ES2608315T3

ES2608315T3 - Uso de glu-tubulina como un biomarcador de la respuesta de fármacos a furazanobencimidazoles

Info

Publication number: ES2608315T3
Application number: ES12700494.3T
Authority: ES
Inventors: Heidi Alexandra Lane; Felix Bachmann
Original assignee: Basilea Pharmaceutica AG
Current assignee: Basilea Pharmaceutica AG
Priority date: 2011-01-21
Filing date: 2012-01-19
Publication date: 2017-04-07
Anticipated expiration: 2032-01-19
Also published as: NZ611525A; CN103460042A; CA3142744A1; PL2666014T3; JP2014505876A; DK2666014T3; US20180364254A1; CA2822530A1; EP2666014B1; PT2666014T; AU2012208516B2; JP6270481B2; US10656162B2; WO2012098203A1; AU2012208516A1; CA2822530C; CN103460042B; US9995754B2; US20140024686A1; HUE031162T2

Abstract

Uso de glu-tubulina como un biomarcador para predecir la respuesta a un compuesto, en el que el compuesto es un compuesto de fórmula general I, **Fórmula** en donde R representa fenilo, tienilo o piridinilo, en donde fenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrógeno forman, junto con el nitrógeno, heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, ciano, halógeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en donde piridinilo está opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halógeno; X representa un grupo C>=Y, en donde Y representa oxígeno o nitrógeno sustituido con hidroxi o alcoxi inferior; R1 representa hidrógeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior; R2, R3 y R6 representan hidrógeno; R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi; y derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmacéuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, éster o una amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, 20 sal de tal éster o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto, o en donde R representa fenilo o piridinilo, en donde fenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrógeno forman junto con el nitrógeno un heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, formilo, ciano, halógeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en donde piridinilo está opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halógeno; X representa oxígeno; R1 representa hidrógeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior; R2, R3 y R6 representan hidrógeno; R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi; y derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmacéuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, éster o amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal éster o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto, y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un máximo de 7, especialmente hasta e incluye un máximo de 4 átomos de carbono, y en el que la respuesta es de una enfermedad en un sujeto, y el biomarcador se mide ex vivo en una muestra o muestras tomadas del cuerpo animal, preferiblemente tomadas del cuerpo humano.

Description

DESCRIPCION

Uso de glu-tubulina como un biomarcador de la respuesta de farmacos a furazanobencimidazoles

La presente invencion se refiere al uso ex vivo de glu-tubulina como un biomarcador para predecir la respuesta de una enfermedad tal como una enfermedad neoplasica o autoinmune, preferiblemente cancer, a un compuesto de 5 formula general I tal como 3-(4-{1-[2-(4-amino-fenil)-2-oxo-etil]-1H-benzoimidazol-2-il}-furazan-3-ilamino)propionitrilo (BAL27862). En otros aspectos se refiere a metodos y kits, asf como a metodos de tratamiento que implican el uso del biomarcador.

Los microtubulos son uno de los componentes del citoesqueleto de la celula y se componen de heterodfmeros de tubulina alfa y beta. Los agentes que fijan como objetivo los microtubulos se encuentran entre los agentes 10 quimioterapeuticos citotoxicos mas eficaces que tienen un amplio espectro de actividad. Agentes desestabilizantes de microtubulos (p. ej., los alcaloides de la vinca tales como vincristina, vinblastina y vinorelbina) se utilizan, p. ej., en el tratamiento de varios tipos de tumores malignos hematologicos tales como leucemia linfoblastica y linfoma, asf como tumores solidos tales como el cancer de pulmon. Agentes estabilizadores de los microtubulos (p. ej., los taxanos tales como paclitaxel, docetaxel) se utilizan, por ejemplo, en el tratamiento de tumores solidos, incluyendo 15 cancer de mama, de pulmon y cancer de prostata.

Sin embargo puede producirse una resistencia a estos agentes fijadores como objetivo de microtubulos conocidos. La resistencia puede ser inherente o puede ser adquirida despues de la exposicion a estos agentes. Tal resistencia, por lo tanto, impacta sobre las tasas de supervivencia de los pacientes, asf como opciones de regfmenes de tratamiento. Se han identificado varios mecanismos potenciales de resistencia, e incluyen defectos en las dianas de 20 microtubulos tales como concentraciones elevadas de beta-tubulina subtipo III y mutaciones adquiridas en beta- tubulina subtipo I que se sabe reducen la union de taxano. Ademas, se ha sugerido que defectos en otras protemas celulares se asocian con la resistencia a determinados agentes que fijan como objetivo microtubulos tales como la sobre-expresion de la bomba de eflujo de glicoprotema P (bomba de P-gp, tambien conocida como protema de resistencia a multiples farmacos 1 o MDR1). Este tipo de factores puede entonces ser utilizado como biomarcadores 25 de resistencia a estos agentes que fijan como objetivo microtubulos convencionales.

Una clase de agentes desestabilizantes de microtubulos descubierta relativamente reciente son compuestos abarcados por la formula dada a continuacion:

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en donde

30 R representa fenilo, tienilo o piridinilo

en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en 35 donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman, junto con el nitrogeno, heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;

X representa un grupo C=Y, en donde Y representa oxfgeno o nitrogeno sustituido con hidroxi o alcoxi inferior;

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R1 representa hidrogeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;

R2, R3y R6representan hidrogeno;

R4y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4y R5 juntos representan metilendioxi; y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos;

o en donde

R representa fenilo o piridinilo

en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman junto con el nitrogeno un heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, formilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi;

y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;

X representa oxfgeno;

R2, R3y R6 representan hidrogeno;

R4y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4y R5 juntos representan metilendioxi;

y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos;

y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un maximo de 7, especialmente hasta e incluye un maximo de 4 atomos de carbono.

Estos compuestos se describen en el documento WO2004/103994 A1. Estos compuestos han demostrado detener la proliferacion de celulas tumorales e inducir la apoptosis.

La smtesis de compuestos de formula I se describe en el documento WO2004/103994 A1, en general, en las paginas 29-35, y en concreto en las paginas 39-55. Se pueden preparar tal como se describe o por un metodo analogo a los procesos descritos en el mismo.

Un compuesto que cae dentro de esta clase, conocido como BAL27862, y mostrado en el documento WO2004/103994 Al como ejemplo 58, tiene la estructura qrnmica y el nombre dado a continuacion:

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Nombre qrnmico:

3-(4-{1-[2-(4-amino-fenil)-2-oxo-etil]-1H-benzoimidazol-2-il}-furazan-3-ilamino)-propionitrilo.

O en esta memoria como Compuesto A

Otros compuestos ejemplificados en el documento WO2004/103994 A1 como ejemplos 50 y 79, respectivamente, tienen las estructuras y nombres qmmicos que se indican a continuacion:

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Nombre qmmico: 2-[2-(4-amino-furazan-3-il)-benzoimidazol-1-il]-1-(4-amino-fenil)-etanona o en esta memoria como Compuesto B y

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10 Nombre qmmico: 3-(4-{1-[2-(6-amino-piridin-3-il)-2-oxo-etil]-1H-benzoimidazol-2-il}-furazan-3-ilamino)-propionitrilo o en esta memoria como Compuesto C.

BAL27862 tiene actividad a lo largo de un amplio panel de modelos experimentales de xenoinjertos de tumores solidos. Ademas de ello, la actividad se mantiene incluso en contra de modelos de tumores que han sido seleccionados en cuanto a la resistencia a agentes que fijan como objetivo microtubulos convencionales (incluyendo 15 los desestabilizadores de microtubulos de alcaloides de la vinca y los estabilizadores de microtubulos paclitaxel y epotilona B). La actividad de BAL27862 no se ve afectada por la sobre expresion de la bomba de P-gp en ningun modelos sometido a ensayo in vitro, ni en xenoinjertos de tumores mamarios humanos. Adicionalmente, BAL27862 retuvo su actividad a pesar de las concentraciones elevadas de beta-tubulina subtipo III y mutaciones en tubulina subtipo I (vease el poster "Actividad in vitro del nuevo agente activo tubulina BAL27862 en MDR1(+) y MDR1(-) de 20 variantes de cancer de mama y de ovario humano, seleccionadas en cuanto a la resistencia a taxanos", presentado en la 101a Reunion Anual de 20l0).

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Por lo tanto, la actividad de BAL27862 no se ve afectada por un cierto numero de factores que confieren resistencia a los agentes que fijan como objetivo microtubulos convencionales.

Ademas de ello, se sabe que los compuestos de formula general I tienen un efecto diferente en el fenotipo de las celulas en comparacion con otros agentes que fijan como objetivo microtubulos, incluyendo otros desestabilizadores de microtubulos (vease el poster "BAL27862: Un Nuevo Agente Anticancer que Disocia Microtubulos y Crea un Fenotipo Celular Distinto", presentado en el Simposio EORT-NCI-AACR de 2009). La presente solicitud tambien muestra que el tratamiento con un compuesto de formula general I induce un fenotipo de microtubulos consistente en lmeas celulares tumorales derivadas de una diversidad de organos, por ejemplo, pulmon, cuello uterino y mama, como se ve en la Figura 1. La tincion de los microtubulos en estas celulas con un anticuerpo anti-tubulina alfa demuestra que en lugar de las fibras del huso mitotico de celulas no tratadas, solamente son visibles las estructuras en forma de puntos en las celulas tratadas. Este mismo efecto se muestra tambien utilizando compuestos C y B en las Figuras 2A y 2B, respectivamente, en la lmea celular de cancer de pulmon A549. Sin embargo, es muy distinto del observado con los agentes convencionales que fijan como objetivo microtubulos vinblastina, colchicina, paclitaxel y nocodazol tal como se ve en las Figuras 3B, 3C, 3D y 4, respectivamente. Los microtubulos se tineron con un anticuerpo anti-tubulina alfa y las celulas se vieron en un aumento de 1000 x (Figuras 3, 4). Para las celulas tratadas con BAL27862, son visibles multiples estructuras en forma de puntos, mientras que, en marcado contraste, los otros farmacos convencionales producen estructuras filamentosas de microtubulos o estructuras agregadas de microtubulos densas. Estas diferencias a nivel fenotfpico, en dosis de compuestos considerados optima en terminos de efecto antiproliferativo indican una diferencia en el modo de accion a nivel molecular.

Ademas, se sabe que BAL27862 provoca un fenotipo dominante de microtubulos en presencia de los otros agentes que fijan como objetivo microtubulos (vease tambien el poster "BAL27862: Un Nuevo Agente contra el Cancer que Disocia Microtubulos y Crea un Fenotipo Celular Distinto"). La presente solicitud tambien muestra que el tratamiento con vinblastina, colchicina, paclitaxel o nocodazol por sf solo induda los fenotipos de microtubulos caractensticos de estos agentes (Figuras 5A, 5D, 5G, 6C-6F, respectivamente). Sin embargo, el tratamiento de combinacion con BAL27862 durante las ultimas 4 horas dio lugar a la interrupcion de estos fenotipos; a pesar de la presencia continua de vinblastina, colchicina, paclitaxel o nocodazol (Figuras 5B, 5E, 5H, 6G-6J, respectivamente). En contraste, el tratamiento primero con BAL27862 y posteriormente durante 4 horas en combinacion con vinblastina, colchicina, paclitaxel o nocodazol no tuvo impacto alguno en la generacion del fenotipo compatible con el tratamiento con BAL27862 (Figuras 5C, 5F, 5I, 6K-6N, respectivamente).

EMBO Journal 6 (9), pags. 2597-2606 (1987) afirma que "los microtubulos que contienen tubulina destirosinada (glu- tubulina) son menos dinamicos". Una publicacion posterior, J. Cell Biol. 111, pags. 113-122 (1990) llega a una conclusion opuesta en cuanto al efecto de glu-tubulina en estabilidad de los microtubulos.

Cancer Res. 65(20), pags. 9406-9414 (2005) describe que celulas 2ME2R seleccionadas de farmacos (que estan asociadas con concentraciones elevadas de (Glu) tubulina destirosinada) son resistentes a desestabilizadores de microtubulos de alcaloides de la vinca, mmimamente resistentes a desestabilizadores de microtubulos del sitio de union a colchicina y no resistentes a estabilizadores de microtubulos paclitaxel y epotilona.

El poster "BAL27862: Un farmaco unico que fija como objetivo microtubulos suprime la dinamica de los microtubulos, corta los microtubulos y supera la resistencia a farmacos con Bcl-2 y relacionados con el subtipo tubulina", presentado en la 101a Reunion Anual de la Asociacion Americana para la Investigacion del Cancer, describe que BAL27862 produce un fenotipo de microtubulos unico distinto del observado con alcaloides de la vinca.

Neurobiology of Disease, 24 (3), pags. 525-530 (2006) describe que se ha demostrado que la degeneracion axonal inducida por paclitaxel se asocia con un aumento de la tubulina destirosinada (= glu-tubulina) y que la eritropoyetina humana recombinante previene la degeneracion axonal en neuronas sensoriales in vitro.

Todos estos datos demuestran que BAL27862 afecta a la biologfa de los microtubulos de una manera diferente que los agentes convencionales que fijan como objetivo microtubulos.

Por lo tanto, a partir de la informacion acerca de los agentes convencionales que fijan como objetivo microtubulos, las predicciones no pueden hacerse respecto a si, o como, genes particulares estan implicados en la accion de los compuestos de formula I.

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Un objeto de la presente invencion es identificar factores que esten asociados con la respuesta a compuestos de formula I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, por ejemplo, para identificar los factores asociados con la resistencia a los compuestos de formula general I, en particular BAL27862 o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se define mas adelante.

Sorprendentemente, se ha encontrado que glu-tubulina se puede utilizar como un biomarcador ex vivo de la respuesta al tratamiento con un compuesto de formula general I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se define mas adelante.

En una realizacion preferida de la invencion, concentraciones relativamente altas de glu-tubulina en una muestra de tumor se asocian con una resistencia inherente y adquirida a BAL27862 tal como se describe mas adelante.

La tubulina se somete a una diversidad de modificaciones post-traduccionales, incluyendo

destirosinacion/tirosinacion, acetilacion, glutamilacion, poliglicilacion, fosforilacion de residuos serina y fosforilacion de residuos tirosina, haciendola una de las protemas mas modificadas conocidas. Muchos genes de tubulina alfa descritos hasta la fecha predicen la presencia de una tirosina carboxi terminal en la tubulina. Actualmente se cree que una vez que la tubulina se polimeriza y se ensambla en los microtubulos, en algunos casos una carboxipeptidasa (tubulina carboxipeptidasa o tubulina tirosina carboxipeptidasa, TTCP) actua para separar la tirosina C-terminal de la tubulina alfa exponiendo el penultimo glutamato. Otra enzima, la tubulina tirosina ligasa (TTL), puede volver a conectar este tirosina. La funcion exacta de este ciclo de destirosinacion/tirosinacion en la celula aun no se ha dilucidado.

La forma de tubulina alfa que no tiene una tirosina, sino mas bien un glutamato en su extremo C-terminal se conoce como glu-tubulina o glu tubulina o tubulina destirosinada. El termino glu-tubulina se utilizara en esta memoria para referirse a la forma de la tubulina alfa con un glutamato como el aminoacido final en el extremo C. La designacion glu-tubulina comprendera tambien formas en las que pueden estar adicionalmente presentes otras modificaciones post-traduccionales. Se sabe que la tubulina alfa, que forma la base para la glu-tubulina, existe en multiples variantes, subtipos e isoformas, asf como que existen multiples genes de tubulina alfa que dan lugar los mismos, y todos estos tambien se incluiran en la designacion glu-tubulina, con la condicion de que un glutamato sea el aminoacido final en el extremo C. Preferentemente se refiere a variantes, subtipos e isoformas humanos de la tubulina alfa, con la condicion de que un glutamato sea el aminoacido final en el extremo C. En una realizacion mas preferida, un glutamato, no una tirosina, es el aminoacido final en el extremo C de la tubulina alfa despues de la modificacion post-traduccional. Subtipos de tubulina alfa incluyen, pero no se limitan a tubulina alfa 1A, tubulina alfa 1B, tubulina alfa 1C y tubulina alfa 3C/D. Las secuencias de protemas de estos subtipos son accesibles a traves de los siguientes Numeros de Referencia del Centro Nacional de Informacion Biotecnologica (NCBI) NP_006000, NP_006073, NP_116093 y NP_005992, respectivamente. Estos tambien se enumeran en las Figuras 11-14 (NP_006000.2, NP_006073.2, NP_116093.1, NP_005992.1,) como SEQ ID NO. 1-4, respectivamente. Glu-tubulina, tal como se describe anteriormente, no tiene la tirosina en el aminoacido final en el extremo C de las secuencias presentadas en SEQ. ID. NO. 1-4.

Un aspecto de la presente invencion se refiere al uso ex vivo de glu-tubulina como un biomarcador para predecir la respuesta a un compuesto, en el que el compuesto es un compuesto de formula general I,

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en donde

R representa fenilo, tienilo o piridinilo

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en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman, junto con el nitrogeno, heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;

R2, R3y R6 representan hidrogeno;

R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi;

y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmaceuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, ester o una amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal ester o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto,

o en donde

R representa fenilo o piridinilo

X representa oxfgeno;

R2, R3y R6 representan hidrogeno;

y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmaceuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, ester o amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal ester o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto,

La respuesta es de una enfermedad en un sujeto. Preferiblemente, la respuesta puede ser para el tratamiento, es decir, para el tratamiento con el compuesto de formula general I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos.

El biomarcador glu-tubulina se mide ex vivo en una muestra o muestras tomadas del cuerpo humano o animal, tomadas preferentemente del organismo humano.

En una realizacion preferida, la invencion se refiere al uso ex vivo de glu-tubulina como un biomarcador para predecir la resistencia de una enfermedad en un sujeto a un compuesto de formula general I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos como se define anteriormente.

El derivado farmaceuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en una sal, solvato, pro-farmaco tal como se define en esta memoria, sal de un pro-farmaco y polimorfo de un compuesto de formula general I tal como se ha definido anteriormente. Los pro-farmacos son esteres y amidas hidrolizables in vivo del compuesto de formula (I), preferiblemente esteres y amidas de aminoacidos de origen natural, pequenos peptidos o hidroxiacidos pegilados. Mas preferiblemente, el pro-farmaco es una amida formada a partir de un grupo amino presente en el grupo R del compuesto de formula general I y el grupo carboxi de glicina, alanina o lisina.

De manera particularmente preferible el compuesto es

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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, preferiblemente una sal hidrocloruro del mismo, lo mas preferiblemente una sal dihidrocloruro del mismo.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para predecir la respuesta de cancer en un sujeto a un compuesto de formula general I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se define anteriormente, que comprende las etapas de:

a) medir una concentracion de glu-tubulina en una muestra pre-obtenida del sujeto para obtener un valor o valores que representan esta concentracion; y

b) comparar el valor o los valores de la etapa a) con un valor estandar o un

conjunto de valores estandar de los sujetos con el mismo tipo de cancer, en donde una

concentracion de glu-tubulina superior en la muestra en relacion con el valor estandar o un conjunto de

valores estandares es predictiva de la resistencia del cancer de los sujetos al compuesto de

formula (I).

Ademas, preferiblemente la respuesta que se preve es la resistencia.

La medicion de una concentracion o concentraciones de glu-tubulina se lleva a cabo ex-vivo en una muestra o muestras pre-obtenidas del sujeto. Pre-obtenidas se refiere al hecho de que la muestra se obtiene antes de someterla a cualquier metodo que implique la medicion de la concentracion del biomarcador, y pre-obtenidas no ha de entenderse como en relacion con el tratamiento. En una realizacion preferida, una mayor concentracion de glu- tubulina en la muestra del sujeto con relacion al valor estandar o conjunto de valores estandares predice resistencia.

La enfermedad es cancer. De manera especialmente preferida, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de prostata, cancer cervical, cancer de ovario, cancer gastrico, cancer colorrectal (es decir, incluyendo el cancer de colon y cancer rectal), cancer de pancreas, cancer de tngado, cancer de cerebro, cancer neuroendocrino, cancer de pulmon, cancer de rinon, tumores malignos hematologicos, melanoma y sarcomas. De manera mas especialmente preferida, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer cervical, cancer de ovario, cancer colorrectal, melanoma y cancer de pulmon. En una realizacion especialmente preferida, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, melanoma, cancer de ovario y cancer colorrectal. En una realizacion particularmente preferida, en la que se determina la resistencia inherente, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, melanoma o cancer colorrectal. En otra realizacion particularmente preferida, en la que se determina la resistencia adquirida, el cancer es de pulmon o cancer de ovario.

En esta memoria tambien se describe un metodo de tratamiento de una enfermedad neoplasica o autoinmune, preferiblemente cancer, en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende medir una concentracion de glu- tubulina en una muestra del sujeto para obtener un valor o valores que representan esta concentracion, y tratar el sujeto con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se

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define anteriormente, si la concentracion de glu-tubulina en dicha muestra no es mayor que un valor estandar o un conjunto de valores estandares.

Glu-tubulina se puede utilizar en el tratamiento de una enfermedad neoplasica o autoinmune, preferiblemente cancer, en donde una concentracion de glu-tubulina en una muestra del sujeto se mide para obtener un valor o valores que representan esta concentracion, y el sujeto es tratado con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo como se define anteriormente, si la concentracion de glu-tubulina no es mayor que un valor estandar o un conjunto de valores estandares.

La medicion de una concentracion de glu-tubulina se lleva a cabo ex-vivo en una muestra pre-obtenida del sujeto.

En esta memoria tambien se describe un metodo de tratar una enfermedad neoplasica o autoinmune, preferiblemente cancer, disminuyendo primero la concentracion de glu-tubulina en un sujeto que tiene una muestra con una mayor concentracion de glu-tubulina en comparacion con una concentracion estandar o un conjunto de concentraciones estandares y, a continuacion, tratar al sujeto con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo como se define anteriormente.

En aun otro aspecto, la invencion se refiere a un kit para predecir la respuesta a un compuesto de formula I general o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente, que comprende los reactivos necesarios para medir la concentracion de glu-tubulina en una muestra. El kit tambien comprende un modulo de comparador que comprende un valor estandar o un conjunto de valores estandares con los que la concentracion de glu-tubulina en la muestra se compara como se define en las reivindicaciones.

El kit tambien comprende un compuesto de formula I o derivados farmaceuticamente aceptables del mismo tal como se define en las reivindicaciones o la siguiente formula o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos

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Nombre qmmico: [4-(2-{2-[4-(2-ciano-etilamino)-furazan-3-il]-benzoimidazol-1-il}-acetil)- fenil]-amida del acido S-2,6- diamino-hexanoico

En una realizacion particularmente preferida, la sal farmaceuticamente aceptable es una sal dihidrocloruro.

En una realizacion preferida, los reactivos en el kit comprenden un reactivo de captura que comprende un detector para glu-tubulina, y un reactivo detector. De manera especialmente preferida el reactivo de captura es un anticuerpo. Tambien preferiblemente, la enfermedad se predice para ser resistente al tratamiento con dicho compuesto cuando glu-tubulina es mayor en relacion con un valor estandar o un conjunto de valores estandares. En una realizacion preferida, el modulo de comparador esta incluido en las instrucciones de uso del kit. En otra realizacion preferida, el modulo de comparador esta en forma de un dispositivo de visualizacion.

Realizaciones de la presente invencion se describiran ahora a modo de ejemplo con referencia a las figuras adjuntas. La invencion, sin embargo, no ha de entenderse limitada a estas formas de realizacion.

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Breve Descripcion de las Figuras

Figura 1: Muestra el tratamiento de lmeas celulares de tumores humanos de diferentes histotipos con BAL27862 50 nM. Los microtubulos de celulas mitoticas o detenidas G2/M fueron tenidos despues de 24 horas de tratamiento con BAL27862 50 nM o vehfculo de control

Fig. 1A y 1B: celulas de NSCLC A549;

Fig. 1C y 1D: celulas de cancer cervical HeLa;

Fig. 1E y 1F: celulas de cancer de mama SKBR3 Tratamiento con control de vehuculo: Figuras 1A, 1C y 1E, tratamiento con BAL27862: Figuras 1B, 1D y 1F.

Figura 2: Muestra el tratamiento de celulas de NSCLC A549 con los Compuestos B y C. Los microtubulos de celulas mitoticas o detenidas G2/M de NSCLC A549 fueron tenidos despues de 24 horas de tratamiento con 80 nM o 20 nM de los Compuestos B y C, respectivamente. La barra de escala blanca representa 10 micrometros.

Fig. 2A: tratamiento con 20 nM de Compuesto C Fig. 2B: tratamiento con 80 nM de Compuesto B

Figura 3: Muestra una comparacion del tratamiento de celulas con BAL27862 en comparacion con los agentes convencionales que fijan como objetivo microtubulos. Microtubulos de celulas mitoticas o detenidas G2/M de NSCLC A549 fueron tenidos despues de 24 horas de tratamiento con 50 nM de A: BAL27862; B: vinblastina; C: colchicina; D: paclitaxel. Pilas de imagenes tomadas cada 1 pm, se procesaron utilizando el software ImageJ.

Figura 4: Muestra una comparacion del tratamiento de celulas de NSCLC A549 con BAL27862 en comparacion con nocodazol. Microtubulos de celulas mitoticas o detenidas G2/M fueron tenidos despues de 24 h de tratamiento con diversas concentraciones de nocodazol (B, C y D) y BAL27862 (E, F y G). A: control, B: Nocodazol 50 nM, C: Nocodazol 100 nM, D: Nocodazol 200 nM, E: BAL27862 20 nM; F: BAL27862 30 nM y G: BAL27862 50 nM. La barra de escala blanca representa 10 micrometros. Se muestran imagenes representativas de los fenotipos de microtubulos observados.

Figura 5: Muestra una combinacion de tratamiento con BAL27862 y agentes convencionales que fijan como objetivo microtubulos. Microtubulos de celulas mitoticas o detenidas G2/M de NSCLC A549 fueron tenidos despues del tratamiento durante los tiempos indicados mas adelante. Se utilizaron BAL27862 50 Nm, vinblastina 50 nM, colchicina 50 nM y paclitaxel 25 nM. La barra de escala blanca representa 10 micrometros.

Fig. 5A: Tratamiento con vinblastina durante 24 horas;

Fig. 5B: Tratamiento con vinblastina durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862;

Fig. 5C: Tratamiento con BAL27862 durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales vinblastina;

Fig. 5D: Tratamiento con colchicina durante 24 horas;

Fig. 5E: Tratamiento con colchicina durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862;

Fig. 5F: Tratamiento con BAL27862 durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales colchicina;

Fig. 5G: Tratamiento con paclitaxel durante 24 horas;

Fig. 5H: Tratamiento con paclitaxel durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862;

Fig. 5I: Tratamiento con BAL27862 durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales paclitaxel.

Figura 6: Muestra una combinacion de tratamiento con BAL27862 y nocodazol. Microtubulos de celulas mitoticas o detenidas G2/M de NSCLC A549 fueron tenidos despues del tratamiento durante los tiempos indicados mas adelante. Se utilizaron BAL27862 25 nM y nocodazol a las concentraciones indicadas a continuacion. La barra de escala blanca representa 10 micrometres.

Figo. 6A: Tratamiento con control durante 24 horas;

Figo. 6B: Tratamiento con BAL27862 25 nM durante 24 horas;

Figo. 6C: Tratamiento con nocodazol 50 nM durante 24 horas;

Figo. 6D: Tratamiento con nocodazol 100 nM durante 24 horas;

Figo. 6E: Tratamiento con nocodazol 150 nM durante 24 horas;

Figo. 6F: Tratamiento con nocodazol 200 nM durante 24 horas;

Fig. 6G: Tratamiento con nocodazol 50 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862 25 nM;

Fig. 6H: Tratamiento con nocodazol 100 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862 25 nM;

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Fig. 6I: Tratamiento con nocodazol 150 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862 25 nM;

Fig. 6J: Tratamiento con nocodazol 200 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862 25 nM;

Fig. 6K: Tratamiento con BAL27862 25 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales nocodazol 50 nM;

Fig. 6L: Tratamiento con BAL27862 25 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales nocodazol 100 nM;

Fig. 6M: Tratamiento con BAL27862 25 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales nocodazol 150 nM;

Fig. 6N: Tratamiento con BAL27862 25 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales nocodazol 200 nM;

Figura 7: Muestra extractos de protemas preparados a partir de cancer colorrectal derivado del paciente (Fig. 7A), cancer de pulmon (Fig. 7B) y tumores de melanoma (Fig. 7C) obtenidos de ratones xenoinjertados por via subcutanea, y se analizaron por inmunotransferencia para la expresion de glu-tubulina, con actina incluida como control de carga. Tres tumores independientes se analizaron en cada caso (1 - 3). La resistencia a BAL27862, paclitaxel y vinblastina y la sensibilidad es tal como se define en la Tabla 1.

Figura 8: Muestra mediante inmunohistoqmmica que las concentraciones de glu-tubulina en las celulas tumorales se incrementan en un tumor colorrectal xenoinjertado derivado del paciente definido como resistente a BAL27862 mediante analisis del brote de la colonia ex vivo. Se prepararon xenoinjertos de tumores derivados de los pacientes (mantenidos en ratones inmunodeficientes), se fijaron y se tineron para la expresion de protemas glu-tubulina utilizando inmunohistoqmmica. La resistencia a BAL27862, paclitaxel y vinblastina y la sensibilidad es tal como se define en la Tabla 1.

Figura 9: Muestra las lmeas de celulas tumorales que han sido seleccionados en cuanto a la resistencia a BAL27862 a traves de cultivo in vitro en presencia del compuesto. Sobre la base de determinaciones de CI50, factores de resistencia de BAL27862 frente a lmeas parentales fueron: A549 (3,0 veces); SKOV3 (7,6 veces - resistente a 1 lmea); H460 (5,3 veces) (vease la Tabla 2). Extractos de protemas de celulas enteras se han preparado a partir de lmeas parentales y resistentes y se han analizado por inmunotransferencia para la expresion de glu-tubulina. Las concentraciones de actina se incluyeron como control de carga.

Figura 10: Muestra que concentraciones incrementadas de protemas glu-tubulina se mantienen en lmeas tumorales SKOV3 durante el desarrollo de la resistencia. Se seleccionaron lmeas de celulas tumorales SKOV3 para la resistencia a BAL27862 a traves de cultivo in vitro en presencia de BAL27862 para aumentar los penodos de tiempo. Sobre la base de determinaciones de CI50, los factores de resistencia de BAL27862 frente a lmeas parentales fueron: SKOV3 resistente 1 (7,6 veces), SKOV3 resistente 2 (11,6 veces) (vease la Tabla 2). Extractos de protemas de celulas enteras se prepararon a partir de lmeas parentales y resistentes y se analizaron por inmunotransferencia para la expresion de glu-tubulina. Las concentraciones de actina actuan como un control de la carga.

Figura 11: Muestra la secuencia de protemas de la cadena de tubulina alfa-1A [Homo sapiens] (SEQ ID No. 1)

Figura 12: Muestra la secuencia de protemas de la cadena de tubulina alfa-1B [Homo sapiens] (SEQ ID No. 2)

Figura 13: Muestra la secuencia de protemas de la cadena de tubulina alfa-1C [Homo sapiens] (SEQ ID No. 3)

Figura 14: Muestra la secuencia de protemas de la cadena de tubulina alfa-3C/D [Homo sapiens] (SEQ ID No. 4).

Descripcion Detallada

Compuestos de formula I

Los compuestos estan representados por la formula general I:

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en donde

R representa fenilo, tienilo o piridinilo

R2, R3y R6 representan hidrogeno;

y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos segun se definen en las reivindicaciones, o en donde

R representa fenilo o piridinilo,

X representa oxfgeno;

R2, R3v R6 representan hidrogeno;

y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos segun se definen en las reivindicaciones; y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un maximo de 7, especialmente hasta e incluye un maximo de 4 atomos de carbono.

Heterociclilo designa preferiblemente un anillo saturado, parcialmente saturado o insaturado, mono- o bi-ciclico que contiene 4-10 atomos que comprenden uno, dos o tres heteroatomos seleccionados de nitrogeno, oxfgeno y azufre, que puede estar, a menos que se especifique lo contrario, enlazado a carbono o nitrogeno, en el que un atomo de nitrogeno del anillo puede estar opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado entre alquilo inferior, amino- alquilo inferior, arilo, arilo-alquilo inferior y acilo, y un atomo de carbono del anillo puede estar sustituido con alquilo inferior, amino-alquilo inferior, arilo, arilo-alquilo inferior, heteroarilo, alcoxi inferior, hidroxi u oxo. Ejemplos de heterociclilo son pirrolidinilo, oxazolidinilo, tiazolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, dioxolanilo y tetrahidropiranilo.

Acilo designa, por ejemplo, alquilcarbonilo, ciclohexilcarbonilo, arilcarbonilo, aril-alquil inferior-carbonilo o heteroarilcarbonilo. Acilo inferior es preferiblemente alquil inferior-carbonilo, en particular propionilo o acetilo.

Preferiblemente, el compuesto de formula general I se define como en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, acetilo, CH2CH2CN y CH2CH2CH2OH.

5 En una realizacion preferida, el compuesto de formula general I se selecciona del grupo que consiste en:

4-(1-fenacil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina,

4-[1-(4-bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima, N-{4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il}-acetamida, 4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina 10 4-[l-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(3-hidroxipropil)-amina, 4-[l-(3-amino-4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina 4-[l-(3-metoxi-4-metoximetoxi-fenacilo)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina, y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos.

En otra realizacion preferida, el compuesto de formula general I se selecciona del grupo que consiste en:

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en donde

R, Y y R1 se definen como sigue:

R: Y R1

JJ: O H

a: NOH H

a: NOMe H

jcr: O H

XT: NOH H

: NOH H

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O

CH2CH2CN

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O

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O

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O

CH2CH2CH2OH

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O

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O

CH2CH2CN

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O

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O

CH2CH2CN

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O

CH2CH2CN

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O

CH2CH2CN

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O

H

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O

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XX

O

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O

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O

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O

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O

H„N.

XX

O

CH2CH2CN

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O

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O

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O

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H

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O

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O

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O

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O

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O

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O

CH2CH2CN

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O

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O

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O

CH2CH2CN

H

o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen anteriormente.

Aun en una realizacion preferida, el compuesto de formula general I se selecciona del grupo que consiste en: 4-(1-fenoximetil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina,

5 4-[1-(4-fluorofenoximetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina,

4-[l-(3,4-dimetilfenoximetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina y compuestos representados por la formula:

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en donde R y R1 son como se definen a continuacion

R1

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CH2CH2CN

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CH2CH2CN

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CH2CH2CN

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R

H

R1

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R

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H

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CH2CH2CN

CH2CH2CH2OH

H

y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen anteriormente.

En aun otra realizacion preferida, el compuesto de formula general I es:

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en donde R, R4y R5son como se definen a continuacion

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Me

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Me

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Me

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Me

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Me

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OMe

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OMe

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OMe

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OMe

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R

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o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen anteriormente. Mas preferiblemente, el compuesto es un compuesto de formula general I

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5 en donde

R representa fenilo o piridinilo,

en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo inferior, alcoxi inferior, amino, acetilamino, halogeno y nitro; y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con amino o halogeno;

10 X representa un grupo C=O;

R1 representa hidrogeno o ciano- alquilo inferior;

R2, R3, R4, R5y R6representan hidrogeno;

y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen anteriormente, y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un maximo de 7, especialmente hasta e 15 incluye un maximo de 4 atomos de carbono.

De manera especialmente preferida, el compuesto esta representado por la siguiente formula

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en donde R, Y y R1 se definen como sigue:

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De manera mas especialmente preferida, el compuesto esta representado por la siguiente formula

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en donde R, Y y R1 se definen como sigue:

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De manera particularmente preferida, el compuesto es

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El termino derivado o derivados en la frase "derivado farmaceuticamente aceptable" o "derivados farmaceuticamente aceptables" de los compuestos de formula general I se refiere a sales, solvatos y complejos de los mismos y a solvatos y complejos de sales de los mismos, asf como a pro-farmacos tal como se define en esta memoria, y polimorfos y tambien sales de pro-farmacos de los mismos tal como se definen anteriormente.

En una realizacion mas preferida, se refiere a sales y pro-farmacos, asf como a sales de profarmacos de los mismos tal como se definen anteriormente.

Las sales son preferiblemente sales por adicion de acidos. Las sales se forman, preferiblemente con acidos organicos o inorganicos, a partir de compuestos de formula (I) con un atomo de nitrogeno de caracter basico, especialmente las sales farmaceuticamente aceptables. Acidos inorganicos adecuados son, por ejemplo, acidos halogenados tales como acido clorlddrico, acido sulfurico o acido fosforico. Acidos organicos adecuados son, por ejemplo, los acidos carboxflico, fosfonico, sulfonico o sulfamico, por ejemplo, acido acetico, acido propionico, acido octanoico, acido decanoico, acido dodecanoico, acido glicolico, acido lactico, acido fumarico, acido succmico, acido ad^pico, pimelico acido, acido suberico, acido azelaico, acido malico, acido tartarico, acido dtrico, aminoacidos tales como acido glutamico o acido aspartico, acido maleico, acido hidroximaleico, acido metilmaleico, acido ciclohexanocarboxflico, acido adamantanocarbox^lico, acido benzoico, acido salidlico, acido 4-aminosalidlico, acido ftalico, acido fenilacetico, acido mandelico, acido cinamico, acido metano- o etano-sulfonico, acido 2- hidroxietanosulfonico, acido etano-1,2-disulfonico, acido bencenosulfonico, acido 2-naftalenosulfonico, acido 1,5- naftaleno-disulfonico, acido 2-, 3- o 4-metilbencenosulfonico, acido metilsulfurico, acido etilsulfurico, acido dodecilsulfurico, acido N-ciclohexilsulfamico, acido N-metil-, N-etil- o N-propil-sulfamico, u otros acidos protonicos organicos tales como acido ascorbico.

El compuesto de formula (I) se puede administrar en forma de un pro-farmaco que se descompone en el cuerpo humano o animal para dar el compuesto de la formula I. Los pro-farmacos son esteres y amidas hidrolizables in vivo de un compuesto de la formula I. Pro-farmacos particulares considerados son esteres y amidas de aminoacidos que se producen de forma natural y esteres o amidas de peptidos pequenos, en particular peptidos pequenos que consisten en hasta cinco, preferiblemente en dos o tres aminoacidos, asf como esteres y amidas de hidroxiacidos pegilados, preferiblemente acido hidroxi-acetico y acido lactico. Esteres de pro-farmacos se forman a partir de la funcion acido del aminoacido o el extremo C del peptido y grupo o grupos hidroxi adecuados en el compuesto de formula I. Amidas de pro-farmacos se forman a partir de la funcion amino del aminoacido o el extremo N del peptido y grupo o grupos carboxi adecuados en el compuesto de formula I, o de la funcion acido del aminoacido o el extremo C del peptido y grupo o grupos amino adecuados en el compuesto de formula I. De manera particularmente preferida, las amidas de pro-farmacos se forman a partir del o de los grupos amino presentes en el grupo R de formula I.

Mas preferiblemente, el pro-farmaco se forma por la adicion de glicina, alanina o lisina al compuesto de formula I.

Incluso mas preferiblemente, el compuesto de formula general I esta en forma de un pro-farmaco seleccionado de los compuestos de formulas:

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y

En una realizacion especialmente preferida, el compuesto de formula general I esta en forma de un pro-farmaco que tiene la siguiente formula

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5 En una realizacion mas especialmente preferida, el compuesto es una sal farmaceuticamente aceptable, preferiblemente una sal hidrocloruro, lo mas preferiblemente una sal dihidrocloruro, de un compuesto de la siguiente formula

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El metabolito farmaceuticamente activo in vivo en este caso es BAL27862.

10 Estos pro-farmacos se pueden preparar mediante procedimientos que son conocidos per se, en particular, un procedimiento en el que un compuesto de formula (II)

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en donde R1 se define como para la formula (I) y Z es CH o N, o un derivado de un compuesto de este tipo que comprende grupos funcionales en forma protegida, o una sal del mismo

(1) se acila con un aminoacido de formula (III)

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en donde

R10se selecciona de hidrogeno (Gly); metilo (Ala) y aminobutilo protegido (Lys) y R11 es un grupo protector adecuado de amino, y

(2) cualesquiera grupos protectores en un derivado protegido del compuesto resultante se separan para producir un pro-farmaco del compuesto (II) tal como se muestra arriba y, si se desea,

(3) dicho pro-farmaco se convierte en una sal mediante tratamiento con un acido, o una sal de un compuesto de formula (II) se convierte en el correspondiente compuesto libre de formula (II) o en otra sal, y/o una mezcla de compuestos de productos isomericos se separa en los isomeros individuales.

La acilacion de un compuesto de formula (II) con un aminoacido de formula (III) se lleva a cabo de una manera conocida per se, habitualmente en presencia de un disolvente aprotico polar o dipolar adecuado, con enfriamiento o calentamiento segun se requiera, por ejemplo en un intervalo de temperaturas de aproximadamente menos 80°C a aproximadamente mas 150°C, mas preferiblemente de menos 30°C a mas 120°C, especialmente en un intervalo de aproximadamente alrededor de 0°C a la temperatura de reflujo del disolvente utilizado. Opcionalmente se anade una base adecuada, en particular una base aromatica tal como piridina o colidina o una base de amina terciaria tal como trietilamina o diisopropiletilamina, o una sal inorganica de caracter basico, p. ej., carbonato de potasio o de sodio.

La acilacion puede llevarse a cabo en las condiciones utilizadas para la formacion de amidas conocida per se en la qmmica de los peptidos, p. ej., con agentes activantes para el grupo carboxi tales como carbodiimidas tales como N,N'-dietil-, N,N'-dipropil-, N,N'-diisopropil-, N,N'-diciclohexil-carbodiimida e hidrocloruro de N-(3-

dimetilaminoisopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC), o con agentes tales como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)-fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de O-(7-aza- benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HATU), tetrafluoroborato de 2-(2-oxo-1-(2H)piridil)-1,1,3,3- tetrametiluronio (TPTU), opcionalmente en presencia de bases, catalizadores o co-reactivos adecuados. El grupo carboxi puede tambien ser activado como haluro de acilo, preferiblemente como cloruro de acilo, p. ej., por reaccion con cloruro de tionilo o cloruro de oxalilo, o como anhfdrido simetrico o asimetrico, p. ej., por reaccion con halogenoformiatos tales como cloroformiato de etilo, opcionalmente en presencia de bases, catalizadores o co- reactivos adecuados.

Si uno o mas de otros grupos funcionales, por ejemplo carboxi, hidroxi o amino, estan o necesitan ser protegidos en un compuesto de formula (II) o (III), debido a que no deben formar parte de la reaccion, estos son grupos protectores tales como los que se emplean normalmente en la smtesis de amidas tales como, en particular compuestos peptfdicos, cefalosporinas, penicilinas, derivados de acidos nucleicos y azucares, que son conocidos por personas expertas. Grupos protectores adecuados para grupos amino son, por ejemplo, carbamato de t-butilo, carbamato de bencilo o carbamato de 9-fluorenilmetilo.

Los grupos protectores pueden estar ya presentes en precursores y deben proteger a los grupos funcionales en cuestion frente a reacciones secundarias no deseadas tales como alquilaciones, acilaciones, eterificaciones,

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esterificaciones, oxidaciones, solvolisis y reacciones similares. Es una caractenstica de los grupos protectores que se prestan facilmente, es decir, sin reacciones secundarias no deseadas, a la separacion, tfpicamente por solvolisis, reduccion, fotolisis o tambien por actividad enzimatica, por ejemplo bajo condiciones analogas a las condiciones fisiologicas, y que no estan presentes en los productos finales. El especialista conoce, o puede establecer facilmente, que grupos protectores son adecuados con las reacciones mencionadas anteriormente en esta memoria y de aqu en adelante.

La proteccion de grupos funcionales de este tipo mediante tales grupos protectores, los propios grupos protectores, y sus reacciones de separacion se describen, por ejemplo, en libros de referencia estandares para la smtesis de peptidos y en libros especiales sobre grupos protectores tales como

J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Londres y Nueva York 1973, en "Methoden der organischen Chemie" (Methods of organic chemistry), Houben-Weyl, 4a edicion, Volumen 15/l, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, y en T. W. Greene, G. M. Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, Nueva York, 2006.

Enfermedad

Los compuestos de formula general I han demostrado detener la proliferacion celular e inducir la muerte celular, por ejemplo por apoptosis.

La desregulacion de la proliferacion celular, o la falta de una muerte celular apropiada, tiene una amplia gama de implicaciones clmicas. Un cierto numero de enfermedades asociadas con una desregulacion de este tipo implican hiperproliferacion, inflamacion, remodelacion y reparacion de tejidos. Indicaciones familiares en esta categona incluyen canceres, restenosis, hiperplasia neointimal, angiogenesis, endometriosis, trastornos linfoproliferativos, patologfas relacionadas con el trasplante (rechazo del injerto), poliposis, perdida de la funcion neural en el caso de remodelacion de tejidos y similares.

El cancer se asocia con tasas de proliferacion celular y muerte celular anormales. Dado que la apoptosis es inhibida o retrasada en la mayona de los tipos de enfermedades proliferativas, neoplasicas, la induccion de la apoptosis es una opcion para el tratamiento del cancer, especialmente en tipos de cancer que muestran resistencia a la quimioterapia clasica, la radiacion y la inmunoterapia (Apoptosis and Cancer Chemotherapy, Hickman y Dive, comps., Blackwell Publishing, 1999). Tambien en enfermedades y patologfas autoinmunes y relacionadas con el trasplante se puede utilizar compuestos que inducen la apoptosis para restablecer los procesos de muerte celular normal y, por lo tanto, pueden erradicar los smtomas y podnan curar las enfermedades. Otras aplicaciones de compuestos que inducen la apoptosis pueden ser la restenosis, es decir, la acumulacion de celulas de la musculatura lisa vascular en las paredes de las arterias, y en infecciones persistentes provocadas por un fallo de erradicar celulas infectadas por bacterias y virus. Ademas, la apoptosis puede ser inducida o restablecida en celulas epiteliales, en celulas endoteliales, en las celulas de la musculatura y en otras que han perdido contacto con la matriz extracelular.

Un compuesto de acuerdo con la formula general I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos se puede usar para el tratamiento profilactico o especialmente terapeutico del cuerpo humano, en particular para el tratamiento de una enfermedad neoplasica, enfermedad autoinmune, patologfa relacionada con el trasplante y/o enfermedad degenerativa. Ejemplos de tales enfermedades neoplasicas incluyen, pero no se limitan a neoplasias epiteliales, neoplasias de celulas escamosas, neoplasias de celulas basales, papilomas de celulas de transicion y carcinomas, adenomas y adenocarcinomas, neoplasias anexiales y fanera, neoplasias mucoepidermoides, neoplasias qrnsticas, neoplasias mucinosas y serosas, neoplasias ducales, lobulares y medulares, neoplasias de celulas acinares, neoplasias epiteliales complejas, neoplasias gonadales especializadas, paragangliomas y tumores del glomus, nevus y melanomas, tumores de tejido blando y sarcomas, neoplasias fibromatosas, neoplasias mixomatosas, neoplasias lipomatosas, neoplasias miomatosas, neoplasias mixtas complejas y estromales, neoplasias fibroepiteliales, neoplasias tipo sinoviales, neoplasias mesoteliales, neoplasias de celulas germinales, neoplasias trofoblasticas, mesonefromas, tumores de los vasos sangumeos, tumores de los vasos linfaticos, neoplasias oseas y condromatosas, tumores de celulas gigantes, tumores oseos miscelaneos, tumores odontogenicos, gliomas, neoplasias neuroepiteliomatosas, meningiomas, tumores de la vaina nerviosa, tumores de celulas granulares y sarcomas de las partes blandas alveolares, linfomas de Hodgkin y no Hodgkin, otras neoplasias linforreticulares, tumores de celulas plasmaticas, tumores de mastocitos, enfermedades inmunoproliferativas, leucemias, trastornos mieloproliferativos miscelaneos, trastornos linfoproliferativos y smdromes mielodisplasicos.

Los compuestos de formula I general o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos se pueden utilizar para tratar enfermedades autoinmunes. Ejemplos de tales enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a

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lupus eritematoso cutaneo sistemico, discoide o subagudo, artritis reumatoide, smdrome antifosfol^pido, CREST, esclerosis sistemica progresiva, enfermedad mixta del tejido conjuntivo (smdrome de Sharp), smdrome de Reiter, artritis juvenil, enfermedad de aglutinina fna, crioglobulinemia mixta esencial, fiebre reumatica, espondilitis anquilosante, poliartritis cronica, miastenia grave, esclerosis multiple, polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica, smdrome de Guillan-Barre, dermatomiositis/polimiositis, anemia hemolftica autoinmune, purpura trompocitopenica, neutropenia, diabetes mellitus tipo I, tiroiditis (incluida la enfermedad de Hashimoto y de Grave), enfermedad de Addison, smdrome poliglandular, penfigo (vulgar, foliaceo, sebaceo y vegetante), penfigoide ampolloso y cicatricial, penfigoide gestacional, epidermolisis ampollosa adquirida, enfermedad de IgA lineal, liquen escleroso y atrofico, enfermedad de Duhring, psoriasis vulgar, guttata, psoriasis pustular generalizada y pustular localizada, vitiligo, alopecia areata, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune, todas las formas de glomerulonefritis, hemorragia pulmonar (smdrome de Goodpasture), nefropatfa por IgA, anemia perniciosa y gastritis autoinmune, enfermedades inflamatorias del intestino (incluyendo colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), enfermedad de Behcet, enfermedad celiaca-bebedero, uveftis autoinmune, miocarditis autoinmune, orquitis granulomatosa, aspermatogenesis sin orquitis, fibrosis pulmonar idiopatica y secundaria, enfermedades inflamatorias con una posibilidad de patogenesis autoinmune tal como pioderma gangrenoso, liquen ruber, sarcoidosis (incluyendo Lofgren y de tipo cutanea/subcutanea), granuloma anular, reaccion inmunologica alergica tipo I y tipo IV, asma bronquial, polinosis, dermatitis atopica, de contacto y por el aire, vasculitis de grandes vasos (arteritis de celulas gigantes y de Takayasu), vasculitis de vasos de tamano mediano (poliarteritis nodosa, enfermedad de Kawasaki), vasculitis de vasos pequenos (granulomatosis de Wegener, smdrome de Churg Strauss, polangiitis microscopica, purpura de Henoch Schoenlein, vasculitis crioglobulinemica esencial, angiitis cutanea leucoclastica), smdromes de hipersensibilidad, necrolisis epidermica toxica (smdrome de Stevens-Johnson, eritema multiforme), enfermedades debidas a los efectos secundarios de los farmacos, todas las formas de efectos cutaneos, espedficos para organos y sistemicos debidos al tipo I-vu (clasificacion de Coombs) formas inmunologicas de reaccion, patologfas relacionadas con el trasplante tales como enfermedad de injerto aguda y cronica frente a huesped e injerto frente a huesped, que implican todos los organos (piel, corazon, rinon, medula osea, ojo, hugado, bazo, pulmon, musculo, sistema nervioso central y periferico, tejido conjuntivo, hueso, vasos sangumeos y linfaticos, sistema genito-urinario, ofdos, cartflago , sistema linfatico primario y secundario incluyendo medula osea, ganglios linfaticos, timo, tracto gastrointestinal, incluyendo oro-faringe, esofago, estomago, intestino delgado, colon y recto, incluidas partes de los organos anteriormente mencionados hasta la concentracion y subestructuras de celulas individuales, p. ej., celulas madre).

De manera particularmente preferible, la enfermedad es una enfermedad neoplasica o autoinmune. En una realizacion especialmente preferida, la enfermedad es cancer.

Ejemplos de canceres en terminos de los organos y partes del cuerpo afectadas incluyen, pero no se limitan al cancer de mama, cuello uterino, ovario, colon, recto, (incluyendo colon y recto es decir, cancer colorrectal), pulmon (incluyendo cancer de pulmon de celulas pequenas cancer, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de pulmon de celulas grandes y mesotelioma), hueso, sistema endocrino, glandula adrenal, timo, hugado, estomago, intestino (incluyendo el cancer gastrico), pancreas, medula osea, tumores malignos hematologicos, (tales como linfoma, leucemia, mieloma o tumores malignos linfoides), vejiga, tracto urinario, rinones, piel, tiroides, cerebro, cabeza, cuello, prostata y testmulos. Preferiblemente, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de prostata, cancer cervical, cancer de ovario, cancer gastrico, cancer colorrectal, cancer de pancreas, cancer de hugado, cancer de cerebro, cancer neuroendocrino, cancer de pulmon, cancer de rinon, tumores malignos hematologicos, melanoma y sarcomas. De manera especialmente preferida, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer cervical, cancer de ovario, cancer colorrectal, melanoma y cancer de pulmon. De manera mas especialmente preferida, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, melanoma, cancer de ovario y cancer colorrectal. En otra realizacion preferida, para el caso en el que la resistencia predicha es resistencia adquirida, el cancer es cancer de pulmon o cancer de ovario. En aun otra realizacion preferida, para el caso en el que la resistencia predicha es resistencia inherente, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer colorrectal, cancer de pulmon o melanoma.

Muestras

La medicion de la concentracion de glu-tubulina se puede realizar in vitro, en una muestra de tejido biologico derivada del sujeto. La muestra puede ser cualquier material biologico separado del cuerpo tal como, por ejemplo, tejido normal, tejido tumoral, lmeas celulares, sangre entera, suero, plasma, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido linfatico, celulas tumorales circulantes, lisado celular, lisado tisular, orina y aspirados. Preferiblemente, la muestra se deriva de tejido normal, tejido tumoral o celulas tumorales circulantes. Mas preferiblemente, la muestra se deriva de tejido tumoral o celulas tumorales circulantes. En una realizacion particularmente preferida, la muestra se deriva de tejido

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tumoral. Por ejemplo, la concentracion de glu-tubulina se puede medir en una muestra de tejido tumoral reciente, congelada o fijada en formalina/embebida en parafina.

La muestra se pre-obtiene del sujeto antes de que la muestra sea sometida a las etapas del metodo que implican medir la concentracion del biomarcador. Los metodos para la separacion de la muestra son bien conocidos en la tecnica, y puede ser separada, por ejemplo, del sujeto por biopsia, por ejemplo, mediante biopsia por puncion, biopsia de nucleo o biopsia con aguja fina de aspiracion, biopsia endoscopica o biopsia superficial. La sangre puede ser recogida por puncion venosa y puede ser procesada adicionalmente de acuerdo con tecnicas estandares. Las celulas tumorales circulantes tambien pueden obtenerse a partir de sangre sobre la base de, por ejemplo, el tamano (p. ej., ISET - Aislamiento por Tamano de las Celulas Tumorales del Epitelio) o el enriquecimiento celular inmunomagnetico (p. ej., Cellsearch®, Veridex, Raritan, NJ)

Comparacion de la muestra

El sujeto puede ser humano o animal. Preferiblemente, el sujeto es humano.

El biomarcador glu-tubulina se mide ex vivo en una muestra o muestras tomadas del cuerpo humano o animal, tomada preferentemente del cuerpo humano. La muestra o muestras se pre-obtienen del cuerpo humano o animal, preferiblemente se pre-obtienen del cuerpo humano antes de que la muestra se someta a las etapas del metodo que implica medir la concentracion del biomarcador.

Un biomarcador es, en general, una sustancia que se utiliza como un indicador de una respuesta biologica, preferiblemente como un indicador de la susceptibilidad a un tratamiento dado, que en la presente solicitud es el tratamiento con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo.

En una realizacion particularmente preferida, concentraciones elevadas de glu-tubulina en la muestra con respecto a un valor estandar o conjunto de valores estandar predice resistencia.

Tal como se utiliza en esta memoria, un aumento o concentraciones relativamente altas o altas o mayores en relacion con una concentracion estandar o conjunto de concentraciones estandares significa la cantidad o concentracion del biomarcador en una muestra es detectablemente mayor en la muestra con relacion a la concentracion estandar o conjunto de concentraciones estandares. Esto abarca al menos un incremento de, o una concentracion mayor que, aproximadamente 1% con relacion al estandar, preferiblemente al menos un aumento de aproximadamente 5% con relacion al estandar. Mas preferiblemente, es un incremento de, o una concentracion mayor que, al menos aproximadamente 10% con relacion al estandar. De manera mas particularmente preferida, es un incremento de, o una concentracion mayor que, al menos aproximadamente 20% con relacion al estandar. Por ejemplo, un incremento de, o una concentracion mayor que, puede incluir, pero no se limita a, al menos aproximadamente 1%, aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 50%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 100%, aproximadamente 150% o aproximadamente 200% o mas con respecto a la norma.

Preferiblemente, concentraciones mas altas de glu-tubulina en una muestra o muestras

i) con respecto a un valor estandar o un conjunto de valores estandares de sujetos con el mismo histotipo del tumor; o

ii) tomadas despues del inicio del tratamiento y en comparacion con una muestra o muestras tomadas del mismo sujeto antes de iniciar el tratamiento; o

iii) con relacion a un valor estandar o un conjunto de valores estandares a partir de celulas o tejidos normales;

son predictivas de resistencia.

La medicion de una concentracion de glu-tubulina se lleva a cabo ex-vivo en una muestra pre-obtenida del sujeto. Ademas, preferiblemente la respuesta que ha de ser predicha es la resistencia.

Mas preferiblemente, concentraciones mas altas de glu-tubulina en una muestra o muestras

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ii) tomadas despues del inicio del tratamiento y en comparacion con una muestra o muestras tomadas del mismo sujeto antes de iniciar el tratamiento;

son predictivas de resistencia.

De manera especialmente preferida, concentraciones mas altas de glu-tubulina en una muestra o muestras con respecto a un valor estandar o un conjunto de valores estandares de sujetos con el mismo histotipo del tumor son predictivas de resistencia.

En una realizacion preferida, para el caso i) en el que la medicion se compara en una muestra o muestras con respecto a un valor estandar o un conjunto de valores estandares a partir de muestras de sujetos con el mismo histotipo de tumor que la muestra a la que se ha de comparar, el valor estandar o conjunto de valores estandares se establece a partir de muestras de una poblacion de sujetos con ese tipo de cancer. Las muestras de estos sujetos estandares pueden derivarse, por ejemplo, del tejido tumoral, celulas tumorales circulantes o de sangre, siempre que el origen de la muestra sea consistente entre el patron y la muestra a comparar.

En otra realizacion preferida, para el caso ii) en el que la medicion se compara en una muestra o muestras tomadas despues del inicio del tratamiento y en comparacion con una muestra o muestras tomadas del mismo sujeto antes del inicio del tratamiento, se mide preferentemente para predecir la resistencia adquirida. Las muestras se comparan con celulas o tejido del mismo origen biologico. La prediccion de la resistencia adquirida indicana entonces que el tratamiento con el compuesto debena ser interrumpido. El biomarcador es asf utilizado para controlar si es probable que el tratamiento adicional con el compuesto de la respuesta requerida (p. ej., reduccion de celulas anormales), o si las celulas se han convertido en no sensibles o resistentes a dicho tratamiento.

En aun otra realizacion preferida, para el caso iii) en el que la medicion se compara en una muestra o muestras con respecto a un valor estandar o conjunto de valores estandares a partir de celulas o tejidos normales, el valor estandar o un conjunto de valores estandares puede ser establecido a partir de una muestra de celulas normales (p. ej., no tumorales) o tejido o fluido corporal. Tales datos pueden ser recogidos de una poblacion de sujetos con el fin de desarrollar el valor estandar o conjunto de valores estandares.

El valor estandar o conjunto de valores estandares se establece ex-vivo de las muestras pre-obtenidas, que puede ser de lmeas celulares o, preferiblemente, de material biologico de al menos un sujeto y mas preferiblemente de una media de sujetos (p. ej., n = 2 hasta 1000 o mas). El valor estandar o conjunto de valores estandares puede entonces ser correlacionado con los datos de respuesta de las mismas lmeas celulares, o mismos sujetos, al tratamiento con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo. A partir de esta correlacion, se puede establecer un modulo de comparador, por ejemplo, en forma de una escala o sistema de puntuacion relativo, incluyendo opcionalmente los valores de corte o umbrales, que indique las concentraciones de biomarcador asociadas con un espectro de niveles de respuesta para el compuesto de formula I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo. El espectro de niveles de respuesta puede comprender la sensibilidad relativa con la actividad terapeutica del compuesto, (p. ej., alta sensibilidad a baja sensibilidad), asf como la resistencia a la actividad terapeutica. En una realizacion preferida, este modulo de comparador comprende un valor de corte o conjunto de valores que predice resistencia al tratamiento.

Por ejemplo, si se utiliza un metodo inmunohistoqmmico para medir la concentracion de glu-tubulina en una muestra, los valores estandares pueden estar en forma de un sistema de puntuacion. Un sistema de este tipo podna tener en cuenta el porcentaje de celulas en las que esta presente la tincion para la glu-tubulina. El sistema tambien puede tener en cuenta la intensidad relativa de la tincion en las celulas individuales. Los valores estandares o el conjunto de valores estandares de la concentracion de glu-tubulina pueden entonces correlacionarse con datos que indican la respuesta, especialmente la resistencia del sujeto o tejido o lmea celular a la actividad terapeutica de un compuesto de formula I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo. Tales datos pueden entonces formar parte de un modulo de comparador.

La respuesta es la reaccion de las lmeas celulares o, preferiblemente, del sujeto, o mas preferiblemente de la enfermedad en un sujeto, a la actividad terapeutica de un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo. El espectro de niveles de respuesta puede comprender la sensibilidad con respecto a la actividad terapeutica del compuesto (p. ej., alta sensibilidad a baja sensibilidad), asf como la

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resistencia a la actividad terapeutica. Los datos de respuesta pueden ser monitoreados, por ejemplo, en terminos de: tasas de respuesta objetiva, tiempo hasta la progresion de la enfermedad, progresion de la supervivencia libre y la supervivencia global.

La respuesta de una enfermedad cancerosa se puede evaluar utilizando criterios bien conocidos por una persona en el campo del tratamiento del cancer, por ejemplo, pero no restringido a,

directrices de criterios de evaluacion de respuesta en tumores solidos (RECIST), Fuente: Eisenhauer EA, Therasse P, Bogaerts J, Schwartz LH, Sargent D, Ford R, Dancey J, Arbuck S, Gwyther S, Mooney M, Rubinstein L, Shankar L, Dodd L, Kaplan R, Lacombe D, Verweij J. New response evaluation criteria in solid tumours: directriz RECIST revisada (version 1.1). Eur J Cancer.2009; 45:228-47;

RANO Criteria for High-Grade Gliomas, Fuente: Wen PY, Macdonald DR, Reardon DA, Cloughesy TF, Sorensen AG, Galanis E, Degroot J, Wick W, Gilbert MR, Lassman AB, Tsien C, Mikkelsen T, Wong ET, Chamberlain MC, Stupp R, Lamborn KR, Vogelbaum MA, van den Bent MJ, Chang SM. Updated response assessment criteria for high-grade gliomas: response assessment in neuro-oncology working group. J Clin Oncol. 2010;28(11):1963-72;

CA-125 Rustin Criteria for Ovarian Cancer Response, Fuente: Rustin GJ, Quinn M, Thigpen T, du Bois A, Pujade- Lauraine E, Jakobsen A, Eisenhauer E, Sagae S, Greven K, Vergote I, Cervantes A, Vermorken J. Re: New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors (ovarian cancer). J Natl Cancer Inst. 2004; 96(6):487-8;

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PSA Working Group 2 Criteria for Prostate Cancer Response,

Source: Scher HI, Halabi S, Tannock I, Morris M, Sternberg CN, Carducci MA, Eisenberger MA, Higano C, Bubley GJ, Dreicer R, Petrylak D, Kantoff P, Basch E, Kelly WK, Figg WD, Small EJ, Beer TM, Wilding G, Martin A, Hussain M; Prostate Cancer Clinical Trials Working Group. Design and end points of clinical trials for patients with progressive prostate cancer and castrate levels of testosterone: recommendations of the Prostate Cancer Clinical Trials Working Group. J Clin Oncol. 2008;26(7):1148-59.

La resistencia se asocia con que no existe una reduccion observable y/o medible en, o en ausencia de uno o mas de los siguientes: reduccion en el numero de celulas anormales, preferiblemente celulas cancerosas; o ausencia de las celulas anormales, preferiblemente celulas cancerosas; para enfermedades cancerosas: reduccion en el tamano del tumor; inhibicion (es decir, reducido a cierto grado y preferiblemente detenido) de un crecimiento ulterior del tumor; reduccion en las concentraciones de los marcadores tumorales tales como PSA y CA-125, inhibicion (es decir, se redujo hasta cierto punto y preferiblemente se detuvo) de la infiltracion de celulas cancerosas en otros organos (incluyendo la extension del cancer en el tejido blando y los huesos); inhibicion (es decir, se redujo hasta cierto punto y preferiblemente se detuvo) de la metastasis tumoral; alivio de uno o mas de los smtomas asociados con el cancer espedfico; y morbilidad y mortalidad reducidas.

En una realizacion preferida, resistencia significa que no hay reduccion observable y/o medible en, o ausencia de, uno o mas de los siguientes criterios: reduccion del tamano del tumor; inhibicion del crecimiento ulterior del tumor, inhibicion de la infiltracion de celulas cancerosas en otros organos; e inhibicion de la metastasis tumoral.

En una realizacion mas preferida, resistencia se refiere a uno o mas de los siguientes criterios: ninguna reduccion en el tamano del tumor; ninguna inhibicion del crecimiento ulterior del tumor, ninguna inhibicion de la infiltracion de celulas cancerosas en otros organos; y ninguna inhibicion de la metastasis tumoral.

La medicion de los criterios de resistencia anteriormente mencionados es de acuerdo con las directrices clmicas bien conocidas por una persona en el campo del tratamiento del cancer tales como las enumeradas anteriormente para la medicion de la respuesta de una enfermedad cancerosa.

La respuesta tambien puede ser establecida mediante la evaluacion in vitro de la proliferacion celular y/o la muerte celular. Por ejemplo, los efectos sobre la muerte o la proliferacion celular pueden ser evaluados in vitro por uno o mas de los siguientes ensayos bien establecidos: A) tincion nuclear con colorante Hoechst 33342 que proporciona informacion sobre la morfologfa nuclear y la fragmentacion de ADN que son distintivos de la apoptosis. B) Ensayo de union a anexina V que refleja el contenido de fosfatidilserina de la bicapa lipidica externa de la membrana plasmatica. Este evento se considera un distintivo temprano de la apoptosis. C) Ensayo TUNEL (ensayo de marcaje

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de extremo de corte de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal), un metodo de fluorescencia para evaluar las celulas sometidas a apoptosis o necrosis mediante la medicion de la fragmentacion del ADN marcando el extremo terminal de acidos nucleicos. D) ensayo de proliferacion MTS que mide la actividad metabolica de las celulas. Las celulas viables son metabolicamente activas, mientras que las celulas con una cadena respiratoria comprometida muestran una actividad reducida en esta prueba. E) ensayo de tincion con cristal violeta, en donde los efectos sobre el numero de celulas se controlan mediante la tincion directa de los componentes celulares. F) ensayo de proliferacion que monitorea la smtesis de ADN a traves de la incorporacion de bromodesoxiuridina (BrdU). Pueden determinarse directamente efectos inhibitorios sobre el crecimiento/la proliferacion. G) Ensayo YO-PRO que implica un colorante de acidos nucleicos de cianina monomerica, fluorescente e impermeable a la membrana, que permite el analisis de la muerte (p. ej., apoptosis) de las celulas sin interferir en la viabilidad celular. Tambien se pueden analizar efectos globales sobre el numero de celulas despues de la permeabilizacion celular. H) Tincion con yoduro de propidio para la distribucion del ciclo celular que muestra alteraciones en la distribucion entre las diferentes fases del ciclo celular. Se pueden determinar puntos que detienen el ciclo celular. I) Ensayos de crecimiento independiente del anclaje tales como ensayos del brote de colonias que evaluan la capacidad de las suspensiones de celulas individuales para crecer en colonias en agar blando.

En una realizacion preferida en relacion con la determinacion de la resistencia in vitro, resistencia significa que no hay disminucion en la tasa de proliferacion de celulas anormales y/o reduccion en el numero de celulas anormales. Mas preferiblemente, resistencia significa que no hay disminucion de la tasa de proliferacion de celulas cancerosas y/o ninguna reduccion en el numero de celulas cancerosas. La reduccion en el numero de celulas anormales, preferiblemente cancerosas, se puede producir a traves de una diversidad de mecanismos de muerte celular programados y no programados. La apoptosis, la muerte celular programada independiente de caspasas y la muerte celular autofagica son ejemplos de la muerte celular programada. Sin embargo los criterios de muerte celular implicados en formas de realizacion de la invencion no se han de tomar como limitados a ningun mecanismo de la muerte celular.

Glu-tubulina

Ejemplos preferidos de la secuencia de protemas de la tubulina alfa (tubulina alfa humana) se enumeran en SEQ. ID NO. 1-4, Figuras 11-14. Tubulina alfa es un precursor de glu-tubulina. Como se ha descrito anteriormente, la glu- tubulina propiamente dicha tiene la tirosina C-terminal eliminada. El termino glu-tubulina tambien abarca homologos, formas mutantes, variantes alelicas, isoformas, variantes de corte y empalme y equivalentes de las secuencias representadas por SEQ ID NO 1-4, con la condicion de que un glutamato sea el aminoacido final en el extremo C. Mas preferiblemente abarca secuencias que tienen al menos aproximadamente 75% de identidad, de manera especialmente preferida al menos aproximadamente 85% de identidad, con especial preferencia al menos aproximadamente 95% de identidad, y de manera mas particularmente preferida aproximadamente 99% de identidad con dichas secuencias, en cada caso con la condicion de que un glutamato sea el aminoacido final en el extremo C.

Concentracion de glu-tubulina

La concentracion de glu-tubulina puede someterse a ensayo en la muestra mediante tecnicas de analisis de protemas bien conocidas para una persona experta. Ejemplos de metodos conocidos en la tecnica que son adecuados para medir la concentracion de glu-tubulina al nivel de protemas incluyen, pero no se limitan a i) analisis de inmunohistoqmmica (IHC), ii) transferencia western, iii) inmunoprecipitacion iv) ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA), v) radioinmunoensayo, vi) clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) vii) espectrometna de masas, incluyendo desorcion/ionizacion por laser asistida por matriz (MALDI, p. ej., MALDI-TOF) y espectrometna de masas de ionizacion por electroproyeccion (ESI-MS).

Los anticuerpos implicados en algunos de los metodos anteriores pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales, fragmentos de anticuerpos y/o diversos tipos de anticuerpos sinteticos, incluidos anticuerpos quimericos. El anticuerpo puede estar marcado para permitir que sea detectado o sea susceptible de deteccion tras la reaccion con una o mas especies adicionales, por ejemplo, utilizando un anticuerpo secundario que esta marcado o es capaz de producir un resultado detectable. Anticuerpos espedficos para la forma glu-tubulina de tubulina alfa estan disponibles comercialmente de Millipore o se pueden preparar a traves de metodos convencionales de generacion de anticuerpos, bien conocidos para una persona experta.

Metodos preferidos de analisis de protemas son ELISA, tecnicas de espectrometna de masas, inmunohistoqmmica y transferencia western, mas preferiblemente transferencia western e inmunohistoqmmica. En la transferencia western, tambien conocida como inmunotransferencia, se pueden utilizar anticuerpos marcados para evaluar las

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concentraciones de protema, en donde la intensidad de la senal procedente del marcador detectable corresponde a la cantidad de protema, y se puede cuantificar, por ejemplo, mediante densitometna.

La inmunohistoqmmica utiliza de nuevo anticuerpos marcados para detectar la presencia y cantidad relativa del biomarcador. Se puede utilizar para evaluar el porcentaje de celulas para las cuales el biomarcador esta presente. Tambien se puede utilizar para evaluar la localizacion o la cantidad relativa del biomarcador en celulas individuales, esto ultimo se ve como una funcion de la intensidad de tincion.

ELISA significa ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas, ya que utiliza una enzima enlazada a un anticuerpo o antfgeno para la deteccion de una protema espedfica. El ELlSA se realiza tfpicamente como sigue (aunque existen otras variaciones en la metodologfa): un sustrato solido tal como una placa de 96 pocillos se recubre con un anticuerpo primario, que reconoce el biomarcador. El biomarcador unido es reconocido a continuacion por un anticuerpo secundario espedfico para el biomarcador. Esto puede estar unido directamente a una enzima o se puede utilizar un tercer anticuerpo anti-inmunoglobulina que se une a una enzima. Se anade un sustrato y la enzima cataliza una reaccion, produciendo un color espedfico. Mediante la medicion de la densidad optica de este color, se puede determinar la presencia y cantidad del biomarcador.

Usos de biomarcador

El biomarcador puede ser utilizado para predecir la resistencia inherente de la enfermedad en un sujeto al compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente.

El biomarcador puede ser utilizado para predecir la resistencia adquirida de la enfermedad en un sujeto al compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente.

El biomarcador puede ser utilizado para seleccionar sujetos que padecen o estan predispuestos a padecer una enfermedad, preferiblemente cancer, para el tratamiento con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente. Las concentraciones de un biomarcador de este tipo se pueden utilizar para identificar a los sujetos susceptibles a responder o a no responder o a continuar respondiendo o a no continuar respondiendo al tratamiento con dichos agentes. La estratificacion de los sujetos se puede hacer con el fin de evitar regfmenes de tratamiento innecesarios. En particular, el biomarcador se puede utilizar para identificar a sujetos de los que una muestra o muestras no exhiben una mayor concentracion de glu- tubulina, con relacion a una concentracion estandar o un conjunto de concentraciones estandares, despues de lo cual esos sujetos pueden entonces ser seleccionados para el tratamiento con el compuesto de formula I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente.

El biomarcador tambien se puede utilizar para ayudar en la determinacion de los regfmenes de tratamiento, en relacion con cantidades y programas de dosificacion. Adicionalmente, el biomarcador puede ser utilizado para ayudar en la seleccion de una combinacion de farmacos a ser administrados a un sujeto, incluyendo un compuesto o compuestos de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable de los mismos, y otro agente o agentes quimioterapeuticos (citotoxicos). Ademas, el biomarcador puede ser utilizado para ayudar en la determinacion de estrategias de terapia en un sujeto, incluyendo si un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo se ha de administrar en combinacion con una terapia dirigida, terapia endocrina, radioterapia, inmunoterapia o intervencion quirurgica, o una combinacion de estos.

La glu-tubulina tambien se puede utilizar en combinacion con otros biomarcadores para predecir la respuesta a un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo y para determinar los regfmenes de tratamiento. Ademas, se puede utilizar en combinacion con pruebas de quimio-sensibilidad para predecir la resistencia y para determinar los regfmenes de tratamiento. Pruebas de quimio-sensibilidad consisten en aplicar directamente un compuesto de formula general I de celulas tomadas del sujeto, por ejemplo, de un sujeto con tumores malignos hematologicos o tumores solidos accesibles, por ejemplo, canceres de mama, de cabeza y cuello o melanomas, para determinar la respuesta de las celulas al compuesto.

Metodo de tratamiento

En un metodo de tratamiento y en glu-tubulina para uso en un metodo de tratamiento, la concentracion de glu- tubulina se establece primero en relacion con una concentracion estandar o conjunto de concentraciones estandares

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o concentraciones de inicio de pre-tratamiento y luego se administra un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente, si la concentracion de glu- tubulina en dicha muestra no es mayor que un valor estandar o un conjunto de valores estandares o no ha aumentado en relacion con las concentraciones de inicio del pre-tratamiento, respectivamente. El compuesto de formula I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo puede administrarse en una composicion farmaceutica, como es bien conocido por una persona experta en la tecnica. Composiciones y dosificaciones adecuadas se describen, por ejemplo, en el documento WO 2004/103994 A1, paginas 35-39. Las composiciones para administracion enteral, tal como administracion nasal, bucal, rectal o, especialmente, oral, y para la administracion parenteral tal como administracion intravenosa, intramuscular o subcutanea a seres humanos, son especialmente preferidas. Mas particularmente, se prefieren las composiciones para administracion intravenosa.

Las composiciones comprenden el ingrediente activo y un soporte farmaceuticamente aceptable. Un ejemplo de una composicion incluye, pero no se limita a lo siguientes: 5000 capsulas de gelatina blanda, comprendiendo cada una como ingrediente activo 0.05 g de uno de los compuestos de formula general (I), se preparan como sigue: 250 g de ingrediente activo pulverizado se suspenden en 2 litros de Lauroglykol® (laurato de propilenglicol, Gattefosse S.A., Saint Priest, Francia) y se muelen en un pulverizador humedo para producir un tamano de partfcula de aproximadamente 1 a 3 pm. Porciones de 0,419 g de la mezcla se introducen luego en capsulas de gelatina blanda utilizando una maquina de llenado de capsulas.

En esta memoria tambien se describe un metodo de tratamiento de una enfermedad neoplasica o autoinmune, preferiblemente cancer, disminuyendo primero la concentracion de glu-tubulina en un sujeto que tiene una muestra con una mayor concentracion de glu-tubulina en comparacion con una concentracion estandar o un conjunto de concentraciones estandares o concentraciones de inicio del pre-tratamiento, a continuacion, tratando al sujeto con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable tal como se define anteriormente. La concentracion de glu-tubulina puede ser reducida por medios qmmicos o geneticos directos o indirectos. Ejemplos de tales metodos son el tratamiento con un farmaco que resulta en una expresion reducida de glu-tubulina, la administracion dirigida de construcciones virales, de plasmidos o de peptidos, o anticuerpo o ARNip o antisentido para regular a la baja la concentracion de glu-tubulina. Por ejemplo, ARNip se puede utilizar para reducir la concentracion de TTCP o el suministro de un plasmido se puede utilizar para aumentar la expresion de TTL y, por lo tanto, reducir la concentracion de glu-tubulina en la celula. El sujeto puede entonces ser tratado con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo.

Un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo puede administrarse solo o en combinacion con uno o mas de otros agentes terapeuticos. Una terapia de combinacion posible puede adoptar la forma de combinaciones fijas, o la administracion de un compuesto y uno o mas de otros agentes terapeuticos que se administran escalonada o independientemente uno de otro, o la administracion combinada de combinaciones fijas y uno o mas de otros agentes terapeuticos.

Un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo puede, aparte de o ademas de, ser administrado especialmente para la terapia de tumores en combinacion con quimioterapia (terapia citotoxica), terapia dirigida, terapia endocrina, radioterapia, inmunoterapia, intervencion quirurgica, o una combinacion de estos. La terapia a largo plazo es igualmente posible como lo es la terapia adyuvante en el contexto de otras estrategias de tratamiento, tal como se describio anteriormente. Otros tratamientos posibles son terapia para mantener el estado del paciente despues de la regresion del tumor, o incluso terapia quimio-preventiva, por ejemplo, en pacientes en riesgo.

Kit

En un aspecto, la invencion se refiere a un kit para predecir la respuesta, preferiblemente de una enfermedad en un sujeto, a un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente, que comprende los reactivos necesarios para medir la concentracion de glu-tubulina en una muestra. Preferiblemente, los reactivos comprenden un reactivo de captura que comprende un detector para glu- tubulina y un reactivo detector.

El kit tambien comprende un modulo de comparador que comprende un valor estandar o un conjunto de valores estandares con los que se compara la concentracion de glu-tubulina en la muestra. En una realizacion preferida, el modulo de comparador esta incluido en las instrucciones de uso del kit. En otra realizacion preferida, el modulo de comparador esta en forma de un dispositivo de visualizacion, por ejemplo una tira de color o de material numericamente codificado que esta disenado para ser colocado junto a la lectura de la medicion de la muestra para

indicar los niveles de resistencia. El valor estandar o un conjunto de valores estandares se puede determinar tal como se describe anteriormente.

Los reactivos son preferiblemente anticuerpos o fragmented de anticuerpos que se unen selectivamente a glu- tubulina. Estos puede estar, por ejemplo, en forma de un anticuerpo primario espedfico que se une a glu-tubulina y 5 un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario, y que es en sf mismo marcado para la deteccion. Alternativamente, el anticuerpo primario tambien puede marcarse para la deteccion directa. Los kits pueden contener tambien, opcionalmente, una disolucion o disoluciones de lavado que permiten selectivamente la retencion del biomarcador unido al reactivo de captura en comparacion con otros biomarcadores despues del lavado. Tales kits se pueden utilizar en ELISA, transferencia western, citometna de flujo, inmunohistoqmmica u otros metodos 10 inmunoqmmicos para detectar la concentracion del biomarcador.

El kit de acuerdo con la invencion se puede utilizar en el metodo de tratamiento tal como se define anteriormente. Comprende un compuesto de la siguiente formula o una sal farmaceuticamente aceptable

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En una realizacion particularmente preferida del kit la sal farmaceuticamente aceptable es una sal dihidrocloruro. En 15 otro aspecto, la invencion se refiere al uso de un kit de este tipo tal como se describio anteriormente.

En la presente memoria descriptiva las palabras "comprenden" o "comprende" o "que comprende" han de entenderse como que implican la inclusion de un elemento indicado o grupo de elementos, pero no la exclusion de cualquier otro elemento o grupo de elementos.

Metodologia experimental

20 Tincion inmunofluorescente de celulas cultivadas

Celulas de cancer de pulmon de celulas no pequenas humanas A549 (NSCLC, numero de referencia ATCC CCL- 185), celulas de cancer cervical HeLa (numero de referencia ATCC CCL-2) y celulas de carcinoma de mama SKBR3 (ATCC numero de referencia HTB-30) se sembraron a densidades de 50% en cubreobjetos de microscopio redondos y se cultivaron durante 24 horas en RPMI-1640 que contiene FCS al 10% (al que tambien se alude como 25 FBS) a 37°C, 5% de CO2. Los compuestos a ensayar se disolvieron en DMSO. El medio de cultivo celular se remplazo por medio que contiene el o los compuestos diluidos (paclitaxel, vinblastina, colchicina y nocodazol se adquirieron de Sigma-Aldrich) o vehteulo. Despues del tratamiento durante los tiempos indicados en la Breve Descripcion de las Figuras, los cubreobjetos se lavaron y las celulas se fijaron en metanol/acetona (1:1) durante 5 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se incubaron en tampon de bloqueo (BSA al 0,5% y TX -100 al 30 0,1% en PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras fueron incubadas luego con anti-tubulina

alfa (Sigma, 1:2000) durante 1 hora a temperatura ambiente en tampon de bloqueo. Despues de varias etapas de lavado, las celulas se incubaron con IgG anti-raton de cabra AlexaFluor-488 (Molecular Probes, 1:3000) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de varias etapas de lavado con tampon de bloqueo. Las muestras fueron montadas despues con el agente anti-decoloracion ProLong Gold (Molecular Probes), sellado con esmalte de unas y

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examinado con un microscopio Leica de inmunofluorescencia. Las imagenes fueron capturadas con una camara CCD enfriada y procesadas por el software ImageJ.

Ensayo del Brote de Colonias:

Se prepararon suspensiones de celulas individuales de xenoinjertos tumorales derivados de pacientes (mantenidos en ratones inmunodeficientes). Para los ensayos del brote de colonias, las celulas se extendieron en agar blando en placas de 24 pocillos de acuerdo con el ensayo introducido por Hamburger y Salmon (bioensayo primario de celulas madre tumorales humana, Science, 1977, l97 : 461-463). 2x104 -6x104celulas en 0,2 mL de medio que contiene 0,4% de agar se extendieron sobre una capa inferior de 0,75% de agar. Los compuestos de ensayo se aplicaron en 0,2 mL de medio de cultivo. Cada una de las placas de 24 pocillos contema controles sin tratar y muestras por triplicado. Los cultivos se incubaron a 37°C y 7,5% de CO2 durante 5 - 28 dfas. 24 horas antes del analisis, las colonias vitales se tineron con una disolucion de sal de tetrazolio metabolizable (Alley MC et al, Life Sci. 1982, 31:3071-3078) y se contaron con un sistema de analisis de imagenes automatico (Omnicon 3600, Biosys GmbH).

Los efectos de los farmacos relativos se expresaron por la relacion del numero medio de colonias en los pocillos tratados y los pocillos control. Los valores CI70 fueron determinados mediante la representacion de las concentraciones de compuestos frente a los recuentos de colonias relativos.

Generacion y Ensayo de Cristal Violeta de Lineas Celulares Resistentes a BAL27862

Sub-lmeas resistentes a BAL27862 de lineas de cancer de pulmon de celulas no pequenas humano (H460 referencia ATCC HTB-177; A549 referencia ATCC CCL-185), de cancer de ovario (SKOV3 referencia ATCC HTB- 77) fueron generadas mediante seleccion a largo plazo en medio de cultivo celular completa (RPMI-1640 que contiene FCS al 10%; Sigma-Aldrich) mediante concentraciones crecientes de BAL27862. Dependiendo de la lmea celular, el proceso de seleccion se llevo a cabo durante 8-12 meses con el fin de lograr factores de resistencia (relacion de CI50 de la lmea celular resistente y la lmea celular de tipo salvaje correspondiente) entre 3 y 11,6. Las sub-lmeas resistentes se expandieron a la concentracion mas alta tolerada de BAL27862 y posteriormente se congelaron y almacenaron en nitrogeno lfquido.

Las celulas se sembraron en placas de 96 pocillos a las siguientes densidades: A549: 2000, H460: 1000, SKOV3: 2000 y, despues de 24 horas de incubacion, se incubaron durante 72 horas con DMSO, BAL27862, colchicina, nocodazol, paclitaxel o vinblastina diluidos en medio completo (concentracion final de DMSO max. 0,5%). Despues se retiro el medio, las celulas se fijaron y tineron mediante la adicion de 50 jl de Tincion de Cristal Violeta (0,2% de Cristal Violeta en metanol al 50%) por pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, la mancha se decanto y las placas se lavaron 4 veces con agua bidestilada. Las placas se secaron al aire durante varias horas. La mancha se disolvio mediante la adicion de 100 jl de tampon (Tris 0,1 M pH 7,5, SDS al 0,2%, etanol al 20%) por pocillo y agitando las placas. La absorbancia a 590 nm se midio utilizando un lector de placas SpectraMax M2e (Molecular Devices). Valores CI50 anti-proliferativos se calcularon a partir de curvas de concentracion-respuesta utilizando el software GraphPad Prism. Los factores de resistencia se calcularon como una relacion de BAL27862 CI50 en la variante de la lmea resistente frente a la CI50 en la lmea parental.

Extraccion de Protemas

Extraccion del tumor: Los tumores se extrajeron en tampon de lisis enfriado en hielo que contema HEPES 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, p-glicerofosfato25 mM, NaF 25 mM, EGTA 5 mM, EDTA 1 mM, NP40 al 0,1%, pirofosfato 15 mM , ortovanadato de sodio 2 mM, molibdato de sodio 10 mM, leupeptina (10 jg/mL), aprotinina (10 jg/mL) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM (1 mL de volumen de extraccion por 45 mg de tumor). Despues de la homogeneizacion por Polytron, los lisados se ajustaron a NP40 al 1% y se incubaron en hielo durante 20 min. Los lisados se clarificaron por centrifugacion y se congelaron a -80°C.

Extraccion de la lmea celular tumoral: Se lavaron las celulas con PBS enfriado en hielo que contema PMSF 1 mM y con tampon de lisis enfriado en hielo (vease mas arriba) sin NP40. Las celulas se extrajeron en el mismo tampon de lisis que contema NP40 al 1%. Despues de la homogeneizacion, los lisados se clarificaron por centrifugacion y se congelaron a -80°C.

Inmunotransferencia/Transferencia Western

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La inmunotransferencia se realizo utilizando 20 pg de protema total por pista. La concentracion total de protema se determino con el ensayo de protemas BCA (Pierce). La protema se separo en un gel de SDS al 10% y se transfirio a una membrana de PVDF utilizando la transferencia semi-seca (90 min, 50 mA/gel). Los anticuerpos primarios utilizados para la inmunotransferencia eran como sigue:

Anticuerpo de glu-tubulina (disponible de Millipore, numero de referencia AB3201), policlonal de conejo, dilucion 1:1000, condiciones del tampon: BSA al 3% en PBS/Tween al 0,1%

Anticuerpo de actina (disponible en Chemicon, numero de referencia MAB1501), monoclonal de raton, dilucion 1:5000, condiciones del tampon: BSA al 3% en PBS/Tween al 0,1%

Los anticuerpos secundarios utilizados para la inmunotransferencia eran anti-conejo de cabra o anti-raton de cabra conjugados con peroxidasa (disponibles de Jackson ImmunoResearch Laboratories INC: numero de referencia 111035-144 JIR y 115-035-146 JIR), dilucion 1:5000, condiciones del tampon: 0,5% de leche en PBS/Tween al 0,1%. Las bandas marcadas fueron reveladas utilizando un sistema de formacion de imagenes de alto rendimiento Raytest Stella 3200.

Inmunohistoquimica

La fijacion de xenoinjertos de tumores derivados del paciente (mantenido en ratones inmunodeficientes) se realizo en formalina neutra tamponada al 10% que contema formaldehudo al 4% durante 20 - 28 horas a temperatura ambiente. Muestras fijadas se mantuvieron en una disolucion de etanol al 70% durante un maximo de una semana antes de la deshidratacion e inclusion en parafina de acuerdo con un procedimiento estandar, utilizando las condiciones enumeradas a continuacion:

Tratamiento Secuencial: tiempo (horas)

EtOH al 70%: 1

EtOH al 80%: 2

EtOH al 99%: 1

Isopropanol al 100%: 0,5

Isopropanol al 100%: 1

Xilol: 0,5

Xilol: 1

Xilol: 1

Parafina: 1

Parafina: 2

Parafina: 2

Secciones de parafina de aproximadamente 2 pm se cortaron y se procesaron utilizando el aparato de inmunotincion automatizado Benchmark XT® (Roche) ejecutando las etapas de procesamiento estandares. La visualizacion de la tincion de anticuerpos espedficos se realizo con DAB (3,3-diaminobencidina) como sustrato cromogenico a una concentracion de 5 mg/ml. Para la tincion se utilizaron las siguientes condiciones de anticuerpos primarios y de procesamiento:

Especificacion de anticuerpos: Procesamiento

Anti-Glu-tubulina, Millipore, n° AB3201, policlonal de conejo: Acondicionamiento celular 1 tampon de Roche durante 90 minutos, incubacion de anticuerpos a 37°C durante 32 minutos, a una dilucion de 1:50

Ejemplos detallados

Ejemplo 1: Un Fenotipo Mitotico Distinto Inducido por compuestos de formula general I

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El tratamiento con el compuesto A (BAL27862) o con el compuesto B o el compuesto C induda un fenotipo de microtubulos altamente reproducible y distinto en todas las lmeas celulares tumorales ensayadas (mostradas para el compuesto A en A549, celulas HeLa y SKBR3 en la Figura 1 y para el compuesto B y el compuesto C en celulas A549 en la Figura 2). En celulas en division, se produjo una fragmentacion aparente del huso mitotico, lo que resulta en la formacion de estructuras a modo de puntos (Figura 1). Se demostro que este fenotipo era distinta del observado con agentes convencionales que fijan como objetivo microtubulos tales como el estabilizador de microtubulos paclitaxel y los desestabilizadores de microtubulos vinblastina y colchicina (Figura 3) y nocodazol (Figura 4).

Ejemplo 2: BAL27862 Supera el Fenotipo de Microtubulos Inducido por Farmacos Convencionales que fijan como objetivo Microtubulos de una Manera Dominante

Con el fin de mostrar la singularidad de su actividad sobre los microtubulos, BAL27862 fue sometido a ensayo en combinacion con vinblastina, colchicina y paclitaxel (Figura 5) y nocodazol (Figura 6) utilizando celulas A549. El tratamiento con vinblastina, colchicina, paclitaxel o nocodazol por sf solo induda los fenotipos de los microtubulos mitoticos caractensticos de estos agentes. Sin embargo, el tratamiento de combinacion con BAL27862 durante las ultimas 4 horas dio lugar a la interrupcion de las estructuras de microtubulos; creando un fenotipo compatible con el tratamiento de BAL27862 solo, a pesar de la presencia continua de vinblastina, colchicina, paclitaxel o nocodazol. En contraposicion, el tratamiento primero con BAL27862 y posteriormente durante 4 horas en combinacion con vinblastina, colchicina, paclitaxel o nocodazol no tuvo impacto en el fenotipo de microtubulos observado que era consistente con el tratamiento con BAL27862.

Estos datos demuestran que los compuestos de formula I afectan a la biologfa de los microtubulos consistentemente, pero de una manera diferente que los agentes convencionales de fijacion como objetivo de microtubulos.

Ejemplos detallados de acuerdo con la invencion

Ejemplo 3: Asociacion de altos niveles de expresion de glu-tubulina con celulas tumorales derivadas de pacientes resistentes al tratamiento con BAL27862.

Sobre la base de ensayos del brote de colonias, utilizando celulas tumorales derivadas de tumores derivados de 6 pacientes mantenidos como xenoinjertos en ratones, celulas tumorales sensibles a BAL27862 o relativamente resistentes se identificaron a partir melanoma y cancer colorrectal y de pulmon (vease la Tabla 1). Las concentraciones a las que se observo un 70% de inhibicion del crecimiento frente a los controles (CI70) se muestran en la Tabla 1. En esta tabla, las celulas tumorales sensibles a BAL27862 tienen valores CI70 en el intervalo nanomolar bajo, mientras que las celulas tumorales resistentes a BAL27862 se definen por valores CI70 > 600 nanomolares. Datos de paclitaxel y vinblastina, utilizando el mismo ensayo ex vivo, estaban disponible para 5 de los 6 modelos tumorales. De estos 5 modelos, todos eran resistentes al tratamiento con paclitaxel, mientras que 4 de 5 de estos tumores eran sensibles al tratamiento con vinblastina.

Tabla 1

Tipo de cancer: Nombre Respuesta a BAL27862 CI70 BAL27862 [microMl Respuesta a paclitaxel Respuesta a vinblastina

Cancer colorrectal: CXF 1103 Sensible 0,022 Resistente Resistente

CXF 243: Resistente 0,696 Resistente Sensible

Cancer de pulmon: LXFE 211 Sensible 0,021 Resistente Sensible

LXFE 397: Resistente > 3,5 No conocida No conocida

Melanoma: MEXF 1341 Sensible 0,025 Resistente Sensible

MEXF 276: Resistente > 3,5 Resistente Sensible

El analisis de inmunotransferencia se realizo con el fin de medir las concentraciones de glu-tubulina en los mismos tumores mantenidos como xenoinjertos, utilizando el anticuerpo Milipore (Figura 7). Las concentraciones de actina se incluyeron en la inmunotransferencia como control de carga.

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El analisis de las concentraciones de glu-tubulina indica que la expresion de glu-tubulina vario drasticamente a lo largo de todos los tumores medidos (Figura 7).

Basado en el ensayo del brote de colonias y los mismos criterios de CI70, no hubo asociacion entre resistencia a paclitaxel o vinblastina y altas concentraciones de glu-tubulina. Esto es evidente, ya que, por ejemplo, para el tipo de tumor melanoma, ambos modelos fueron resistentes a paclitaxel y sin embargo para MEXF 1341 las concentraciones de glu-tubulina fueron claramente mas bajas que en MEXf 276. La misma falta de asociacion era cierta para el alcaloide de la vinca, vinblastina, en el modelo de melanoma, ya que estos dos tumores fueron sensibles a la vinblastina. Por lo tanto, las concentraciones de glu-tubulina demostraron ser inadecuadas como un biomarcador fiable de la resistencia a los agentes de microtubulos convencionales paclitaxel y vinblastina en modelos de tumores derivados del paciente.

Sorprendentemente, por el contrario, cuando los datos de resistencia a BAL27862 se comparan con la concentracion de glu-tubulina, glu-tubulina demuestra ser mas alta solo en los tumores resistentes y no de los tumores sensibles derivadas del mismo histotipo de tumor. Concentraciones incrementadas eran por lo tanto consistentemente indicativas de resistencia a BAL27862. Por lo tanto, las concentraciones de glu-tubulina demuestran ser un biomarcador de la resistencia para el compuesto BAL27862.

Ejemplo 4: Analisis inmunohistoqmmico de xenoinjertos de tumores colorrectales

El analisis inmunohistoqmmico se realizo en los xenoinjertos de tumores colorrectales (Figura 8), revelando una alta concentracion de glu-tubulina en el modelo de tumor CXF 243. Una vez mas se observo una clara correlacion entre las altas concentraciones de glu-tubulina y la resistencia a BAL27862 (el modelo de tumor CXF 243 era resistente a BAL27862, mientras que el modelo de tumor CXF 1103 era sensible a BAL27862; tal como se define mediante el ensayo del brote de colonias). Por lo tanto, las concentraciones de glu-tubulina demuestran de nuevo ser un biomarcador de la resistencia para el compuesto BAL27862.

Ejemplo 5: Se observa una expresion mayor de glu-tubulina en lineas tumorales seleccionadas para la resistencia a un compuesto de formula general I

La seleccion in vitro para la resistencia a BAL27862 dio lugar a la generacion de tres lineas de celulas tumorales relativamente resistentes, con los siguientes factores de resistencia frente a las lineas parentales (basada en determinaciones de CI50 utilizando el ensayo de Cristal Violeta): A549 (3,0 veces); resistente 1 a SKOV3 (7,6 veces); resistente 2 a SKOV3 (11,6 veces); H460 (5,3 veces) (Tabla 2).

Tabla 2:

Compuesto para el tratamiento: Factores de resistencia (relacion de CI50 de variante de lmea celular resistente a BAL27862 y CI50 de lmea celular parental)

A549: H460 resistente 1 a SKOV3 resistente 2 a SKOV3

BAL27862: 3,0 5,3 7,6 11,6

Colchicina: 0,9 1,6 2,0 2,8

Nocodazol: 1,6 1,3 3,6 3,9

Vinblastina: 2,3 4,6 15,7 17,8

Paclitaxel: 0,06 0,3 0,4 0,5

En general estas celulas resistentes a BAL27862 exhibieron un nivel diferente de respuesta a otros agentes de desestabilizacion de microtubulos tales como colchicina, nocodazol y vinblastina, en comparacion con BAL27862; y se observo de hecho una sensibilidad incrementada al estabilizador de microtubulos paclitaxel en todas las lineas (Tabla 2).

La extraccion y el analisis de inmunotransferencia de estas lineas para medir las concentraciones de glu-tubulina, seguido de la comparacion con los datos de resistencia a BAL27862, demuestran de nuevo que glu-tubulina es mayor en las lineas resistentes, en comparacion con las lrneas parentales (Figura 9). Esto se mantuvo a lo largo del desarrollo de resistencia en las celulas SKOV3 (Figura 10). Estos datos demuestran la asociacion de los niveles incrementados de expresion de glu-tubulina con la resistencia adquirida a BAL27862.

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Lista de abreviaturas

A549 lmea celular de cancer de pulmon de celulas no pequenas humana

Anexina V protema de union a fosfatidilserina

BCA acido bicinconmico

Bcl-2 linfoma de celulas B de protema 2

BRCA1 protema de susceptibilidad al cancer de mama tipo 1

BrdU bromodesoxiuridina

BSA albumina de suero bovino

CA-125 antigeno de cancer 125

ADNc acido desoxirribonucleico complementary

CREST smdrome de esclerodermia limitada

CO2 dioxido de carbono

CXF 243 tumor colorrectal derivado del paciente

CXF 1103 tumor colorrectal derivado del paciente

DAB 3,3-diaminobencidina

DMSO dimetilsulfoxido

ADN acido desoxirribonucleico

dUTP 2 '-desoxiuridina 5'-trifosfato

ELISA ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas

ErbB-2 receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano

ESI-MS espectrometna de masas por ionizacion por electroproyeccion

EtOH Etanol

FACS exploracion/clasificacion de celulas activadas por fluorescencia

FCS/FBS suero de ternera fetal / bovino fetal

G2/M transicion de G2 a la fase mitotica del ciclo celular

HeLa lmea celular de cancer de celulas escamosas humana

HEPES acido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfonico

Hoe33342 trihidrocloruro de 2'-(4'-etoxifenil)-5-(4-metil-piperazin-1-il)-2,5'-bis-1H-

bencimidazol trihidrato

H460

IgG

IHC

LXFE 211 LXFE 397 MALDI

matriz

MALDI-TOF

lmea celular de cancer de pulmon de celulas no pequenas humano

inmunoglobulina G

inmunohistoqmmica

tumor pulmonar derivado de pacientes

espectrometna de masas de desorcion/ionizacion mediante laser asistida por

espectrometna de masas de desorcion/ionizacion mediante laser asistida por matriz-tiempo-de-vuelo

MEXF 276 melanoma derivado de paciente

MEXF 1341 melanoma derivado de paciente

ARNm acido ribonucleico mensajero

MTS 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio

NaCl cloruro sodico

NaF fluoruro de sodio

NCBI Centro Nacional de Informacion sobre Biotecnologfa

NSCLC cancer de pulmon de celulas no pequenas NP40 Nonidet P40

PBS solucion salina tamponada con fosfato

PCR reaccion en cadena de la polimerasa

P-gp glicoprotema P

PMSF fluoruro de fenilmetilsulfonilo

PSA antfgeno espedfico de la prostata

PVDF poli(fluoruro de vinilideno)

RANO evaluacion de la respuesta para gliomas de alto grado

RECIST criterios de evaluacion de respuesta en tumores solidos ARN acido ribonucleico

RPMI-1640 medio de cultivo celular utilizado para el cultivo de celulas eucarioticas y lmeas celulares transformada y no transformadas SDS dodecilsulfato de sodio

SEQ. ID NO. numero de identificacion de la secuencia ARNip acido ribonucleico inhibidor pequeno

SKBR3 lmea celular de carcinoma mamario humano SKOV3 lmea celular de carcinoma de ovario humano 5 TTCP tubulina tirosina carboxipeptidasa

TTL tubulina tirosina ligasa

TUNEL ensayo de marcaje de extremo de corte de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal

Tween-20 detergente, monolaurato de sorbitan polioxietilenado

10 TX-100 Triton-X100

YO-PRO colorante de acidos nucleicos de cianina monomerica, fluorescente

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Basilea Pharmaceutica AG

<120> Uso de glu-tubulina como un biomarcador de la respuesta de farmacos 5 <130> P40620EP00

<160>4

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1 <211> 451 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Uso de glu-tubulina como un biomarcador para predecir la respuesta a un compuesto, en el que el compuesto es un compuesto de formula general I,

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en donde

R representa fenilo, tienilo o piridinilo,

en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman, junto con el nitrogeno, heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;

X representa un grupo C=Y, en donde Y representa oxfgeno o nitrogeno sustituido con hidroxi o alcoxi inferior;

R1 representa hidrogeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;

R2, R3y R6 representan hidrogeno;

R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi;

y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmaceuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, ester o una amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal ester o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto,

o en donde

R representa fenilo o piridinilo,

en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman junto con el nitrogeno un heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, formilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi;

y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;

X representa oxfgeno;

R1 representa hidrogeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;

R2, R3v R6 representan hidrogeno;

R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi;

y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmaceuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, ester o amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal ester o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto,

y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un maximo de 7, especialmente hasta e incluye un maximo de 4 atomos de carbono,

y en el que la respuesta es de una enfermedad en un sujeto, y el biomarcador se mide ex vivo en una muestra o muestras tomadas del cuerpo animal, preferiblemente tomadas del cuerpo humano.

5 2. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde en el compuesto de formula general I,

R representa fenilo o piridinilo;

en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo inferior, alcoxi inferior, amino, acetilamino, halogeno y nitro; y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con amino o halogeno;

10 X representa un grupo C=O;

R1 representa hidrogeno o ciano-alquilo inferior;

R2, R3, R4, R5 y R6 representan hidrogeno;

y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos segun se define en la reivindicacion 1, y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un maximo de 7, especialmente hasta e 15 incluye un maximo de 4 atomos de carbono.
3. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el compuesto se representa por la siguiente formula

imagen2

en donde R, Y y R1 se definen como sigue:

imagen3

o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen en la reivindicacion 1.
4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el compuesto es

imagen4

o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen en la reivindicacion 1.
5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el derivado es un pro-farmaco, que es una amida formada a partir de un grupo amino presente dentro del grupo R del compuesto de formula general I

5 segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y el grupo carboxi de glicina, alanina o lisina.
6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el compuesto es

imagen5

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, preferiblemente una sal hidrocloruro del mismo, lo mas preferiblemente una sal dihidrocloruro del mismo.

10 7. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para predecir la resistencia de una enfermedad

en un sujeto a dicho compuesto.
8. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la enfermedad es una enfermedad neoplasica o un enfermedad autoinmune.
9. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la enfermedad es un cancer.

15 10. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la enfermedad se selecciona del

grupo que consiste en cancer de mama, cancer de prostata, cancer cervical, cancer de ovario, cancer gastrico, cancer colorrectal, cancer de pancreas, cancer de hngado, cancer de cerebro, cancer neuroendocrino, cancer de pulmon, cancer de rinon, tumores malignos hematologicos, melanoma y sarcomas.

5

10

15

20

25

30

35

40
11. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer cervical, cancer de ovario, cancer colorrectal, cancer de pulmon y melanoma.
12. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cancer de ovario, cancer colorrectal, cancer de pulmon y melanoma.
13. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde una concentracion elevada de glu- tubulina en la muestra del sujeto con relacion a un valor estandar o conjunto de valores estandares predice resistencia.
14. Uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde concentraciones mas altas de glu-tubulina en una muestra o muestras

i) con respecto a un valor estandar o un conjunto de valores estandares de sujetos con el mismo histotipo del tumor; o

ii) tomadas despues del inicio del tratamiento y en comparacion con una muestra o muestras tomadas del mismo sujeto antes de iniciar el tratamiento; o

iii) con relacion a un valor estandar o un conjunto de valores estandares a partir de celulas o tejidos normales;

son predictivas de resistencia.
15. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el biomarcador se utiliza para seleccionar sujetos que padecen o estan predispuestos a padecer una enfermedad, preferiblemente cancer, para el tratamiento con un compuesto de formula general I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
16. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la muestra se deriva de tejido normal tejido tumoral o celulas tumorales circulantes, preferiblemente en donde se deriva de tejido tumoral.
17. Un metodo para predecir en un sujeto que padece cancer la respuesta de ese cancer a un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende las etapas de:

a) medir una concentracion ex vivo de glu-tubulina en una muestra pre-obtenida del

tejido tumoral o celulas tumorales circulantes del sujeto para obtener un valor o valores

que representan esta concentracion; y

b) comparar el valor o los valores de la etapa a) con un valor estandar o un conjunto de valores estandares de los sujetos con el mismo tipo de cancer,

en donde una concentracion de glu-tubulina superior en la muestra en relacion con el valor

estandar o el conjunto de valores estandares es predictiva de la resistencia del cancer del sujeto al

compuesto de formula (I), y preferiblemente en donde el cancer es un cancer tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10, 11 o 12.
18. Un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento de una enfermedad neoplasica o autoinmune en un sujeto humano que padece dicha enfermedad, caracterizado por que el sujeto humano tiene una concentracion de glu-tubulina, medida ex vivo en una muestra de un sujeto humano que no es mayor que un valor estandar o conjunto de valores estandares de sujetos con el mismo histotipo de tumor o de celulas, tejido o fluido corporal normales, en donde una concentracion elevada de glu-tubulina en la muestra obtenida del sujeto con relacion al valor estandar o conjunto de valores estandares es predictiva de resistencia al compuesto de formula I.

10

15

20
19. Un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicacion 18, para uso en el tratamiento de un cancer, preferiblemente un cancer tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10, 11 o 12.
20. Un kit para predecir la respuesta a un compuesto de formula I general o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende reactivos necesarios para medir una concentracion de glu-tubulina en una muestra tomada de un sujeto con un cancer, y que comprende un compuesto de formula I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde el derivado farmaceuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en una sal, solvato, ester o amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal ester o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto;

y que comprende, ademas, un modulo de comparador que comprende un valor estandar o un conjunto de valores estandares de una concentracion de glu-tubulina tomada de muestras de tejido tumoral o celulas tumorales circulantes de sujetos con un cancer del mismo histotipo con el que se compara la concentracion de glu-tubulina, en donde una concentracion elevada de glu-tubulina en la muestra obtenida del sujeto con relacion al valor estandar o conjunto de valores estandares es predictiva de resistencia al compuesto de formula (I).
21. El kit de acuerdo con la reivindicacion 20, en donde los reactivos comprenden un reactivo de captura que comprende un detector para glu-tubulina y un reactivo detector, preferiblemente, en donde el reactivo de captura es un anticuerpo.
22. El kit de acuerdo con la reivindicacion 20 o la reivindicacion 21, en donde el compuesto es

imagen6

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en particular la sal dihidrocloruro del mismo.

imagen7

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imagen11

imagen12

imagen13

cancer colorrectal

CXF 1103

CXF 243

Glu-tubulina

actina

cancer de pulmon

LXFF 211

LXFE 397

Glu-tubulina

actina

me anoma

MEXF 1341

MEXF 276

Glu-tubulina

actina

imagen14

Glu-tubulina

IQ

C

-i 0)

ID

sensible

resistente

>

Ul

&

sensible

resistente

(Ji

s

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<

sensible

resistente

u

01

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Cadena detubulina alfa-1A[Homo sapiens] (SEQ. ID. NO. 1)

1 mrdcisibvg 61 hvpravfvdi

121 rirkladqat

l&l vvepynsilt 2 'l l slrfdgalnv 301 qmvkcdpxhg 361 tvvpggdlak 421 aredx.aalek

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Wtlydlshgi gtypqlflipe fgqqtgE-gft afmvdiaeaiy pyp~i hfpl a gd vvpkd v p a ttaiaeawat egeg&esgee

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LfCfifiLqagk gkeiidlvld

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i tiia-xfepan £kvqu;yqpp

Figura 12

Cadena detubulina alfa-1B [Homo sapiens] (SEQ. ID. NO. 2)

1

mrecisibvg

61

h.vpra vfvdl

121

iirkladgcc

3 SI

vvepyna.i 11

241

slrldgalnv

301

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t vvpgqdla k

421

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qagvqignaa eptvidevxt glqgflvfhs r.litt Lahari^ dlLefqtnlu Jtymaccllyr vqravcmlsn dyeevgvdsv

welyclehgi gtyrqlihpe fgggtqsgit avTivdn^an y pyprihfpla gdvvpkdvna tiEiaeawar egeg^eegee

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tffsetgagk qkei idlvld iypapqvsta 3 sqi v=ii.r.s aLaa-alepaa

fkvginyqpp eqneeqe £ae

Cadena de tubulina alfa-1C [Homo sapiens] (SEQ. ID. NO. 3)

1 mrecisihvg qagvqignac welyclehgi qpdgqmpsdk tigggddsfn tffsetgagk 61 hvpravfvdl eptvidevrt gtyrqlfhpe qlitgkedaa nnyarghyti gkeiidlvld 121 rirkladqct glqgflvfhs fgggtgsgft sllmerlsvd ygkksklefs iypapqvsta 181 wepynsilt thttlehsdc afmvdneaiy dicrrnldie rptytnlnrl isqivssita 241 slrfdgalnv dltefqtnlv pyprihfpla tyapvisaek ayheqltvae itnacfepan 301 qmvkcdprhg kymaccllyr gdwpkdvna aiatiktkrt iqfvdwcptg fkvginyqpp 361 tvvpggdlak vqravcmlsn ttavaeawar ldhkfdlmya krafvhwyvg egmeegefse 421 aredmaalek dyeevgadsa dgedegeey

Figura 14

Cadena de tubulina alfa-3C/D [Homo sapiens] (SEQ. ID. NO. 4)

i

61 121 1 HI 241 301 361 421

tnreci&ihvg hvpravfvdl ri rk.l.ad.l.ct wepynsi It slrfdgalnv qmvkcdprhg t vvpggdlak arcdlaalek

qagvqignac cpLvvdcvrL g.l.qg f 1 i f hs thttIshsdr dltefqtnlv kymaccmlyr vqravcmlsn dyaavgvdsv

welyclehgi qpdgqmpsdk gtyrqlfhpe qlitgkedaa fgggtgsgfa sllmfirlsvd afmvdneaiy dicrrnldie pyprihfpla tyapvlsaek gdwpkdvna aiatiktkrt Ttaiaeawar ldhkfdlmya eaeaeegeey

tigqqddcfr. tffsetgagk nnyarghyti gkeivdlvld ygkkaklafa iynapqvsta rptytn I r. r I igqivss i ta ayheqlsvae itnacfepan iqfvdwcptg fkvginyqpp krafvhwyvg egmeegefse