ES2609313T3 - Método de expresión de proteínas - Google Patents

Abstract

Un método de cribado de un polipéptido para una actividad deseada contra una molécula objetivo, comprendiendo el método: a) cultivar una célula bacteriana Gram negativa que comprende un polinucleótido exógeno que codifica el polipéptido de manera que el polipéptido se produzca en la célula, b) permitir que un fago de lisis defectuosa empaquete el polinucleótido que codifica el polipéptido, en el que el fago de lisis defectuosa se retiene dentro de la célula bacteriana, c) permeabilización: i) de la membrana externa de la célula bacteriana, o ii) de las membranas interna y externa de la célula bacteriana, d) poner en contacto la célula bacteriana con la molécula objetivo, y e) cribar el polipéptido para la actividad deseada, en donde se retiene el polipéptido dentro de la célula bacteriana por la pared celular bacteriana o membrana interna y/o el polipéptido se une a la pared de la célula bacteriana o a la membrana interna.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de expresion de protemas Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos para cribar un polipeptido para una actividad deseada contra una molecula objetivo. En particular, la presente invencion se refiere a metodos para cribar un polipeptido para una actividad deseada contra una molecula objetivo mediante la expresion del polipeptido en una celula bacteriana Gram negativa y la permeabilizacion de la celula bacteriana. La memoria descriptiva tambien se refiere a metodos de empaquetamiento de bibliotecas de genes en una celula bacteriana.

Antecedentes de la invencion

El metodo mas antiguo de expresion de protemas es la expresion en fagos (Smith, 1985), en el que la protema de interes se fusiona con una de las protemas de recubrimiento externo del fago donde puede estar presente junto con las copias de tipo silvestre de la protema. Por ejemplo, una plataforma de expresion basada en el fago filamentoso M13 usando fusiones con la protema gill.

Otros metodos de expresion incluyen metodos de expresion "in vitro" en los que la protema se expresa utilizando un extracto de traduccion celular y el acoplamiento entre la protema y el acido nucleico codificador se logra mediante enlace ffsico (por ejemplo, expresion en ribosomas, expresion de ARNm) o a traves de union con un andamiaje comun o encapsulacion dentro de una membrana, tal como compartimentacion in vitro (IVC) en donde el ARNm se traduce dentro de una suspension de micelas que puede tambien incluir un sistema de captura de microperlas (magnetico o de Sefarosa) tanto para ARNm como para protema.

Otro metodo de expresion de protemas es la expresion en la superficie microbiana que involucra la localizacion dirigida de protemas expresadas al exterior de una celula microbiana, ya sea eubacteria Gram negativa o Gram positiva o levadura. Las protemas se fusionan con dominios de anclaje que las unen a la superficie de la celula. Los dominios de anclaje pueden tener motivos que dictan lipidacion o union covalente con la pared celular, o pueden ser una fusion con una protema de la membrana entera dentro de una region bucle expuesta. Debido a la escalabilidad de la produccion, la expresion en la superficie microbiana puede ser utilizada no solamente para cribado de las variantes de protema mejoradas a partir de una biblioteca diversa, sino que tambien puede utilizarse para presentar antfgenos para vacunacion o como un andamiaje celular para enzimas de biotecnologfa industrial.

Los metodos de expresion de protemas se aplican comunmente a la evolucion de protemas de afinidad, tales como anticuerpos. Los metodos de expresion de moleculas individuales son historicamente los mas populares, pero adolecen de alto nivel de ruido y baja resolucion entre las escalas de afinidad. Los anticuerpos identificados mediante expresion in vitro o mediante sistemas de fagos son habitualmente reformados para su expresion en el periplasma de E. coli, aunque los rendimientos periplasmaticos son a menudo extremadamente pobres en comparacion con la expresion en el citoplasma. Sin embargo, cuando los anticuerpos se expresan en el citoplasma con alto rendimiento, en casi todos los casos forman cuerpos de inclusion insolubles que deben ser replegados laboriosamente y sometidos a prueba de actividad.

Por lo tanto, subsiste la necesidad de metodos de expresion de protemas, particularmente para el cribado de bibliotecas de expresion de protemas de afinidad y bibliotecas de enzimas.

SUMARIO DE LA INVENCION

Los presentes inventores han desarrollado un metodo de expresion de protemas en el que se produce un polipeptido que es cribado para una actividad deseada en el citoplasma de una celula bacteriana Gram negativa y el polinucleotido que codifica el polipeptido se empaqueta dentro de un fago de lisis defectuosa que tambien se retiene dentro de la celula bacteriana. Una o mas de las membranas celulares bacterianas estan permeabilizadas, por lo que la celula bacteriana puede ponerse en contacto con una molecula objetivo con el fin de detectar la actividad deseada. La presente invencion proporciona el objetivo tal como se expone en una cualquiera de las reivindicaciones anexas 1 a 15.

Por consiguiente, la presente invencion proporciona un metodo de cribado de un polipeptido para una actividad deseada contra una molecula objetivo, comprendiendo el metodo:

a) cultivar una celula bacteriana Gram negativa que comprende un polinucleotido exogeno que codifica el polipeptido de manera que el polipeptido se produzca en la celula,

b) permitir que un fago de lisis defectuosa empaquete el polinucleotido que codifica el polipeptido, en el que el fago de lisis defectuosa se retiene dentro de la celula bacteriana,

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c) permeabilizacion:

i) de la membrana externa de la celula bacteriana, o

ii) de las membranas interna y externa de la celula bacteriana,

d) poner en contacto la celula bacteriana con la molecula objetivo, y

e) cribar el polipeptido para la actividad deseada,

en donde se retiene el polipeptido dentro de la celula bacteriana por la pared celular bacteriana o membrana interna y/o el polipeptido se une a la pared de la celula bacteriana o a la membrana interna.

En una realizacion, el polipeptido puede ser expresado y retenido dentro del citoplasma de la celula bacteriana por la pared celular bacteriana. Por lo tanto, en una realizacion, el metodo comprende la permeabilizacion de las membranas interna y externa de la celula bacteriana.

El polipeptido puede tener un tamano suficiente de tal manera que es retenido dentro de la celula bacteriana que comprende membranas internas y externas permeabilizadas por la pared celular intacta. Alternativamente, si el polipeptido es suficientemente pequeno en tamano puede difundirse a traves de la pared celular intacta. Con el fin de evitar que el polipeptido se difunda a traves de la pared celular, en una realizacion el polipeptido se asocia con al menos un segundo polipeptido para formar un complejo proteico que es retenido dentro de la celula bacteriana permeabilizada y/o se une a la pared celular bacteriana. En una realizacion, el polipeptido se fusiona con el segundo polipeptido o una de sus subunidades.

En una realizacion particular, el segundo polipeptido se selecciona de:

i) un polipeptido que tiene un tamano molecular tal manera que se retiene el complejo de protema dentro de la pared celular bacteriana permeabilizada;

ii) una protema de union al ADN;

iii) una protema de union a la pared celular bacteriana; y/o

iv) una protema de la cubierta del fago del fago de lisis defectuosa.

Aunque se puede utilizar cualquier metodo adecuado para permeabilizar las membranas bacterianas interna y externa, en una realizacion, las membranas bacterianas interna y externa son permeabilizadas con uno o mas detergentes o un disolvente organico.

En una realizacion, uno o mas detergentes son un detergente no ionico.

En otra realizacion, el detergente no ionico se selecciona de Decanoil-N-metilglucamida (Mega10), oxido de dimetiloctilfosfina (Apo8), n-octil-p-D-tioglucopiranosido (8TGP) y una mezcla de Decanoil-N-metilglucamida (Mega10) y oxido de dimetiloctilfosfina (Apo8).

Alternativamente, las membranas interna y externa de la celula bacteriana pueden ser permeabilizadas con un disolvente organico tal como cloroformo. Por ejemplo, en una realizacion, las membranas interna y externa de la celula bacteriana se permeabilizan incubando la celula bacteriana en una solucion acuosa saturada con cloroformo.

En una realizacion particular, la celula bacteriana se incuba en la solucion acuosa saturada con cloroformo durante aproximadamente l0 minutos a aproximadamente 25°C.

En otra realizacion de la invencion, el polipeptido se produce en la celula bacteriana y se une a la membrana interna de la celula bacteriana. De este modo, la membrana externa de la celula bacteriana se permeabiliza y la pared celular se hidroliza al menos parcialmente, mientras que la membrana interna permanece intacta.

Por consiguiente, en una realizacion del metodo de la invencion:

i) se permeabiliza la membrana externa de la bacteria;

ii) se hidroliza al menos parcialmente la pared celular bacteriana; y

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iii) se une el polipeptido a la membrana interna.

En una realizacion particular, la pared celular bacteriana se hidroliza al menos parcialmente con lisozima.

En una realizacion adicional, el polipeptido se fusiona con una protema que se une a la membrana interna. En una realizacion particular, el polipeptido esta unido a la cara externa de la membrana interna.

En aun otra realizacion, el polipeptido esta asociado con una protema del recubrimiento del bacteriofago. En una realizacion particular, el polipeptido se fusiona a cualquiera de los extremos de la protema de la capside del bacteriofago lambda, gpD. En otra realizacion, el polipeptido se fusiona con al extremo del terminal N de la protema de la capside del bacteriofago P2, gpL.

El ADN que codifica el polipeptido puede ser ADN genomico y/o ADN episomal. En una realizacion, el polinucleotido que codifica el polipeptido es un ADN de plasmido, de cosmido, de fagemido o de fago.

En una realizacion, el fago de lisis defectuosa es un fago templado seleccionado entre el fago lambda, 186, P2, un tnbrido de 186 y P2 y/o P4.

El fago de lisis defectuosa puede estar presente en la celula bacteriana Gram negativa como un fago o integrado en el genoma de la celula huesped como un profago. Por tanto, en una realizacion, el fago de lisis defectuosa es un profago.

En una realizacion particular, la celula bacteriana comprende un fago lambda de lisis defectuosa, 186, P2, un tnbrido de 186 y profago P2, y/o P4.

En otra realizacion, la celula bacteriana comprende un profago P2 y P4.

En una realizacion particular, la celula bacteriana comprende un profago lambda.

En aun otra realizacion, la celula bacteriana comprende un tnbrido de 186 y un profago P2.

En una realizacion, permitir que el fago de lisis defectuosa empaquete al polinucleotido que codifica el polipeptido comprende inducir la activacion del profago en la celula bacteriana para producir el fago, donde el fago empaqueta el polinucleotido.

En una realizacion, la induccion de la activacion del profago comprende producir una o mas protemas activadoras de fagos en la celula bacteriana.

En una realizacion particular, la celula bacteriana comprende los profagos P2 y P4 y el metodo comprende producir protemas activadoras de P2 y/o P4 en la celula bacteriana.

En una realizacion, las protemas activadoras de P2 y/o P4 se seleccionan de uno o mas de P2 cox, P2 ogr, P4 6 y/o P4e.

En otra realizacion, la induccion de la activacion del profago comprende inactivar una o mas protemas represoras de fagos en la celula bacteriana.

En una realizacion, la celula bacteriana comprende al profago de P2 y/o P4 y la induccion de la activacion del profago P2 comprende inactivar un alelo represor sensible a la temperatura de la protema C de P2 en la celula bacteriana.

En una realizacion, la celula bacteriana comprende el profago lambda e induccion de la activacion del profago lambda comprende la inactivacion de un alelo represor sensible a la temperatura de la protema cl represora del fago lambda en la celula bacteriana.

En otra realizacion, la celula bacteriana comprende al profago 186 y la induccion de la activacion del profago 186, comprende la inactivacion de un alelo represor sensible a la temperatura de la protema cl de 186 en la celula bacteriana.

En otra realizacion, la celula bacteriana comprende un tnbrido de profago 186 y P2 y la induccion de la activacion del profago comprende la inactivacion de un alelo represor sensible a la temperatura del fago tnbrido en la celula bacteriana.

En otra realizacion adicional, el profago es de lisis defectuosa debido a la supresion o mutacion a una forma inactiva de cualquiera de los genes de lisozima o de holina, o supresion o mutacion a una forma inactiva tanto de los genes de

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holina como de lisozima. En una realizacion particular, el gen de la lisozima del profago P2 comprende una secuencia de nucleotidos que comprende la SEQ ID NO: 17 y el gen de la holina P2 comprende una secuencia de nucleotidos que comprende la SEQ ID NO: 18. En otra realizacion, el gen de holina del profago lambda comprende una secuencia de nucleotidos que comprende la SEQ ID NO: 23 y el gen de lisozima lambda comprende una secuencia de nucleotidos que comprende la SEQ ID NO: 24.

En otra realizacion, la induccion de la activacion del profago comprende el aumento de la temperatura de incubacion de las celulas bacterianas. En una realizacion particular, la temperatura de incubacion de las celulas bacterianas se incrementa desde aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 42°C para inducir la activacion del profago. En una realizacion, el profago es fago lambda. En otra realizacion, el profago es 186 o un hnbrido de profago 186 y P2.

El experto en la tecnica comprendera que el metodo de la presente invencion se puede usar junto con otros sistemas conocidos de expresion en fagos. En contraste con la presente invencion, los sistemas conocidos de expresion en fagos no empacan el polinucleotido que codifica el polipeptido en un fago de lisis defectuosa y/o no retienen el polipeptido dentro de la celula bacteriana o se unen a la pared celular bacteriana o a las membranas celulares.

Por consiguiente, en una realizacion, el metodo comprende ademas una seleccion adicional del polipeptido para una actividad deseada contra una molecula objetivo en una celula bacteriana Gram negativa, en donde

i) el polinucleotido que codifica el polipeptido no se empaqueta en un fago de lisis defectuosa , y/o

ii) el polipeptido no esta retenido dentro de la celula bacteriana por la pared celular bacteriana y/o unido a la pared celular bacteriana.

Aunque el cribado adicional utilizando un sistema conocido de expresion en fagos puede realizarse antes y/o despues del metodo de la invencion, en una realizacion el cribado adicional se lleva a cabo antes del metodo de la invencion.

En una realizacion, el fago en el cribado adicional se lleva a cabo usando un fago lftico o un fago templado para empaquetar el polinucleotido que codifica el polipeptido.

En otra realizacion, la celula bacteriana en el cribado adicional es lisada para liberar el fago.

En aun otra realizacion, el fago en el cribado adicional es un fago lftico que lisa la celula bacteriana.

Cuando la celula bacteriana es lisada durante el cribado adicional, es deseable unir el polipeptido a la partmula del fago. De este modo, en una realizacion:

i) el fago lftico comprende una primera pareja de union en la capa del fago, y

ii) el polipeptido que esta siendo cribado para una actividad deseada es una protema de fusion que comprende una segunda pareja de union,

en donde la protema de fusion que comprende la segunda pareja de union se une a la primera pareja de union en la capa del fago lambda.

En una realizacion, el fago lftico es fago lambda.

En otra realizacion, el fago lftico es 186, P2, un tnbrido de 186 y un profago P2, y/o P4.

En una realizacion, la primera pareja de union es calmodulina y la segunda pareja de union es un peptido que se une a la calmodulina.

En aun otra realizacion, los uno o mas profagos en el cribado adicional son fagos de lisis defectuosa y las celulas se lisan qmmicamente y/o enzimaticamente. En una realizacion particular, la lisis enzimatica de las celulas comprende la lisis de las celulas bacterianas con lisozima. El fago de lisis defectuosa puede ser, por ejemplo, lambda, 186, P2, un hnbrido de 186 y el profago P2, y/o P4 de lisis defectuosa.

Aunque el metodo de la invencion puede ser usado para empaquetar cualquier biblioteca genica, en una realizacion, la biblioteca de polinucleotidos que codifica polipeptidos que van a ser cribados para una actividad deseada contra una molecula objetivo.

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La memoria descriptiva proporciona ademas una bacteria Gram negativa que comprende un fago de lisis defectuosa con una protema represora sensible a la temperature.

La memoria descriptiva proporciona ademas una bacteria Gram negativa que comprende un fago de lisis defectuosa y un polinucleotido que codifica una o mas proternas activadoras de fagos.

El fago de lisis defectuosa se puede seleccionar a partir de lambda, 186, P2, un hforido de 186 y P2 y/o P4.

Las proternas activadoras de fagos se pueden seleccionar de P2 cox, P2 ogr, P4 6 y/o P4e.

La memoria descriptiva proporciona ademas un kit que comprende la bacteria Gram negativa como se describe en la presente memoria.

El kit puede comprender ademas un agente capaz de permeabilizar la celula bacteriana Gram negativa. El agente capaz de permeabilizar la celula bacteriana Gram negativa se puede seleccionar de uno o mas detergentes o un disolvente organico.

El detergente puede ser un detergente no ionico seleccionado de decanoil-N-metilglucamida (Mega10), oxido de dimetiloctilfosfina (Apo8), n-octil-p-D-tioglucopiranosido (8TGP), polisorbato 20 (Tween20) y un mezcla de decanoil-N- metilglucamida (Mega10) y oxido de dimetiloctilfosfina (Apo8).

El disolvente organico puede ser cloroformo.

La memoria descriptiva proporciona ademas un metodo para cribar un polipeptido para una actividad deseada contra una molecula objetivo, comprendiendo el metodo:

a) cultivar una celula bacteriana Gram negativa que comprende un polinucleotido que codifica el polipeptido de tal manera que se produce el polipeptido,

b) permeabilizar las membranas interna y externa de la celula bacteriana con cloroformo, en donde el polipeptido y el polinucleotido que codifica el polipeptido se retienen dentro de la celula bacteriana permeabilizada,

c) poner en contacto la celula bacteriana permeabilizada con la molecula objetivo de tal manera que se difunda en la celula bacteriana permeabilizada y

d) cribar el polipeptido para la actividad deseada.

La memoria descriptiva proporciona ademas un metodo de cribado de un polipeptido para una actividad deseada contra una molecula objetivo, comprendiendo el metodo:

a) cultivar una celula bacteriana Gram negativa que comprende un polinucleotido que codifica el polipeptido de tal manera que se produce el polipeptido y se une a la pared celular bacteriana,

b) permeabilizar las membranas interna y externa de la celula bacteriana con cloroformo, en donde el polinucleotido que codifica el polipeptido se retiene dentro de la celula bacteriana permeabilizada,

c) poner en contacto la celula bacteriana permeabilizada con la molecula objetivo, y

d) cribar el polipeptido para la actividad deseada.

La etapa d) puede comprender:

i) determinar si el polipeptido se une y/o el grado de union con la molecula objetivo, y/o

ii) determinar si el polipeptido modifica enzimaticamente y/o la velocidad de modificacion enzimatica de la molecula objetivo.

El polipeptido puede estar asociado con al menos un segundo polipeptido para formar un complejo proteico que es retenido dentro de la celula bacteriana permeabilizada y/o unido a la pared celular bacteriana.

El polipeptido puede fusionarse con el segundo polipeptido, o una de sus subunidades.

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En el metodo descrito en la presente memoria, el segundo polipeptido se puede seleccionar de:

i) un polipeptido que tiene un tamano molecular de tal manera que el complejo de protema se retiene dentro de la pared celular bacteriana permeabilizada;

ii) una protema de union al ADN;

iii) una protema de union a la pared celular bacteriana, y/o

iv) una protema de recubrimiento del fago.

La memoria descriptiva proporciona ademas un metodo para identificar un polipeptido con una actividad deseada, comprendiendo el metodo:

a) cribar una biblioteca de polipeptidos usando un metodo como se describe en el presente documento; y

b) seleccionar uno o mas polipeptidos con la actividad deseada.

La memoria descriptiva proporciona ademas una celula bacteriana Gram negativa obtenida mediante permeabilizacion de las membranas interna y externa de la celula bacteriana con cloroformo, en donde la celula bacteriana comprende un polipeptido exogeno asociado con un segundo polipeptido para formar un complejo proteico que se retiene dentro de la celula bacteriana permeabilizada.

La memoria descriptiva proporciona ademas una celula bacteriana Gram negativa obtenida por permeabilizacion de las membranas interna y externa de la celula bacteriana con cloroformo, en donde la celula bacteriana comprende un polipeptido exogeno unido a la pared celular bacteriana.

La memoria descriptiva proporciona ademas un kit que comprende:

a) un vector que comprende

i) un sitio para insertar en el vector un polinucleotido que codifica un primer polipeptido, y

ii) un marco de lectura abierto que codifica un segundo polipeptido que se asocia con el primer polipeptido para formar un complejo de protema que se retiene dentro de la celula bacteriana Gram negativa permeabilizada, y

b) cloroformo para permeabilizar una celula bacteriana.

La memoria descriptiva proporciona ademas un kit que comprende:

a) un vector que comprende

i) un sitio para insertar dentro del vector un polinucleotido que codifica un primer polipeptido, y

ii) un marco de lectura abierto que codifica un segundo polipeptido que se asocia con el primer polipeptido para formar un complejo proteico que se une a una pared celular bacteriana Gram negativa, y

b) cloroformo para permeabilizar una celula bacteriana.

Como sera evidente, los rasgos y caractensticas preferidas de un aspecto de la invencion son aplicables a muchos otros aspectos de la invencion.

A lo largo de esta memoria descriptiva, la palabra "comprende", o variaciones tales como "que comprende", se entendera que implican la inclusion de un elemento, un numero entero o un etapa determinados, o un grupo de elementos, numeros enteros o etapas, pero no la exclusion de cualquier otro elemento, numero entero o etapa, o grupo de elementos, numeros enteros o etapas.

La invencion sera descrita a continuacion por medio de los siguientes Ejemplos no limitantes y con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripcion de los dibujos adjuntos

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FIGURA 1. Permeabilizacion con detergente de celulas de E. coli . Las celulas de E. coli que expresan GFP fueron tratadas con detergentes para determinar la eficacia de la permeabilizacion de la membrana. Las celulas fueron observadas ya sea por microscopfa de campo claro (primera columna) o de fluorescencia (segunda y tercera columnas). La permeabilizacion fue efectiva si GFP (columna 2) fue liberaba de la celula al mismo tiempo con la absorcion del colorante impermeable a la membrana que se une al ADN, Gel Red (tercera columna). Se encontro que los detergentes 8TGP (0,5%) y Mega10 al 0,5%/ Apo8 al 0,5% ('Agente86') fueron los mas eficaces en la permeabilizacion de las celulas de E. coli.

FIGURA 2. SDS-PAGE de sobrenadantes de detergente. El sobrenadante de la permeabilizacion con detergente de las celulas de E. coli mostradas en la Figura 1 fueron cargadas en una SDS-PAGE al 9% para juzgar cualitativamente la liberacion de protema por los detergentes (primer carril). Para demostrar la retencion de un subconjunto de protemas celulares por la capsula de la pared celular en celulas permeabilizadas con detergente, se trato una muestra de celulas permeabilizadas con detergente con lisozima (2 mg/mL) para hidrolizar la pared celular (segundo carril).

FIGURA 3. Expresion de la protema de fusion tetramerica. (A) La expresion de las protemas de fusion His6::SNAP:: tetramero en E. coli se examino mediante transferencia de Western utilizando un anticuerpo aHis probado contra la protema celular total. Se observo una banda de alto peso molecular > 250 kD en la fusion del tetramero RhnA (carril 4), ademas de una banda del peso molecular esperado, que es una forma presumiblemente resistente a SDS del complejo que migro como un tetramero. (B) El extracto de protema de fusion tetramerica BetB se separo en los extractos soluble en detergente e insoluble en detergente (sedimento de la capsula celular), y se examino mediante SDS-PAGE.

FIGURA 4. Marcacion con SNAP de las protemas de fusion tetramericas. Las protemas de fusion His6::SNAP::tetramero se expresaron en E. coli y se permeabilizaron las celulas con 8TGP, como se describe en el Ejemplo 1. La expresion de la protema de fusion se detecto mediante microscopfa de fluorescencia de las celulas permeabilizadas marcadas con el ligando BG-547 de SNAP impermeable a la membrana (segunda columna), como se describe en el Ejemplo 3. Se marco el ADN celular con el colorante permeable a la membrana, Sytox Green (primera columna). La superposicion de la senal de SNAP y Sytox Green se presenta en la tercera columna.

FIGURA 5. Marcacion con el anticuerpo aHis del tetramero His6::SNAP::BetB en celulas permeabilizadas. Microscopfa de fluorescencia de celulas permeabilizadas que expresan el tetramero His6::SNAP::BetB probado con un anticuerpo aHis (primer panel), como se describe en el Ejemplo 3. Las celulas fueron marcadas con el ligando BG-547 de SNAP(segundo panel). La localizacion conjunta tanto de aHis como de SNAP (tercer panel) indica que el anticuerpo aHis penetro a traves de la pared celular de las celulas permeabilizadas.

FIGURA 6. Fusiones de los tetrameros BetB, RhnA y YdcW con reporteros de expresion HALO y SNAP. Los tetrameros BetB, RhnA y YdcW se fusionaron en forma separada con los reporteros de expresion, HALO y SNAP. Las celulas que expresan la protema de fusion fueron permeabilizadas y se marco el ADN del huesped con Gel Red y se detecto la protema de fusion usando los ligandos fluorescentes para HALO (G1001) y SNAP (BG-488).

FIGURA 7. Expresion de la fusion GFP5::Protema de union a ADN(DBP). Se fusiono la protema de union a ADN de alta afinidad, no espedfica, ComE, de N. gonorrea al extremo terminal C de GFP5 y se expreso en E. coli. Las celulas se permeabilizaron y se observaron por microscopfa de fluorescencia para GFP (primer panel) y Gel Red (segundo panel). La localizacion conjunta(tercer panel) de la fluorescencia indica que tanto la protema de fusion como el aDn del huesped fueron retenidos dentro de la capsula celular permeabilizada.

FIGURA 8. Retencion de ADN en celulas permeabilizadas. Las celulas de E. coli que expresan la fusion GFP5::DBP o una fusion His6::eGFP fueron o bien dejadas sin tratamiento (filas 1 y 4) o fueron permeabilizadas (filas 2, 3, 5 y 6) como se describe en el Ejemplo 1. Las celulas permeabilizadas fueron o bien almacenadas durante la noche a 4°C o resuspendidas en TBS y agitadas durante la noche a 37°C antes de ser observadas por microscopfa de fluorescencia para GFP (primera columna) o Gel Red (segunda columna). La localizacion conjunta de GFP y Gel Red se presenta en la tercera columna.

FIGURA 9. Extraccion de ADN de celulas permeabilizadas. Las celulas de E. coli que expresan (A) las protemas de fusion GFP5::DBP o (B) His6::eGFP fueron permeabilizadas como se describe en el Ejemplo 1. Las celulas permeabilizadas se almacenaron durante la noche a 4°C o se resuspendieron en TBS y se agitaron durante la noche a 37°C antes de que fuera extrafdo el ADN plasmfdico y se sometiera a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% con regulador TAE y tenido con bromuro de etidio. El carril 1 es el ADN plasmfdico total en celulas no tratadas. Los carriles 2 y 4 son los sobrenadantes de la etapa de permeabilizacion de las capsulas celulares almacenadas durante la noche a 4°C y con agitacion a 37°C, respectivamente, y los carriles 3 y 5 son preparaciones de plasmido de las capsulas celulares almacenadas durante la noche a 4°C y con agitacion a 37°C, respectivamente.

FIGURA 10. Marcacion con SNAP de la protema de fusion OmpF::SNAP::LPP. Las celulas de E. Coli que expresan la protema de fusion OmpF::SNAP::LPP se permeabilizaron como se describe en el Ejemplo 1. La localizacion de la protema de fusion se detecto mediante marcacion con el ligando BAG-488 de SNAP como se describe en el Ejemplo 3.

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Las celulas marcadas se observaron mediante microscop^a de campo claro (primer panel) y por microscopfa de fluorescencia (segundo panel). El tercer panel es la superposicion de las observaciones de campo claro y de fluorescencia.

FIGURA 11. Union de eGFP por protema de fusion aGFP::HALO::RhnA. Las celulas de E. Coli que expresan la protema de fusion aGFP::HALO::RhnA se permeabilizaron como se describe en el Ejemplo 1. La protema eGFP purificada se unio a las capsulas celulares como se describe en el Ejemplo 8 y se observo eGFP por microscopfa de fluorescencia. Primer panel, observacion por campo claro; segundo panel, fluorescencia con eGFP; tercer panel, superposicion de la observacion por campo claro y fluorescencia.

FIGURA 12. Union de eGFP por la protema de fusion aGFP::KzPG::SNAP::DBP. Las celulas de E. Coli que expresan la protema de fusion aGFP::KzPG::SNAP::DBP se permeabilizaron como se describe en el Ejemplo 1. La protema eGFP purificada se unio a las capsulas celulares como se describe en el Ejemplo 8 y se observo la eGFP por microscopfa de fluorescencia mediante dos metodos, montaje en humedo y montaje en seco, como se describe en el Ejemplo 3. (A) eGFP unida a capsulas de celulas montadas en humedo. Los paneles de insercion (i) y (ii) muestran la localizacion en la pared celular de la eGFP unida por la protema de fusion aGFP::KzPG::SNAP::DBP. (B) y el panel de inserto (Aiii) muestran las mismas celulas preparadas para microscopfa por montaje en seco en DABCO/glicerol.

FIGURA 13. Union de eGFP por la protema de fusion OmpF::aGFP::SNAP::LPP. Las celulas de E. Coli que expresan la protema de fusion OmpF::SNAP::LPP o la protema de fusion OmpF::aGFP::SNAP::LPP se permeabilizaron como se describe en el Ejemplo 1. La protema eGFP purificada se unio a las capsulas celulares como se describe en el Ejemplo 8 y eGFP se observo mediante microscopfa de fluorescencia por montaje en seco, como se describe en el Ejemplo 3. (A) Las celulas que expresan la protema de fusion OmpF::SNAP::LPP carecen de fluorescencia de eGFP (segundo panel, fila superior), a diferencia de las celulas que expresan la protema de fusion OmpF::aGFP::SNAP::LPP (segundo panel, fila inferior).

FIGURA 14. Demostracion de la union covalente a la pared celular mediante la protema de fusion LPP. Las celulas de E. Coli que expresan la protema de fusion OmpF::aGFP::SNAP::LPP se permeabilizaron como se describe en el Ejemplo 1. La localizacion de la protema de fusion se detecto mediante la marcacion con el ligando BG-488 de SNAP como se describe en el Ejemplo 3 y se tino el ADN con Gel Red. Las muestras se calentaron durante 5 minutos a 22°C (A) o a 95°C (B) antes de ser montadas en seco y observadas por microscopfa de fluorescencia.

FIGURA 15. Permeabilizacion de la membrana externa utilizando un regulador detergente/Ca2+. Las celulas de E. Coli que expresan la protema de fusion OmpF::aGFP::SNAP::LPP (aGFP externa o la protema de fusion

aGFP::HALO::FLAG::RhnA (aGFP interna) se permeabilizaron como se describe en el Ejemplo 10. La permeabilizacion de la membrana externa a los ligandos grandes se evaluo mediante la union de eGFP al dominio de aGFP unido a la

pared celular. La permeabilizacion de la membrana interna se evaluo utilizando un ligando grande (eGFP) y un ligando

pequeno (Gel Red). Ambos detergentes Apo8 (A) y Tween20 (B) en regulador de Ca2+ demostro permeabilidad selectiva de la membrana externa a ligandos grandes.

FIGURA 16. Permeabilizacion de la membrana externa utilizando un regulador detergente/EDTA. Las celulas de E. Coli que expresan la protema de fusion OmpF::aGFP::SNAP::LPP (aGFP externa) o la protema de fusion

aGFP::HALO::FLAG::RhnA (aGFP interna) se permeabilizaron como se describe en el Ejemplo 10. La permeabilizacion de la membrana externa con ligandos grandes se evaluo mediante la union de eGFP al dominio de aGFP unido a la pared celular. La permeabilizacion de la membrana interna se evaluo utilizando un ligando grande (eGFP) y un ligando pequeno (Gel Red). Ambos detergentes Apo8 (A) y Tween20 (B) en regulador de EDTA demostraron permeabilidad selectiva de la membrana externa a ligandos grandes.

Figura 17. Analisis por FACS de una poblacion mixta de celulas marcadas con eGFP y SNAP. Tres poblaciones de celulas de E. coli que expresan; EGFP (flecha #1); la protema de fusion aGFP::KzPG::SNAP::DBP marcada con el ligando BG-488 de SNAP (flecha # 2); y His6::SNAP::BetB marcado con ligando BG-547 de SNAP (flecha # 3) fueron clasificados por FACS. Las poblaciones clasificadas se analizaron nuevamente con respecto a la pureza y la integridad de las celulas 60 minutos despues de la primera clasificacion.

Figura 18. Un enlazador peptfdico entre los dominios aGFP y KzPG permite la union de las celulas de E. coli que expresan una protema de fusion aGFP::KzPG::SNAP::DBP con un soporte de sefarosa. Las celulas que expresan una protema de fusion aGFP::KzPG::SNAP::DBP con una region enlazadora de 12-mer, RL6, entre los dominios de aGFP y KzPG se unieron a un soporte de Co2+-sefarosa a traves de un compuesto intermedio His6::eGFP. La union de GFP se muestra en el panel izquierdo (verde); la union del ligando de SNAP (rojo) de la protema de fusion se muestra en el panel central; la superposicion de cada uno se muestra a la derecha.

FIGURA 19. Union de celulas de E. coli que expresan la protema de fusion aGFP::RL6::KzPG::SNAP::DBP a perlas magneticas marcadas con estreptavidina. (A) eGFP marcada con biotina (paneles central y derecho) se unio a las celulas que expresan la protema de fusion aGFP::RL6::KzPG::SNAP::DBP que a su vez se unio a partmulas magneticas

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marcadas con estreptavidina. (B) La union inversa de las celulas que expresan la protema de fusion aGFP::RL6::KzPG::SNAP::DBP a partmulas magneticas marcadas con estreptavidina que habfan sido primero marcadas con eGFP biotinilado. En este ejemplo, las perlas estan marcadas en verde (panel GFP), las celulas fueron marcadas con el ligando BG-547 de SNAP (rojo, panel rojo de SNAP). (C) Un enlazador de dominio, el dominio 27 de Ig de titina humana, tambien fue eficaz como un espaciador de union. Las celulas de E. Coli que expresan la protema de fusion aGFP::I27::RL6::KzPG::SNAP::DBP se unieron primero a eGFP biotinilado (verde, panel GFP) y se marcaron con el ligando BG-547 de SNAP (rojo, panel SNAP rojo) antes de unirse a las partmulas magneticas marcadas con estreptavidina.

Figura 20. Expresion de los genes scFv de raton en el citoplasma de E. coli como protemas de fusion scFv::I27::RL6::KzPG::SNAP::DBP. Se construyo y expreso una biblioteca de scFv de raton de acuerdo con una realizacion del metodo de la invencion en citoplasma de E. coli. Los clones con expresion detectable se detectaron mediante union del ligando de SNAP y se categorizaron como plegados erroneamente (panel izquierdo), expresados debilmente pero solubles (panel del medio) o altamente expresados y solubles (panel derecho).

Figura 21. Deteccion de la expresion de scFv soluble e insoluble en el citoplasma de E. coli. Los clones seleccionados que se encontro que eran altamente expresados y solubles en una criba limitada de la biblioteca de la biblioteca de expresion de scFv de raton se subclonaron en constructos de expresion como las protemas de fusion scFv::I27::RL6::FLAG y scFv::RL6::FLAG. Las fracciones de protema se cargaron como solubles o insolubles en geles de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se detectaron usando anticuerpos aFLAG. Las muestras se emparejan por fracciones solubles (S) o insolubles (P), asf como cada clon se expresa con el enlazador I27::RL6 (I) o RL6 (R). Tambien se muestra en los paneles inferiores una imagen de microscopfa de fluorescencia del clon scFv original en constructo de expresion I27::RL6::KzPG::SNAP::DBP aislado del cribado de la biblioteca.

FIGURA 22. Permeabilizacion de membranas con E. coli usando disolventes organicos. Las celulas de E. coli que expresan una protema de fusion aGFP::RL6::KzPG::SNAP::DBP se suspendieron en mezclas acuosas de disolventes organicos. La permeabilizacion de la membrana se indico mediante la union de (A) un ligando fluorescente de union a ADN de pequeno peso molecular, Gel Red; y de una protema de 30 kD, eGFP. De los disolventes organicos probados, solo el cloroformo permeabilizo membranas tanto internas como externas para permitir la entrada en la celula de la eGFP de alto peso molecular (B).

FIGURA 23. Expresion de la protema de fusion aGFP:I27:gpL en E. coli. La expresion de la protema de fusion aGFP:I27: gpL se indujo por induccion de arabinosa, como se describe en el Ejemplo 20. La protema soluble se libero de celulas de E. coli por permeabilizacion con 8TGP al 0,5% y el resto de la muestra se considero insoluble. Las muestras se sometieron a ebullicion en regulador de carga SDS y a electroforesis en SDS-PAGE al 15%. Se transfirieron las protemas a la membrana de nitrocelulosa y se probaron con anticuerpo monoclonal aFLAG para detectar la protema de fusion aGFP:I27:gpL. (1) muestra 1: clon de fusion 1 no inducido de aGFP:I27:gpL; (2) clon de fusion 1 inducido aGFP:I27:gpL 1; (3) clon de fusion 2 inducido aGFP:I27:gpL. S = fraccion soluble; In = fraccion insoluble.

FIGURA 24. Formacion de imagenes de fluorescencia del fago lambda encapsulado marcado con mAG1 que expresa la protema de fusion gpD::a-mAG1. Las celulas de E. Coli inducidas por un profago lambda y que expresan la protema de fusion gpD::a-mAG1 fueron permeabilizadas y tenidas con la protema mAG1 y el colorante de union al ADN, Gel Red. mAG1 se observo mediante microscopfa de fluorescencia para unirse en un patron punteado dentro de celulas permeabilizadas (panel izquierdo).

FIGURA 25. Captura de pantalla del analisis por FACS de la afluencia del fago lambda encapsulado que expresa la protema de fusion gpD::a-mAG1. Se muestra el grafico de fluorescencia para eventos de 100 K en un FACS de afluencia (BD Biosciences) con una entrada de ~ 1% de celulas positivas para a-mAG1. La poblacion de celulas ha sido tenida conjuntamente con el colorante de union al ADN, Gel Red (rojo, 561 nm) y la protema mAG1 fluorescente (verde, 488 nm). La poblacion cerrada P2 es positiva para a-mAG1 y la poblacion cerrada p3 es negativa para a-mAG1.

Clave del listado de la secuencias

SEQ ID NO: 1 - Secuencia de nucleotidos del vector de arabinosa pAra3::His6::SNAP

SEQ ID NO: 2 - Secuencia de nucleotidos del vector pAra3::His6::KzPG::SNAP::DBP

SEQ ID NO: 3 - Secuencia de nucleotidos del vector pAra3::OmpF::SNAP::LPP

SEQ ID NO: 4 - Secuencia de nucleotidos del vector pAra3::aGFP(R35)::HALO::FLAG::RhnA

SEQ ID NO: 5 - Dominio espaciador peptfdico aleatorizado

SEQ ID NO: 6 a 12 - Espaciadores enlazadores peptidicos SEC ID NO: 13 - I27::RL6::KzPG::SNAP::DBP

SEC ID Neo: 14 - Secuencia de codificacion de I27::RL6::KzPG::SNAP::DBP SEQ ID NO: 15 - Vector de andamiaje de biblioteca 5 SEQ ID NO: 16 - Espaciador I27

SEQ ID NO: 17 - Secuencia de nucleotidos del gen de la endolisina del enterobacteriofago P2

SEQ ID NO: 18 - Secuencia de nucleotidos del gen de la holina del enterobacteriofago P2

SEQ ID NO: 19 - Secuencia de nucleotidos del vector P4 6 inducible por temperature SEQ ID NO: 20 - Secuencia de aminoacidos de la protema de fusion aGFP::I27::gpL 10 SEQ ID NO: 21 - Secuencia de aminoacidos de la protema de fusion gpL::aGFP::I27

SEQ ID NO: 22 - Secuencia de nucleotidos del vector de expresion de la protema de fusion aGFP::I27::gpL SEQ ID NO: 23 - Secuencia de nucleotidos del gen de holina del fago lambda

SEQ ID NO: 24 - Secuencia de nucleotidos del gen de lisozima del fago lambda

SEQ ID NO: 25 - Secuencia de aminoacidos del residuo de supresion de la agrupacion de lisis lambda 15 SEQ ID NO: 26 - Secuencia de nucleotidos de la region lambda cos

SEQ ID NO: 27 - Secuencia de nucleotidos del vector de supresion de lambda SR (ASR)

Descripcion detallada Tecnicas generales y definiciones

A menos que se defina espedficamente lo contrario, se entendera que todos los terminos tecnicos y cientfficos usados 20 en este documento tienen el mismo significado que comunmente entiende un experto en la tecnica (por ejemplo, en qmmica de protemas, bioqmmica, cultivo de celulas, genetica molecular, microbiologfa, e inmunologfa).

A menos que se indique lo contrario, la protema recombinante, el cultivo celular y las tecnicas inmunologicas utilizadas en la presente invencion son procedimientos estandar, bien conocidos por los expertos en la tecnica. Tales tecnicas se describen y explican en la literatura en fuentes tales como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley 25 and Sons (1984), J. Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ra edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), R. Scopes, Protein Purification - Principals and Practice, 3ra edicion, Springer (1994), TA Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, volumenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, volumenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel y colaboradores (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, 30 incluyendo todas las actualizaciones hasta la fecha), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988) y J.E Coligan y colaboradores (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta la fecha).

Los terminos "polipeptido", "protema" y "peptido" se usan generalmente indistintamente en la presente memoria descriptiva. Como se usa en la presente memoria, el termino "polipeptido exogeno" se refiere a un polipeptido codificado 35 por un polinucleotido exogeno. El termino "polinucleotido exogeno" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un polinucleotido que es foraneo a la celula en la que ha sido introducido, o que la secuencia es homologa a una secuencia en la celula en la que se introduce pero en una posicion dentro del acido nucleico de la celula huesped en el que no se encuentra normalmente el polinucleotido.

El termino "anticuerpo", tal como se usa aqrn, incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos 40 biespedficos, diacuerpos, triacuerpos, multicuerpos, anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos quimericos incluyendo

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moleculas intactas, asf como sus fragmentos, tales como Fab, F(ab')2, Fv y scFv y otras moleculas similares a anticuerpos.

El termino "aproximadamente" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un intervalo de +/- 5% del valor especificado.

Fago de lisis defectuosa

En una realizacion de la invencion, se criba un polipeptido para una actividad deseada en una celula bacteriana Gram negativa, en donde el polipeptido se produce en la celula y el polinucleotido que codifica el polipeptido se empaqueta en un fago de lisis defectuosa. Por "fago de lisis defectuosa" se entiende un fago lttico o templado que normalmente tendna una etapa lttica en su ciclo de vida pero que se ha modificado de modo que, aunque pueda ejecutar todas las otras funciones de un ciclo lttico, es incapaz de lisis de una celula bacteriana Gram negativa para liberar el fago empaquetado. Por lo tanto, el fago de lisis defectuosa incluye fagos templados que son capaces de tener un ciclo lisogenico en el que el genoma viral se integra en el ADN de la celula huesped como un profago o se replica como un plasmido (fagemido). El profago permanece latente en la celula bacteriana hasta que las condiciones de la celula huesped permitan que el profago se active e inicie el ciclo reproductivo. Mientras que la iniciacion del ciclo de reproduccion de un profago resultana normalmente en la lisis de la celula huesped bacteriana, el fago de lisis defectuosa en el metodo de la presente invencion se ha modificado para que la celula huesped bacteriana no se lise y el fago permanezca dentro de la celula bacteriana.

El termino "fago de lisis defectuosa" tal como se usa en la presente memoria descriptiva no incluye referencia a un fago que normalmente no tiene una etapa lttica en su ciclo de vida, por lo que el experto entendera que no incluye referencia a fagos que se liberan a partir de una celula bacteriana por extrusion, por ejemplo fago filamentoso tal como M13, f1 o f2, o que son liberados de una celula bacteriana por germinacion.

Ejemplos de fagos lfticos que pueden modificarse para eliminar la etapa lttica de su ciclo de vida para producir un fago de lisis defectuosa incluyen los al bacteriofagos phiX174, T1, T2, T3, T4, T5, T6 y T7. Ejemplos de fagos lisogenicos que pueden modificarse para eliminar la etapa lttica de su ciclo de vida incluyen fago lambda, al fago N15, al fago P22, al fago Mu, al fago P2, al fago 186 y al fago satelite de P2, P4 (Lindqvist y colaboradores, 1993; Ziermann y colaboradores, 1994, Liu y colaboradores, 1997, y Briani y colaboradores, 2001).

El experto en la tecnica comprendera que algunos fagos templados que son capaces de empaquetar un polinucleotido en una celula bacteriana requieren la presencia de otro fago, por ejemplo, un fago auxiliar, con el fin de que experimente el empaquetamiento del polinucleotido y/o para que ocurra la lisis de celula bacteriana. Un ejemplo de esta relacion es el fago P2 y su fago satelite, P4. El requisito para la presencia de un fago auxiliar para el empaquetamiento del polinucleotido y/o para la lisis de la celula bacteriana se conoce como sistema de fago auxiliar. En un sistema de fago auxiliar, la actividad de un fago auxiliar, o de polipeptidos de fagos (es decir, "protemas activadoras"), induce a otro fago a que experimente empaquetamiento del polinucleotido y/o provoque la lisis de la celula bacteriana. Por lo tanto, el experto en la materia comprendera que mientras que un polinucleotido puede ser empaquetado en un fago (es decir, un fago en un sistema de fago auxiliar), se puede requerir de la actividad de otro fago (es decir, un fago auxiliar) para lisar la celula bacteriana en la que estan presentes ambos fagos. Para uso en algunas realizaciones del metodo de la presente invencion, se modifica el fago que normalmente proporcionana la actividad lttica de manera que ya no sea capaz de lisar una celula bacteriana. Por lo tanto, el termino "fago de lisis defectuosa", tal como se usa en la presente memoria, tambien se refiere a un fago dentro del cual se empaqueta un polinucleotido, en donde el fago normalmente dependena en un segundo fago para proporcionar la actividad lttica, pero en donde el segundo fago ha sido modificado de manera que ya no sea capaz de lisar una celula bacteriana Gram negativa.

El experto en la tecnica se dara cuenta que el polinucleotido tambien puede estar ffsicamente separado del genoma del fago de lisis defectuosa. Por ejemplo, el polinucleotido puede estar operativamente enlazado a secuencias que son suficientes para empaquetamiento del polinucleotido por las protemas estructurales y replicativas del fago para formar una unidad infecciosa que se parezca morfologicamente, o sea identica a, la cepa progenitora del fago de lisis defectuosa.

Como ejemplo no limitante, los vectores plasmfdicos del tamano apropiado pueden contener la secuencia alrededor de la region cos requerida para el empaquetamiento del ADN en el bacteriofago lambda. Estos vectores plasmfdicos pueden ser empaquetados in vivo por un fago auxiliar y tambien pueden ser empaquetados in vitro mediante extractos purificados que contienen las protemas estructurales y replicativas del fago. Se proporciona una secuencia suficiente para empaquetamiento de lambda como la SEQ ID NO: 26. Estos vectores se conocen como cosmidos (cos + plasmido) y son bien conocidos por el experto en la tecnica por su capacidad para clonar polinucleotidos exogenos y propagarlos como partmulas de bacteriofagos. En la tecnica se conocen kits comerciales para clonar polinucleotidos dentro de cosmidos, y kits para empaquetamiento in vitro.

Ejemplo de un sistema de fago auxiliar: el sistema P2-P4

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Un ejemplo no limitante de un sistema de fago auxiliar es el sistema del fago P2-P4. Aunque cada fago porta los genes necesarios para garantizar su propia replicacion e integracion del ADN en el genoma del huesped, el fago P4 de E. coli carece de la informacion genetica necesaria para las funciones de cola y lisis, asf como de la protema estructural principal para la formacion de la capside (Kahn y colaboradores, 1991; Liu y colaboradores, 1997). Por lo tanto, P4 depende del fago P2, o de un fago relacionado con P2, tal como el fago 186, con el fin de hacer que los componentes estructurales del fago P4, empaqueten su ADN y lisen la celula huesped. Cuando P4 infecta una celula huesped lisogenica de P2 (por ejemplo, E. coli que comprende un profago de P2 en su genoma), el profago de P2 es desreprimido por el gen £ de P4. La desrepresion produce como resultado una expresion genica temprana y tardfa de P2 y es suficiente para completar el ciclo lftico de P4.

P4 tambien puede ser empaquetado por el fago similar a P2, el fago 186. Este fago tiene protemas estructurales ortologas a P2 (~75% de identidad) y se han construido fagos hftbridos P2/186 que contienen los genes estructurales de P2 que son regulados por los factores de transcripcion del fago 186 (Younghusband y colaboradores, 1975). Crucialmente, la region temprana del fago 186 y de los hftbridos P2/186 (Hy2 y Hy5) no esta relacionada con P2 y, por lo tanto, no esta inhibida por la protema de P4£. Sin embargo, se puede usar un fago 186 como fago auxiliar de P4 si se usa el mutante sensible a la temperatura del represor de inmunidad del fago 186 para inducir las funciones del fago 186 para que coincidan con la infeccion por P4 (Sauer y colaboradores, 1982) o activacion.

El experto comprendera que un sistema bacteriofago P2/P4 sera adecuado para su uso en el metodo de la presente invencion. Las caractensticas ventajosas de un sistema bacteriofago P2 / P4 incluyen:

i) la preferencia de la enzima P2 terminasa para moldes de plasmido, a diferencia de otras terminasas de bacteriofagos que prefieren empaquetar moldes de polinucleotidos lineales concatemerizados. Por lo tanto, este sistema es mas adecuado para el empaquetamiento in vivo de plasmidos que codifican al polipeptido que es cribado para una actividad deseada, y

ii) un cosmido (es decir, un plasmido que comprende una secuencia cos del bacteriofago que dicta el empaquetamiento del bacteriofagos) que puede ser empaquetado eficientemente en una capside del tamano de P4 (aproximadamente 1012 kb) es mas susceptible a metodos de clonacion rutinarios y mutagenesis iterativa que los genomas de bacteriofagos mas grandes, tal como lambda (48,5 kb).

Modificacion genetica para producir un fago de lisis defectuosa

El ciclo de vida del bacteriofago lftico implica tanto replicacion como empaquetamiento del genoma como una partmula de fago, pero tambien la lisis celular para liberacion de las partmulas para nueva infeccion. La lisis celular de bacterias Gram negativas es un proceso de dos etapas, donde se perfora primero la membrana interna, permitiendo que una enzima que degrada la pared celular (una lisozima) acceda al espacio periplasmatico y actue sobre la pared celular del peptidoglicano. La celula se lisa por la diferencia en la presion osmotica entre el citoplasma y la solucion circundante, liberando por lo tanto las partmulas de fago en el medio.

Las actividades de perforacion de la membrana (holina) y de lisozima son usualmente codificadas por dos genes en la mayor parte de los fagos lfticos y lisogenicos. Debido a la parsimonia de la mayona de los genomas de fagos, estos genes son a menudo vecinos en el mismo operon. Para retener la integridad de la pared celular y para evitar la liberacion de partmulas de fago y protemas que estan siendo funcionalmente cribadas por un metodo de la invencion, el gen que codifica la lisozima del fago, o tanto a la lisozima como la holina, deben ser suprimidas del genoma del fago. Debido al uso frecuente de marcos de lectura superpuestos y codones de detencion/inicio que conducen al acoplamiento de traduccion en muchos genes de fagos, los efectos sobre el(los) gen(es) secuencia abajo deben ser cuidadosamente considerados cuando se disenan estas supresiones. Si la agrupacion se acopla a la traduccion a genes estructurales secuencia abajo, entonces preferiblemente la supresion dejana un ORF truncado como la "cicatriz" residual en el locus que tiene la region de inicio de un gen y la region de detencion del otro.

En una realizacion, el metodo de cribado de protemas de la invencion utiliza la permeabilizacion de las membranas tanto interna como externa de la bacteria Gram negativa, mientras que retiene la integridad estructural de la pared celular de peptidoglicano. Por tanto, en esta realizacion, los genes de holina pueden mantenerse funcionales en el genoma del bacteriofago y pueden ayudar a contribuir a la permeabilizacion de la membrana interna, mientras que el gen de la lisozima se suprime para retener la integridad estructural de la pared celular. En el caso de que el fago de lisis defectuosa se utilice en un sistema de cribado que esta acoplado a una protema de orientacion periplasmatica, tal como se describe en los documentos WO 2002/034886 y WO 2005/095988, o a protemas de fusion de union a la pared celular, entonces las funciones de holina o holina/lisozima deben ser suprimidas del genoma del fago con el fin de retener la integridad de la membrana interna de la celula o del esferoplasto.

El experto en la tecnica comprendera que las funciones del gen de la lisina y/o de la lisozima pueden suprimirse suprimiendo el gen que codifica las moleculas del genoma del fago, o alternativamente mediante la mutacion de los

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genes de lisina y/o lisozima de manera que sean defectuosos y ya no codifiquen una lisina funcional y/o la protema lisozima.

En las realizaciones de la invencion que utilizan el sistema de satelite P2 y P4, el genoma de P2 contiene tanto los genes de holina (Y) como de lisozima (K) usados por P4. Por lo tanto, un profago P2 puede ser modificado por supresion de los genes K, Y o YK. La construccion de un fago P2 de lisis defectuosa se describe en el Ejemplo 16 con la supresion de los genes YK del genoma de un profago P2 de una cepa K12 de E. coli. El profago P2AYK que porta un cosmido del tamano de P4 puede ser infectado por un bacteriofago P4 induciendo asf el empaquetamiento del cosmido. El cosmido tambien puede ser inducido para la expresion del gen que es cribado funcionalmente. Al final de la induccion tanto del empaquetamiento del cosmido como de la expresion del gen, las membranas celulares pueden ser permeabilizadas y la capside celular cribada por el metodo de la invencion. El empaquetamiento de un cosmido por un fago P2 de lisis defectuosa en una cepa de E. coli se describe en el Ejemplo 18 utilizando la infeccion de una cepa que porta el profago P2AYK mediante un fago P4.

En las realizaciones de la invencion que utilizan el sistema de fagos lambda, los genes S y R lambda codifican la holina y la endolisina (lisozima), respectivamente. La supresion o inactivacion mutacional de los genes R o SR producina un profago lambda de lisis defectuosa.

La construccion de un fago lambda de lisis defectuosa se describe en el Ejemplo 20 con la supresion de los genes SR del genoma de un profago lambda de una cepa K12 de E. coli. El empaquetamiento de un cosmido por un fago lambda de lisis defectuosa en una cepa de E. Coli se describe en el Ejemplo 21 mediante la induccion a traves de la inactivacion del represor cl termolabil.

En realizaciones de la invencion que utilizan un fago lftico, usando el fago T7 como ejemplo, puede producirse un fago de lisis defectuosa por inactivacion mutacional del gen 3.5 que codifica la lisozima T7. Dado que la lisozima T7 tiene una actividad reguladora sobre la transcripcion de T7 a traves de su interaccion inhibidora con RNAP de T7, la supresion de la lisozima sena desaconsejable. Por lo tanto, se requieren mutantes que inactiven espedficamente la actividad amidasa de la pared celular de la enzima para crear mutantes de lisis defectuosa que retienen la replicacion de T7.

Los sistemas de lisina/holina de otros fagos ltticos o lisogenicos pueden identificarse mediante comparacion con genomas de fagos conocidos, o mediante analisis genetico, y pueden crearse mutantes de lisis defectuosa correspondientes para su uso en bibliotecas de empaquetamiento en los metodos de la presente invencion.

Empaquetamiento de polinucleotido mediante fago de lisis defectuosa

En los metodos de cribado de la invencion que utilizan un fago de lisis defectuosa, el metodo comprende el cultivo de una celula Gram negativa que comprende un polinucleotido exogeno que codifica al polipeptido que es cribado de tal manera que se produce el polipeptido dentro de la celula, y permitiendo que el fago de lisis defectuosa empaquete al polinucleotido que codifica al polipeptido. La frase "permitir que un fago de lisis defectuosa empaquete al polinucleotido" significa que se proporcionan condiciones dentro de una celula bacteriana Gram negativa de tal manera que un fago de lisis defectuosa sea capaz de empaquetar un polinucleotido.

El experto en la tecnica comprendera que en algunos casos el cultivo de celulas bacterianas Gram negativa para producir el polipeptido y permitir que el fago de lisis defectuosa empaquete al polinucleotido pueden ocurrir simultaneamente. A manera de ejemplo no limitante, una celula bacteriana Gram negativa que comprende un profago auxiliar y un cosmido que codifica un polipeptido de interes pueden ser infectados con un fago de lisis defectuosa capaz de empaquetar al cosmido y luego cultivarse para producir el polipeptido.

Alternativamente, una celula bacteriana Gram negativa que comprende un profago auxiliar y un cosmido que codifica un polipeptido de interes pueden ser tratados para inducir las funciones de empaquetamiento del profago a traves, por ejemplo, de inactivacion por calor de una protema represora labil, o a traves de induccion conjunta de una protema activadora, y despues se cultivan para producir el polipeptido.

De esta forma, se produce el polipeptido en la celula bacteriana Gram negativa mientras que simultaneamente se empaqueta el cosmido en el fago de lisis defectuosa.

En una realizacion, se retiene el fago de lisis defectuosa (es decir, encapsulado) dentro de una celula bacteriana Gram negativa permeabilizada y se criba el polipeptido para una actividad deseada de acuerdo con el metodo de la invencion. Espedficamente, se clona una biblioteca de genes que codifica el polipeptido que va a ser cribado en un fago de lisis defectuosa, o en un cosmido, y se introduce en una celula bacteriana Gram negativa. Tanto el empaquetamiento del fago como el polipeptido que va a ser cribado se pueden inducir conjuntamente (es decir, inducidos simultaneamente) y en el momento apropiado la poblacion de celulas bacterianas Gram negativas se permeabilizan usando un detergente o disolvente organico con el polipeptido que es retenido dentro de la capside celular, junto con el fago. La poblacion de celulas bacterianas Gram negativas permeabilizadas se criba luego para la actividad deseada del polipeptido.

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Las etapas de cultivo de la celula bacteriana Gram negativa para producir el polipeptido y permitir que el fago de lisis defectuosa empaquete al polinucleotido que codifica al polipeptido tambien pueden llevarse a cabo secuencialmente en lugar de simultaneamente. Por lo tanto, las bacterias Gram negativas pueden ser cultivadas en primer lugar para producir el polipeptido, y posteriormente se permite que el fago de lisis defectuosa empaquete al polinucleotido que codifica al polipeptido. La produccion secuencial del polipeptido en la celula bacteriana seguido por el empaquetamiento del polinucleotido pueden ocurrir, por ejemplo, en los casos en que el polipeptido es codificado por un cosmido en la celula bacteriana, e infectar la celula bacteriana con un fago auxiliar permite que el fago de lisis defectuosa empaquete al polinucleotido que codifica al polipeptido. En un ejemplo del metodo de la invencion, la celula bacteriana comprende al profago P2 y/o P4 y la induccion de la activacion del profago P2 comprende la inactivacion un alelo represor sensible a la temperatura de la protema C de P2 en la celula bacteriana y/o la expresion de protemas activadoras de P4 en la celula bacteriana.

Alternativamente, las bacterias Gram negativas pueden ser cultivadas bajo condiciones adecuadas para la produccion del polipeptido y permitir que el fago de lisis defectuosa empaquete al polinucleotido que codifica al polipeptido puede comprender la induccion de la activacion de un profago en la celula bacteriana para producir un fago, en donde el fago empaqueta al polinucleotido. Como comprendera un experto en la tecnica, la etapa de induccion de la activacion del profago en la celula podna ser realizada simultanea o secuencialmente con la etapa de cultivo de la celula bacteriana Gram negativa para producir el polipeptido en la celula.

A la luz de la presente memoria descriptiva, el experto en la tecnica comprendera que existen varias formas en las que puede lograrse la induccion de la activacion de un fago de lisis defectuosa para empaquetar un polinucleotido. Por ejemplo, la induccion de la activacion de un fago de lisis defectuosa puede comprender la introduccion de un fago satelite o auxiliar en una celula bacteriana Gram negativa que comprende un fago de lisis defectuosa que esta presente tanto en el genoma de la celula bacteriana como en el profago.

Alternativamente, la induccion de la activacion puede comprender la produccion de una o mas protemas activadoras de un profago en una celula bacteriana. Por ejemplo, la celula bacteriana Gram negativa puede comprender un profago P2 y/o P4, y las protemas activadoras de P2 y/o P4 pueden ser seleccionadas, por ejemplo, de uno o mas de P2cox, P2ogr, P48 y/o P4e. Como resultado de la activacion, un profago en una celula bacteriana produce un fago que empaqueta al polinucleotido. Alternativamente, la induccion de la activacion de un fago de lisis defectuosa para empaquetar un polinucleotido puede comprender la inactivacion de una o mas protemas represoras del fago en la celula bacteriana. En una realizacion particular de la invencion, la induccion de la activacion comprende la inactivacion de un alelo represor sensible a la temperatura del profago lambda en la celula bacteriana. En otra realizacion, la induccion de la activacion de un fago de lisis defectuosa comprende el aumento de la temperatura de incubacion de las celulas bacterianas.

Permeabilizacion

En ciertas realizaciones del metodo de la invencion, se permeabilizan ya sea solamente la membrana celular externa, o tanto las membranas celulares interna como externa de una celula bacteriana Gram negativa, permitiendo asf que al menos algunos de los componentes celulares solubles se difundan a traves de la pared celular. El polipeptido que se va a cribar para una actividad deseada se retiene dentro de la pared celular bacteriana, o esta unido a la pared celular bacteriana. Como se usa en la presente memoria, los terminos "permeabilizacion", "permeabilizada" o "celula bacteriana permeabilizada" se refieren al uso de un agente de permeabilizacion o tratamiento mecanico, o una combinacion de ambos, para producir poros en la membrana externa o tanto en las membranas interna como externa, de una bacteria Gram negativa, o para solubilizar la membrana externa, o tanto las membranas interna como externa, de una bacteria Gram negativa, aunque que sin hidrolizar los enlaces entre peptidoglicanos manteniendo por lo tanto la pared celular intacta. Ejemplos no limitantes de agentes capaces de permeabilizar una celula bacteriana incluyen detergentes y disolventes organicos. Un ejemplo no limitante de un tratamiento mecanico capaz de permeabilizar una celula bacteriana es la electroporacion.

La permeabilizacion permite convenientemente la entrada de protemas de tamano pequeno a moderado, por ejemplo hasta de 120 kDa, u otras moleculas de tamano equivalente o menor, en la capsula celular que permanece intacta. Ademas, al mantener la integridad de la pared celular bacteriana, las celulas bacterianas permeabilizadas son menos fragiles que los esferoplastos que se producen, por ejemplo, mediante el tratamiento de celulas bacterianas con lisozima en Tris-EDTA, en la que la pared celular bacteriana es al menos parcialmente hidrolizada. Las celulas bacterianas permeabilizadas producidas en ciertas realizaciones de los metodos de la presente invencion son adecuadas para tecnicas tales como clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), mientras que los esferoplastos son danados por el entorno de citometna de flujo de alta cizalla y requieren condiciones osmoticas controladas, limitando asf sus usos potenciales.

Preferiblemente, el tratamiento de permeabilizacion preserva las protemas celulares en su estado nativo y sus interacciones. Los detergentes no ionicos son generalmente menos perjudiciales para el plegamiento de las protemas y los complejos de protemas que los detergentes ionicos. De este modo, en una realizacion preferida, se utiliza un detergente no ionico para permeabilizar la pared celular bacteriana. Ejemplos no limitantes de detergentes no ionicos

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incluyen Triton X-100, Triton X-114, Brij 35, Brij 58, Tween 20, Tween 80, sustituto de Nonidet P-40, Octil p Glucosido, Mega 8, Mega 9, Mega 10 , BigCHAP, Desoxi BigCHAP, Apo8 y 8TGP (n-octil-p-D-tioglucopiranosido).

Pueden usarse mezclas de detergentes para permeabilizar la celula bacteriana. Por ejemplo, el detergente puede ser una mezcla de dos o mas detergentes no ionicos. En una realizacion, el detergente es una mezcla de Mega 10 y Apo8.

Cuando se criba el polipeptido para una actividad deseada se une a la pared celular bacteriana, o se integra o se une a la membrana celular interna, la persona experta se dara cuenta que puede no ser necesario permeabilizar la membrana interna de la celula bacteriana. Por lo tanto, en una realizacion la celula bacteriana se permeabiliza selectivamente. Por "permeabilizada selectivamente" se entiende que la membrana externa de la celula bacteriana permeabilizada esta permeabilizada en una mayor extension que la membrana interna, por lo que 50% o menos, o mas preferiblemente 40%, 30%, 20%, 10%, 5% , 4%, 3%, 2%, 1% o menos, o ninguna, de una sustancia impermeable a la membrana, por ejemplo el ligando Gel Red de union al ADN impermeable a la membrana, permea la membrana interna de una celula permeabilizada selectivamente cuando se compara con una celula permeabilizada en la que tanto las membranas interna como externa han sido permeabilizadas, tal como mediante el uso de una solucion que comprende Mega 10 0,5% y Apo8 al 0,5%.

Aunque la persona experta sera capaz de determinar las condiciones adecuadas para permeabilizar selectivamente una celula bacteriana de acuerdo con los metodos de la presente invencion, en una realizacion la celula bacteriana se permeabiliza selectivamente con un detergente no ionico. Por ejemplo, el detergente no ionico puede seleccionarse de Apo8 y Tween20. En una realizacion, una solucion para permeabilizar selectivamente la celula bacteriana comprende el detergente a una concentracion de aproximadamente 0,2% hasta aproximadamente 0,4%, o aproximadamente 0,2% hasta aproximadamente 0,3%, o aproximadamente 0,2%. Preferiblemente, la solucion para permeabilizar selectivamente la celula bacteriana comprende el detergente en un regulador que comprende Ca2+ o EDTA. Los ejemplos de reguladores adecuados para permeabilizar selectivamente una celula bacteriana incluyen Apo8 al 0,2-0,4% o Tween20 en Tris 5 mM, EDTA 1mM (pH 8,0) o Tris 25 mM, Ca2+ 2 mM (pH 8,0). En una realizacion, la permeabilizacion selectiva de una celula bacteriana se puede lograr, por ejemplo, incubando la celula en un regulador adecuado a aproximadamente 25°C durante aproximadamente 10 minutos.

En otra realizacion, el agente capaz de permeabilizar una celula bacteriana Gram negativa es un disolvente organico tal como cloroformo. A modo de ejemplo, las membranas celulares bacterianas internas y externas pueden permeabilizarse mediante la suspension de las celulas bacterianas Gram negativas en una solucion acuosa que ha sido saturada con el disolvente lipofflico cloroformo. Para crear una solucion saturada de cloroformo se requiere la mezcla de dos fases inmiscibles de agua y el disolvente organico mediante agitacion de los dos, usualmente por agitacion, o en un vortice mecanico, hasta que la fase de cloroformo se suspenda en forma de gotitas finas. Las dos fases se dejan sedimentar, y se usa una centrifugacion pulsada para ayudar en la separacion de las fases. Una mezcla de cloroformo al 5% (v/v) es suficiente para crear una solucion saturada. Un tiempo de incubacion de 10 minutos a 25°C es suficiente para la permeabilizacion de ambas membranas celulares. El Ejemplo 19 y la Figura 22 describen y demuestran la permeabilizacion de y membranas interna y externa de E. coli usando disolvente organico, cloroformo.

Expresion del polipeptido

Un polipeptido que se va a cribar para una actividad deseada puede clonarse en un vector adecuado para la expresion en una celula bacteriana. "Vector", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier vector conocido en la tecnica que sea adecuado para transformar una celula bacteriana. Preferiblemente, el vector es tambien capaz de replicarse dentro de la celula bacteriana independientemente del genoma del huesped. Los vectores incluyen plasmidos, virus y cosmidos, asf como elementos lineales de ADN, tales como el fago lineal N15 de E. coli y/o ADN extracromosomico que se replica independientemente de un genoma de celula bacteriana. Preferiblemente, el vector es un vector de expresion. Como comprendera la persona experto en la materia, en realizaciones en las que el polinucleotido que codifica al polipeptido se empaqueta en un fago, el vector estara en una forma adecuada y comprende la secuencia necesaria (por ejemplo, tal como las secuencias cos en un cosmido), para empaquetar al polinucleotido en el fago.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "vector de expresion" es un vector que es capaz de efectuar la expresion de una molecula de polinucleotido especificada en una celula bacteriana. Preferiblemente, el vector de expresion tambien es capaz de replicarse dentro de la celula bacteriana. Los vectores de expresion adecuados tfpicamente contienen secuencias reguladoras tales como secuencias de control de transcripcion, secuencias de control de traduccion, ongenes de replicacion y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la celula bacteriana recombinante y que controlan la expresion de moleculas de polinucleotido que codifican un polipeptido. Las secuencias de control de la transcripcion son secuencias que controlan el inicio, alargamiento y terminacion de la transcripcion. Las secuencias de control de transcripcion particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de la transcripcion, tales como las secuencias promotora, de refuerzo, operadora y represora.

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Las secuencias adecuadas de control de la transcripcion incluyen cualquier secuencia de control de la transcripcion que pueda funcionar en una celula bacteriana. Se conocen una variedad de tales secuencias de control de la transcripcion por parte de los expertos en la tecnica.

La transformacion de un vector de expresion en una celula bacteriana se puede lograr mediante cualquier metodo adecuado por medio del cual se puede insertar una molecula de polinucleotido en la celula. Las tecnicas de transformacion incluyen, pero no se limitan a, electroporacion y transformacion qmmica. Las moleculas de polinucleotidos transformadas pueden permanecer extracromosomales o pueden integrarse en uno o mas sitios dentro de un cromosoma de la celula transformada (es decir, recombinante) de tal manera que se mantiene su capacidad de expresion.

Se pueden usar tecnologfas de ADN recombinante para mejorar la expresion de una molecula de polinucleotido transformada mediante la manipulacion, por ejemplo, el numero de copias de la molecula de polinucleotido dentro de una celula huesped, la eficiencia con la que se transcriben dichas moleculas polinucleotidicas, la eficiencia con la que las transcripciones resultantes son traducidas, y la eficiencia de las modificaciones postraduccionales. Las tecnicas recombinantes utiles para aumentar la expresion de moleculas de polinucleotidos incluyen, pero no se limitan a, enlazar operativamente moleculas de polinucleotidos con plasmidos de alto numero de copias, adicion de secuencias de estabilidad del vector con plasmidos, sustituciones o modificaciones de senales de control de la transcripcion (por ejemplo, promotores, operadores, reforzadores), sustituciones o modificaciones de senales de control de la traduccion (por ejemplo, sitios de union a ribosomas, secuencias de Shine-Dalgarno), modificacion de moleculas de polinucleotidos para que correspondan al uso del codon de la celula huesped y la supresion de secuencias que desestabilizan los transcritos.

La persona experta en la materia sera capaz de determinar facilmente las cepas bacterianas adecuadas para expresar polipeptidos en los metodos de la invencion. Aquellos expertos en la tecnica comprenderan que las bacterias Gram negativas adecuadas para uso en los metodos de la invencion incluyen Salmonella, E. coli, Shigella, Campylobacter, Fusobacterium, Bordetella, Pasteurella, Actinobacillus, Haemophilus y Histophilalus. En una realizacion preferida, las bacterias Gram negativas son E. coli

Complejos de protemas

El polipeptido que va a ser cribado para una actividad deseada puede estar asociado con al menos un segundo polipeptido para formar un complejo de protema que tiene un tamano molecular tal que el complejo de protema es retenido dentro de la celula bacteriana permeabilizada. El polipeptido puede estar asociado con el segundo polipeptido, por ejemplo, mediante enlaces covalentes tales como puentes disulfuro, o mediante asociacion no covalente. "Asociacion no covalente" se refiere a interacciones moleculares que no involucran un enlace interatomico. Por ejemplo, las interacciones no covalentes involucran enlaces ionicos, enlaces de hidrogeno, interacciones hidrofobas y fuerzas de van der Waals. Las fuerzas no covalentes se pueden utilizar para mantener las cadenas polipeptfdicas separadas juntas en protemas o en complejos de protema. De este modo, el polipeptido y un segundo polipeptido pueden ser expresados como polipeptidos separados ya sea a partir del mismo o de diferentes vectores, o uno o ambos polipeptidos pueden expresarse a partir del ADN que codifica los polipeptidos que se han integrado en el genoma de la celula bacteriana.

Alternativamente, el polipeptido y el segundo polipeptido que estan asociados en un complejo de protema pueden ser una protema de fusion. Como se utiliza en la presente memoria, "protema de fusion" se refiere a una protema tubrida, que consiste de dos o mas polipeptidos, o fragmentos de los mismos, que resultan de la expresion de un polinucleotido que codifica al menos una porcion de cada uno de los dos polipeptidos y unidos mediante un enlace peptfdico.

La protema completa es retenida en la celula bacteriana permeabilizada por el tamano molecular

El segundo polipeptido puede ser cualquier polipeptido que tenga un tamano molecular suficiente, es decir, un peso molecular o radio molecular suficiente, de tal manera que al menos parte del complejo formado con el polipeptido que se esta cribando para una actividad deseada es incapaz de difusion a partir de la celula bacteriana permeabilizada . Por lo tanto, el complejo de protemas es retenido dentro de la celula bacteriana despues de la permeabilizacion de la celula. El experto en la materia apreciara que la naturaleza del segundo polipeptido, incluyendo su peso molecular y si es una protema globular o de varilla (filamentosa), determinara su capacidad para prevenir o inhibir la difusion del complejo de protema a traves de la pared celular bacteriana. En una realizacion, el peso molecular del segundo polipeptido es de al menos aproximadamente 30 kDa, o al menos aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 140, 150 o mas kDa. En una realizacion, el segundo polipeptido es de al menos aproximadamente 120 kDa.

En una realizacion, el segundo polipeptido forma multimeros que tienen un peso molecular mayor que el tamano de exclusion de poros de la celula bacteriana permeabilizada. Como se usa en la presente memoria, el termino "multfmero" y sus variantes gramaticales se refieren a la formacion de un complejo multimerico entre dos o mas moleculas distintas. El multimero puede comprender, por ejemplo, dos o mas moleculas de la misma protema (es decir, un homomultimero) o una mezcla de dos o mas protemas diferentes o no identicas (es decir, un heteromultimero). Las protemas que forman

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multimeros adecuados para su uso en los metodos de la invencion incluyen aquellos que forman d^eros, tnmeros, tetrameros, pentameros, hexameros y multimeros de orden superior que comprenden siete o mas subunidades.

Las protemas multimericas incluyen homod^eros, por ejemplo, isoformas a y p del receptor de PDGF, el receptor de eritropoyetina, MPL y el receptor de G-CSF, heterodfmeros cuyas subunidades tienen dominios efectores y de union al ligando, por ejemplo, isoforma ap del receptor de PDGF y multimeros que tienen subunidades componentes con funciones dispares, por ejemplo, receptores de IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 y GM-CSF. Los ejemplos no limitantes de otras protemas multimericas que pueden utilizarse en los metodos de la presente invencion incluyen factores implicados en la smtesis o replicacion de aDn, tales como protemas de ADN polimerasa implicadas en la produccion de ARNm, tales como TFIID y TFIIH; las protemas asociadas a la celula, nucleares y otras asociadas a la membrana, tales como hormonas y otros receptores de transduccion de senal, protemas de transporte activo y canales ionicos, protemas multimericas en la sangre, incluyendo hemoglobina, fibrinogeno y el factor de von Willabrand; protemas que forman estructuras dentro de la celula, tales como actina, miosina y tubulina y otras protemas citoesqueleticas; protemas que forman estructuras en el ambiente extracelular, tales como colageno, elastina y fibronectina; protemas involucradas en el transporte intra y extracelular, tales como quinesina y dinema, la familia SNARE de protemas (receptor soluble de la protema de union a NSF) y clatrina; protemas que ayudan a regular la estructura de la cromatina, tales como histonas y protaminas, Swi3p, Rsc8p y moira; factores de transcripcion multimerica tales como Fos, Jun y CBTF (factor de transcripcion de caja CCaAt); enzimas multimericas tales como acetilcolinesterasa y alcohol deshidrogenasa; protemas chaperonas tales como GroE, Gro EL (chaperonina 60) y Gro ES (chaperonina 10); antitoxinas, tales como veneno de serpiente, toxina de botulismo, super antigenos de Estreptococos; Lisinas (enzimas de bacteriofagos y virus); asf como la mayona de las protemas alostericas. En una realizacion, la protema multimerica es una protema de E. coli. Ejemplos no limitantes de protemas de E. coli que forman multfmeros incluyen la L-ramnosa isomerasa (RhnA, por ejemplo numero de acceso del NCBI CAA43002), p-galactosidasa (p-gal, por ejemplo numero de acceso del NCBI YP 001461520), betama aldetudo deshidrogenasa (BetB, por ejemplo No de acceso de NCBI AAA23506), glutamato-5- quinasa (G5K, por ejemplo numero de acceso del NCBl AAB08662), glutation sintasa (GshB, por ejemplo numero de acceso de NCBI AP_003504), y una cadena media de aldehfdo deshidrogenasa (YdcW, por ejemplo numero de acceso de NCBI AP_002067).

En una realizacion, el polipeptido que es cribado para una actividad deseada tiene un tamano molecular suficiente para retener al polipeptido dentro de la pared celular bacteriana. Por lo tanto, el experto en la tecnica apreciara que tal polipeptido no necesita estar necesariamente asociado con un segundo polipeptido con el fin de retener al polipeptido dentro de la celula bacteriana permeabilizada.

Expresion de la capside en fagos ltticos y lisogenicos

En otra realizacion, el polipeptido puede estar unido a un complejo macromolecular mas grande, tal como un bacteriofago y/o una protema de recubrimiento del fago. La union del polipeptido al fago se puede lograr mediante una fusion directa de los genes del polipeptido con el gen de una protema de recubrimiento del fago, o puede ser mediante una fuerte interaccion entre dos polipeptidos expresados separadamente. La union de bibliotecas de protemas sobre la superficie de la cabeza del bacteriofago lttico y lisogenico se conoce como "expresion de la capside". Un ejemplo de protemas de recubrimiento del fago que pueden adaptarse adecuadamente para la fusion al polipeptido son los genes para la protema de lambda D de 11 kD (Sternberg y Hoess, 1995; Mikawa y colaboradores, 1996), que decora las cabezas del bacteriofago lambda o la protema lambda V de 25 KD (Maruyama y colaboradores, 1994), que es la protema de envoltura de la cola. Otros fagos ltticos tambien han utilizado fusiones de polipeptidos con la protema SOC de 9 kD de fagos similares a T4 (Rao y colaboradores, 2007) y fusiones con el extremo terminal C con la protema de la capside T7 de 42 kD, 10B (Dai y colaboradores, 2008 ). En el caso del sistema del bacteriofago P2/P4, los peptidos han sido expresados en el extremo terminal N de la protema Psu de P4 de 21 kD (Lindqvist y Naderi, 1995).

Un ejemplo de un metodo de expresion de la capside es la fusion de peptidos o polipeptidos con la protema de la capside, gpD, del bacteriofago lambda. Este metodo ha sido descrito ampliamente en la literatura (Sternberg y Hoess, 1995, Mikawa y colaboradores, 1996, Gupta y colaboradores, 2003, Vaccaro y colaboradores, 2006, Levy y colaboradores, 2007) y en la patente estadounidense No. 7.732.150 y la patente estadounidense No. 6.884.612.

Se ha demostrado que la protema gpD de lambda tolera las fusiones de polipeptidos ya sea en el extremo terminal N o C (Mikawa y colaboradores, 1996) con una valencia de hasta -400 por fago, aunque una carga mayor a ~50% de protema de fusion por cabeza disminuye la viabilidad del fago. Las comparaciones directas de la expresion de la capside lambda contra la expresion del fago filamentoso demostro una expresion superior de la protema de fusion y eficiencias de captura durante la exploracion objetivo (Santini y colaboradores, 1998; Gupta y colaboradores, 2003). Aunque la expresion de la capside lambda sena de mayor utilidad en el cribado de bibliotecas de anticuerpos, solamente ha sido citado como en uso por tres grupos. Gupta y colaboradores (2003) demostraron que un anticuerpo de una sola cadena (scFv) se plego productivamente y era aproximadamente 100 veces mas reactivo mediante un ensayo de ELISA que un anticuerpo expresado en un fago filamentoso. Similarmente, Vaccaro y colaboradores (2006) encontraron que lambda es una excelente plataforma de expresion de un scFv. Sin embargo, como muestran Vaccaro y colaboradores (2006) esto se debio a la notable y rara estabilidad del scFv que se habfa elegido, que se pudo plegar en el citoplasma. Estos autores demostraron que para otras secuencias de scFv era probable que hubiera dificultad en la

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obtencion de una expresion productiva. Levy y colaboradores (2007) reconocieron e hicieron uso de este hecho en un intento por utilizar la expresion de lambda como una criba genetica para seleccionar las protemas citoplasmaticas de E. coli que mejoranan el plegamiento productivo de los scFv en el citoplasma. Su resultado fue solo una mejora muy modesta en el plegamiento productivo de un scFv. Los metodos de la presente invencion pueden utilizar un andamiaje estable de scFv, tal como lo demostraron Gupta y colaboradores (2003) y Vaccaro y colaboradores (2006) en un sistema de expresion de capside en un fago de lisis defectuosa.

Existen una cantidad de ventajas en la utilizacion de fagos de lisis defectuosa tanto para el empaquetamiento del polinucleotido como para la expresion del polipeptido codificado en la superficie de la capside. En primer lugar, la capside del fago sirve como una encapsulacion estable, de endonucleasa protegida para el polinucleotido en una forma tal que, una vez liberado, permite un alto rendimiento de recuperacion (se puede recuperar aproximadamente el 100% del fago empaquetado). En segundo lugar, la capside del fago sirve como un sitio de union estable y numeroso para el polipeptido codificado dentro de la celula permeabilizada. La Figura 25 demuestra que esta propiedad puede ser utilizada para visualizar directamente una union de scFv con su objetivo fluorescente donde el scFv se fusiona con la protema gpD lambda. Por lo tanto, la biblioteca de polinucleotidos empaquetada en un fago de lisis defectuosa, y ademas encapsulada por la celula permeabilizada, se puede usar en el metodo de expresion de protemas de la invencion. Un ejemplo de expresion usando esta realizacion sena para cribar la union de un objetivo etiquetado de manera fluorescente con un anticuerpo o andamiaje de afinidad expresado en la capside, donde la union se detecta usando ya sea microscopfa de fluorescencia o usando FACS. La Figura 25 demuestra la identificacion positiva de la union del objetivo fluorescente con un fago encapsulado que expresa un anticuerpo unido a la capside usando FACS.

Una tercera ventaja de la expresion de la biblioteca y empaquetamiento usando un fago de lisis defectuosa es que la liberacion fallida del fago de las celulas huesped inducidas permite la concentracion del fago con altos tftulos a traves de centrifugacion de las celulas huesped, seguido por permeabilizacion utilizando ya sea detergente o cloroformo, y lisis inducida usando lisozima purificada. Los inventores pueden reportar que los tftulos de los fagos lambdoides pueden aumentarse 100 veces en comparacion con los tftulos de cultivo ftquido de fagos lisados cuando se utilizan los mutantes de lisis defectuosa de los fagos para empaquetamiento. Es rutinario lograr tftulos > 1011 fagos por mL de celulas lisadas por Readylyse (Epicentre) cuando se empaquetan los fagos utilizando mutantes de lisis defectuosa. Con el fin de lograr tftulos de este nivel se requiere una precipitacion laboriosa y ultracentrifugacion de los lisados de fagos, lo que aumenta el riesgo de perdida de la protema de fusion unida a la superficie durante un procedimiento largo.

Aun otra mejora de la expresion de la capside permitida por el metodo de la invencion es que la protema de fusion de la capside soluble en exceso que no esta unida a las partmulas de fago encapsuladas puede ser eliminada facilmente mediante permeabilizacion celular. Esta caractenstica es importante para la union del objetivo con las partmulas de bacteriofago encapsuladas, ya que de otro modo puede producirse union en solucion con la protema de fusion que no esta unida a la capside, y que usualmente esta en exceso. Sin particion de la protema de fusion unida a la capside y soluble, la union y/o captura de bacteriofagos que muestran una protema de afinidad se reducina.

Los Ejemplos 20 y 23 describen la fusion de protemas de afinidad tanto del fago Hy5 (un hftbrido de P2/186 con los genes estructurales de P2) como a las protemas de la capside del fago lambda, gpL y gpD, respectivamente, y su uso demostrado en el enriquecimiento a traves del objetivo unido a la matriz.

El polipeptido que se va a cribar no necesita estar directamente fusionado con la protema de recubrimiento del fago, sino que puede ser expresado como un polipeptido separado que esta enlazado in vivo al exterior del fago a traves de una asociacion estable de los dominios de protema. Un ejemplo de tal asociacion puede ser la alta afinidad entre un dominio proteico y un ligando pepftdico, tal como se observa entre peptidos de calmodulina y de union a la calmodulina (CBP). Alternativamente, la asociacion podna establecerse mediante una interaccion covalente entre dos polipeptidos. Un ejemplo de esto senan las protemas SNAP y CLIP (New England Biolabs) que se fusionanan por separado como asociados a la protema de expresion y una protema de recubrimiento del bacteriofago, y un ligando que esta unido covalentemente por ambas protemas.

Protemas de union al ADN

Los presentes inventores han encontrado que el ADN se retiene dentro de una celula bacteriana despues de la permeabilizacion. De este modo, en una realizacion, el polipeptido esta asociado con una protema de union al ADN para formar un complejo proteico que se une al ADN y que se retiene dentro de la celula bacteriana. Como se usa en la presente memoria, "protema de union al ADN" se refiere a cualquier protema que comprende un dominio de union al ADN que comprende al menos un motivo que reconoce ADN bicatenario o monocatenario. Como lo sabna un experto en la tecnica, los dominios de union al ADN incluyen una helice-vuelta-helice, un dedo de zinc, una cierre de leucina, una helice alada, una helice-vuelta-helice alada, helice-bucle-helice, inmunoglobulina plegada que reconoce ADN, o dominios B3. La asociacion del polipeptido con una protema de union al ADN proporciona ventajosamente una mejor recuperacion de ADN, por ejemplo un plasmido, que codifica el polipeptido en los metodos de cribado de la invencion.

Los ejemplos de protemas de union a ADN incluyen protemas de competencia bacteriana tales como, pero sin limitarse a, protemas de union al ADN de E. coli, protemas de union al ADN de Neisseria gonorrhoeae, por ejemplo ComE,

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protemas E2 de Adenovirus, factor de transcripcion AraC, factores de transcripcion basicos helice-bucle-helice, factores de transcripcion basicos del cierre de leucina, factor de respuesta de butirato, protema B del centromero, factores de transcripcion COUP, factores de transcripcion de respuesta de crecimiento temprano, factores de union a la caja G, factores de transcripcion GATA, protemas HMGA, protemas de homeodominio, protemas I-kappa B, factores de integracion del huesped, factores reguladores del interferon, factor 3 del gen estimulado por interferon, factores de transcripcion de tipo Kruppel, protema reguladora sensible a la leucina, protemas de union a la region de union a la matriz, protema de union a metil-CpG, protema homologa 2 de MutS, protema de leucemia mieloide-linfoide, NF-Kappa B, factores de transcripcion NF1, factores respiratorios nucleares, protema oncogenica p55, complejo de reconocimiento de origen, factores de transcripcion de caja apareada, factores de dominio POU, factores del protooncogen, Rad51 recombinasa, protema de reparacion y recombinacion de ADN de Rad52, protema A de replicacion, protema C de replicacion, protema de retinoblastoma, protemas de Smad, factores de transcripcion SOX, protemas del dominio de caja T, factores de transcripcion TCF, protemas de union a telomeros, receptor 9 similar a Toll, activadores trans y factores de transcripcion de helice alada. En una realizacion, la protema de union al ADN es una protema de union al ADN de E. coli. En otra realizacion, la protema de union al ADN es una protema Neisseria gonorrhoeae, por ejemplo ComE, o un dominio del mismo.

Protemas de union a la pared celular

El polipeptido que esta siendo cribado para una actividad deseada puede ser asociado con una protema de union a la pared celular bacteriana. El experto en la tecnica comprendera que la eleccion de una protema de union a la pared celular dependera de la especie de la celula huesped, ya que las diferentes bacterias tienen diferentes composiciones de la pared celular. Aunque que las bacterias tienen paredes celulares compuestas de peptidoglicano (PG), las modificaciones qmmicas entre especies pueden afectar la union de especies cruzadas. El experto en la tecnica podra determinar facilmente las protemas de union a la pared celular adecuadas para uso en una especie bacteriana particular.

Las protemas de union a la pared celular bacteriana incluyen protemas conocidas por tener una estructura de dominio, por lo que parte de la cadena polipeptfdica en la estructura nativa es capaz de reconocer y unir moleculas espedficas o conformaciones moleculares en la pared celular bacteriana. Por lo tanto, el termino "protema de union a la pared celular bacteriana" incluye un dominio proteico que es parte de la protema que se une espedficamente a la pared celular bacteriana. Ejemplos de protemas de union a la pared celular bacteriana incluyen las hidrolasas de la pared celular codificadas por bacteriofagos, hidrolasas de la pared celular de bacterias y diferentes autolisinas. Se incluyen ademas moleculas receptoras codificadas por el ADN de bacteriofagos y otros virus. Cuando la protema de union a la pared celular bacteriana proviene de enzimas hidrolfticas de origen bacteriofago, que son capaces de unirse espedficamente a bacterias, la protema de union a la pared celular mantiene su capacidad de union pero preferiblemente no tiene actividad hidrolftica significativa.

En una realizacion, la protema de union a la pared celular se une no covalentemente a la pared celular de E. coli. Por ejemplo, para una celula huesped de E. coli existen protemas endogenas de union a PG con un dominio de union a PG de ~100 aminoacidos conservados que se presenta en PAL, OmpA, YiaD, YfiB y MotB (Parsons y colaboradores, 2006). Sin embargo, se ha demostrado que las protemas de otros organismos estan bien expresadas en E. coli y para unir la pared celular con alta afinidad, por ejemplo el dominio de union a PG de ~70 aminoacidos del fago 9KZ de Pseudomonas (KzPG) (Briers y colaboradores, 2009). De este modo, se puede utilizar un dominio de union a PG de una protema que se une a PG como una protema de union a la pared celular bacteriana en los metodos de la invencion.

En un ejemplo de una realizacion, el dominio de union a PG se puede fusionar con el polipeptido que esta siendo cribado para una actividad deseada y expresado en el citosol de la celula bacteriana. Despues de la permeabilizacion de la membrana, el dominio de union a PG gana acceso y se une a la pared celular dando como resultado la retencion del polipeptido de interes dentro de la celula permeabilizada. Para mejorar potencialmente adicionalmente la retencion del polipeptido de interes dentro de la celula, el experto entendera que el polipeptido puede estar asociado con una protema de union al ADN ademas de una protema de union a la pared celular bacteriana.

Alternativamente, el polipeptido de interes puede estar asociado con una protema que es capaz de enlazarse covalentemente con la pared celular bacteriana. Preferiblemente, la protema comprende una serial de orientacion periplasmica. Por lo tanto, el polipeptido se expresa en el citosol de la celula bacteriana, pero se dirige al periplasma donde se enlaza con la pared celular antes de la permeabilizacion de la membrana.

A manera de ejemplo no limitante, la protema de union a la pared de la celula bacteriana que se une a la pared celular en forma covalente puede ser una lipoprotema capaz de unirse a la pared celular y que carece de una secuencia serial funcional del extremo terminal N necesaria para la union a la membrana externa. Por ejemplo, la lipoprotema puede ser LPP de E. coli. LPP es una protema abundante de E. coli que forma una bobina trimerica en espiral. En su forma nativa, un extremo esta atado a la membrana externa a traves de lipidacion y el otro extremo esta unido covalentemente a la pared celular a traves de una lisina del extremo terminal C. La lipoprotema puede comprender ademas una secuencia que dirige a la lipoprotema al periplasma, por ejemplo una secuencia de direccionamiento periplasmico OmpF. En una

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realizacion, la lipoprotema es lipoprotema de E. coli que carece de una secuencia senal funcional del extremo terminal N, necesaria para la union a la membrana externa.

A la luz de las ensenanzas de la presente memoria descriptiva, el experto en la tecnica sera capaz de identificar o disenar protemas que se unan covalentemente a la pared celular bacteriana y que sean adecuadas para uso en los metodos de la presente invencion.

En una realizacion de la invencion, el polipeptido que es cribado para una actividad deseada es un polipeptido de fusion que comprende un dominio KzPG y uno o mas dominios seleccionados de un espaciador, SNAP y/o DBP. En una realizacion particular, el polipeptido de fusion comprende uno o mas espaciadores y los dominios KzPG, SNAP y DBP.

Espaciadores

En una realizacion, el polipeptido que se criba para una actividad deseada puede expresarse como un polipeptido de fusion que comprende uno o mas espaciadores. Un "espaciador" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un peptido o polipeptido que puede estar incluido en un polipeptido de fusion para aumentar la expresion del polipeptido en una celula bacteriana o para disminuir el impedimento esterico de tal manera que el polipeptido que se esta cribando para una actividad deseada puede asumir su estructura terciaria deseada y/o interactuar adecuadamente con su molecula objetivo. De este modo, la protema de fusion puede comprender uno o mas espaciadores antes, despues o entre uno o mas dominios polipeptfdicos en el polipeptido de fusion. Para espaciadores y metodos de identificacion de espaciadores deseables, vease, por ejemplo, George y colaboradores (2003).

En una realizacion, el espaciador comprende una o mas secuencias de aminoacidos que estan entre 1-50 residuos de aminoacidos de longitud, o aproximadamente 1-25 residuos, o aproximadamente 5-15 residuos de longitud. Por ejemplo, el espaciador puede seleccionarse de uno o mas de I27, RL1, RL2, RL3, RL4, RL5 y/o RL6. El experto en la tecnica entendera que se puede introducir un numero limitado de sustituciones de aminoacidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoacidos en el espaciador sin afectar su capacidad para funcionar como un espaciador. En una realizacion particular, los uno o mas espaciadores se seleccionan de cualquiera de las SEQ ID NOs: 6 a 12 o 16. Por lo tanto, en una realizacion, el polipeptido que se esta cribando para una actividad deseada es un polipeptido de fusion que comprende I27, RL6, KzPG, sNaP y DBP.

En otra realizacion, la region espaciadora puede comprender una secuencia peptfdica que es un sitio de union de alta afinidad para un dominio proteico. Por ejemplo, la calmodulina tiene una afinidad dependiente de Ca2+ para una cantidad de secuencias peptfdicas de ligandos de protemas que han sido mapeados para regiones peptfdicas cortas. Estos CBP (peptidos de union a calmodulina) han sido mutados para una union de afinidad incluso mayor con calmodulina (Kd entre ~1 nM a 1 pM) (Montigiani y colaboradores, 1996), permitiendo una interaccion de alta afinidad entre dos protemas intercambiable por Ca2+, teniendo una, una region espaciadora de CBP y la otra fusionada a calmodulina.

Metodos de cribado y evolucion de protemas

La presente invencion proporciona metodos para cribar polipeptidos para una actividad deseada contra una molecula objetivo. Como se utiliza en la presente memoria, el termino "actividad deseada" se refiere a cualquier actividad potencial util de un polipeptido e incluye, pero no se limita a, union, modificacion enzimatica, estabilidad de plegado y/o estabilidad termica.

El termino "molecula objetivo" se refiere a una molecula que se une a y/o es modificada por el polipeptido y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un receptor, un antfgeno, una enzima, etc. Por lo tanto, se puede usar "molecula objetivo" para referirse a un sustrato tal como un sustrato enzimatico o una molecula que esta siendo evaluada para union (por ejemplo, un ligando, epftopo, antfgeno, companero de multimerizacion tal como un companero homo o heterodimerico, etc., o cualquier combinacion de los mismos).

Se apreciara que las actividades del polipeptido pueden cribarse para o seleccionarse en el contexto de un unico tipo de celula que expresa un solo polipeptido o en el contexto de una biblioteca de celulas que expresan cada una de ellas un polipeptido o una variante de polipeptido diferente. Por lo tanto, los metodos de la presente invencion pueden utilizar para la evolucion de la protema in vitro. La evolucion de la protema in vitro permite que una gran cantidad de funciones y caractensticas de la protema sean investigadas y comprende tipicamente dos etapas principales: diversificacion y seleccion. La diversificacion se basa en la capacidad para generar diversas bibliotecas de acidos nucleicos que codifican polipeptidos. La seleccion puede lograrse mediante cribado de las bibliotecas para una actividad deseada y enlazando la actividad con el genotipo, por ejemplo, mediante la identificacion del miembro de la biblioteca que comprende al genotipo que es responsable de la actividad observada.

Las bibliotecas de ADN son una coleccion de vectores recombinantes que contienen insertos de ADN (fragmentos de ADN) que codifican un polipeptido. El origen de los insertos de ADN puede ser genomico, ADNc, sintetico o

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semisintetico. El polipeptido puede tener cualquier actividad deseada, por ejemplo el polipeptido de interes puede ser una protema de union, por ejemplo un anticuerpo, o una enzima, por ejemplo, una polimerasa, ligasa, enzima de restriccion, topoisomerasa, quinasa, fosfatasa, enzima metabolica, enzima catalttica, o una hormona del factor de crecimiento, peptido antimicrobiano, antigeno, receptor, protema reportera, protema inmunomoduladora,

neurotransmisor, protema estructural, factor de transcripcion o transportador. En una realizacion, el polipeptido es un anticuerpo o una enzima. Por lo tanto, los metodos de la presente invencion se pueden usar para cribar variantes de un polipeptido que tiene una actividad deseada.

La clonacion y construccion de bibliotecas de ADN de, por ejemplo, protemas o enzimas de union, se pueden realizar usando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, Lutz y Patrick (2004) han revisado los metodos de generacion de la variabilidad de las bibliotecas y las estrategias de recombinacion genica para uso en la ingeniena de protemas. Para cribado de las variantes polipeptfdicas expresadas, las estrategias utilizadas para las bibliotecas expresadas en la superficie podnan adoptarse y adaptarse para los metodos de la presente invencion (Becker y colaboradores, 2004, Daugherty y colaboradores, 2000, Kenrick y colaboradores, 2007, Miller y colaboradores, 2006).

Se puede introducir una biblioteca de acidos nucleicos en una pluralidad de celulas bacterianas dando como resultado la expresion de un miembro de la biblioteca en cada una de las celulas bacterianas. Ademas de ser expresados, los polipeptidos se retienen dentro de la celula bacteriana permeabilizada, o se unen a la pared celular, con el fin de evaluar su funcion o caractenstica. Las bibliotecas de acido nucleico de un polipeptido, por ejemplo, una protema de union tal como un anticuerpo, o de una enzima, se pueden generar a traves de una diversidad de metodos incluyendo a traves de la introduccion de mutaciones tales como mutaciones puntuales, supresiones, e inserciones, o a traves de eventos de recombinacion. Los metodos para la generacion de bibliotecas de variantes son conocidos en la tecnica e incluyen PCR propensa a errores, smtesis de ADN en bacterias comprometidas en la reparacion del ADN y modificacion qrnmica del ADN. Los metodos para la generacion de bibliotecas mediante recombinacion son conocidos en la tecnica e incluyen mezcla de genes, ensamblaje de ADN en bacterias altamente recombinogenicas, ensamblaje de bibliotecas de acido nucleico sinteticas, etc., o cualquier combinacion de los mismos. De esta forma, se puede introducir una biblioteca de polinucleotidos que codifican polipeptidos en una pluralidad de celulas bacterianas, dando como resultado la expresion de uno o mas miembros de la biblioteca en cada una de las celulas bacterianas.

En algunas realizaciones, una biblioteca comprende dos o mas variantes de un polipeptido en el que cada variante comprende un polipeptido unico con un cambio menor en la secuencia de aminoacidos. En otras realizaciones, una biblioteca comprende dos o mas secuencias no relacionadas. Por ejemplo, para identificar un polipeptido candidato que puede inhibir una enzima, se puede interrogar una biblioteca de secuencias aleatorias o secuencias predeterminadas. Una biblioteca puede tener al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 50, al menos 100, al menos 1000, al menos 10.000, al menos 100.000, al menos 1.000.000, al menos 107 o mas miembros.

Expresion de la protema de union

En una realizacion, los metodos de la presente invencion se aplican a la evolucion de protemas de union, tales como por ejemplo anticuerpos. Por lo tanto, en una realizacion, el polipeptido que se criba para una actividad deseada es una protema de union, la molecula objetivo puede ser cualquier molecula a la que pueda unirse la protema de union, y la actividad deseada es union, y/o el grado de union con la molecula objetivo. Los metodos de la invencion pueden comprender, por ejemplo, el cultivo de una celula bacteriana que comprende un polinucleotido que codifica una protema de union de manera que la protema se produce en la celula. La celula se permeabiliza posteriormente y la celula permeabilizada se pone en contacto con una molecula objetivo. Se puede usar cualquier metodo adecuado en la tecnica para determinar si el polipeptido se une y/o el grado de union a la molecula objetivo.

Los metodos de la invencion son particularmente adecuados para el cribado de bibliotecas que expresan la protema de union. A diferencia de otros procedimientos de expresion superficial in vivo, los cuales requieren absolutamente el direccionamiento de la protema a un espacio extracelular, ya que las membranas celulares evitan la interaccion con el objetivo marcado presentado a la protema de expresion, los metodos de la invencion pueden expresar y plegar las protemas de afinidad en el citoplasma de la celula huesped. Por lo tanto, los parametros de cribado pueden incluir el alto rendimiento y el plegamiento productivo de la protema variante de afinidad en el citoplasma de las bacterias.

Ademas, como la expresion y el plegado de la protema citoplasmatica es en un ambiente reductor, los metodos de la invencion pueden aplicarse para seleccionar variantes de anticuerpos, u otras protemas que tienen enlaces disulfuro en su forma nativa, que pueden plegarse productivamente en un ambiente reductor. Se esperana que las variantes seleccionadas fueran mas estables ya que no dependenan de los enlaces disulfuro intra o inter dominios para la estabilidad de plegado. Este enfoque tiene aplicacion para el desarrollo de anticuerpos que podnan utilizarse para la union intracelular de objetivos, ya sea para neutralizar o para marcar.

Los metodos de la invencion pueden por lo tanto utilizarse como una plataforma para la expresion y seleccion de una variedad de protemas de union, incluyendo aquellos andamiajes conocidos en la tecnica, tales como anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de dominio, Fab, y los andamiajes que no son de anticuerpo tales como lipocalinas, FN3, ubiquitina, Y-B-cristalina.

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Cribado de polipeptidos en combinacion con expresion en fagos

La expresion convencional en fagos, con el polipeptido que esta siendo cribado unido a la superficie de un fago filamentoso, generalmente en solo una o algunas copias, permite el cribado de un gran numero de clones en paralelo por afinidad con una molecula objetivo. Sin embargo, el ambiente de los clones de baja y moderada afinidad es alto y no se pueden distinguir clones unicos sin subclonacion y secuenciacion, y la determinacion de las propiedades de cada clon unico (por ejemplo, niveles de expresion, solubilidad y afinidad) usualmente requiere de un cambio en el formato de expresion. Por lo tanto, en los metodos de la tecnica anterior, una cantidad sustancial de trabajo se encuentra secuencia abajo del cribado inicial de expresion en fago.

En comparacion, los metodos de la invencion permiten el uso de FACS para caracterizar polipeptidos dentro o unidos a celulas bacterianas Gram negativas. FACS permite definir los parametros de union resultando en clones con las caractensticas deseadas altamente enriquecidas. Sin embargo, el cribado de clones individuales es secuencial e incluso con velocidades de clasificacion de 104 clones por segundo existe un lfmite superior comparativamente bajo en el numero de individuos que pueden ser procesados en un cribado. Por ejemplo, el cribado de 108 clones puede tardar mas de 2 horas.

Por lo tanto, en ciertas circunstancias, puede ser deseable combinar el cribado paralelo de sistemas convencionales de expresion en fagos con la caracterizacion clonal de expresion celular analizada por FACS como se proporciona en la presente invencion. Por lo tanto, los cribados tempranos pueden realizarse mediante expresion convencional en fagos, siendo posteriormente analizados los clones de salida por el sistema de expresion de la presente invencion en el que el polipeptido es retenido dentro de la celula bacteriana por la pared celular y/o por union a la pared celular, o mediante la union a un fago encapsulado de lisis defectuosa.

De este modo, una biblioteca de genes puede expresarse y mostrarse en la superficie de un fago lttico o fago filamentoso usando fusiones con protemas de fagos, o traves de asociacion estable de dos polipeptidos como se describe en la presente memoria. Estos fagos pueden ser cribados por la actividad del polipeptido ('exploracion') usando tecnicas estandar para expresion en bacteriofagos. La expresion en fagos de la protema de fusion que se adhiere a una molecula objetivo, tal como un sustrato de afinidad, puede producirse y recuperarse como, por ejemplo, cosmidos por infeccion en la cepa auxiliar que contiene al profago lisogeno. Este ciclo puede repetirse hasta que la biblioteca este dominada por clones enriquecidos. En este punto, la biblioteca podna subclonarse en un sistema de vectores que realice la expresion encapsulada de acuerdo con el metodo de la invencion.

Por consiguiente, en una realizacion de la presente invencion, se lleva a cabo una etapa de cribado adicional antes y/o despues del metodo de cribado de la invencion. Como se ha indicado anteriormente, el cribado adicional implica un sistema convencional de expresion en fagos, es decir, un sistema de expresion en fagos en el que: i) el polinucleotido que codifica al polipeptido que es cribado para una actividad deseada no se empaqueta en un fago de lisis defectuosa, y /o ii), el polipeptido no es retenido dentro de la celula bacteriana por la pared celular bacteriana y/o se une a la pared celular bacteriana. Dicho cribado adicional puede involucrar metodos conocidos de expresion en fagos tal como el uso de fagos lttico lambda o el fago M13 filamentoso.

En una realizacion adicional del metodo de la invencion, el metodo convencional de expresion en fagos se puede combinar con el uso del fago de lisis defectuosa y de expresion celular encapsulada para permitir la conmutacion facil entre las dos formas de expresion de protemas, sin subclonacion adicional del ADN de la biblioteca enriquecida.

En esta realizacion, la protema que se va a expresar puede codificarse como una fusion a una protema de la capside del fago mediante un polinucleotido clonado en un bacteriofago o fagemido de lisis defectuosa, o en un cosmido que puede ser empaquetado por un profago. Los metodos para construir un vector bacteriofago para expresion en la capside, tal como un vector lambda, se describen en Mikawa y colaboradores (1996), Sternberg y Hoess (1995), y Vaccaro y colaboradores (2006). Los metodos para la construccion de vectores de fagemidos y cosmidos son tambien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los vectores fagemidos basados en los ongenes de pUC y pBR322 fueron descritos por Yankovsky y colaboradores (1989) y King y colaboradores, (1982), respectivamente. Para los cosmidos lambda, Sambrook y Russell (2001), y para los cosmidos P2/P4/186, Kahn y colaboradores (1991), ambos proporcionan buenas descripciones generales y detalles de los vectores. El cosmido sera transformado en una lmea celular bacteriana que contiene un profago de lisis defectuosa e inducido tanto para la expresion de la protema de fusion de la capside como para el empaquetamiento del vector cosmido.

Alternativamente, el vector de bacteriofago de lisis defectuosa se transforma/infecta en una celula huesped y es igualmente inducido para expresion de la protema de fusion de la capside y el genoma del vector de bacteriofago.

Despues del empaquetamiento del vector bacteriofago/cosmido, las celulas pueden lisarse para liberar el fago empaquetado mediante el tratamiento combinado de una etapa de permeabilizacion usando detergente o un disolvente organico tal como cloroformo, y una actividad enzimatica de lisozima, tal como la comercialmente disponible como ReadyLyse (Epicentre). La biblioteca de expresion puede ahora ser "explorada" para union a un objetivo mediante

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metodos comunmente usados para la seleccion de expresion en fagos. Despues de la exploracion, la biblioteca puede ser recuperada por reinfeccion en el huesped bacteriano que contiene el profago de lisis defectuosa. Los ciclos de exploracion y reinfeccion pueden repetirse hasta que la proporcion del fago de union se enriquezca sustancialmente en la poblacion de la biblioteca, momento en el que el siguiente ciclo de produccion de fagos se permeabilizan las celulas, pero se omite la etapa de lisis enzimatica, produciendo una sub-biblioteca de fagos encapsulados. Un objetivo marcado en forma fluorescente puede unirse a estos fagos encapsulados que pueden entonces ser clasificados por FACS, como se describe en el Ejemplo 23 y se observa en la Figura 25.

El experto en la tecnica apreciara que esta realizacion, asegura que la biblioteca de expresion se mueva entre dos modos diferentes de expresion; 1) exploracion del fago libre con el objetivo inmovilizado que es un cribado altamente paralelo con baja selectividad clonal; y 2) caracterizacion y purificacion por FACS de clones individuales encapsulados, que es un cribado altamente selectivo pero de bajo rendimiento. Por lo tanto, esta realizacion del metodo de la invencion permite utilizar los elementos mas potentes de cada sistema sin la intervencion del usuario para el reformateo que de otro modo sena necesario. Tal realizacion es, por lo tanto, altamente susceptible a un flujo de trabajo robotico de alto rendimiento.

En otra realizacion del metodo de la invencion, los anticuerpos solubles pueden identificarse y utilizarse como andamiajes en bibliotecas de genes que pueden conmutarse entre la expresion en fagos y la expresion celular bacteriana Gram negativa mediante el metodo de la invencion.

Expresion enzimatica

Los metodos de la invencion pueden usarse para la expresion de enzimas y bibliotecas de enzimas y para la evolucion de las propiedades enzimaticas. Por tanto, en una realizacion, el polipeptido que se criba para una actividad deseada es una enzima, la molecula objetivo es un sustrato de la enzima, y la actividad deseada es la union a y/o modificacion enzimatica de la molecula objetivo. El experto en la materia comprendera que los metodos para el desarrollo de ensayos para actividades enzimaticas que utilizan otras tecnologfas de expresion superficial podnan aplicarse igualmente como ensayos a los metodos de la invencion.

Los metodos de la invencion tambien senan adecuados en el uso de bibliotecas de enzimas que se expresan en la celula huesped, que se permeabiliza y luego se suspende como una emulsion de agua en aceite en agua (w/o/w). Aharoni y colaboradores (2005) demostraron que la utilidad del uso de bibliotecas de enzimas expresadas en la superficie celular en una emulsion w/o/w mediante FACS para la mejora de la paraoxonasa. Las ventajas de la encapsulacion en una membrana oleosa no permeable son que un sustrato que puede difundirse y un producto pueden mantenerse en la proximidad de la actividad enzimatica y de la secuencia de acido nucleico codificante. Sin embargo, la criba descrita por Aharoni y colaboradores (2005) requiere que la enzima se exprese en el exterior de la celula huesped. Utilizando los metodos de la invencion, la expresion intracelular y el plegamiento de bibliotecas de enzimas podnan usarse para mejorar la funcion enzimatica.

En los metodos de la invencion, se cultiva una celula bacteriana que comprende un polinucleotido que codifica una enzima con el fin de producir la enzima. Despues de la permeabilizacion de la celula bacteriana, la celula se pone en contacto con un sustrato de la enzima y se pueden usar metodos conocidos para determinar si se modifica la enzima y/o la velocidad de modificacion enzimatica del sustrato.

En algunos casos, puede ser deseable que la molecula objetivo (por ejemplo un sustrato enzimatico) se enlace a la celula bacteriana. El experto entendera que la molecula objetivo puede enlazarse a cualquier componente de la celula bacteriana permeabilizada, ya sea directa o indirectamente. El enlazamiento directo puede lograrse, a manera de ejemplo no limitante, mediante enlazamiento de la molecula objetivo con la pared celular bacteriana. El enlazamiento indirecto de la molecula objetivo puede lograrse, por ejemplo, mediante enlazamiento de la molecula objetivo con el segundo polipeptido que esta asociado con el polipeptido que se esta cribando para que una actividad deseada forme un complejo proteico. Por ejemplo, la molecula objetivo puede enlazarse al polipeptido que tiene un tamano molecular suficiente para retener el complejo proteico dentro de la celula bacteriana permeabilizada, o puede enlazarse con la protema de union al ADN o a la protema de union de la pared celular bacteriana como se usa en los metodos de la invencion. El enlazamiento de la molecula objetivo a la celula bacteriana permite ventajosamente el aislamiento de celulas bacterianas que presentan enzimas activas utilizando tecnologfas tales como, por ejemplo, FACS o mediante selecciones con perlas magneticas.

El experto en la tecnica podra determinar facilmente una qmmica de acoplamiento adecuada para enlazar una molecula objetivo con una celula bacteriana. Las qmmicas de acoplamiento adecuadas incluyen marcacion de cistema con reactivos de acoplamiento de tiol tales como acrilato y maleimida, marcacion con amina y marcacion con carboxilo que estan comercialmente disponibles a traves de proveedores incluyendo Pierce Protein Research Products e Invitrogen.

Analisis de citometna de flujo

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La tecnologfa de expresion celular de la presente invencion puede presentar muchos miles de moleculas de un polipeptido de interes a la vez y, a diferencia de las tecnologfas de expresion molecular tales como expresion ribosomal/ARNm o expresion en fagos, puede ser cribada usando tecnicas de citometna de flujo, por ejemplo usando maquinas de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS). No solo se pueden capturar eventos positivos en la biblioteca, sino que se pueden definir simultaneamente parametros tales como expresion de protema, actividad enzimatica o afinidad objetivo para cada miembro positivo, mejorando por lo tanto la salida del cribado. Los instrumentos para llevar a cabo la citometna de flujo son conocidos en la tecnica e incluyen FACS Star Plus, FACScan y FACSort (Becton Dickinson), Apis C y MoFlo. Las tecnicas de citometna de flujo en general implican la separacion de celulas en una muestra lfquida. Tfpicamente, el proposito de FACS es analizar las celulas para una o mas caractensticas, por ejemplo, la presencia de una molecula objetivo. Los metodos para realizar el analisis de citometna de flujo son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se describe una revision de metodo usando FACS para evaluacion de la actividad enzimatica por parte Farinas (2006).

Para la presente invencion, es util la citometna de flujo para multiples rondas de cribado que pueden llevarse a cabo secuencialmente. Las celulas pueden ser aisladas de una ronda inicial de clasificacion e inmediatamente reintroducidas en el citometro de flujo y cribadas de nuevo para mejorar la rigurosidad del cribado. Ya que la citometna de flujo es esencialmente una tecnologfa de clasificacion de partfculas, la capacidad para cultivar celulas no es necesaria. Las tecnicas para la recuperacion de acidos nucleicos a partir de celulas no viables son bien conocidas en la tecnica y pueden incluir, por ejemplo, tecnicas de amplificacion dependientes de la plantilla incluyendo PCR.

Despues de que se ha identificado una celula bacteriana Gram negativa que produce un polipeptido que tiene una actividad deseada, el ADN que codifica el polipeptido puede aislarse de la celula bacteriana usando cualquier tecnica conocida adecuada. De este modo, el ADN que codifica el polipeptido puede aislarse y secuenciarse usando procedimientos convencionales. Si se desea, el polinucleotido puede pasar a traves de otra ronda de diversificacion con el fin de generar otra biblioteca de variantes que se criba para la actividad deseada. De esta manera es posible utilizar un proceso repetitivo para optimizar la actividad deseada de un polipeptido.

En las realizaciones en las que el polinucleotido es empaquetado por un fago de lisis defectuosa, los polinucleotidos que codifican los miembros polipeptfdicos de la biblioteca que tienen una actividad deseada pueden recuperarse facil y rapidamente del cribado posterior a FACS para un enriquecimiento repetitivo adicional o para analisis clonal mediante recuperacion de la biblioteca de fagos, o de la biblioteca de cosmidos empaquetada, por tratamiento de las celulas bacterianas permeabilizadas con una lisozima, por ejemplo, ReadyLyse (Epicentre), para degradar la pared celular y liberar el fago para la infeccion subsiguiente.

De este modo, esta realizacion de la invencion permite la caracterizacion concurrente de parametros de expresion y de union con el cribado por FACS, junto con la facil recuperacion y manipulacion de bibliotecas de genes empaquetadas en fagos. Las rondas repetitivas de cribado por FACS usando bibliotecas de fagos de lisis defectuosa se simplifican por lo tanto y no dependen de la amplificacion por PCR de los clones positivos con el consiguiente error de mutacion y la manipulacion requerida.

Empaquetamiento de bibliotecas de genes usando fagos de lisis defectuosa.

Los presentes inventores han encontrado que el uso de un profago de lisis defectuosa inducible permite la clonacion y el empaquetamiento de alta eficiencia de una biblioteca de genes en bacterias Gram negativas. Un profago inducible es uno que esta presente en el genoma de una celula bacteriana Gram negativa, en la que tras la induccion de la activacion del profago, el profago se activa como un fago en la celula bacteriana. El fago en la celula puede entonces ser capaz de empaquetar un polinucleotido.

Los polinucleotidos que codifican las protemas que van a ser cribadas por los metodos de expresion de la invencion pueden empaquetarse en fagos que tienen una etapa lttica o, alternativamente, en un fago de lisis defectuosa. Tanto los genomas de fagos lfticos como lisogenicos generalmente tienen una region que es dispensable para cualquier ciclo de vida, y puede ser reemplazada por un gen clonado y regiones reguladoras asociadas. Las regiones dispensables pueden incluir regiones que contienen genes para la recombinacion del ADN (por ejemplo, los genes bet y exo del bacteriofago lambda y la region Nin5), o regiones que proporcionan funciones de supervivencia de la celula huesped con un lisogeno (por ejemplo, el fago lambda Ea47, Ea31, Ea59, genes Lom y bor; el fago Old P2, y genes Fun). Alternativamente, puede haber una tolerancia para el empaquetamiento de genomas que son fraccionalmente mayores de lo normal (por ejemplo, el bacteriofago Lambda empaquetara hasta 105% de la longitud de tipo silvestre de 48,5 kb) permitiendo la clonacion de regiones cortas directamente en el genoma sin reemplazo de regiones no esenciales, tal como en el sistema de expresion T7 Select Phage (Novagen). Cuando la biblioteca de genes va a ser clonada en un vector bacteriofago de lisis defectuosa, los genes de lisis tambien representan una region dispensable.

Siempre que sea posible, el polinucleotido que codifica el polipeptido que se esta cribando para una actividad deseada debe clonarse en una region del genoma del fago de tal manera que no interrumpa la transcripcion y traduccion de los operones esenciales del bacteriofago. Por lo tanto, el experto entendera que el polipeptido puede expresarse usando sus propias regiones reguladoras de la transcripcion tales como, por ejemplo, su propio promotor y/o terminador.

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Las bibliotecas genicas de los polipeptidos que van a ser cribados para una actividad deseada tambien se pueden construir usando elementos que instruyen a un fago auxiliar para empaquetar un plasmido como una partmula infecciosa de fago. Por ejemplo, las regiones cos de los bacteriofagos Lambda, P2, P4 y de otros fagos lambdoides son elementos de <500 pb que tienen los sitios de union y de escision para la enzima terminasa, que corta y empaqueta un plasmido que contiene estas regiones como un elemento lineal dentro de una cabeza de capside de fago. Estas regiones cos se pueden clonar en un plasmido que es luego denominado en la tecnica como un cosmido. En general, el tamano de un cosmido debe ser cercano al tamano del genoma de tipo silvestre, usualmente dentro dl 80 a 105% del genoma del fago de tipo silvestre, que va a ser empaquetado eficientemente. Alternativamente, puede ser una fraccion unitaria del genoma de tipo silvestre (1/2, 1/3, 1/4) con multimeros del cosmido que va a ser empaquetado dentro de una unica cabeza de fago. Los multimeros pueden formarse dentro de la celula mediante recombinacion entre cosmidos en una celula recA+, o pueden formarse durante el ciclo de replicacion del bacteriofago (por ejemplo, replicacion circular continua por el bacteriofago lambda).

El fago P2, o el fago 186 o el tnbrido de 186 y P2, y su satelite, P4, proporcionan ventajosamente un cosmido de un tamano manejable para las tecnicas de clonacion basadas en plasmidos (~ 11 kb) y la protema terminasa de P2 tiene una preferencia por el empaquetamiento de sustratos de plasmidos que contienen una sola region cos, en lugar de multfmeros lineales con regiones cos adyacentes, como prefiere la Lambda terminasa. Por lo tanto, se puede construir una biblioteca de cosmidos con facilidad y empacarla in vivo con alto grado de eficacia. Los metodos para el empaquetamiento de bibliotecas de genes utilizando un fago P2 se describen en Kahn y colaboradores (1991).

Las bibliotecas de fago elaboradas usando un bacteriofago lftico (por ejemplo, T7 Select) pueden ser empaquetadas in vivo despues de la infeccion de una celula huesped. Cuando el fago es de lisis defectuosa, la celula permanecera intacta hasta que sea permeabilizada y cribada por el metodo de la invencion. El fago infeccioso puede ser luego recuperado de las celulas seleccionadas por tratamiento con lisozima para degradar el peptidoglicano y liberar las partmulas de fago.

Las bibliotecas de fago elaboradas usando un bacteriofago lisogenico o sus cosmidos son empaquetadas in vivo mediante la induccion de activacion de un profago integrado o mediante infeccion de un fago auxiliar para producir fagos y para ingresar en la ruta lttica. La induccion del profago se logra comunmente utilizando mutantes sensibles a la temperatura de la protema represora de la inmunidad del fago. Las bibliotecas se pueden establecer en la celula huesped a baja temperatura, y luego se induce el empaquetamiento del bacteriofago por un cambio de temperatura hacia arriba. Por ejemplo, el alelo c/857 del gen represor del fago lambda soporta el establecimiento y mantenimiento de lisogenia a 30°C, pero es inactivo a temperaturas superiores a 37°C, forzando la escision del profago y la entrada a la ruta lttica. Sin embargo, el fago P2, que se conoce como un fago no inducible, no puede ser inducido por metodos estandar tales como UV o un represor sensible a la temperatura. Por el contrario, las funciones de P2 pueden ser inducidas como un fago auxiliar para el empaquetamiento de cosmidos mediante el uso de la infeccion del satelite P4, en particular, los mutantes vir de P4 que impiden el establecimiento de un colisogeno P2/P4, pero en vez de eso activan P2. Sin embargo, el fago relacionado con P2, 186, no tiene un represor sensible a la temperatura, c/ts, que pueda inducir la replicacion del fago y el empaquetamiento tras la inactivacion (Woods y Egan (1974)). Ademas, el fago tnbrido de P2 y 186 fueron obtenidos por infeccion conjunta que contiene el control de replicacion inducible por temperatura del fago 186 con los genes estructurales de P2. Uno de estos fagos se conoce como Hy5 (Younghusband y colaboradores, 1975).

Los elementos de P2 y P4 que regulan la ruta lttica de P2 tambien pueden clonarse e inducirse para activar la lisis. El Ejemplo 17 detalla el uso de los factores de transcripcion de los genes P4 6, P2 cox y P2 ogr para inducir lisis y empaquetamiento de cosmidos en un colisogeno P2/P4 de la cepa C de E. coli. El fago lambda c/857 represor se utilizo con su promotor endogeno y la region del operador del gen cro para regular la expresion de los factores de transcripcion de P2 y P4. El gen 6 fue el activador mas rapido de lisis, seguido por los genes ogr y cox, en ese orden. La lisis celular fue acompanada por la liberacion del fago P4 infeccioso y partmulas de cosmido.

Otros genes de control de P2 que pueden inducir la activacion de P2 incluyen al operon completo sid-6-psu de P4 y el antirrepresor P4e, o combinaciones de los mismos.

Una biblioteca de cosmidos transformada en celulas que contienen un fago auxiliar P2 con un fago auxiliar P4 colisogenico y/o las regiones de control de P4 descritas anteriormente, pueden ser empaquetadas in vivo despues de la induccion de la activacion de P2. Cuando el fago es de lisis defectuosa, la celula permanecera intacta hasta que sea permeabilizada y cribada por el metodo de la invencion. Las partmulas infecciosas del fago cosmido pueden ser luego recuperadas de las celulas seleccionadas por tratamiento con lisozima para degradar el peptidoglicano y liberar las partmulas de fago.

Kits

Los componentes necesarios para llevar a cabo los metodos de la invencion pueden proporcionarse convenientemente en forma de un kit. Como lo comprendera la persona experta en la tecnica, los diversos componentes del kit pueden suministrarse en recipientes individuales o almuotas, o los componentes de la solucion se pueden combinar en

diferentes combinaciones y en diferentes concentraciones para conseguir un rendimiento optimo de los metodos de la invencion. Esta dentro del conocimiento del experto en la tecnica determinar que componentes del kit pueden combinarse de manera que los componentes se mantengan en una forma estable antes de su uso.

Los kits, tal como se describen aqm, contendran tipicamente, como mmimo, un vector que comprende un sitio para 5 insertar en el vector un polinucleotido que codifica un primer polipeptido y un marco de lectura abierto que codifica un segundo polipeptido que se asocia con el primer polipeptido para formar un complejo proteico que se retiene dentro o se une a la pared celular de una celula bacteriana permeabilizada. Preferiblemente, el kit tambien contiene un agente para permeabilizar una celula bacteriana. En una realizacion, el kit comprende ademas celulas bacterianas, preferiblemente celulas bacterianas Gram negativas. Otros componentes adicionales pueden ser incluidos con el kit u otros 10 componentes suministrados por el usuario final, si es necesario.

La memoria descriptiva tambien proporciona kits adecuados para su uso en metodos de cribado de una protema para una actividad deseada que utiliza un fago de lisis defectuosa. Dichos kits comprenderan tfpicamente al menos una bacteria Gram negativa que comprende un fago de lisis defectuosa junto con una protema represora de fago sensible a la temperatura y/o un polinucleotido que codifica una o mas protemas activadoras de fagos. En una realizacion, el kit 15 comprende un fago de lisis defectuosa seleccionado de P2, 186, Hy5 y/o P4. En otra realizacion, el kit comprende un fago lambda de lisis defectuosa. El kit puede comprender opcionalmente un agente para permeabilizar una celula bacteriana Gram negativa.

Ejemplos

Ejemplo 1. Cribado de detergentes que permeabilizan E. coli

20 Para identificar los detergentes que permeabilizanan las celulas de E. coli se cribaron una cantidad de detergentes, tanto ionicos (Acido n-dodecil-p-iminodipropionico, cloruro de deciltrimetilamonio, decanoil sarcosina de sodio, anzergente 3-10) como no ionicos (oxido de dimetiloctilfosfina [Apo8], oxido de dimetildecilfosfina, n-octil-p-D- tioglucopiranosido [8TGP], monodecanoato; de sacarosa; Mega 10; Tween 80; Triton X-100; Triton X-114), ambos para la absorcion del colorante impermeable a la membrana, Gel Red (Biotium, cat. No. 41002) y para la liberacion de GFP. 25 Los detergentes probados para permeabilizacion fueron adquiridos a traves de Anatrace.

La cepa huesped de E. coli utilizada en todos los experimentos reportados fue la lmea celular Argentum derivada de K12 (Alchemy Biosciences) (AmcrA A (mrr-hsdRMS-mcrBC) AendA lacZAM15). Sin embargo, tambien se ensayo el metodo segun una realizacion de la invencion, con resultados comparables, con BL21 derivada de la cepa B (F-dcm ompT hsdS (re- me-) gal) y con la cepa de clonacion K12 DH5a (F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 30 080dlacZAM15 A (lacZYA-argF) U169, hsdR17 (rK mK+), A-).

La GFP se clono en un vector de alto numero de copias inducible por arabinosa (pAra1::GFP5). La expresion procedfa de un cultivo fuertemente inoculado de una placa con colonias recien estriadas. El cultivo se desarrollo a 37°C hasta una OD600 de -0,3 cuando se indujo la expresion mediante la adicion de arabinosa hasta una concentracion final de 0,2%. El cultivo inducido se agito a 25°C durante 2 horas antes de la recoleccion.

35 Las celulas se sedimentaron a partir de 1 mL de cultivo inducido por centrifugacion y se permeabilizaron mediante suspension en 300 pL de detergente al 0,5% en LB y se incubaron a 25°C durante 10 minutos. Las celulas permeabilizadas se sedimentaron y resuspendieron en 1X Gel Red en agua durante 2 minutos antes de ser sedimentadas y lavadas una vez en 300 pL de TBS. Se suspendieron en 300 pL de TBS y se procesaron para microscopfa de fluorescencia mediante la adicion de DABCO/glicerol (0,0325 g de dAbCO disuelto en 900 pL de glicerol 40 + 100 pL de PBS).

Las muestras se observaron ya sea en un microscopio optico Olympus Provis AX70 con una camara deslizante (SPOT RT 2.3.0 Software version 4.6), o en un microscopio confocal laser de barrido Leica TCS SP2/Microscopio invertido Leica DM IRE2 (Leica Confocal Software version 2.0).

La Figura 1 muestra el resultado de la permeabilizacion con detergente con E. coli que expresa GFP. Mientras que las 45 celulas no tratadas son verdes (GFP), las celulas que han sido permeabilizadas pierden su GFP interna y toman la coloracion Gel Red de union al ADN. Mientras que el nonidet-40 muestra alguna permeabilizacion, Apo8 y Mega10 muestran una mayor proporcion de celulas que han sido permeabilizadas. Una mezcla de estos dos detergentes al 0,5% cada uno, denominada Agente 86, demostro una permeabilizacion casi completa, al igual que otro detergente, n-octil-p- D-tioglucopiranosido (8TGP). Mega10, Apo8 y 8TGP son todos detergentes no ionicos, que son menos perturbadores 50 que los detergentes ionicos para el plegamiento y funcion de las protemas.

Como la pared celular permanecio intacta despues de la permeabilizacion, los extractos proteicos solubles del sobrenadante de la permeabilizacion con detergente descritos anteriormente se analizaron mediante SDS-PAGE. Se anadio tambien lisozima de clara de huevo de gallina (Boehringer Mannheim; 837 059) hasta una concentracion final de

2 mg/ml a una muestra de las celulas que se permeabilizan para remover la pared celular y liberar las protemas celulares totales. Se anadio luego colorante de carga para SDS-PAGE con p-mercaptoetanol a las muestras, que se desnaturalizaron a 95°C durante 2 minutos. Se cargaron 20 pL de muestras en SDS-PAGE al 9% y se tineron/fijaron con Azul Brillante de Coomassie / metanol / acido acetico.

5 La Figura 2 muestra que la liberacion de protema soluble se correlaciona directamente con la liberacion de GFP y la incorporacion de Gel Red como se observa mediante microscopfa. Significativamente, hubo diferencias entre la liberacion de protema de celulas con paredes celulares intactas en comparacion con aquellas cuyas paredes celulares se removieron usando lisozima, con las celulas encapsuladas en la pared celular liberando protema soluble hasta un tamano de ~ 120 kD. Este es presumiblemente el tamano de corte por encima del cual las protemas globulares son 10 incapaces de salir de la celula a traves de los poros de la red del peptidoglicano que constituye la pared celular de las eubacterias Gram negativas.

Ejemplo 2. Cribado para soluciones de permeabilizacion que retienen el ADN huesped

Si el metodo de la invencion se va a utilizar para cribar bibliotecas de genes para variantes de protemas con propiedades mejoradas, debe permanecer un enlace entre la protema expresada y su acido nucleico codificante. A 15 medida que la etapa de permeabilizacion de la membrana elimina la barrera que impide la perdida del ADN a traves de la pared celular, se examinaron las condiciones para la permeabilizacion que podnan reducir o prevenir la perdida del ADN del huesped.

La permeabilizacion de celulas utilizando 8TGP al 0,5% se llevo a cabo en diferentes medios y se examino la perdida de ADN mediante microscopfa de fluorescencia utilizando el colorante de union al ADN, Gel Red.

20 Se ensayaron composiciones de medio de permeabilizacion (todos los medios con 8TGPal 0,5%):

Medio LB (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl por litro)

Medio LB [sal] (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura por litro)

Tris 50 mM, pH 7,5

Hepes 50 mM, pH 7,0

25 NaCl 170 mM

NaCl 250 mM

Tris 25 mM, pH 7,5 + PEG 6000 al 1,5% (p / v)

Tris 50 mM, pH 7,5 + PEG 6000 al 3% (p / v)

Tris 50 mM, pH 7,5 + NaCl 170 mM 30 Tris 50 mM, pH 7,5 + NaCl 250 mM

Se identifico un medio optimo para la permeabilizacion como medio LB bacteriano. De acuerdo con esto, de aqu en adelante se realizo la permeabilizacion utilizando ya sea 8TGP al 0,5% en LB o Agente 86 en LB (Mega10 al 0,5% y Apo8 al 0,5% en LB).

Ejemplo 3. Fusiones de protema con un andamiaje de tetramero

35 Como se observo por los experimentos descritos en el Ejemplo 1, las protemas de tamano superior a ~ 120 kD se retuvieron dentro de celulas permeabilizadas de E. coli por la pared celular. Por lo tanto, se razono que una protema de interes que era menor de 120 kD se mantendna dentro de la capsula de la pared celular si, por fusion a una pareja de protemas, se pudiera hacer que el tamano total supere los 120 kD.

Por consiguiente, se clonaron 6 protemas tetramericas diferentes a partir de E. coli para uso como socios de fusion. 40 Estas fueron p-gal, BetB, G5K, GshB, RhnA y YdcW, que teman tamanos monomericos de 116 kD, 52 kD, 39 kD, 35 kD, 47 kD y 50 kD, respectivamente.

Se construyo un vector de alto numero de copias inducible por arabinosa para expresion tetramerica. La etiqueta SNAP (NEB / Covalys), un dominio de 20 kD que se une covalentemente a un sustrato fluorescente, se clono secuencia arriba

de los genes tetrameros y se uso como reportero de expresion. Tambien se incluyo un epftopo 6 x His en el extremo del terminal N de la protema de fusion para facilitar la purificacion o deteccion.

La secuencia del vector de arabinosa, pAra3::His6::SNAP, se proporciona como la SEQ ID NO: 1.

La expresion de la protema de fusion se indujo con la adicion de arabinosa al 0,2% y el cultivo se incubo a 25°C durante 5 2 horas.

Para permeabilizar las celulas para expresion de protemas mediante el metodo de acuerdo con una realizacion de la invencion, el protocolo fue el siguiente:

1. Precipitar 1 ml de celulas por centrifugacion

2. Resuspender las celulas en 300 pl de 8TGP al 0,5% / LB

10 3. Incubar a 25°C durante 10 minutos

4. Precipitar celulas mediante centrifugacion

5. Resuspender las celulas en 200 pl de TBS o LB

Para marcar el dominio informador de expresion SNAP con los colorantes SNAP impermeables a la membrana (Covalys / New England Biolabs), el protocolo fue el siguiente:

15 1. Disolver 20 nmol de BG-488 (colorante verde) o BG-547 (colorante rojo) en 300 pl de DMSO en forma de un patron

200x

2. Anadir 1 pl de patron 200x a 200 pl de celulas permeabilizadas suspendidas en TBS o LB

3. Incubar a 25°C durante 15 minutos

4. Lavar las celulas dos veces mediante sedimentacion por centrifugacion y resuspender en 300 pL de TBS

20 Para observar las protemas de fusion tetramericas mediante microscopfa de fluorescencia para retencion dentro de la capsula celular permeabilizada, el protocolo fue el siguiente:

1. Dejar caer 20 pL de suspension de celulas sobre una lamina de vidrio para microscopio, cubrir con cubreobjetos y sellar los bordes con esmalte de unas (montaje humedo); alternativamente, dejar que la gotita de las celulas se seque casi por completo, dejar caer 20 pL de DABCO / glicerol en la parte superior, cubrir con cubreobjetos y sellar los bordes

25 con esmalte de unas (montaje en seco)

2. Visualizar la muestra utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus o Leica

La expresion de la protema de fusion de longitud completa se confirmo mediante transferencia tipo Western de extractos de protema corridos en geles SDS-PAGE y se probaron con anticuerpo a-His6. Todos los constructos tetramericos expresados en E. coli a niveles detectables (Figura 3A).

30 La microscopfa de fluorescencia de las protemas de fusion tetramericas expresadas en E. coli encontro que (3-gal y G5K tema cuerpos de inclusion significativos y baja fluorescencia, presumiblemente debido a dificultades en el plegamiento de la protema de fusion. Sin embargo, como se muestra en la Figura 4, la expresion de la protema de fusion, segun se juzgo por fluorescencia SNAP, fue buena para GshB, y excelente para RhnA, BetB y YdcW. Se observo que la distribucion de la protema de fusion en la celula huesped permeabilizada no era homogenea, con focos evidentes tanto 35 por microscopfa de campo brillante como por fluorescencia. Sin embargo, como el sustrato de SNAP fluorescente no estana unido por un dominio mal plegado, y como la senal era muy intensa, se cree que estos cuerpos son probablemente agregados de protema plegada, y no cuerpos de inclusion de protema no plegada que se observan frecuentemente cuando sobreexpresan protemas en E. coli.

Las fusiones de SNAP::tetramero tambien teman un epftopo His6 en el extremo terminal N. Para probar si una molecula 40 grande tal como un anticuerpo sena capaz de penetrar a traves de la estructura de la red de la pared celular de E. coli se probaron las celulas permeabilizadas con anticuerpo aHis para detectar la fusion de SNAP::tetramero.

1. La expresion y permeabilizacion de la fusion del andamiaje His6::SNAP::BetB se realizo como se describio anteriormente.

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2. La marcacion con el ligando de SNAP BG-547 se realizo como se describio anteriormente.

3. 200 pl de celulas marcadas con SNAP permeabilizadas, se lavaron tres veces en LB y se dejaron sedimentar sobre un cubreobjetos recubierto con polietilenimina (PEI). Se elimino el exceso de medio celular por aspiracion y se dejaron secar al aire los portaobjetos.

4. Se bloquearon las celulas durante una hora en regulador de bloqueo (BSA al 1%, gelatina de pescado de agua fna al 1% (Sigma, G7765), Azida al 0,02% en PBS-Tween20).

5. Las celulas se incubaron durante la noche a 25°C en anticuerpo primario aHis (Abcam, AB9136-100), diluidas 1:10 en regulador de bloqueo.

6. Las celulas se lavaron 3 veces en PBS-Tween20 (10 min cada vez).

7. Las celulas se incubaron en anticuerpo secundario diluido 1: 2.000 (Molecular Probes, A11015) en regulador de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente.

8. Las celulas se lavaron 3 veces en PBS-Tween20.

9. Se montaron en DABCO / glicerol y se observaron bajo el microscopio confocal Olympus.

La Figura 5 muestra que el anticuerpo aHis se localiza conjuntamente con el ligando fluorescente SNAP dentro de la capsula de la pared celular, indicando que los poros de la pared celular son lo suficientemente anchos para permitir la difusion de una protema relativamente grande en el volumen interno de la capsula. De este modo, incluso pueden usarse ligandos proteicos muy grandes como sustratos de afinidad para protemas de afinidad expresadas en el citoplasma de acuerdo con una realizacion del metodo de la invencion.

El companero de fusion SNAP y el informador de expresion se compararon con la protema HALO (Promega) en un intento de ver si la formacion de los cuerpos subcelulares se alteraba. La protema HALO se une covalentemente a un sustrato fluorescente impermeable a la membrana (Alexa fluor 488; G1001, Promega) de forma similar a SNAP. El gen informador HALO se clono en marco directamente en el lugar del gen SNAP en los constructos de expresion tetramericos. La expresion de las protemas de andamiaje HALO::tetramericas se compararon con las variantes de SNAP. La marcacion de las celulas HALO permeabilizadas se llevo a cabo esencialmente como se describe para SNAP, y siguiendo las instrucciones del fabricante. La Figura 6 muestra que se encontro que los patrones de expresion de los HALO::tetrameros y de los SNAP::tetrameros eran similares, con la excepcion de que la protema de fusion HALO::RhnA era fraccionalmente mas soluble que la fusion SNAP::RhnA, con menos celulas conteniendo focos fluorescentes.

Por lo tanto, la expresion de una protema como una fusion a un andamiaje tetramerico (en este ejemplo, SNAP o HALO), y luego permeabilizar de la celula huesped de E. coli con un detergente adecuado permite la retencion de la protema de interes dentro de la pared celular.

Ejemplo 4. Protemas de union al ADN como andamiaje celular

Para acoplar el fenotipo al genotipo, la celula huesped debe retener al menos algun ADN episomal despues de la permeabilizacion y a lo largo del cribado funcional. Habiendo identificado las condiciones de permeabilizacion que reteman el ADN genomico del huesped, asf como el ADN plasirndico, se razono que el ADN podna usarse como un andamiaje de retencion para la protema de interes expresada.

Por lo tanto, se clono una pequena protema de union al ADN (DBP) de helice-horquilla-helice de alta afinidad (80 aa) del gen ComE de Neisseria gonorrhoea (Chen y Gotschlich, 2001) y se fusiono con el extremo terminal C de GFP en un constructo inducible porarabinosa (pAra3::GFP::DBP, seq 2).

La expresion por induccion de arabinosa se llevo a cabo como se describe en el Ejemplo 1. Las celulas se permeabilizaron y se prepararon para microscopfa de fluorescencia como se describe en los Ejemplos 1 y 3.

La Figura 7 muestra que la fusion de GFP::DBP (verde) se conservo en celulas permeabilizadas y se colocalizo con el colorante de union al ADN, Gel Red (rojo).

Por lo tanto, expresar una protema como una fusion a una protema de union de ADN no espedfica de alta afinidad, y luego permeabilizar la celula huesped de E. coli con un detergente adecuado permite la retencion de la protema de interes dentro de la capsula celular.

Ejemplo 5. Retencion de ADN en celulas permeabilizadas

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Para demostrar la retencion de ADN, tanto genomico como episomal, dentro de la capsula celular despues de la permeabilizacion, se prepararon celulas que expresan GFP5::DBp y His6::eGFP para microscopfa de fluorescencia y extraccion de ADN plasirndico.

Despues de la induccion, las celulas se permeabilizaron, luego o bien se congelaron o se dejaron en TBS a 37°C con agitacion durante la noche. Todas las muestras se procesaron al dfa siguiente para cualquier microscopfa de fluorescencia, para visualizar la GFP y el contenido de ADN de la capsula mediante el colorante Gel Red de union al ADN, o se llevo a cabo una preparacion de ADN plasirndico.

La microscopfa de fluorescencia se realizo como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 8 muestra que tanto el ADN de la celula huesped (rojo) como el GFP5::DBP (verde) se mantuvieron en la capsula celular inmediatamente despues de la permeabilizacion y tambien con la incubacion durante la noche a 37°C, sin ninguna perdida aparente. La protema His6::GFP se perdio de las celulas despues de la permeabilizacion, pero el ADN de la celula huesped (rojo) se conservo despues de la permeabilizacion, y tambien durante la noche, de nuevo sin perdida aparente.

Para confirmar que el ADN plasirndico, y no solo el genoma del huesped, se mantuvo dentro de las celulas permeabilizadas, se llevaron a cabo minipreparaciones de plasmido sobre muestras preparadas de forma identica.

El ADN de plasmido de 1 ml de celulas tratadas con detergente o no tratadas se preparo mediante un protocolo de lisis alcalina de minipreparaciones de plasmido. El ADN de plasmido liberado en el sobrenadante de la extraccion con detergente se extrajo utilizando una columna y solucion Perfectprep Gel Cleanup (Eppendorf; 955152051), siguiendo el protocolo del fabricante.

La cantidad total de cada muestra se cargo en un gel de agarosa al 1% y se formo una imagen en una pelmula FujiFilm LAS-3000 Inteligent Darkbox usando el software LAST-3000 de lector de imagenes y el software Multi Gauge version 3.0.

La Figura 9 muestra un gel de agarosa al 1% tenido con bromuro de etidio con regulador TAE con muestras de ADN plasirndico de ambas lmeas celulares.

El carril 1 de la Figura 9 es el ADN plasirndico total en celulas no tratadas. El carril 2 es el sobrenadante de la etapa de permeabilizacion y el carril 3 es el plasmido retenido en la capsula celular despues de la permeabilizacion. Se observa que hay muy poca liberacion de plasmido en el sobrenadante con permeabilizacion, a pesar de la perdida completa de la protema His6::GFP soluble observada en la Figura 8. Por lo tanto, el ADN plasirndico esta casi completamente retenido por la pared celular y puede usarse en el metodo de acuerdo con una realizacion de la invencion para el enlazamiento del genotipo con el fenotipo en cribados para variantes mejoradas de protemas.

Confirmando los datos de microscopfa, la incubacion durante la noche no revelo ninguna perdida de ADN plasirndico despues de una incubacion durante la noche a 37°C de celulas permeabilizadas suspendidas en TBS (carril 5).

Ejemplo 6. Andamiaje de union al peptidoglicano

Otra estructura celular que se retiene despues de la permeabilizacion de la membrana es la pared celular, que esta compuesta por un polfmero reticulado de peptidoglicano (PG).

Para unir PG no covalentemente, se clono un dominio de union a PG de 70aa a partir del fago 9KZ de pseudomonas (KzPG) que se mostro previamente que estaba bien expresado en E. coli y se unio a la pared celular con alta afinidad (K = 3 x 107 M'1) (Briers y colaboradores, 2009). Como un cribado para protemas de afinidad se esperana identificar variantes que tienen afinidades aun mas altas para sus objetivos que el dominio de union a KzPG para PG, se necesita aumentar la afinidad de la protema de union al andamiaje. Para aumentar la afinidad de la unidad estructural de union al andamiaje, se enlazaron tanto el dominio de union al aDn de ComE (DBD) como el dominio de union a PG en la misma protema de fusion. Por lo tanto, la constante de disociacion final de la protema de fusion de ambos andamiajes (PG o ADN) debe ser cercana a un multiplo de cada constante de velocidad.

Por lo tanto, se construyo un vector de expresion pAra3::His6::KzPG::SNAP::DBP (SEQ ID NO: 2). Se indujo la expresion como se describe en el Ejemplo 1 y se prepararon celulas para microscopfa de fluorescencia como se describe en el Ejemplo 3. La expresion y distribucion de la protema de fusion se controlo mediante marcacion con SNAP, como se describe en el Ejemplo 3.

Se observo fluorescencia en la periferia de la celula, en el area de la pared celular y en un nivel inferior en un area difusa dentro del volumen unido a la pared celular de la capsula.

Otra realizacion de la invencion sena unir covalentemente la protema de interes a un andamiaje celular antes de la permeabilizacion. Para lograr esto, se utilizo una fusion de protemas a LPP, una protema abundante de E. coli que

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forma una bobina trimerica en espiral en el periplasma. En su forma nativa, un extremo esta atado a la membrana externa por medio de lipidacion y el otro esta unido covalentemente a la pared celular a traves de una lisina del extremo terminal C.

Se construyo un constructo de expresion que fusiona la secuencia senal dirigida al OmpF periplasmico con el informador de expresion de SNAP, seguido por la secuencia de LPP de 57 aa de E. coli que carece de la secuencia senal del extremo terminal N y la cistema requerida para la union a la membrana externa. El vector de expresion pAra3::OmpF::SNAP::LPP (SEQ ID NO: 3) se indujo con arabinosa, como se describe en el Ejemplo 1, y se prepararon celulas para microscopfa de fluorescencia como se describe en el Ejemplo 3. La expresion y distribucion de la protema de fusion se controlo mediante marcacion con SNAP, como se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 10 muestra que la distribucion de la protema de fusion LPP era irregular a traves de la superficie de la pared celular, con areas de fluorescencia intensa y areas ausentes de cualquier fluorescencia. Sin embargo, en casi todos los casos, se marcaron los polos de las celulas.

Ejemplo 7. Expresion de una protema de afinidad aGFP usando un andamiaje de protema tetramerica

Para demostrar una realizacion del metodo de la invencion tal como se aplica a protemas de afinidad, se clono un anticuerpo de dominio unico generado a partir de un inmunizado de Llama contra eGFP en los vectores de andamiaje celular. Debe observarse que, de las dos secuencias enumeradas en la solicitud de patente para el anticuerpo aGFP (WO 2007/068313), solo se encontro que la variante R35 era funcional (aGFP-R35; Protein Database ID 3KlK). Por lo tanto, esta secuencia se utilizo para todas las pruebas experimentales.

El gen aGFP-R35 se clono como una fusion en el extremo terminal N al andamiaje tetramerico pAra3::HALO::FLAG::RhnA para crear el vector pAra3::aGFP (R35)::HALO::FLAG::RhnA (SEC ID No: 4).

Tambien se construyo un vector pAra3::His6::eGFP para producir una protema de fusion His6::eGFP como el sustrato objetivo del anticuerpo. La protema His6::eGFP se indujo como se describe en el Ejemplo 1. La protema soluble se libero a partir de celulas usando 8TGP al 0,5%, se purifico mediante IMAC usando resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen; 30230). Se eluyo His6::eGFP a partir de la resina Ni-NTA en regulador NTTW + imidazol (NaCl 500 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, Tween20 al 0,1% + imidazol 200 mM).

La expresion de la protema de fusion anticuerpo::tetramerica y la permeabilizacion de las celulas huesped se llevo a cabo como se describe en los Ejemplos 1 y 3.

Para la union de aGFP a eGFP en capsulas celulares permeabilizadas, el sedimento de la capsula se suspendio en 300 |jl de eGFP y se dejo equilibrar durante 20 minutos a 25°C, momento en el que las capsulas se precipitaron por centrifugacion, se lavaron una vez en 300 jl de TBS, y luego se resuspendieron en TBS. La microscopfa de fluorescencia en capsulas de aGFP / eGFP se llevo a cabo como se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 11 muestra que las capsulas permeabilizadas que expresan la protema de fusion aGFP::HALO::RhnA unen eGFP a traves de la celula, aunque paredan ser focos de coloracion mas intensa que se pueden correlacionar con los focos observados en la Figura 5 con la marcacion del ligando HALO.

Por lo tanto, el anticuerpo aGFP de Llama se expresa funcionalmente en el citoplasma y, ademas, se retiene dentro de la capsula despues de la permeabilizacion con detergente.

La marcacion con anticuerpo aHis descrito en el Ejemplo 3 y observado en la Figura 5 ya demostro que una protema mayor de ~ 150 kD es capaz de difundirse a traves de la pared celular permeabilizada en el interior de la capsula. Sin embargo, los anticuerpos nativos son protemas de forma irregular con 3 dominios de tamano aproximadamente igual separados por una region de bisagra flexible. Por lo tanto, el radio efectivo que estas protemas pueden presentar puede ser de una protema globular mucho mas pequena. Sin embargo, la GFP, que tiene una estructura de barril p y un tamano molecular de ~ 27 kD, es una protema simetrica con un radio proporcional a su tamano, que fue capaz de pasar a traves de las paredes celulares de la capsula permeabilizada para ser unida por el anticuerpo aGFP interno.

Por lo tanto, el metodo de la invencion puede usarse para expresar protemas de afinidad en el citoplasma de E. coli para el uso en la expresion de bibliotecas de afinidad para union de objetivos simetricos de al menos 30 kD.

Ejemplo 8. Expresion de una protema de afinidad aGFP usando un andamiaje de protema de union al ADN y a PG

Se demostro adicionalmente una realizacion del metodo de la invencion usando el anticuerpo de camelido aGFP fusionado a los dominios de union de ADN y a PG.

La expresion de la protema de fusion de anticuerpo::KzPG::SNAP::DBP, permeabilizacion de celulas huesped y marcacion con His6::eGFP se llevo a cabo como se describe para el Ejemplo 6.

Se utilizaron montajes tanto en humedo como en seco para formar imagenes de la union de eGFP mediante la protema de fusion aGFP. La Figura 12 muestra que hubo diferencias significativas con la fluorescencia de GFP entre los dos 5 metodos diferentes de formacion de imagenes. Las celulas montadas en seco (DABCO / glicerol) tuvieron principalmente fluorescencia interna, con una fusion entre el campo claro y la marcacion con eGFP que demuestra que la region alrededor de la pared celular no era mas intensa que el volumen interno (Figura 12B). Sin embargo, las celulas montadas directamente en TBS teman un patron distintivo de un borde exterior de fluorescencia fuerte que parece ser la eGFP unida a la pared celular con una senal interna mas debil (Figura 12A). Sin estar limitado por la teona, se especula 10 que el entorno del disolvente DABCO / glicerol, que es viscoso y no acuoso, evita la interaccion entre el dominio KzPG con la pared celular de peptidoglicano, pero no evita la union de aGFP con eGFP, o de DBP con ADN.

Sin embargo, como los procedimientos de cribado para protemas o enzimas de afinidad casi siempre se llevaran a cabo en ambientes acuosos, la distribucion de la protema de fusion de afinidad se aproximara al montaje en humedo unido a la pared celular observado en la Figura 12A.

15 Ejemplo 9. Expresion de una protema de afinidad aGFP mediante union covalente a la pared celular

Una realizacion del metodo de la invencion se demostro adicionalmente enlazando covalentemente el anticuerpo aGFP a la pared celular.

El anticuerpo aGFP se clono como una fusion inducible de arabinosa secuencia abajo de la secuencia senal OmpF y secuencia arriba de las secuencias SNAP y LPP.

20 Tras la induccion de la expresion por arabinosa, la secuencia senal OmpF dirigira la protema naciente a traves de la membrana celular interna dentro el periplasma y sera escindida cuando pase a traves del poro de la membrana.

En el periplasma, se espera que el dominio LPP forme una bobina trimerica en espiral con otros dos companeros, ya sea protemas de fusion LPP de tipo silvestre o con otras protemas de fusion aGFP. El residuo del extremo terminal C del dominio LPP es una lisina que esta covalentemente enlazada a la pared celular de E. coli a traves del grupo amino £, 25 lo mas probablemente por la L, D-transpeptidasa YbiS (Magnet y colaboradores, 2007).

La expresion de la protema de fusion OmpF::aGFP::SNAP::LPP, la permeabilizacion celular y la marcacion con eGFP se realizo como se describe para el Ejemplo 8.

La Figura 13 muestra que eGFP se unio de manera desigual, pero intensamente, alrededor de la pared celular (Figura 13B). EGFP no se unio a las celulas que expresan la fusion OmpF::SNAP::LPP fusion sin el dominio aGFP (Figura 13A).

30 La union covalente de la fusion OmpF::SNAP::LPP a la pared celular se demostro marcando primero las celulas permeabilizadas que expresan la protema de fusion con un ligando de SNAP antes de calentar una muestra de capsulas de celulas marcadas a 95°C durante 5 minutos . La Figura 14 demuestra que la fluorescencia del ligando de SNAP que marca la pared celular no cambio entre la muestra tratada termicamente y un control que no se calento. La tincion con Gel Red tambien demostro que el ADN genomico estaba todavfa retenido en la celula, incluso en la muestra tratada 35 termicamente.

Ejemplo 10. Experimentos de permeabilizacion de la membrana externa

En una realizacion adicional de la invencion, la membrana externa puede ser selectivamente permeabilizada por objetivos ligandos, tales como, por ejemplo, sustratos o polipeptidos enzimaticos, conservando al mismo tiempo el polipeptido que esta siendo cribado ya sea dentro o unido a la pared celular.

40 Para identificar las condiciones que permeabilizanan selectivamente la membrana externa, se cribo una gama de detergentes y reguladores. Se usaron ligandos tanto grandes (eGFP) como pequenos (Gel Red) para determinar si la permeabilizacion de las membranas externa/interna generaron ya sea poros de membrana grandes o pequenos.

Se cultivaron cepas de E. coli que expresan OmpF::aGFP::SNAP::LPP inducida por arabinosa (unida a la pared celular) o aGFP::HALO::FLAG::RhnA (citoplasmatica) y se indujeron como se describe para el Ejemplo 1.

45 Se lavo 1 ml de cultivo inducido una vez en Tris 50 mM (pH 8) antes de ser suspendido en variantes del regulador de permeabilizacion que contema detergente 0,2 - 0,4% ya sea en Tris 25 mM + EDTA 1 mM (pH 8) o en Tris 25 mM + Ca2+ 2 mM (pH 8) y se incubo a 25°C durante 10 minutos.

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Se lavaron las celulas permeabilizadas una vez en regulador apropiado y luego se tineron con Gel Red (1 vez en agua) y se lavaron con TBS. Luego se incubaron con His6::eGFP purificada durante 1 hora a 25°C antes de ser sedimentadas por centrifugacion y resuspendidas en TBS y se observaron mediante microscop^a de fluorescencia como un montaje en humedo.

Las Figuras 15 y 16 demuestran que Apo8 (A) al 0,2% o el Tween20 (B) en regulador Tris/Ca2+ o Tris/EDTA permeabilizaron selectivamente la membrana externa permitiendo la permeacion de un ligando grande (eGFP) a traves de la membrana externa, pero no a traves de la membrana interna. El ligando mas pequeno Gel Red de union al ADN, impermeable a la membrana, fue parcialmente permeable al citoplasma en la mayona de las muestras, lo que indica que ocurrio algun grado de formacion de poros en la membrana interna en algunas celulas. Sin embargo, el grado de union de Gel Red se redujo mucho en comparacion con las muestras que habfan sido tratadas con los detergentes 8TGP al 0,5% o Agente86 donde tanto las membranas externa como interna fueron completamente permeables a eGFP.

Ejemplo 11. Clasificacion por fluorescencia y analisis de expresion encapsulada

Como plataforma de expresion celular, el metodo de la invencion es idealmente adecuado para clasificacion de las celulas activadas por fluorescencia (FACS) para identificar clones de union al ligando. Para probar la estabilidad de las celulas de E. coli permeabilizadas para la clasificacion por FACS, se indujeron tres poblaciones para expresion: i) eGFP; ii) aGFP::KzPG::SNAP::DBP; y iii) His6::SNAP::BetB.

Las celulas que expresan aGFP no fueron permeabilizadas y fueron un control positivo para la fluorescencia en celulas de E. coli intactas. Las celulas que expresan aGFP::KzPG::SNAP::DBP fueron permeabilizadas de acuerdo con una realizacion del metodo de la invencion, y fueron marcadas con el ligando BG-488 de SNAP (verde). Las celulas que expresan His6::SNAP::BetB fueron permeabilizadas de acuerdo con una realizacion del metodo de la invencion, y fueron marcadas con el ligando BG-547 de SNAP (rojo).

Se suspendieron las celulas en PBS y se mezclaron en cantidades aproximadamente iguales para clasificacion de poblaciones mixtas o clasificadas por separado para calibracion de la senal. La clasificacion celular se realizo en un FACS de afluencia de Becton Dickson. El analisis de los datos se realizo mediante el software FlowJo. Los parametros para clasificacion de E. coli fueron determinados por el operador.

La Figura 17 demuestra que las tres poblaciones fueron identificables por fluorescencia. Un nuevo analisis de las poblaciones clasificadas mostro que la clasificacion proporciono poblaciones relativamente puras de cada una. Las senales presentes en la region de baja fluorescencia del grafico se demostro posteriormente que era ruido inherente en la senal y fueron removidas posteriormente por el operador mediante correcciones del instrumento.

Ejemplo 12. Seleccion de la region espaciadora para union al soporte solido

Las celulas que expresan la protema de fusion aGFP::KzPG::SNAP::DBP fueron permeabilizadas usando medios 8TGP, y las celulas unidas a perlas de sefarosa de HisPur Co2+ (Thermo Scientific) a traves de un compuesto intermedio eGFP etiquetada con His6. Las celulas o perlas fueron incubadas primero con un exceso de His6-eGFP antes de ser lavadas en TBS y luego incubadas juntas durante 30 minutos a 25°C. Las celulas no unidas fueron luego retiradas mediante lavado de las perlas antes de que se evaluara el grado de la union a las perlas mediante microscopfa de fluorescencia.

Inicialmente no se detecto union de la protema de fusion aGFP::KzPG::SNAP::DBP a las perlas de sefarosa. Se teorizo que el dominio de union de aGFP puede estar muy cerca a la pared celular para alcanzar la aGFP complejada con cobalto en la resina de sefarosa. Por consiguiente, se clono un dominio espaciador peptfdico de 12 residuos con codones aleatorios entre el dominio de union de aGFP y el dominio de union del peptidoglicano KzPG (GGT ACC gcy gcy gkk wtb gck wtb gkk gkk gck gkk gcy gcy GGT CTG (SEQ ID NO: 5)

Se expreso una biblioteca pequena(-2.000 miembros) de las variantes espaciadoras y luego se unio a Sefarosa Co2+, como se describio anteriormente. Se observo que una proporcion de la biblioteca se urna a las perlas. Estos clones fueron amplificados luego por PCR, clonados nuevamente y se analizaron individualmente una docena de clones para union y secuenciacion. Se encontro que una variedad de espaciadores peptfdicos eran a la vez resistentes a la escision proteolftica (manteniendo altos niveles de aGFP en la protema de fusion) asf como permitiendo la union de las celulas tratadas con detergente a las perlas de sefarosa como se demuestra en la Figura 18. Las secuencias espaciadoras que resultaron ser funcionales para la union al soporte se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1. Espaciadores enlazadores aleatorios (RL) para union al soporte solido

Enlazador

Secuencia de aminoacidos

5

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15

20

25

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RL1

GSNSNNQSKPSS (SEQ ID NO: 6)

RL2

GGPRNPQRHTGS (SEQ ID NO: 7)

RL6

SGTRHHNSHNSS (SEQ ID NO: 8)

RL9

SSNRTHKSNNSS (SEQ ID NO: 9)

RL10

SGHRTTERKHSS (SEQ ID NO: 10)

RL13

GGHRHTQRHNGG (SEQ ID NO: 11)

RL14

GGPRTPQSQPSG (SEQ ID NO: 12)

Se selecciono una secuencia espaciadora, RL6, fue escogida para estudios de union adicionales. Se examinaron otros factores que contribuyen a una union fuerte con matrices de soporte solidas. Se encontro que tanto el tiempo de incubacion de las celulas con la matriz como la concentracion de sal (NaCl) de la solucion de union tienen efectos positivos en la union. Se encontro que una incubacion de 30 minutos y un intervalo de concentraciones de NaCl de 200 mM a 500 mM fueron efectivos aunque se considero optimo 300 mM. La union fue efectiva en una gama de reguladores, incluyendo soluciones tris, fosfato y MOPS reguladas con sal 300 mM.

Tambien se confirmo que las condiciones de union para celulas que expresan la protema de fusion aGFP::RL6::KzPG::SNAP::DBP con las nanopartmulas magneticas de estreptavadina (MagneSphere; Roche diagnostics) a traves de eGFP biotinilado se confirmo tambien que estaban dentro de los intervalos identificados para la union a perlas de sefarosa y demostradas por la Figura 19.

Ademas de los espaciadores de 12 residuos, tambien se consideraron dominios de protemas para uso como dominios espaciadores. El dominio pequeno, de la inmunoglobulina 27 estable y altamente expresado del gen de titina humana (127) se clono secuencia arriba del espaciador RL6. Tambien se encontro que este dominio permitfa una expresion alta y estable del dominio aGFP del extremo terminal N asf como una excelente union a la matriz solida (Figura 19).

Ejemplo 13. Construccion de una biblioteca de scFv de raton para expresion encapsulada

La estructura de dominio final para la expresion intracelular de una biblioteca de anticuerpo monocatenario (scFv) fue: scFv::I27::RL6::KzPG::SNAP::DBP. Las secuencias de protema y ADN de la protema de fusion sin el dominio scFv se proporcionan como las SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14. Esta fusion proteica tiene la scFv en el extremo terminal N, seguido por los dos dominios espaciadores, I27 y RL6, luego el dominio de union de peptidoglicano, KzPG, el dominio informador de SNAP y, finalmente, el dominio de union al ADN (DBP).

El ADNc cebado al azar fue producido a partir de ARN total de bazo de raton usando la enzima Superscript III (Invitrogen). A partir de este ADNc, se amplificaron los dominios variables de cadena ligera (Vl) y de cadena pesada (Vh) de scFv utilizando ADN polimerasa Vent (New England Biolabs) y cebadores oligonucleotfdicos degenerados para las secuencias de la familia de anticuerpos de raton, como lo describen Schaefer y colaboradores (2010). Los cebadores oligonucleotfdicos usados para clonacion de la biblioteca difirieron de los descritos por Schaefer y colaboradores en el sentido de que teman extremos apropiados para clonacion a traves de BsmBI en nuestro vector de andamiaje de biblioteca (SEQ ID NO: 15). Los dominios VL y VH se unieron mediante PCR de extension superpuesta. La banda final de scFv se habfa sometido a un total de 60 ciclos de amplificacion por PCR (30 primera ronda, 30 segundas ronda).

Para la clonacion de la biblioteca, se cortaron 900 ng del constructo de expresion con BsmBI, se precipito usando Sureclean (Bioline) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se ligo usando ADN ligasa T4 con 400 ng de producto scFv tratado en forma similar. Se inactivo la ligasa mediante incubacion a 65°C durante 10 minutos y se electroporo la ligacion en la cepa Argentum de E. coli (Alchemy Biosciences). Se recuperaron las celulas electroporadas en medio SOC y se incubaron durante 1 hora a 37°C antes de combinarlas y luego esparcirlas a traves de placas de agar LB de 20 x 150 mm con 75 pg/mL de ampicilina. Se incubaron las placas durante una noche a 30°C. El tamano de la biblioteca se estimo en 4 x 105 clones independientes. Se encontro que 20 de las 20 colonias conteman un inserto del tamano esperado.

Ejemplo 14 Cribado de una biblioteca de expresion scFv de raton encapsulada

Los anticuerpos monocatenarios aislados de bibliotecas de expresion en fagos son a menudo difmiles de expresar en E. coli, ya sea con bajos niveles de expresion en el periplasma, o son completamente insolubles en el citoplasma debido a la carencia de formacion de enlaces disulfuro entre las laminas B del pliegue de Ig. Para determinar si la expresion encapsulada podna utilizarse para seleccionar un andamiaje de scFv de raton que fuera soluble en el citoplasma de E. 5 coli, fue necesario determinar si la solubilidad de scFv se correlacionaba con el comportamiento de la protema de fusion.

Se predijo que una scFv soluble util tendna bajos niveles de agregacion y al menos un nivel moderado de expresion. Esto se podna juzgar visualmente como un clon que permitio la union del dominio KzPG en una celula permeabilizada con la pared celular (y por lo tanto, no localizada en un cuerpo de inclusion dentro de la celula) y que mostro una al menos expresion moderada del dominio informador SNAP.

10 Para cribar estos parametros, se escogieron colonias individuales y se indujo la expresion de la protema de fusion usando arabinosa como se describio previamente en el Ejemplo 1. Despues de la permeabilizacion se marcaron con ligando de SNAP y se observaron usando microscopfa de fluorescencia. Se caracterizaron los clones de la biblioteca en cuatro categonas con base en su expresion y distribucion celular del SNAP reportero, cuyos ejemplos pueden observarse en la Figura 20.

15 1) sin expresion de SNAP

2) expresion moderada/alta de SNAP en cuerpos de inclusion agregados (Figura 20, panel izquierdo)

3) expresion debil de SNAP con localizacion en la pared celular (Figura 20, panel central)

4) expresion alta de SNAP con localizacion en la pared celular (Figura 20, panel derecho)

Solamente los clones con expresion y solubilidad alta fueron analizados adicionalmente. Sin embargo, como la 20 expresion debil del reportero SNAP puede deberse a expresion ineficiente de una protema no optimizada para expresion en E. coli. se espera que una proporcion de estos clones pruebe ser excelente para expresion de bibliotecas citoplasmaticas solubles si se optimiza su uso de codon.

Se secuenciaron clones con alta expresion del reportero SNAP y una distribucion uniforme alrededor de la pared celular de celulas permeabilizadas para confirmar la presencia de un inserto de scFv que estaba en el marco de traduccion 25 correcto con el resto de la protema de fusion. En todos los 21 clones analizados, se encontro que el inserto de scFv era de longitud completa, con la longitud correcta de la region enlazadora de glicina/serina y en el marco de lectura correcto para la traduccion de toda la protema de fusion. Esto sugirio que el metodo de cribado de acuerdo con una realizacion de la invencion identificaba correctamente los genes de scFv de raton que se expresaron en una forma soluble en el citoplasma de celulas de E. coli. Para confirmar que las protemas de scFv aisladas de la biblioteca eran solubles en el 30 citoplasma de E. coli fueron transportados desde el constructo de la biblioteca hasta un vector de expresion inducible por arabinosa con un epttopo FLAG del extremo terminal C con una region espaciadora interviniente ya sea de I27-RL6 o RL6.

Despues de la induccion de la expresion de la protema por arabinosa, se extrajeron las protemas de fusion scFv::I27::RL6: FLAG o scFv::RL6: FLAG solubles con 8TGP al 0,5%. El material celular insoluble se sedimento y se 35 resuspendio en regulador de carga de SDS-PAGE con p-mercaptoetanol por sonicacion de la muestra y se calento a 95°C durante 5 minutos. Se cargaron volumenes iguales de cada fraccion en geles de SDS-PAGE al 10% y se sometieron a electroforesis. Las protemas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, que se bloquearon a continuacion con leche en polvo desnatada al 5%. Se probo la expresion de protema recombinante usando una dilucion 1: 1000 de un anticuerpo aFLAG de oveja (Sigma) seguido por un anticuerpo secundario conjugado con anti- 40 HRP de raton. Se uso deteccion de quimioluminiscencia.

La Figura 21 demuestra que el metodo de acuerdo con la realizacion de la invencion es capaz de identificar genes de scFv que se expresan en una forma principalmente soluble dentro del citoplasma bacteriano. La transferencia tipo Western de los perfiles de expresion se compara en cada muestra con la microscopfa de fluorescencia detectada por el ligando de SNAP para el constructo scFv::I27::RL6::FLAG.

45 Ejemplo 15. Generacion del lisogeno P2 en la cepa Argentum de E. coli

Se creo un lisogeno P2 de Argentum (K12; AmcrAA (mrr-hsdRMS-mcrBC) AendAlacZAM15) por excrecencia a partir de una sola placa de P2 sobre una capa de celulas de Argentum. Se realizo la infeccion del fagos como lo describen Kahn y colaboradores (1991).

Ejemplo 16. Desactivacion de AYK de P2

50 a. Generacion por recombinacion homologa

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15

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35

40

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50

El bacteriofago P2 tiene genes para un sistema putativo de holina y lisina, similar al sistema de lisis caracterizado para muchos bacteriofagos ltticos y lisogenicos. La holina proporciona acceso a traves de la membrana interna al espacio periplasmico para que la enzima lisina degrade la pared celular de mureina.

El gen K de P2 (SEQ ID NO: 17) y el gen Y (SEQ ID NO: 18) codifican lisozima y holina putativas, respectivamente. Estos genes fueron suprimidos usando recombinacion homologa en forma similar a como lo describen Hamilton y colaboradores (1989). Las regiones de flanqueo de homologfa se seleccionaron a partir del genoma de P2 (secuencia del GenBank NC_001895.1) y se clonaron entre un casete de seleccion de kanamicina flanqueado por FRT. La region de reemplazo del genoma de P2 fue de 6.721 a 7.487 pb.

Despues del reemplazo de los genes YK objetivo, se elimino el casete de kanamicina mediante FLP recombinasa expresada a partir del plasmido pCP20, como lo describen Cherepanov y Wackernagel (1995). La cepa resultante tema una supresion de los genes YK con un peptido corto de 20 mer que permaneda como el unico ORF.

La cepa K12 P2 AYK se ensayo funcionalmente mediante infeccion con el bacteriofago P4. Se infectaron cultivos de Argentum (P2) y Argentum (P2 AYK) con 103 pfu del bacteriofago P4 y se vertieron en la parte superior de las placas de agar. Se observo que se forman placas en los cultivos de Argentum (P2) pero no de Argentum (P2 AYK).

b. Ensayo utilizando P4 vir1 y Ready-Lyse

Para probar la funcionalidad de la supresion de YK del bacteriofago P2 (P2 AYK) para replicar y empaquetar un bacteriofago P4 infectante, se infecto la cepa P2 AYK con el mutante P4, P4Wr1, que tiene una mutacion que aumenta la transcripcion de la region de control de P4 y tiene un fenotipo de placa clara.

Las celulas de P2 AYK se cultivaron hasta fase logantmica temprana y se suplementaron con CaCl21 mM. Se anadio 1 |jL de un sobrenadante lisado que contema 109 pfu/mL del bacteriofago P4 vir1 a 1 mL de cultivo de P2 AYK y se incubo durante 80 minutos a 37°C. Se centrifugo la suspension para sedimentar las celulas, se desecho el sobrenadante y se lavo el precipitado tres veces en medio LB que contema EGTA 0,08 mM y MgCh 2,5 mM para remover el P4vir1 no unido. Las celulas se resuspendieron en 1 mL de medio LB y luego se dividieron en tres muestras. Se mantuvo una muestra sin tratamiento adicional (Muestra 1, no permeabilizada). Las muestras 2 y 3 se trataron adicionalmente por precipitacion y resuspension en LB suplementado con 0,5% del detergente 8TGP para permeabilizar tanto las membranas interna como externa. Las celulas fueron luego sedimentadas y lavadas dos veces en medio LB no suplementado. Los sedimentos de celulas lavadas permeabilizadas se resuspendieron en medio LB. La muestra 2 (permeabilizada) se mantuvo sin tratamiento adicional. La muestra 3 (permeabilizada; lisozima) se trato adicionalmente con 0,5 |jL de Ready-Lyse (Epicenter, EE.UU.), que es una lisozima recombinante. La rapida disminucion de la turbidez indico que la pared celular de peptidoglicano se degradada por Ready-Lyse y que cualquier partfcula P4 vir empaquetada se liberana en el lisado.

Se anadieron luego 10 jL de cada una de las muestras 1 y 2 y 0,1 jL de la muestra 3 (una dilucion del lisado sin purificar) a 200 jL de celulas K12 frescas (P2) suplementadas con CaCl2 1 mM. Las celulas se incubaron a 37°C durante 20 minutos, luego se anadieron 7 mL de agar de la parte superior (medio LB,% de agar) y se vertieron sobre placas de LB previamente calentadas. Las placas se incubaron durante la noche a 37°C y se determino la presencia de placas de P4vir1 en el cultivo de K12 determinado la manana siguiente.

La muestra 1, que representaba celulas infectadas con P4 que no habfan sido permeabilizadas, produjo 83 colonias en la placa superior de agar. La muestra 2, que representa celulas infectadas con P4 que habfan sido permeabilizadas por detergente, produjo 34 colonias. La muestra 3, que representa celulas infectadas con P4 que habfan sido permeabilizadas por el detergente y luego degradada la pared celular por la lisozima, produjo 168 colonias.

Ajustando la dilucion de la muestra, las celulas P2 AYK tratadas con lisozima permeabilizadas (Muestra 3), tema 200 veces mas bacteriofago P4vir1 que la Muestra 1 y 500 veces mas bacteriofago P4 vir1 que la Muestra 2.

La presencia del bacteriofago P4vir1 competente para la replicacion en celulas P2 AYK K12 infectadas demostro que la supresion de los genes de lisis de YK no evito la replicacion del genoma de P4vir1, o el montaje de partfculas funcionales de bacteriofago. Sin embargo, la supresion de los genes de lisis de YK evito la liberacion de las partfculas de bacteriofago ensambladas a partir de las celulas infectadas. La permeabilizacion de las membranas celulares interna y externa, lograda mediante el tratamiento con detergente, no produjo la liberacion de partfculas de bacteriofago en solucion. Sin embargo, el tratamiento de las celulas permeabilizadas con una lisozima libero bacteriofago infeccioso en solucion.

Ejemplo 17. Colisogeno P2 AYK/P4 con activador inducible a. Generacion de un colisogeno P2/P4 en celulas C1a

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Historicamente, la cepa utilizada para experimentar con el bacteriofago P2 y su satelite, P4, es la cepa C de E. coli (Wiman y colaboradores, 1970). Utilizando un derivado de la cepa C, C1a (Sasaki y Bertani, 1965), se establecio un lisogeno P2 mediante subclonacion de celulas lisogenizadas a partir de colonias de P2, como se ha descrito anteriormente. De forma similar, se establecieron colisogenos P4 de la cepa C1a P2.

Una cepa de colisogeno P2/P4 tiene ambos profagos bajo represion transcripcional. Para usar esta cepa para empaquetar de forma inducible un plasmido de una biblioteca de cosmidos, es necesario activar ambos fagos. Para el otro fago templado bien caracterizado, lambda, la liberacion de represion se produce con la inactivacion de la protema represora, cl, ya sea mediante escision mediada por RecA/LexA o utilizando un represor mutante termolabil, cI857. Sin embargo, P2 se conoce como un fago no inducible en el sentido de que no es sensible a la depresion por inactivacion de su represor, presumiblemente debido a que es incapaz de coordinar la escision del genoma con transcripcion genica estructural de replicacion (Bertani, 1968). Sin embargo, el fago satelite P4 infectante tiene mecanismos de activacion del profago P2 reprimido tras la entrada. La protema P4s (epsilon) actua como un antirrepresor a traves de la union con la protema represora P2. Ademas, la protema P4 6 (delta) es un potente activador de operones estructurales P2, siendo una duplicacion fusionada en tandem del activador de transcripcion P2 ogr. Sin embargo, un profago P4 tiene un control complejo y estricto tanto de su propia activacion como de la activacion de P2.

El profago P4 usa la interaccion entre un represor transcripcional, la protema Vis, en su propio promotor y los genes Eta y cl secuencia abajo que se basan en el acoplamiento de transcripcion y traduccion para producir un complejo inhibidor con base en el aRn de cl. En ultima instancia, este complejo actua para bloquear la expresion de la protema P4s, que es un antagonista de union de la protema represora P2.

La desrepresion de los profagos P4 y P2 requiere la inhibicion del represor P2 por la protema P4s. El P2 activado a su vez produce los activadores de la transcripcion de Cox y Ogr que actuan in en trans para promover la transcripcion del gen P4 6, que activa adicionalmente P4 a traves del promotor Vis y actua tambien en trans sobre los operones del gen estructural P2.

En un sistema tan complejo, con muchos elementos que interaccionan para reforzar sus efectos combinados, una celula que contiene ambos profagos reprimidos, P2 y P4, debe controlar estrechamente la expresion de todos los genes activadores para evitar que se produzca un efecto de retroalimentacion positiva. Los activadores potenciales de los profagos incluyen los activadores de transcripcion P2cox, P2ogr y P4 6, asf como el antirrepresor P4s.

Los tres activadores de transcripcion se clonaron bajo el control transcripcional estrecho proporcionado por el alelo sensible a la temperatura del represor del fago A, cI857. El origen de replicacion del plasmido pACYC184 de bajo numero de copias compatible con el origen pUC permite el mantenimiento del activador inducible junto con un plasmido de biblioteca con base en pUC.

Se transformo el colisogeno C1a P2/P4 con los constructos de expresion inducibles y se cultivo a 30°C. Los cultivos se hicieron crecer hasta la fase logantmica temprana antes de la induccion mediante cambio de temperatura a 42°C durante 20 minutos, antes del crecimiento a 37°C hasta que se produjo la lisis.

Los tres activadores fueron capaces de inducir lisis en un colisogeno, aunque el gen P4 6 demostro lisis mas temprana, seguida por el ogr y luego cox. La secuencia de polinucleotidos de P4 6 inducible por temperatura se proporciona en la SEQ ID NO: 19.

La produccion de partmulas del bacteriofago P4 infeccioso se confirmo mediante titulacion del lisado contra a cultivos de lisogeno C1a P2. Se determino que el tftulo de P4 era > 109 pfu/mL.

Ejemplo 18. P2 AYK con transmision de cosmidos

Para utilizar el sistema P2/P4 para el cribado y transmision de la biblioteca genica, se construyo un vector que contema la region P4 cos. Se amplifico una region de 389 pb a partir de P4 que parte del gen psu que se extiende sobre el sitio de escision de cos, y hasta el gen gop (11461 pb hasta 225 pb del genoma de P4; numero de acceso del NCBI NC_001609) por PCR y se clono en un vector plasmido de origen pUC de alto numero de copias. Se verifico la identidad de la region P4 cos por secuenciacion. El vector tambien contema al gen arac y al promotor inducible por arabinosa que controla la expresion del sistema de cribado intracelular de una biblioteca como se describe en la solicitud de patente No. PCT/AU2010/001702.

Al igual que con todos los vectores cosmidos, ya sea para bacteriofagos P2, P4 o A, existe un tamano mmimo para el empaquetamiento en la cabeza de la capside para producir una unidad transmisiva viable. Para P4, esto se ha determinado que es de aproximadamente 9,2 kb (Kim y Song, 2006). Para lograr este tamano mmimo para empaquetamiento en una cabeza de capside P4, se aumento el tamano total del vector cosmfdo se aumento hasta 10,7 kb, mas cerca del tamano del genoma P4 de tipo silvestre de 11,6 kb, por clonacion en un fragmento de 'relleno' de 4,3 kb de ADN genomico de E. coli.

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Para demostrar el empaquetamiento conjunto del vector cosirftdo residente en un colisogeno C1a P2 AYK/P4, se transformo la cepa con el vector cosmido resistente a ampicilina con cadena principal de pUC as^ como el vector resistente a cloranfenicol con cadena principal de pACYC184, con el gen P4 6 inducible por temperature.

La cepa con ambos colisogenos y ambos plasmidos se cultivo a 30°C hasta fase logarftmica temprana antes inducir protema P4 6 por cambio de temperatura a 42°C durante 20 minutos, seguido de crecimiento a 37°C durante 1 hora. Como control, se indujo tambien una cepa que contema un plasmido de biblioteca sin la region P4 cos y el fragmento de relleno para empaquetamiento de la capside P4.

Para liberar los cosmidos empaquetados y el bacteriofago P4, se sedimentaron y resuspendieron las celulas inducidas en medio de permeabilizacion (medio lB + 8TGP al 0,5%) durante 10 minutos a temperatura ambiente (~ 25°C). Despues de la permeabilizacion, se sedimentaron y resuspendieron en LB y se anadio 0,5 pL de lisozima Ready-Lyse para digerir la pared celular. La lisis se confirmo por la disminucion de la turbidez. Tambien se confirmo que el cloroformo era tambien eficaz en la permeabilizacion de la celula para la accion de Ready-Lyse en la pared celular. Los cosmidos empaquetados y el bacteriofago P4 se titularon por infeccion de lisogenos C1a y C1a P2, respectivamente.

Se confirmo que el cosmido de la biblioteca se empaqueto en cantidades aproximadamente iguales que el profago P4 residente en celulas P2 6 YK inducidas, ya que se obtuvieron aproximadamente el mismo numero de colonias resistentes a los antibioticos de la recuperacion del cosmido comparado con las colonias de P4. No se obtuvieron colonias de la infeccion con un lisado preparado a partir de la cepa que portaba el plasmido de la biblioteca que carecfa de una region de P4 cos y un fragmento de relleno.

Tambien se observo que, a diferencia de la pobre estabilidad del bacteriofago P4 o de los cosmidos empaquetados en lisados no purificados de celulas C1a P2 lisadas (almacenadas a 4°C en medio LB con Mg/EGTA), presumiblemente debido a la accion de proteasas celulares tambien en el lisado, el bacteriofago P4 y los cosmidos empaquetados liberados de las celulas P2 6 YK que fueron primero permeabilizadas y lavadas, antes de ser lisadas por la accion de la lisozima anadida en forma exogena (Ready-Lyse), eran estables a temperatura ambiente, con solamente una cafda menor en el tftulo despues de dos dfas. Esto es presumiblemente debido a la liberacion de las proteasas antes mencionadas de las celulas permeabilizadas que son retiradas por lavado de las partmulas infecciosas que son retenidas por la pared celular durante las etapas de precipitacion y cambio de medios. Por lo tanto, se pueden producir facilmente un alto tftulo de partmulas de cosmidos por induccion de temperatura, permeabilizacion y cambio de medio, y manteniendo un tftulo estable sin requerir etapas de purificacion por ultracentrifugacion prolongada segun protocolos estandar de bacteriofagos.

Ejemplo 19 Permeabilizacion de E. coli usando disolventes organicos

Ademas de la permeabilizacion de celulas Gram negativas usando detergentes, otros agentes qmmicos para interrumpir la integridad de la membrana podnan ser los disolventes organicos lipofilos. Los disolventes organicos han sido utilizados sustancialmente en la tecnica anterior en la permeabilizacion y fijacion celular para inmunomarcacion por microscopfa (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). En el metodo de acuerdo con una realizacion de la invencion, la membrana celular se permeabiliza para la entrada de grandes complejos de inmunoglobulina que se unen a objetivos intracelulares.

En particular, el disolvente organico cloroformo tambien se ha usado para matar selectivamente celulas bacterianas en una suspension de celulas/bacteriofagos, presumiblemente a traves de la permeabilizacion de las membranas celulares (Sambrook y colaboradores, 2001). El cloroformo tambien se ha usado en genetica de bacteriofagos lfticos para permitir el rescate de mutantes de holina que fueron incapaces de permeabilizar la membrana interna para liberar lisozima del citoplasma celular para liberacion de bacteriofagos (Ziermann y colaboradores, 1994). De forma similar, se uso para rescatar mutantes de lisozima que eran incapaces de hidrolizar la pared celular de peptidoglicano mediante permeabilizacion de la membrana externa para permitir la entrada activa de la lisozima exogena al periplasma (Ziermann y colaboradores, 1994). Por lo tanto, el cloroformo fue capaz en forma demostrable de permitir al menos el paso de lisozimas pequenos (~ 15 kD) a traves de las membranas tanto interna como externa de la celula de E. coli Gram-negativa.

Para ensayar disolventes organicos para la permeabilizacion de las membranas celulares para su uso en expresion intracelular descrita por el metodo de acuerdo con una realizacion de la invencion, se suspendieron celulas de E. coli que expresan la protema de fusion aGFP::RL6::KzPG::SNAP::DBP (expresion inducida como se describe para el Ejemplo 8) en mezclas acuosas de disolventes organicos. La permeabilizacion de la membrana se indico mediante la union de un ligando fluorescente de union al ADN de pequeno peso molecular, Gel Red, y de una protema de 30 kD, eGFP.

Aunque algunos disolventes organicos permanecen miscibles en agua (por ejemplo, los alcoholes de cadena mas corta), otros son en gran medida inmiscibles y la mezcla se divide en fases acuosa y no acuosa (por ejemplo, cloroformo

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y butanol). La division de la fase representa la saturacion de la baja solubilidad del disolvente organico en la fase acuosa.

Las celulas que expresan la protema de fusion aGFP::RL6::KzPG::SNAP::DBP se recogieron por centrifugacion y se permeabilizaron con una de las siguientes composiciones de disolvente durante 10 minutos a 25°C. Se utilizo medio de crecimiento LB para el componente acuoso de la mezcla. Tambien se realizaron controles regulados con Tris.

10% de Etanol; 20% de etanol; 30% de Etanol

10% de Metanol; 20% de metanol; 30% de Metanol

10% de isopropanol; 20% de isopropanol; 30% de isopropanol

10% de DMSO; 20% de DMSO; 30% de DMSO

10% de Acetona; 10% de Acetona; 30% de Acetona

Butanol (1: 5)

Cloroformo (1: 5)

Tris 50 mM/LB (pH 7,0); Tris 1 M/LB (pH 7,0)

Despues del tratamiento con disolventes, se sedimentaron las celulas mediante centrifugacion, se lavaron una vez con medio LB por suspension, se sedimentaron por centrifugacion y luego se suspendieron en medio LB que contema tanto al fluoroforo de union al ADN de pequeno peso molecular, Gel Red (dilucion 1: 10.000 en agua), como eGFP. Despues de 20 minutos de incubacion a 25°C en medio para marcacion, se sedimentaron las celulas por centrifugacion, se lavaron en LB mediante resuspension, luego se observaron por microscopfa de fluorescencia. La Figura 22 demuestra que, de los disolventes organicos analizados, el cloroformo y el butanol permeabilizaron el E. coli para permitir que un ligando de peso molecular pequeno entre en el citoplasma (A), pero solo el cloroformo permitio la entrada de una protema de gran peso molecular (~ 30 kD).

Ejemplo 20. Expresion en la capside usando la protema de decoracion gpL de P2

Se detecto la protema gpL del bacteriofago P2 como un componente estructural de viriones maduros por espectrometna de masas (Chang y colaboradores, 2008) y se presume que es el equivalente funcional de la protema de la capside gpD del bacteriofago lambda, aunque las dos protemas no demuestran ninguna region de homologfa significativa mediante una alineacion por parejas mediante BLAST (NCBI). La protema gpD de lambda tiene una longitud de 110 residuos, mientras que la protema gpL de P2 tiene una longitud de 169 residuos.

Para evaluar si la protema gpL de P2 funcionana para la expresion en la capside, se fusiono la secuencia de aGFP: I27 con los extremos de los terminales N y C de gpL de P2 para crear las protemas de fusion enumeradas como las SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO : 21. La protema de fusion tambien inclma una etiqueta de epftopo FLAG que intercalaba los dominios gpL y aGFP: I27. La expresion de la protema de fusion se hizo inducible por arabinosa mediante clonacion de la secuencia genica secuencia abajo del el promotor de araBAD, con un regulador transcripcional araC secuencia arriba. La secuencia de ADN del vector de expresion aGFP: I27: gpL se enlista en la SEQ ID NO: 22.

El plasmido que codifica la protema de fusion aGFP: I27: gpL se transformo en un huesped K123 de E. coli que contiene un profago Hy5. El fago Hy5 es un Imbrido de los fagos relacionados P2 y 186 que contienen los genes estructurales de P2 bajo control transcripcional de 186 (Bradley y colaboradores, 1975; Younghusband y colaboradores, 1975). Ademas, el represor cl de Hy5 (186) es sensible a la temperatura, permitiendo la induccion por temperatura del crecimiento del fago.

La expresion de la protema de fusion aGFP: I27: gpL mediante arabinosa y analisis por SDS-PAGE produjo una banda superior de aproximadamente 55 kD, que era mayor que el tamano esperado de 44 kD que estaba tanto en las fracciones solubles como insolubles, y una banda inferior que estaba unicamente en la fraccion soluble (Figura 23).

Para demostrar que la protema de fusion aGFP: I27: gpL estaba unida a la capside del fago y era funcional para union mediante expresion en el fago, se calento la cepa del profago con el constructo de expresion a 45°C durante 15 minutos para activar la replicacion de Hy5. Despues del choque termico las muestras se desplazaron hacia abajo en temperatura para crecimiento a 32°C. Se indujo la expresion de la protema de fusion 30 minutos despues de la disminucion de la temperatura con la adicion de arabinosa a una concentracion de 0,2%. Se incubaron los cultivos durante un tiempo total de 70 minutos a 32°C para maxima liberacion de fagos.

Para captura del fago Hy5 que expresa la protema de fusion aGFP: I27: gpL, se marcaron primero las perlas Dynal recubiertas con estreptavidina (M-270, catalogo No. 653-05, Life Technologies) con His6-GFP biotinilado y se lavaron completamente con TBS. La marcacion de las perlas Dynal con eGFP se confirmo mediante microscop^a de fluorescencia.

5 La Tabla 2 enumera los resultados de la expresion de la protema de fusion gpL en la captura de fagos Hy5 por las perlas Dynal. Estos datos demuestran que la fusion del anticuerpo aGFP con la protema de la capside gpL de P2 da lugar a un enriquecimiento de 82 veces por las perlas de Dynal sobre el fagos que se empaquetan usando la protema gpL de tipo silvestre. Ademas, incluso la muestra no inducida con un nivel no detectable de expresion de la protema de fusion (figura 23, muestra 1) fue aun purificada por afinidad con un nivel significativo por encima del control, lo que 10 sugiere que incluso un nivel muy bajo de expresion resulto en una captura de fago.

Tabla 2. Enriquecimiento del fago Hy5 que expresa la protema de fusion de la capside gpL sobre el control Hy5

Tftulo del patron Rendimiento de exploracion Enriquecimiento (numero

(PFU/mL) (PFU) de veces sobre Hy5)

Hy5

3.5 x 109 93 (muestra de referencia)

Hy5 + (GFP:I27:gpL (no inducida)

1.2 x 109 202 6.5 3

Hy5 + <GFP:I27:gpL (inducida)

1.1 x 109 2,550 82 3

Ejemplo 21. Supresion de los genes de lisis SR de fase lambda

Los genes de lisis de fase lambda se localizan en el brazo derecho del genoma en una agrupacion que contiene los 15 genes S'/S (holina (SEQ ID NO: 23) anti-holina), R (endolisina (SEQ ID NO: 24 )), Rz/Rz1 (requeridos para lisis en ciertos medios). La agrupacion de lisis esta dentro de una gran unidad transcripcional mas grande transcrita desde el promotor pR que es responsable de la transcripcion de todos los genes estructurales y ltticos de lambda. El ARNm de pR' es un solo transcrito que cubre por lo tanto aproximadamente la mitad del genoma lambda. Para inactivar los genes de lisis se decidio suprimir los genes usando recombinacion homologa. Para permitir la seleccion facil de los mutantes 20 lambda los genes de lisis fueron reemplazados por un gen de resistencia a la kanamicina (KanR). Sin embargo, para asegurar que no se insertaran secuencias promotoras o terminadoras de transcripcion que tuvieran como resultado una expresion genica estructural del profago que pudiera ser perjudicial para la viabilidad celular, tambien se suprimio el gen vecino bor no esencial. El gen bor, que confiere resistencia al suero a la celula huesped de E. coli, es expresado constitutivamente en el profago en direccion opuesta a la pR' bajo su propio promotor (Barondess y Beckwith, 1995). 25 Utilizando fragmentos gBlocks sinteticos (IDT), se diseno un truncamiento de la agrupacion de lisis con una fusion del codon de inicio del gen KanR con el codon de inicio del gen bor. La unica secuencia que permanece de la agrupacion de lisis lambda de esta supresion fue un peptido truncado de secuencia MKMPEKQLEgTqKYINEQCR (SEQ ID NO: 25). La secuencia de ADN del constructo de supresion de lisis con brazos sinteticos y casete KanR se enlista como la SEQ ID NO: 27.

30 Los brazos de homologfa sintetica y el casete KanR se clonaron en el vector de clonacion de PCR con base en pUC, pAcquire (Alchemy Biosciences, Melbourne, Australia), y se verificaron mediante secuenciacion.

Para llevar a cabo la supresion de la agrupacion de lisis lambda, se transformo el constructo en un lisogeno cI857sam7 lambda de la cepa de E. coli ED8739 (F-, metB, hsdS, supE, supF) y se indujo la lisis del fago por induccion de temperatura (42°C, 10 min) seguido por el cultivo a 37°C durante 1 hora. Se clarifico por centrifugacion 1 mL del 35 sobrenadante que contema el fago y se anadio 1 gota de cloroformo. Se infecto luego un cultivo de ED8739 con suplemento de magnesio (10 mM) y maltosa (0,1%) con diluciones del lisado del fago y se recuperaron los lisogenos por excrecencia a 30°C durante 2 horas antes de la siembra en placa de agar con LB + kanamicina (15 pg/mL) que se cultivaron durante 16 horas a 30°C. Como el plasmido objetivo fue lo suficientemente pequeno para los recombinantes lambda::, que se empaquetan como fago viable, se cribaron por lo tanto las colonias de profago resistentes a la 40 kanamicina por la perdida del gen de resistencia a la ampicilina (es decir, KanR/AmpS) que indicana un evento de recombinacion homologa entre ambos brazos de homologfa del constructo objetivo, cortando la agrupacion de lisis y reemplazandola con el casete de kanamicina segun se desee. Se identifico el profago KanR/AmpS y para confirmar que se efectuo la supresion sin mutaciones no deseadas, se amplifico la region mediante PCR y se secuencio. Se encontro que todos los clones eran correctos segun lo disenado.

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Ejemplo 22. Empaquetamiento del genoma del ASR lambda

Para demostrar que la supresion de la agrupacion de lisis aun produda el mismo numero de fagos empaquetados viables por celula (es decir, que el transcrito pR 'modificado no afecto la produccion de las protemas estructurales del fago), se cultivo el profago cI857sam7ASR lambda junto con el profago cI857sam7 lambda a 30°C hasta una densidad celular identica y se indujo la produccion del fago mediante induccion por temperatura (42°C, 10 minutos) seguido de crecimiento a 37°C durante 1 hora. Como se esperaba, el cultivo de cI857sam7 lambda lisado hasta completarse, mientras que el cI857sam7ASR lambda fallo en la lisis. Se recolecto el cultivo de cI857sam7ASR lambda mediante centrifugacion y se resuspendio en LB + 8TGP al 0,5% y se incubo a 25°C durante 10 minutos. Se recolectaron luego las celulas permeabilizadas por centrifugacion, se lavaron una vez con LB + MgSO4 10 mM y se resuspendieron en el volumen original de 1 mL de LB + MgSO4 10 mM y se lisaron usando 0,5 pL de Ready-Lyse (Epicenter). Se anadio una gotita de cloroformo a cada lisado para matar cualquiera de las celulas viables restantes y se titulo el fago usando diluciones en serie infectadas en cultivos de ED8739 y se sembraron en placa sobre agar superior de LB suplementado con MgSO4 10 mM y maltosa al 0,1%. Las placas se cultivaron durante 16 horas a 37°C antes de contar las colonias. Tanto, el profago cI857sam7 lambda como el profago cI857sam7ASR lambda produjeron tttulos de fago de ~ 1 x 109 pfu/mL lo que demuestra que la supresion de la agrupacion de lisis ASR lambda, y la correspondiente insercion de un gen de kanamicina en la direccion transcripcional opuesta, no perturbaron la transcripcion o la traduccion de los genes estructurales.

Ejemplo 23. Expresion en la capside del fago ASR lambda

La expresion en la capside usando el gen gpD lambda ha sido bien documentada en la literatura, al igual que los metodos de exploracion de fagos para la union de objetivos usando la expresion de gpD. Sin embargo, la combinacion del uso de la expresion en capside con fago de lisis defectuosa no ha sido propuesta antes de esta solicitud. Ademas, la combinacion de la expresion en capside con el fago de lisis defectuosa en celulas permeabilizadas de acuerdo con una realizacion del metodo de la invencion permite el cribado para union objetivo a la capside del fago mediante deteccion por FACS, que es un metodo de alto rendimiento de caracterizacion clonal.

Para demostrar la union del objetivo con el fago de lisis defectuosa retenido dentro de las celulas permeabilizadas, se fusiono una secuencia que codifica un anticuerpo monocatenario (scFv) que se une a una protema fluorescente relacionada con GFP, mAG1 (Karasawa y colaboradores, 2003), con el extremo 3' del gen gpD lambda. El scFv de a- mAG1 es una clase rara de anticuerpo que es soluble y estable cuando se expresa en el citoplasma bacteriano en un estado reducido. Se fusiono un epftopo FLAG al extremo terminal C de la protema de fusion gpD::a-mAG1 y se demostro que la protema soluble de longitud completa se expresaba en el citoplasma de celulas de E. coli utilizando un anticuerpo monoclonal aFLAG.

Se construyo un cosmido lambda que expresa la protema de fusion gpD::a-mAG1 a partir del promotor araBAD, bajo represion por la protema araC e inducible por arabinosa. El cosmido tambien contema caractensticas comunes con otros vectores cosmidos comercialmente disponibles, y en forma privada, de la region cos lambda (SEQ ID NO: 26), del origen de replicacion del plasmido bacteriano y genes de resistencia a antibioticos (AmpR y ChlR). Tambien contema un fragmento de relleno para permitir el empaquetamiento del fago in vivo. Un ejemplo de vectores cosmidos comercialmente disponible es pFOS1 (New England BioLabs (NEB)).

Se transformo el cosmido gpD::a-mAG1 en una cepa de E. coli ED8739 que contema al profago cI857ASR lambda y se cultivo a 30°C para crecimiento vegetativo. Para inducir las funciones del fago, se cultivo la cepa en medio LB a una densidad baja, luego se calento a 42°C durante 15 minutos, antes del cultivo a 31°C durante 75 minutos. La induccion de la protema de fusion gpD::a-mAG1 se inicio inmediatamente despues de la incubacion a 42°C mediante la adicion de arabinosa al 0,2% p/v. Al completarse el crecimiento y empaquetamiento del fago, se permeabilizaron las celulas mediante el metodo segun una realizacion de la invencion mediante centrifugacion y resuspension en 0,3 volumenes de LB + 8TGP al 0,5% durante 10 minutos a 25°C. Luego se centrifugaron nuevamente las celulas y se lavaron en 1 x volumen de TBS + MgSO4 10 mM (TBS/Mg), antes de ser sedimentadas y suspendidas en TBS/Mg con exceso de protema mAG1 durante 20 minutos. Despues de la union de mAG1, se limpiaron las celulas mediante el lavado de mAG1 no unido con TBS/Mg antes de ser suspendidas para su visualizacion por microscopfa o para analisis por FACS.

La Figura 24 demuestra que la expresion lambda polivalente, cuando se encapsula en celulas permeabilizadas y se prueba con objetivo fluorescente, genera una senal suficientemente fuerte para la deteccion visual mediante microscopfa de fluorescencia. Cada celula bacteriana demostro una marcacion puntual entre 10 y 30 focos. Estos focos solo se observaron en celulas que expresan la protema de fusion gpD::a-mAG1 y se indujeron para el fago. Los focos no se observaron dentro de las celulas que no expresaban la protema de fusion, o no se indujeron para el fago cuando se probaron con la protema mAG1. De forma similar, el fago marcado con gpD::a-mAG1 no se unio a la protema fluorescente relacionada, GFP. Dado que el tamano rafaga del fago lambda de tipo silvestre es de 100 a 200 copias por celula y suponiendo que los fagos estan concentrados solo dentro de unas pocas regiones de la celula, entonces cada uno de los focos puede contener entre 3 y 20 fagos. Esta estimacion puede ser conservadora ya que el tamano de rafaga del fago de lisis defectuosa puede ser mayor dado que se permite que la replicacion persista mas alla del tiempo normal de lisis. Por lo tanto, la expresion polivalente del fago encapsulado de lisis defectuosa, como se describe por el

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metodo de acuerdo con una realizacion de la invencion, permite la deteccion directa de la union a protemas marcadas con fluoroforo por microso^a optica.

Dado que la sensibilidad de la instrumentacion FACS es superior a la obtencion de imagenes por microscop^a convencional, entonces se esperaba que la deteccion y recoleccion de las celulas que conteman el fago marcado, de aquellas que no estaban marcadas, sena facilmente realizada dada la intensidad de la senal ya observada por microso^a optica. La Figura 25 muestra el grafico de fluorescencia para 100 K eventos en un FACS de afluencia (BD Biosciences) con una entrada de ~1% de celulas positivas para a-mAG1. La poblacion de celulas ha sido tenida conjuntamente con el colorante de union a ADN, Gel Red y la protema mAG1 fluorescente. La poblacion cerrada de P2 es positiva para a-mAG1- y la poblacion cerrada de P3 es negativa para a-mAG1.

Se recupero la salida posterior a FACS mediante la adicion de la enzima Ready-Lyse seguida por infeccion en celulas ED8739 cI857ASR lambda. Se registro una recuperacion de aproximadamente 10 partfculas de fago por evento positivo.

Por lo tanto, el cribado por FACS de alto rendimiento del fago encapsulado de expresion en capside se hace posible usando el metodo de acuerdo con una realizacion de la invencion.

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Claims (15)

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   Reivindicaciones

   1. Un metodo de cribado de un polipeptido para una actividad deseada contra una molecula objetivo, comprendiendo el metodo:

   a) cultivar una celula bacteriana Gram negativa que comprende un polinucleotido exogeno que codifica el polipeptido de manera que el polipeptido se produzca en la celula,

   b) permitir que un fago de lisis defectuosa empaquete el polinucleotido que codifica el polipeptido, en el que el fago de lisis defectuosa se retiene dentro de la celula bacteriana,

   c) permeabilizacion:

   i) de la membrana externa de la celula bacteriana, o

   ii) de las membranas interna y externa de la celula bacteriana,

   d) poner en contacto la celula bacteriana con la molecula objetivo, y

   e) cribar el polipeptido para la actividad deseada,

   en donde se retiene el polipeptido dentro de la celula bacteriana por la pared celular bacteriana o membrana interna y/o el polipeptido se une a la pared de la celula bacteriana o a la membrana interna.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el polipeptido esta asociado con al menos un segundo polipeptido para formar un complejo proteico que se retiene dentro de la celula bacteriana permeabilizada y/o esta unido a la pared celular bacteriana.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde las membranas bacterianas interna y externa se permeabilizan con uno o mas detergentes o un disolvente organico.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en donde:

   i) la membrana bacteriana externa esta permeabilizada;

   ii) la pared celular bacteriana esta al menos parcialmente hidrolizada; y

   iii) el polipeptido esta unido a la membrana interna.
5. 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el polinucleotido que codifica el polipeptido es un ADN de plasmido, cosmido, fagemido o fago.
6. 6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el fago de lisis defectuosa es un fago templado seleccionado entre el fago lambda, 186, P2, un hnbrido de 186 y P2, y P4 y/o donde el fago de lisis defectuosa es un profago.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en donde permitir que el fago de lisis defectuosa empaquete al polinucleotido comprende inducir la activacion del profago en la celula bacteriana para producir un fago, en donde el fago empaqueta al polinucleotido y/o en donde inducir la activacion del profago comprende producir una o mas protemas activadoras de fagos en la celula bacteriana.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en donde la induccion de la activacion del profago comprende inactivar una o mas protemas represoras de fagos en la celula bacteriana.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en donde el fago es de lisis defectuosa debido a la supresion o mutacion a una forma inactiva del gen de la lisozima, o supresion o mutacion a una forma inactiva de los genes de holina y lisozima.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 8, en donde la celula bacteriana comprende al profago lambda y la induccion de la activacion del profago comprende la inactivacion de un alelo represor sensible a la temperatura de la protema cl en la celula bacteriana.

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11. 11. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el metodo comprende ademas un cribado adicional del polipeptido para una actividad deseada contra una molecula objetivo en una celula bacteriana Gram negativa, en donde

    i) el polinucleotido que codifica al polipeptido no esta empaqueta en un fago de lisis defectuosa, y/o

    ii) el polipeptido no es retenido dentro de la celula bacteriana por la pared celular bacteriana y/o unido a la pared celular bacteriana.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en donde el cribado adicional se realiza usando un fago lftico o templado para empaquetar al polinucleotido que codifica al polipeptido.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en donde la celula bacteriana en el cribado adicional se lisa para liberar al fago.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 13, en donde

    i) el fago lftico comprende una primera pareja de union en la capa del fago, y

    ii) el polipeptido que se criba para una actividad deseada es una protema de fusion que comprende una segunda pareja de union,

    en donde la protema de fusion que comprende la segunda pareja de union se une a la primera pareja de union en la capa del fago lftico.
15. 15. El metodo de la reivindicacion 14, en donde la primera pareja de union es calmodulina y la segundo pareja de union es un peptido de union a calmodulina.