ES2607059T3 - Xenorhabdus, lipopéptido y procedimientos mosquitocidas - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de control de un insecto que comprende la etapa de aplicar a un entorno del insecto una cantidad eficaz de una toxina lipopeptídica que tiene actividad funcional contra un insecto, en el que dicha toxina lipopeptídica es producida por un cultivo bacteriano puro de Xenorhabdus MT depositado en la ATCC como PTA- 6826, y en el que el insecto es un miembro de Culicidae.
Description
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Debido a que es estable al secado y calor, esta toxina puede ser producida, almacenada y distribuida a bajo precio. Es posible utilizar un medio de cultivo secado o preparaciones de células secadas directamente con poca o ninguna purificación.
La toxina XLT descrita en el presente documento tiene ventajas significativas sobre dos agentes biológicos de control de mosquitos actualmente empleados, Bacillus thuringiensis israeliensis y Bacillus sphaericus. Las toxinas producidas por estas bacterias son grandes moléculas de proteína inactivadas por la luz UV, el calor y proteasas, y sedimentan rápidamente en ambientes acuáticos. En consecuencia, deben aplicarse en dosis múltiples, lo cual es caro y aumenta el potencial de desarrollo de mosquitos resistentes. La resistencia de los mosquitos a estas toxinas bacterianas ha aumentado en los últimos años a consecuencia de la aplicación a largo plazo en el campo, y existe la preocupación de que estos agentes podrían llegar a ser obsoletos en un futuro próximo (Science 200: 328. 2003). Además, ninguna de estas toxinas es letal para todas las especies de mosquitos transmisores de enfermedades.
Otra ventaja significativa de la XLT es el bajo coste de producción, la XLT se produce en un medio de sales minerales de bajo coste con glucosa o glicerol con suplementos vitamínicos, y todo el cultivo puede secarse en tambor a alta temperatura hasta una preparación estable de fácil aplicación en el campo por medios convencionales. Los mosquitos son los agentes artrópodos médicamente más importantes transmisores de enfermedades infecciosas que causan fiebre del dengue, fiebre del Nilo occidental, fiebre del Chikungunya, fiebre amarilla, malaria, filariasis linfática y muchas enfermedades víricas. El impacto económico de estas enfermedades, especialmente en los países en desarrollo, es asombroso. La malaria se estima que afecta a 500 millones de personas, causando 3 millones de muertes al año, y se estima que mata a un niño en África cada 30 segundos (National Geographic, julio de 2007). Con la posibilidad del calentamiento global, se espera que la distribución geológica de los mosquitos se expanda, acompañado de una mayor incidencia de las enfermedades que transmiten. La toxina lipopeptídica de Xenorhabdus, XLT, es una importante adición al arsenal de control de mosquitos y ayuda a limitar el alcance de las enfermedades que transmiten.
El material mosquitocida presente se puede combinar con otros agentes insecticidas, incluyendo Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaerius, espinosina (insecticidas de policétidos producidos sintéticamente o por Saccharopolyspora u otro material insecticida).
La actividad de la toxina mosquitocida se encuentra en el caldo de cultivo y se asocia con las células, con niveles máximos obtenidos en la fase logarítmica tardía de crecimiento, a alrededor de 2-3 días de incubación a temperaturas desde 28 -33 ºC. Se produce menos toxina mosquitocida a 20 ºC, y esta bacteria no crece a 37 ºC. La toxina mosquitocida también está asociada a la superficie de las células bacterianas. Los medios óptimos para la producción de esta toxina incluyen tanto medios complejos de crecimiento (caldo nutriente) como medio con sales minerales definido con glucosa o glicerol como fuente de carbono.
La molécula activa se purificó a partir de caldo de cultivo por precipitación con acetona, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía líquida de alta presión (HPLC). La toxina es una molécula lipopeptídica que varía en tamaño desde aproximadamente 1.182 a aproximadamente 1.431 Da. El componente peptídico contiene ocho residuos de aminoácidos: 2 histidinas, 2,3-diaminobutirato, 3 asparaginas (y/o ácido aspártico), glicina y serina. El componente de ácido graso es principalmente ácido 2-oxodecanoico (C10) y ácido 2-oxododecanoico (C12), pero parecen estar presentes otros ácidos grasos de cadena más larga en las preparaciones de toxina también, lo que explica los pesos moleculares variables. Cada una de las moléculas de tamaño variable (fracciones de pico HPLC separadas) tiene actividad mosquitocida.
La toxina no se inactiva por la desecación, congelación, irradiación de luz ultravioleta, calentamiento a 120 ºC durante 30 min, o incubación en NaOH 0,1 N o HCl 0,1 N, y no se inactiva por tratamiento con cualquier proteasa probada hasta la fecha. Las muestras de cultivos secados a 60 ºC conservan la actividad completa después de un almacenamiento durante más de tres años a temperatura ambiente.
La estabilidad a la luz UV, calor, proteasas y desecación son ventajas significativas sobre los agentes de control biológico de mosquitos que se usan actualmente. La producción de la actividad tóxica en medios de cultivo de bajo coste y definidos será de importancia económica. Las toxinas de Bacillus thuringiensis israeliensis y Bacillus sphaericus, dos agentes biológicos comercializados para el control de mosquitos, son grandes proteínas que son inactivadas por el calor, la luz UV y proteasas; por lo tanto, deben ser aplicados en dosis múltiples. Además, en los últimos años, los mosquitos han desarrollado resistencia a estas toxinas, y hay por tanto la preocupación de que estos agentes pueden llegar a ser obsoletos en un futuro próximo. La espinosina, una lactona tetracíclica de 21 carbonos con dos restos de azúcares, también se comercializa para el control de mosquitos.
En un experimento piloto, se añadió una preparación de cultivo de Xenorhabdus MT secada a agua estancada de un pantano boscoso (100 mg polvo de cultivo secado por 100 ml), y los recipientes se colocaron en una zona de pantanos boscosos durante el verano. Frascos que contenían agua estancada más cultivo de Xenorhabdus MT secado no contenían larvas de mosquitos después de dos semanas, mientras que los frascos de control de agua estancada solamente contenían 20-85 larvas de mosquitos vivas después del mismo período de tiempo. Esto apoya que las preparaciones descritas en el presente documento son útiles en el control de insectos en el campo.
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Como se usa en el presente documento, un "cultivo puro" de una bacteria significa que no hay otras cepas u otras especies de bacterias presentes. En ciertos contextos, no hay más de 1 célula de otras cepas o especies en 107 células en el cultivo.
Una XLT aislada o purificada, como se usa en el presente documento, se refiere a "aislada" a esta molécula cuando no está asociada con las otras moléculas con las que se encontraría en la naturaleza. Por tanto, la referencia a "aislado" y/o "purificado" significa la participación de la "mano del hombre" tal como se describe en el presente documento.
Por actividad de la toxina contra un insecto se entiende que una proteína funciona como un agente de control de insectos activo por vía oral (solo o en combinación con otras proteínas), como se demuestra por su capacidad de desestabilizar o impedir la actividad, crecimiento y/o alimentación de los insectos. La actividad de la toxina puede o no causar la muerte del insecto. Cuando un insecto entra en contacto con una cantidad eficaz de una "toxina" de la invención en cuestión suministrada a través de la composición o composiciones de proteínas formuladas, la composición o composiciones de proteínas pulverizables, una matriz de cebo u otro sistema de suministro, los resultados son típicamente la muerte del insecto, la inhibición del crecimiento y/o proliferación del insecto y/o la prevención de la alimentación de los insectos de la fuente que pone la toxina a disposición de los insectos.
En el presente contexto, una toxina mosquitocida es una proteína que funciona como un agente de control de mosquitos activo por vía oral (solo o en combinación con otras proteínas), como se demuestra por su capacidad de desestabilizar o impedir la actividad, crecimiento y/o alimentación de los insectos. La actividad de la toxina puede o no causar la muerte del mosquito, pero ventajosamente causa la muerte. Cuando un mosquito ingiere una cantidad eficaz de una "toxina" de la invención en cuestión suministrada a través de la composición o composiciones de proteínas formuladas, la composición o composiciones de proteínas pulverizables, una matriz de cebo u otro sistema de suministro, los resultados son típicamente la muerte del mosquito, la inhibición del crecimiento y/o de la proliferación del mosquito.
Como se usa en el presente documento, la actividad insecticida, como se relaciona con la XLT descrita en el presente documento, se refiere a la capacidad de la toxina XLT de matar, inhibir el crecimiento y/o reproducción o afectar negativamente de otro modo a la totalidad o parte de una plaga de insectos, que es un mosquito adulto o juvenil, especialmente después de la ingestión oral de la toxina XLT. Se prefiere la letalidad completa de los insectos que se alimentan, pero no se requiere para alcanzar la actividad funcional. Si un insecto evita la toxina o deja de alimentarse, esa evitación será útil en algunas aplicaciones, incluso si los efectos son subletales o la letalidad se retrasa o es indirecta. Se entiende que la toxina XLT se puede truncar y todavía conservar la actividad funcional. Tal como se usa en el presente documento, el término "toxina" también pretende incluir truncamientos funcionalmente activos, y truncamiento puede incluir menos de la acilación grasa específicamente ejemplificada y/o menos de la acilación grasa completa como se da a conocer en el presente documento.
Además, puede haber sustitución de aminoácidos en la XLT, siempre que se retenga la actividad insecticida y/o tóxica para insectos. Ventajosamente, las sustituciones de aminoácidos son conservativas, es decir, aminoácidos de propiedades físicas similares a los sustituidos (aminoácido básico por aminoácido básico: lisina por ácido diaminobutírico e histidina; glutamina por asparagina; treonina por serina, serina por cisteína, cisteína por serina o alanina por glicina, por ejemplo).
Una cantidad de la XLT eficaz para el control de insectos, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de la toxina que es suficiente para causar al menos una inhibición significativa del crecimiento, el retardo en el desarrollo o la inhibición de la fertilidad o la muerte de al menos una etapa de desarrollo del insecto, especialmente una etapa larval, de un insecto que es un mosquito.
Los insectos diana, especialmente pero no sólo las larvas de mosquitos así como los adultos, se ponen en contacto con la XLT y se permite que la ingiera para dar como resultado el control de insectos. Ventajosamente, la XLT se formula para facilitar la aplicación a un entorno en el que el insecto aparece y se reproduce. La toxina puede estar en forma de un concentrado de cultivo completo, un concentrado de cultivo completo secado o una preparación secada de un concentrado de cultivo completo, células o un sobrenadante de cultivo. Una formulación secada puede incluir un cebo que atraiga a los insectos, incluyendo mosquitos, e induzca la ingestión del material que contiene la toxina para dar como resultado el control de insectos.
Los lipopéptidos XLT descritos en el presente documento también tienen potente actividad antimicrobiana contra una amplia gama de microorganismos incluyendo bacterias grampositivas y gramnegativas y hongos. Se puede encontrar una descripción detallada de los microorganismos pertenecientes a las bacterias grampositivas y gramnegativas en Medical Microbiology (1991), tercera edición, editado por Samuel Baron, Churchill Livingstone, Nueva York. Los ejemplos de bacterias sensibles incluyen, pero sin limitación, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Bacillus cereus. Se entiende que las bacterias grampositivas y gramnegativas adicionales son sensibles, y se aprecia además que los ensayos in vitro descritos en el presente documento modelizan los efectos de los presentes péptidos antimicrobianos en el uso tópico, local, respiratorio o sistémico en un ser humano o animal. La actividad antimicrobiana in vitro de estos péptidos, como se demuestra en el presente documento, es un indicador preciso de la actividad antimicrobiana
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complejos, peptona Bacto y peptona de proteosa (Difco, Detroit, MI). La adición de glucosa a un caldo nutriente no aumentó la formación de XLT. El nivel máximo de producción de toxina (menor dosis letal mínima) es mayor en el medio de sales minerales que contienen una mezcla de vitaminas (por ejemplo, 1,0 ml por 100 ml de medio definido de mezcla de vitaminas de Sigma (Sigma-Aldrich ™, St. Louis, MO; número de catálogo v1-1kt, mezcla de vitaminas completa, o nicotinamida), o extracto de levadura y glucosa o glicerol como fuente de carbono y energía. Estos resultados muestran que las condiciones óptimas para la producción de toxina están en cultivos en crecimiento aeróbico a 30 ºC en el medio de crecimiento definido después de 3 días de incubación. Los cultivos no centrifugados para retirar las células son dos veces más tóxicos que los fluidos sobrenadantes que no contiene células bacterianas, el DLM para los cultivos enteros tanto de caldo nutriente como de sales minerales es de 2,5 μl. Una muestra de 10 μg de un cultivo de glucosa MS (mínimo en sales) secado a 60 ºC era letal para todas las larvas de mosquito de prueba en menos de 5 horas. Las células de la bacteria retiradas por centrifugación se encontró que eran tóxicas para las larvas de mosquito. Se estima que alrededor de la mitad de la toxina está asociada a las células y la mitad está en el medio de cultivo.
Se investigó la ubicación de la toxina en las células. La Tabla 2 muestra que una dosis de 5 X 10 7 células era letal para las larvas. Erradicar la bacteria mediante el calentamiento de las células a 90 ºC durante 20 minutos no disminuyó la actividad, mostrando que la toxicidad no es debido a la infección bacteriana de las larvas. La desestabilización de las células, seguida de centrifugación, revela que toda la actividad de la toxina está asociada con la superficie celular (pared de la membrana); ninguna actividad estaba presente en el citoplasma celular. Se retiró una pequeña cantidad de actividad de las células por incubación con sal, se liberó más por ácido diluido y se retiró casi toda la actividad por base diluida.
Se encontró que XLT era tóxica la etapa adulta voladora de mosquitos Aedes aegypti. Se colocaron de 20 a 30 mosquitos adultos en un vaso de precipitados de 50 ml cubierto con una gasa y que contiene una bola de algodón que había sido humedecida con 1 ml de solución de sacarosa al 1%. Después de aproximadamente 24 horas, los mosquitos comenzaron a beber el agua con azúcar que contiene la toxina y murieron entonces 4-6 horas más tarde. Ningún mosquito murió en un control de sólo agua.
Se cultiva Xenorhabdus MT en cualquier medio complejo (tal como en caldo nutriente, 20 gramos de extracto de peptona o 30 gramos de extracto de carne en 1 litro de agua), o en medio de sales definido con fuente de carbono 0,1 M incluyendo, pero sin limitación, glucosa o glicerol y una fuente de vitaminas. Las células viables pueden conservarse utilizando procedimientos microbiológicos estándares, por ejemplo liofilización o con almacenamiento en glicerol a -80 ºC.
Para la producción de la toxina mosquitocida, puede usarse medio complejo o medio definido para el cultivo durante aproximadamente 2-3 días a 30 ºC con aireación, al menos hasta que se alcanza la fase estacionaria.
Tabla 1. Producción de la actividad mosquitocida por Xenorhabdus sp
- Medios
- Tiempo (d) Temperatura DLM
- caldo nutriente al 2 %
- 1 2 3 5 14 30 30 30 30 30 0 25 10 10 10 10
- caldo nutriente al 2 %
- 3 3 3 25 35 37 25 25 0
- peptona Bacto al 2 %
- 3 30 25
- peptona de proteosa al 2 %
- 3 30 25
- caldo nutriente al 2 %+ glucosa 50 mM
- 3 30 10
- MS + glucosa
- 3 30 5
- MS + glicerol
- 3 30 5
MLD: ul de licor de crecimiento que causan un 100 % de letalidad de 15-20 larvas de A. aegypti después de 24 horas de incubación
MS: fosfato de Na-K 25 mM; (NH4)2SO40,25 mM, fuente de carbono 100 mM y cantidades traza de vitaminas (o nicotinamida) o extracto de levadura. Cultivos agitados a 180 rpm
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Aproximadamente la mitad de la actividad mosquitocida está asociada a células (y/o asociada a la fracción de membrana de pared de células desestabilizadas) y aproximadamente la mitad se encuentra en el medio agotado. Véase la Tabla 2 para información adicional. Al menos parte de la toxina activa se puede retirar de las células o restos celulares usando extracción con ácido (HCl 0,01 N), base (NaOH 0,01 N) o sal (NaCl 1 M).
Tabla 2. Localización de la actividad mosquitocida de Xenorhabdus
- % de actividad*
- Células vivas
- 100
- Células muertas por calor (90 ºC, 20 min)
- 100
- Desestabilización por sonicación Sobrenadante Sedimento
- 0 100
- Desestabilización por prensa French Sobrenadante Sedimento
- 0 100
- NaCl 1,0 M, 24 horas Sobrenadante Sedimento
- 20 80
- HCl 0,01 M, 24 hr Sobrenadante Sedimento
- 40 60
- NaOH 0,01 M, 24 hr Sobrenadante Sedimento (células lisadas)
- 90 10
- * Muestra de 10 μl aplicada a 10-20 larvas de A. aegypti en 0,5 ml y observada después de 24 horas.
La toxina mosquitocida producida como se describe anteriormente en el presente documento se ha purificado hasta homogeneidad aparente usando el esquema que se muestra en la Tabla 3.
Los ensayos se llevaron a cabo tanto para la actividad mosquitocida como para la actividad contra las larvas del insecto lepidóptero Manduca sexta (gusano de cuernos del tabaco). Los resultados se muestran en la Tabla 3. El licor de crecimiento (sobrenadante después de la retirada de las células por centrifugación) contenía toxicidad para ambos insectos de prueba. Ambas actividades precipitaron de licor de crecimiento usando tres volúmenes de acetona, un procedimiento que concentra la preparación 40 veces. Se secó el precipitado de acetona para retirar la acetona residual y después se disolvió en agua y se aplicó a una columna de 2,0 por 30 cm de la matriz de intercambio aniónico Sepharose ™ Q. La actividad mosquitocida no fue absorbida, lo que indica que la toxina está cargada positivamente. La actividad de M. sexta fue completamente absorbida por la resina y eluyó con NaCl 0,5 M. Esta es una etapa de purificación importante que separa las actividades de erradicación de lepidóptero (Manduca) y mosquito. El flujo a través de la fracción no absorbida por la resina se concentró a vacío hasta 10 ml y se aplicó a una columna de intercambio catiónico de 1,0X5,0 cm de CM (carboximetil)Sepharose ™. La actividad fue completamente absorbida por la resina y se eluyó usando NaCl 1,0 M. Se separó continuación este eluido por cromatografía líquida a alta presión en fase inversa (HPLC) utilizando una columna preparativa C18 de 1,0X20 cm y elución con un gradiente de acetonitrilo al 0,1 % en trifluoroacetato. La Figura 5A muestra que la actividad se eluyó de la columna en forma de una serie de picos de absorción a 215 nm (la toxina no tiene absorbancia a 280 nm) que aparecen entre los 40 y 55 minutos. Los materiales de cada uno de estos picos eran mosquitocidas. Se purificó adicionalmente el material de cada fracción de 2 ml, de 40 a 55 minutos de elución, por HPLC de forma individual. Se determinaron los pesos moleculares de las fracciones eluidas, ahora con una sola banda predominante de absorbancia, por espectroscopia de masas MALDI-TOF. Se muestran en la Tabla 4 los resultados representativos de los datos de espectros de masas. Estos resultados muestran que la XLT se compone de una serie de moléculas peptídicas que varían en tamaño desde 1182 hasta 1478 Da.
Los análisis de aminoácidos totales de XLT realizado por la Molecular Structure Facility, Universidad de California Davis, reveló que la toxina se compone de 2 residuos de histidina, 3 residuos de asparagina/aspartato y 1 residuo de cada uno de ácido 2,3-diaminobutírico, glicina y serina. Los análisis de ácidos grasos de derivados metílicos de dos
muestras de XLT hidrolizada con ácido, obtenidos a partir de dos fracciones de pico de HPLC, revelaron que una muestra contenía ácido 2-oxodecanoico y la otra ácido 2-oxooctadecanoico. Estos análisis confirman que la XLT es un lipopéptido con constituyentes de ácidos grasos variables.
Tabla 3. Purificación de toxina de mosquito Xenorhabdus
- DLM*
- Fracción
- Manduca sexta Aedes aegypti
- Licor de crecimiento
- 1000 25 10
- precipitado de acetona 3:1
- 25 100 2
- Sepharose ™ Q Flujo a través Eluido con NaCl
- 40 25 0 100 10 0
- Sepharose ™ CM Flujo a través
- 10 0 2
- HPLC C18 en fase inversa Fraccione activas de Sepharose ™ Q Pool
- 10 0 2
- *ul de muestra que muestran un 80-100 % de efecto letal después de 24 horas Aedes, 5 días Manduca M sexta: μl de la muestra de prueba añadida a 1 cm de fuente de alimentación, 10 larvas probadas de A. aegypti: μl de la muestra de prueba añadida a 10-20 larvas en 0,5 ml de agua
Tabla 4. Tamaños de los péptidos mosquitocidas producidos por Xenorhabdus scapterisci innexi
- Pesos moleculares (Da)**
- Tiempo de elución (min)
- Toxicidad* Mayor Menor
- 40-42
- + 1306 1350
- 42-44
- + 1350 1392
- 44-46
- + 1350 1392
- 46-48
- + 1363 1349
- 48-50
- + 1195 1209
- 50-52
- + 1195 1209
- 52-55
- + 1197 1182
- 55-60
- + 1478 1182
- * 80-100 % de las larvas de Aedes aegypti erradicadas en 24 horas, 10 ul de muestra ** espectrometría de masas MALDI-TOF, las estimaciones de peso molecular son más o menos 3.
Se han estudiado las propiedades de estabilidad de las preparaciones brutas (medio agotado) y preparaciones purificadas de toxina mosquitocida, haciendo medidas de la actividad usando el ensayo descrito en el presente documento.
No hubo pérdida de la actividad, ya sea para la toxina presente en medio bruto agotado (licor de crecimiento) o la
10 toxina purificada, con calentamiento a 100 ºC durante 60 min o con calentamiento a 120 ºC (en autoclave) durante 30 min. Además, la actividad tóxica se mantuvo en las preparaciones secadas mantenidas a 25 ºC durante al menos 36 meses o al menos 48 meses a 0 ºC. Además, esta toxina mosquitocida de Xenorhabdus era estable a la irradiación de una solución acuosa usando una lámpara ultravioleta (254 nm) durante al menos 2 horas. Por último, la actividad mosquitocida no disminuía por la exposición a proteasas incluyendo tripsina, quimotripsina, proteasa K,
15 pronasa o papaína. Del mismo modo, la exposición a pH 1,0 o pH 10,5 durante al menos 24 horas a 25 ºC no dio como resultado un cambio significativo en la actividad.
Comparación de peptidoma con otras cepas de Xenorhabdus y Photorhabdus
Se comparó el espectro peptídico de Xenorhabdus MT obtenido por análisis de MALDI-TOF con los de otras cepas de Xenorhabdus y Photorhabdus con actividad antibiótica y/o mosquitocida. Los resultados se muestran en la tabla 5.
20 Obsérvese que ninguna de las cepas produjo los péptidos característicos de la actividad mosquitocida de X.
innexi.MT.
Tabla 5. Peptidomas relevantes de aislamientos seleccionados de Xenorhabdus y Photorhabdus (componentes principales)
- Aislamiento
- Actividad mosquitocida1 Actividad antibiótica2 Péptido (Dalton)
- X. Scapterisci innexi
- + + 1306, 1350, 1392
- X. innexi de DSM
- - + 1233, 1247, 1249
- X. bovenii
- - + 1080, 1113, 1127, 1151,
- X. riobravis
- W + 1080, 1094, 1108, 1296,
- X. nematophilus
- W + 1080, 1107, 1130
- X. japonica
- - + 1080, 1094, 1108, 1130,
- P. luminescens tto1
- W + 1097,1389
- SLP3
- + + 1199, 1213, 1462, 1519,
- XNH3 3
- W + 1075, 1113, 1127, 1131,
- SEX20 3
- + + 1105, 1162, 1185, 1901,
- MP4 3
- - + 1213
- SEP389 3
- - + 1105, 1162, 1518, 1590,
- SEP301 3
- W + 1105, 1340, 1354
- SEP562 3
- + + 1199, 1213, 1462, 1519,
- 1590
- GLX120 3
- W + 1389
- 1 + 25 μl de sobrenadante letal para 15-20 larvas de A. aegypti en 24 h con 50 μl de sobrenadante letal a las 72 h 50 μl de sobrenadante no letal a las 72 horas 2 Sin crecimiento de Bacillus subtilis o Staphylococcus aureus, 1,0 ml de sobrenadante añadido a 25 ml de cultivo3 Aislado por J. Ensign; las estimaciones de peso molecular son más o menos 3.
Análisis estructural del lipopéptido mosquitocida
5 Se dedujo la estructura del lipopéptido mosquitocida usando datos de espectrometría de masas después de la hidrólisis del lipopéptido. El análisis de espectro de masas fue precedido por una hidrólisis ácida en fase de vapor estándar para liberar los aminoácidos libres, seguida de (a) análisis de MS directo de los aminoácidos libres en el hidrolizado y (b) derivatización con FDAA seguida por LC/MS para ayudar a determinar la quiralidad, y para determinar las masas de residuos de aminoácidos con el fin de identificar los diversos aminoácidos. Estos datos se
10 correlacionaron con los datos de masa por MS de infusión directa para confirmar la presencia de los aminoácidos sospechosos. Sin desear estar ligado por ninguna teoría particular, se cree que los aminoácidos en la Xenorhabdus XT incluyen histidina, glicina, asparagina (y/o aspartato), ácido diaminobutírico y serina, y hay al menos un ácido oxograso de C8 a C20.
Modo de acción de la toxina de Xenorhabdus para mosquitos
15 El modo de acción de la toxina de Xenorhabdus MT para mosquitos (XLT) se estudió en un bioensayo de larvas de mosquitos, modificado del de Addullah et al. (2003), Appl. Environ. Microbiol. 69: 5343-5374. Se crían mosquitos en una sala de ambiente controlado a 28 ºC y 85 % de humedad, con un fotoperíodo de 14 h de luz y 10 h de oscuridad. Se usan larvas de 2-3 instar para todos los bioensayos. Se realizan los bioensayos 2-4 días después de la eclosión de las larvas. Se alimentaron un total de 10 a 20 larvas por 0,5 ml de agua con una réplica en una placa de cultivo
20 celular Costar (Corning) de 24 pocillos con diluciones en serie de las preparaciones de XLT o cantidades definidas de las preparaciones de XLT, y se cuenta la mortalidad después de 24 horas de incubación a 28 ºC.
Se determinó la dosis letal mínima de XLT para las larvas de Aedes aegypti como sigue. Se colocan de 10 a 20 larvas de instar 3 a 4 de A. aegypti en 0,5 ml de agua en los pocillos de una placa de microtitulación de 24 pocillos. Se añadieron entonces diluciones en serie de XLT como muestras de 10 μl. Después de 8 y 24 horas de incubación
25 a 25 ºC, se contaron los números de larvas vivas (móviles) y muertas (inmóviles). La dosis letal mínima a la que se erradicaron todos los mosquitos era de 10 μg de toxina purificada.
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Puede usarse cada formulación o combinación de componentes descrita o ejemplificada para practicar la invención, a menos que se indique lo contrario. Los nombres específicos de los compuestos pretenden ser ejemplares, ya que se sabe que un experto en la técnica puede nombrar los mismos compuestos de forma diferente. Cuando un compuesto se describe en el presente documento de tal manera que no se especifica un isómero o enantiómero particular del compuesto, por ejemplo en una fórmula o un nombre químico, se pretende que la descripción incluya cada uno de los isómeros y enantiómeros del compuesto descrito individualmente o en cualquier combinación. Un experto en la técnica apreciará que pueden emplearse procedimientos, materiales de partida, procedimientos sintéticos y cepas bacterianas distintos de los específicamente ejemplificados en la práctica de la invención sin recurrir a experimentación indebida.
Tal como se usa en el presente documento, "que comprende" es sinónimo de "que incluye", "que contiene" o "caracterizado por," y es inclusivo o de extremos abiertos y no excluye elementos o etapas de procedimiento adicionales no citados. Cuando se usa en el presente documento, “que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se usa en el presente documento, “que consiste esencialmente en” no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación. Cualquier cita en el presente documento de la expresión "que comprende", particularmente en una descripción de componentes de una composición o en una descripción de elementos de un dispositivo, se entiende que engloba las composiciones y procedimientos que consisten esencialmente en y que consisten en los componentes o elementos citados. La invención ilustrativamente descrita en el presente documento puede practicarse adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se dé a conocer específicamente en el presente documento.
En el contexto de esta solicitud, insecticida significa que la exposición a o el consumo de la toxina lipopeptídica de Xenorhabdus descrita en el presente documento da como resultado la muerte de al menos un insecto, especialmente de al menos una larva de insecto.
En la presente solicitud, medio de cultivo agotado o medio de cultivo completo agotado (incluyendo células) es sustancialmente sinónimo de un caldo de fermentación o caldo de fermentación agotado, que es el producto de crecimiento de Xenorhabdus MT (PTA 6826) o una cepa que produce el mismo lipopéptido mosquitocida y contiene ese mismo lipopéptido mosquitocida. El reconocimiento de que la toxina lipopeptídica mosquitocida descrita en el presente documento actúa en el intestino de la larva de mosquito, por ejemplo después de la ingestión oral, conduce al desarrollo de composiciones de control de insectos y a procedimientos que se basan en la ingestión en un entorno infestado. Una manera de introducir el péptido mosquitocida descrito en el presente documento es en cebos de insectos (especialmente mosquitos).
El lipopéptido o lipopéptidos mosquitocidas se puede administrar a los insectos ya sea en forma purificada o no purificada, por ejemplo, en cantidades de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 mg/l de caldo u otra formulación. Cuando las composiciones contienen células de Xenorhabdus, las células pueden ser viables o no viables. Las formulaciones insecticidas se pueden aplicar en forma de polvos secos o gránulos o una formulación líquida, por ejemplo, mediante pulverización. Los caldos de fermentación agotados completos o libres de células se pueden secar o concentrar mediante procedimientos adecuados de ultrafiltración, secado por pulverización, secado en tambor, o la liofilización. Las composiciones insecticidas se pueden aplicar al entorno infestado usando pulverizadores de pista, pulverizadores de jeringa, fumigadores, dispersión manual de material seco o líquido, o similares, en cantidades mosquitocidas eficaces, por ejemplo a partir de 247 g a 112 kg/Ha.
Pueden añadirse agentes humectantes, agentes emulsionantes y difusores a las preparaciones que contienen la toxina de Xenorhabdus diseñadas para su aplicación en un entorno en el que se desea el control de las poblaciones de mosquitos. Los emulsionantes son conocidos en la técnica, y pueden incluir alquilfenoles, Tween ™ 80, Sandovit., 9 D 207, Novémol, Pinolene 1882, Petro AG, Span 80, Colloidal X77, Triton N60, Triton X100, Triton GR7M, Triton 155, Atlox 848, Tween ™ 20, Triton X45 V Atplus 448 F, Triton X114 Bt, Atplus 300 F, V Atlox 849, o Atlox 3404/849, entre otros. Además, pueden añadirse materiales inertes para volumen, como se conoce en la técnica. Después del secado, se puede moler el material secado para facilitar el manejo y dispersión en agua.
En general, los términos y frases que se usan en el presente documento tienen su significado reconocido en la técnica, que se puede encontrar por referencia a textos estándares, referencias de revistas y contextos conocidos por los expertos en la técnica.
La formulación exacta, vía de administración y dosificación de un lipopéptido XLT antimicrobiano pueden elegirse por el médico individual en vista del estado del paciente (véase, por ejemplo, Fingl et. al., en “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 1975, cap. 1, pág. 1).
Cabe señalar que el médico encargado sabría cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la administración debido a la toxicidad, o a disfunciones de órganos, o para un tratamiento exitoso. A la inversa, el médico encargado sabrá también ajustar el tratamiento a niveles superiores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluye la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en la gestión del trastorno de interés varía con la gravedad de la afección a tratar y la vía de administración. La gravedad de la afección puede evaluarse, por ejemplo en parte, mediante procedimientos estándares de evaluación de pronóstico. Además, la dosis y quizás frecuencia de dosis
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también varían según la edad, peso corporal y respuesta del paciente individual. Puede usarse también un programa comparable al discutido anteriormente en medicina veterinaria.
Dependiendo de las afecciones específicas que se esté tratando y del procedimiento de orientación o de suministro seleccionado, dichos agentes se pueden formular y administrar sistémicamente o localmente. Las técnicas para formulación y administración pueden encontrarse en Alfonso y Gennaro (1995). Las vías adecuadas pueden incluir, por ejemplo, la administración tópica, oral, rectal, transdérmica, vaginal, transmucosa o intestinal; el suministro parenteral, incluyendo inyecciones intramuscular, subcutánea o intramedular, así como inyeccione intratecal, intravenosa o intraperitoneal.
Para la inyección, el péptido o péptidos XLT antimicrobianos de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica. Para la administración transmucosa, se usan en la formulación os penetrantes apropiados a la barrera para permear. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
El uso de vehículos farmacéuticamente aceptables para formular los compuestos dados a conocer en el presente documento para la práctica de la invención en dosificaciones adecuadas para la administración sistémica está dentro del alcance de la invención. Con la elección apropiada de vehículo y la práctica de fabricación adecuada, las composiciones proporcionadas en el presente documento, en particular las formuladas como soluciones, se pueden administrar por vía parenteral, tal como mediante inyección intravenosa. Las composiciones antimicrobianas terapéuticamente eficaces apropiadas se pueden formular fácilmente usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para la administración oral. Dichos vehículos permiten que los compuestos de la invención sean formulados como comprimidos, píldoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones densas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un paciente a tratar.
Los lipopéptidos XLT antimicrobianos que se pretenden administrar intracelularmente se pueden administrar usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, dichos agentes pueden encapsularse en liposomas y a continuación administrarse como se describe anteriormente. Los liposomas son bicapas lipídicas esféricas con interiores acuosos. Todas las moléculas presentes en una solución acuosa en el momento de la formación del liposoma se incorporan al interior acuoso. Los contenidos liposómicos están tanto protegidos del microentorno externo como, debido a que los liposomas se fusionan con las membranas celulares, se suministran eficazmente al citoplasma celular. Además, debido a su hidrofobicidad, las moléculas orgánicas pequeñas pueden administrarse directamente de forma intracelular.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en procedimientos antimicrobianos incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el objetivo pretendido. La determinación de las cantidades eficaces está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas antimicrobianas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos a preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Las preparaciones formuladas para administración oral pueden estar en forma de comprimidos, grageas, cápsulas o soluciones, incluyendo las formuladas para liberación retardada o sólo para liberar cuando el producto farmacéutico alcanza el intestino delgado o grueso.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden fabricarse de una manera que es en sí conocida, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, elaboración de grageas, levitación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácido graso sintéticos tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas.
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener combinando los compuestos activos con excipiente sólido, moliendo opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.
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Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito, pueden usarse soluciones de azúcar concentradas, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de lacado y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de las grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse oralmente incluyen cápsulas de ajuste suave hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste suave pueden contener los ingredientes activos mezclados con carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes.
Cuando se da a conocer un grupo de sustituyentes en el presente documento, se entiende que todos los miembros individuales de esos grupos y todos los subgrupos, incluyendo cualquier isómero e enantiómero de los miembros del grupo, y las clases de compuestos que se pueden formar usando los sustituyentes, se dan a conocer por separado.
Cuando se reivindica un compuesto, se debe entender que los compuestos conocidos en la técnica, incluyendo los compuestos dados a conocer en las referencias descritas en el presente documento, no se pretenden incluidos dentro de la reivindicación.
Cada formulación o combinación de componentes descrita o ejemplificada se puede usar para practicar la invención, a menos que se indique lo contrario. Los nombres específicos de los compuestos se pretende que sean ejemplares, ya que se sabe que un experto en la técnica puede nombrar los mismos compuestos de forma diferente. Cuando un compuesto se describe en el presente documento de tal manera que no se especifica un isómero o enantiómero particular del compuesto, por ejemplo, en una fórmula o un nombre químico, se pretende que esa descripción incluya cada uno de los isómeros y enantiómeros del compuesto descrito individual o en cualquier combinación. Un experto ordinario en la técnica apreciará que pueden emplearse procedimientos, medios, estrategias de fermentación, materiales de partida, procedimientos sintéticos y procedimientos de purificación distintos de los específicamente ejemplificados en la práctica de la invención sin recurrir a experimentación indebida. Todos los equivalentes funcionales conocidos en la técnica de cualquiera de dichos procedimientos, medios, estrategias de fermentación, materiales de partida, procedimientos sintéticos, y procedimientos de purificación se pretenden incluidos en esta invención.
Tal como se usa en el presente documento, "que comprende" es sinónimo de "que incluye", "que contiene" o "caracterizado por," y es inclusivo o de extremos abiertos y no excluye elementos o etapas de procedimiento adicionales no citados. Cuando se usa en el presente documento, “que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se usa en el presente documento, “que consiste esencialmente en” no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación. Cualquier cita en presente documento de la expresión "que comprende", particularmente en una descripción de componentes de una composición o en una descripción de elementos de un dispositivo, se entiende que engloba las composiciones y procedimientos que consisten esencialmente en y que consisten en los componentes o elementos citados.
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