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ES2617783T3 - Sensor del sustrato de quinasa - Google Patents

Sensor del sustrato de quinasa Download PDF

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ES2617783T3
ES2617783T3 ES12706065.5T ES12706065T ES2617783T3 ES 2617783 T3 ES2617783 T3 ES 2617783T3 ES 12706065 T ES12706065 T ES 12706065T ES 2617783 T3 ES2617783 T3 ES 2617783T3
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Spain
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luciferase
tyk2
rpapi
pxp2d2
pmet7
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Jan Tavernier
Samuel LIEVENS
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Universiteit Gent
Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
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Universiteit Gent
Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
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Abstract

Un complejo de proteínas citoplasmáticas que comprende (a) una primera proteína de fusión recombinante que comprende una quinasa mutante condensada a un primer polipéptido de interacción, en donde dicha quinasa mutante se selecciona del grupo que consiste en una tirosina quinasa constitutiva mutante y una tirosina quinasa inactiva que es activada por la adición de un pequeño compuesto exógeno y (b) una segunda proteína de fusión recombinante que comprende un dominio que comprende un sitio de fosforilación del informador, con lo que dicho dominio está condensado a un segundo polipéptido de interacción.

Description

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El plásmido informador pXP2d2-rPAPI-luciferasa utilizado en los ejemplos contiene el promotor rPAPI (Proteína I Asociada a la Pancreatitis de rata) dependiente STAT3 que dirige un gen informador de luciferasa de luciérnaga como se ha descrito previamente (documento WO0190188, Eyckerman et al., 2001).
Procedimiento de transfección
5 Las transfecciones se llevaron a cabo utilizando un método de fosfato de calcio estándar. Células HEK293-T fueron sembradas en placas negras de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejido a razón de 10.000 células/pocillo en un medio de cultivo de 100 μΙ (DMEM suplementado con FCS al 10%). Veinticuatro horas más tarde, se prepararon mezclas de ADN de plásmido que contenía los plásmidos que codifican las proteínas de fusión con la primera y segunda proteínas interactuantes y plásmidos informadores. El ADN fue suplementado con 10 μΙ de CaCl2 2,5 M y
10 agua doblemente destilada a un volumen final de 100 μΙ. Esta mezcla se añadió gota a gota a 100 μΙ de tampón 2xHeBS (NaCl 280 mM, Na2HPO4 1,5 mM, Hepes 50 mM, pH 7,05), al tiempo que se sometían vigorosamente a un vórtex. Después de incubación a temperatura ambiente durante 15 min para permitir que se formaran precipitados de ADN, la disolución se añadió a las células a razón de 10 μΙ/pocillo. Las células se incubaron a 37°C, 8% de CO2. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se midió la actividad luciferasa utilizando el kit de sistema de
15 ensayo de luciferasa (Promega) en un luminómetro TopCount (Perkin-Elmer). Cada una de las transfecciones se realizó por triplicado y se utilizó la media de las lecturas de actividad de luciferasa en los cálculos. Una disolución madre de Nutlina-3 (Sigma) de 20 mM en DMSO se diluyó en medio de cultivo y se añadió a las células 24 h después de la transfección. Se añadió imidazol (Sigma) diluido en medio de cultivo a las células 24 h después de la transfección.
Código del cebador oligonucleótidos
de SEQ N° ID Secuencia (5' > 3')
MBU-O-6486
imagen9 8 imagen10 imagen11
MBU-O-6487
imagen12 9 imagen13 GGGGAATTCGCACACGCTGAACACTGAAGG
MBU-O-3879
imagen14 10 imagen15 imagen16
MBU-O-3880
imagen17 11 imagen18 imagen19
MBU-O-3912
imagen20 12 imagen21 GCGGAATTCATGTGCAATACCAACATGTCTG
MBU-O-3913
imagen22 13 imagen23 CGCGCGGCCGCCTAGGGGAAATAAGTTAGCAC
MBU-O-2277
imagen24 14 imagen25 GCGAGAATTCGAGGAGCCGCAGTCAGATCC
MBU-O-2273
imagen26 15 imagen27 CGCTGCGGCCGCTTAGCGGGGAGCAGCCTCTGGC
MBU-O-6653
imagen28 16 imagen29 imagen30
MBU-O-6655
imagen31 17 imagen32 GGGCTCGAGGAATTCCGCAGCTATACTGTCCCGG
MBU-O-6656
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Código del cebador oligonucleótidos
de SEQ N° ID Secuencia (5' > 3')
MBU-O-6657
imagen36 19 imagen37 GGGCTCGAGGAATTCGAAGTAGTCCTCCAGGAAGG
MBU-O-3813
imagen38 20 imagen39 CGTACGAATTCGGGAGCTCGTTTTTAGATGGAATAG
MBU-O-3814
imagen40 21 imagen41 imagen42
MBU-O-7811
imagen43 22 imagen44 CATTTAATTAAACCTCTGCGCCACTGGGGG
MBU-O-7812
imagen45 23 imagen46 CATGAATTCGCACACGCTGAACACTGAAGGG
MBU-O-7341
imagen47 24 imagen48 CCGAGACCTAGCCGCGGCCAACGTGCTGC
MBU-O-7342
imagen49 25 imagen50 GCAGCACGTTGGCCGCGGCTAGGTCTCGG
Ejemplo 1: Detección de la interacción entre subunidades de transcriptasa inversa (RT) de VIH1
Con el fin de determinar la funcionalidad del ensayo, se sometió a ensayo la interacción entre las subunidades de VIH1 que forman homodímeros y heterodímeros mediante la transfección de las siguientes combinaciones de plásmidos (100 ng de la construcción de fusión Tyk2(C), 1 µg de la construcción de fusión gp130 y 50 ng de la construcción de informador de luciferasa) de acuerdo con los métodos descritos anteriormente:
a) pMET7-HA-Tyk2(C)-RTp66 + pMG2-RTp51 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa
b) pMET7-HA-Tyk2(C)-RTp66 + pMG2-RTp66 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa
c) pMET7-HA-Tyk2(C)-RTp51 + pMG2-RTp51 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa
Se determinó la señal de fondo para cada uno de los polipéptidos de fusión Tyk2(C) mediante la transfección del plásmido que lo codifica junto con un plásmido que codifica un fragmento de gp130 no condensado (pMG1) y el plásmido informador de luciferasa (pMET7-HA-Tyk2(C)-RTp66 + pMG1 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa en a) y b); pMET7-HA-Tyk2(C)-RTp51 + pMG1 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa en c)). La inducción múltiple para cada una de las interacciones testadas se calculó como la relación de la actividad de luciferasa medida en relación con la actividad de luciferasa medida para la señal de fondo correspondiente. Los resultados (Figura 2A) muestran señales claras tanto para los homodímeros como para los heterodímeros de RT. La señal más fuerte era la del heterodímero p66p51, se obtuvieron señales inferiores, pero aún robustas para los homodímeros p66 y p51. Esta tendencia se corresponde con las afinidades medidas para las interacciones p66-p51, p66-p66 y p51-p51 en ensayos de interacción in vitro, que se informó que eran 0,3 μΜ, 4μΜ y 230 μΜ, respectivamente (Venezia et al., 2006). Estos datos ilustran la alta sensibilidad del método.
Ejemplo 2: Interacción entre proteínas nucleares
Para determinar si el método puede detectar interacciones entre proteínas nucleares, los autores de la invención han sometido a ensayo la interacción entre la integrasa (IN) de VIH1 y LEDGF humana y entre p53 y MDM2 humanas, proteínas con una localización nuclear. Las células se transfectaron con las siguientes combinaciones de plásmidos (250 ng de la construcción de fusión Tyk2(C), 500 ng de la construcción de fusión gp130 y 50 ng de la construcción de informador de luciferasa) de acuerdo con los métodos descritos anteriormente:
a) pMET7-HA-Tyk2(C)-LEDGF + pMG2-IN + pXP2d2-rPAPI-luciferasa
b) pMET7-HA-Tyk2(C)-MDM2 + pMG1-p53 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa
Se determinó la señal de fondo para cada uno de los polipéptidos de fusión Tyk2(C) mediante la transfección del plásmido que lo codifica junto con un plásmido que codifica un fragmento de gp130 no condensado (pMG1) y el plásmido informador de luciferasa (pMET7-HA-Tyk2(C)-LEDGF + pMG1 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa en a); pMET7-HA-Tyk2(C)-MDM2 + pMG1 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa en b)). La inducción múltiple para cada una de las interacciones testadas se calculó como la relación de la actividad de luciferasa medida en relación con la actividad de luciferasa medida para la señal de fondo correspondiente. El resultado (Figura 3) demuestra que estas
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interacciones dan lugar a señales fuertes, lo que indica que el método es capaz de detectar interacciones en el núcleo.
Ejemplo 3: Interrupción dependiente de la dosis de la interacción entre p53 y MDM2 humana por Nutlina-3
Para demostrar que el método puede detectar la modulación de las interacciones proteína-proteína de moléculas pequeñas los autores de la invención analizaron la interacción entre p53 y MDM2, que se ha informado que es interrumpida por Nutlina-3, un miembro de la familia de nutlinas de potenciales nuevos compuestos contra el cáncer (Vassilev et al., 2004). Las células fueron transfectadas con las siguientes combinaciones de plásmidos (100 ng de la construcción de fusión Tyk2(C), 1000 ng de la construcción de fusión gp130 y 50 ng de la construcción de informador de luciferasa) de acuerdo con los métodos descritos anteriormente:
a) pMET7-HA-Tyk2(C)-p53(N) + pMG1 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa
b) pMET7-HA-Tyk2(C)-p53(N) + pMG1-EFHA1 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa
c) pMET7-HA-Tyk2(C)-p53(N) + pMG2-MDM2 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa
Después de la transfección, las células fueron tratadas con 0-14-41-123-370-1111-3333nM Nutlina-3, concentración final. Los resultados mostrados en la Figura 4 demuestran una disminución dependiente de la dosis de la señal para la interacción entre p53 (región N-terminal que contiene el dominio de unión de MDM2) y MDM2 tras el tratamiento con Nutlina-3, mientras que la señal correspondiente a la interacción con EFHA1 (que se une a Tyk2(C) en sí) no se ve afectada por este tratamiento. La señal procedente de una transfección de control de combinar pMET7-HATyk2(C)-p53(N) y el plásmido pMG1 que codifica un fragmento de receptor gp130 no condensado es baja y tampoco se ve afectada por el tratamiento de Nutlina-3. Estos datos indican que el método puede detectar cambios dinámicos en los complejos de proteínas que dependen de la adición de componentes exógenos.
Ejemplo 4: Incorporación de otros dominios de quinasa en el método
Para apoyar el hecho de que el método no se limita al uso del dominio quinasa derivado de Tyk2, los autores de la invención han sometido a ensayo proteínas de fusión que comprenden los dominios de quinasa de Jak2 o c-Src. De manera similar a Tyk2, Jak2 pertenece a la familia Jak de tirosina quinasas asociadas al receptor. c-Src pertenece a la familia de tirosina quinasas no receptora de Src. Las células fueron transfectadas con las siguientes combinaciones de plásmidos (250 ng de la construcción de fusión de quinasa, 1000 ng de la construcción de fusión gp130 y 50 ng de la construcción de informador de luciferasa) de acuerdo con los métodos descritos anteriormente:
a) pMET7-HA-Tyk2(C)-RTp66 + pMG2-RTp66 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa
b) pMET7-HA-Jak2(C)-RTp66 + pMG2-RTp66 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa
c) pMET7-HA-c-Src(K)-RTp66 + pMG2-RTp66 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa La actividad de luciferasa se muestra como la inducción múltiple con respecto a la actividad de luciferasa medida en células transfectadas con la misma fusión del dominio RTp66-quinasa, un fragmento de gp130 no condensado y el plásmido informador de luciferasa (pMET7-HA-Tyk2(C)-RTp66 + pMG1 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa en a); pMET7HA-Jak2(C)-RTp66 + pMG1 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa en b); pMET7-HA-c-Src(K)-RTp66 + pMG1 + pXP2d2-rPAPIluciferasa en c)). La inducción múltiple para cada una de las interacciones testadas se calculó como la relación de la actividad de luciferasa medida en relación con la actividad de luciferasa medida para la señal de fondo correspondiente. El resultado (Figura 5) indica que la interacción entre las subunidades RTp66 también puede detectarse utilizando proteínas de fusión con dominios de quinasa de otras quinasas distintas de Tyk2.
Ejemplo 5: Versión inducible del método
Una versión inducible del método fue ideada para añadir un nivel adicional de control y para permitir la separación temporal de los eventos de interacción de proteínas y de generación de la señal. Esto último podría ser importante en los casos en que la modificación de los polipéptidos de interacción por parte de la actividad de quinasa prohíbe la interacción. Se ha descrito un mutante de tirosina quinasa Src cuya actividad se hace inducible por la pequeña molécula imidazol por una mutación de arginina a alanina en el centro catalítico de la enzima (Qiao et al., 2006). La mutación puntual correspondiente de esta arginina catalítica conservada (R1027) fue generada en Tyk2, condensada a RTp66 y testada en una versión inducible por imidazol del ensayo. Las células fueron transfectadas con las siguientes combinaciones de plásmidos (250 ng de la construcción de fusión de quinasa, 250 ng de la construcción de fusión gp130 y 50 ng de la construcción informador de luciferasa) de acuerdo con los métodos descritos anteriormente:
a) pMET7-HA-Tyk2(C)-RTp66 + pMG1 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa
b) pMET7-HA-Tyk2(C)-RTp66 + pMG2-RTp51 + pXP2d2-rPAPI-luciferasa
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Claims (1)

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