ES2609924T3 - Anticuerpos monoclonales neutralizantes contra el receptor de Nogo-66 (NGR) y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal neutralizante aislado, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que interactúan específicamente al menos con un epítopo del receptor de Nogo-66, donde el anticuerpo monoclonal neutralizante aislado, o un fragmento de unión al antígeno del mismo , comprende una secuencia que comprende una región variable de cadena pesada (región VH) que comprende SEQ ID NO: 3 y una secuencia que comprende una región variable de cadena ligera (región VL) que comprende SEQ ID NO: 4, o una secuencia que comprende una región variable de cadena pesada (región VH) que comprende SEQ ID NO: 5 y una secuencia que comprende una región variable de cadena ligera (región VL) que comprende SEQ ID NO: 6.

Description

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expresión transitoria en células HEK293F, se transfectaron las células en suspensión según el fabricante (Invitrogen; sistema Free-Style), se recolectaron tras 48 o 72 horas y se utilizaron para los estudios FACS (véase la sección de Ejemplos).

5 Producción de AP-Nogo66

Se produjo AP-Nogo66 (SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 10) en condiciones convencionales. En resumen, se clonó el Nogo66 en el vector pAPTag5, se transfectaron las células HEK293 con la construcción y se seleccionaron con PRMI Glutamax + un 10 % de FCS, 150 µg/ml Zeocin. Para la producción de la proteína las células HEK293 se cultivaron en seis fábricas de 10 cámaras con 1200 ml de RPMI (Invitrogen) más un 10 % de FCS por fábrica celular hasta la confluencia (3 días). Luego se desechó el sobrenadante y se cargaron 1200 ml de Pro293a-CDM (Cambrex Bio Science) en cada fábrica de células. Las células se cultivaron durante 3 días más. A continuación se centrifugaron los 7200 ml de sobrenadante y se concentró hasta 350 ml con columnas Hemoflow F (Fresenius Medical Care). Tras la adición de 1 mM de PefablocSC (ROCHE) se prepararon alícuotas del concentrado y se congeló a -80 ⁰C.

15 Producción de anticuerpos y líneas celulares generadoras de anticuerpos

Los anticuerpos de la divulgación se pueden generar por inmunización de un huésped adecuado (por ejemplo, vertebrados, que incluyen seres humanos, ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado vacuno, caballos, reptiles, peces, anfibios, y huevos de ave, reptil y peces). Dichos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Para generar los anticuerpos de la presente divulgación, se inmuniza el huésped con un polipéptido NgR inmunogénico o un fragmento del mismo de la invención. El término “inmunización” se refiere en el presente documento al proceso de presentación de un antígeno a un repertorio inmunitario siempre que ese repertorio exista en un organismo natural sin alterar genéticamente, o un organismo transgénico, que incluye los modificados para presentar un

25 repertorio inmunitario humano artificial. De manera similar, una “preparación inmunogénica” es una formulación de antígeno que contiene adyuvantes y otros aditivos que aumentarían la inmunogenicidad del antígeno.

La inmunización de animales se puede hacer por cualquier método conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Los métodos para inmunizar animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado vacuno, y caballos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane y Pat. de EE. UU. Nº 5. 994.619. En una realización preferida, el antígeno NgR se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria. Dichos adyuvantes incluyen el adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (muramil dipéptidos) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Dichos adyuvantes pueden proteger al polipéptido de la dispersión rápida por secuestro en un

35 depósito local, o pueden contener sustancias que estimulen al huésped para que secrete factores que son quimioestáticos para los macrófagos y otros componentes del sistema inmunitario. Preferentemente, si se va a administrar un polipéptido, el programa de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido, separados varias semanas.

Se contempla que el huésped animal se inmunice con NgR asociado con la membrana celular de una célula intacta

o destruida y los anticuerpos de la presente solicitud se identifican uniéndolos con un polipéptido NgR de la invención.

Tras la inmunización del huésped animal con el antígeno NgR, los anticuerpos y las células productoras de

45 anticuerpos se pueden obtener del animal. Se obtiene un suero que contiene el anticuerpo anti-NgR del animal por extracción de sangre o por sacrificio del animal. El suero se puede utilizar tal como se obtiene del animal, se puede obtener la fracción de inmunoglobulina del suero, o los anticuerpos anti-NgR se pueden purificar del suero. El suero

o las inmunoglobulinas obtenidas de esta manera son policlonales, por lo tanto tienen una matriz heterogénea de propiedades.

Líneas celulares productoras de anticuerpos

La presente divulgación también describe hibridomas inmortalizaros productores de anticuerpos que se pueden preparar a partir del animal inmunizado. Preferentemente, el animal inmunizado es un animal no humano que

55 expresa genes de inmunoglobulina humana y las células B esplénicas se fusionan con un mieloma derivado de la misma especie que el animal no humano.

Tras la inmunización, al animal se sacrifica y las células B esplénicas se fusionan con células de mieloma inmortalizadas como se conoce bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, supra. Preferentemente, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea celular no secretora). Tras la fusión y la selección con antibióticos, se exploran los hibridomas utilizando NgR, o una porción del mismo o una célula que exprese NgR. Preferentemente, la exploración inicial se lleva a cabo utilizando un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), preferentemente un ELISA (se proporciona un ejemplo de exploración por ELISA en la sección de Ejemplos).

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Tabla 1. Parámetros individuales de la tasa cinética de Biacore

(Antígeno: quimera hNgR-Fc)

Anticuerpo capturado

Isotipo Tasa On (M-1 s-1) Tasa Off (s-1) Kd (M)

mAb 50

IgG2a,k 3,51 x 105 4,97 x 10-5 1,41 x 10-10

mAb 51

IgG2a,k 5,44 x 105 5,88 x 10-5 1,08 x 10-10

El término “Kon”, como se utiliza en el presente documento, se pretende que hace referencia a la tasa de constante on para la asociación de un anticuerpo al antígeno para formar el complejo anticuerpo/antígeno como se conoce en 5 la técnica.

El término “Koff” como se utiliza en el presente documento, se pretende que hace referencia a la tasa de la constante off para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno como se conoce en la técnica. El término “Kd”, como se utiliza en el presente documento, se pretende que hace referencia a la constante de disociación de

10 una interacción anticuerpo-antígeno particular como se conoce en la técnica.

De manera alternativa, el anticuerpo mAb 50 y mAb 51 de la presente invención, o la parte de unión al antígeno de los mismos, puede inhibir la actividad del NgR humano con una CI50 de aproximadamente 1 x 10-6 M o menos, preferentemente 1 x 10-7 M o menos, preferentemente 1 x 10-8 M o menos, más preferentemente 1 x 10-9 M o

15 menos, más preferentemente 1 x 10-10 M o menos, y más preferentemente 1 x 10-11 M o menos. El término CI50 como se utiliza en el presente documento, se pretende que haga referencia a la concentración de un anticuerpo que compite por la unión del ligando Nogo66 con NgR.

Anticuerpos de fusión e inmunoadhesinas

20 La presente divulgación también describe un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que se puede producir que comprenden todo o una parte de un anticuerpo anti-receptor 1 de Nogo de la presente divulgación unido a otro polipéptido. En algunas realizaciones, solo la región variable del anticuerpo anti-receptor 1 de Nogo se une al polipéptido. En otras realizaciones, el dominio VH de un anticuerpo anti-receptor 1 de Nogo de la presente solicitud

25 se une a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL del anticuerpo se une a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de manera que permite que los dominios VH y VL interactúen entre ellos para formar un sitio de unión al antígeno del anticuerpo. En otras realizaciones, el dominio VH está separado del dominio VL por un enlazador que permite a los dominios VH y VL interactuar entre ellos (véase posteriormente en Anticuerpos de cadena sencilla). El anticuerpo VH-enlazador-VL se une entonces a un polipéptido de interés. El

30 anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido a una célula o tejido que expresa el ligando del receptor-1 de Nogo. El polipéptido de interés puede ser un agente terapéutico tal como una toxina, o puede ser un agente diagnóstico, tal como una enzima; que pueden visualizarse fácilmente, tal como una peroxidasa de rábano rusticano. Además, pueden crearse anticuerpos de fusión en los que dos (o más) anticuerpos de cadena sencilla se unen entre ellos. Esto es útil si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena sencilla de polipéptido, o si

35 se quiere crear un anticuerpo biespecífico.

Una realización proporciona una proteína de unión marcada en la que un anticuerpo o una parte del anticuerpo de la presente divulgación se derivan o une a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por ejemplo, una proteína de unión marcada de la presente invención se puede derivar por la unión funcional de un anticuerpo o

40 una parte de anticuerpo de la presente divulgación (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otra) a una o más entidades moleculares, tales como un ácido nucleico, otro anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puede intervenir en la asociación del anticuerpo o parte de anticuerpo con otra moléculas (tal como una región central de estreptavidina o un marcador de polihistidina).

45 Los agentes detectables útiles con los que se puede derivar un anticuerpo o parte de anticuerpo de la presente divulgación incluyen compuestos fluorescentes. Agentes fluorescentes detectables ejemplares incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, y similares. Un anticuerpo se puede derivar también de enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano

50 rusticano, glucosa oxidasa y similares. Cuando se deriva un anticuerpo con una enzima detectable, se detecta añadiendo reactivos adicionales que utiliza la enzima para producir un producto de la reacción detectable. Por ejemplo, cuando está presente la peroxidasa de rábano rusticano, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina da lugar a un producto de la reacción coloreado, que es detectable. Un anticuerpo se puede derivar también con un ácido nucleico, biotina y se detecta por medio de la medición indirecta de la unión con

55 avidina o estreptavidina.

Otra realización de la presente divulgación proporciona una proteína de unión cristalizada. El término “cristalizada” como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo, o la parte de unión al antígeno del mismo, que

existe en forma de un cristal. Los cristales son una forma del estado sólido del a materia, que es distinta de otras formas tales como el estado sólido amorfo o el estado cristalino líquido. Los cristales están compuestos por matrices regulares, repetidas, tridimensionales de átomos, iones, moléculas (por ejemplo, proteínas tales como anticuerpos),

o ensamblajes moleculares (por ejemplo complejos antígeno/anticuerpo). Estas matrices tridimensionales están

5 dispuestas de acuerdo con relaciones matemáticas específicas que se entienden bien en el campo. La unidad fundamental, o bloque de construcción, que se repite en un cristal se denomina unidad asimétrica. La repetición de unidades fundamentales en una disposición que conforma una simetría cristalográfica determinada bien definida proporciona la “célula unitaria” del cristal. La repetición de la célula unitaria por traducciones regulares en las tres dimensiones proporciona el cristal. Véase Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2ª ed., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999).

Preferentemente, la presente divulgación describe cristales de anticuerpos anti-NgR completos y fragmentos de los mismos como se desvela en el presente documento, y formulaciones y composiciones que comprenden dichos cristales. En una realización la proteína de unión cristalizada tiene una mayor semivida in vivo que la equivalente

15 soluble de la proteína de unión. En otra realización la proteína de unión mantiene la actividad biológica tras la cristalización.

La proteína de unión cristalizada de la divulgación se puede producir según los métodos conocidos en la técnica.

Anticuerpos de cadena sencilla

La presente divulgación incluye un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que se une a un NgR inmunogénico de la invención. Para producir el scFv, el ADN que codifica VH y VL se une operativamente al ADN que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácido (GLY4-Ser), de manera que las secuencias

25 de VH y VL se pueden expresar como contiguos en una proteína de cadena sencilla, que tienen las regiones VL y VH unidas por un enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-42 6; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., 30 Nature (1 99 0) 34 8: 552-554). El anticuerpo de cadena sencilla puede ser monovalente, si solamente se utiliza una VH y VL, bivalente sin se utilizan dos VH y VL, o polivalente si se utilizan más de dos VH y VL.

Anticuerpos quiméricos

La presente divulgación incluye además un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión al antígeno del mismo en el que una especificidad es para un polipéptido del receptor 1 de Nogo inmunogénico de la presente divulgación. 35 Por ejemplo, se puede generar un anticuerpo quimérico que se una específicamente a un polipéptido NgR inmunogénico de la divulgación por medio de un dominio de unión y a una segunda molécula por un segundo dominio de unión. La expresión “anticuerpo quimérico” se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de regiones variables de cadena pesada y ligera de una especie y secuencias de región constante de otra especie, tales como los anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera murinas unidas a regiones constantes humanas. El anticuerpo quimérico se puede producir por medio de técnicas de biología molecular recombinante, o se pueden conjugar físicamente. Además, se puede generar un anticuerpo de cadena sencilla que contiene más de una VH y VL que se una específicamente a un polipéptido inmunogénico de la invención y a otra molécula que se asocia la disminución del colapso de crecimiento de conos mediado por mielina y la inhibición del crecimiento y brotes de neuritas. Dichos anticuerpos biespecíficos se pueden generar utilizando técnicas que se

45 conocen bien, por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) y Wright y Harris, 20 (supra). En algunas realizaciones, los anticuerpos quiméricos se preparan utilizando una o más de las regiones variables de un anticuerpo de la divulgación. En otra realización, el anticuerpo quimérico se preparar utilizando una o más regiones CDR de dicho anticuerpo. La expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadenas pesada y ligeras de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en el que al menos una parte de la secuencia de VH y/o VL se ha alterado para que sea más “similar a la humana”, es decir, más similar a las secuencias variables de la línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo con injerto de CDR en el que las secuencias CDR humanas se introducen en secuencias VH y VL no humanas para sustituir las secuencias CDR no humanas correspondientes.

55 Anticuerpos humanizados

Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que se unen a antígenos deseados que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de especies no humanas y regiones marco conservadas de una molécula de inmunoglobulina humana. Se conocen secuencias de Ig humanas en la técnica. Dichas secuencias importadas se pueden utilizar para reducir la inmunogenicidad, aumentar o modificar la unión, afinidad, tasa on, tasa off, especificidad, semivida, o cualquier otra característica adecuada, como se conoce en la técnica. Los restos de la región marco conservada en las regiones marco conservadas humanas se pueden sustituir con el resto correspondiente de la CDR del anticuerpo donante para alterar, preferentemente mejorar, la unión con el

65 antígeno. Estas sustituciones de la región marco conservada se identifican por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, modelando las interacciones de los restos de CDR y región marco conservada para identificar

los restos de la región marco conservada importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencias para identificar restos de la región marco conservadas inusuales en posiciones particulares (véase, por ejemplo, Queen et al., Pat. de EE. UU. Nº 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles comúnmente y son familiares para los expertos en la técnica. Están disponibles 5 programas de computadora que ilustran y presentan probables estructuras de conformación tridimensional de secuencias candidatas de inmunoglobulina seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel más probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que tienen influencia en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los restos FR se pueden seleccionar y combinar a partir de secuencias de consenso e importadas de manera que se consigue la característica deseada del anticuerpo, tal como el aumento de afinidad por el antígeno(s) diana. En general, los restos de CDR están implicados directamente y más sustancialmente en influenciar la unión al antígeno. Los anticuerpos se pueden humanizar utilizando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, tal como pero sin limitarse en las descritas en Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka

15 et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994).

Anticuerpos derivados y marcados

Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de la presente divulgación se pueden derivar o unir con otra molécula (por ejemplo, otro péptido o proteína). En general, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se deriva de manera que la unión a un polipéptido inmunogénico de la divulgación no está afectada adversamente por la derivación o marcado. Por ejemplo, un anticuerpo o parte de anticuerpo de la presente divulgación puede unirse funcionalmente (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación covalente u otra) a una o más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o diacuerpo), un reactivo de 25 detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que pueden intervenir en la asociación del anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o un marcador de polihistidina). Aún más, un anticuerpo o parte de unión al antígeno del mismo puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión mayor, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o parte de anticuerpo con una o más de otras o diferentes proteínas o péptidos. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región central de estreptavidina para producir una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un resto de cisteína, un péptido marcador y un marcador polihistidina del extremo C para producir moléculas de scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov et al. (1994) Molecular Immunology 31:1047-1058). Las partes de anticuerpo, tal como Fab y F(ab’)2 respectivamente, se pueden preparar a partir de anticuerpos completos utilizando técnicas convencionales,

35 tales como la digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Además, los anticuerpos, partes de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión se pueden obtener utilizando técnicas convencionales de ADN recombinante.

Un anticuerpo derivado se puede producir entrecruzando dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los agentes de entrecruzamiento adecuados incluyen los que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos reactivos distintos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncionales (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Dichos enlazadores están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.

45 Un anticuerpo derivado puede ser también un anticuerpo marcado. Por ejemplo, los agentes de detección con los que se puede derivar un anticuerpo o parte de anticuerpo de la divulgación son compuestos fluorescentes, que incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, fósforos lantánidos y similares. Un anticuerpo también se puede marcar con enzimas que son útiles para la detección, tal como la peroxidasa de rábano rusticano, galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. En realizaciones que se marcan con una enzima detectable, el anticuerpo se detecta añadiendo reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de la reacción detectable. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano rusticano con peróxido de hidrógeno y diaminobencidina. Un anticuerpo se puede marcar también con biotina, y detectarse por medición indirecta de la unión con avidina o estreptavidina. Un anticuerpo también se puede marcar con un epítopo polipeptídico predeterminado reconocido como un indicador secundario

55 (por ejemplo, un par de secuencias de leucina en cremallera, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión con metales, epítopo: marcadores). Un anticuerpo anti-receptor 1 de Nogo o un fragmento de antígeno del mismo también se pueden marcar con un aminoácido radiomarcado. El radiomarcador se puede utilizar tanto con fines diagnósticos como terapéuticos. El anticuerpo anti-receptor 1 de Nogo radiomarcado se puede utilizar de manera diagnóstica, por ejemplo, para determinar los niveles de receptor-1 de Nogo en un sujeto. Además, el anticuerpo anti-receptor-1 de Nogo radiomarcado se puede utilizar terapéuticamente para tratar la lesión de la médula espinal.

Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes radioisótopos o radionúclidos 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 153Sm. Un anticuerpo anti-receptor-1 de Nogo o un fragmento de 65 antígeno del ismo también se puede derivar con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo,

o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por

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La presente divulgación también describe anticuerpos específicos duales entre NgR y receptores del factor de crecimiento que incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrópico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor estimulantes de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), neurotrofinas, factor de crecimiento derivado

5 de plaquetas (PDGF), eritropoyetina (EPO), trombopoyetina (TPO), miostatina (GDF-8), factor 9 de diferenciación de crecimiento (GDF-09), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF o FGF2), factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), factor neurotrófico ciliar (CNTF).

Usos de los anticuerpos

Debido a su capacidad de unión al NgR humano, los anticuerpos neutralizantes de la presente divulgación, o partes de los mismos, se pueden utilizar para detectar el NgR humano (por ejemplo, en una muestra biológica, tal como suero o plasma), utilizando un inmunoensayo convencional, tal como un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica tisular. La presente divulgación proporciona un

15 método para detectar un NgR humano en una muestra biológica que comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo, o una parte de anticuerpo, de la invención y detectar o el anticuerpo (o parte del anticuerpo) unido al NgR humano o el anticuerpo no unido (o parte del anticuerpo), para detectar de esta manera el NgR humano en la muestra biológica. El anticuerpo está marcado directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriacinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material

25 luminiscente incluye luminol; y ejemplos de material radioactivo adecuado incluye 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I,131I, 177Lu, 166Ho, 153Sm. Los anticuerpos y partes de anticuerpo de la presente divulgación son capaces preferentemente de neutralizar la actividad de NgR humano tanto in vitro como in vivo. En consecuencia, dichos anticuerpos y partes de anticuerpo de la divulgación se pueden utilizar para inhibir la unión de Nogo-66 a NgR o la actividad resultante. En otra realización, la presente divulgación proporciona un método para reducir la actividad de Nogo-66 o la actividad de NgR en un sujeto, ventajosamente de un sujeto que padece una enfermedad o trastorno en el que la actividad de NgR es perjudicial. La presente divulgación presenta un anticuerpo o partes de anticuerpo de la presente invención para su uso en métodos para reducir la actividad en un sujeto que padece de dicha enfermedad

o trastorno, cuyo método comprende la administración al sujeto de un anticuerpo o partes de anticuerpo de la

35 presente invención de manera que se reduce la actividad de NgR. Preferentemente, el NgR es humano y el sujeto es un sujeto humano. De manera alternativa, el sujeto puede ser un mamífero que expresa un NgR al que el anticuerpo de la invención es capaz de unirse. Aún más, el sujeto puede ser un mamífero en el que se ha introducido un NgR. Un anticuerpo de la presente invención es para su uso en terapia y se puede administrar a un sujeto humano. Además, un anticuerpo de la presente invención es para su uso en terapia veterinaria y se puede administrar a un mamífero no humano que expresa un NgR con el que el anticuerpo es capaz de unirse con fines veterinarios o como un modelo animal de una enfermedad humana. Con respecto al último, dichos modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención (por ejemplo, ensayo de dosificaciones y cursos de tiempo de administración). Como se utiliza en el presente documento, la expresión “un trastorno en el que la actividad de NgR es perjudicial”

45 tiene la intención de incluir enfermedades y otros trastornos en los que la presencia de NgR o la actividad resultante en un sujeto que padece el trastorno ha demostrado que es o es sospechoso de ser el responsable de la patofisiología del trastorno o un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. En consecuencia, un trastorno en el que la actividad de NgR es perjudicial es un trastorno en el que se espera que la reducción de la actividad de NgR alivie los síntomas y/o progresión del trastorno. Ejemplos no limitantes de trastornos que se pueden tratar utilizando los anticuerpos de la invención incluyen los trastornos expuestos en la sección posterior que pertenece a las composiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la invención.

Se reconoce que el NgR tiene un papel importante en la patología asociada con una variedad de enfermedades que implican enfermedades neurológicas asociadas con neurodegeneración o inhibición de los procesos

55 neurorregenerativos, que dan lugar a parálisis. Esto incluye esclerosis lateral Amiotrófica, lesión del plexo braquial, lesión cerebral, incluyendo la lesión cerebral traumática, parálisis cerebral, ataxia de Friedrich, síndrome de Guillain-Barré, leucodistrofias, esclerosis múltiple, post polio, espina bífida, lesión de la médula espinal, atrofia muscular espinal, tumores de médula espinal, ictus, mielitis transversa. Además se reconoce que el NgR tiene un papel en la demencia, demencia senil, disfunción cognitiva leve, demencia relacionada con el Alzheimer, corea de Huntington, disquinesia tardía, hiperquinesias, manía, morbus Parkinson, síndrome de Steel-Richard, síndrome de Down, miastenia gravis.

El NgR y sus ligandos también pueden estar implicados en la generación o desarrollo de estados inflamatorios o autoinmunitarios que implican elementos inflamatorios conocidos (Teng y Tang, 2005; Fontoura y Steinmann, 2006).

65 Estas enfermedades incluyen pero no se limitan a artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, Lyme artritis, artritis psoriásica, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico,

enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis esclerodérmica, enfermedad del injerto contra el huésped, rechazo de trasplante de órganos, enfermedad inmunitaria asociada con el trasplante de órganos aguda

o crónica, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad

5 de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, Granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los riñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choque séptico, síndrome de choque toxico, síndrome séptico, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, ictus, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, tumores malignos, fallo cardíaco, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, esporádica, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de disfunción respiratoria del adulto (aguda), alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriásica, artropatía cólica ulcerativa, sinovitis enteropática, artropatía asociada a clamidias, yersinias y salmonelas, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa /arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad autoinmunitaria bullosa, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad IgA

15 lineal, anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia hemolítica Coombs positiva, anemia adquirida perniciosa, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica /Royal Free Enfermedad, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmunitaria criptogénica, Síndrome de enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades Relacionadas con la Inmunodeficiencia Adquirida, Hepatitis B, Hepatitis C, inmunodeficiencia variable común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, fallo ovárico, fallo ovárico prematuro, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a enfermedad del tejido conjuntivo, enfermedad pulmonar asociada a enfermedad mixta de tejido conjuntivo, enfermedad pulmonar intersticial asociada a esclerosis sistémica, artritis reumatoide asociada a enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad pulmonar asociada a lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada

25 a dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a enfermedad de Sjogren, enfermedad pulmonar asociada a espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar vasculítica difusa, enfermedad pulmonar asociada a hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármacos, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar linfocítica infiltrativa, enfermedad pulmonar intersticial post-infecciosa, artritis por gota, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria tipo-1 (hepatitis autoinmunitaria clásica o lupoide), hepatitis autoinmunitaria tipo-2 (hepatitis de anticuerpos anti-LKM), hipoglucemia autoinmunitaria mediada, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmunitaria aguda asociada con trasplante de órganos, enfermedad inmunitaria crónica asociada con trasplante de órganos, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmunitaria, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los riñones,

35 enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad espermática, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmia simpática, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conjuntivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmunitaria, trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipertiroidismo, hipotiroidismo gotoso autoinmunitario (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmunitario atrófico, mixedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática aguda con vitíligo, enfermedades hepáticas crónicas, cirrosis alcohólica Inducida por fármacos, lesión hepática inducida por alcohol, colestasis, enfermedad hepática idiosincrática, hepatitis, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia),

45 enfermedades mediadas Tipo T2 y Tipo T1, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y cánceres tales como cáncer de pulmón, mama, estómago vejiga, colon, páncreas, ovárico, próstata y rectal y neoplasias malignas hematopoyéticas (leucemia y linfoma). Los anticuerpos humanos y partes de anticuerpo de la presente invención son para su uso en métodos para tratar seres humanos que padecen enfermedades autoinmunitarias, en particular las asociadas con inflamación, incluyendo la espondilitis reumatoide, alergia, diabetes autoinmunitaria, uveítis autoinmunitaria.

También se sabe que el NgR interactúa con otras proteínas que incluyen pero no se limitan a proteínas relevantes con la adhesión celular, migración celular, seguimiento celular, hallazgo de ruta de axón, y proteínas de la matriz extracelular. Una combinación terapéutica potencial comprendida en la presente divulgación puede incluir

55 anticuerpos contra NgR y semaforinas (en particular Sema-1a, 1b; Sema-2a; Sema-3A, B, C, D, E, F; Sema 4A, D; Sema 5A; Sema 6D; Sema 7A, Sema VA), plexinas (Plexina-A1-4, Plexina-B1-3, Plexina-C1, Plexina D-1, Tim-2); neuropilinas (neuropilina-1 y neuropilina-2), cadherinas (E-cadherinas y N-cadherinas), netrinas (netrina-1), efrinas (EphA3, 4, 6, 7, 8; B2, B3), receptores Eph, ligandos Eph, Ig CAM, tenascina-C, CSPG, tenascina, Sema 3A, fibronectina, laminina-1, colágeno (por ejemplo, colágeno-IV), Robo, AbI, N-Cadherina, L1, NCAM.

Se ha descrito que el NgR también interactúa con fragmentos de proteína precursora de amiloide extracelular (Aβ). Por lo tanto, la presente divulgación comprende una combinación entre anticuerpos contra NgR y especies de Aβ (Aβ 1-40, Aβ 1-42, oligómeros de Aβ, multímeros de Aβ, globulómeros de Aβ). Este tipo de combinación puede ser interesante en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. La combinación puede traducirse en un efecto dual 65 sobre el crecimiento/neuroprotección de neuritas y en el alivio de la carga de lacas y la actuación cognitiva en pacientes de EA. La pérdida axonal y dendrítica es un distintivo temprano de la enfermedad de Alzheimer y una

combinación para su uso en el tratamiento puede ser muy eficaz.

También, como se ha tratado anteriormente, se pueden utilizar anticuerpos específicos duales entre cualquiera de las parejas descritas anteriormente. Dichas preparaciones de anticuerpo que se han descrito anteriormente pueden

5 ser útiles para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, lesión de médula espinal, lesión cerebral traumática, esclerosis múltiple, lesión de nervios periféricos, esquizofrenia, depresión, ansiedad, así como crecimiento y plasticidad de nueritas y enfermedades relacionadas con neurotoxicidad mencionadas anteriormente.

Los anticuerpos de la presente divulgación también se pueden combinar con péptidos que permitan la transferencia transmembrana para incluir proteínas diana intracelulares. Dichas secuencias peptídicas pueden incluir, pero no se limitan a, tat, antenapedia, poli-arg, algunos péptidos anti-microbianos. Dichos péptidos pueden permitir la transferencia a través de membranas, incluyendo membranas plasmáticas celulares, y también membranas epiteliales o endoteliales, incluyendo, la barrera hematoencefálica, mucosa intestinal, meninges y otras.

15 Dichos péptidos también pueden permitir la entrada de inhibidores de señalización en las células,que pueden incluir anticuerpos o moléculas pequeñas contra las moléculas de señalización de NgR, incluyendo ROCK, GTPasas pequeñas, actina y estabilizador de mielina.

Un anticuerpo o parte de anticuerpo, de la presente invención también es para su uso en la administración con uno o más agentes terapéuticos de molécula pequeña adicionales útiles en el tratamiento de trastornos en los que está implicada la actividad de NgR como se ha tratado en los párrafos anteriores. Se debería entender que los anticuerpos de la presente invención o parte de unión al antígeno de los mismos se proporcionan para su uso solos

o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapéutico, siendo seleccionado dicho agente

25 adicional por el experto según su fin pretendido. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como que es útil para tratar la enfermedad o afección que se va a tratar por administración del anticuerpo de la presente invención. El agente adicional también puede ser un agente que dé lugar a un atributo beneficioso a la composición terapéutica, por ejemplo, un agente que afecte a la viscosidad de la composición. Las combinaciones preferidas pueden incluir, aunque no se limitan a, agentes antisicóticos, tales como, pero sin limitarse a Risperidona, Olanzapina, Quetiapina, Fenotiacinas (Clorpromacina, Flufenacina, Levomepromacina, Pericianina, Perfenacina, Proclorperacina, Promacina, Tioridacina, Trifluoperacina), Butirofenonas (Benperidol, Haloperidol), Zotepina, Loxapina, Aripiprazol, Sertolina, Ziprasidona, inhibidores moleculares pequeños de la actividad de Rho cinasa (ROCK), incluyendo compuestos como fasudil, dimetilfasudil o cualquier otro inhibidor ROCK, ligandos de receptor pequeños contra receptor GABA A o receptores de glutamato metabotrópicos (mGluR), fármacos anti

35 inflamatorios no esteroideos (AINE), anti-inflamatorios corticosteroides tales como metilprednisolona.

Composiciones farmacéuticas de la invención

Los anticuerpos y partes de anticuerpo de la presente invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir una “cantidad terapéuticamente eficaz” o una “cantidad profilácticamente eficaz” de un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invención. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y por periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéutica eficaz del anticuerpo o parte de anticuerpo puede determinarla un experto en la técnica y puede variar de

45 acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o parte de anticuerpo para dar lugar a una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es la que los efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo o parte de anticuerpo están superados por los efectos terapéuticos beneficiosos. “Cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y por los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Normalmente, aunque la dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes o en un estadio temprano de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Normalmente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente

55 aceptable” incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares, que son compatibles fisiológicamente. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tampón fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes (tales como manitol, sorbitol), o cloruro sódico en la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además pequeñas cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que aumentan la vida propia o efectividad del anticuerpo o parte del anticuerpo.

Las composiciones de la presente invención pueden estar en una variedad deformas. Estas incluyen, por ejemplo,

65 formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo soluciones inyectables y para infusión), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios.

imagen8

Se han establecido diferentes formatos de ELISA y se utilizan de manera rutinaria como una primera exploración para identificar anticuerpos que se unen a NgR humano, de ratón o de rata. Los anticuerpos que reaccionan en los ensayos ELISA se pueden entonces ensayar por unión a células HEK o CHO que expresan establemente NgR recombinante humano o NgR recombinante de rata, y no a las células no transfectadas o de control. Para el formato

5 ELISA, se produjeron los receptores solubles (véase anteriormente). Para los estudios FACS, se expresaron las proteínas NgR de longitud completa en líneas celulares recombinantes. Los resultados para mAb 50 SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO:4 y mAb 51 SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 en la unión ELISA y ensayos FACS se muestran en la Tabla 2.

10 Tabla 2. Resumen de las propiedades de unión de mAb 50 y mAb 51

AnticuerpoMonoclonal

Unión ELISA Unión ELISA Unión FACS Unión FACS Unión FACS Unión FACS Isotipo

HuNgR6X His

NgR6xHisde Rata HEK293 NGR HEK293 de Control CHO K1 NGR de Rata CHO K1 de Control

mAb 50

Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo IgG2a,k

mAb 51

Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo IgG2a,k

Se obtuvieron anticuerpos adicionales mAb 1, mAb 52, mAb 53, mAb 54, mAb 55, mAb 56, mAb 57, mAb 58, mAb 59, mAb 60, mAb 61, y mAb 62 utilizando el mismo protocolo experimental.

15 Ejemplo 2. Determinación de la especificidad y afinidad de unión del anticuerpo por ELISA

Para determinar la especificidad de los anticuerpos monoclonales producidos en el Ejemplo 1, se llevó a cabo un ELISA utilizando NgR-Fc (una proteína de fusión que comprende los aminoácidos Met 1 a Ser 447 del NgR humano y un fragmento Fc humano (R&D Systems)) y NgR de rata (SEQ ID NO. 2). Ambos ligandos se inmovilizaron en 20 placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc Maxisorb; 0,2 µg /pocillo). Como reactivo de bloqueo se utilizó albúmina de suero bovino al 2 % (BSA) en Tris-HCl, pH 7,2 durante 2 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos monoclonales se utilizaron en concentraciones comenzando a 10.000 ng/ml. Los anticuerpos unidos se detectaron con un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con peroxidasa de rábano rusticano (Sigma) y se desarrollaron utilizando un sustrato de 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (TMB, Pierce) en condiciones convencionales. mAb 50 y mAb 25 51 se unían específicamente a NgR humano. Cuando se utilizaban 0,2 µg de NgR-Fc humano/pocillo se apreciaba un 50 % de unión para ambos anticuerpos monoclonales a concentraciones de menos de 20 ng/ml (Figura 1A). En experimentos similares, mAb 50 y mAb 51 también se unían específicamente a un polipéptido que consistía en los aminoácidos del NgR de rata. Cuando se utilizaban 0,2 µg de NgR de rata/pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos se veía una unión del 50 % para ambos anticuerpos monoclonales a concentraciones de menos de 20

30 ng/ml (Figura 1B). El resto de los anticuerpos monoclonales (mAb) de la presente invención también se unían al NgR humano o de rata. Las diferencias de las señales obtenidas en cada anticuerpo sugerían diferencias en las afinidades de unión (véase la Tabla 3).

Tabla 3. Resumen de los valores de CE50 para los mAb utilizando NgR humano o de rata

mAb

EC50

NgR humano ng/ml

NgR de rata ng/ml

1

10 10

4

8 >100

52

3 4

53

3 2

54

5 4

55

2 10

56

8 20

57

20 >100

58

5 15

59

15 15

60

2 5

62

10 7

imagen9

Transferencia de puntos

Transferencia de Western

anticuerpo

hNgR rNgR hNgR rNgR

+++: señal muy fuerte; ++: señal fuerte; +: señal; -: no señal; ~: señal no relevante.

Ejemplo 4. Competición por la unión de AP-Nogo66 al receptor de Nogo humano soluble (hNgR-Fc)

Para caracterizar adicionalmente los anticuerpos monoclonales se utilizó un ensayo de competición similar al ensayo

5 de unión del Ejemplo 2 para ensayar la capacidad de los mAb producidos en el Ejemplo 1 para inhibir la unión de AP-Nogo66 al NgR-Fc humano. Se inmovilizó el NgR-Fc humano (0,2 µl/pocillo) en placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc Maxisorb) en 50 mM de tampón Na-carbonato pH 9 durante una noche a 4 ⁰C seguido por una etapa de bloqueo de 2 h con un 2 % de BSA en Tris-HCl, pH 7,2 a temperatura ambiente. Los pocillos recibieron una concentración constante de AP-Nogo66 (con una concentración final de 0,15 nM en Tris-HCl, pH 7,2 con un 0,1 %

10 de BSA) y concentraciones crecientes de mAb. Las placas se incubaron durante 90 min a temperatura ambiente. Durante cada etapa de incubación se lavaron las placas con tampón de lavado (10 mM Tris-HCl, pH 7,2 y un 0,05 % de Tween 20). La unión de AP-Nogo66 se detectó con sustrato AttoPhos (Roche) y se midieron las unidades de fluorescencia en el instrumento Poarstar (BMG). La Figura 2 muestra las unidades de fluorescencia relativas (RFU) para las mediciones tomadas a los 0 min y 30 min para el mAb 50 y mAb 51. La unión se bloqueó completamente

15 por mAb 50 y mAb 51, y se necesitaba un exceso molar de 10 veces de ambos anticuerpos para inhibir un 50 % de unión de AP-Nogo66 a NgR-Fc. Los restantes anticuerpos, mAb 53, mAb 54, mAb 55, mAb 56, mAb 57, mAb 58, mAb 59, mAb 60, mAb 61, mAb 62 excepto el mAb 1, bloqueaban la unión de AP-Nogo66 al receptor de Nogo soluble, en un intervalo de concentración similar al que se veía par mAb 50 y mAb 51.

20 Ejemplo 5. Competición por la unión de AP-Nogo66 a NgR humano y de rata en células HEK293F por mAb 50 y mAb 51

Para caracterizar adicionalmente la unión y las propiedades competitivas de los mAb producidos como se describe en el Ejemplo 1, se utilizó una suspensión de células HEK293F que expresaban transitoriamente NgR humano o de 25 rata. 48 h después de la transfección las células se colocaron en placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc Maxisorb) y se lavaron con tampón de solución salina tampón fosfato (PBS que contenía un 1 % de BSA). Se añadió 1 µg/200 µl de AP-Nogo66 (con una concentración final de 40 nM) y concentraciones variables de anticuerpos monoclonales (20 µg, 4, 0,8 y 0,16 µg/200 µl) y se incubaron durante 1 h a 4 ⁰C. Se utilizó un anticuerpo monoclonal con el mismo isotipo como control negativo. Se detectó la unión de AP-Nogo66 con un anticuerpo anti-fosfatasa 30 alcalina (Sigma), que se marcó con Alexa Flúor utilizando el kit de marcado con IgG2a de ratón Zenon (Invitrogen). El anticuerpo secundario se incubó durante 1 h a 4 ⁰C. Al final de la incubación, se lavaron las células con PBS y se sometieron al análisis FACS. A la concentración de 20 µg/200 µl (con un exceso molar de 20 veces) el anticuerpo policlonal anti-NgR y el NgR-Fc (ambos de R&D Systems) bloqueaban la unión de AP-Nogo66 entre un 60 % y un 70 %, mientras que el mAb 50 y mAb 51 bloqueaban la unión de AP-Nogo66 aproximadamente un 90 %. El isotipo 35 de anticuerpo de control se muestra en la Figura 3a para el mAb 50 y mAb 51 en NgR humano y rata a una concentración de 20 µg. El isotipo de anticuerpo de control se muestra como líneas negras (la señal más a la izquierda) y la unión de AP-Nogo66 en ausencia de cualquier anticuerpo se muestra como líneas rojas (la señal más a la derecha). El NgR tanto humano como de rata se unía a AP-Nogo66 igual de bien. La florescencia de AP-Nogo66 cambiaba a intensidades menores (sombreado; área verde) en presencia de ambos anticuerpos en células

40 HEK293F que expresaban NgR humano y de reata. Utilizando concentraciones diferentes de anticuerpos se veía una CI50 con un exceso molar de 2 veces de anticuerpos monoclonales 50 y 51 frente a AP-Nogo66 para ambos NgR humano y de rata según se determinó por el ensayo del Kolmogorov-Smirnov (K-S).

La Figura 3b muestra los resultados con concentraciones variables de mAb 50 y mAb 51, es decir, 20,0 µg, 4,0, 0,8 y

45 0,16 µg/200 µl. Los otros mAb de la divulgación bloqueaban la unión de AP-Nogo66 al receptor de Nogo expresado en células HEK293F, en un intervalo de concentraciones similar al que se veía para el mAb 50 y 51. Véase la Tabla 5, que indica la cantidad de anticuerpo necesariamente para una competición de la unión al 50 % de AP-Nogo66 a NgR humano expresado en células HEK293F.

50 Tabla 5. Competición de AP-Nogo66 a NgR humano y de rata en células HEK293F

mAb

50 % Competición (µg)

50 51 52 53 54 55 56

0,5 0,5 3 3 0,8 0,6 0,8

imagen10

imagen11

L106

Mey 1015 : cebador antisentido

imagen12

secuencia del hNgR hasta el aminoácido A58 secuencia de hNgR comenzando desde el aminoácido L106

3. pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ 106-154/Myc/His Mey 1021 : cebador en sentido

imagen13

secuencia del hNgR hasta el aminoácido A105 secuencia del hNgR comenzando desde el aminoácido A155

Mey 1022 : cebador antisentido

imagen14

secuencia del hNgR hasta el aminoácido A105 secuencia del hNgR comenzando desde el aminoácido A155

4. pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ 155-202/Myc/His Mey 1023 : cebador en sentido

imagen15

30

secuencia del hNgR hasta el aminoácido A154 secuencia del hNgR comenzando desde el aminoácido S203

Mey 1024 : cebador antisentido 35

imagen16

secuencia del hNgR hasta el aminoácido A154 secuencia del hNgR comenzando desde el aminoácido S203

5. pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ 203-250/Myc/His Mey 1025 : cebador en sentido

imagen17

secuencia del hNgR hasta el aminoácido H202 secuencia del hNgR comenzando desde el aminoácido A251

Mey 1026 : cebador antisentido

imagen18

secuencia del hNgR hasta el aminoácido H202 secuencia del hNgR comenzando desde el aminoácido 55 A251

imagen19

Tabla 6.

Anticuerpos

Mutantes

1

2 3 4 5 6 7 8

AF1208

+++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ ++

MAB1

+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ~

MAB4

+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ~

MAB 50

++ - - - - +++ - ~

MAB 51

++ - - - - +++ - ~

MAB 52

++ - - - - +++ - ++

MAB 53

++ - - - - +++ - ++

MAB 54

+ - - - - + - ~

MAB 55

+ - - - - + - ~

MAB 57

~ - - - - - - -

MAB 58

++ - - - ~ ++ - ~

MAB 59

++ - - - ~ ++ - ~

MAB60

+++ - - - ~ ++ - +

MAB61

+ - - - - + - +

MAB62

+ - - ~ + - ~

+++: señal muy fuerte; ++: señal fuerte; +: señal; -: no señal; ∼: señal no relevante.

Ejemplo 8 A. Competición con la unión de MAG-Fc a NgR-Fc

5 Para caracterizar adicionalmente los anticuerpos monoclonales se utilizó un ensayo de competición similar al ensayo de unión del Ejemplo 2 para ensayar la capacidad de los dos mAb producidos en el Ejemplo 1 para inhibir la unión de MAG-Fc al NgR-Fc humano. Loa inventores inmovilizaron el NgR-Fc (0,2 µg/pocillo, R&D Systems) en placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc Maxisorb) en 50 mM de tampón carbonato-Na pH 9 durante una noche a 4 ⁰C seguido por una etapa de bloqueo de 2 h con un 2 % de BSA en Tris-HCl, pH 7,2 a temperatura ambiente. Se marcó

10 la MAG-Fc (quimera MAG-Fc recombinante de rata de R&D Systems, nº de catálogo 538-MG) con peroxidasa de rábano rusticano con el kit de marcado de IgG humana Zenon (Molecular Probes). Los pocillos recibieron una concentración constante de MAG-Fc marcado (a una concentración final de 50 ng/ml en Tris-HCl, pH 7,2 con un 0,1 % de BSA) y las concentraciones indicadas de mAb 50 y mAb 51. Se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente y se utilizaron MAG-Fc y NgR-Fc como controles. Durante cada etapa de incubación se lavaron las placas

15 con tampón de lavado (10 mM de Tris-HCl, pH 7,2 y un 0,05 % de Tween-20) La MAG-Fc marcado se desarrolló utilizando el sustrato 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (TMB, Pierce) en condiciones convencionales. Como se muestra en la Fig. 7, el mAb 50 (triángulos cerrados) y el mAb 51 (triángulos abiertos) no inhibían la unión de MAG-Fc al NgR humano. La MAG-Fc y NgR-Fc competían por la unión de la MAG-Fc marcado (círculos cerrados) a NgR-Fc humana (una proteína de fusión que comprendía del aminoácido Met 1 a la Ser 447 del NgR humano y un fragmento Fc

20 humano (R&D Systems); cuadrados cerrados). Por lo tanto, el mAb 50 y mAb 51 no compiten con MAG por la unión a NgR en estas condiciones (Figura 7). Ninguno del resto de otros anticuerpos competía con MAG por la unión a NgR en estas condiciones.

Ejemplo 8 B. Competición de OMgp a NgR-Fc

25 Para caracterizar adicionalmente los anticuerpos monoclonales se utilizó un ensayo similar al ensayo de unión del Ejemplo 8A para ensayar la capacidad de los dos mAb producidos en el Ejemplo 1 para inhibir la unión de OMgp a NgR-Fc humano. Se inmovilizó el NgR-Fc (0,2 µg/pocillo, R&D Systems) en placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc Maxisorb) en 50 mM de tampón carbonato-Na pH 9 durante una noche a 4 ⁰C seguido por una etapa de

30 bloqueo de 2 h con un 2 % de BSA en Tris-HCl, pH 7,2 a temperatura ambiente. Los pocillos recibieron una concentración constante de OMgp humano (R&D Systems/1673-OM; a una concentración final de 500 ng/ml en Tris-HCl, pH 7,2 con un 0,1 % de BSA) y las concentraciones indicadas de mAb 50 y mAb 51. La mezcla se incubó durante 60 min a temperatura ambiente. Se detectó la unión de OMgp con un anticuerpo anti-His marcado con peroxidasa de rábano rusticano (Roche). Durante cada etapa de incubación se lavaron las placas con tampón de

35 lavado (10 mM de Tris-HCl, pH 7,2 y un 0,05 % de Tween 20). El anticuerpo anti-His marcado se desarrolló

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Claims (1)

1. imagen1

   imagen2