ES2617713T3 - Conjugados de derivado de polietilenglicol, catecol y proteína o péptido, y procedimiento de preparación de los mismos - Google Patents
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Abstract
Un conjugado de una proteína o de un péptido con un derivado de polietilenglicol que tiene unido al mismo un compuesto que contiene un catecol de la siguiente fórmula 1, en el que la proteína o el péptido está mono-PEGilado en el grupo amina N-terminal con el catecol del derivado de polietilenglicol:**Fórmula**
Description
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DESCRIPCION
Conjugados de derivado de polietilenglicol, catecol y protema o peptido, y procedimiento de preparacion de los mismos
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un conjugado de derivado de polietilenglicol de catecol y protema o peptido, en el que la protema o el peptido esta mono-PEGilado en el extremo N-terminal con un derivado de polietilenglicol que tiene catecol, y a un procedimiento de preparacion del mismo.
Antecedentes de la tecnica
En el cuerpo humano, se expresan diversos tipos de protemas o peptidos que participan en el crecimiento y en la diferenciacion de las celulas. Dichas protemas o dichos peptidos se unen a receptores en la pared de la celula para inducir la expresion de diversas moleculas de senalizacion, manteniendo asf la homeostasis del organismo. Sin embargo, si la cantidad de dichas protemas o dichos peptidos no se mantiene a niveles adecuados en el organismo, surgiran problemas asociados con la homeostasis debido a la falta o a la sobreexpresion de las moleculas de senalizacion en el organismo, provocando asf diversos problemas. Por ejemplo, si el nivel de una hormona de crecimiento humano o de un factor de crecimiento epidermico asociado con la cicatrizacion de las heridas es bajo, el cuerpo no crecera o la herida no se curara bien.
R. Canfield (en el ano 1962), F. Esch (en el ano 1985), S. Cohen (en el ano 1962) y D. Metcalf (en el ano 1985) descubrieron la lisozima, el factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), el factor de crecimiento epidermico (EGF) y el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), respectivamente, que son factores proteicos que consisten en aminoacidos, y tambien identificaron la secuencia de aminoacidos de cada uno de los factores proteicos (R. Canfield, J. Biol. Chem. 238, 2698., 1963; F. Esch, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82, 6507., 1985; S. Cohen, J. Biol. Chem. 237, 1555., 1962; D. Metcalf, Science 229, 16, 1985).
Se sabe que dichos factores proteicos tienen efectos en la curacion de las heridas (lisozima/bFGF/EGF) y la leucopoyesis (G-CSF), y por lo tanto, se pueden usar como agentes terapeuticos contra la ulcera del pie, que suele ocurrir en los pacientes diabeticos, o como agentes terapeuticos contra la neutropenia tras la terapia contra el cancer.
Sin embargo, se sabe que dichas protemas tienen una semivida corta en la sangre y el tejido. Asf pues, cuando estas protemas se administran con fines terapeuticos, existe el grave problema de que su potencia y estabilidad in vivo sean significativamente bajas.
Para resolver dichos problemas, en los ultimos 10 anos, se ha intentado de forma continua conjugar el polfmero biocompatible polietilenglicol (PEG) con protemas o peptidos (G. Pasut y F. M. Veronese Prog. Polym. Sci. 32, 933, 2007; F. M. Veronese, Biomaterials 22, 405.2001; P. Bailon, Pharm. Sci. Tech. Today 1, 352, 1998).
El polietilenglicol (PEG) es un polfmero altamente biocompatible que no provoca una respuesta inmune in vivo y es uno de los polfmeros sinteticos aprobados por la FDA estadounidense. Este polfmero sintetico se puede usar para los conjugados de protema-polietilenglicol que tienen mayores pesos moleculares. Por lo tanto, estos conjugados pueden evitar que la protema sea eliminada mediante el proceso de filtracion en los rinones. Ademas, estos conjugados presentan el efecto de inhibir la degradacion de las protemas enzimaticas in vivo a traves del efecto sigiloso del polietilenglicol, aumentando asf la semivida y la estabilidad in vivo de la protema. Los ejemplos de protemas que tienen mayor potencia, obtenidas usando este procedimiento, incluyen la hormona humana del crecimiento, la eritropoyetina, el interferon, la insulina, la interleucina, la calcitonina, etc.
No obstante, cuando se usa polietilenglicol para aumentar la estabilidad y la semivida in vivo de un farmaco de protema, existe el problema de que el polietilenglicol reacciona con una pluralidad de sitios de union del farmaco de protema, produciendose, de este modo, una mezcla heterogenea de especies multi-PEGiladas. En particular, la mezcla heterogenea de especies multi-PEGiladas causa muchos problemas en la determinacion de la semivida y la estabilidad in vivo de los farmacos.
Entretanto, incluso cuando el conjugado mono-PEGilado que contiene una molecula de polietilenglicol unida al mismo se prepara en condiciones estrictamente controladas, se da el problema de que la actividad biologica o in vivo del farmaco se ve influenciada de manera significativa por el sitio de union del mismo. Para resolver este problema, ha habido un intento de conjugar PEG con el extremo N-terminal de las protemas o de los peptidos, ya que los sitios activos de la mayona de las protemas terapeuticas (EPO, G-CSF, hormona de crecimiento, etc.) no se encuentran adyacentes al extremo N-terminal. En concreto, esto se debe a que la PEGilacion N-terminal es una tecnica capaz de minimizar la reduccion de la activacion de la protema, lo que es el defecto mas importante de la PEGilacion.
Por lo tanto, para realizar la mono-PEGilacion espedfica de sitio N-terminal como se ha descrito anteriormente, ha habido diversos intentos de conjugar de forma espedfica del sitio mono-polietilenglicol (mono-PEG) con la amina
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primaria del grupo amina N-terminal de protemas o peptidos.
Los polietilenglicoles usados en estos intentos anteriores eran derivados de metoxipolietilenglicol que teman unidos a un extremo N-hidroxisuccinimida o propionato de N-succinimidilo que reacciona espedficamente con la amina primaria (T. H. Kim, “Biomateriales”, 23, 2311, 2002; H Lee, Pharm. Res., 19, 845, 2002). Se sabe que los conjugados mono-PEGilados preparados usando derivados de succinimida-polietilenglicol tienen un cambio muy pequeno en la actividad in vivo, pero la N-hidroxisuccinimida o el propionato de N-succinimidilo se hidrolizan rapidamente durante la conjugacion con protemas o peptidos, dificultando la preparacion de conjugados de protema o de peptido, lo que reduce el rendimiento de la preparacion de los conjugados de protema o de peptido.
En otro intento de usar la mutacion de protemas espedfica del sitio (mutacion simple), se ha intentado la tecnologfa de la realizacion de la PEGilacion mediante la introduccion de mas del 95 % de cistema en el extremo N-terminal de farmacos de protema (peptido). Sin embargo, esta tecnologfa tiene el problema de que, debido a que los farmacos de protemas se modifican qmmicamente, la bioactividad de los farmacos se reduce debido a la modificacion.
Ademas, se intento la PEGilacion espedfica del extremo N-terminal empleando aldeddo-PEG. Es un procedimiento aplicado para la produccion de Neulasta® (Amgen Inc.). Sin embargo, las condiciones de reaccion de esta tecnologfa deben limitarse a las condiciones acidas (pH 4-6, normalmente pH 5,0-5,5), y tambien se debe usar el agente reductor NaBH4. Por lo tanto, la aplicacion de dicha tecnologfa es limitada debido a dichas condiciones de reaccion limitadas.
El documento US 6 506 730 describe una composicion farmaceutica para la administracion a traves de la mucosa nasal de un conjugado de polfmero biocompatible-peptido biologicamente activo. El polietilenglicol es un polfmero preferido. Se sugiere activar el polfmero con fosgeno e hidroxisuccinimida.
Por consiguiente, los presentes inventores han encontrado que, si se prepara un conjugado de una protema o un peptido con un derivado de PEG que tiene un compuesto que contiene un catecol unido al mismo, un procedimiento de preparacion del conjugado sera sencillo, el producto resultante tendra una fuerte resistencia a la hidrolisis, y se puede producir un conjugado que comprenda una protema o un peptido mono-PEGilado con especificidad de sitio en el grupo primario N-terminal con alto rendimiento, completandose asf la presente invencion.
Divulgacion de la invencion
Es un objeto de la presente invencion proporcionar un conjugado de una protema o un peptido con un derivado de polietilenglicol, en el que la protema o el peptido esta mono-PEGilado en el grupo amina N-terminal con el derivado de polietilenglicol, y un procedimiento de preparacion del conjugado.
Para lograr el objeto anterior, la presente invencion incluye el uso de un derivado de polietilenglicol que tiene un compuesto que contiene un catecol unido al mismo, y proporciona un conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol que tiene unido al mismo un compuesto que contiene un catecol de la siguiente formula 1, en el que la protema o el peptido esta mono-PEGilado en el grupo amina N-terminal con el catecol del derivado de polietilenglicol:
[Formula 1]
Por otra parte, se proporciona un procedimiento de preparacion de dicho conjugado de polietilenglicol, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) disolver la protema o el peptido en un reactor;
(b) disolver el derivado de polietilenglicol en otro reactor; y
(c) anadir a y hacer reaccionar con la solucion de la etapa (b) la solucion de la etapa (a).
Breve descripcion de las figuras
La FIG. 1 es un esquema de la reaccion de metoxipolietilenglicol con acido 3,4-dihidroxicinamico.
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La FIG. 2 es la secuencia de aminoacidos de un peptido bisagra-3.
La FIG. 3 muestra los resultados de HPLC de fase inversa de una mezcla de mPEG-CT con bisagra-3.
La FIG. 4 muestra los resultados de MALDI-TOF de una mezcla de mPEG-CT con bisagra-3.
La FIG. 5 es un diagrama esquematico que muestra los candidatos de PEGilacion presentes en bisagra-3.
La FIG. 6 es un diagrama que muestra los resultados de HPLC de fase inversa para productos de digestion tnptica de PEG-bisagra-3. En la FIG. 6, el pico del minuto 13 en la lmea roja: fragmento T1; el pico del minuto 12 en la lmea roja: el resultado de la dilucion insuficiente; y el pico del minuto 23,4 en la lmea roja: fragmentos PEGilados.
La FIG. 7 es un diagrama que muestra los resultados del analisis de MALDI-TOF de fragmentos tnpticos de PEG-bisagra-3. En la FIG. 7, aparecio un pico en mPEG (PM: 5.000) o mPEG mas T1 (PM: 5.883).
La FIG. 8 es un diagrama que muestra la configuracion de la union entre un grupo catecol y succinato de succinimidilo.
La FIG. 9 muestra los resultados de SDS-PAGE de succinato de succinimidilo-PEG-lisozima (carril 3) y catecol- PEG-lisozima (carril 4). En la FIG. 9, el catecol-PEG-lisozima mono-PEGilado presenta una sola banda.
La FIG. 10 muestra los resultados de SDS-PAGE para succinato de succinimidilo-PEG-bFGF (carril 2) y catecol- PEG-bFGF (carril 3) (FIG. 10A), resultados de mAlDI-TOF para los productos de la digestion tnptica de bFGF (PM: 2.495; FIG. 10b) y los resultados de MALDI-TOF para los productos de la digestion tnptica de catecol-PEG- bFGF (PM: 7.468; FIG. 10C).
La FIG. 11 muestra los resultados de SDS-PAGE de succinato de succinimidilo-PEG-G-CSF (carril 2) y catecol- PEG-G-CSF (carril 3) (Fig. 11A), resultados de MALDI-TOF para productos de la digestion tnptica de G-CSF (PM: 1.792; FIG. 11B) y resultados de MALDI-TOF para los productos de la digestion tnptica de catecol-PEG-G- CSF (PM: 6.792; FIG. 11C).
La FIG. 12 es un conjunto de fotograffas de gel de SDS-PAGE que muestran los resultados de la adicion de NaIO4 en proporciones de 0:1, 0,5:1, 1:1, 1,5:1 y 2:1 con respecto al catecol a pH 6,0 durante la reaccion de PEGilacion de protema lisozima.
La FIG. 13 es un diagrama que muestra los valores relativos del rendimiento de la PEGilacion cuando se anade NaIO4 en proporciones de 0:1, 0,5:1, 1:1, 1,5:1 y 2:1 con respecto al catecol a pH 6,0 durante la reaccion de PEGilacion de la protema lisozima.
La FIG. 14 muestra los resultados de SDS-PAGE de una mezcla resultante de la reaccion de mPEG-CT con EPO (carril 2; dos bandas) y de mPEG-CT-EPO (PEG-EPO; carril 3; una banda) purificada usando un sistema de FPLC.
La FIG. 15 es un diagrama que muestra los resultados de HPLC de fase inversa. En la FIG. 15, los picos de la lmea negra indican mPEG-CT-EPO (98 minutos) y una mezcla de EPO (140 minutos), y los picos de la lmea roja indican mono-PEG (105 minutos), di-PEG (98 minutos) y multi-PEG (85 minutos).
La FIG. 16 es un diagrama que muestra las semividas in vivo de mono-PEG-EPO, multi-PEG-EPO y EPO.
La FIG. 17 es un diagrama que muestra los resultados de la medicion de la proporcion de hematocrito de mono- PEG-EPO y EPO.
Mejor modo de llevar a cabo la invencion
La presente invencion incluye el uso de un derivado de polietilenglicol que tiene unido al mismo un compuesto que contiene un catecol de la siguiente formula 1, y proporciona un conjugado de una protema o un peptido con el derivado de polietilenglicol, en el que la protema o el peptido esta mono-PEGilado con especificidad de sitio en el grupo amina N-terminal con el catecol del derivado de polietilenglicol:
[Formula 1]
Los presentes inventores han realizado estudios para resolver los problemas descritos anteriormente que se producen en la tecnica anterior y, como resultado de ello, han descubierto un grupo funcional que se une espedficamente al grupo amina N-terminal de las protemas, en el que el grupo funcional que es un grupo 3,4- dihidroxi-L-fenilalanina grupo (DOPA) se conoce como un aminoacido que esta contenido abundantemente en la protema adhesiva de mejillon. En estudios sobre la dopamina o el catecol, un trabajo de investigacion preparado por los presentes inventores demostro que un grupo catecol puede ser adsorbido a diversas superficies y tambien que
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las protemas se pueden usar para recubrir diversas superficies usando esta adhesion (H. Lee, PNAS, 103, 12999, 2006; H. Lee, Science, 318, 426, 2007; H. Lee, Adv. Mater. 21,431, 2009).
Por lo tanto, en la presente invencion, se usan derivados de polietilenglicol reactivos obtenidos mediante la union de un compuesto que contiene un catecol con polietilenglicol. Dichos derivados de polietilenglicol se pueden unir selectivamente al grupo amina N-terminal de las protemas o de los peptidos, formandose as^ conjugados, y en este caso, las protemas o los peptidos se pueden mono-PEGilar con especificidad de sitio en el extremo N-terminal con los derivados de polietilenglicol, preparandose de este modo formulaciones de protema o peptido que tienen mayores semivida y estabilidad in vivo, a la vez que se mantiene la actividad fisiologica de las protemas o de los peptidos. Tambien, usando el grupo catecol, que es muy estable frente a la hidrolisis que se produce cuando se usan derivados de protemas o peptidos, se puede mantener la eficacia de la reaccion durante un largo penodo de tiempo.
Como se usa en el presente documento, el termino "polietilenglicol" pretende englobar cualquiera de las formas de polietilenglicol (PEG). La definicion del mismo tambien incluye derivados tales como el aldefndo de metoxipolietilenglicol como se describe a continuacion.
El polietilenglicol que se usa en la presente invencion es preferentemente uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en, pero sin limitacion, aldefndo de metoxipolietilenglicol, succinimidilpropionato de polietilenglicol, succinimidilbutanoato de metoxipolietilenglicol, succinimidilsuccinato de metoxipolietilenglicol, benzotriazolcarbonato de metoxipolietilenglicol, epoxido de metoxipolietilenglicol, carbonilimidazol de metoxipolietilenglicol, p- nitrofenilcarbonato de metoxipolietilenglicol, isocianato de metoxipolietilenglicol, amina de metoxipolietilenglicol que contiene amina primaria, hidrazida de metoxipolietilenglicol y metoxicarboxil-polietilenglicol que contiene grupos carboxilo. Debido a que dicho polietilenglicol puede reaccionar con una amina o un grupo carboxilo, se puede unir a un grupo catecol para formar un derivado.
Ademas, el polietilenglicol que se usa en la presente invencion puede tener cualquier forma seleccionada entre forma lineal, ramificada, de cepillo y estrellada.
El compuesto que contiene un catecol que se usa en la presente invencion es preferentemente uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en, pero sin limitacion, 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina que contiene grupos carboxilo y amina, 3-hidroxi-tiramina que contiene grupos amina, acido 3,4-dihidroxihidrocinamico que contiene grupos carboxilo, 3,4-dihidroxibenzaldehndo que contiene grupos aldefndo y norepinefrina. Ademas, el compuesto que contiene un catecol tiene preferentemente un peso molecular de 1.000 o inferior.
El derivado de polietilenglicol usado en la presente invencion tiene preferentemente un peso molecular de 500 a 100.000, y mas preferentemente de 2.000 a 40.000. Esto se debe a que es diffcil obtener un derivado de polietilenglicol que tenga un peso molecular superior a 100.000, y un derivado de polietilenglicol que tenga un peso molecular inferior a 500 esta presente en un estado lfquido, y por lo tanto, tiene malas propiedades ffsicas que conducen a una baja eficiencia de la reaccion.
Si el derivado de polietilenglicol esta conjugado a una protema, se puede obtener un conjugado de protema-derivado de polietilenglicol que tenga un mayor peso molecular, y este conjugado puede evitar que la protema sea eliminada por el proceso de filtracion en los rinones. Ademas, el conjugado presenta el efecto de inhibir la degradacion de la protema enzimatica in vivo a traves del efecto de sigilo del polietilenglicol, aumentando asf la semivida y la estabilidad in vivo de la protema.
En la presente invencion, debido a que el conjugado de protema o peptido-derivado de polietilenglicol se prepara mediante la mono-PEGilacion espedfica de sitio de la protema o del peptido como se ha descrito anteriormente, se puede prevenir el problema como la produccion de un conjugado heterogeneo. Por lo tanto, cuando se mide la duracion de la eficacia y de la estabilidad de un farmaco de protema o peptido de la presente invencion, se pueden obtener datos fiables. Tambien, usando la presente invencion, se puede preparar facilmente un farmaco que tiene actividad biologica in vivo deseada. Ademas, debido a que el conjugado de la presente invencion se prepara a traves de PEGilacion espedfica del extremo N-terminal, se puede aumentar al maximo el efecto farmacologico del farmaco de protema sin modificar qmmicamente el farmaco de protema.
La protema que se usa en la presente invencion puede ser una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en, pero sin limitacion, lisozima, hormona de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento epidermico (EGF), hormona de crecimiento humana (hGH), interferon (IFN), interleucina-2 (IL-2), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH), hormona liberadora de hormona del crecimiento (GHRH), urato oxidasa de mamffero (uricasa), y arginina desiminasa (ADI). En el presente documento, se pueden producir protemas tales como la lisozima, bFGF, EGF y GCSF usando tecnicas recombinantes de genes, ya sea mediante la extraccion de estas protemas de marnfferos o la clonacion de estas protemas en vectores de aDn y luego la expresion de estas protemas en un huesped procariota o eucariota. En el presente documento, los ejemplos del huesped procariota incluyen Escherichia coli, los ejemplos del huesped eucariota incluyen Hanesnula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, etc., y los mairnferos incluyen ratones, perros y cerdos.
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El peptido que se usa en la presente invencion puede ser uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en, pero sin limitacion, bisagra-7, bisagra-3, buforina, histonina, protegrina, indolicidina, histatina, BlP, magainina 2, peptido de tipo glucagon (GLP-1), agonista de GNRH/LHRH, analogos de somatostatina, peptido inmunorregulador glatiramero, calcitonina de salmon, desmopresina, peptidos inhibidores de la coagulacion de plaquetas, eptifibatida y el inhibidor de la fusion del VIH enfuvirtida.
El procedimiento de preparacion de un derivado de polietilenglicol que tiene unido al mismo un compuesto que contiene un catecol de formula 1 puede comprender las etapas de:
(a) disolver polietilenglicol en un disolvente organico polar en un reactor;
(b) disolver un agente de reticulacion y un compuesto que contiene un catecol de formula 1 en un disolvente organico polar en otro reactor;
(c) anadir a y hacer reaccionar con la solucion de la etapa (b) N,N-diisopropiletilamina (DIPEA); y
(d) anadir a y hacer reaccionar con la solucion de la etapa (a) la solucion de la etapa (c).
El derivado de polietilenglicol preparado de acuerdo con el procedimiento anterior se caracteriza en que se puede mono-conjugar (mono-PEGilar) con el grupo amina N-terminal de las protemas o los peptidos.
De aqu en adelante, se describira en detalle cada etapa del procedimiento de preparacion anterior.
Las etapas (a) y (b) del procedimiento de preparacion anterior son etapas de preparacion de soluciones de materiales de reaccion. En las etapas (a) y (b), se puede usar un disolvente organico polar para disolver los materiales de reaccion. Los ejemplos preferidos de un disolvente organico polar que se pueden usar en la presente invencion incluyen alcohol, sulfoxido de dimetilo (DMSO), dimetilformaldel'ndo (DMF), acetona y N-metilpirrolidona (NMP). De estos disolventes, el mas preferido es la DMF, porque la DMF puede evitar la oxidacion de un grupo catecol.
El agente de reticulacion que se anade al compuesto que contiene un catecol puede ser uno o mas seleccionados del grupo que consiste en hexafluorofosfato de benzotriazoliloxitris(dimetilamino)fosfonio (BOP), hidroxibenzotriazol (HOBt), clorhidrato de etil-(W'W-dimetilamino)propilcarboiimida (EDC), diciclohexilcarbodiimida (DCC), N- hidroxisuccinimida (NHS) y cianoborohidruro de sodio. Un ejemplo preferido del agente de reticulacion que se usa para la union de un grupo amina con un grupo carboxilo puede ser una combinacion de HOBt y BOP, una combinacion de EDC y NHS, y una combinacion de DCC y NHS. Un ejemplo preferido del agente de reticulacion que se usa para la union de un grupo amina con un grupo aldehfdo puede ser cianoborohidruro de sodio.
Por ejemplo, el BOP y el HOBt son agentes de reticulacion de orden cero. En la realizacion mas preferida, la relacion molar de BOP:HOBt:compuesto que contiene un catecol (derivado de polietilenglicol) vana preferentemente de 1:1:1 a 10:10:1. Si la relacion molar esta fuera de este intervalo, se puede reducir la reactividad entre los materiales de reaccion.
La etapa (c) del procedimiento de preparacion anterior es una etapa de adicion de W,W-diisopropiletilamina (DIPEA) a la solucion que contiene catecol de la etapa (b) y de dejar que la mezcla reaccione. En la etapa (c), preferentemente, la DIPEA se anade como una base organica a la solucion que contiene catecol, y despues se deja reaccionar durante aproximadamente 10 a 20 minutos.
La etapa (d) del procedimiento de preparacion anterior es una etapa de adicion de la solucion de la etapa (c) a la solucion de la etapa (a) y de dejar que la mezcla reaccione. La reaccion de la etapa (d) se lleva a cabo preferentemente a temperatura ambiente durante aproximadamente 10-14 horas. En un ejemplo, se demostro que el metoxipolietilenglicol y el compuesto que contiene un catecol se unieron entre sf en la etapa (d), formando de este modo un derivado de polietilenglicol.
Ademas, el procedimiento de preparacion anterior puede comprender ademas la etapa (e) de dializar la solucion de la etapa (d). La etapa (e) del procedimiento de preparacion anterior es una etapa de dialisis de la solucion de la etapa (d) para eliminar el material sin reaccionar, una vez finalizada la reaccion. La dialisis se lleva a cabo preferentemente durante 10-14 horas usando una membrana de dialisis que tiene un peso molecular de corte de 2.000 a 10.000.
En el presente documento, como solucion de dialisis, preferentemente, se usa agua destilada que tiene un pH de 16. Si el pH de la solucion de dialisis esta fuera de este intervalo, se puede producir indeseablemente la oxidacion del catecol.
Ademas, el procedimiento de preparacion anterior puede comprender ademas la etapa (f) de liofilizacion de la solucion dializada de la etapa (e). La etapa (f) del procedimiento de preparacion anterior es una etapa de liofilizacion de la solucion dializada para obtener un derivado de polietilenglicol en forma de un polvo blanco. La etapa (f) se puede llevar a cabo mediante un procedimiento de liofilizacion conocido por el experto habitual. A traves de la etapa (f), se sublima el disolvente, obteniendose de este modo un derivado de polietilenglicol como un polvo blanco. Ademas, tambien se puede llevar a cabo el secado adicional para eliminar completamente el disolvente.
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La presente invencion tambien proporciona un procedimiento de preparacion de un conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol que tiene unido al mismo un compuesto que contiene un catecol de la siguiente formula 1, en el que la protema o el peptido esta mono-PEGilado en el grupo amina N-terminal con el catecol del derivado de polietilenglicol:
[Formula 1]
comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) disolver el polfmero o el peptido en un reactor;
(b) disolver el derivado de polietilenglicol en otro reactor; y
(c) anadir a y hacer reaccionar con la solucion de la etapa (b) la solucion de la etapa (a).
De aqu en adelante, se describira en detalle cada uno de los procedimientos de preparacion del conjugado de protema o peptido-derivado de polietilenglicol de acuerdo con la presente invencion.
La etapa (a) del procedimiento de preparacion del conjugado de acuerdo con la presente invencion es una etapa de disolucion de la protema o del peptido, que tiene un grupo amina N-terminal, en el reactor. Preferentemente, la protema o el peptido se pueden disolver en un tampon en el reactor. El tampon que se usa en la etapa (a) puede ser uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en solucion salina tamponada con fosfato, tampon de imidazol, tampon de trimetilamina, tampon trietanolamina, tampon de dietilbarbiturato de sodio, tampon de bicina y tampon de aminometilpropanodiol. Ademas, el pH de la solucion tampon es preferentemente de 5,5 a 10. Si el pH del tampon es inferior a 5,5, se reducira la reactividad de la protema o del peptido, y si el pH es superior a 10, se reducira la estabilidad del farmaco de protema o de peptido.
La etapa (b) del procedimiento de preparacion del conjugado de acuerdo con la presente invencion es una etapa de disolucion del derivado de polietilenglicol, proporcionada de acuerdo con la presente invencion, en otro reactor. Preferentemente, el derivado de propilenglicol se puede disolver en el mismo tampon que se usa en la etapa (a).
La etapa (c) del procedimiento de preparacion del conjugado de acuerdo con la presente invencion es una etapa de adicion de la solucion de la etapa (a) a la solucion de la etapa (b) y de someter la mezcla de solucion a una reaccion de PEGilacion. La reaccion de PEGilacion se lleva a cabo preferentemente a 4-35 °C durante 2 a 100 horas.
En la etapa (c), tambien se puede usar un agente de oxidacion para aumentar la actividad del derivado de polietilenglicol. El agente de oxidacion que se usa en la presente invencion puede ser uno o mas seleccionado del grupo que consiste en NaIO4, MnCh, FeCh, FeCl3, KMnO4, H2O2, Na2Cr2O7 y Na3VO4. El agente de oxidacion se puede anadir durante la disolucion del derivado de polietilenglicol. El agente de oxidacion se usa preferentemente en una relacion molar de 1:1 a 1:10 con respecto al derivado de polietilenglicol. En la realizacion mas preferida, el NaIO4 se puede anadir en una relacion molar de 1,5:1 con respecto al grupo catecol. Si el tiempo de reaccion de PEGilacion es inferior a 2 horas, la eficacia de conjugacion del polietilenglicol se reducira, y si el tiempo de reaccion es superior a 100 horas, se reducira la estabilidad de la protema o del peptido. Ademas, si la temperatura de reaccion es inferior a 4 °C, la velocidad de reaccion sera demasiado baja, y si la temperatura de reaccion es superior a 35 °C, la protema o el peptido se modificaran.
En una realizacion preferida de la presente invencion, el procedimiento de preparacion del conjugado de acuerdo con la presente invencion puede comprender ademas, tras la etapa (c), la etapa (d) de dializar la solucion de la etapa (c) y luego separar el conjugado de la solucion dializada. La etapa (d) del procedimiento de preparacion del conjugado de acuerdo con la presente invencion es una etapa de bien dializar la solucion para eliminar el material sin reaccionar o de separar el conjugado a traves de cromatograffa en fase lfquida (HPLC o FPLC), una vez finalizada la reaccion de PEGilacion. La etapa (d) se puede llevar a cabo usando un procedimiento de dialisis convencional o el procedimiento de cromatograffa en fase lfquida conocido para los expertos habituales en la materia.
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Ejemplos
En lo sucesivo, la presente invencion se describira con mas detalle con referencia a los ejemplos. Sera evidente para el experto habitual en la materia que estos ejemplos tienen fines meramente ilustrativos, y no se han de interpretar como limitantes del alcance de la presente invencion.
Ejemplo 1: Sintesis de derivado de polietilenglicol (PEG) que tiene catecol
Para sintetizar un derivado de polietilenglicol (PEG) que tiene un compuesto que contiene un catecol unido al mismo, se uso metoxipolietilenglicol como PEG, y se uso acido 3,4-dihidroxicinamico como el compuesto que contiene un catecol.
En 15 ml del disolvente organico polar DMF (dimetilformamida) en un reactor, se dejaron reaccionar 1.000 mg de metoxipolietilenglicol (m-PEG; PM: 5.000) que tema un grupo amina terminal con acido 3,4-dihidroxicinamico (HCA), hidroxibenzotriazol (HOBt), hexafluorofosfato de benzotriazoliloxitrisfosfonio (BOP) y W,W-diisopropiletilamina (DIPEA) durante 720 minutos mientras se agitaba. En el presente documento, las cantidades de los compuestos usadas fueron 38 mg, 110 mg y 44 |il. Entretanto, la DMF usada como disolvente fue ventajosa para la reaccion, debido a que pudo evitar la oxidacion del grupo catecol del HCA.
Como se muestra en la FIG. 1, se dializo el producto de reaccion durante 24 horas para eliminar el material sin reaccionar restante una vez finalizada la reaccion. A continuacion, se liofilizo el material resultante, obteniendose asf acido 3,4-dihidroxicinamico-PEG en forma de polvo blanco. Se confirmo que el material obtenido era un derivado de PEG (denominado de aqu en adelante mPEG-CT) que tema catecol.
Ejemplo 2: Preparacion de conjugado de PEG-bisagra-3 con mPEG-CT y examen de la configuracion del conjugado preparado
(1) Preparacion de conjugado de PEG-bisagra-3 usando mPEG-CT
Para conjugar un derivado de polietilenglicol con un peptido, se preparo mPEG-CT de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1 (FIG. 1). Es decir, se dejaron reaccionar mPEG-amina (PM: 5.000) y HCA con HOBt, BOP y DIPEA en una solucion de DMF, obteniendose asf mPEG-CT.
A continuacion, se dejo reaccionar el mPEG-CT con el peptido bisagra-3 (vease la FIG. 2) a 4 °C en condiciones ligeramente acidas (pH 6,5). Como resultado de ello, se preparo satisfactoriamente un conjugado de PEG-bisagra-3.
(2) HPLC de fase inversa y MALDI-TOF para la confirmacion de la mono-PEGilacion
Para confirmar si el conjugado de PEG-bisagra-3 preparado en el Ejemplo 2-(1) tema una configuracion en la que el peptido bisagra-3 esta mono-PEGilado con PEG, se realizaron una HPLC de fase inversa (cromatograffa lfquida de alto rendimiento de fase inversa) y MALDI-TOF (desorcion e ionizacion por laser asistida por matriz-tiempo de vuelo).
El sistema HPLC usado fue Agilent serie 1200, y la columna fue supelco Discovery® BIO Wide Pore C18 5 cm x 4,6 mm, 3 |im. La fase movil consistfa en agua (TFA al 0,1 %):acetonitrilo (TFA al 0,1 %) = 95:5, agua (TFA al 0,1 %):acetonitrilo (TFA al 0,1 %) = 5:95 (hasta 30 minutos), y agua al 95 % (hasta 35 minutos).
Como resultado de ello, como se muestra en la FIG. 3, los resultados de la HPLC de fase inversa mostraron que solo se detectaron dos picos. Los dos picos indican bisagra-3 sin modificar (16,2 minutos) y bisagra-3 mono- PEGilada (17 minutos), solo se produjo mono-PEGilacion sin multi-PEGilacion.
Para el analisis de MALDI-TOF, se mezclo una solucion de acetonitrilo (acido trifluoroacetico al 0,1 % (TFA)) con agua (acido trifluoroacetico al 0,1 % (TFA)) en una proporcion de 1:1, y se adsorbio la protema sobre la fase estacionaria usando un ZipTip, y luego se lavo con agua para eliminar las sales del tampon. A continuacion, se purifico solamente PEG-bisagra-3 puro usando una mezcla 1:1 o acetonitrilo y agua, y se coloco en una placa de MALDI-TOF. A continuacion, se sometio la muestra a analisis de MALDI-TOF usando un sistema de Voyager DE- STR (Applied Biosystems, Inc.).
Como resultado de ello, como se muestra en la FIG. 4, los resultados del analisis MALDI-TOF tambien mostraron que solo se detectaron PEG (PM: 5.000) y mono-PEG-bisagra-3 (PM: 7.238). Por lo tanto, se confirmo que, en el conjugado de peptido-polietilenglicol preparado usando el derivado de polietilenglicol con catecol, el peptido se mono-PEGilo con polietilenglicol.
(3) Examen de los sitios de mono-PEGilacion a traves de la degradacion triptica
Para examinar si el conjugado de PEG-bisagra-3 preparado en el Ejemplo 2-(1) tema una configuracion en la que el PEG estaba conjugado con especificidad de sitio con el extremo N-terminal del peptido bisagra-3, se sometio el conjugado a digestion tnptica, seguida de los analisis de HPLC de fase inversa y de MALDI-TOF.
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El peptido, denominado "bisagra-3", tiene 20 aminoacidos (vease la FIG. 2). El peptido tiene 7 aminas primarias expuestas (potenciales sitios de PEGilacion), es decir, 6 grupos epsilon-amino de la lisina (K) y un grupo alfa-amina en el extremo N-terminal. Todas las aminas eran candidatas como sitios de PEGilacion (vease la FIG. 5). Por consiguiente, si examino si el peptido solo estaba PEGilado en el grupo alfa-amina N-terminal entre estos sitios. Dado que la secuencia de bisagra-3 solo contiene un aminoacido triptofano (vease la FIG. 2), se podfa examinar si el peptido bisagra-3 estaba PEGilado solo en el extremo N-terminal a traves de la forma de los productos de la digestion tnptica del peptido.
Dado que el peptido bisagra-3 no tiene cistema, se anadio una solucion de una pequena cantidad de cloruro de calcio (CaCl2) en urea 4 M al peptido bisagra-3, e inmediatamente despues se anadio tripsina a la solucion en una cantidad de 1/20 del peptido. Entonces, se sometio el peptido a digestion tnptica a 37 °C durante 12 horas, seguida del analisis de HPLC de fase inversa.
Como resultado de ello, se obtuvo un grafico como el mostrado en la FIG. 6. Como puede verse en el mismo, a 280 nm de UV, solo se detecto un resto de triptofano. Esto es porque el peptido bisagra-3 digerido muestra un unico pico en el fragmento T1 (13 min). Si el catecol reaccionara con las aminas epsilon (K12, K13, K16, K17 y K20), el pico del fragmento unico no cambiana. Sin embargo, como se puede ver a partir de los resultados de la FIG. 6, el pico del unico fragmento seguramente disminuyo (lmea roja). Es decir, debido al grupo catecol, la intensidad del pico solo aumento cuando existia el fragmento T1. La presencia del pico anterior (13 min; lmea roja) fue porque no se realizo suficiente dilucion (PMCO: diluido a 1:6000).
Tras el analisis de HPLC de fase inversa, solo quedanan las aminas K9 y N-terminales entre los candidatos de PEGilacion. Si mPEG-CT reaccionara con K9, el peso molecular de los fragmentos PEGilados y digeridos, es decir, el mPEG-CT mas T1+2, sena de 6254,49, porque la tripsina no podna reconocer la lisina PEGilada (K9). Por lo tanto, se realizo el analisis de MALDI-TOF para examinar el sitio en el que el mPEG-CT estaba PEGilado. El analisis de MALDI-TOF se realizo de la misma manera que se describe en el Ejemplo 2-(2).
Los resultados del analisis de MALDI-TOF se muestran en la FIG. 7. Como puede verse en la misma, solo existfan dos picos: 5.000 y 5.883. Dichos resultados indican sin duda que el pico de 5.000 es mPEG-TC y el pico de 5.883 es mPEG-CT mas el fragmento T1 (PM: 899) de bisagra-3. No se observo el peso molecular de mPEG-CT mas el fragmento T1+2 (6.254,49), y por lo tanto, el pico de 5.883 es la prueba fiable de PEGilacion N-terminal. Por consiguiente, se confirmo que el conjugado de PEG-bisagra-3 preparado usando mPEG-CT en el Ejemplo 2-(1) tema una configuracion en la que el peptido bisagra-3 estaba mono-PEGilado en el extremo N-terminal.
Ejemplo 3: Comparacion con el conjugado de PEG-lisozima usando mPEG-SS y mPEG-CT
(1) Preparacion de PEG-lisozima usando mPEG-SS
No solo se pueden PEGilar peptidos, sino tambien protemas en el extremo N-terminal. En la tecnica anterior, el procedimiento mas util para la PEGilacion de aminas fue el uso de succinato de succinimidilo capaz de formar un enlace covalente con un grupo amina primaria expuesto en la superficie. Sin embargo, dicho procedimiento tema el problema de que no era espedfico del sitio. Esto se debe a que el succinato de succinimidilo reacciona con los grupos amina primaria aleatorios, a diferencia de un grupo catecol (FIG. 8). Por lo tanto, para comparar un grupo catecol con el succinato de succinimidilo, se preparo un conjugado de PEG-lisozima usando mPEG-SS y lisozima como ejemplo de protema.
En concreto, a un pH de 8,5, que es una condicion que se conoce en general, se dejaron reaccionar 20 mg de mPEG-SS con 5 mg de lisozima a 4 °C durante 12 horas, preparando de esta manera un conjugado de PEG- lisozima.
Como resultado de ello, se confirmo que se habfa preparado el conjugado de PEG-lisozima.
(2) Preparacion del conjugado de PEG-lisozima usando mPEG-CT
Para preparar un conjugado de PEG-lisozima usando el mPEG-CT del Ejemplo 1, de acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 2-(1), se mezclaron 5 mg de mPEG-CT (5 k) con 5 mg de lisozima a pH de 8,5, y se dejo reaccionar la mezcla a 4 °C durante 12 horas.
Como resultado de ello, se confirmo que se habfa preparado un conjugado de PEG-lisozima.
(3) Examen de mono- o multi-PEGilacion usando el analisis de gel de SDS-PAGE
Se sometieron los conjugados de PEG-lisozima de los Ejemplos 3-(1) y 3-(2) a analisis en gel de SDS-PAGE para examinar si los conjugados estaban mono-PEGilados o multi-PEGilados.
Con este fin, se preparo un gel de SDS-PAGE que tema una fraccion de acrilamida del 15 %, y se aplico una tension al mismo para separar la lisozima y el conjugado de PEG-lisozima de acuerdo con el tamano.
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Los resultados del analisis se muestran en la FIG. 9. En la FIG. 9, el carril 1 es el resultado de la carga de lisozima como un control, el carril 2 es el resultado de la carga del conjugado de PEG-lisozima del Ejemplo 3-(1), y el carril 3 es el resultado de la carga del conjugado de PEG-lisozima del Ejemplo 3-(2). Como resultado de ello, se hizo reaccionar el conjugado del carril 2 preparado usando metoxi-polietilenglicol-succinato de succinimidilo (mPEG-SS) con tres grupos amina (aparecieron 3 bandas) (K33, K97 y K116). Sin embargo, como puede verse en el carril 3, el conjugado de PEG-lisozima preparado usando mPEG-CT mostro una sola banda, lo que sugiere que el conjugado solo reacciono con un grupo amina. Por lo tanto, se confirmo que el derivado de PEG con catecol estaba mono- conjugado con la protema, a diferencia del derivado de PEG con succinato de succinimidilo.
Ejemplo 4: Preparacion de conjugado de PEG-bFGF con mPEG-CT y examen de la configuracion del conjugado preparado
(1) Preparacion del conjugado de PEG-bFGF usando mPEG-CT o mPEG-SS
El bFGF (PM: 17,1 kDa) es un factor de crecimiento de fibroblastos basico, que es un tipo de FGF. En organos adultos, participa en la curacion de las heridas y en la regeneracion de los tejidos. De acuerdo con el mismo procedimiento usado en el Ejemplo 2-(1), se preparo un conjugado de PEG-bFGF usando mPEG-CT. Como resultado de ello, se confirmo que se habfa preparado el conjugado de PEG-bFGF.
Entretanto, de acuerdo con el mismo procedimiento que se describe en el Ejemplo 3-(1), se preparo un conjugado de PEG-bFGF usando mPEG-SS.
(2) Examen de mono-PEGilacion mediante el analisis de gel SDS-PAGE
Se sometio el PEG-bFGF a analisis de SDS-PAGE y analisis de MALDI-TOF de acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 2-(2) para examinar si el PEG-bFGF era un conjugado mono-PEGilado. Sin embargo, el analisis se realizo a un pH diferente del valor de pH usado en el Ejemplo 2-(2). Esto se debe a que la amina N-terminal tiene un valor de pKa diferente. Se analizo si bFGF estaba PEGilado a pH 6,5.
Los resultados del analisis se muestran en la FIG. 10A.
En la FIG. 10A, la protema cargada en el carril 2 es el resultado de realizar la PEGilacion usando mPEG-CT a un pH de 6,5, y en el carril 2, se pudieron observar dos bandas, es decir, la banda del bFGF anterior y la banda del conjugado de PEG-bFGF mono-PEGilado. La protema cargada en el carril 3 es un conjugado de PEG-bFGF mono- PEGilado obtenido mediante la separacion y la purificacion de la protema del carril 2 mediante FPLC. Por consiguiente, se confirmo que, cuando un conjugado de protema-polietilenglicol se prepara usando un derivado de polietilenglicol con catecol, la protema se monoPEGila con el polietilenglicol.
(3) Examen de los sitios de PEGilacion por digestion triptica
Se examinaron los sitios de PEGilacion de PEG-bFGF mediante digestion triptica de acuerdo con el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2-(3).
Como resultado de ello, como se muestra en la FIG. 10C, se observo el pico del fragmento T1 a 7.468. Debido a que el peso molecular del fragmento T1 de bFGF no modificado es de 2.495 (FIG. 10B), el pico a 7.468 es sin duda la suma de mPEG-CT (PM: 5.000) y del fragmento T1 de bFGF (PM: 2.495) y, por lo tanto, el pico a 7.468 es la prueba fiable de PEGilacion N-terminal. Por consiguiente, se confirmo que el PEG-bFGF preparado usando mPEG-CT es una configuracion en la que la protema bFGF estaba mono-PEGilada en el extremo N-terminal con PEG.
Ejemplo 5: Preparacion del conjugado de PEG-G-CSF usando mPEG-CT y examen de la configuracion del conjugado preparado
(1) Preparacion del conjugado de PEG-G-CSF usando de mPEG-CT o mPEG-SS
El G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos; PM: 18,8 kDa) es la protema mas importante del sistema sangumeo humano, y sirve para estimular la liberacion de la medula osea en el flujo sangumeo. Se preparo un conjugado de PEG-G-CSF de acuerdo con el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2-(1). Como resultado de ello, se confirmo que se habfa preparado el conjugado de PEG-G-CSF.
Entretanto, se preparo un conjugado de PEG-G-CSF usando mPEG-SS de acuerdo con el mismo procedimiento que en el Ejemplo 3-(1).
(2) Examen de PEGilacion mediante el analisis en gel de DS-PAGE
Se examino si la protema G-CSF estaba mono-PEGilada mediante el analisis de PEG-bFGF y el analisis en gel de SDS-PAGE de acuerdo con el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2-(2).
Los resultados del analisis se muestran en la FIG. 11.
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Como se puede observar en la FIG. 11A, en el conjugado mono-PEGilado preparado usando mPEG-CT, solo se pudieron observar las bandas de G-CSF y G-CSF mono-PEGilado (carril 2), y cuando se realizo la purificacion del conjugado mediante FPLC, solo se pudo separar el G-CSF mono-PEGilado (carril 3). Por consiguiente, se confirmo que la protema G-CSF estaba mono-PEGilada.
(3) Examen de mono-PEGilacion en extremo N-terminal por digestion tnptica
Se examinaron los sitios de PEGilacion mediante la digestion tnptica de G-CSF y PEG-G-CSF de acuerdo con el mismo procedimiento que en el Ejemplo 4-(3).
Como resultado de ello, como se muestra en la FIG. 11B, los resultados de MALDI-TOF de los productos de la digestion tnptica de G-CSF indicaron que el peso molecular del fragmento T1 era de 1.792. Entretanto, como se muestra en la FIG. 11C, los resultados de la MALDI-TOF para los productos de la digestion tnptica del PEG con catecol-G-CSF indicaron que el peso molecular del fragmento T1 era de 6.792. Por lo tanto, se cree que el resultado anterior es la suma del fragmento T1 y PEG (PM: 5.000), lo que sugiere que el derivado de PEG con catecol estaba mono-conjugado con la protema, a diferencia del derivado de PEG con succinato de succinimidilo.
A traves de los Ejemplos 1 a 5 anteriores, se sintetizo satisfactoriamente el derivado de polietilenglicol (PEG-CT) que tema el compuesto que contema un catecol unido al mismo, y se confirmo que, cuando el derivado de PEG-CT se conjuga con la protema o con el peptido, se puede conjugar con especificidad de sitio con el extremo N-terminal de la protema o del peptido.
Ejemplo 6: Aumento de la eficiencia de la PEGilacion usando peryodato de sodio
Para aumentar la eficiencia de la PEGilacion, se uso el agente de oxidacion peryodato de sodio. En condiciones de bajo pH, la proporcion de aminas alfa (aminas N-terminales) presentes en forma de cationes de NH3+ es mas alta que la de las aminas epsilon (aminas de restos de lisina). Asf pues, solo la amina N-terminal puede reaccionar con una quinona oxidada por el peryodato. Por consiguiente, se realizo la PEGilacion en condiciones de proporciones variables de peryodato de sodio.
Se disolvieron 5 mg de lisozima y 5 mg de mPEG-CT en un tampon (pH 6,0) y se dejaron reaccionar a 4 °C durante 720 minutos. En este momento, se anadio peryodato de sodio en proporciones de 0:1, 0,5:1, y 1:1 y 2:1 con respecto al mPEG-CT.
Se realizo un experimento en un grupo de control de la misma manera que en el Ejemplo 3-(2).
Los resultados experimentales se muestran comparativamente en las FIG. 12 y 13, que muestran las eficiencias de PEGilacion a diferentes proporciones de peryodato a un pH de 6,0 o inferior. La ultima columna del gel de SDS- PAGE y el valor del rendimiento de la PEGilacion a un pH de 8,5 en el grafico son los resultados para el grupo de control que no sufrio reaccion qmmica. Los resultados experimentales indicaron que el mayor rendimiento fue del 57,94 % a una proporcion de peryodato:catecol de 1,5:1.
Ejemplo 7: Examen del tiempo de duracion in vivo del conjugado de PEG-EPO
(1) Preparacion y confirmacion de conjugado de PEG-EPO usando mPEG-CT o mPEG-SS
La eritropoyetina (PM: 30 kDa) es una hormona que se produce en los rinones y estimula la produccion de eritrocitos en la medula. La funcion mas importante es la de estimular la diferenciacion y el desarrollo de los eritrocitos. En el presente ejemplo, se uso mPEG-CT (PM: 30 kDa), porque la PEGilacion que une un PEG de al menos 20 kDa podna ser eficaz en un medio in vivo.
Se preparo un conjugado de PEG-EPO de acuerdo con los mismos procedimientos que se han descrito en los Ejemplos 2-(1) y 3-(1), excepto que se anadio peryodato de sodio a una proporcion de 1,5:1 durante la reaccion de mPEG-CT con EPO y que se uso un pH de 7,5. Debido a que las protemas tienen diferentes valores de pKa, se uso un pH que era algo mas alto que en el caso de la lisozima. Una vez finalizada la reaccion, se purifico la EPO conjugada con PEG usando un sistema de FPLC (Shephacril TM HiPrep 26/60 S-200-HR 320 ml).
Los resultados del analisis se muestran en las FIG. 14 y 15. Como puede verse a partir de los resultados del analisis en gel de SDS-PAGE, despues del procedimiento de FPLC, la mezcla de EPO (una lmea negra en la FIG. 15; 140 minutos) y el mPEG-CT-EPO (PEG-EPO, una segunda lmea en la FIG. 14 o una lmea negra en la FIG. 15; 98 minutos) se purificaron por completo (tercera lmea en la FIG. 14). El rendimiento de PEGilacion fue del 77 %. De los resultados del analisis de MALDI-TOF, se podfa observar una EPO mono-PEGilada (datos no mostrados).
Se uso mPEG-SS (PM: 20 kDa) como un control de multi-PEGilacion de protemas. Se detecto una EPO mono- PEGilada a los 105 minutos, y se detecto una EPO di-PEGilada a los 95 minutos y se purifico mediante FPLC (una lmea roja en la FIG. 15). Se detecto un pico a los 85 minutos, lo que indica una protema conjugada y una protema multi-PEGilada. El rendimiento de la PEGilacion fue mucho menor en mPEG-SS que en mPEG-CT, pero se indico con una altura ajustada en la FIG. 15 para facilitar la comparacion.
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40
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(2) Examen del tiempo de duracion in vivo
En un estudio farmacocinetico in vivo, se uso una EPO multi-PEGilada, es decir, un PEG-EPO multi-PEGilado preparado usando el mPEG-SS del Ejemplo 7-(1), como control positivo. Los ratones recibieron por inyeccion intravenosa 100 |ig/kg (peso corporal del raton) de EPO, y luego se midio el tiempo de circulacion in vivo de la EPO. Para cada muestra de protema, se usaron cinco ratones, y se inyectaron aproximadamente 2,5 |ig de cada protema a cada raton. Esta cantidad de protema corresponde a 6,4 x 104 mlU de EPO, suponiendo un factor de conversion de 2,56 x 104 mlU. Se cuantificaron las protemas plasmaticas mediante ELISA, y se ajustaron las cantidades cuantificadas de acuerdo con las afinidades de diferentes anticuerpos ELISA frente a las muestras de protema, es decir, PEG-EPO, multi-PEG-EPO y EPO.
Los resultados del analisis se muestran en la FIG. 16. Como se puede ver en la FIG. 16, se midieron las semividas de todas las muestras de protema, siendo de aproximadamente 4-96 horas. En la etapa inicial (0,25-4 horas), se mostraron tendencias similares, pero se creyo que los resultados fueron algo inexactos para la medicion exacta de las semividas. Durante la etapa intermedia (4-48 horas), se distribuyo la EPO y resulto tener una semivida de 6 horas. Durante las 72 horas posteriores a la inyeccion, no se detecto la EPO en el plasma. La EPO multi-PEGilada resulto tener una semivida mas larga (30 horas). Sin embargo, durante la ultima etapa (48-96 horas), la EPO multi- PEGilada resulto tener una semivida mas corta (15 horas). Por otro lado, la EPO mono-PEGilada resulto tener la semivida mas larga (30 horas), y se observo durante el tiempo mas largo (96 horas). Estos resultados sugieren que la EPO multi-PEGilada y la EPO mono-PEGilada presentaron la excelente EPO habitual, debido a la larga semivida y que la EPO mono-PEGilada resulto tener una larga semivida en comparacion con la EPO multi-PEGilada. Por lo tanto, se podna predecir que la EPO mono-PEGilada tuvo un largo tiempo de duracion in vivo, de modo que se pudieron aumentar al maximo la eficacia y la estabilidad in vivo del farmaco de protema.
(3) Medicion de la actividad biologica
Para medir la actividad biologica, se midio la proporcion de hematocrito en sangre en cada muestra.
Se anadio EDTA a la sangre extrafda de los ratones para evitar que la sangre se coagulara y, a continuacion, se midio la proporcion de hematocrito en sangre usando VetScan HM5 (Abaxis).
Como resultado de ello, como se muestra en la FIG. 17, durante 0 a 3 dfas despues de la inyeccion, EPO y PEG- EPO tuvieron actividades similares, y dichas actividades similares tambien se mostraron incluso 7-10 dfas despues de la inyeccion. Sin embargo, la EPO perdio la mayor parte de su actividad in vivo hacia el dfa 14, mientras que PEG-EPo todavfa mantema su efecto. A partir de estos resultados, se puede predecir que el farmaco de protema de la presente invencion, que no fue modificado qmmicamente, tiene una excelente eficacia in vivo.
Aunque la presente invencion se ha descrito en detalle con referencia a las caractensticas espedficas, sera evidente para los expertos en la materia que dicha descripcion es solo para una realizacion preferida, y no limita el ambito de la presente invencion. Asf pues, el ambito sustancial de la presente invencion estara definido por las reivindicaciones adjuntas.
Aplicabilidad industrial
Cuando se usa en la presente invencion, el derivado de PEG con catecol se puede mono-conjugar con especificidad de sitio con el grupo amina N-terminal de una protema o de un peptido, de modo que se pueda obtener un conjugado de polietilenglicol-protema o peptido homogeneo con un alto rendimiento. A diferencia de los conjugados de la tecnica anterior, el conjugado obtenido de acuerdo con la presente invencion permite minimizar la reduccion de la actividad de la protema sin modificar qmmicamente la protema, y por lo tanto, el conjugado tiene un excelente efecto farmacologico. Ademas, debido a que el conjugado es homogeneo, el procedimiento de preparacion del conjugado se puede simplificar. Por otra parte, el conjugado tiene una eficacia biologica uniforme in vivo y muestra una fuerte resistencia a la hidrolisis y, por lo tanto, un largo tiempo de duracion in vivo. Por consiguiente, el conjugado tiene el efecto de aumentar la eficacia y la estabilidad in vivo del farmaco de protema.
Claims (16)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Un conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol que tiene unido al mismo un compuesto que contiene un catecol de la siguiente formula 1, en el que la protema o el peptido esta mono-PEGilado en el grupo amina N-terminal con el catecol del derivado de polietilenglicol:
imagen1 - 2. El conjugado de una proteina o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con lareivindicacion 1, en el que el polietilenglicol es uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en aldefndo de metoxipolietilenglicol, succinimidilpropionato de polietilenglicol, succinimidilbutanoato de metoxipolietilenglicol, succinimidilsuccinato de metoxipolietilenglicol, benzotriazolcarbonato de metoxipolietilenglicol, epoxido de metoxipolietilenglicol, carbonilimidazol de metoxipolietilenglicol, p-nitrofenilcarbonato de metoxipolietilenglicol, isocianato de metoxipolietilenglicol, amina de metoxipolietilenglicol que contiene amina primaria, hidrazida de metoxipolietilenglicol y metoxicarboxil-polietilenglicol que contiene grupos carboxilo.
- 3. El conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con lareivindicacion 1, en el que el polietilenglicol es de una forma cualquiera seleccionada del grupo que consiste en forma lineal, forma ramificada, forma de cepillo y forma estrellada.
- 4. El conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con lareivindicacion 3, en el que el compuesto que contiene un catecol es uno cualquiera seleccionado del grupo queconsiste en 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina que contiene grupos carboxilo y amina, 3-hidroxi-tiramina que contiene grupos amina, acido 3,4-dihidroxihidrocinamico que contiene grupos carboxilo, 3,4-dihidroxibenzaldefndo que contiene grupos aldefndo y norepinefrina.
-
5. El conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con lareivindicacion 1, en el que el peso molecular del compuesto que contiene un catecol es de 1000 Da o inferior. -
6. El conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con lareivindicacion 1, en el que el peso molecular del polietilenglicol es de 500 a 100 000 Da. -
7. El conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con lareivindicacion 1, en el que la protema es una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en lisozima, hormona de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento epidermico (EGF), hormona de crecimiento humana (hGH), interferon (IFN), interleucina-2 (IL-2), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH), hormona liberadora de hormona del crecimiento (GHRH), urato oxidasa de mairnfero (uricasa) y arginina desiminasa (ADI). - 8. El conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con lareivindicacion 1, en el que el peptido es uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en bisagra-7, bisagra-3, buforina, histonina, protegrina, indolicidina, histatina, BIP, magainina 2, peptido de tipo glucagon (GLP-1), agonista de GNRH/LHRH, analogos de somatostatina, peptido inmunorregulador glatiramero, calcitonina de salmon, desmopresina, peptidos inhibidores de la coagulacion de plaquetas, eptifibatida e inhibidor de la fusion del VIH enfuvirtida.
- 9. Un procedimiento de preparacion de un conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol que tiene unido al mismo un compuesto que contiene un catecol de la siguiente formula 1, en el que la protema o el peptido esta mono-PEGilado en el grupo amina N-terminal con el catecol del derivado de polietilenglicol:5101520253035[Formula 1]HO
imagen2 comprendiendo el procedimiento las etapas de:(a) disolver la protema o el peptido en un reactor;(b) disolver el derivado de polietilenglicol en otro reactor; y(c) anadir a, y hacer reaccionar con, la solucion de la etapa (b) la solucion de la etapa (a). - 10. El procedimiento de preparacion de un conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el polietilenglicol es uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en aldelmdo de metoxipolietilenglicol, succinimidilpropionato de polietilenglicol, succinimidilbutanoato de metoxipolietilenglicol, succinimidilsuccinato de metoxipolietilenglicol, benzotriazolcarbonato de metoxipolietilenglicol, epoxido de metoxipolietilenglicol, carbonilimidazol de metoxipolietilenglicol, p- nitrofenilcarbonato de metoxipolietilenglicol, isocianato de metoxipolietilenglicol, amina de metoxipolietilenglicol que contiene amina primaria, hidrazida de metoxipolietilenglicol y metoxicarboxil-polietilenglicol que contiene grupos carboxilo.
- 11. El procedimiento de preparacion de un conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el compuesto que contiene un catecol es uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina que contiene grupos carboxilo y amina, 3-hidroxi- tiramina que contiene grupos amina, acido 3,4-dihidroxihidrocinamico que contiene grupos carboxilo, 3,4- dihidroxibenzaldehfdo que contiene grupos aldehfdo y norepinefrina.
- 12. El procedimiento de preparacion de un conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el procedimiento comprende ademas la etapa (d) de dializar la solucion de la etapa (c) y luego separar el conjugado de la solucion dializada.
- 13. El procedimiento de preparacion de un conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que la etapa (d) es separar el conjugado a traves de cromatograffa en fase lfquida.
- 14. El procedimiento de preparacion de un conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que la etapa (b) es disolver el derivado de polietilenglicol con un agente de oxidacion a una proporcion molar de 1:1 a 1:10 con respecto al derivado de polietilenglicol en el reactor.
- 15. El procedimiento de preparacion de un conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con la reivindicacion 14, en el que el agente de oxidacion es uno cualquiera o mas seleccionados del grupo que consiste en NaIO4, MnCh, FeCh, FeCh, KMnO4, H2O2, Na2Cr2O7y Na3VO4.
- 16. El procedimiento de preparacion de un conjugado de una protema o de un peptido con un derivado de polietilenglicol de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que la etapa (b) se lleva a cabo de 4 a 25 °C durante 2 a 100 horas.
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