ES2613263T3 - Sondas oligonucleotídicas marcadas usadas para análisis de secuencias de ácidos nucleicos - Google Patents
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Abstract
Un método para preparar un oligonucleótido marcado para su uso como una sonda de hibridación en una reacción de PCR que comprende: (a) proporcionar un colorante fluorescente que es un derivado de rodamina en el que dicho colorante fluorescente está unido con una molécula enlazadora bifuncional; (b) unir un grupo reactivo al colorante fluorescente a través de la molécula enlazadora bifuncional para incorporar dicho colorante fluorescente dentro del oligonucleótido; (c) incorporar el colorante fluorescente entre dos nucleótidos internos del oligonucleótido, con la condición de que el colorante fluorescente no se incorpore en el extremo 5' del oligonucleótido, en el que la molécula enlazadora bifuncional consiste en L-treoninol o (2R,3R)-2-amino-1,3-butanodiol.
Description
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DESCRIPCION
Sondas oligonucleotidicas marcadas usadas para analisis de secuencias de acidos nucleicos Campo de la invencion
La invencion se refiere a metodos para la deteccion y analisis de secuencias de acidos nucleicos mediante el uso de oligonucleotidos marcados con fluorescencia. La invencion tiene aplicaciones para formacion de genotipos, deteccion de patogenos y diagnostico in vitro.
Antecedentes de la invencion
El desarrollo de tecnologfa de amplificacion de acido nucleico ha revolucionado el analisis genetico y la ciencia de la ingeniena. Por ejemplo, la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza comunmente para amplificar acidos nucleicos diana espedficos usando acidos nucleicos cebadores seleccionados, por ejemplo, para facilitar la deteccion del acido nucleico diana como parte de una aplicacion de diagnostico, forense u otra aplicacion. Por lo general, los cebadores funcionan en pares que estan disenados para la ampliacion uno hacia el otro para cubrir la region diana seleccionada. Un ciclo de PCR habitual incluye una etapa de desnaturalizacion a alta temperatura (por ejemplo, 85 °C o mas) durante la cual las hebras de acido nucleico bicatenario se separan las unas de las otras, una etapa de hibridacion a baja temperatura (por ejemplo, 45-65 °C) durante la cual los cebadores se hibridan con la hebra simple separada, y una etapa de extension a temperatura intermedia (por ejemplo, aproximadamente 72 °C) durante la cual una acido nucleico polimerasa amplfa los cebadores. Tambien se usan procedimientos de termociclado de dos temperaturas. Por lo general, estos incluyen una etapa de desnaturalizacion a alta temperatura y una etapa de ampliacion de la hibridacion a baja temperatura.
Se han desarrollado diversas estrategias para detectar productos de amplificacion y uno de los metodos que mas se utiliza en general es el ensayo de 5' nucleasa o TaqMan®. Por lo general, el ensayo de nucleasa utiliza la actividad de nucleasa de las posiciones 5' a 3' de ciertas ADN polimerasas para escindir las sondas oligonucleotidicas de nucleasa en la posicion 5' durante el transcurso de la pCr. Este ensayo permite tanto la amplificacion de una diana como la liberacion de marcadores para deteccion, por lo general sin recurrir a multiples etapas de manipulacion de productos amplificados. Las sondas de nucleasa en la posicion 5' por lo general contienen tfpicamente restos de marcado, tales como un colorante indicador fluorescente y un colorante inactivador. Cuando la sonda esta intacta, la proximidad del colorante indicador por lo general da como resultado la supresion de la fluorescencia del indicador. Durante una reaccion de nucleasa en la posicion 5', la escision de la sonda separa el colorante indicador y el colorante inactivador entre sf, dando como resultado un aumento detectable de la fluorescencia del indicador. La acumulacion de productos de PCR o amplicones se detecta por lo general de forma indirecta controlando este aumento de fluorescencia en tiempo real.
La tecnologfa TaqMan® tambien se puede usar para amplificacion de ADN y deteccion de genotipos en un ensayo de una sola etapa. En este formato, se usan dos sondas oligonucleotfdicas, una para cada alelo, que estan disenadas para hibridarse con una region del molde de ADN que contiene el nucleotido espedfico del alelo. Cada una de las sondas se marca con un colorante fluorescente diferente. Durante la etapa de amplificacion de PCR, la sonda que esta perfectamente emparejada con el molde se digiere, dando lugar a un aumento de la senal de fluorescencia a partir del colorante correspondiente. Sin embargo, la sonda que tiene una unica falta de coincidencia de nucleotido no se puede hibridar de manera estable con el ADN molde, y no se puede degradar con la actividad de nucleasa. El colorante indicador correspondiente de la sonda de "con falta de coincidencia" aun podna estar desactivado por la molecula inactivadora y podna no presentar senal fluorescente. Con la disponibilidad de instrumentos de deteccion de fluorescencia mas sofisticados, se puede realizar la formacion de genotipos de multiples genes o de multiples posiciones alelicas de un gen en este tipo de ensayo usando multiples sondas, cada una de ellas marcada con cada colorante indicador fluorescente unico.
El documento WO 2009/038548 desvela oligonucleotidos que contienen un colorante indicador fluorescente marcado y una molecula inactivadora de fluorescencia y, por ejemplo, describe un proceso en el que un acido nucleico esta marcado con un colorante de rodamina en la posicion 3'. El proceso desvelado comprende las etapas de proporcionar un colorante de rodamina, unir un enlazador al mismo y acoplar el colorante al oligonucleotido a traves del enlazador. El nucleotido marcado se usa como una sonda para detectar un acido nucleico diana en reacciones de amplificacion. Sin embargo, los oligonucleotidos marcados apropiados tienen una estabilidad al almacenamiento poco adecuada que da como resultado una disminucion enorme de las senales de fluorescencia en las curvas de crecimiento generadas por la sonda.
Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos para generar una sonda oligonucleotfdica marcada que contiene un colorante obtenido a partir de rodamina fluorescente para su uso en reacciones de PCR para detectar un acido nucleico diana. En un primer aspecto, la invencion se refiere a un metodo para preparar un oligonucleotido marcado para su uso como una sonda de hibridacion en una reaccion de PCR que comprende:
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proporcionar un colorante fluorescente que es un derivado de rodamina en el que dicho colorante fluorescente esta unido con una molecula enlazadora bifuncional; unir un grupo reactivo al colorante fluorescente a traves de la molecula enlazadora bifuncional para incorporar dicho colorante fluorescente dentro del oligonucleotido;
incorporar el colorante fluorescente entre dos nucleotidos internos del oligonucleotido, con la condicion de que el colorante fluorescente no se incorpore en el extremo 5' terminal del oligonucleotido, en el que la molecula enlazadora bifuncional consiste en L-treoninol o (2R,3R)-2-amino-1,3-butanodiol.
En un segundo aspecto, la invencion se refiere a un metodo para detectar la presencia o ausencia de un acido nucleico diana o un alelo diana de un acido nucleico en una muestra de ensayo, que comprende:
realizar una reaccion de PCR con el uso de un oligonucleotido sonda marcado que se hibrida con el acido nucleico diana, en el que el oligonucleotido sonda marcado se caracteriza por que tiene: un colorante fluorescente que es un derivado de rodamina que se une con una molecula enlazadora bifuncional; y un grupo reactivo unido a la molecula enlazadora bifuncional para incorporar el colorante fluorescente entre dos nucleotidos internos del oligonucleotido, con la condicion de que el colorante fluorescente no se incorpore en el extremo 5' terminal del oligonucleotido, en el que la molecula enlazadora bifuncional consiste en L-treoninol o (2R,3R)-2-amino-1,3-butanodiol; detectar la senal del colorante fluorescente en el que la intensidad de dicha senal representa la presencia o ausencia del acido nucleico diana.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 muestra las estructuras qmmicas de (A) nucleo del colorante rodamina y (B) L-treoninol.
La Figura 2 muestra la estructura qmmica de JA270 (analogo de acido carboxflico)
La Figura 3 muestra el patron de elucion de los oligonucleotidos en una columna de UPLC en el reactivo de referencia del colorante en la posicion 5 (mezcla del colorante 5, mezcla 2 pM) que se realizo por la manana (parte superior) y por la tarde (parte inferior) del mismo dfa.
La Figura 4 muestra el analisis de UPLC del reactivo de referencia del colorante en la posicion 5 que contiene el oligonucleotido de JA270 marcado interno usando deteccion de fluorescencia.
La Figura 5 muestra los oligonucleotidos presentes en la solucion de "mezcla madre", tal como se analiza mediante UPLC.
La Figura 6 muestra los oligonucleotidos presentes en la misma solucion de "mezcla madre" despues de 3 dfas de almacenamiento a 4 °C, tal como se analiza mediante UPLC.
La Figura 7 muestra las curvas de crecimiento de PCR genera las usando la sonda R33 que se habfa almacenado durante 0 dfas, 3 semanas o 6 semanas con el molde de plasmido de control positivo (RR) o el molde de plasmido de control negativo (CC).
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el significado que normalmente entiende una persona con experiencia en la materia a la que pertenece la presente invencion. Las siguientes referencias proporcionan a alguien con experiencia una definicion general de muchos de los terminos usados en la presente invencion: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and
Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger et al., (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale y Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como se usa en el presente documento, los siguientes terminos tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique de otro modo.
El termino "acido nucleico" se refiere a polfmeros de nucleotidos (por ejemplo, ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, analogos de nucleotidos, etc.) y comprende acidos desoxirribonucleicos (ADN), acidos ribonucleicos (ARN), tnbridos de ADN-ARN, oligonucleotidos, polinucleotidos, aptameros, acidos nucleicos peptfdicos (PNA), conjugados de PNA-ADN, conjugados de PNA-ARN, etc., que comprenden nucleotidos unidos de forma covalente entre sf, de una manera ya sea lineal o ramificada. Por lo general, un acido nucleico es monocatenario o bicatenario y por lo general contendra enlaces fosfodiester, aunque en algunos casos estan incluidos los analogos de acidos nucleicos que pueden tener cadenas principales alternativas, que incluyen por ejemplo fosforamida (Beaucage et al., (1993) Tetrahedron 49 (10): 1925); fosforotioato (Mag et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19: 1437; y Pat. de Estados Unidos N.° 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al., (1989) J. Am. Chem. Soc.
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111: 2321), uniones de O-metilfosforoamidita (vease Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)), y las cadenas principales y uniones de de acidos nucleicos peptidicos (vease, Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1895). Otros analogos de acido nucleico incluyen aquellos con cadenas principales con carga positiva (Denpcy et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097); cadenas principales no ionicas (Pat. de Estados Unidos N.°s 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863) y cadenas principales sin ribosa, incluyendo las que se describen en las Pat. de Estados Unidos N.°s 5.235.033 y 5.034.506. Los acidos nucleicos que contienen uno o mas azucares carbodclicos estan tambien incluidos dentro de la definicion de acidos nucleicos (vease Jenkins et al., (1995) Chem. Soc. Rev. pp. 169-176), y los analogos tambien se describen, por ejemplo, en Rawls, C y E News, 2 de Jun. de 1997, pagina 35. Estas modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato se pueden hacer para facilitar la adicion de restos adicionales tales como marcadores, o para alterar la estabilidad y la semivida de tales moleculas en entornos fisiologicos.
Ademas de las bases heterodclicas de origen natural, que por lo general se encuentran en los acidos nucleicos (por ejemplo, adenina, guanina, timina, citosina y uracilo), los analogos de nucleotido tambien pueden incluir bases heterodclicas que no son de origen natural, tales como las que se describen, por ejemplo, en Seela et al., (1999) Helv. Chim. Acta 82: 1640. Ciertas bases usadas en analogos de nucleotido actuan como modificadores de la temperatura de fusion (Tm). Por ejemplo, algunas de estas incluyen 7-desazapurinas (por ejemplo, 7- desazaguanina, 7-desazaadenina, etc.), pirazolo[3,4-d]pirimidinas, propinil-dN (por ejemplo, propinil-dU, propinil-dC, etc.), y similares. Vease, por ejemplo, la Pat. de Estados Unidos N.° 5.990.303. Otras bases heterodclicas representativas incluyen, por ejemplo, hipoxantina, inosina, xantina; derivados 8-aza de 2-aminopurina, 2,6- diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; derivados 7-desaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; 6-azacitidina; 5- fluorocitidina; 5-clorocitidina; 5-yodocitidina; 5-bromocitidina; 5-metilcitidina; 5-propinilcitidina; 5-bromoviniluracilo; 5- fluorouracilo; 5-clorouracilo; 5-yodouracilo; 5-bromouracilo; 5-trifluorometiluracilo; 5-metoximetiluracilo; 5-etiniluracilo; 5-propiniluracilo, y similares.
Un "nucleosido" se refiere a un componente de acido nucleico que comprende una base o grupo basico (que comprende al menos un anillo homodclico, al menos un anillo heterodclico, al menos un grupo arilo, y/o similares) unido de forma coherente a un resto de azucar (un azucar ribosa o un azucar desoxirribosa), un derivado de un resto de azucar, o equivalente funcional de un resto de azucar (por ejemplo, un anillo carbodclico). Por ejemplo, cuando un nucleosido incluye un resto de azucar, por lo general la base esta unida a una posicion 1' de ese resto de azucar. Como se ha descrito anteriormente, una base puede ser una base de origen natural o una base de origen no natural. Los nucleosidos a modo de ejemplo incluyen ribonucleosidos, desoxirribonucleosidos, didesoxirribonucleosidos y nucleosidos carbodclicos.
Un "nucleotido" se refiere a un ester de un nucleosido, por ejemplo, un ester fosfato de un nucleosido, que tiene uno, dos, tres o mas grupos fosfato unidos covalentemente a una posicion 5' de un resto de azucar del nucleosido.
Los terminos "polinucleotido" y "oligonucleotido" se usan indistintamente. "Oligonucleotido" es un termino usado en ocasiones para describir un polinucleotido mas corto. Un oligonucleotido puede estar formado por al menos 6 nucleotidos, por ejemplo al menos aproximadamente 10-12 nucleotidos, o al menos aproximadamente 15-30 nucleotidos que corresponden a una region de la secuencia de nucleotidos designada.
La expresion "tipo silvestre", como se usa en el presente documento, se refiere a un gen o alelo que tiene las caractensticas de ese gen o alelo cuando se afsla de una fuente de origen natural. Un gen de tipo silvestre o un alelo de tipo silvestre es el que se observa mas frecuentemente en una poblacion y de forma arbitraria se denomina forma "normal" o "de tipo silvestre" del gen o alelo.
Por el contrario, el termino "mutante" o "mutado" se refiere a un gen o alelo que presenta modificaciones en la secuencia cuando se compara con el gen o alelo de tipo silvestre. El termino "mutacion" se refiere a un cambio en la secuencia de nucleotidos de una secuencia de acido nucleico normalmente conservada que da como resultado la formacion de un mutante tal como se diferencia a partir de la secuencia normal (no alterada) o de tipo silvestre. Por lo general, las mutaciones se pueden dividir en dos clases generales, es decir, sustituciones de pares de bases (por ejemplo, sustituciones de un solo nucleotido) y mutaciones de desplazamiento de marco. Las ultimas implican la insercion o delecion de uno a varios pares de nucleotidos.
El termino "alelo" se refiere a dos secuencias que solo son diferentes en una base o en unas pocas bases.
Los terminos "complementario" o "complementariedad" se usan en referencia a hebras antiparalelas de polinucleotidos relacionadas mediante las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick. Las expresiones "perfectamente complementarias" o "complementarias en un 100 %" se refieren a secuencias complementarias que tienen emparejamiento de Watson-Crick de todas las bases entre las hebras antiparalelas, es decir, no hay faltas de coincidencia entre cualquiera de dos bases en el duplex del polinucleotido. Sin embargo, los duplex se forman entre hebras antiparalelas incluso en ausencia de complementariedad perfecta. Las expresiones "parcialmente complementarias" o "complementarias de forma incompleta" se refieren a cualquier alineacion de bases entre las hebras de polinucleotidos antiparalelas que es perfecta en menos de un 100 % (por ejemplo, existe al menos una
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falta de coincidencia o base no emparejada en el duplex de polinucleotidos). Por lo general, los duplex entre hebras parcialmente complementarias son menos estables que los duplex entre hebras perfectamente complementarias.
El termino "muestra" se refiere a cualquier composicion que contenga o que se supone que contiene acido nucleico. Esta incluye una muestra de tejido o fluido aislado de un individuo, por ejemplo, piel, plasma, suero, fluido espinal, fluido linfatico, fluido sinovial, orina, lagrimas, celulas sangumeas, organos y tumores, y tambien a muestras de cultivos in vitro establecidos a partir de celulas tomadas de un individuo, incluyendo tejidos embebidos en parafina fijados con formalina (FFPET) y acidos nucleicos aislados a partir de los mismos.
La expresion "secuencia primaria" se refiere a la secuencia de nucleotidos en un polinucleotido u oligonucleotido. Las modificaciones del nucleotido tales como modificaciones en la base nitrogenada, modificaciones de azucar u otras modificaciones de la cadena principal no son una parte de la secuencia primaria. Los marcadores, tales como cromoforos conjugados con los oligonucleotidos, tampoco son una parte de la secuencia primaria. Por lo tanto dos oligonucleotidos pueden compartir la misma secuencia primaria pero son diferentes con respecto a las modificaciones y marcadores.
El termino "cebador" se refiere a un oligonucleotido que se hibrida con una secuencia en el acido nucleico diana y es capaz de actuar como un punto de inicio de la smtesis junto con una hebra complementaria de acido nucleico en condiciones adecuadas para tal smtesis. Como se usa en el presente documento, el termino "sonda" se refiere a un oligonucleotido que se hibrida con una secuencia en el acido nucleico diana y que normalmente se puede marcar de manera detectable. La sonda puede tener modificaciones, tales como una modificacion en el extremo 3' terminal que hace que la sonda no se pueda extender mediante acido nucleico polimerasas, y uno o mas cromoforos. Un oligonucleotido con la misma secuencia puede servir como un cebador en un ensayo y como una sonda en un ensayo diferente.
Como se usa en el presente documento, la expresion "molecula enlazadora bifuncional" se refiere a un compuesto que puede unir dos o mas compuestos adicionales en conjunto mediante interaccion de forma qrnmica con los mismos de manera simultanea En la presente invencion, por ejemplo, una molecula enlazadora bifuncional puede tener un dominio funcional que sea adecuado para el acoplamiento a un marcador, tal como un colorante fluorescente y otro dominio funcional u otros dominios funcionales capaces de acoplarse en la posicion en el extremo 5'-terminal, en la posicion en el extremo 3' terminal o en una posicion interna de un oligonucleotido. En la presente invencion, la molecula enlazadora bifuncional podna comprender, por ejemplo, L-treoninol. En la Pat. de Estados Unidos N.° 5.585.481, Pat. de Estados Unidos N.° 6.130.323, Nelson et al., Nucl. Acid. Res. 20: 6253-6259, 1992, documento WO 03/102239 y Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 4347-4351, 1992, se han descrito diversas moleculas enlazadoras bifuncionales capaces de unir un marcador en una posicion interna de un oligonucleotido.
Como se usa en el presente documento, la expresion "secuencia diana", "acido nucleico diana" o "diana" se refiere a una porcion de la secuencia de acidos nucleicos que se va a amplificar, detectar o ambos.
Los terminos "hibridado" e "hibridacion" se refieren a la interaccion de emparejamiento de bases entre los acidos nucleicos que da como resultado la formacion de un duplex. Para conseguir la hibridacion no es un requisito que los acidos nucleicos tengan una complementariedad de un 100 % con respecto a su longitud completa.
Las expresiones "hibridacion selectiva" e "hibridacion espedfica" se refieren a la hibridacion de un acido nucleico predominantemente (50 % o mas de la molecula de hibridacion) casi exclusivamente (90 % o mas de la molecula de hibridacion) a un acido nucleico en particular presente en una mezcla compleja en la que tambien estan presentes otros acidos nucleicos. Por ejemplo, en condiciones de PCR habituales, los cebadores se hibridan de forma espedfica con los acidos nucleicos diana con la exclusion de los acidos nucleicos no diana o tambien presentes en la solucion. Los cebadores hibridados de forma espedfica conducen en la amplificacion del acido nucleico diana para producir un producto de amplificacion del acido nucleico diana que es al menos el producto de amplificacion mas predominante que es preferentemente el producto de amplificacion casi exclusivo (por ejemplo, que representa un 90 % o mas de todos los productos de amplificacion en la muestra). Preferentemente, el producto de amplificacion no espedfico esta presente en cantidades tan pequenas que no se puede detectar o se detecta en cantidades tan pequenas de modo que se puede distinguir facilmente del producto de amplificacion espedfico. De forma analoga, las sondas se hibridan de forma espedfica con los acidos nucleicos diana con la exclusion de los acidos nucleicos no diana tambien presentes en la mezcla de reaccion. Las sondas hibridadas en forma espedfica permiten la deteccion espedfica del acido nucleico diana para generar una senal detectable que es al menos la senal mas predominante y es preferentemente la senal casi exclusiva (por ejemplo, que representa un 90 % o mas de todos los productos de amplificacion en la muestra).
Sondas Espedficas de Alelo
La hibridacion espedfica de alelo se basa en distinguir entre dos moleculas de ADN que difieren en al menos una base por hibridacion de un oligonucleotido que es espedfico para una de las secuencias variantes a un producto amplificado obtenido a partir de la amplificacion de la muestra de acido nucleico. Un ensayo espedfico de alelo puede comprender tambien dos oligonucleotidos espedficos de alelos, por ejemplo, una sonda espedfica de alelo
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para la primera variante y una sonda espedfica de alelo para la segunda variante en la que las sondas se hibridan diferencialmente a una variante con respecto a la otra. La hibridacion espedfica de alelo por lo general en oligonucleotidos cortos, por ejemplo, con una longitud de 15-35 nucleotidos. En la tecnica hay disponibilidad de principios y directrices para disenar dicha sonda. Las condiciones de hibridacion debenan ser lo suficientemente rigurosas como para que existiera una diferencia significativa en la intensidad de hibridacion entre alelos, y preferentemente una respuesta esencialmente binaria, por lo que una sonda se hibrida solamente con uno de los alelos. Algunas sondas se disenan para su hibridacion con un segmento de ADN diana de tal manera que el sitio de interes se alinea con una posicion central de la sonda, pero este diseno no es necesario.
La cantidad y/o presencia de un alelo se determina midiendo la cantidad de sonda espedfica de alelo que se hibrida a la muestra. Por lo general, el oligonucleotido esta marcado con un marcador, tal como un marcador fluorescente. Por ejemplo, se hibridiza una sonda espedfica de alelo que es espedfica para un alelo del acido nucleico diana a acidos nucleicos obtenidos a partir de una muestra biologica en condiciones de hibridacion que dan como resultado una hibridacion preferente con un alelo. La intensidad de la fluorescencia se mide para determinar si el oligonucleotido espedfico se ha hibridado.
El nucleotido presente en el sitio polimorfico de un solo nucleotido se identifica por hibridacion en condiciones de hibridacion suficientemente rigurosas con un oligonucleotido sustancialmente complementario al alelo en una region que abarca el sitio polimorfico y exactamente complementario con el alelo diana en este sitio. En tales condiciones de hibridacion suficientemente rigurosas, los duplex estables se formaran solamente entre la sonda y el alelo diana. Estos oligonucleotidos sonda pueden tener una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 35 nucleotidos, preferentemente una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 nucleotidos.
El uso de oligonucleotidos sustancialmente, en lugar de exactamente, complementarios puede ser deseable en formatos de ensayo en los que la optimizacion de las condiciones de hibridacion es limitada. Por ejemplo, en un formato de ensayo de sonda inmovilizada de multiples dianas, las sondas para cada diana se inmovilizan sobre un unico soporte solido. Las hibridaciones se realizan de forma simultanea poniendo en contacto el soporte solido con una solucion que contiene ADN diana. Como todas las hibridaciones se realizan en condiciones identicas, las condiciones de hibridacion no se pueden optimizar por separado para cada sonda. La incorporacion de faltas de coincidencia en una sonda se puede usar para ajustar la estabilidad del duplex cuando el formato de ensayo impide ajustar las condiciones de hibridacion. El efecto de una falta de coincidencia introducida en particular en la estabilidad del duplex se conoce bien, y la estabilidad del duplex se puede calcular y determinar de forma emprnca de forma rutinaria, como se ha descrito anteriormente. Las condiciones de hibridacion adecuadas, que dependen del tamano y secuencia exactos de la sonda, se pueden seleccionar de forma emprnca usando las directrices proporcionadas en el presente documento y bien conocidas en la tecnica. El uso de sondas oligonucleotfdicas para detectar diferencias de un solo par de bases en secuencia se describe, por ejemplo, en Conner et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 278-282, y en las Pat. de Estados Unidos N.°s 5.468.613 y 5.604.099.
El cambio proporcional en la estabilidad entre un duplex de hibridacion perfectamente emparejado y con falta de coincidencias de una sola base depende de la longitud de los oligonucleotidos hibridados. Los duplex formados con secuencias de sondas mas cortas se desestabilizan proporcionalmente mas por la presencia de una falta de coincidencia. En la practica, para la deteccion espedfica de la secuencia se prefieren los oligonucleotidos con una longitud entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleotidos. Ademas, dado que los extremos de un oligonucleotido hibridado sufren una disociacion aleatoria continua y una nueva hibridacion debido a la energfa termica, una falta de coincidencia en cualquier extremo desestabiliza el duplex de hibridacion menos que una falta de coincidencia que se produzca e internamente. Preferentemente, para la discriminacion de un unico cambio de par de bases en la secuencia diana, se selecciona la secuencia sonda que se hibrida con la secuencia diana de modo que el sitio de mutacion se produce en la region interior de la sonda.
Ensayo de 5-Nucleasa
La deteccion de un acido nucleico diana se puede realizar usando un ensayo "TaqMan®" o de "5'-nucleasa", como
se describe en las Pat. De Estados Unidos N.°s 5.210.015; 5.487.972; y 5.804.375; y en Holland et al., 1988, Proc.
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Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280. En el ensayo TaqMan , las sondas de deteccion marcadas que se hibridan dentro de la region amplificada estan presentes durante la reaccion de amplificacion. Las sondas se modifican para evitar que las sondas actuen como cebadores para la smtesis de ADN. La amplificacion se realiza usando una ADN polimerasa que tiene actividad de exonucleasa de las posiciones 5' a 3'. Durante cada etapa de smtesis de la amplificacion, cualquier sonda que se hibrida con el acido nucleico diana cadena abajo del cebador que se esta ampliando se degrada por la actividad de exonucleasa de las posiciones 5' a 3' de la aDn polimerasa. Por lo tanto, la smtesis de una nueva hebra de diana tambien da como resultado la degradacion de una sonda, y la acumulacion de producto de degradacion proporciona una medida de la smtesis de las secuencias diana.
Cualquier metodo adecuado para detectar el producto de degradacion se puede usar en un ensayo de 5' nucleasa. A menudo, la sonda de deteccion esta marcada con dos colorantes fluorescentes, uno de las cuales es capaz de inactivar la fluorescencia del otro colorante. Los colorantes se unen a la sonda, por lo general con el indicador o colorante detector unido al extremo en el extremo 5' terminal y la inactivacion del colorante unido a un sitio interno,
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de modo que la inactivacion se produce cuando la sonda se encuentra en un estado no hibridado t y una escision de este tipo de la sonda mediante la actividad de exonucleasa de las posiciones 5' a 3' de la ADN polimerasa se produce entre los dos colorantes. La amplificacion da como resultado la escision de la sonda entre los colorantes con una eliminacion simultanea de la inactivacion y un aumento de la fluorescencia observable a partir del colorante inactivado inicialmente. La acumulacion del producto de degradacion se controla midiendo el aumento de la fluorescencia de la reaccion. Las Pat. de Estados Unidos N.°s 5.491.063 y 5.571.673 describen metodos alternativos para detectar la degradacion de la sonda que se produce de manera simultanea con la amplificacion.
Un ensayo de 5' nucleasa para la deteccion de un acido nucleico diana puede emplear cualquier polimerasa que tenga una actividad exonucleasa de las posiciones 5' a 3'. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las polimerasas con actividad de 5'-nucleasa son polimerasas de acido nucleico termoestables y termoactivas. Tales polimerasas termoestables incluyen, pero no se limitan a, formas nativas y recombinantes de polimerasas de una diversidad de especies de los generos eubacterianos Thermus, Thermatoga, y Thermosipho, asf como formas quimericas de los mismos. Por ejemplo, las polimerasas de las especies Thermus que se pueden usar en los metodos de la invencion incluyen ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa de la especie Z05 de Thermus (Z05), especie sps17 de Thermus (sps17), y especie Z05 de Thermus (por ejemplo, como se describe en las Pat. de Estados Unidos N.°s 5.405.774, 5.352.600, 5.079.352, 4.889.8l8, 5.466.591, 5.618.711, 5.674.738 y 5.795.762). Las polimerasas de Thermatoga que se pueden usar en los metodos de la invencion incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa de Thermatoga maritima y ADN polimerasa de Thermatoga neapolitana, mientras que un ejemplo de una polimerasa de a Thermosipho que se puede usar es la ADN polimerasa de Thermosipho africanus. Las secuencias de ADN polimerasas de Thermatoga maritima y Thermosipho africanus estan publicadas en la solicitud internacional WO 92/06200. La secuencia de Thermatoga neapolitana se puede encontrar en la solicitud internacional WO 97/09451.
En el ensayo de nucleasa en la posicion 5', la deteccion de amplificacion es, por lo general, simultanea a la amplificacion (es decir, en "tiempo real"). En algunas realizaciones la deteccion de amplificacion es cuantitativa, y la deteccion de amplificacion es en tiempo real. En algunas realizaciones, la deteccion de amplificacion es cualitativa (por ejemplo, deteccion de punto final de la presencia o ausencia de un acido nucleico diana). En algunas realizaciones, la deteccion de amplificacion es posterior a la amplificacion. En algunas realizaciones, la deteccion de amplificacion es cualitativa y la deteccion de amplificacion es posterior a la amplificacion.
La sonda se puede marcar con cualquier numero de marcadores, pero por lo general es un marcador fluorescente. En algunas realizaciones, el resto fluoroforo se selecciona entre colorantes de la familia de la fluorescema, colorantes de la familia de la polihalofluorescema, colorantes de la familia de la hexaclorofluorescema, colorantes de la familia de la cumarina, colorantes de la familia de la rodamina, colorantes de la familia de la cianina, colorantes de la familia de la oxazina, colorantes de la familia de la tiazina, colorantes de la familia s de la escuarama, colorantes de la familia de los lantanidos quelados, colorantes de la familia azo, colorantes de la familia del trifenilmetano y colorantes de la familia BODIPY®.
El ensayo comprende a menudo una sonda marcada con un marcador fluorescente y un resto inactivador. En algunas realizaciones, el resto inactivador se selecciona del grupo que consiste en colorantes de la familia de fluorescema, colorantes de la familia de polihalofluorescema, colorantes de la familia de hexaclorofluorescema, colorantes de la familia de cumarina, colorantes de la familia de rodamina, colorantes de la familia de cianina, colorantes de la familia de oxazina, colorantes de la tiazina, colorantes de la familia de la escuarama, colorantes de la familia de lantanidos quelados, colorantes de la familia BODIPY®, colorantes de la familia azo; colorantes de la familia de trifenilmetano, restos inactivadores de baja fluorescencia (es decir, "donantes de dim") y restos inactivadores fluorescentes (por ejemplo, los denominados "inactivadores oscuros" incluyendo Black Hole Quenchers™ (BHQ)).
Colorantes obtenidos a partir de rodamina
La rodamina es un colorante fluorescente que contiene una estructura del nucleo tal como se muestra en la Figura 1A. Varios derivados de rodamina, tales como Carboxitetrametilrrodamina (TAMRA) y cloruro de acido de sulforrodamina 101 (Rojo Texas) tambien son colorantes fluorescentes, usados normalmente con fines de formacion de imagenes. En la Patente de Estados Unidos N.° 6.184.379, ('379) se han desvelado nuevos derivados de rodamina cuyos maximos de emision de fluorescencia estan en el intervalo de 600 nm. Estos derivados tienen estructuras que se pueden representar con la siguiente formula:
5
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40
en la que cada uno de Ca, Cb, Cc y Cd indica un atomo de C, Ca y Cb estan unidos en conjunto mediante un enlace sencillo o mediante un enlace doble, y Cc y Cd estan unidos en conjunto mediante un enlace sencillo o mediante un enlace doble; X1, X2, X3, X4, X7 y X10 son hidrogeno y X5, X6, X8, X9, X11 y X12 son metilo.
R1 y R2 son identicos o diferentes y se seleccionan entre un grupo que consiste en hidrogeno y alquilo con 1-20 atomos de C, en la que los restos de alquilo estan opcionalmente sustituidos con al menos un grupo hidroxilo, halogeno, acido sulfonico, amino, carboxi o alcoxicarbonilo, y al menos R1 contiene un grupo que se puede activar; A1, A2, A3, B1 son cualquiera de cloro o fluor y B2 es cualquiera de cloro, fluor o hidrogeno. En la patente '379 tambien se describen dos compuestos en particular, JA270 y JF9, con un analogo de acido carboxflico de JA270 (Figura 2) que se muestra como particularmente adecuado como fluoroforo que se puede usar como en un sistema de transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia (FRET).
Un uso particularmente preferente de JA270 podna ser como un fluoroforo unido a una sonda oligonucleotfdica en un ensayo TaqMan® que se pueden activar mediante una molecula inactivadora apropiada que tambien esta unida a la sonda. Ademas, para maximizar la utilidad de JA270 como un marcador fluorescente, podna ser deseable unir un enlazador bifuncional a JA270 que podna permitir la colocacion del marcador en cualquier parte dentro de la secuencia de oligonucleotidos de la sonda. Un enlazador bifuncional adecuado podna ser L-treoninol o (2R,3R)-2- amino-1,3-butanodiol (Figura 1B), que puede formar un enlace amida con JA270, y que se puede unir en ambos restos de hidroxilo con grupos reactivos convencionales para smtesis de oligonucleotidos tales como fosforamidita y grupos de bloqueo tales como 4,4'dimetoxitritilo (DMT). Como se describe en la presente invencion, la colocacion del colorante JA270 en el SIP interno del oligonucleotido sonda podna presentar una mejora inesperada de la estabilidad y funcion de la sonda.
Polimorfismos en el gen de la Apolipoprote^na E (apoE)
La ApoE es un componente principal de diversas especies de lipoprotema y desempena un papel fundamental en el control de los niveles de colesterol en plasma. El gen que codifica la apoE esta presente en formas heterogeneas, algunas de las cuales se sabe que influyen de forma diferencial en la actividad transcripcional o codifican de forma estructural y funcional distintas isoformas de protema. Las tres isoformas principales de apoE, denominadas apoE2, apoE3, y apoE4, tienen diferentes afinidades de union hacia el receptor de lipoprotema de baja densidad (lDl), y estan asociadas con diferentes niveles de lfpidos y lipoprotemas en plasma. Estas tres isoformas principales se caracterizan por la presencia de cistina (Cys) para las formas apoE2 y apoE3 y arginina (Arg) para la forma apoE4 en la posicion 112 de la cadena polipeptfdica de apoE y Cys para la forma apoE2 y Arg para las formas apoE3 y apoE4 en la posicion 158. La variabilidad de los aminoacidos 112 y 158 se basa en polimorfismos de nucleotidos individuales (SNP) presentes en las posiciones 334 y 472 del nucleotido, respectivamente, del gen de apoE. En cualquier posicion, Cys esta determinada por el codon TGC y Arg esta determinada por el codon CGC. En el presente documento, estos alelos se denominan los alelos 334T/C y los alelos 472 T/C. Las combinaciones, 334T/472T, 334T/472C y 334C/472C forman los alelos de apoE espedficos de la isoforma, £2, £3, y £4, respectivamente.
El interes en la formacion de genotipos de apoE ha sido elevado debido a su reconocimiento por proporcionar una informacion valiosa en la identificacion de individuos con riesgo de enfermedades cardiovasculares y neurologicas.
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En particular, se encontro que la presencia del alelo £4 de apoE estaba asociada con la patogenesis de la enfermedad arterial periferica y coronaria, asf como trastornos neurodegenerativos que incluyen las formas familiares esporadica y de inicio tardfo de la enfermedad de Alzheimer. Los metodos usados normalmente para la formacion de genotipos incluyen analisis de Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restriccion de PCR (PCR- RFLP) y PCR seguido de secuenciacion o espectrometna de masas, pero ambos son metodos que consumen tiempo y de bajo rendimiento. Tambien se ha descrito la formacion de genotipos mediante PCR en tiempo real usando cualquiera de cebadores espedficos de alelo o sondas espedficas de alelo (Calero et al., J. Neurosci Methods. 2009, 183 (2): 238-40; Koch et al., Clin. Chem. Lab Med. 2002, 40: 1123-1131) y se ha mostrado que son alternativas rapidas y eficaces. Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar reactivos usados en ensayos de PCR en tiempo real, tales como la tecnologfa de TaqMan®, que puedan formar genotipos de forma tanto rapida como precisa de los alelos de apoE.
Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan para ayudar en la comprension de la presente invencion, cuyo alcance real se establece en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que se pueden realizar modificaciones en los procedimientos expuestos sin apartarse de la invencion.
Ejemplos
Ejemplo 1 Analisis de un oligonucleotido de control marcado con JA270 usado para calibracion
Se produjo una solucion de reactivo de referencia a usar para calibracion de deteccion de fluorescencia y contema cinco oligonucleotidos de desoxitimidina (dT) 10-meros a una concentracion de 2 pM todos marcados en el nucleotido en la posicion 5' terminal usando cinco colorantes fluorescentes diferentes. Los cinco colorantes fluorescentes eran FAM, HEX, JA270, Cumarina-343, y Cy5.5. La pureza y estabilidad de esta solucion de referencia se analizo con un Sistema para UPLC Waters Acquity con Matriz de Fotodiodo (PDA) y deteccion de fluorescencia. La cromatograffa se realizo en una columna Acquity OST C8 de partfcula de 1,7 pm. Las fases moviles consistfan en Acetato de hexilamonio 0,1 M (HAA) a pH 7,0 como el Tampon A y acetonitrilo al 100 % como el Tampon B y los oligonucleotidos se separaron a traves de un gradiente de Tampon B al 30-60 % durante los primeros 0,6 minutos, y seguido del Tampon B al 60-95 % durante 1,4 minutos, a un caudal de 1 ml/min. Los perfiles de elucion de los oligonucleotidos para un experimento realizado por la manana (parte superior) y por la tarde (parte inferior) del mismo dfa se muestra en la Figura 3. De manera interesante, el pico de JA270 tema un tamano mucho mas reducido en la realizacion de la tarde, lo que sugiere posibles problemas con la estabilidad de este oligonucleotido en particular. Se sospechaba que debido al tamano y la hidrofobia del colorante JA270, este oligonucleotido en particular podna caer fuera de la solucion. Para disminuir la hidrofobia del oligonucleotido marcado con JA270, se determino la smtesis del dT de 10-meros marcado con JA270 con el JA270 colocado en una posicion interna en lugar de en el extremo 5' terminal. La colocacion interna del colorante JA270 se hizo posible mediante la union del enlazador L-treoninol al resto de acido carboxflico del colorante y mediante la adicion de un grupo fosforamidita reactivo que permite la union con un fosfato interno dentro del oligonucleotido. El analisis de UPLC se realizo de nuevo y los resultados se muestran en la tabla y en el grafico de barras representados en la Figura 4. Al colocar el colorante JA270 en el sitio interno del oligonucleotido, la estabilidad del dT de 10-meros marcado con JA270 se pudo mantener incluso despues de un mes de almacenamiento.
Ejemplo 2 Analisis de una sonda marcada con JA270 para formacion de genotipos de apoE
Un ensayo para formar genotipos de los alelos £2 £3, y £4 del gen de apoE se desarrollo usando tecnologfa usando TaqMan®y oligonucleotidos de sonda de TaqMan® espedficos de alelo. Se preparo una solucion de oligonucleotidos de "mezcla madre" y contema las siguientes sondas:
Sonda 22-meros marcada con FAM en el extremo en la posicion 5' selectiva para el alelo 334T
Sonda 22-meros marcada con HEX en el extremo en la posicion 5' selectiva para el alelo 334C
Sonda 22-meros marcada con JA270 en el extremo en la posicion 5' selectiva para el alelo 472C
Sonda 22-meros marcada con Cy5.5 en el extremo en la posicion 5' selectiva para el alelo 472T
La solucion de "mezcla madre" se analizo a la composicion y estabilidad correctas mediante UPLC usando una columna de partfcula de 1,7 pm, Acquity OST C18. Las fases moviles consistfan en Acetato de trietilamonio 0,1 M (TEAA) a pH 7,0 como Tampon A y acetonitrilo al 100 % como Tampon B y los oligonucleotidos se separaron a traves de un gradiente de Tampon B al 5-60 % durante 3 minutos a un caudal de 1 ml/min. El perfil de elucion de una solucion "recien preparada" en el Dfa 0 se muestra en la Figura 5 en la que se podfan observar picos del oligonucleotido para las cuatro sondas y los dos cebadores de PCR. Sin embargo, como se observa en la Figura Figure 6, cuando esta solucion se analizo despues de tres dfas de almacenamiento a 4 °C, el pico para el oligonucleotido marcado con JA270 habfa desaparecido. Similar a lo que se crefa que era la razon de la inestabilidad del oligonucleotido dT de referencia marcado con JA270 en el extremo 5' terminal en el Ejemplo 1, tambien se crefa que la inestabilidad de la sonda de apoE marcada con JA-270 se debfa a la agregacion del oligonucleotido su cafda
fuera de la solucion.
Para resolver el problema de la inestabilidad, la longitud de la sonda marcada con JA270 se aumento primero desde un oligonucleotido de 22-meros a un oligonucleotido de 25-meros. Una version de la sonda de 25-meros todavfa 5 colocaba a JA270 en el extremo en la posicion 5' terminal (denominada sonda R33) mientras que en otra version, el colorante JA270 se colocaba ahora internamente entre los nucleotidos 12 y 13 (denominado sonda R34). La colocacion interna del colorante se hizo posible uniendo el enlazador de L-treoninol al resto de acido carboxflico en JA270. A continuacion, se realizo un ensayo de PCR en tiempo real usando las dos sondas R33 y R44 en tampones y condiciones que se enumeran en las Tablas 1 y 2 que siguen a continuacion. Para generar curvas de crecimiento 10 de PCR espedficas de alelo se uso un molde de plasmido encontro positivo que portaba un alelo 472C y un molde de plasmido de control negativo que portaba un alelo 472T para comparar el rendimiento de las sondas R33 y R34. La sonda R34 con el colorante JA270 colocado internamente mostraba buena estabilidad sin cambios significativos en las curvas de crecimiento al usar la sonda almacenada durante tres semanas o seis semanas. Por el contrario, como se muestra en la Figura 7, la sonda R33 marcada en el extremo 5' terminal presentaba un enorme declive en 15 las senales de fluorescencia y la curva de crecimiento generada por la sonda que se habfa almacenado durante tres semanas o seis semanas. Este resultado mostraba claramente que la colocacion del colorante JA270 en un sitio interno dentro del oligonucleotido sonda aumentaba de forma considerable la estabilidad y el rendimiento de la sonda.
20 TABLA 1
- R2: Mezcla Madre
- Prototipo II
- Componente
- Conc. en MMx (2,79x) Conc. en PCR (final)
- Tricina pH 8,3 (mM)
- 1674 mM 60 mM
- KOH (mM)
- 38,8 mM 13,9 mM
- EDTA (mM)
- 0,56 mM 02 mM
- Glicerol (%)
- 41,9 % 15 %
- Tween 20 (%)
- 0,056 % 0,02 %
- DMSO(%)
- 5,6 % 2 %
- Azida de Na (%)
- 0,09* % N/D %
- dATP (mM)
- 0,56 mM 0,2 mM
- dCTP (mM)
- 0,56 mM 0,2 mM
- dGTP (mM)
- 0,56 mM 0,2 mM
- dUTP (mM)
- 1,12 mM 0,4 mM
- dTTP (mM)
- 0,14 mM 0,05 mM
- Z05 (Unidad/ul)
- 0,84 U/ul 15 U (o 0,30 U/ul)
- Aptamero, 46A (uM)
- 0,56 uM 0,2 uM
- AmpErase UNG (Unidad/ul)
- 0,167 U/ul 3 U (o 0,060 U/ul)
- 5'APOE5P05 (uM)
- 1,12 uM 0,4 uM
- 3'APOE3P04 (uM)
- 1,12 uM 0,4 uM
- Sonda APOE112C07 (uM) FAM
- 0,84 uM 0,3 uM
- Sonda APOE112R05 (uM) HEX
- 0,84 uM 0,3 uM
- Sonda APOE158R28 (uM) JA270
- 0,84 uM 0,3 uM
- Sonda APOE158C14 (uM) CY5.5
- 0,56 uM 0,2 uM
- * Concentracion en Mezcla Madre
- R1: Cation/Cofactor/KOAc
- Prototipo II
- Componente
- Conc. en MMx (7,04x) Conc. en PCR (final)
- Mg (OAc)2, pH 6,5
- 14,1 mM 2 mM
- Mn (OAc)2, pH 6,3
- 7,04 mM 1 mM
- KOAc, pH 8,0 (mM)
- 634 mM 90 mM
TABLA 2
- PA: D96 / D95A6Sx3 / D94A65xS7 (ApoE 2Et.i|>.iP4 040312]
- Dianii rc;i
- Modo do Adquisicion (hh:rnm:s s) Tasa rc/s) Modo de Analisis N.° do Ciclos
- Etapa do UNO
- 1
- 50
- Niiujuno I 0 05 00 2,2 Ninguno
- Desiiaturalizacion
- T
- 96 Nil......... | 0:00:45 4v4 ...............
- Ciclo Pi ovio
- 3
- Ninguno 0 00 20 2,2
- 65
- Individual 0:00:30 2.2 Cuantificacion
- PCR
- ■, , 'v S7
- 94
- Ninguno 0:00:20 4.4
- 65
- Individual 0:00:30 2,2 Cuantificacion
Claims (10)
- 51015202530REIVINDICACIONES1. Un metodo para preparar un oligonucleotido marcado para su uso como una sonda de hibridacion en una reaccion de PCR que comprende:(a) proporcionar un colorante fluorescente que es un derivado de rodamina en el que dicho colorante fluorescente esta unido con una molecula enlazadora bifuncional;(b) unir un grupo reactivo al colorante fluorescente a traves de la molecula enlazadora bifuncional para incorporar dicho colorante fluorescente dentro del oligonucleotido;(c) incorporar el colorante fluorescente entre dos nucleotidos internos del oligonucleotido, con la condicion de que el colorante fluorescente no se incorpore en el extremo 5' del oligonucleotido,en el que la molecula enlazadora bifuncional consiste en L-treoninol o (2R,3R)-2-amino-1,3-butanodiol.
- 2. El metodo de la reivindicacion 1 en el que el colorante fluorescente es un compuesto con la formula general
imagen1 en la que cada uno de Ca, Cb, Cc y Cd indica un atomo de C, Ca y Cb estan unidos en conjunto mediante un enlace sencillo o mediante un enlace doble, y Cc y Cd estan unidos en conjunto mediante un enlace sencillo o mediante un enlace doble;X1, X2, X3, X4, X7 y X10 son hidrogeno y X5, X6, X8, X9, X11 y X12 son metilo;R1 y R2 son identicos o diferentes y se seleccionan entre un grupo que consiste en hidrogeno y alquilo con 1-20 atomos de C, en la que los restos de alquilo estan opcionalmente sustituidos con al menos un grupo hidroxilo, halogeno, acido sulfonico, amino, carboxi o alcoxicarbonilo, y al menos R1 contiene un grupo que se puede activar;A1, A2, A3, B1 son cloro o fluor y B2 es cloro, fluor o hidrogeno. - 3. El metodo de la reivindicacion 2 en el que el colorante fluorescente es:
imagen2 - 4. El metodo de la reivindicacion 1 en el que el oligonucleotido marcado comprende adicionalmente una molecula inactivadora unida en el extremo 5' del oligonucleotido marcado.51015202530
- 5. Un metodo para detectar, en una muestra de ensayo, la presencia o la ausencia de un acido nucleico diana o de un alelo diana de un acido nucleico, que comprende:realizar una reaccion de PCR con el uso de un oligonucleotido sonda marcado que se hibrida con el acido nucleico diana, en el que el oligonucleotido sonda marcado se caracteriza por que tiene:un colorante fluorescente que es un derivado de rodamina que se une con una molecula enlazadora bifuncional; y un grupo reactivo unido a la molecula enlazadora bifuncional para incorporar el colorante fluorescente entre dos nucleotidos internos del oligonucleotido, con la condicion de que el colorante fluorescente no se incorpore en el extremo 5' del oligonucleotido, en el que la molecula enlazadora bifuncional consiste en L-treoninol o (2R,3R)-2-amino-1,3-butanodiol;detectar la senal del colorante fluorescente en el que la intensidad de dicha senal representa la presencia o la ausencia del acido nucleico diana.
- 6. El metodo de la reivindicacion 5 en el que el colorante fluorescente es un compuesto con la formula general
imagen3 en la que cada uno de Ca, Cb, Cc y Cd indica un atomo de C, Ca y Cb estan unidos en conjunto mediante un enlace sencillo o mediante un enlace doble, y Cc y Cd estan unidos en conjunto mediante un enlace sencillo o mediante un enlace doble;X1, X2, X3, X4, X7 y X10 son hidrogeno y X5, X6, X8, X9, X11 y X12 son metilo; \R1 y R2 son identicos o diferentes y se seleccionan entre un grupo que consiste en hidrogeno y alquilo con 1-20 atomos de C, en la que los restos de alquilo estan opcionalmente sustituidos con al menos un grupo hidroxilo, halogeno, acido sulfonico, amino, carboxi o alcoxicarbonilo, y al menos R1 contiene un grupo que se puede activar;A1, A2, A3, B1 son cloro o fluor y B2 es cloro, fluor o hidrogeno. - 7. El metodo de la reivindicacion 6 en el que el colorante fluorescente es:
imagen4 - 8. El metodo de la reivindicacion 5 en el que el oligonucleotido marcado comprende adicionalmente una molecula inactivadora unida en el extremo 5' del oligonucleotido marcado.
- 9. El metodo de la reivindicacion 5 en el que el acido nucleico diana es el gen de la apolipoprotema E.5
- 10. El metodo de la reivindicacion 5 en el que el alelo diana de un acido nucleico es el alelo 334T/C o el alelo 472 T/C del gen de la apolipoprotema E.
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