCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
69
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUGACCGUCAACUGUGUCCAAGGAGUGAAG-5' 50
70
38 a 5'-CACUGCUCAUUCACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC ( (Tree v 50
71
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUGACGAGUAAGUGU-5' 50
72
39 a 5’-GUCACAGUCAAGUUCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCC-3’ 50
73
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIICAGUGUCAGUUCAAG-5' 50
74
40 a S’-CGUGAACUGACACUGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCC-3’ 50
75
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGCACUUGACUGUGAC-5' 50
76
41 a 5’- CACUGGCAGUUGACACAGGUCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCCCCCCCCCCC-3 ’ 60
77
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUGACCGUCAACUGUGUCCA-5' 60
78
42 a .V-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCCCCCCCCCCC-3' 60
79
b 3’-l 1111111111111111111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 60
80
43 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
81
b 3'-IIIIGIIIIGIIIIGI IIIGI HIGH IIGIIII IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
82
44 a 5‘CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3' 50
83
b 3'-l IGI IGI IGI IGI IGI IGI IGI IGI IGI IGI IGI IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
84
45 a S’-CACUGGCAGUUGACACCCCUCCCCCCCCCUCCCCCCCCCUCCC CCCCCCC-3' 50
85
b 3'-ll MAIN IIIIIIAIII III IIIAI III II III IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
86
46 a 5'-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
87
b 3'-IIIIGilllllllllGilllllllllGilllMIIIMGUGACCGUCAACUGU-5' 50
88
47 a 5 ’-C ACUGGCAGUUG AC ACCCCC, CC CCCCCCCC, CCCCCCCCCC, CC CCCCCCCC-3’ 50
89
b 3'-IIIIGIIIIIIIIIGIIIIIIIIIGIIIIIMIMGUGACCGUCAACUGU-5' 50
90
48 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
91
b 3'-l 11IG211111111IG211111111IG2111111111 IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
92
49 a 5 ’-CACUGGCAGUUGACACCCCC, CCCCCCCCCC, CCCCCCCCCC tCC CCCCCCCC-3’ 50
93
b 3'-l 11IG211111111IG211111111IG2111111111 IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
94
50 a 5 ’ -CACUGGCAGUUGACACCCCC2CCCCCCCCCC2CCCCCCCCCC;CC CCCCCCCC-3’ 50
95
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIMMGUGACCGUCAACUGU-5' 50
96
51 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCC-3’ 50
97
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIMMGUGACCGUCAACUGU-5' 50
98
52 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
99
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIMMGUGACCGUCAACUGU-5' 50
100
53 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
101
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIMMGUGACCGUCAACUGU-5' 50
102
54 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
103
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIMMGUGACCGUCAACUGU-5' 50
SEC ID n°
Long. del n° de compuesto Secuencia Long.
104
55 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
105
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUGACCGUCAACUGU-5' 50
106
56 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
107
b 3'-l 1111111111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5’ 50
108
57 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3' 50
109
b 3'-ll II III IIII III II III IIII III II III IIII IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
110
58 a 5’ CACUGGCAGUCGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCCC-3 50
111
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
112
59 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCUCCCCCCCCCUCCCCCCCCCUCCC CCCCCCC-3’ 50
113
b 3'-l 111111111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
114
60 a S’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
115
b 3'-l 111 Al 111111111 Al 11111111 Al 11111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
116
61 a 5’-CACUGGCAGUUGACA-3’-3’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCCCCC-5’ 50
117
b 5 '-UGUCAACUGCCAGUG-3'-3'-lllllllllllllllllllllllllllllllllllll-5' 50
118
62 a 5'-CACUGGCAGHUGACA-3’-3'-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCCCCC-5’ 50
119
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
120
63 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
121
b 5 '-UGUCAACUGCCAGUG-3'-3'-llllllllllllllllllllllllllllllllll-5' 50
122
64 a 5'-CACUGGCAGUUGACA -3' 15
123
b 3'-GUGACCGUCAACUGU-5' 15
124
65 a 5' -CACUGGCAGUUGACACACUGGCAGUUGACACACUGGCAGUUG ACA -3’ 45
125
b 3’-GUGACCGUCAACUGUGUGACCGUCAACUGUGUGACCGUCAAC UGU-5’ 45
126
66 a 5’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCACUGGCAG UUGACA -3’ 50
127
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
128
67 a 5’-UGUCAACUGCCAGUGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC -3’ 50
129
b 3’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCACAGUUGAC GGUCAC-5’ 50
130
68 a 5'-CACUGGCAGU UGACAI11111111111111111111111111111-3' 50
131
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
132
69 a 5’-CAAGGCAAGCAUUCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
133
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUUCCGUUCGUAAGC-5’ 50
134
70 a 5'-GCUACUGUUCGUCGUCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
135
b S'-llllllllllllllllllllllllllllll CGAUGACAAGCAGCA-3' 50
136
71 a 5’-GAAGUCAGUAGUCUCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
137
b 3'-ll II III IIII III II III IIII III IIIICUUCAGUCAUCAGAG-5' 50
138
72 a 5’-CACUGAGACUGAUGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
139
b 3'-1II III IIII III II III IIII III IIIIIGUGACUCUGACUACG-5' 50
140
73 a 5’-UACAGCAGUCAGUCUCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
141
b 3'-l 11111111111111111111111111111AUGUCGUCAGUCAGA-5’ 50
142
74 a 5’-CGAUGACUGACUACGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCC-3’ 50
143
b 5'-l 1111111111111111111111111111IGCUACUGACUGAUGC-3' 50
144
75 a 5’-CCCCGGCCGCCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3' 50
145
b 5'-IGICIICIGCCIGIGII III IIII III II III IIII III II III 1-3' 50
SEC ID n°
Long. del n° de compuesto Secuencia Long.
146
76 a 5’-GCCCCGCCCCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3' 50
147
b 5'-IIGICGIGICGIGICII II III II III IIII III II III IIII11-3' 50
148
77 a 5'-CACUGCUCAUUCACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-37 50
149
b 3'-IIIIIIIIIGilllllllllGilllllllllGilllllGUGACGAGUAAGUGU-5' 50
150
78 a. 5’-UACAGCAGUCAGUCUCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3' 50
151
b. 5'-l 111 IGi 11111111 IGi 11111111 IGi 111111111AUGUCGUCAGUCAGA-3’ 50
152
79 a. 5’CGAUGACUGACUACGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
153
b. 5'-l 111111 IGi 1111111 IGi 1111111 IGi 1111111IGCUACUGACUGAUGC-3' 50
154
80 a. S’-CACUGAGACUGAUGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
155
b. 5'-l 111 IGi 11111111 IGi 11111111 IGi 11111111IGUGACUCUGACUACG-3’ 50
156
81 a. 5 ’ -CAAGGCAAGCAUUCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
157
b. 5'-IIIIIIIIGillllllllGillllllllGillllllllGUUCCGUUCGUAAGC-3' 50
158
82 a 5 ’-CACUGCUCAUUCACACCCCCCCCCC3CCCCCCCCCC3CCCCCCCC CC3CCCCC-3’ 50
159
b 3'-l 1111111 IGI 1111111 IGI 1111111 IGI 111IGUGACGAGLIAAGUGU-S’ 50
160
83 a 5 ’-UACAGCAGUCAGUCUCCCCCC5CCCCCCCCCC5CCCCCCCCCC3C CCCCCCCC-3’ 50
161
b 3'-l 1111111111111111111111111111111111AUGUCGUCAGUCAGA-S’ 50
162
84 a 5’-CGAUGACUGACUACGCCCCCCCCC3CCCCCCCCC3CCCCCCCCC3 CCCCCCCC-3’ 50
163
b 5'-l 1111111111111111111111111111IGCUACUGACUGAUGC-3' 50
164
85 a 5’-CACUGAGACUGAUGCCCCCCC3CCCCCCCCCC,CCCCCCCCCC?C CCCCCCCC-3’ 50
165
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACUCUGACU ACG-5' 50
166
86 a 5’-CAAGGCAAGCAUUCGCCCCCCCCC3CCCCCCCCC3CCCCCCCCC3 CCCCCCCC-3’ 50
167
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUUCCGUUCGUAAGC-5’ 50
168
87 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCC3CCCCCC3CCCCCC3CCCCCC3CCC CCCiCCCCC-3’ 50
169
b 3'-llllllllllllllllllllllllllllll GUGACCGUCAACUGU-5' 50
170
88 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
171
b 3'-llllllllllllllllllllllllllllll GUGACCGUCAACUGU-5' 50
172
89 a S’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
173
b 3'-llllllllllllllllllllllllllllll GUGACCGUCAACUGU-5' 50
174
90 a 5 ’-GUCCUCAGCGAUAGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
175
b 3'- llllllllllllllllllllllllllllll CAGGAGUCGCUAUCG-5' 50
176
91 a 5 ’ -CAUCGCUCCUCUCCACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
177
b 5'-llllllllllllllllllllllllllllll GUAGCGAGGAGAGGU-3' 50
178
92 a S’-CUCUACCGUUCGCUCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCCC-3’ 50
179
b 5'-l 1111111111111111111111111111IGAGAUGGCAAGCGAG-3' 50
180
93 a 5 ’-CACUGGCAGUUG AC A-HEG- CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3’ 50
181
b 5'-11111111111111111111111111111 l-HEG-GUGACCGUCAACUGU-3' 50
182
94 a 5’-CACUGGCAGUUGACA-HEG-CCCCCCCCCC-HEG- CCCCCCCCCC-HEG-CCCCCCCCCCCCCCC-3’ 50
183
b 5'-l 11111111 l-HEG-l 11111111 l-HEG-l 1111111111111IGUGACCGUCAACUGU-3' 50
184
95 a S'-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC.CCCCC CCCCCCC-3’ 50
185
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
186
96 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
187
b 3'-l 1111111111111111111111111111 IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
SEC ID n°
Long. del n° de compuesto Secuencia Long.
188
97 a 5‘-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
189
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUGACCGUCAACUGU-5' 50
190
98 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
191
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUGACCGUCAACUGU-5' 50
192
99 a S’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
193
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUGACCGUCAACUGU-5' 50
194
100 a 5’CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
195
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUGACCGUCAACUGU-5' 50
196
101 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
197
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUGACCGUCAACUGU-5' 50
198
102 a 5'-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3' 50
199
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
200
103 a S’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
201
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUGACCGUCAACUGU-5' 50
202
104 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCC'CCCCC.CCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
203
b 3'-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUGACCGUCAACUGU-5' 50
204
105 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
205
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5’ 50
206
106 a 5'-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
207
b 3'-l 111111111111111111111111111111111 IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
208
107 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
209
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
210
108 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
211
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5’ 50
212
109 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
213
b 3'-llll 1111111111111111111111111 IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
214
110 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
215
b 3'-l 111111111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
216
111 a S’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
217
b 3'-llll 1111111111111111111111111 IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
218
112 a 5‘-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
219
b S'-llll 1111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5’ 50
220
113 a 5’CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
221
b 3'-l 111111111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5’ 50
222
114 a 5’-CACUGGCAGUUGACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
223
b 3'IIIMIII II III IIII III II III IIII IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
224
115 a 5’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCACUGGC AGUUGACA -3’ 50
225
b 5'-l 11111111111111111111111111111UGUCAACUGCCAGUG-3' 50
226
116 a 3’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCACAGUUGACGGUCACCCCCCCCCCC CCCCCCC-5’ 50
227
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
228
117 a 5 ’-CACUGGCAGUUGACAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUmJUU UUUUUUUUU-3’ 50
229
b 3'-l 111111111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
SEC ID n°
Long. del n° de compuesto Secuencia Long.
230
118 a 5'-CACUGGCAGUUGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAA-3’ 50
231
b 3'-l 11111111111111111111111111111ITI1IGUGACCGUCAACUGU-5’ 50
232
119 a 5'-ACACCCCCCC-3' 10
233
b 3'-IIIIIIIUGU-5' 10
234
120 a 5'-ACACCCCCCCCCCCCCCCCC-3' 20
235
b 3'-l 1111111111111UGU-5' 20
236
121 a. 5’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCC.CCCC-3’ 50
237
b. s'-iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii-s' 50
238
122 a 5’-CACUGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
239
b 3'-ll II III IIII III II III IIII III II III IIII III II III IIIGUGAC-5' 50
240
123 a 5’-CACUGGCAGUCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
241
b 3' 11111111111111111111111111111IGUGACCGUCA-5' 50
242
124 a 5’-CACUGGCAGUUGACACAGGUUCCUCACUUCACAAAUCGUUCA UCGUUCAC-3’ 50
243
b 3’-GUGACCGUCAACUGUGUCCAAGGAGUGAAGUGUUUAGCAAG UAGCAAGUG-5’ 50
244
125 a 5’-CAAUGGCACUUAACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCC-3’ 50
245
b 3'-l 1111111111111111111111111111IGUGACCGUCAACUGU-5' 50
I = inosina; X = glicerol; Y = 1,3-propanodiol; C1 = ara-C; C2 = 5-Me-C; C3 = 5-metilcitidina; G1 = 7-deaza-G; G2 = ara- G; negrita = enlace fosforotioato; subrayado = 2'-metoxi-nucleosido ; HEG = hexaetilenglicol.
5 Los agonistas del TL3 de la invencion pueden formar otras estructuras que incluyen las Formulas XI, XII y XIII.
10
15
imagen28
En cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, se administra a una celula una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un agonista del TLR3 de la invencion para estimular la actividad del TLR3. Esta celula puede ser parte de un cultivo celular, un cultivo de tejido neovascularizado, o parte o la totalidad del cuerpo de un mamffero, como un humano u otro mamffero. La administracion de las composiciones terapeuticas de un agonista del TLR3 de acuerdo con la invencion se puede llevar a cabo utilizando procedimientos conocidos y a dosis y durante periodos de tiempo eficaces para reducir los sfntomas o los marcadores indirectos de la enfermedad, en funcion de la enfermedad y de la respuesta, segun lo determine un experto en la materia. Puede ser deseable administrar simultanea o secuencialmente una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o mas de los agonistas del TLR3 terapeuticos de la invencion a un individuo en un unico episodio de tratamiento. En algunas formas de realizacion ilustrativas de la invencion anteriormente descritas, el agonista del TLR3 de la invencion se administra
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local y/o sistematicamente. El termino "administrado localmente" se refiere a la administracion en una zona o region definida del cuerpo, mientras que el termino "administracion sistemica" indica la administracion en todo el organismo.
En cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, uno o mas de los agonistas o composiciones del TLR3 de acuerdo con la invencion se pueden administrar individualmente o en combinacion con cualquier otro agente que resulte util para tratar la enfermedad o afeccion que no disminuya el efecto inmunoestimulador de los agonistas del TLR3. Otros agentes utiles para prevenir o tratar la enfermedad o afeccion incluyen, entre otros, una o mas vacunas, antfgenos, anticuerpos, agentes citotoxicos, alergenos, antibioticos, oligonucleotidos antisentido, agonistas del TLR, antagonista del TLR, ARNip, miARN, peptidos, protefnas, vectores de terapia genica, vacunas de ADN, adyuvantes o inhibidores de cinasa para mejorar la especificidad o la magnitud de la respuesta inmunitaria, o moleculas coestimuladoras como citocinas, quimiocinas, ligandos de protefna, factores transactivadores, peptidos y peptidos que comprenden aminoacidos modificados. Por ejemplo, en el tratamiento del cancer, se contempla que el agonista del TLR3 o su composicion de acuerdo con la invencion se pueda administrar en combinacion con uno o mas agentes terapeuticos dirigidos y/o anticuerpos monoclonales. Alternativamente, el agente puede incluir vectores de ADN que codifican antfgenos o alergenos. En estas formas de realizacion, el agonista del TLR3 de la invencion puede producir efectos inmunoestimuladores directos. El agonista del TLR3 de la invencion, cuando se administra de forma conjunta con uno o mas tratamientos, puede administrarse simultanea o secuencialmente a dichos tratamientos.
De acuerdo con la invencion, la via de administracion puede ser cualquiera que se considere adecuada, incluyendo de manera no limitativa parenteral, mucosal, oral, sublingual, transdermica, topica, inhalatoria, intranasal, en aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, mediante pistola genica, parche dermico o en forma de colirios o colutorios.
Cuando se administra oralmente una cantidad terapeuticamente eficaz del agonista del TLR3 de la invencion, el TLR3 estara en forma de comprimido, capsula, polvo, solucion o elixir. Cuando se administra en forma de comprimido, la composicion farmaceutica de la invencion puede contener ademas un portador solido, como una gelatina o un adyuvante. El comprimido, la capsula y el polvo contienen aproximadamente de 5 a 95% de oligonucleotido sintetico y preferentemente de 25 a 90% aproximadamente de oligonucleotido sintetico. Cuando se administra en forma lfquida, puede anadirse un portador lfquido como agua, petroleo, aceites de origen animal o vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja, aceite de sesamo o aceites sinteticos. La forma lfquida de la composicion farmaceutica puede contener ademas solucion salina fisiologica, dextrosa u otra solucion de sacarido o glicoles como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma lfquida, la composicion farmaceutica contiene aproximadamente de 0,5 a 90% en peso del oligonucleotido sintetico o de aproximadamente 1 a 50% del oligonucleotido sintetico.
Cuando se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de agonista de TLR3 de la invencion por via parenteral, mucosal, oral, sublingual, transdermica, topica, inhalatoria, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, mediante pistola genica, parche dermico o en forma de colirio o colutorio, el agonista del TLR3 debera estar en forma de solucion acuosa, sin pirogenos y parenteralmente aceptable. La preparacion de estas soluciones parenteralmente aceptables, considerando el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares resultara evidente para el experto en la materia. Una composicion farmaceutica para administracion parenteral, mucosal, oral, sublingual, transdermica, topica, inhalatoria, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, mediante pistola genica, parche dermico o en forma de colirio o colutorio debe contener, ademas del agonista del TLR3, un vehfculo isotonico, como inyeccion de cloruro de sodio, inyeccion de Ringer, inyeccion de dextrosa, inyeccion de dextrosa y cloruro de sodio, inyeccion de lactato de Ringer u otro vehfculo tal y como se conoce en la tecnica. La composicion farmaceutica de la presente invencion tambien puede contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes u otros aditivos conocidos por los expertos en la materia.
Cuando se administra por via parenteral, mucosa oral, sublingual, transdermica, topica, inhalacion, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, mediante pistola genica, parche dermico o en forma de colirio o colutorio, se pueden usar dosis comprendidas entre 0,01% y 10% (peso/volumen). Cuando se administra en forma lfquida, puede anadirse un portador lfquido como agua, petroleo, aceites de origen animal o vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja, aceite de sesamo o aceites sinteticos. La administracion topica puede realizarse por medio de un parche liposomico o transdermico de liberacion temporal.
La cantidad de agonista del TLR3 de la composicion farmaceutica de la presente invencion dependera de la naturaleza y gravedad de la afeccion que se este tratando, y de la naturaleza de los anteriores tratamientos a los que se haya sometido el paciente. Se contempla que las diversas composiciones farmaceuticas puedan contener aproximadamente de 10 a 20 microgramos de oligonucleotido sintetico por kg de peso del cuerpo u organo.
La duracion de la terapia intravenosa utilizando la composicion farmaceutica de la presente invencion variara en funcion de la gravedad de la enfermedad que se este tratando y del estado y de la posible respuesta idiosincratica de cada paciente individual.
Algunas enfermedades se prestan a un tratamiento agudo mientras que otras requieren de un tratamiento a mas
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largo plazo. Tanto las intervenciones agudas de las enfermedades como las de a largo plazo son objetivos que merecen la pena. Las inyecciones de agonistas del TLR3 pueden ser unos medios eficaces para inhibir ciertas enfermedades en una situacion aguda. Sin embargo, en el tratamiento a largo plazo durante un periodo de semanas, meses o anos, deberfa tenerse en cuenta la administracion sistemica (intraperitoneal, intramuscular, subcutanea, intravenosa) sea con portadores tales como solucion salina, polfmeros o liposomas de liberacion lenta.
En algunas enfermedades cronicas, puede resultar preferida la administracion sistemica de los agonistas del TLR3 de la invencion. La frecuencia de las inyecciones oscila entre una infusion continua a una vez al mes, y varias veces al mes o con menos frecuencia, circunstancia que se determinara en funcion de la evolucion de la enfermedad y de la semivida biologica media del agonista del TLR3.
Los agonistas del TLR3 de la invencion resultan tambien utiles para examinar la funcion del TLR3 en una celula o en un mamffero de control, o en un mamffero con una enfermedad asociada al TLR3 o a la estimulacion inmunitaria a traves del TLR3. En esta utilizacion, se administran los agonistas del TLR3 a la celula o al mamffero y se examina la actividad del TLR3.
Sin limitarse a ninguna teorfa ni mecanismo, generalmente se cree que la actividad de los agonistas del TLR3 de acuerdo con la invencion depende de la union del agonista del TLR3 al TLR3, estimulandose de esta forma la actividad del TLR3. Dicha estimulacion en condiciones fisiologicas se mide en la practica observando la actividad descendente (“down-stream”) del TLR3. De este modo, un agonista del TLR3 ilustrativo utilizado de acuerdo con la invencion es capaz de formar un enlace estable con el TLR3, activando el TLR3 e iniciando una cascada de actividad a traves de diversas moleculas senalizadoras.
Los siguientes ejemplos ilustran modos de realizacion y puesta en practica ejemplificativos de la presente invencion. El objeto en los ejemplos no comprendidos en las reivindicaciones es proporcionado unicamente a tftulo comparativo.
Ejemplo 1
Sfntesis de agonistas del TLR3
Se sintetizaron qufmicamente los oligorribonucleotidos inmunomoduladores utilizando la qufmica de la fosforamidita en un sintetizador de ADN/ARN. Se adquirieron monomeros de 2'-O-TBDMS ARN protegidos con TAC (excepto U), A, G, C y U, de Sigma-Aldrich. Se adquirieron monomeros de 7-deaza-G, inosina y loxoribina de ChemGenes Corporation. Se adquirieron 5-etiltio-1 H-tetrazol 0,25 M, anhfdrido de PAC Cap A y Cap B de Glen Research. En el propio laboratorio se prepararon acido tricloroacetico al 3% (TCA) en diclorometano (DCM) y 3H-1,2-benzoditiol-3- ona-1,1-dioxido al 5% (reactivo de Beaucage).
Los oligorribonucleotidos inmunomoduladores se sintetizaron a escala 1-2 pM utilizando un protocolo de sfntesis de ARN normalizado.
Escision y desproteccion de bases
Los oligorribonucleotidos inmunomoduladores se escindieron del soporte solido y se calento la solucion adicionalmente a 65°C para eliminar los grupos protectores de las aminas exocfclicas. La solucion resultante se seco completamente en un equipo SpeedVac.
Purificacion mediante IE HPLC
Los oligorribonucleotidos inmunomoduladores se purificaron mediante HPLC de intercambio ionico.
Columna: Columna Dionex DNAPac 100 (22X250)
Calentador de la columna: Calentador de columna ChromTech TL-105 HPLC, la temperatura se ajusta a 80°C. Tampon A: Tris-HCl 20 mM, pH 7,0, acetonitrilo al 20%
Tampon B: NaCl 3,0 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,0, acetonitrilo al 20%
Caudal: 10 ml/min
Gradiente:
0-2 min: 0% de B 2-11 min: 0% de B a 35% de B 11-41 min: 35% de B a 90% de B 41-45 min: 100% de B
La solucion de oligorribonucleotidos inmunomoduladores se inyecto en el HPLC. Se llevo a cabo el anterior gradiente y se recogieron las fracciones. Se mezclaron todas las fracciones que contenfan mas de 90% del producto
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deseado y, a continuacion se concentro la solucion hasta casi sequedad mediante un equipo RotoVap. Se anadio agua exenta de ARNasa para preparar un volumen final de 10 ml.
Desalacion en C-18 de fase invertida
El cartucho CC-18 Sep-Pak adquirido de Waters se acondiciono en primer lugar con 10 ml de acetonitrilo seguido por 10 ml de acetato de sodio 0,5 M. Se cargaron 10 ml de la solucion del oligorribonucleotido inmunomodulador. A continuacion se utilizaron 15 ml para lavar la sal. El oligorribonucleotido inmunomodulador se eluyo finalmente mediante 1 ml de acetonitrilo al 50% en agua.
La solucion se coloco en un equipo SpeedVac durante 30 minutos. La solucion restante se filtro a traves de un filtro de 0,2 micrometros y a continuacion se liofilizo hasta sequedad. A continuacion, el solido se volvio a disolver en agua para preparar la concentracion deseada. La solucion final se almaceno por debajo de 0°C.
Electroforesis capilar
Instrumento: Beckman 5010
Capilar: Capilar para ADNmc de 62 cm
Preparacion de la muestra: Un compuesto SIMRA con una DO de 0,2 se disolvio en 200 ul de agua exenta de ARNasa.
Inyeccion: inyeccion electrocinetica a 5 KV durante 5 segundos.
Condiciones de funcionamiento: 14 KV durante 50 minutos a 30°C.
Analisis mediante HPLC de intercambio ionico
Columna: Precolumna Dionex DNAPac (22X250)
Calentador de la columna: Calentador de columna ChromTech TL-105 HPLC, la temperatura se ajusta a 80°C. Tampon A: Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, acetonitrilo al 20%
Tampon B: LiCl 2,0 M, Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, acetonitrilo al 20%
Caudal: 2 ml/min
Gradiente:
0-2 min: 0% de B
2-10 min: 0% de B a 100% de B
10-15 min: 100% de B
Analisis PAGE
Un oligorribonucleotido inmunomodulador con una DO de 0,3 se cargo en un gel de poliacrilamida al 20% y se hizo avanzar a una potencia constante de 4 vatios durante aproximadamente 5 horas. Se observo el gel con luz Uv a una longitud de onda corta.
Ejemplo 2
Cultivos de celulas HEK293:
Las celulas HEK293 que expresan de manera estable el TLR3 humano y el plasmido pNifty-2 que contiene el gen informante SEAP se adquirieron a partir de Invivogen. Las celulas se conservaron en un medio Eagle modificado por Dulbecco con suero fetal bovino (FBS) al 10% y 10 pg/ml de blasticidina y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina.
Para el ensayo de transfeccion transitoria, las celulas se tripsinizaron y se sembraron durante una noche en DMEM con FBS (sin antibioticos) en placas de 48 pocillos. Al dfa siguiente, se anadieron a cada pocillo de la placa de cultivo celular alfcuotas de 25 pl de la mezcla de ADN plasmido/lipofectamina2000 que contenfa 100 ng de ADN plasmido y 1 pl de lipofectamina. Se anadieron a los cultivos compuestos del agonista del TLR3, y se continuaron los cultivos durante 18 horas. Al final del tratamiento, se tomaron 20 pl de sobrenadante del cultivo de cada tratamiento y se usaron para el ensayo SEAP siguiendo el protocolo del fabricante (Invivogen).
Ensayo SEAP:
La actividad de SEAP se cuantifico utilizando el sustrato Quanti Blue Detection (Invivogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A 20 pl de sobrenadante del cultivo en una placa de 96 pocillos se le anadieron 150 pl
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del sustrato de deteccion SEAP. Las muestras se ensayaron por duplicado. Las placas se incubaron a 37°C durante 30-40 minutos y se leyeron a 620-655 nm. Los resultados se expresan como el % de la actividad maxima (agonista) de NF-kB.
Ensayo de celulas J774:
Se conservaron macrofagos J774 murinos (BIM-67, ATCC) en un medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con FBS al 10% (v/v) y antibioticos (100 U/ml de penicilina y estreptomicina). En los experimentos, las celulas se sembraron en placas a una densidad de 7 x 105celulas/ml en placas de 48 pocillos y se dejaron unir durante la noche. Al dfa siguiente las celulas se trataron con el agonista durante 18 horas y a continuacion se recogieron los sobrenadantes para medir la produccion de citocinas mediante ELISA (IL-6, IL-12, IFNp), segun instrucciones del fabricante (BD Biosciences, PBL, respectivamente).
Cultivos de PBMC y de celulas dendriticas mieloides humanas:
Se aislaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de sangre recien extrafda de voluntarios sanos (Research Blood Components, Brighton, MA) mediante un procedimiento de centrifugacion en gradiente de densidad de Ficoll (Ficoll-Paque PLUS, GE Health Care).
Las celulas dendriticas mieloides CD1c (BDCA-1)+ humanas se aislaron de las PBMC en dos etapas de separacion magnetica que implican el agotamiento de las celulas B CD19+ y la seleccion positiva de las celulas CD1c (BDCA-1)+ (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El medio de cultivo usado para el ensayo consistio en un medio RPMI 1640 suplementado con glutamina 1,5 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoacidos no esenciales 0,1 mM, 50 pM 2-mercaptoetanol, mezcla de penicilina- estreptomicina 100 IU/ml y 10% de suero bovino fetal inactivado con calor (Hyclone).
Mediciones de citocinas:
Se cultivaron PBMC (5 x 106 celulas/ml) y mDCS (1 x 106 celulas/ml) en placas de fondo plano de 96 pocillos y a continuacion se estimularon con un agonista durante un periodo de 24 horas. Las celulas no estimuladas sirvieron como control.
Al final del periodo de incubacion se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron congelados hasta el momento del ensayo mediante multiplex con el sistema Luminex. Se utilizo un kit de microesferas de citocinas humanas con un panel de 25 pruebas (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados de las celulas tratadas como en el Ejemplo 2 se muestran en las figuras 2A, 2B, 4, 5, 6, 7, 10 u 11, y en las Tablas 3, 4, 5A, 5B, 5C, 5D, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13.
Tabla 3.
Compuesto n°
Citocina/quimiocina, pg/ml (+/- SD)
IL-1Ra
IL-8 MI P-1 p IP-10 MCP-1
27
667 (220) 1034 (31) 20 (4) 595 (133) 200 (4)
29
269 (46) 113 (7) 5 (6) 466 (81) 39 (7)
30
617 (14) 106 (2) 15 (2) 713 (126) 83 (6)
31
131 (40) 265 (17) 17 (2) 39 (7) 17 (1)
PBS
40 (16) 127 (24) _6_(4)__________ 11 (4) 50 (65)
A una concentracion de 250 pg/ml de los compuestos. Tabla 4.
Compuesto n°
Citocina/quimiocina, pg/ml (+/-SD)
IL-1Ra
IL-6 IL-8 MIP-1a MI P-1 p IP-10 MCP-1
27
1057 (38) 257 (6) 21907 (526) 299 (8) 955 (7) 2936 (79) 7929 (698)
29
1249 (40) 113 (1) 9618 (35) 129 (4) 521 (0) 4568 (80) 6548 (138)
30
1058 (113) 157 (12) 12007 (388) 123 (9) 489 (14) 2438 (185) 3538 (210)
31
544 (45) 115 (5) 17607 (575) 48 (3) 224 (5) 326 (15) 1189 (38)
PBS
288 (0) 42 (1) 2875 (52) 0(0)_____ 79 (2)___ 41 (0) 68 (0)
A una concentracion de 250 pg/ml de los compuestos.
Tabla 5A.
Compuesto Incremento en veces en la actividad de NF-kB
Medio
1,0
1
0,8
3
1,3
4
1,0
5
0,9
6
1,0
12
1,7
13
1,0
24
1,0
5 La concentracion de los compuestos fue de 250 pg/ml. Los datos mostrados representan dos experimentos diferentes.
Tabla 5B.
Compuesto
Incremento en veces en la actividad de NF-kB
Medio
1 ,0
8
1 ,0
14
1 ,2
18
1 ,2
20
1 ,2
21
1 ,2
22
1 ,1
23
1 ,2
10
La concentracion de los compuestos fue de 50 pg/ml. Los datos mostrados representan dos experimentos diferentes.
Tabla 5C.
15
Compuesto Incremento en veces en la actividad de NF-kB
Medio
1,0
9
1,6
10
1,5
11
1,8
La concentracion de los compuestos fue de 100 pg/ml. Los datos mostrados representan dos experimentos diferentes.
20 Tabla 5D.
Compuesto Incremento en veces en la actividad de NF-kB M 1,0
_16__________0,6__________________________________
La concentracion de los compuestos fue de 150 pg/ml. Los datos mostrados representan dos experimentos diferentes.
25
Tabla 6.
N° de compuesto
Incremento en veces en la actividad de NF-kB
Medio
1, ,0
36
0 93
37
1 33
38
5 50
41
3 64
42
5, ,20
La concentracion de los compuestos fue de 250 pg/ml. Los datos mostrados representan dos experimentos 30 diferentes.
5
10
15
20
25
Tabla 7.
N° de compuesto
IL-6 (pg/ml) IL-12 (pg/ml) IP-10 (pg/ml) IFN-8(pg/ml)
Medio
0 51,3 0 1,2
36
0 97,3 0 0
37
1004,7 313,1 16583 76,8
38
1114,1 223,5 20361 94,3
41
1271,3 352,9 17900 101,2
42
1359,5 315,4 19493 121,5
La concentracion de los compuestos fue de 250 pg/ml. Los datos mostrados representan dos experimentos diferentes.
Tabla 8.
N° de compuesto
IL-6 (pg/ml) IL-12 (pg/ml) IP-10 (pg/ml) IFN-8(pg/ml)
Medio
0 85,1 0 0
43
175,8 287,2 18724 36,5
44
137,0 145,8 13923 0
45
3313,4 3236,6 19175 1416,2
46
5672,4 8599,6 18398 446,5
47
9,44 114,2 9281,5 0
48
2 110,5 8187,5 0
49
11,9 118,8 157,3 0
50
135,4 153,9 14871 68,8
La concentracion de los compuestos fue de 250 pg/ml. Los datos mostrados representan dos experimentos diferentes.
Tabla 9.
N° de compuesto
IL-6 (pg/ml) IL-12 (pg/ml) IP-10 (pg/ml) IFN-8(pg/ml)
Medio
11,2 117,2 54,7 0
51
2432,7 1319,4 32923 533,5
52
1296,6 113,3 676833 7,9
53
32,0 133,8 12764 0
54
11,9 114,3 563,4 0
55
11,9 99,0 206,0 0
56
4177,5 1838,0 80034 1037,3
57
27,4 129,0 5424,3 0
La concentracion de los compuestos fue de 250 pg/ml. Los datos mostrados representan dos experimentos diferentes.
Tabla 10.
N° de compuesto
IL-6 (pg/ml) IL-12 (pg/ml) IP-10 (pg/ml) IFN-8(pg/ml)
Medio
22,3 149,2 109,4 0
61
22,3 137,8 249,1 3,59
62
966,2 294,4 21736 3,08
63
61,1 141,2 6239,7 0
La concentracion de los compuestos fue de 250 pg/ml. Los datos mostrados representan dos experimentos diferentes.
Tabla 11.
N° de compuesto
IL-6 (pg/ml) IL-12 (pg/ml) IP-10 (pg/ml) IFN-8(pg/ml)
Medio
22,3 149,2 109,4 0
64
18,9 119,1 179,8 0
65
32,1 14,5 0 -
66
233,7 168,2 14256,8 0
67
18,9 128,8 244,3 0
68
1379,4 171,4 33076,8 1,43
La concentracion de los compuestos fue de 250 pg/ml. Los datos mostrados representan dos experimentos diferentes.
5 Tabla 12.
N° de compuesto
IL-1Ra (pg/ml) IL-12 (pg/ml) IP-10 (pg/ml) MCP-1 (pg/ml)
Medio
8,0 0,6 3,8 3,2
36
79,6 26,8 16,9 19,8
37
343,0 32,7 51,8 1955,2
38
151,9 34,9 102,4 44,3
41
1440,3 45,1 1526,0 895,0
42
2482,8 125,2 150,6 34655
La concentracion de los compuestos fue de 300 pg/ml. Los datos mostrados representan dos experimentos diferentes.
10
Tabla 13.
N° de compuesto
IL-1Ra (pg/ml) IL-6 (pg/ml) IP-10 (pg/ml) MCP-1 (pg/ml)
Medio
91,5 10,6 0 0
36
58,8 17,3 23,7 27,0
37
344,2 18,7 458,7 321,6
38
1390,7 538,2 1291,6 7251,5
41
962,0 326,1 1001,2 8959,4
42
1237,1 367,3 2257,4 7263,4
La concentracion de los compuestos fue de 300 pg/ml. Los datos mostrados representan dos experimentos 15 diferentes.
Ejemplo 3
Modelo de secrecion de citocinas in vivo en raton tratado con compuestos del agonista del TLR3
20
Se obtuvieron ratones C57BL/6 de 5-6 semanas de Taconic Farms, Germantown, NY, y se mantuvieron segun los protocolos para animales aprobados por el IACUC de Idera Pharmaceutical. A los ratones (n = 2 o 3) se les inyectaron por via subcutanea (s.c) unos agonistas individuales del TLR3 de la invencion a 5 mg/kg, 10 mg/kg o 25 mg/kg (dosis unica). Los animales sin tratamiento previo (“naive”) no fueron tratados con un agonista del TLR3. Los 25 animales de control se trataron con 25 mg/kg de poli(I:C). El suero se recogio por sangrado retroorbital 2 horas despues de la administracion del agonista del TLR3 y se determinaron los niveles de citocina y quimiocina mediante ensayos ELISA o multiplex de Luminex. Los resultados se muestran en la tabla 14 y en las figuras 8 y 9 y demuestran que la administracion in vivo de los agonistas del TLR3 de la invencion genera perfiles unicos de citocinas y quimiocinas in vivo. Todos los reactivos, con inclusion de citocinas, quimiocinas, anticuerpos y patrones, 30 se adquirieron en PharMingen. (San Diego, CA).
Tabla 14.
N° de compuesto_______IL-12 (pg/ml)
Sin tratamiento previo
67,1
36
1142,6
37
5093,1
38
4925,0
41
3638,4
42
11902
35 A los ratones se les administraron dosis de 25 mg/kg del compuesto de agonista del TLR3. Los ratones sin tratamiento previo se trataron con solucion salina.
Ejemplo 4
40 Modelo de secrecion de citocinas in vivo en raton tratado con compuestos del agonista del TLR3
Se obtuvieron ratones C57BL/6 de 5-6 semanas de Taconic Farms, Germantown, NY, y se mantuvieron segun los protocolos para animales aprobados por el IACUC de Idera Pharmaceutical. A los ratones (n = 3) se les inyectaron por via subcutanea (s.c) unos agonistas individuales del TLR3 de la invencion a 5 mg/kg, 10 mg/kg (dosis unica).
5
10
15
20
25
Los animales sin tratamiento previo no fueron tratados con un agonista del TLR3. Los animales de control se trataron con 25 mg/kg de poli(I:C). El suero se recogio por sangrado retroorbital 2 horas despues de la administracion del agonista del TLR3 y se determinaron los niveles de citocinas mediante un ensayo ELISA. Los resultados se muestran en la tabla l5 y demuestran que la administracion in vivo de agonistas del TLR3 de la invencion genera una estimulacion del TLR3 unica, produciendo concentraciones inducidas de IL-12 in vivo. Todos los reactivos, con inclusion de citocinas, quimiocinas, anticuerpos y patrones, se adquirieron en PharMingen (San Diego, CA).
Tabla 15.
N° de compuesto_______IL-12 (pg/ml)
Sin tratamiento previo
621,5
39
10078
40
32388
43
35655
44
51066
45
33699
46
24979
47
535,2
48
1311,9
49
181,2
50
41085
51
8470
52
2091
53
416,7
54
329,7
55
331,6
56
10874
57
2948
58
845,9
59
1704
60
928,8
61
535,2
62
41,1
63
221,1
A los ratones se les administraron dosis de 10 mg/kg del compuesto de agonista del TLR3. Los ratones sin tratamiento previo se trataron con solucion salina.
Ejemplo 5
Modelo de secrecion de citocinas in vivo en raton tratado con compuestos del agonista del TLR3
Se obtuvieron unos ratones C57BL/6 de 5-6 semanas de Taconic Farms, Germantown, NY, y se mantuvieron segun los protocolos para animales aprobados por el IACUC de Idera Pharmaceutical. A los ratones (n = 2) se les inyectaron por via subcutanea (s.c) unos agonistas individuales del TLR3 de la invencion a 10 mg/kg (dosis unica). Los animales sin tratamiento previo no fueron tratados con un agonista del TLR3. Los animales de control se trataron con 25 mg/kg de poli(I:C). El suero se recogio por sangrado retroorbital 2 horas despues de la administracion del agonista del TLR3 y se determinaron los niveles de citocinas mediante un ensayo ELISA. Los resultados se muestran en las figuras 12 y 13 y demuestran que la administracion in vivo de los agonistas del TLR3 de la invencion genera una estimulacion del TLR3 unica, produciendo unas concentraciones inducidas de IL-12 in vivo. Todos los reactivos, con inclusion de citocinas, quimiocinas, anticuerpos y patrones, se adquirieron a PharMingen. (San Diego, CA).

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Agonista de TLR3 sintetico que comprende
    i) un primer oligorribonucleotido que presenta la estructura: 5'-Dominio A-Dominio B-3'; y
    ii) un segundo oligorribonucleotido que presenta la estructura: 5'-Dominio C-Dominio D-3',
    en el que el Dominio A es un primer dominio complementario, el Dominio B es un dominio de polirriboinosina, el Dominio C es un segundo dominio complementario y el Dominio D es un dominio de polirribocitidina, en el que el Dominio A y el Dominio C son complementarios entre si, y en el que el primer oligorribonucleotido y el segundo oligorribonucleotido se unen entre si mediante enlace de hidrogeno intermolecular entre (i) los dominios complementarios dejando un dominio de polirriboinosina libre y un dominio de polirribocitidina libre o (ii) entre los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina dejando un primer dominio complementario libre y un segundo dominio complementario libre, y en el que los primer y/o segundo oligorribonucleotidos adicionales pueden unirse a los dominios complementarios y/o de polirriboinosina o polirribocitidina libres, creando asf una cadena de oligorribonucleotidos,
    en el que el dominio de polirriboinosina comprende opcionalmente uno o mas sitios de union de fuerza, en el que una o mas guanosinas son sustituidas por inosina en el dominio de polirriboinosina.
  2. 2. Agonista de TLR3 sintetico que comprende
    i) un primer oligorribonucleotido que presenta la estructura: 5'-Dominio B-Dominio A-3'; y
    ii) un segundo oligorribonucleotido que presenta la estructura: 5'-Dominio D-Dominio C-3',
    en el que el Dominio A es un primer dominio complementario, el Dominio B es un dominio de polirriboinosina, el Dominio C es un segundo dominio complementario y el Dominio D es un dominio de polirribocitidina, en el que el Dominio A y el Dominio C son complementarios entre si, y en el que el primer oligorribonucleotido y el segundo oligorribonucleotido se unen entre si mediante enlace de hidrogeno intermolecular entre (i) los dominios complementarios dejando un dominio de polirriboinosina libre y un dominio de polirribocitidina libre o (ii) entre los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina dejando un primer dominio complementario libre y un segundo dominio complementario libre, y en el que los primer y/o segundo oligorribonucleotidos adicionales pueden unirse a los dominios complementarios y/o de polirriboinosina o polirribocitidina libres, creando asf una cadena de oligorribonucleotidos,
    en el que el dominio de polirriboinosina comprende opcionalmente uno o mas sitios de union de fuerza, en el que una o mas guanosinas son sustituidas por inosina en el dominio de polirriboinosina.
  3. 3. Agonista de TLR3 segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el dominio de polirriboinosina comprende uno o mas sitios de union de fuerza.
  4. 4. Agonista de TLR3 segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que uno o mas atomos de hidrogeno en el primer y/o el segundo oligorribonucleotido se reemplazan por un atomo de deuterio mediante un intercambio deuterio-hidrogeno.
  5. 5. Agonista de TLR3 segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los primer y segundo dominios complementarios son de 10 a 20 nucleotidos de longitud y los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina son de 30 a 40 nucleotidos de longitud.
  6. 6. Agonista de TLR3 segun la reivindicacion 5, en el que los primer y segundo dominios complementarios son de 15 nucleotidos de longitud y los dominios de polirriboinosina y polirribocitidina son de 35 nucleotidos de longitud.
  7. 7. Composicion que comprende un agonista de TLR3 segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y una o mas vacunas, antfgenos, anticuerpos, agentes citotoxicos, alergenos, antibioticos, oligonucleotidos antisentido, agonista de TLR, antagonista de TLR, ARNip, miARN, peptidos, protefnas, vectores de terapia genica, vacunas de ADN, adyuvantes, inhibidores de cinasa, moleculas coestimuladoras.
  8. 8. Composicion que comprende un agonista de TLR3 segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una composicion segun la reivindicacion 7 y un portador fisiologicamente aceptable.
  9. 9. Agonista de TLR3 segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o composicion segun la reivindicacion 7 u 8 para su utilizacion en un procedimiento para estimular la actividad de TLR3 que comprende poner en contacto TLR3 con el agonista de TLR3 o la composicion.
  10. 10. Agonista de TLR3 segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o composicion segun la reivindicacion 7 u 8 para estimular la actividad de TLR3 en un mamffero.
  11. 11. Agonista de TLR3 segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o composicion segun la reivindicacion 7 u 8 para estimular la respuesta inmunitaria mediada por TLR3 en un mamffero.
    5 12. Agonista de TLR3 segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o composicion segun la reivindicacion 7 u 8
    para tratar un mamffero que presenta una enfermedad o un trastorno cuyo tratamiento puede ser mediado mediante TLR3.
  12. 13. Agonista de TLR3 segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o composicion segun la reivindicacion 7 u 8 10 para prevenir una enfermedad o un trastorno, cuya prevencion puede ser mediada por TLR3, en un mamffero en
    riesgo de contraer/desarrollar dicha/o enfermedad o trastorno.
  13. 14. Vacuna que comprende un agonista de TLR3 segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un antfgeno y un portador fisiologicamente aceptable.
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