ES2609234T3

ES2609234T3 - Predicción de la probabilidad de recidiva de cáncer

Info

Publication number: ES2609234T3
Application number: ES14163233.1T
Authority: ES
Inventors: Joffre Baker; John L. Bryant; Soonmyung Paik; Steve Shak
Original assignee: Genomic Health Inc; NSABP Foundation Inc
Current assignee: Genomic Health Inc; NSABP Foundation Inc
Priority date: 2003-06-24
Filing date: 2004-06-17
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2024-06-17
Also published as: DK3170906T3; DK1641810T3; CA3061769C; EP2775000B1; DK3470535T3; US20060286565A1; US20200299781A1; ES2488845T5; ES2488845T3; HK1231521A1; EP3170906A1; CA2530738A1; ES2690168T3; US20180051348A1; HK1201569A1; WO2005039382A2; EP3470535A1; HUE050365T2; CA2530738C; EP3170906B1

Abstract

Un método de predicción de la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad de un paciente con cáncer de mama ductal invasivo, de ganglios negativos, positivo para ER, que comprende determinar el nivel de expresión del transcrito de ARN de STMY3 en una muestra de célula o tejido de cáncer de mama obtenida del paciente, normalizado frente al nivel de expresión de un conjunto de referencia de transcritos de ARN comparando el nivel de expresión normalizado de STMY3 del paciente con un nivel de expresión normalizado de STMY3 en un conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama que comprende pacientes que (a) estaban vivos sin recidiva de cáncer de mama local, regional o distante, (b) estaban vivos con recidiva de cáncer de mama contralateral, (c) estaban vivos con un segundo cáncer primario distinto de mama, o (d) murieron antes de la recidiva de cáncer de mama, en el que un nivel de expresión normalizado aumentado de STMY3 del paciente indica una probabilidad reducida de supervivencia libre de enfermedad.

Description

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ARN total aislado de tumores o líneas celulares tumorales humanos, y tejidos o líneas celulares normales correspondientes, respectivamente. Por lo tanto, puede aislarse ARN de una variedad de tumores primarios, incluyendo tumor o líneas celulares tumorales de mama, pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, testículos, ovario, útero, etc., con ADN combinado de donantes sanos. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, puede extraerse ARNm, por ejemplo, de muestras de tejido incluidas en parafina congeladas o archivadas, y fijadas (por ejemplo fijadas en formalina).

En la técnica se conocen bien métodos generales para la extracción de ARNm y se desvelan en libros de texto convencionales de biología molecular, incluyendo Ausubel y col., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Se desvelan métodos para la extracción de ARN a partir de tejidos incluidos en parafina, por ejemplo, en Rupp y Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), y De Andrés y col., BioTechniques 18: 42044 (1995). En particular, el aislamiento de ARN puede realizarse usando un kit de purificación, conjunto de tampones y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, según las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, puede aislarse ARN total a partir de células en cultivo usando mini-columnas RNeasy de Qiagen. Otros kits de aislamiento de ARN disponibles en el mercado incluyen el kit de purificación de ADN y ARN completo MasterPure™ (EPICENTRE®, Madison, WI) y el kit de aislamiento de ARN de bloque de parafina (Ambion, Inc.). Puede aislarse el ARN total de muestras de tejido usando RNA Stat-60 (Tel-Test). El ARN preparado a partir del tumor puede aislarse, por ejemplo, mediante centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio.

Dado que el ARN no puede servir como molde para la PCR, la primera etapa en la obtención del perfil de expresión génica mediante RT-PCR es la transcripción inversa del molde de ARN para dar ADNc, seguido de su amplificación exponencial en una reacción de PCR. Las dos transcriptasas inversas más comúnmente usadas son transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). La etapa de transcripción inversa se ceba normalmente usando cebadores específicos, hexámeros al azar o cebadores de oligo-dT, dependiendo de las circunstancias y del objetivo de la obtención del perfil de expresión. Por ejemplo, ARN extraído puede someterse a transcripción inversa usando un kit de PCR de ARN de GeneAmp (Perkin Elmer, CA, Estados Unidos), siguiendo las instrucciones del fabricante. Después, puede usarse el ADNc derivado como molde en la reacción de PCR posterior.

Aunque la etapa de PCR puede usar una variedad de ADN polimerasas dependientes de ADN termoestables, normalmente emplea la ADN polimerasa de Taq, que tiene una actividad nucleasa en 5'-3' pero carece de actividad endonucleasa de corrección en 3'-5'. Por lo tanto, la PCR TaqMan® utiliza normalmente la actividad nucleasa en 5' de polimerasa de Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero puede usarse cualquier enzima con actividad nucleasa en 5' equivalente. Se usan dos cebadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típico de una reacción de PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar una secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no puede extenderse mediante la enzima ADN polimerasa de Taq, y está marcada con un tinte fluorescente indicador y un tinte fluorescente extintor. Cualquier emisión inducida por láser del tinte indicador se extingue por el tinte extintor cuando los dos tintes están ubicados cerca uno del otro como lo están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima ADN polimerasa de Taq escinde la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución y la señal del tinte indicador liberado está libre del efecto extintor del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de tinte indicador por cada nueva molécula sintetizada y la detección del tinte indicador no extinguido proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

La RT-PCR TaqMan® puede realizarse usando equipo disponible en el mercado, tal como, por ejemplo, ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una realización preferida, el procedimiento de nucleasa en 5' se realiza en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real tal como el ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™. El sistema consiste en un termociclador, un láser, un dispositivo de carga acoplada (CCD), una cámara y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, se recoge en tiempo real una señal fluorescente inducida por láser a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para hacer funcionar el instrumento y para analizar los datos.

Los datos del ensayo de nucleasa en 5' se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Como se ha analizado anteriormente, se registran los valores de fluorescencia durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese punto en la reacción de amplificación. El punto en el que se registra por primera vez que la señal fluorescente es estadísticamente significativa es el ciclo umbral (Ct).

Para minimizar errores y el efecto de la variación de muestra a muestra, la RT-PCR se realiza habitualmente usando un patrón interno. El patrón interno ideal se expresa a un nivel constante entre diferentes tejidos y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Los ARN usados con mayor

frecuencia para normalizar patrones de expresión génica son ARNm para los genes de mantenimiento gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y -actina.

Una variación más reciente de la técnica de RT-PCR es la PCR cuantitativa en tiempo real, que mide la acumulación de producto de PCR a través de una sonda fluorigénica con doble marcador (es decir, sonda TaqMan®). La PCR en tiempo real es compatible tanto con la PCR de competencia cuantitativa, en la que se usa un competidor interno para cada secuencia diana para la normalización, como con PCR comparativa cuantitativa que usa un gen de normalización contenido dentro de la muestra o un gen de mantenimiento para RT-PCR. Para más detalles, véase, por ejemplo Held y col., Genome Research 6: 986-994 (1996).

Las etapas de un protocolo representativo para obtener el perfil de expresión génica usando tejidos incluidos en parafina, fijados, como fuente de ARN, incluyendo aislamiento de ARNm, purificación, extensión por cebadores y amplificación, se facilitan en diversos artículos de revistas publicados {por ejemplo: T.E. Godfrey y col. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 [2000]; K. Specht y col., Am. J. Pathol. 158: 419-29 [2001]}. En resumen, un proceso representativo comienza con cortar secciones de aproximadamente 10 m de grosor de muestras de tejido tumoral incluidas en parafina. Después, se extrae el ARN y se retiran las proteínas y el ADN. Tras el análisis de la concentración de ARN, pueden incluirse etapas de reparación y/o amplificación de ARN, si es necesario, y se somete el ARN a transcripción inversa usando promotores específicos del gen seguido por RT-PCR.

b. Sistema MassARRAY

En el método de obtención del perfil de expresión génica basado en MassARRAY, desarrollado por Sequenom, Inc. (San Diego, CA) tras el aislamiento de ARN y transcripción inversa, al ADNc obtenido se le añaden cantidades conocidas de una molécula de ADN sintético (competidor), que se corresponde con la región de ADNc seleccionada como diana en todas las posiciones, excepto en una única base, y sirve como patrón interno. Se amplifica mediante PCR la mezcla de ADNc/competidor y se somete a un tratamiento con enzima fosfatasa alcalina de gamba (SAP) tras la PCR, que da como resultado la desfosforilación de los nucleótidos restantes. Tras la inactivación de la fosfatasa alcalina, los productos de PCR del competidor y el ADNc se someten a extensión por cebador, que genera señales de masa diferenciadas para los productos de PCR derivados de competidor y de ADNc. Después de la purificación, estos productos se dispensan en un alineamiento en chip, que está precargado con los componentes necesarios para el análisis con análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS). El ADNc presente en la reacción se cuantifica entonces analizando las relaciones de las áreas de pico en el espectro de masas generado. Para detalles adicionales véase, por ejemplo Ding y Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 3059-3064 (2003).

c. Otros métodos basados en PCR

Las técnicas basadas en PCR adicionales incluyen, por ejemplo, presentación diferencial (Liang y Pardee, Science 257: 967-971 (1992)); polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (iAFLP) (Kawamoto y col., Genome Res. 12: 1305-1312 (1999)); tecnología BeadArray™ (IIlumina, San Diego, CA; Oliphant y col., Discovery of Markers for Disease (suplemento a Biotechniques), junio de 2002; Ferguson y col., Analytical Chemistry 72: 5618 (2000)); BeadsArray para la detección de expresión génica (BADGE), usando el sistema Luminex100 LabMAP disponible en el mercado y microesferas codificadas por múltiples colores (Luminex Corp., Austin, TX) en un ensayo rápido para determinar la expresión génica (Yang y col., Genome Res. 11: 1888-1898 (2001)); y análisis de obtención de perfiles de expresión de alta cobertura (HiCEP) (Fukumura y col., Nucl. Acids. Res. 31(16) e94 (2003)).

3. Microalineamientos

También puede identificarse o confirmarse la expresión génica diferencial usando la técnica de microalineamientos. Por lo tanto, puede medirse el perfil de expresión de genes asociados con cáncer de mama en tejido tumoral o bien reciente o bien incluido en parafina, usando tecnología de microalineamientos. En este método, se recubren o disponen en alineamiento secuencias de polinucleótido de interés (incluyendo ADNc y oligonucleótidos) sobre un sustrato de microchip. Después, las secuencias dispuestas en alineamiento se hibridan con sondas de ADN específicas de células o tejidos de interés. Al igual que en el método de RT-PCR, la fuente de ARNm es normalmente ARN total aislado de tumores o líneas de células tumorales humanos, y tejidos o líneas celulares normales correspondientes. Por lo tanto, puede aislarse ARN de una variedad de tumores primarios o líneas de células tumorales. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, puede extraerse ARNm, por ejemplo, de muestras de tejido incluidas en parafina congeladas o archivadas, y fijadas (por ejemplo fijadas en formalina), que se preparan y se conservan de manera rutinaria en la práctica clínica diaria.

En una realización específica de la técnica de microalineamientos, se aplican insertos amplificados por PCR de clones de ADNc a un sustrato en un alineamiento denso. Preferiblemente se aplican al menos

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Análisis y resultados

Se analizó tejido tumoral para detectar 187 genes relacionados con cáncer y 5 genes de referencia. Se obtuvieron perfiles de RT-PCR adecuados de 242 de los 252 pacientes. Se normalizaron los valores de

5 ciclo umbral (CT) para cada paciente basándose en la media de los 7 genes de referencia para ese paciente particular. Había datos de desenlace clínico disponibles para todos los pacientes a partir de una revisión de datos de registro e historias clínicas de pacientes seleccionados. Los desenlaces se clasificaron como:

10 Acontecimiento: Vivo con recidiva de cáncer de mama local, regional o distante o muerte debido a cáncer de mama. Sin acontecimiento: Vivo sin recidiva de cáncer de mama local, regional o distante o vivo con recidiva de cáncer de mama contralateral o vivo con segundo cáncer primario distinto de mama o muerte antes de la recidiva de cáncer de mama.

15 El análisis se realizó mediante:

A. Determinación de la relación entre la expresión génica normalizada y los desenlaces binarios de 0 o 1;

B. Análisis de la relación entre la expresión génica normalizada y el tiempo hasta el desenlace (0 o 1

20 como se definió anteriormente) en el que se censuraron los pacientes que estaban vivos sin recidiva de cáncer de mama o que murieron debido a una causa distinta al cáncer de mama. Este enfoque se usó para evaluar el impacto del pronóstico de genes individuales y también conjuntos de múltiples genes.

Análisis de pacientes con carcinomas de mama invasivos mediante enfoque binario

25 En el primer enfoque (binario) se realizó el análisis con los 242 pacientes con carcinoma de mama invasivo. Se realizó una prueba de la t con los grupos de pacientes clasificados como sin recidiva o sin muerte relacionada con cáncer de mama a los 10 años, frente a recidiva o muerte relacionada con cáncer de mama a los 10 años, y se calcularon los valores de p para las diferencias entre los grupos para cada

30 gen.

La Tabla 1 enumera los 33 genes para los que el valor de p para las diferencias entre los grupos fue <0,05. La primera columna de valores de expresión medios se refiere a pacientes que tenían una recidiva metastásica de, o murieron por, cáncer de mama. La segunda columna de valores de expresión medios

35 se refiere a pacientes que ni tenían recidiva metastásica ni murieron por cáncer de mama.

Tabla 1

Media del grupo A: Media del grupo B

Gen: Acontecimiento Sin acontecimiento Prueba estadística de la t Valor de p

MMP9: -3,15 -4,27 3,75 0,00

GSTM1: -5,02 -4,03 -3,56 0,00

MELK: -3,89 -4,66 3,34 0,00

PR: -4,56 -3,18 -3,27 0,00

DKFZp586M07: -3,83 -2,94 -3,09 0,00

GSTM3: -2,56 -1,69 -3,06 0,00

MCM2: -3,51 -4,08 3,03 0,00

CDC20: -3,01 -3,75 3,01 0,00

CCNB1: -4,48 -5,17 3,02 0,00

STMY3: -0,58 -1,20 2,95 0,00

GRB7: -1,93 -3,01 2,98 0,00

MYBL2: -3,91 -4,78 2,91 0,01

CEGP1: -3,00 -1,85 -2,89 0,01

SURV: -4,23 -5,06 2,88 0,01

LMNB1: -2,40 -2,91 2,81 0,01

CTSL2: -5,74 -6,39 2,83 0,01

PTTG1: -3,49 -4,14 2,72 0,01

BAG1: -1,76 -1,30 -2,58 0,01

KNSL2: -3,35 -4,06 2,60 0,01

CIAP1: -4,44 -4,02 -2,58 0,01

PREP: -3,34 -3,74 2,56 0,01

NEK2: -5,25 -5,80 2,53 0,01

EpCAM: -1,95 -2,31 2,50 0,01

PCNA: -2,79 -3,13 2,42 0,02

C20_orf 1: -2,48 -3,09 2,39 0,02

ITGA7: -4,53 -3,87 -2,37 0,02

ID1: -2,58 -2,17 -2,30 0,02

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TOP2A: 1,38 0,009551

PCNA: 1,67 0,010237

PREP: 1,69 0,012308

FOXM1: 1,52 0,012837

NME1: 1,46 0,013622

CEGP1: 0,84 0,013754

BAG1: 0,68 0,015422

STK15: 1,46 0,017013

HNRPAB: 1,96 0,017942

EstR1: 0,80 0,018877

MMP9: 1,19 0,019591

DKFZp586M07: 0,79 0,020073

TS: 1,44 0,025186

Src: 1,70 0,037398

BIN1: 0,75 0,038979

NPD009: 0,80 0,039020

RPLPO: 0,52 0,041575

GSTM3: 0,84 0,041848

MMP12: 1,27 0,042074

TFRC: 1,57 0,046145

IGF1R: 0,78 0,046745

Basándose en los datos expuestos en la Tabla 2, la expresión de cualquiera de los siguientes genes en el cáncer de mama indica una probabilidad reducida de supervivencia sin recidiva de cáncer: GRB7; SURV; LMNB1; MYBL2; HER2; MELK; C20_orf1; PTTG1; BUB1; CDC20; CCNB1; STMY3; KNSL2; CTSL2;

5 MCM2; NEK2; Ki_67; CCNE2; TOP2A-4; PCNA; PREP; FOXM1; NME1; STK15; HNRPAB; MMP9; TS; Src; MMP12; TFRC.

Basándose en los datos expuestos en la Tabla 2, la expresión de cualquiera de los siguientes genes en el cáncer de mama indica un mejor pronóstico para la supervivencia sin recidiva de cáncer: PR; GSTM11;

10 DR5; CEGP1; BAG1; EstR1; DKFZp586M07; BIN1; NPD009; RPLPO; GSTM3; IGF1R.

Los análisis binario y de tiempo hasta el acontecimiento, con pocas excepciones, identificaron los mismos genes como marcadores de pronóstico. Por ejemplo, la comparación de las Tablas 1 y 2 muestra que 10 genes estaban representados entre los 15 genes más importantes en ambas listas. Además, cuando

15 ambos análisis identificaron el mismo gen a [p<0,01], lo que sucedió para 26 genes, siempre concordaban con respecto al sentido (signo positivo o negativo) de la correlación con la supervivencia/recidiva. En conjunto, estos resultados refuerzan la conclusión de que los marcadores identificados tienen un valor de pronóstico significativo.

20 Análisis génico de múltiples variables de 242 pacientes con carcinoma de mama invasivo

Para modelos de Cox que comprenden más de dos genes (modelos de múltiples variables), se realiza la introducción gradual de cada gen individual en el modelo, en el que el primer gen introducido se selecciona previamente de los genes que tienen valores de p para una variable significativos, y el gen

25 seleccionado para su introducción en el modelo en cada etapa posterior es el gen que mejora de la mejor manera el ajuste del modelo a los datos. Este análisis puede realizarse con cualquier número total de genes. En el análisis cuyos resultados se muestran a continuación, se realizó la introducción gradual para hasta 10 genes.

30 Se realizó un análisis de múltiples variables usando la siguiente ecuación: RR = exp[coef(genA) x Ct(genA) + coef(genB) x Ct(genB) + coef(genC) x Ct(genC) +..................].

En esta ecuación, los coeficientes para los genes que son factores pronóstico de un desenlace beneficioso son números positivos y los coeficientes para genes que son factores pronóstico de un 35 desenlace desfavorable son números negativos. Los valores de "Ct" en la ecuación son Ct, es decir, reflejan la diferencia entre el valor de Ct normalizado promedio para una población y el Ct normalizado medido para el paciente en cuestión. El convenio usado en el presente análisis ha sido que Ct por debajo y por encima del promedio de la población tienen signos positivos y signos negativos, respectivamente (reflejando una mayor o menor abundancia de ARNm). El riesgo relativo (RR) calculado

40 resolviendo esta ecuación indicará si el paciente tiene una probabilidad potenciada o reducida de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer.

Se realizó un análisis gradual de múltiples variables, usando el modelo de riesgos proporcionales de Cox, sobre los datos de expresión génica obtenidos para los 242 pacientes con carcinoma de mama invasivo. 45 Mediante este análisis se identificó que el siguiente conjunto de diez genes tenía un valor predictivo

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TABLA 4

Gen: Acceso Nombre SEQ ID NO Secuencia

B-Catenin: NM_0019 04 S2150/B-Cate.f3 SEQ ID NO:55 GGCTCTTGTGCGTACTGTCCTT 2 2

B-Catenin: NM_0019 04 S2151/B-Cate.r3 SEQ ID NO:56 TCAGATGACGAAGAGCACAGATG 2 3

B-Catenin: NM_0019 04 S5046/BCate.p3 SEQ ID NO:57 AGGCTCAGTGATGTCTTCCCTGTCAC CAG 2 9

BAG1: NM_0043 23 S1386/BAG1.f2 SEQ ID NO:58 CGTTGTCAGCACTTGGAATACAA 2 3

BAG1: NM_0043 23 S1387BAG1.r2 SEQ ID NO:59 GTTCAACCTCTTCCTGTGGACTGT 2 4

BAG1: NM_0043 23 S4731/BAG1.p2 SEQ ID NO:60 CCCAATTAACATGACCCGGCAACCAT 2 6

BIN1: NM_0043 05 S2651/BIN1.f3 SEO ID NO:61 CCTGCAAAAGGGAACAAGAG 2 0

BIN1: NM_0043 05 S2652/BIN1.r3 SEQ ID NO:62 CGTGGTTGACTCTGATCTCG 2 0

BIN1: NM_0043 05 S4954/BIN1.p3 SEQ ID NO:63 CTTCGCCTCCAGATGGCTCCC 2 1

BUB1: NM_0043 36 S4294/BUB1.f1 SEQ ID NO:64 CCGAGGTTAATCCAGCACGTA 2 1

BUB1: NM_0043 36 S4295/BUB1.r1 SEQ ID NO:65 AAGACATGGCGCTCTCAGTTC 2 1

BUB1: NM_0043 36 S4296/BUB1.p1 SEQ ID NO:66 TGCTGGGAGCCTACACTTGGCCC 2 3

C20 orf1: NM_0121 12 S3560/C20 or.f1 SEQ ID NO:67 TCAGCTGTGAGCTGCGGATA 2 0

C20 orf1: NM_0121 12 S3561/C20 or.r1 SEQ ID NO:68 ACGGTCCTAGGTTTGAGGTTAAGA 2 4

C20 orf1: NM_0121 12 S3562/C20 or.p1 SEO ID NO:69 CAGGTCCCATTGCCGGGCG 1 9

CCNB1: NM_0319 66 S1720/CCNB1.f 2 SEQ ID NO:70 TTCAGGTTGTTGCAGGAGAC 2 0

CCNB1: NM_0319 66 S1721/CCNB1.r 2 SEQ ID NO:71 CATCTTCTTGGGCACACAAT 2 0

CCNB1: NM_0319 66 S4733/CCNB1.p 2 SEQ ID NO:72 TGTCTCCATTATTGATCGGTTCATGC A 2 7

CCNE2: NM_0577 49 S1458/CCNE2.f 2 SEQ ID NO:73 ATGCTGTGGCTCCTTCCTAACT 2 2

CCNE2: NM_0577 49 S1459/CCNE2.r 2 SEQ ID NO:74 ACCAAATTGTGATATACAAAAAGGTT 2 7

CCNE2: NM_0577 49 S4945/CCNE2.p 2 SEQ ID NO:75 TACCAAGCAACCTACATGTCAAGAAA GCCC 3 0

CDC20: NM_0012 55 S4447/CDC20.f1 SEQ ID NO:76 TGGATTGGAGTTCTGGGAATG 2 1

CDC20: NM_0012 55 S4448/CDC20.r 1 SEQ ID NO:77 GCTTGCACTCCACAGGTACACA 2 2

CDC20: NM_0012 55 S4449/CDC20.p 1 SEQ ID NO:78 ACTGGCCGTGGCACTGGACAACA 2 3

CDH1: NM_0043 60 S0073/CDH1.f3 SEQ ID NO:79 TGAGTGTCCCCCGGTATCTTC 2 1

CDH1: NM_0043 60 S0075/CDH1.r3 SEQ ID NO:80 CAGCCGCTTTCAGATTTTCAT 2 1

CDH1: NM 004360 S4990/CDH1.p3 SEQ ID NO:81 TGCCAATCCCGATGAAATTGGAAATT T 2 7

CEGP1: NM_0209 74 S1494/CEGP1.f 2 SEQ ID NO:82 TGACAATCAGCACACCTGCAT 2 1

CEGP1: NM_0209 74 S1495/CEGP1.r 2 SEQ ID NO:83 TGTGACTACAGCCGTGATCCTTA 2 3

CEGP1: NM_0209 74 S4735/CEGP1.p 2 SEO ID NO:84 CAGGCCCTCTTCCGAGCGGT 2 0

ClAP1: NM_0011 66 S0764/CIAP1.f2 SEQ ID NO:85 TGCCTGTGGTGGGAAGCT 1 8

ClAP1: NM_0011 66 S0765/CIAP1.r2 SEQ ID NO:86 GGAAAATGCCTCCGGTGTT 1 9

ClAP1: NM_0011 66 S4802/CIAP1.p2 SEQ ID NO:87 TGACATAGCATCATCCTTTGGTTCCC AGTT 3 0

cMYC: NM_0024 67 S0085/eMYC.f3 SEQ ID NO:88 TCCCTCCACTCGGAAGGACTA 2 1

cMYC: NM_0024 67 S0087/cMYC.r3 SEQ ID NO:89 CGG1-7-GTTGCTGATCTGTCTCA 2 2

cMYC: NM_ 002467 S4994/cMYC.p3 SEQ ID NO:90 TCTGACACTGTCCAACTTGACCCTCT T 2 7

CTSL2: NM_0013 33 S4354/CTSL2.f1 SEQ ID NO:91 TGTCTCACTGAGCGAGCAGAA 2 1

CTSL2: NM_0013 33 S4355/CTSL2.ri SEQ ID NO:92 ACCATTGCAGCCCTGATTG 1 9

CTSL2: NM_0013 33 S4356/CTSL2.p 1 SEQ ID NO:93 CTTGAGGACGCGAACAGTCCACCA 2 4

DKFZp586M07 23: AL050227 S4396/DKFZp5.f 1 SEQ ID NO:94 TCCATTTTCTACCTGTTAACCTTCATC 2 7

DKFZp586M07 23: AL050227 S4397/DKFZp5.r 1 SEQ ID NO:95 ATGCAGTCGGTCCCTTCCT 1 9

DKFZp586M07 23: AL050227 S4398/DKFZpS. p1 SEQ ID NO:96 TTGCTTCCAGGGCCTGCACAAAA 2 3

DR5: NM_0038 42 S2551/DR5.f2 SEQ ID NO:97 CTCTGAGACAGTGCTTCGATGACT 2 4

DR5: NM_0038 42 S2552/DR5.r2 SEQ ID NO:98 CCATGAGGCCCAACTTCCT 1 9

DR5: NM_0038 42 S4979/DR5.p2 SEQ ID NO:99 CAGACTTGGTGCCCTTTGACTCC 2 3

EpCAM: NM_0023 54 51807/EpCAM.f 1 SEQ ID NO:10 0 GGGCCCTCCAGAACAATGAT 2 0

EpCAM: NM_0023 54 S1808/EpCAM.r 1 SEO ID NO:10 1 TGCACTGCTTGGCCTTAAAGA 2 1

EpCAM: NM_0023 54 S4984/EpCAM.p 1 SEQ ID NO:10 2 CCGCTCTCATCGCAGTCAGGATCAT 2 5

EstR1: NM_0001 25 S0115/EstR1.f1 SEQ ID NO:10 3 CGTGGTGCCCCTCTATGAC 1 9

EstR1: NM_0001 25 S0111/EstR1.r1 SEQ ID NO:10 4 GGCTAGTGGGCGCATGTAG 1 9

EstR1: NM_0001 25 S4737/EstR1.p1 SEQ ID NO:10 5 CTGGAGATGCTGGACGCCC 1 9

FGFR1: NM_0231 09 S0818/FGFR1.f3 SEQ ID NO:10 6 CACGGGACATTCACCACATC 2 0

FGFR1: NM_0231 09 S0819/FGFR1.r 3 SEQ ID NO:10 7 GGGTGCCATCCACTTCACA 1 9

FGFR1: NM_0231 09 S4816/FGFR1.p 3 SEQ ID NO:10 8 ATAAAAAGACAACCAACGGCCGACT GC 2 7

FOXM1: NM_0219 53 S2006/FOXM1.f 1 SEQ ID NO:10 9 CCACCCCGAGCAAATCTGT 1 9

FOXM1: NM_0219 53 S2007/FOXM1.r 1 SEQ ID NO:11 0 AAATCCAGTCCCCCTACTTTGG 2 2

FOXM1: NM_0219 53 S4757/FOXMI.p 1 SEQ ID NO:11 1 CCTGAATCCTGGAGGCTCACGCC 2 3

GRB7: NM_0053 10 S0130/GRB7.f2 SEQ ID NO:11 2 ccatctgcatccatcftgft 2 0

GRB7: NM_0053 10 S0132/GRB7.r2 SEQ ID NO:11 3 ggccaccagggtattatctg 2 0

GRB7: NM_0053 10 S4726/GRB7.p2 SEQ ID NO:11 4 ctccccacccttgagaagtgcct 2 3

GSTM1: NM_0005 61 S2026/GSTM1.r 1 SEQ ID NO:11 5 GGCCCAGCTTGAATTTTTCA 2 0

GSTM1: NM_0005 61 S2027/GSTM1.f 1 SEQ ID NO:11 6 AAGCTATGAGGAAAAGAAGTACACG AT 2 7

GSTM1: NM_0005 61 S4739/GSTM1.p 1 SEQ ID NO:11 7 TCAGCCACTGGCTTCTGTCATAATCA GGAG 3 0

GSTM3: NM_0008 49 S2038/GSTM3.f 2 SEQ ID NO:11 8 CAATGCCATCTTGCGCTACAT 2 1

GSTM3: NM_0008 49 S2039/GSTM3.r 2 SEQ ID NO:11 9 GTCCACTCGAATCTTTTCTTCTTCA 2 5

GSTM3: NM_0008 49 S5064/GSTM3.p 2 SEQ ID NO:12 0 CTCGCAAGCACAACATGTGTGGTGA GA 2 7

HER2: NM_0044 48 S0142/HER2.f3 SEQ ID NO:12 1 CGGTGTGAGAAGTGCAGCAA 2 0

HER2: NM_0044 48 S0144/HER2.r3 SEQ ID NO:12 2 CCTCTCGCAAGTGCTCCAT 1 9

HER2: NM_0044 48 S4729/HER2.p3 SEQ ID NO:12 3 CCAGACCATAGCACACTCGGGCAC 2 4

HNRPAB: NM_0044 99 S4510/HNRPAB .f3 SEQ ID NO:12 4 CAAGGGAGCGACCAACTGA 1 9

HNRPAB: NM_0044 99 S4511/HNRPAB .r3 SEQ ID NO:12 5 GTTTGCCAAGTTAAATTTGGTACATA AT 2 8

HNRPAB: NM_0044 99 S4512/NNRPAB .p3 SEQ ID NO:12 6 CTCCATATCCAAACAAAGCATGTGTG CG 2 8

ID1: NM_0021 65 S0820/ID1.f1 SEQ ID NO:12 7 AGAACCGCAAGGTGAGCAA 1 9

ID1: NM_0021 65 S0821/ID1.r1 SEQ ID NO:12 8 TCCAACTGAAGGTCCCTGATG 2 1

ID1: NM_0021 65 S4832/ID1.pi SEQ ID NO:12 9 TGGAGATTCTCCAGCACGTCATCGA C 2 6

IGF1R: NM_0008 75 S1249/IGF1R.f3 SEQ ID NO:13 0 GCATGGTAGCCGAAGATTTCA 2 1

IGF1R: NM_0008 75 S1250/IGF1R.r3 SEQ ID NO:13 1 TTTCCGGTAATAGTCTGTCTCATAGA TATC 3 0

IGF1R: NM_0008 75 S4895/IGF1R.p3 SEQ ID NO:13 2 CGCGTCATACCAAAATCTCCGATTTT GA 2 8

ITGA7: NM_0022 06 S0859/ITGA7.f1 SEQ ID NO:13 3 GATATGATTGGTCGCTGCTTTG 2 2

ITGA7: NM_0022 06 S0920/ITGA7.r1 SEQ ID NO:13 4 AGAACTTCCATTCCCCACCAT 2 1

ITGA7: NM_0022 06 S4795/ITGA7.p1 SEQ ID NO:13 5 CAGCCAGGACCTGGCCATCCG 2 1

Kl-67: NM_0024 17 S0436/Ki-67.f2 SEQ ID NO:13 6 CGGACTTTGGGTGCGACTT 1 9

Ki-67: NM_0024 17 S0437/Ki-67.r2 SEQ ID NO:13 7 TTACAACTCTTCCACTGGGACGAT 2 4

Ki-67: NM_0024 17 S4741/Ki-67.p2 SEQ ID NO:13 8 CCACTTGTCGAACCACCGCTCGT 2 3

KLK10: NM_0027 76 S2624/KLK10.f3 SEQ ID NO:13 9 GCCCAGAGGCTCCATCGT 1 8

KLK10: NM_0027 76 S2625/KLK10.r3 SEQ ID NO:14 0 CAGAGGTTTGAACAGTGCAGACA 2 3

KLK10: NM_0027 76 S4978/KLK10.p3 SEQ ID NO:14 1 CCTCTTCCTCCCCAGTCGGCTGA 2 3

KNSL2: BC000712 S4432/KNSL2.f2 SEQ ID NO:14 2 CCACCTCGCCATGATTTTTC 2 0

KNSL2: BC000712 S4433/KNSL2.r2 SEQ ID NO:14 3 GCAATCTCTTCAAACACTTCATCCT 2 5

KNSL2: BC000712 S4434/KNSL2.p 2 SEQ ID NO:14 4 TTTGACCGGGTATTCCCACCAGGAA 2 5

KRT5: NM_0004 24 S0175/KRT5.f3 SEQ ID NO:14 5 tcagtggagaaggagttgga 2 0

KRT5: NM_0004 24 S0177/KRT5.r3 SEQ ID NO:14 6 tgcctatccagaggaaaca 2 0

KRT5: NM_0004 24 S5015/KRT5.p3 SEQ ID NO:14 7 ccagtcacatctctgttgtcacaagca 2 8

LMNB1: NM_0055 73 S4477/LMNB1.f 1 SEQ ID NO:14 8 TGCAAACGCTGGTGTCACA 1 9

LMNB1: NM_0055 73 S4478/LMNB1.r 1 SEQ ID NO:14 9 CCCCACGAGTTCTGGTTCTTC 2 1

LMNB1: NM_0055 73 S4479/LMNB1.p 1 SEQ ID NO:15 0 CAGCCCCCCAACTGACCTCATC 2 2

MCM2: NM_0045 26 S1602/MCM2.f2 SEQ ID NO:15 1 GACTTTTGCCCGCTACCTTTC 2 1

MCM2: NM_0045 26 S1603/MCM2.r2 SEQ ID NO:15 2 GCCACTAACTGCTTCAGTATGAAGAG 2 6

MCM2: NM_0045 26 S4900/MCM2.p2 SEQ ID NO:15 3 ACAGCTCATTGTTGTCACGCCGGA 2 4

MCM6: NM_0059 15 S1704/MCM6.f3 SEQ ID NO:15 4 TGATGGTCCTATGTGTCACATTCA 2 4

MCM6: NM_0059 15 S1705/MCM6.r3 SEQ ID NO:15 5 TGGGACAGGAAACACACCAA 2 0

MCM6: NM_0059 15 S4919/MCM6.p3 SEQ ID NO:15 6 CAGGTTTCATACCAACACAGGCTTCA GCAC 3 0

MELK: NM_0147 91 S4318/MELK.f1 SEQ ID NO:15 7 AACCCGGCGATCGAAAAG 1 8

MELK: NM_0147 91 S4319/MELK.r1 SEQ ID NO:15 8 GGGCCTGCTGTCCTGAGA 1 8

MELK: NM_0147 91 S4320/MELK.p1 SEQ ID NO:15 9 TCTTAGGAACGCCGTACCAGCCGC 2 4

MMP12: NM_0024 26 S4381/MMP12.f 2 SEQ ID NO:16 0 CCAACGCTTGCCAAATCCT 1 9

MMP12: NM_0024 26 S4382/MMP12.r 2 SEQ ID NO:16 1 ACGGTAGTGACAGCATCAAAACTC 2 4

MMP12: NM_0024 26 S4383/MMP12.p 2 SEQ ID NO:16 2 AACCAGCTCTCTGTGACCCCAATT 2 4

MMP9: NM_0049 94 S0656/MMP9.f1 SEQ ID NO:16 3 GAGAACCAATCTCACCGACA 2 0

MMP9: NM_0049 94 S0657/MMP9.r1 SEQ ID NO:16 4 CACCCGAGTGTAACCATAGC 2 0

MMP9: NM_0049 94 S4760/MMP9.p1 SEQ ID NO:16 5 ACAGGTATTCCTCTGCCAGCTGCC 2 4

MYBL2: NM_0024 66 S3270/MYBL2.f1 SEQ ID NO:16 6 GCCGAGATCGCCAAGATG 1 8

MYBL2: NM_0024 66 S3271/MYBL2.r 1 SEQ ID NO:16 7 CTTTTGATGGTAGAGTTCCAGTGATT C 2 7

MYBL2: NM_0024 66 S4742/MYBL2.p 1 SEQ ID NO:16 8 CAGCATTGTCTGTCCTCCCTGGCA 2 4

NEK2: NM_0024 97 S4327/NEK2.f1 SEQ ID NO:16 9 GTGAGGCAGCGCGACTCT 1 8

NEK2: NM_0024 97 S4328/NEK2.r1 SEQ ID NO:17 0 TGCCAATGGTGTACAACACTTCA 2 3

NEK2: NM_0024 97 S4329/NEK2.p1 SEQ ID NO:17 1 TGCCTTCCCGGGCTGAGGACT 2 1

NME1: NM_0002 69 S2526/NME1.f3 SEQ ID NO:17 2 CCAACCCTGCAGACTCCAA 1 9

NME1: NM_0002 69 S2527/NME1.r3 SEQ ID NO:17 3 ATGTATAATGTTCCTGCCAACTTGTAT G 2 8

NME1: NM_0002 69 S4949/NME1.p3 SEQ ID NO:17 4 CCTGGGACCATCCGTGGAGACTTCT 2 5

NPD009: NM_0206 86 S4474/NPD009.f 3 SEQ ID NO:17 5 GGCTGTGGCTGAGGCTGTAG 2 0

NPD009: NM_0206 86 S4475/NPD009.r 3 SEQ ID NO:17 6 GGAGCATTCGAGGTCAAATCA 2 1

NPD009: NM_0206 86 S4476/NPD009. p3 SEQ ID NO:17 7 TTCCCAGAGTGTCTCACCTCCAGCAG AG 2 8

PCNA: NM_0025 92 S0447/PCNA.f2 SEQ ID NO:17 8 GAAGGTGTTGGAGGCACTCAAG 2 2

PCNA: NM_0025 92 S0448/PCNA.r2 SEQ ID NO:17 9 GGTTTACACCGCTGGAGCTAA 2 1

PCNA: NM_0025 92 S4784/PCNA.p2 SEQ ID NO:18 0 ATCCCAGCAGGCCTCGTTGATGAG 2 4

PR: NM_0009 26 S1336/PR.f6 SEQ ID NO:18 1 GCATCAGGCTGTCATTATGG 2 0

PR: NM_0009 26 S1337/PR.r6 SEQ ID NO:18 2 AGTAGTTGTGCTGCCCTTCC 2 0

PR: NM_0009 26 S4743/PR.p6 SEQ ID NO:18 3 TGTCCTTACCTGTGGGAGCTGTAAG GTC 2 8

PREP: NM_0027 26 S1771/PREP.f1 SEQ ID NO:18 4 GGGACGGTGTTCACATTCAAG 2 1

PREP: NM_0027 26 S1772/PREP.r1 SEQ ID NO:18 5 CAGGATCCCAGAAGTCAATGTTG 2 3

PREP: NM_0027 26 S4929/PREP.p1 SEQ ID NO:18 6 TCGCCAGTCTCCCAACTATCGCGT 2 4

PTTG1: NM_0042 19 S4525/PTTG1.f2 SEQ ID NO:18 7 GGCTACTCTGATCTATGTTGATAAGG AA 2 8

PTTG1: NM_0042 19 S4526/PTTG1.r2 SEQ ID NO:18 8 GCTTCAGCCCATCCTTAGCA 2 0

PTTG1: NM_0042 19 S4527/PTTG1.p 2 SEQ ID NO:18 9 CACACGGGTGCCTGGTTCTCCA 2 2

RPLPO: NM_0010 02 S0256/RPLPO.f 2 SEQ ID NO:19 0 CCATTCTATCATCAACGGGTACAA 2 4

RPLPO: NM_0010 02 S0258/RPLPO.r 2 SEQ ID NO:19 1 TCAGCAAGTGGGAAGGTGTAATC 2 3

RPLPO: NM_0010 02 S4744/RPLPO.p 2 SEQ ID NO:19 2 TCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCG 2 5

SNRPF: NM_0030 95 S4489/SNRPF.f 2 SEQ ID NO:19 3 GGCTGGTCGGCAGAGAGTAG 2 0

SNRPF: NM_0030 95 S4490/SNRPF.r 2 SEQ ID NO:19 4 TGAGGAAAGGTTTGGGATTGA 2 1

SNRPF: NM_0030 95 S4491/SNRPF.p 2 SEQ ID NO:19 5 AAACTCATGTAAACCACGGCCGAATG TTG 2 9

Src: NM_0043 83 S1820/Src.f2 SEQ ID NO:19 6 CCTGAACATGAAGGAGCTGA 2 0

Src: NM_0043 83 S1821/Src.r2 SEQ ID NO:19 7 CATCACGTCTCCGAACTCC 1 9

Src: NM_0043 83 S5034/Src.p2 SEQ ID NO:19 8 TCCCGATGGTCTGCAGCAGCT 2 1

STK15: NM_0036 00 S0794/STK1 5.f2 SEQ ID NO:19 9 CATCTTCCAGGAGGACCACT 2 0

STK15: NM_0036 00 S0795/STK15.r2 SEQ ID NO:20 0 TCCGACCTTCAATCATTTCA 2 0

STK15: NM_0036 00 S4745/STK15.p 2 SEQ ID NO:20 1 CTCTGTGGCACCCTGGACTACCTG 2 4

STMY3: NM_0059 40 S2067/STMY3.f 3 SEQ ID NO:20 2 CCTGGAGGCTGCAACATACC 2 0

STMY3: NM_0059 40 S2068/STMY3.r 3 SEQ ID NO:20 3 TACAATGGCTTTGGAGGATAGCA 2 3

STMY3: NM_0059 40 S4746/STMY3.p 3 SEQ ID NO:20 4 ATCCTCCTGAAGCCCTTTTCGCAGC 2 5

Claims

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