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ES2606703T3 - Método para predecir el pronóstico de una terapia de cáncer de mama con base en el análisis de metilación del gen - Google Patents

Método para predecir el pronóstico de una terapia de cáncer de mama con base en el análisis de metilación del gen Download PDF

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ES2606703T3
ES2606703T3 ES13179002.4T ES13179002T ES2606703T3 ES 2606703 T3 ES2606703 T3 ES 2606703T3 ES 13179002 T ES13179002 T ES 13179002T ES 2606703 T3 ES2606703 T3 ES 2606703T3
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Ralf Lesche
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Abstract

Un método para determinar el pronóstico de un sujeto que tiene cáncer de mama y para predecir el resultado del tratamiento de dicho cáncer de mama posterior a una terapia, en donde el procedimiento comprende la determinación de los niveles de metilación del gen CDO1 como se establece en SEQ NO: 13 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, en donde el estatus de metilación es indicativo de pronóstico.

Description

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En el análisis de transferencia Northern total o poli(A)+ ARNm se ejecuta en un gel de agarosa desnaturalizante y se detecta por hibridación con una sonda marcada en el gel secado por sí mismo o en una membrana. La señal resultante es proporcional a la cantidad de ARN objetivo en la población de ARN.
La comparación de las señales de dos o más poblaciones de células o tejidos revela diferencias relativas en los niveles de expresión génica. La cuantificación absoluta se puede realizar mediante la comparación de la señal con una curva estándar generada usando cantidades conocidas de una transcripción in vitro que corresponden al ARN objetivo. Se espera que el análisis de genes cuidadores, genes cuyos niveles de expresión permanecen relativamente constantes independientemente de las condiciones, sea con frecuencia utilizada para normalizar los resultados, eliminando cualesquier diferencias aparentes causados por transferencia desigual de ARN a la membrana o carga desigual de ARN en el gel.
El primer paso en el análisis Northern es aislar ARN puro, intaco de las células o tejido de interés. Debido a transferencias Northern que distinguen ARN por tamaño, la integridad de la muestra influye en el grado en el que una señal se localiza en una banda individual. Muestras de ARN parcialmente degradadas darán como resultado la señal que está manchada o distribuida sobre varias bandas con una pérdida global de la sensibilidad y posiblemente una interpretación errónea de los datos. En el análisis de transferencia de Northern, las sondas de ADN, ARN y oligonucleótidos se pueden utilizar y estas sondas se marcan preferiblemente (por ejemplo, marcadores radiactivos, marcadores de masa o marcadores fluorescentes). El tamaño del ARN objetivo, no de la sonda, determinará el tamaño de la banda detectada, por lo que los métodos tales como el etiquetado cebado al azar, que genera sondas de longitudes variables, son adecuados para la síntesis de la sonda. La actividad específica de la sonda determinará el nivel de sensibilidad, por lo que se prefiere que se utilicen las sondas con altas actividades específicas.
En un ensayo de protección de RNasa, el ARN objetivo y una sonda de ARN de una longitud definida se hibridaron en solución. Después de la hibridación, el ARN se digiere con RNasas específicas para los ácidos nucleicos de cadena sencilla para eliminar cualquier ARN objetivo de cadena sencilla no hibridada y la sonda. Las RNasas se inactivan, y el ARN se separa, por ejemplo, por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. La cantidad de sonda de ARN intacta es proporcional a la cantidad de ARN objetivo en la población de ARN. Se puede utilizar RPA para la cuantificación relativa y absoluta de la expresión génica y también para la estructura del ARN de mapeo, tales como límites intrón/exón y sitios de inicio de la transcripción. El ensayo de protección de RNasa es preferible a análisis de transferencia Northern, ya que generalmente tiene un límite inferior de detección.
Las sondas de ARN antisentido utilizadas en RPA son generadas por transcripción in vitro de una plantilla de ADN con un punto final definido y están típicamente en el rango de 50-600 nucleótidos. El uso de sondas de ARN que incluyan secuencias adicionales no homólogas al ARN objetivo permite que el fragmento protegido sea distinguido de la sonda de longitud completa. Las sondas de ARN se utilizan típicamente en lugar de sondas de ADN debido a la facilidad de generar sondas de ARN de cadena simple y la reproducibilidad y fiabilidad de la digestión de ARN:ARN dúplex con RNasas (Ausubel et al. 2003), particularmente preferidas son sondas con altas actividades específicas. Particularmente preferido es el uso de microarreglos. El proceso de análisis de microarreglos se puede dividir en dos partes principales. Primero, es la inmovilización de secuencias de genes conocidos en láminas de vidrio u otro soporte sólido seguido por la hibridación del ADNc marcado con fluorescencia (que comprende las secuencias que se van a interrogar) a los genes conocidos inmovilizados sobre láminas de vidrio (u otra fase sólida). Después de la hibridación, los arreglos son escaneados utilizando un escáner de microarreglos fluorescente. El análisis de la intensidad de fluorescencia relativa de diferentes genes provee una medida de las diferencias en la expresión génica.
Los arreglos de ADN pueden generarse inmovilizando oligonucleótidos presintetizados en láminas de vidrio preparadas u otras superficies sólidas. En este caso, las secuencias de genes representativos se fabrican y se preparan utilizando métodos estándar de síntesis y purificación de oligonucleótidos. Estas secuencias de genes sintetizados son complementarias a las transcripciones de ARN de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de CDO1; APC; BMPR1A; CTAGE5; CXCL12; NCR1; NFATC2; PAX9; POU4F3; y ZBTB16 y tienden a ser secuencias más cortas en el rango de 25-70 nucleótidos. Alternativamente, los oligonucleótidos inmovilizados pueden sintetizarse químicamente in situ sobre la superficie de la lámina. La síntesis de oligonucleótidos in situ implica la adición consecutiva de los nucleótidos adecuados a las manchas en el microarreglo; las manchas que no reciben un nucleótido se protegen durante cada etapa del proceso usando máscaras físicas o virtuales. Preferiblemente, dichos ácidos nucleicos sintetizados son ácidos nucleicos bloqueados.
En los experimentos de microarreglos de perfiles de expresión, las plantillas de ARN utilizadas son representativas del perfil de transcripción de las células o tejidos bajo estudio. El ARN es primero aislado de las poblaciones de células o tejidos que se van a comparar. Cada muestra de ARN se utiliza entonces como una plantilla para generar ADNc marcado con fluorescencia a través de una reacción de transcripción reversa. El etiquetado fluorescente del ADNc puede realizarse por cualquiera de los métodos de marcaje directo o métodos de marcaje indirecto. Durante el marcaje directo, los nucleótidos fluorescentemente modificados (por ejemplo, Cy®3-o Cy®5-dCTP) se incorporan directamente en el ADNc durante la transcripción reversa. Alternativamente, el marcaje indirecto puede lograrse mediante la incorporación de nucleótidos modificados con aminoalilos durante la síntesis de ADNc y luego conjugación de un colorante de N-hidroxisuccinimida (NHS) -éster al ADNc modificado con amimoalilos después de
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para la amplificación de ADN tratado con bisulfito permite la diferenciación entre ácidos nucleicos metilados y no metilados. Pares de cebadores MSP contienen al menos un cebador que se hibrida a un dinucleótido CpG tratado con bisulfito. Por lo tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido CpG. Cebadores de MSP específicos para el ADN no metilado contienen una "T" en la posición de la posición C en el CpG. Preferiblemente, por lo tanto, la secuencia bases de dichos cebadores se requiere para comprender una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que se hibrida a una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 21-40 y 61-80 o regiones preferidas de las mismas de acuerdo con SEQ ID NO: 41-60 y 81-100 y las secuencias complementarias de las mismas, en donde la secuencia bases de dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido CpG. Una realización preferida adicional del método comprende el uso de oligonucleótidos bloqueadores (el ensayo HeavyMethyl™). El uso de tales oligonucleótidos bloqueadores se ha descrito por Yu et al, BioTechniques 23:714-720, 1997. Los oligonucleótidos de la sonda de bloqueo se hibridan con el ácido nucleico tratado con bisulfito simultáneamente con los cebadores de PCR. La amplificación por PCR del ácido nucleico se termina en la posición 5' de la sonda de bloqueo, de tal manera que la amplificación de un ácido nucleico es suprimida donde la secuencia complementaria a la sonda de bloqueo está presente. Las sondas pueden diseñarse para hibridar con el ácido nucleico tratado con bisulfito de una manera específica al estatus de metilación. Por ejemplo, para la detección de ácidos nucleicos metilados dentro de una población de ácidos nucleicos no metilados, la supresión de la amplificación de ácidos nucleicos que son no metilados en la posición en cuestión podría llegarse a cabo mediante el uso de sondas de bloqueo que comprenden un 'CpA "o" TPA 'en la posición en cuestión, a diferencia de un "CpG" si se desea la supresión de la amplificación de ácidos nucleicos metilados.
Para los métodos de PCR utilizando oligonucleótidos bloqueadores, la interrupción eficiente de la amplificación mediada por polimerasa requiere que los oligonucleótidos bloqueadores no sean alargados por la polimerasa. Preferiblemente, esto se logra mediante el uso de los bloqueadores que son 3'desoxioligonucleótidos, u oligonucleótidos derivados en la posición 3' con un grupo diferente de hidroxilo "libre". Por ejemplo, oligonucleótidos 3'-O-acetilo son representativos de una clase preferida de molécula bloqueadora.
Adicionalmente, la descomposición mediada por polimerasa de los oligonucleótidos bloqueadores debería ser precluida. Preferiblemente, tal preclusión comprende bien sea el uso de una polimerasa que carece de actividad de 5'-3' exonucleasa, o el uso de oligonucleótidos bloqueadores modificados que tienen, por ejemplo, puentes tioato en los terminales 5' del mismo que hacen que la molécula de bloqueador sea resistente a la nucleasa. Aplicaciones particulares pueden no requerir tales modificaciones en 5' del bloqueador. Por ejemplo, si el bloqueador -y los sitios de enlazamiento del cebador se superponen, por lo tanto el enlazamiento precluyente del cebador (por ejemplo con bloqueador en exceso), la degradación del oligonucleótido bloqueador será sustancialmente precluida. Esto se debe a que la polimerasa no extenderá el cebador hacia y a través de (en la dirección 5'-3’) del bloqueador-un proceso que normalmente da como resultado la degradación del oligonucleótido bloqueador hibridado.
Una realización del bloqueador /PCR particularmente preferida, para los propósitos de la presente divulgación y tal como es implementada aquí, comprende el uso de oligómeros de ácido nucleico peptídico (PNA) tales como oligonucleótidos bloqueadores. Tales oligómeros bloquedores PNA son adecuados idealmente, puesto que ni son descompuestos ni extendidos por la polimerasa.
Preferiblemente, por lo tanto, la secuencia bases de dichos oligonucleótidos bloquedores se requiere para comprender una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibridan con una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 21-40 y 61-80 o regiones preferidas de los mismos de acuerdo con SEQ ID NO: 41-60 y 81-100 y las secuencias complementarias de las mismas, en donde la secuencia bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA. Se prefiere particularmente que la secuencia bases de dichos oligonucleótidos de bloqueo es requerido para comprender una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibridan a una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 61-80 o regiones preferidas de las mismas de acuerdo con la SEQ ID NO: 81-100 y secuencias complementarias de las mismas, en donde la secuencia bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido TpG o CpA.
Los fragmentos obtenidos por medio de la amplificación pueden llevar un marcador directa o indirectamente detectable. Se prefieren marcadores en la forma de marcadores fluorescentes, radionúclidos o fragmentos de moléculas desprendibles que tienen una masa típica que puede ser detectada en un espectrómetro de masas. Cuando dichos marcadores son marcadores de masa, se prefiere que los amplificados marcados tengan una carga neta individual positiva o negativa, permitiendo una mejor detección en el espectrómetro de masas. La detección puede llevarse a cabo y visualizarse por medio de, por ejemplo, espectrometría de masas de matriz de desorción/ionización asistida por láser (MALDI) o utilizando espectrometría de masas con aspersión de electrones (ESI).
La espectrometría de masas de matriz de desorción/ionización asistida por (MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficiente para el análisis de biomoléculas (Karas & Hillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988). Un analito es embebido en una matriz absorbente de luz. La matriz es evaporada mediante un pulso corto de láser transportando así la molécula del analito hacia la fase de vapor de una manera no fragmentada. El analito es ionizado por colisiones con moléculas de la matriz. Un voltaje aplicado acelera los iones hacia un tubo de vuelo libre de campo.
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sustancias o soluciones para la realización de una cromatografía en columna; sustancias o soluciones para la realización de un enriquecimiento basado en la inmunología (por ejemplo, inmunoprecipitación); sustancias o soluciones para la realización de una amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, PCR; un colorante o varios colorantes, si se aplica con un reactivo de acoplamiento, si es aplicable en una solución; sustancias o soluciones
5 para la realización de una hibridación; y/o sustancias o soluciones para la realización de una etapa de lavado.
La divulgación se refiere además a una composición de materia útil para determinar el pronóstico de un sujeto que tiene trastorno proliferativo celular, preferiblemente cáncer. Dicha composición de materia es particularmente adecuada para determinar dicho pronóstico posterior a una terapia que comprende al menos una antraciclina.
Dicha composición comprende al menos un ácido nucleico de 18 pares de bases de longitud de un segmento de la
10 secuencia de ácido nucleico divulgada en la SEQ ID NO: 21-40 y 61-80 o regiones preferidas de las mismas de acuerdo con SEQ ID NO: 41-60 y 81-100, y una o más sustancias tomadas del grupo que comprende: cloruro de magnesio 1-5 mM, dNTP 100 a 500 µM, 0.5-5 unidades de Taq polimerasa, albúmina de suero bovino, un oligómero, en particular, un oligonucleótido u oligómero de (PNA) de ácido nucleico peptídico, dicho oligómero que comprende en cada caso al menos una secuencia base que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que es
15 complementaria a, o se hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a un ADN genómico pretratado de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 21-40 y 61-80 o regiones preferidas de las mismas de acuerdo con SEQ ID NO: 41-60 y 81-100 y secuencias complementarias a las mismas. Se prefiere que dicha composición de materia comprenda una solución reguladora apropiada para la estabilización de dicho ácido nucleico en una solución acuosa y que permita reacciones basadas en polimerasa dentro de dicha solución. Los reguladores adecuados son
20 conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente.
En realización preferidas adicionales de la divulgación dicho al menos un ácido nucleico es al menos de 50, 100, 150, 200, 250 o 500 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de ácido nucleico divulgada en la SEQ ID NO: 21-40 y 61-80 regiones o preferidas de las mismas de acuerdo con SEQ ID NO: 41-60 y 81-100.
Tabla 1: Secuencias genómicas y variantes tratadas de las mismas de acuerdo con la divulgación.
Gen
Accession No. SEQ ID NO: genómico Secuencia metilada pretratada (en sentido) SEQ ID NO: Cadena metilada pretratada (antisentido) SEQ ID NO: Secuencia no metilada pretratada (en sentido) SEQ ID NO: Secuencia no metilada pretratada (antisentido) SEQ ID NO:
APC
1 21 22 61 62
APC
BMPR1A
2 23 24 63 64
BMPR1A
CDO1
3 25 26 65 66
CDO1
CTAGE5
4 27 28 67 68
CTAGE5
CXCL12
5 29 30 69 70
CXCL12
NCR1
6 31 32 71 72
NCR1
NFATC2
7 33 34 73 74
NFATC2
PAX9
8 35 36 75 76
PAX9
POU4F3
9 37 38 77 78
POU4F3
ZBTB16
10 39 40 79 80
ZBTB16
Tabla 2: Regiones particularmente preferidas de las secuencias de acuerdo con la tabla 1.
Gen
SEQ ID NO: genómico Secuencia metilada pretratada (en sentido) SEQ ID NO: Cadena metilada pretratada (antisentido) SEQ ID NO: Secuencia no metilada pretratada (en sentido) SEQ ID NO: Secuencia no metilada pretratada (antisentido) SEQ ID NO:
APC
11 41 42 81 82
BMPR1A
12 43 44 83 84
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