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ES2618831T3 - Métodos para predecir la viabilidad de un embrión de mamífero - Google Patents

Métodos para predecir la viabilidad de un embrión de mamífero Download PDF

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ES2618831T3
ES2618831T3 ES12735601.2T ES12735601T ES2618831T3 ES 2618831 T3 ES2618831 T3 ES 2618831T3 ES 12735601 T ES12735601 T ES 12735601T ES 2618831 T3 ES2618831 T3 ES 2618831T3
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Anna AJDUK
Chris Graham
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Cambridge Enterprise Ltd
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Abstract

Un método in vitro de valoración del potencial de desarrollo de un embrión de mamífero, por ejemplo, un embrión de mamífero que ha sido fecundado in vitro, comprendiendo el método (a) tomar mediciones de los movimientos citoplasmáticos en el embrión en la fase de una célula y, opcionalmente tomar más mediciones adicionales de cambios periódicos en la forma del embrión en la fase de una célula y (b) usar las mediciones para predecir el potencial de desarrollo del embrión.

Description

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Descripción detallada de la invención
El término “embrión” es usado en esta memoria para referirse a un organismo mamífero a partir de la fase más temprana que comienza con un óvulo fecundado unicelular. Un óvulo se fecunda en la fusión con un espermatozoide. El óvulo puede haber sido fecundado in vitro para obtener el embrión. Los embriones unicelulares son células vivas.
Los métodos de la invención se pueden aplicar a embriones de cualquier especie de mamífero adecuada, tal como: primates, incluyendo seres humanos, grandes simios (por ejemplo, gorilas, chimpancés, orangutanes), monos del viejo mundo, monos del nuevo mundo; roedores (por ejemplo, ratones, ratas, cobayas, hámster); gatos; perros; lagomorfos (incluyendo conejos); vacas; ovejas; cabras; caballos; cerdos; y cualquier otro mamífero de ganado, agrícola, de laboratorio o doméstico. Aunque el trabajo descrito en los Ejemplos se lleva a cabo en ratones, los resultados preliminares indican que un mismo patrón de movimientos citoplasmáticos también se da en embriones unicelular humanos.
El “potencial de desarrollo”, de un embrión de mamífero es una medida de la calidad del embrión. Es una medida de la capacidad del embrión para desarrollarse posteriormente con éxito. El desarrollo con éxito puede ser durante un periodo de tiempo definido o bajo condiciones particulares, por ejemplo, después del crecimiento en cultivo o después de transferencia del embrión a un receptor materno. La transferencia a un receptor materno significa la transferencia de un embrión en una madre aspirante con el objetivo de un embarazo resultante. La madre puede ser el donante o la fuente de los óvulos (gametos femeninos) que dan origen al embrión o puede ser una madre subrogada.
Una predicción del potencial de desarrollo de un embrión es una predicción de la capacidad del embrión para desarrollarse posteriormente con éxito. Una predicción del potencial de desarrollo puede comprender una predicción de si el embrión tiene la capacidad de desarrollarse a una fase particular. Los ejemplos son una predicción de que un embrión alcanzará la fase de blastocisto si crece en cultivo, o que un embrión se desarrollará a la fase de gástrula o a término completo después de la transferencia del embrión al receptor materno. La predicción puede comprender una probabilidad determinada de que el embrión alcanzará una fase particular de desarrollo, o la probabilidad de que se alcanzará una fase particular del desarrollo dentro de un periodo de tiempo definido. Por ejemplo, la predicción puede definir la probabilidad de que un embrión alcanzará la fase de blastocisto después de 4 días de crecimiento en cultivo. No es necesario que el embrión se cultive posteriormente de acuerdo con la predicción. En su lugar, el embrión se puede transferir a un receptor materno. La predicción puede comprender una predicción de la fase de desarrollo que el embrión alcanzará después de un periodo de tiempo definido. Un ejemplo es una predicción del número de células que un embrión tendrá después de un periodo de tiempo en cultivo, por ejemplo, después de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más días de crecimiento en cultivo.
En algunos casos la predicción del potencial de desarrollo está basado en las mediciones de los movimientos citoplasmáticos en el embrión y/o cambios periódicos en la forma del embrión solos. En otras realizaciones la predicción de la predicción de desarrollo se basa en estas mediciones junto con otros parámetros que son conocidos por ser predictivos del éxito del desarrollo. Por ejemplo, después de tomar mediciones de los movimientos citoplasmáticos y/o cambios periódicos en la forma del embrión en el embrión unicelular, el embrión posteriormente se puede cultivar y además usar el grado del desarrollo y/o morfología del embrión en cultivo en la valoración del potencial de desarrollo del embrión.
El término “movimiento citoplasmático” se refiere a las dinámicas de fluido del citoplasma. El citoplasma es la fase fluida en un embrión unicelular. No hay núcleo convencional en un óvulo no fecundado o fecundado hasta que se descondensa el complemento cromosómico haploide de la segunda división de la meiosis femenina y adquiere una envuelta nuclear y, para óvulos fecundados, hasta que la cromatina del espermatozoide llega a asociarse correctamente con histonas y se encapsula con una envuelta nuclear. Tal formación de los pronúcleos femeninos y masculinos son anteriores a la primera división celular embrionaria. Los movimientos citoplasmáticos descritos en el presente documento se dan hasta el momento de la formación de pronúcleos.
El término “promedio” tal como es usado en esta memoria se refiere a una medida de la tendencia central. “Promedio” abarca la media y la mediana.
La “velocidad citoplasmática promedio” significa la velocidad promedio en cualquier tiempo particular medida en un solo plano a través del embrión unicelular o en el propio citoplasma, por ejemplo, medido en una serie de planos a través de toda la célula.
Los inventores han mostrado que antes de la fecundación, el movimiento citoplasmático en un óvulo de ratón es lento y relativamente homogéneo. La fecundación desencadena incrementos y descensos periódicos drásticos en la velocidad de los movimientos citoplasmáticos en el óvulo. Estos flujos citoplasmáticos bruscos, periódicos y transitorios son distintos de los movimientos de velocidad menor que se dan entremedias y en el presente documento reciben el nombre de “picos de velocidad”.
El término “movimientos de después” se refiere a los movimientos citoplasmáticos que se pueden dar
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las cuestiones que luchamos en abordar, valoramos la significancia estadística al nivel 5 %. Para determinar las relaciones entre la velocidad basal media o el intervalo medio entre los picos de velocidad y el número total de las células producidas después de 4 días de desarrollo (es decir, el recuento celular del día cuatro), ajustamos modelos binomiales negativos a los recuentos celulares de los embriones, con una función de unión logarítmica que relaciona el recuento celular medio con la combinación lineal de las variables explicativas: la velocidad basal media, el cuadrado de la velocidad basal media, el intervalo medio entre picos de velocidad, el cuadrado del intervalo medio entre picos de velocidad, y las diversas interacciones entre las variables de la velocidad basal y los picos de velocidad. En nuestro análisis inicial tomamos en cuenta los efectos de distorsión potencial del sistema de toma de imagen usado (Zeiss o Deltavision) sobre el desarrollo del embrión. Sin embargo, puesto que encontramos que la interacción entre los parámetros analizados, el efecto cuadrático del intervalo medio entre picos de velocidad y el sistema de imagen, no era estadísticamente significativa y no contribuía a ninguna fuerza explicativa adicional, los suprimimos en nuestro análisis final. El ensayo de la relación de probabilidad del modelo completo con todas las variables anteriormente mencionadas incluidas en comparación con el modelo final produjo un cambio no estadísticamente significativo en el log-probabilidad (p=0,53). El diseño binomial negativo del recuento celular se eligió sobre el diseño de regresión Poison más estándar del recuento celular para representar la variación observada en los datos del recuento celular51.
Para investigar la relación entre las mimas variables explicativas que se describieron anteriormente y la probabilidad de que un cigoto se desarrolle en un blastocisto (es decir, alcance al menos la fase de 32 células), también analizamos nuestros datos ajustando los modelos de regresión logística después de dicotomizar el número total de células producidas después de 4 días de desarrollo en una variable binaria que indica si el recuento celular total excede o no 31 células. El modelo logístico final incluía las mismas variables explicativas que aquellas en el modelo binomial negativo final. El ensayo de la relación de probabilidad del modelo completo frente al modelo fina produjo un cambio no estadísticamente significativo en el log-probabilidad (p=0,30).
Ejemplo 1
La fecundación del óvulo de ratón da como resultado estallidos del movimiento citoplasmático rítmico
Para caracterizar los movimientos citoplasmáticos tras la fecundación del óvulo de ratón y para evaluar si, y si es así, cómo, se relacionan con otros sucesos asociados a la fecundación, primero filmamos los óvulos desde el momento inmediatamente después de la fecundación hasta la formación de pronúcleos. A continuación, usamos análisis de imagen avanzado basado en el método de PIV21,24 para analizar y cuantificar estos movimientos (Fig. 1A). Esto reveló que la fecundación del óvulo de ratón fue seguida por incrementos y descensos periódicos drásticos en la velocidad de los movimientos citoplasmáticos (que denominamos picos de velocidad; Fig. 1B-D, n=55 ovocitos no fecundados y n=125 óvulos fecundados in vivo). Esta secuencia de movimientos repetitivos rápidos por todo el citoplasma del óvulo duró aproximadamente 4 horas, hasta la formación de pronúcleos. Los picos de velocidad inicialmente eran de relativamente baja amplitud (entre anafase de meiosis II y protuberancia de FC temprana; Fase 1); pero posteriormente desarrollaron amplitudes significativamente mayores cuando el FC se extendió por completo (Fase 2). Finalmente, su amplitud descendió durante y después de la regresión de FC (Fase 3) (Fig. 1B, D, Tabla 1). En la Fase 2 los movimientos citoplasmáticos rápidos eran mayores en el plano que corta el FC ecuatorialmente y llegaron a ser más lentos en los planos más periféricos (Fig. 9). El análisis de PIV reveló que cada pico de velocidad era seguido por movimientos de después que normalmente persistían durante más de 4 min y eran de menor amplitud. Los movimientos durante la Fase 3 eran excepciones a esta regla en la que los picos de velocidad eran con frecuencia menos distintos que los movimientos de después (Fig. 1D, Tabla 1). Además, notamos que la fecundación conducía a un incremento mayor del doble en la velocidad citoplasmática media basal (la velocidad durante los intervalos inter-pico o después del último pico registrado) en comparación con el nivel restante de ovocitos no fecundados (Fig. 1C-D, Tabla 2).
Nuestro análisis reveló que durante la Fase 1, los vectores de estos movimientos citoplasmáticos bruscos tendieron a ser hacia el desarrollo del segundo PB (17/25 picos de velocidad, 11 cigotos). Esto cambió direccionalmente durante la Fase 2 de manera que los vectores estaban directamente hacia el FC o algunas veces ligeramente desplazados hacia el segundo PB (64/65 picos de velocidad, 19 cigotos). No había patrón persistente durante los movimientos de después de baja magnitud o intervalos inter-pico en ninguna de estas fases. En la Fase 3 direccionalmente o cualquier patrón de los picos de velocidad no era más aparente (Fig. 1E, Tabla 4). Estos picos de velocidad cesaron después de la regresión de FC cuando se observaron los pronúcleos en la mayoría de los cigotos (46/63, 77,8 %) (Fig. 1D). Por tanto, nuestros resultados indican que la fecundación del óvulo de ratón desencadena picos de velocidad de movimientos citoplasmáticos que en su mayor fuerza están dirigidos hacia la formación de FC por encima del sitio de entrada de espermatozoide.
Ejemplo 2
Los picos de velocidad citoplasmática de alta amplitud se correlacionan con las pulsaciones del FC y dependen del citoesqueleto de actomiosina
Puesto que la dirección de los movimientos bruscos de la Fase 2 sugirieron que el FC podría estar implicado en su generación, después examinamos la morfología del FC por todo este periodo (69 picos de velocidad, 14 cigotos).
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Tabla 3
Amplitudes medias de picos de velocidad y después de movimientos de después en embriones obtenidos por ICSI o por activación con SrCl2
Embriones obtenidos
Fases post-fecundación Amplitud media de picos Amplitud media de
por:
de velocidad movimientos de después
+/-s.d. (nm/s)
+/-s.d. (nm/s)
ICSI bajo la corteza
Fase 1* (6 cigotos, 9 picos) 19,5 +/-11,1 10,7 +/-5,9
Fase 2 (14 cigotos, 66 picos) Fase 1 prolongada‡ (14
34,1 +/-15,4 32,3 +/-15,7 12,8 +/-5,0 12,5 +/-5,1
cigotos, 75 picos)
ICSI dentro del
Fase 3 (16 cigotos, 28 picos) Fase 1 prolongada‡ (31 14,3 +/-9,4 14,6 +/-8,2# 13,6 +/-4,9 10,5 +/-14,7
citoplasma central
cigotos, 209 picos)
Activación con SrCl2§ ICSI con el espermatozoide inactivado y
Fase 3 (31 cigotos, 37 picos) Fase 1 prolongada‡ (45 partenotes, 337 picos†) Fase 1 (10 cigotos, 30 picos) Fase 2 (16 cigotos, 71 picos) Fase 3 (19 cigotos, 71 picos) 10,3 +/-6,8 7,4 +/-4,0#,‖,¶ 8,8 +/-8,8‖ 8,6 +/-5,4# 7,1 +/-4,3# 12,4 +/-3,5 7,7 +/-2,9#,** 7,9 +/-3,0 10,1 +/-3,5#,‡‡ 13,0 +/-7,0
activación con SrCl2
*Las fases post-fecundación están descritas en el texto principal.
‡La fase 2 (es decir, FC completamente formado) no estaba presente en óvulos inyectados con espermatozoide dentro del citoplasma central o óvulos activados con SrCl2, por tanto, el nombre de “Fase 1 prolongada” se refiere al periodo entre el comienzo de la formación de 2PB y la formación de pronúcleos.
†En el caso de óvulos activados con SrCl2, se muestra un número total de picos de velocidad y, si los picos de velocidad estaban ausentes, movimientos de después.§Picos de velocidad y movimientos de después parados en óvulos activados con SrCl2 antes de que los pronúcleos lleguen a ser visibles, por tanto, la Fase 3 no está analizada.#p<0,001 frente a una fase análoga en cigotos obtenidos por ICSI bajo la corteza; ‖p<0,05 frente a la Fase 1 en cigotos obtenidos por ICSI bajo la corteza; ¶p<0,001 frente a cigotos obtenidos por ICSI dentro del citoplasma central; **p<0,01 frente a cigotos obtenidos por ICSI dentro del citoplasma central; ‡‡p<0,001 frente a Fase 1 prolongada en óvulos activados por SrCl2.
Tabla 4 Dirección de vectores durante los picos de velocidad en diferentes fases post-fecundación
Nº Total de Nº de picos de velocidad con vectores que apuntan en una dirección Fases post-picos de especificada* (%): fecundación† velocidad Hacia 2PB Entre 2PB y FC Hacia FC Nº de dirección
analizados predominante Fase 1 (11 25 17‡ (66,7) 6 (25,9) 2§ (7,4) 0 cigotos) Fase 2 (19 65 1‡ (1,5) 22 (33,8) 42§ (64,6) 0 cigotos) Fase 3 (19 34 7 (20,6) 4 (11,8) 8 (23,5) 15 (44,1)
cigotos) *La dirección del movimiento se juzgó como se describe en el Material y Métodos, †Fases del desarrollo del cigoto como se describe en el texto principal.
‡,§ p<0,0001
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