ES2605740T3

ES2605740T3 - Método inmunoterapéutico para aumentar en un sujeto la tolerancia a los cacahuetes

Info

Publication number: ES2605740T3
Application number: ES08856600.5T
Authority: ES
Inventors: Lucie Mondoulet; Christophe Dupont; Pierre-Henri Benhamou; Bertrand Dupont
Original assignee: DBV Technologies SA
Current assignee: DBV Technologies SA
Priority date: 2007-12-03
Filing date: 2008-12-03
Publication date: 2017-03-16
Anticipated expiration: 2028-12-03
Also published as: WO2009080934A3; AU2008333192B2; IL205822A0; CA2707013A1; US10272151B2; ES2441580T3; IL205822A; US12403193B2; US11931411B2; US20200353072A1; WO2009080934A2; US10758610B2; US20220241405A1; FR2924349B1; US20250375518A1; AU2008339833A1; US20100260821A1; CA2706020A1; US11202826B2; FR2924349A1

Abstract

Una composición de alérgenos de cacahuete para uso en el aumento de la tolerancia a los cacahuetes en un sujeto alérgico a los cacahuetes, en donde dicha composición comprende una o más proteínas seleccionadas de Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3 o sus isoformas, sin adyuvante, y en donde dicha composición se administra repetidamente a dicho sujeto por vía epicutánea por medio de un dispositivo de parche para la piel que comprende un soporte, estando adaptada la periferia de dicho soporte para crear con la piel una cámara herméticamente cerrada, en donde el parche comprende dicha composición en una dosis suficiente para inducir y controlar una reacción inflamatoria sobre la piel de dicho sujeto después de la aplicación del dispositivo de parche a la piel, conduciendo dicha administración, por repetición, a un aumento progresivo en el sujeto de la tolerancia a los cacahuetes.

Description

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DESCRIPCION

Metodo inmunoterapeutico para aumentar en un sujeto la tolerancia a los cacahuetes Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a nuevos metodos inmunoterapeuticos para aumentar en un sujeto la tolerancia a los cacahuetes. En particular, la presente invencion describe el uso de un dispositivo de parche para la piel para la insensibilizacion progresiva a los cacahuetes de un sujeto.

Antecedentes de la invencion

La alergia a los cacahuetes es una de las reacciones de hipersensibilidad inmediata a los alimentos mas comun y grave en terminos de persistencia y gravedad de la reaccion. De hecho, se estima que esta alergia esta implicada en la mayona de las anafilaxias letales y casi letales relacionadas con los alimentos en todos los grupos de edad. La prevalencia de esta alergia se ha duplicado en la ultima decada y ahora afecta entre el 0,6% y el 1,2% de la poblacion general (Sicherer et al., 2003).

Esta alergia tiende a presentarse en una etapa temprana de la vida y solo el 20% de ninos alergicos llega a ser tolerante a los cacahuetes (Skolnick et al., 2001). La sensibilizacion se produce generalmente en el tracto gastrointestinal, pero tambien se puede producir como consecuencia de una sensibilizacion directa o cruzada por exposicion por inhalacion a cacahuetes o antfgenos medioambientales de reaccion cruzada, tal como el polen.

La reaccion alergica provocada por los cacahuetes es estrictamente una reaccion de hipersensibilidad de tipo I mediada por IgE. El complejo IgE-alergeno hace que reticulen receptores de mastocitos induciendo una cascada de transduccion de senal que termina en la desgranulacion y liberacion de una variedad de mediadores, lo que da lugar a los smtomas clmicos de hipersensibilidad a los cacahuetes.

Los principales alergenos de cacahuete son protemas de almacenamiento de semillas. Aunque han sido documentados 9 alergenos de cacahuete, es decir, Ara h 1 a Ara h 9 (Burks et al., 1992; Burks et al., 1991; Rabjohn et al., 1999; Koppelman et al., 2005; Mittag et al., 2004; Becker et al., 2001, Lauer et al., 2008), Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3 se clasifican como los principales alergenos de cacahuete debido a que generalmente se reconocen en mas del 50% de pacientes alergicos a los cacahuetes (Koppelman et al., 2001).

El tratamiento preventivo de esta alergia consiste en evitarla, lo que es muy diffcil debido al uso generalizado y con frecuencia enmascarado de cacahuetes en la industria alimentaria. Se pueden utilizar farmacoterapias actuales (antihistaminas y corticosteroides) para reducir los smtomas de una enfermedad alergica pero no evitan la reaccion alergica.

La inmunoterapia es el unico tratamiento disponible que puede modificar el curso natural de la enfermedad alergica, reduciendo la sensibilidad a los alergenos. Para inmunoterapia, se administra una dosis de un alergeno con el fin de inducir progresivamente una respuesta inmunitaria caracterizada por la tolerancia al antfgeno/alergeno, tambien conocida como insensibilizacion. Este metodo esta indicado particularmente para pacientes con reacciones alergicas graves dependientes de IgE.

A pesar de que la inmunoterapia se ha estado utilizando durante mas de 90 anos, el mecanismo exacto de su accion todavfa no esta claro. En los seres humanos implica: (i) un aumento de la IgG, en particular IgG4, que es un anticuerpo bloqueante que puede bloquear mecanismos mediados por IgE inhibiendo la liberacion de mediadores inflamatorios de mastocitos y basofilos, (ii) un aumento de linfocitos T reguladores (Treg) lo que conduce a un mejor equilibrio del perfil Th2/Th1 y (iii) la produccion de linfocitos T productores de IL-10, conocida tambien como factor inhibidor de la smtesis de citoquinas humanas (CSIF), que contrarresta el efecto inflamatorio de los mastocitos y promueve la produccion de IgG4.

Hasta ahora, la inmunoterapia podfa ser administrada por vfas subcutanea, sublingual o intra-nasal.

La inmunoterapia subcutanea es el tratamiento mas comun utilizado por los alergologos. Sin embargo, este metodo es bastante caro y requiere un profesional especializado para cada inyeccion. Un inconveniente importante de la inmunoterapia subcutanea es sus efectos secundarios alergicos. Estos efectos secundarios pueden ser locales o sistemicos. Se ha demostrado que las inmunoterapias para la alergia a los cacahuetes que utilizan la via subcutanea inducen una alta tasa de reaccion sistemica adversa (hasta 50%) (Nelson et al., 1997 y Oppenheimer et al., 1992). Los efectos secundarios sistemicos son causados por alergenos que han sido inyectados inadvertidamente en pequenos vasos sangumeos subcutaneos, o alergenos que se difunden en los vasos sangumeos subcutaneos. Los alergenos pueden ser transportados a otros organos, tales como el pulmon o sitios distantes de la piel, donde pueden provocar asma o urticaria. Tambien pueden causar anafilaxia que puede producir la muerte. En consecuencia, las alergias con altos riesgos de anafilaxia, tal como la alergia a los cacahuetes, no pueden ser tratadas por via subcutanea.

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La inmunoterapia sublingual fue aceptada por la OMS como una alternativa valida a la via subcutanea y se debe utilizar en todos los pacientes que requieran inmunoterapia y no toleren la via subcutanea de administracion de alergenos. Sin embargo, la dosis de alergeno requerida para la inmunoterapia sublingual es mayor que para la inmunoterapia subcutanea y este metodo algunas veces induce algunos efectos adversos locales, tales como prurito oral, irritacion de garganta, hinchazon de la lengua o garganta.

La inmunoterapia intra-nasal es otra alternativa a la via subcutanea que ha demostrado ser eficaz para la rinitis estacional y el tratamiento del asma (Hufnagl et al., 2008). Sin embargo, esta via no es generalmente bien tolerada por los pacientes y la mayona de ellos interrumpe prematuramente su tratamiento (Pajno et al., 2005).

En consecuencia, existe la necesidad de un metodo de inmunoterapia para el tratamiento de la alergia a los cacahuetes que sea seguro, eficaz y bien tolerado por los pacientes.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona un nuevo metodo de inmunoterapia para alergias a los cacahuetes. Mas espedficamente, la invencion muestra, por primera vez, que la inmunoterapia eficaz para alergias a los cacahuetes se puede lograr por via epicutanea.

La presente invencion proporciona un nuevo metodo inmunoterapeutico para aumentar en un sujeto la tolerancia a los cacahuetes, que comprende administrar repetidamente a dicho sujeto una o mas protemas derivadas del cacahuete por via epicutanea por medio de un dispositivo de parche para la piel que comprende un soporte, estando adaptada la periferia de dicho soporte para crear con la piel una camara hermeticamente cerrada, en donde el soporte lleva dentro de la camara sobre el lado que va a estar en contacto con la piel dichas una o mas protemas en una dosis suficiente para inducir una reaccion inmunologica en dicho sujeto despues de la aplicacion del dispositivo de parche a la piel, separandose dichas una o mas protemas del soporte despues de la aplicacion del dispositivo de parche a la piel y a partir de ese momento suministrandose al sujeto por via epicutanea, conduciendo dicha administracion, por repeticion, a un aumento progresivo en el sujeto de la tolerancia a los cacahuetes.

En un segundo aspecto, la presente invencion se refiere a un dispositivo de parche para la piel que comprende un soporte, estando adaptada la periferia de dicho soporte para crear con la piel una camara hermeticamente cerrada, en donde el soporte lleva dentro de la camara sobre el lado que va a estar en contacto con la piel una o mas protemas procedentes de cacahuetes en una dosis suficiente para inducir una reaccion inmunologica en dicho sujeto despues de la aplicacion del dispositivo de parche a la piel, separandose dichas una o mas protemas procedentes de cacahuetes del soporte despues de la aplicacion del dispositivo de parche a la piel y a partir de ese momento suministrandose al sujeto por via epicutanea.

En otro aspecto, la presente invencion tambien se refiere (al uso de) a un dispositivo de parche para la piel que comprende un soporte, estando adaptada la periferia de dicho soporte para crear con la piel una camara hermeticamente cerrada, en donde el soporte lleva dentro de la camara sobre el lado que va a estar en contacto con la piel una o mas protemas procedentes de cacahuetes en una dosis suficiente para inducir una reaccion inmunologica en un sujeto despues de la aplicacion del dispositivo de parche a la piel, separandose dichas una o mas protemas procedentes de cacahuetes del soporte despues de la aplicacion del dispositivo de parche a la piel y a partir de ese momento suministrandose al sujeto por via epicutanea, (en la fabricacion de una composicion) para aumentar en un sujeto la tolerancia a los cacahuetes.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere tambien a un kit de parches que comprende una pluralidad de dispositivos de parche para la piel, comprendiendo cada uno de dichos dispositivos un soporte, estando adaptada la periferia de dicho soporte para crear con la piel una camara hermeticamente cerrada, en donde el soporte lleva dentro de la camara sobre el lado que va a estar en contacto con la piel una o mas protemas procedentes de cacahuetes en una dosis suficiente para inducir una reaccion inmunologica en dicho sujeto despues de la aplicacion del dispositivo de parche a la piel, separandose dichas una o mas protemas procedentes de cacahuetes del soporte despues de la aplicacion del dispositivo de parche a la piel y a partir de ese momento suministrandose al sujeto por via epicutanea. Los diferentes parches del kit pueden contener la misma o una cantidad diferente de alergeno de cacahuete haciendo por lo tanto posible mantener o aumentar/disminuir las dosis de alergenos en el transcurso del metodo inmunoterapeutico de la invencion.

La invencion se puede usar en cualquier sujeto, en particular cualquier sujeto humano, incluyendo ninos y adultos. Preferiblemente, el sujeto es alergico a los cacahuetes.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es un grafico que muestra niveles espedficos de IgE, IgG1, IgG2a en suero de raton al final de la sensibilizacion (dfa 43).

La Figura 2 es un grafico que muestra citoquinas segregadas por esplenocitos reactivados de ratones sensibilizados por extracto de protema de cacahuete (abreviadamente PPE, por las siglas en ingles de Peanut Protein Extract) por

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via oral. Se aislaron celulas del bazo de ratones BALB/c sensibilizados por via oral y se reactivaron ex vivo con PPE durante 60 horas. Se cuantificaron las citoquinas en el lfquido sobrenadante por un inmunoensayo enzimatico (EIA).

La Figura 3 es un grafico que muestra niveles de histamina en muestras de plasma obtenidas de ratones sensibilizados y de control despues de inoculacion por via oral. La histamina se ensayo por EIA competitivo.

La Figura 4 es un grafico que muestra las respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) medidas 24 horas despues de una sola inoculacion de protemas de cacahuetes en la almohadilla plantar y expresadas como incremento medio del hinchazon de la almohadilla plantar (SEM). Inicial: medida de la almohadilla plantar antes de la inyeccion de PPE o PBS. Se inyecto PBS en la almohadilla plantar derecha y PPE en la otra almohadilla. La hinchazon de cada almohadilla plantar se midio 24 horas despues de la inyeccion.

La Figura 5 muestra el patron electroforetico (en condiciones desnaturalizantes y reductoras) de la formulacion del PPE.

La Figura 6 muestra un grafico que representa la concentracion de la IgE espedfica en ratones de control y ratones sensibilizados insensibilizados por via epicutanea (VE) o no tratados (NT). Los resultados se expresan como la media en |jg.mL-1 +/- DT.

La Figura 7 muestra un grafico que representa la concentracion de la IgG2a espedfica en ratones de control y ratones sensibilizados insensibilizados por via epicutanea (VE) o no tratados (NT). Los resultados se expresan como la media en pg.mL-1 +/- DT.

La Figura 8 muestra un grafico que representa la relacion IgG1/IgG2a para el grupo de ratones de insensibilizacion (VE), no tratados (NT) y de control (C). Los resultados se muestran despues de 8 semanas y 16 semanas de insensibilizacion.

La Figura 9 muestra un grafico que representa la concentracion de histamina en muestras de plasma despues de inoculacion por via oral de ratones de control y ratones sensibilizados insensibilizados por via epicutanea (VE) o no tratados (NT). Los resultados se expresan como la media en nM +/- DT. * p <0,05, ** p <0,001, *** p <0,001.

La Figura 10 muestra un grafico que representa la concentracion de la IgA espedfica de cacahuetes en muestras de suero en ratones tratados (VE) con una formulacion del PPE o no tratados (NT) y de control. Los resultados en ratones sensibilizados (S0) y despues de 8 (S8) y 16 semanas (S16) de insensibilizacion se expresan en densidad optica (DO) a 450 nm. * p <0,05, ** p <0,001, *** p <0,001.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo inmunoterapeutico para aumentar en un sujeto la tolerancia a los cacahuetes usando la administracion epicutanea. Este metodo es particularmente seguro para el paciente teniendo en cuenta que no se ha demostrado que los alergenos atraviesen la piel y se incorporen al torrente sangumeo. Este metodo podna evitar asf a pacientes alergicos graves el riesgo importante de reacciones sistemicas o anafilacticas durante el protocolo de inmunoterapia. Ademas, los resultados obtenidos por los autores de la presente invencion muestran que la insensibilizacion a los cacahuetes por via epicutanea de acuerdo con la presente invencion es al menos tan eficaz como la insensibilizacion usando otras vfas de administracion, en particular la via intradermica.

En particular, la presente invencion muestra que una reaccion inmunologica espedfica provocada por la aplicacion a la piel de alergenos de cacahuete de acuerdo con esta invencion induce una modificacion del sistema inmunitario del sujeto y conduce en el sujeto a un aumento progresivo de la tolerancia a los cacahuetes.

El metodo inmunoterapeutico de la invencion implica la administracion de una composicion de alergenos de cacahuete a un sujeto por via epicutanea usando dispositivos particulares de parche, lo que conduce a la tolerancia.

Como se utiliza en esta memoria, el termino "via epicutanea" significa la administracion de un alergeno a un sujeto por aplicacion de este alergeno a la piel. La via epicutanea no requiere el uso de aguja, jeringa o de cualquier otro medio que perfore o altere la integridad de la capa superficial de la epidermis. El alergeno se mantiene en contacto con la piel durante un penodo de tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el alergeno penetre en el estrato corneo de la epidermis. Esta difusion induce la migracion y la activacion de las celulas de Langerhans promoviendo asf una reaccion inmunologica.

El termino "tolerancia" se define en la presente memoria como una reduccion de la reactividad inmunologica de un sujeto hacia alergenos espedficos, en la presente memoria alergenos de cacahuete.

Como se utiliza en esta memoria, el termino "cacahuete" significa una especie en la familia de las leguminosas Fabaceae, por ejemplo Arachis. Los cacahuetes tambien son conocidos en ingles como earthnuts, goobers, goober peas, pindas, jack nuts, pinders, manila nuts y monkey nuts.

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Como se utiliza en la presente memoria, el termino "alergeno de cacahuete" se refiere a cualquier protema o peptido procedente del cacahuete que es capaz de provocar una reaccion alergica. Este alergeno se puede seleccionar de alergenos naturales u originarios, alergenos naturales modificados, alergenos sinteticos, alergenos recombinantes, alergoides y sus mezclas o combinaciones. Preferiblemente, los alergenos seleccionados son capaces de producir una hipersensibilidad de tipo inmediato mediada por IgE. Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protema" se utilizan indistintamente en esta memoria para referirse a un polfmero de residuos de aminoacidos. Los terminos se aplican a polfmeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos de aminoacido son un residuo modificado, o un residuo de origen no natural, tal como un compuesto mimetico qmmico artificial de un aminoacido de origen natural correspondiente, asf como a polfmeros de aminoacidos de origen natural.

En la presente memoria, el termino "protema procedente de cacahuete" se refiere a cualquier protema que se puede obtener del cacahuete o que comprende una porcion o una secuencia de una protema obtenible del cacahuete. En una realizacion particular, la protema se selecciona de protemas de almacenamiento de semillas. Preferiblemente, la protema se selecciona de Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8 y Ara h 9 de Arachis hypogaea. En una realizacion mas preferida, la protema procedente de cacahuete comprende al menos Ara h 1, Ara h 2 o Ara h 3 o sus isoformas. Las secuencias de aminoacidos de Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3 son conocidas por los expertos en la tecnica. Como ilustracion, los numeros de acceso al Genbank de la protema Ara h 1, dos isoformas de Ara h 2 y dos isoformas de Ara h 3 son, respectivamente, AAL27476, AAM78596, AAN77576, AAT39430 y AAC63045. Estas protemas se pueden obtener a partir de un extracto de cacahuete o ser producidas por un organismo recombinante, tal como bacterias modificadas geneticamente, levaduras o por cualesquiera otros metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Estas protemas se pueden utilizar en combinacion o por separado. Se debe entender que el termino "protema procedente de cacahuete" tambien incluye fragmentos o variantes de los antfgenos anteriores, tales como fragmentos que contienen epttopos o protemas obtenidas del cacahuete y, posteriormente modificadas enzimatica, qmmica, mecanica o termicamente.

En una realizacion particular, la composicion de alergenos de cacahuete comprende una o mas protemas procedentes de cacahuete.

En otra realizacion, la composicion de alergenos de cacahuete comprende una o mas protemas procedentes de cacahuete seleccionadas de Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3, opcionalmente en combinacion con otras protemas procedentes de cacahuete.

En otra realizacion, la composicion de alergenos de cacahuete comprende un extracto de cacahuete como fuente de protemas procedentes de cacahuete.

Un extracto de cacahuete designa cualquier preparacion (lisado, filtrado, homogeneizado, etc....) obtenida de cacahuete. El extracto de cacahuete se puede utilizar directamente o los alergenos de cacahuete se pueden purificar al menos parcialmente a partir de este extracto. Este proceso de purificacion puede implicar filtracion, centrifugacion, precipitacion o cualesquiera otros metodos conocidas por los expertos en la tecnica. Preferentemente, las protemas procedentes de cacahuete y administradas al sujeto estan al menos parcialmente purificadas.

En una realizacion, la composicion de alergenos de cacahuete esta en forma lfquida, tal como una solucion o una dispersion de partmulas. En ese caso, la administracion epicutanea eficaz esta garantizada por migracion del alergeno desde la fase lfquida de la composicion de alergenos hasta la piel con el fin de permitir que el alergeno penetre en el estrato corneo de la epidermis. En una realizacion particular, la migracion del alergeno de la fase ifquida de la composicion de alergenos esta garantizada por difusion del alergeno a traves de la condensacion formada dentro de la camara hermeticamente cerrada, por ejemplo, como resultado de la transpiracion.

En otra realizacion, la composicion de alergenos de cacahuete esta en forma seca, en particular en forma de partmulas, obtenidas, por ejemplo, por liofilizacion. La presente invencion muestra en realidad que una tolerancia eficaz a los cacahuetes se puede lograr utilizando una preparacion de alergenos de cacahuete en forma solida (por ejemplo, seca). Es ventajoso el uso de protemas en forma de partmulas. De hecho, dichos alergenos en partmulas pueden estar unidos directamente al soporte del dispositivo, evitando con ello cualquier interaccion qmmica o cualquier reaccion que pueda alterar la inmunogenicidad de estas protemas. Ademas, el uso de las partmulas permite conservar la sustancia en un envase adecuado, de manera que ya no sea necesario realizar una preparacion extemporanea. En este caso, la administracion epicutanea de alergenos de cacahuete mantenidos en el soporte del parche se puede garantizar por disolucion de estos alergenos en la condensacion formada dentro de la camara hermeticamente cerrada.

En cada realizacion, la condensacion presente dentro de la camara hermeticamente cerrada puede provenir de la transpiracion condensada segregada por la piel.

Como se utiliza en la presente memoria, el termino "transpiracion" o "sudoracion" significa la produccion de un fluido que es segregado por las glandulas sudonparas de la piel de los mamfferos. Este fluido contiene principalmente agua, pero tambien diversos minerales y oligoelementos disueltos. En la presente invencion, la transpiracion segregada por la piel se evapora y se condensa dentro de la camara hermeticamente cerrada.

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El termino "condensacion" se refiere, en esta memoria descriptiva, al cambio del estado ffsico de la materia desde la fase gaseosa a la fase lfquida, particularmente el cambio de la transpiracion evaporada a una fase lfquida. La condensacion formada por la transpiracion dentro de la camara despues de la aplicacion del dispositivo de parche a la piel provoca o aumenta la retirada y suministro epicutaneo de los alergenos. De hecho, los alergenos se pueden disolver en el agua contenida en la transpiracion condensada y a partir de ah ser suministrados al sujeto por via epicutanea.

La composicion de alergenos puede comprender ademas componentes adicionales, tales como adyuvantes.

En una realizacion, la composicion de alergeno de cacahuete usada en la presente invencion se formula sin ningun adyuvante. La invencion muestra en realidad que la inmunoterapia de cacahuetes se puede realizar por via epicutanea sin necesidad de adyuvante adicional.

En otra realizacion, la composicion de alergenos de cacahuete usada en la presente invencion comprende o se aplica con un adyuvante. En el contexto de esta invencion, un adyuvante designa cualquier sustancia que actue para activar, acelerar, prolongar o potenciar las respuestas inmunitarias espedficas de antfgenos cuando se utiliza en combinacion con un antfgeno espedfico. Los compuestos adyuvantes que se pueden utilizar en combinacion con alergenos de cacahuete incluyen sales minerales, tales como fosfato de calcio, fosfato de aluminio e hidroxido de aluminio; DNA o RNA inmunoestimulador, tales como oligonucleotidos CpG; protemas, tales como anticuerpos o protemas que se unen a receptores de tipo Toll; saponinas, por ejemplo, QS2l; citoquinas; derivados de muramil dipeptidos; LPS; MPL y derivados que incluyen 3D-MPL; GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos); imiquimod; partmulas coloidales; adyuvante completo o incompleto de Freund; adyuvante de Ribi o toxina bacteriana, por ejemplo, toxina o enterotoxina (TL) del colera. En una realizacion particular, la composicion de alergenos de cacahuete se formula con enterotoxina.

El dispositivo de parche para la piel usado en el metodo de la invencion comprende un soporte, estando adaptada la periferia de dicho soporte para crear con la piel una camara hermeticamente cerrada. Este soporte lleva dentro de la camara sobre el lado que va a estar en contacto con la piel la composicion de alergenos de cacahuete utilizada para inducir una reaccion inmunitaria.

El termino "camara hermeticamente cerrada" tal como se utiliza en la presente memoria, significa que el soporte del parche es impermeable a la humedad y que la periferia de este soporte constituye una barrera oclusiva definiendo de este modo un espacio cerrado. Se requiere que la impermeabilidad a la humedad de esta camara permita que los alergenos sean retirados del soporte, por ejemplo, por disolucion o extraccion, debido al efecto de humedad dentro de dicha camara y siendo posteriormente suministrados al sujeto. La eficacia del parche esta condicionada en gran medida por la creacion de esta fase lfquida, en la que el alergeno esta en solucion o en suspension, promoviendo asf su paso a traves de los poros.

El termino "humedad" como se utiliza en la presente memoria, significa la presencia de agua u otro lfquido, ya sea en fase lfquida o de vapor.

Preferiblemente, la periferia del soporte tiene propiedades adhesivas y forma una junta hermetica para crear con la piel una camara hermeticamente cerrada.

En una realizacion particular, los alergenos de cacahuete se mantienen sobre el soporte por medio de fuerzas electrostaticas y/o de Van der Waals. Esta realizacion es particularmente adecuada cuando los alergenos de cacahuete estan en forma solida (por ejemplo, partmulas), aunque tambien se puede utilizar, indirectamente, cuando los alergenos estan en forma lfquida.

En el contexto de la presente invencion, el termino "fuerza electrostatica" designa generalmente cualquier fuerza no covalente que implique cargas electricas. El termino fuerzas de Van der Waals designa fuerzas no covalentes creadas entre la superficie del soporte y el alergeno solido y pueden ser de tres tipos: fuerzas entre dipolos permanentes, fuerzas entre dipolos inducidas y fuerzas de London-Van der Waals. Las fuerzas electrostaticas y las fuerzas de Van der Waals pueden actuar por separado o juntas.

A este respecto, en una realizacion preferida, el dispositivo de parche comprende un soporte electrostatico. Como se utiliza en la presente memoria, la expresion "soporte electrostatico" indica cualquier soporte hecho de un material capaz de acumular cargas electrostaticas y/o generar fuerzas de Van der Waals, por ejemplo, por frotamiento, calentamiento o ionizacion, y de conservar dichas cargas. El soporte electrostatico incluye tfpicamente una superficie con cargas espaciales, que pueden estar dispersadas uniformemente o no. Las cargas que aparecen sobre un lado u otro de la superficie del soporte pueden ser positivas o negativas, dependiendo del material que constituye dicho soporte y del metodo utilizado para crear las cargas. En todos los casos, las cargas positivas o negativas distribuidas sobre la superficie del soporte producen fuerzas de atraccion sobre los materiales conductores o no conductores, permitiendo de este modo mantener el alergeno. Las partmulas tambien pueden estar ionizadas, produciendo de este modo el mismo tipo de fuerzas electrostaticas de atraccion entre las partmulas y el soporte.

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Ejemplos de materiales adecuados para proporcionar soportes electrostaticos son vidrio o un poUmero elegido del grupo que comprende plasticos de celulosa (CA, CP), polietileno (PE), poli(tereftalato de etileno) (PET), poli(cloruros de vinilo) (PVC), polipropilenos, poliestirenos, policarbonatos, poliacnlicos, en particular poli(metacrilato de metilo) (PMMA) y fluoropolfmeros (por ejemplo, PTFE). La lista anterior no es de ningun modo limitativa.

La parte posterior del soporte puede estar cubierta con una etiqueta que puede ser retirada justo antes de la aplicacion. Esta etiqueta hace que sea posible, por ejemplo, almacenar el alergeno de cacahuete en la oscuridad cuando el soporte es al menos parcialmente translucido.

La intensidad de la fuerza entre una superficie y una partfcula se puede aumentar o disminuir por la presencia de una pelfcula delgada de agua debido a la presencia de humedad. Generalmente, el parche se fabrica y se mantiene en un lugar seco. La humedad debe ser suficientemente baja para permitir que se conserve el ingrediente activo. El mdice de humedad se puede regular con el fin de obtener las maximas fuerzas de adhesion.

Como se ha expuesto anteriormente, el uso de un soporte electrostatico es particularmente ventajoso cuando el alergeno esta en forma seca, por ejemplo, en forma de partfculas. Ademas, el tamano de partfculas puede ser ajustado por el experto en la tecnica para mejorar la eficacia de las fuerzas electrostaticas y/o de Van der Waals, para mantener las partfculas sobre el soporte. Preferiblemente, el tamano de las partfculas esta en el intervalo de 1 a 60 micrometros.

En una realizacion espedfica, el parche comprende un soporte de polfmero o metal o de polfmero recubierto de metal y las partfculas de alergenos de cacahuete se mantienen sobre el soporte esencialmente por medio de fuerzas de Van der Waals. Preferiblemente, para mantener las partfculas sobre el soporte por fuerzas de Van der Waals, el tamano medio de las partfculas es inferior a 60 micrometros.

En otra realizacion, los alergenos de cacahuete se mantienen sobre el soporte por medio de un recubrimiento adhesivo sobre el soporte. El soporte puede estar completamente cubierto con un material adhesivo o solo parcialmente. Se pueden utilizar diferentes soportes oclusivos, tales como pelfculas de polietileno o PET recubiertas con aluminio, o espumas de PE, PVC o PET con una capa adhesiva (acnlica, de silicona, etc.).

La composicion de alergenos de cacahuete en forma de partfculas se puede cargar sobre el soporte por medio de un proceso de secado por pulverizacion, tal como un proceso de electropulverizacion como se ha descrito en la solicitud de patente francesa n° 08 50406. Un dispositivo de electropulverizacion usa alto voltaje para dispersar un lfquido en el aerosol fino. Los alergenos disueltos en un disolvente se pulverizan entonces sobre el soporte del parche donde se evapora el disolvente, dejando los alergenos en forma de partfculas. El disolvente puede ser, por ejemplo, agua o etanol, de acuerdo con el tiempo de evaporacion deseado. Otros disolventes pueden ser elegidos por los expertos en la tecnica. Este tipo de proceso para aplicar sustancias sobre el soporte del parche permite partfculas de tamano nanometrico y del mismo tamano con un reparto de partfculas regular y uniforme sobre el soporte. Esta tecnica se adapta a cualquier tipo de parche, tal como parche con soporte que comprende polfmero aislante, polfmero dopado o polfmero recubierto con una capa conductora. Preferiblemente, el soporte comprende un material conductor.

En otra realizacion, la periferia del soporte esta cubierta con un polfmero hidrofilo seco, capaz de formar una pelfcula adhesiva de hidrogel por contacto con la piel humedecida (como se describe en la solicitud de patente francesa n° 07 57970). En esta realizacion, la piel tiene que ser humedecida antes de la aplicacion del parche. Cuando el hidrogel entra en contacto con la piel humedecida, las partfculas de polfmero absorben el lfquido y se vuelven adhesivas, creando de este modo una camara hermeticamente cerrada cuando se aplica el parche a la piel. Ejemplos de dichos hidrogeles incluyen polivinilpirrolidona, poliacrilato de Na, copolfmero de metilvinileter y anhudrido maleico.

En otra realizacion particular, la composicion lfquida de alergenos de cacahuete se mantiene sobre el soporte del parche en un deposito de material absorbente. La composicion puede consistir en una solucion de alergenos o en una dispersion de los alergenos, por ejemplo, en glicerina. El material adsorbente puede estar hecho, por ejemplo, de acetato de celulosa.

El soporte puede ser ngido o flexible, puede o no puede ser hidrofilo y puede o no puede ser translucido, dependiendo del material constituyente. En el caso de vidrio, el soporte puede fabricarse resistente a la rotura uniendo una lamina de plastico al vidrio.

En una realizacion, el soporte del parche contiene una zona transparente que permite observar y controlar directamente la reaccion inflamatoria, sin necesidad de tener que retirar el parche. Materiales transparentes adecuados incluyen pelfcula de polietileno, pelfcula de poliester [(poli(tereftalato de etileno)], policarbonato y cada pelfcula o material biocompatible transparente o translucido.

En una realizacion particular, la porcion del soporte que lleva el alergeno no esta en contacto directo con la piel. En esta realizacion, la altura de la camara definida por el soporte, la periferia del soporte y la piel esta en el intervalo de 0,1 mm a 1 mm.

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El metodo de la invencion implica tipicamente la administracion repetida al sujeto de uno o mas alergenos de cacahuete como se ha descrito anteriormente, dando lugar en el sujeto a un aumento progresivo de la tolerancia.

La dosis espedfica de alergenos, asf como el numero de aplicaciones y la duracion del contacto pueden ser adaptadas por el experto en la tecnica, dependiendo del sujeto, la naturaleza de la preparacion de alergenos, el tipo de dispositivo de parche usado, etc.

Generalmente, el metodo comprende la aplicacion de al menos dos dispositivos de parche como se ha descrito anteriormente, preferiblemente al menos 3, 5, 10 o 15, durante un penodo de tiempo comprendido entre una semana y anos. El tratamiento se puede detener en cualquier momento, por ejemplo, una vez que se ha establecido una tolerancia eficaz.

En una realizacion, el metodo de la invencion implica la aplicacion repetida de 1 a 4 parches al dfa, al menos una vez a la semana, durante un penodo de 1 mes a varios anos. En una realizacion preferida, el metodo de la invencion implica la aplicacion de 1 parche al dfa, cada dfa, o al menos una vez a la semana, durante un penodo de 1 mes a varios anos. La duracion del contacto del parche con la piel para cada aplicacion esta en el intervalo de 1 a 24 horas, preferiblemente alrededor de 8 horas.

La cantidad de alergenos de cacahuete en cada parche esta tipicamente en el intervalo de 0,1 a 1000 pg/cm2 de superficie de parche, preferiblemente en el intervalo de 20 a 500 pg/cm2 de superficie de parche, mas preferiblemente en el intervalo de 20 a 200 pg/cm2 de superficie de parche. La superficie de parche esta en el intervalo de 1 cm2 a 10 cm2, preferiblemente en el intervalo de 1 cm2 a 5 cm2.

Para su aplicacion, los dispositivos de parche se pueden aplicar directamente a la piel, sin ningun tratamiento previo, preferiblemente sobre una parte sin pelo del cuerpo. Alternativamente, la piel se puede tratar antes de la aplicacion del dispositivo, para alterar el estrato corneo, para eliminar los pelos o simplemente para producir la hidratacion de la piel, en el sitio de contacto con el dispositivo de parche. Para aumentar eficazmente la tolerancia del sujeto a los cacahuetes, se administran preferiblemente alergenos de cacahuete en una dosis suficiente para inducir en el sujeto una reaccion inmunologica.

Esta reaccion inmunologica puede implicar una reaccion inflamatoria que conduce a una cascada de episodios bioqmmicos que afectan al sistema vascular local y al sistema inmunitario. La reaccion inflamatoria es bien moderada en forma de eritema (primer elemento clmico de la reaccion inflamatoria) o en forma de una papula que indica tambien la presencia de un edema local (otro componente de la reaccion inflamatoria). La reaccion inflamatoria inducida por la aplicacion de alergenos de cacahuete por via epicutanea puede ser visible o no visible a simple vista.

Como se describe en el apartado experimental, el metodo de la invencion da como resultado una reduccion de los niveles de la IgE espedfica y un aumento de algunos niveles de la IgG espedfica, en particular de los niveles de la IgG4, lo que conduce a un aumento progresivo de la tolerancia a los cacahuetes. El termino "Ig espedfica" se refiere en la presente memoria a inmunoglobulinas que son espedficas de al menos un alergeno al que es alergico el sujeto. En una realizacion preferida, estas inmunoglobulinas son espedficas de al menos una protema procedente del cacahuete, especialmente Ara h 1, Ara h 2 o Ara h 3 o sus isoformas.

El metodo de la invencion conduce tambien a una desviacion inmunitaria desde un perfil Th2 dominante hasta un perfil Th1/Th2 mas equilibrado. En otras palabras, el metodo de la invencion provoca un aumento de una respuesta Th1 a las protemas administradas. Los linfocitos Th1 y Th2 son dos tipos de linfocitos T cooperador CD4+ que difieren en su patron de produccion de citoquinas. Los linfocitos Th1 producen IFN-y, IL-2 y TNF-p y estan implicados en respuestas inmunitarias mediadas por celulas que son beneficiosas en la defensa del hospedante contra los patogenos intracelulares y celulas malignas, pero perjudiciales en la mediacion de la autoinmunidad. Los linfocitos Th2 segregan IL-4, IL-5, lL-9, IL-10 e IL-13, lo que aumenta las respuestas de anticuerpos, incluyendo la produccion de IgE, y protegen contra las infestaciones parasitarias pero tambien pueden producir alergia y asma. Las respuestas Th1 y Th2 son mutuamente antagonicas, de tal manera que existen normalmente en equilibrio y se regulan entre sf En un sujeto alergico, se altera el equilibrio Th1/Th2 y es predominante el perfil Th2. Una desviacion inmunitaria desde el perfil Th2 dominante hasta un perfil Th1/Th2 mas equilibrado significa una desviacion de un estado alergico a un estado de tolerancia. Esta desviacion, mediada por un aumento de linfocitos Treg, puede ser evaluada por cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica, tal como una disminucion de la relacion IgG1/IgG4 o el analisis de la produccion de citoquinas.

En una realizacion preferida, el metodo de la invencion esta libre de efectos sistemicos. Probablemente se observara una reaccion inflamatoria en la piel del sujeto solo en el sitio de la administracion epicutanea o en la periferia inmediata de este sitio. Esta reaccion inflamatoria puede ser modulada por la dosis de alergeno extendida sobre el soporte.

La presente invencion proporciona tambien un dispositivo de parche para la piel, como se ha descrito anteriormente, que comprende un soporte, estando adaptada la periferia de dicho soporte para crear con la piel una camara hermeticamente cerrada, en donde el soporte lleva dentro de la camara sobre el lado que va a estar en contacto con

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la piel uno o mas alergenos de cacahuete, como se ha descrito en la presente memoria, en una dosis suficiente para inducir una reaccion inmunologica en la piel de dicho sujeto despues de la aplicacion del dispositivo de parche a la piel, separandose dichos uno o mas alergenos del soporte despues de la aplicacion a la piel del dispositivo de parche y a partir de ese momento suministrandose al sujeto por via epicutanea.

La presente invencion se refiere tambien al uso de un dispositivo de parche para la piel como se ha descrito anteriormente, en la fabricacion de una composicion para aumentar la tolerancia a los cacahuetes en un sujeto alergico a los cacahuetes.

La presente invencion se refiere tambien al uso de un dispositivo de parche para la piel como se ha descrito anteriormente, en la fabricacion de una composicion para aumentar una respuesta inmunitaria de tipo Th1 a los cacahuetes en un sujeto alergico a los cacahuetes.

La presente invencion se refiere tambien a un kit de parches que comprende una pluralidad de parches como se ha descrito anteriormente, conteniendo los parches del kit la misma o una cantidad diferente de alergenos de cacahuete. Ademas, la composicion de alergenos utilizada en los parches del kit puede ser la misma o diferente. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes protemas de cacahuete, con o sin adyuvante. Preferiblemente, la misma composicion se utiliza en el transcurso del tratamiento de insensibilizacion.

Los siguientes ejemplos se dan con fines de ilustracion y de ningun modo de limitacion.

Ejemplos

Metodos

Animales y extractos de protemas

Ratones BALB/c hembras de cuatro semanas, comprados a Charles River Laboratories (Francia), se sensibilizaron a protemas de cacahuete. El uso de ratones BALB/c como modelo de murido de sensibilizacion a protemas de cacahuete ha sido descrito en Adel-Patient et al., 2005. Este modelo debe reproducir la especificidad fina de IgE y los smtomas que se observan en los seres humanos por su inoculacion. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las normas de la Comunidad Europea sobe el cuidado de los animales.

Se preparo extracto de cacahuete mezclando polvo de cacahuete (Allergon, Suecia) con tampon de fosfato 20 mM, pH 7,4, que contema NaCl 1 M durante 4 horas a temperatura ambiente. Despues de centrifugacion, el lfquido sobrenadante se mantuvo como extracto de protemas de cacahuete (PPE). A continuacion, se dializo el PPE y se cuantifico el contenido de protemas por ensayo con acido bicinconmico (BCA) y se analizo por SDS-PAGE. Los niveles de endotoxinas eran inferiores a 0,06 ng/mL (kit de E-toxato, Sigma, Francia).

Protocolo de sensibilizacion

Ocho ratones BALB/c recibieron 1 mg del PPE homogeneizado mezclado con 10 |jg de toxina del colera (TC) los dfas 1, 6, 12, 18, 24, 30 por medio de alimentacion por sonda intragastrica. Se recogieron los sueros del plexo venoso retro-orbital los dfas 0, 18 y 43, se centrifugaron y las muestras se conservaron a -20°C hasta su posterior analisis. A ratones no tratados previamente se les extrajo sangre los mismos dfas (n = 8). Se controlo la sensibilizacion por parametros biologicos como se ha definido anteriormente.

Protocolo de insensibilizacion

La insensibilizacion se realizo una vez a la semana durante 8 y 16 semanas por via epicutanea (VE) como sigue:

Los ratones se anestesiaron intraperitonealmente con ketamina y xilacina y se afeitaron con una maquinilla electrica y crema depilatoria. Al dfa siguiente, se colocaron en los lomos de los ratones y se mantuvieron con un vendaje durante 48 horas, dispositivos de parche para la piel con un soporte que llevaba 100 jg de PPE en forma seca, estando adaptada la periferia de dicho soporte para crear con la piel del raton una camara hermeticamente cerrada.

Inoculacion de alergenos y cuantificacion de la liberacion de histamina

Los ratones se mantuvieron en ayunas durante una noche y se estimularon con alimentacion por sonda intragastrica con el PPE de 10 mg por raton dividido en 2 dosis a intervalos de 30 minutos. Los ratones no tratados previamente se inocularon de la misma manera. Para determinar los niveles de histamina en plasma, se recogio sangre 30 minutos despues de la segunda inoculacion por alimentacion por sonda intragastrica y se conservo a -20°C hasta su analisis. Los niveles de histamina se determinaron usando un kit de inmunoensayo enzimatico (SPI-BIO, Francia) como habia descrito por el fabricante.

Cuantificacion de IgE, IgG1, IgG2a especificas

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Se recogieron muestras de sangre del plexo venoso retro-orbital antes y durante la inmunoterapia y el plasma se conservo a -30°C hasta su posterior analisis.

Se utilizo un ELISA cuantitativo, validado usando las directrices de la ICH, para IgE, IgG1 e IgG2a espedficas. Expresado brevemente, se recubrieron placas de microtitulacion con PPE a una concentracion de 10 pg/mL. Se distribuyeron diluciones en serie de 100 pL de cada suero por pocillo y se incubaron durante 24 horas a 4°C. Se utilizo como trazador un anticuerpo anti-raton IgG1 o IgG2a marcado con fosfatasa alcalina (Serotec, Inglaterra). Como sustrato enzimatico se utilizo el reactivo (pNPP) (Sigma, Francia). Se cuantificaron las IgE, IgG1 e IgG2a espedficas por comparacion con las curvas de concentracion-respuesta obtenidas con un ensayo de las IgE, IgG1 o IgG2a totales realizado en condiciones identicas utilizando una fase solida recubierta con un anticuerpo anti-raton IgE, IgG o IgG2a (Serotec, Inglaterra) en lugar de protemas de cacahuete, que es complementario a los trazadores. Los patrones de inmunoglobulina de raton se obtuvieron de Serotec.

Ensayo de IgA

Se determinaron las IgA espedficas en muestras de suero. Se incubaron sueros (1/50) diluidos en tampon PBS que contema 0,1% de BSA en placas recubiertas con el PPE a 10 pg.mL-1. Las IgA espedficas se detectaron usando IgA anti-raton de cabra (Southern Biotechnology Associated, EE.UU.) marcada con fosfatasa alcalina y se detectaron como anteriormente. Los resultados se presentan como unidades de absorbancia a 405 nm.

Produccion de citoquinas

Despues de la ultima toma de muestras de sangre, los ratones se sacrificaron por dislocacion vertebral y se extrajeron los bazos en condiciones esteriles. Se realizo un cultivo celular en presencia del PPE (2,5-250 pg.mL-1), PBS (control negativo) o concanavalina A (1 pg.mL-1, control positivo). Se analizaron IL-4, IL-5, IL-10, IFNy y TGFp utilizando kits CytoSet™ (BioSource International Europe, Belgica) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH)

Para provocar una respuesta de DTH, los ratones fueron inoculados despues de la ultima inmunizacion oral por una inyeccion de 100 pg de protemas de cacahuete en PBS en la almohadilla plantar trasera. Se inyecto PBS en la otra almohadilla plantar. Se midio el hinchazon neto de ambas almohadillas plantares utilizando un microcalibrador 24 h despues de la inoculacion y se compararon entre sf.

Analisis estadistico

Para el analisis estadfstico se utilizo el programa informatico Graph Pad (San Diego, EE.UU.). Los datos se analizaron utilizando el analisis de varianza (ANOVA) y el ensayo de Dunnett para comparar los ratones tratados con los de control, o utilizando ANOVA y el ensayo de Tukey para comparar todos los grupos entre sf.

Resultados

Observaciones preliminares

La comprension del sistema inmunologico en ratones y en seres humanos y el estudio de sus similitudes y diferencias en mecanismos tales como las respuestas Th1 y Th2 aun estan en curso. Con el fin de evaluar el modelo que ha sido desarrollado como una prueba del concepto de inmunoterapia epicutanea, se proporcionan algunos elementos sobre los principales biomarcadores alergicos y su interpretacion en seres humanos y ratones, especialmente con relacion al equilibrio Th1/Th2.

Desgranulacion de mastocitos: en los seres humanos, la IgE es el unico isotipo de inmunoglobulina que desencadena directamente la desgranulacion de mastocitos y la posterior manifestacion de anafilaxia, mientras que en los ratones, la desgranulacion de mastocitos es desencadenada por IgG1 junto con IgE.

Produccion de anticuerpos IgG: en los seres humanos, la produccion de anticuerpos IgG, principalmente el subtipo IgG4, puede antagonizar y "bloquear" la cascada de inflamacion alergica resultante del reconocimiento de los antfgenos por IgE. En los ratones, los anticuerpos equivalentes no estan descritos y el cambio del perfil Th2 a Th1 consiste en el aumento del anticuerpo IgG2a.

En los seres humanos, la produccion de IgE e IgG4 es estimulada en los linfocitos Th2, mientras que la produccion de IgG1 e IgG3 es estimulada en los linfocitos Th1.

En los ratones, la produccion de IgE e IgG1 es estimulada en los linfocitos Th2, mientras que la produccion de IgG2a e IgG3 es estimulada en los linfocitos Th1.

En resumen, en el modelo de muridos, la eficacia de la inmunoterapia se evaluo esencialmente por el aumento de IgG2a espedfica.

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1. Validacion de la sensibilizacion

1.1 IgE, IgG1, IgG2a especificas durante la sensibilizacion

Se analizaron los anticuerpos espedficos para el PPE inducidos en ratones BALB/c despues de la administracion de PPE por sonda nasogastrica. La sensibilizacion a los cacahuetes en ratones se caracterizo por una produccion de IgE y IgG1 espedficas como se muestra en la figura 1. Tambien se produjo IgG2a pero en menor medida que la IgG1 espedfica. En ratones sin tratamiento previo no pudieron detectarse anticuerpos espedficos.

1.2 Citoquinas segregadas despues de reactivacion in vitro de esplenocitos

Esplenocitos de ratones sensibilizados con TC mas PPE segregaron altas cantidades de alergenos IL-4 e IL-5 espedficos y pequenas cantidades de IL-10, IFNy y TGFp (figura 2). No se encontraron citoquinas en los ratones de control. Estos resultados demostraron que la respuesta Th2 espedfica al PPE fue inducida en ratones BALB/c que recibieron protemas de cacahuete por medio de sonda nasogastrica.

1.3 Niveles de histamina despues de inoculacion oral

Debido a que el aumento de los niveles de histamina refleja la desgranulacion de mastocitos y es uno de los principales mediadores de la reaccion anafilactica, la histamina se analizo en plasma despues de la inoculacion oral. La histamina fue detectable solamente en muestras de plasma de ratones sensibilizados (figura 3).

1.4 Hipersensibilidad de tipo retardado (DTH)

Para completar los resultados previos que muestran la sensibilizacion de ratones a protemas de cacahuete, se investigo la respuesta de DTH. Se realizo la inoculacion en la almohadilla plantar al finalizar la sensibilizacion y se produjo una inflamacion solo en ratones sensibilizados (figura 4). No se encontro respuesta de DTH en la almohadilla plantar tratada con PBS.

2. Inmunoterapia para los cacahuetes

2.1 Formulacion para la inmunoterapia

El contenido de protemas de la formulacion utilizada para inmunoterapia se caracterizo por SDS-PAGE (figura 5).

2.2 IgE, IgG1, IgG2a especificas durante la inmunoterapia

IgE e IgG1: la sensibilizacion a los cacahuetes se caracterizo particularmente por una produccion de IgE e IgG1 especificas. Durante la inmunoterapia, se controlo la evolucion de anticuerpos espedficos. Como se muestra en la figura 6, se estabilizo la produccion de IgE espedfica durante 8 y 16 semanas de insensibilizacion. La disminucion de IgE espedfica es un proceso a largo plazo que se puede observar solo despues de algunos meses. Ademas, durante la inmunoterapia, no se observo ninguna modificacion de la IgG1 espedfica (datos no mostrados).

IgG2a: la IgG2a espedfica aumento significativamente en ratones tratados despues de 8 semanas y 16 semanas de insensibilizacion (figura 7).

Para confirmar la desviacion inmunitaria desde un perfil Th2 dominante hasta un perfil Th2/Th1 equilibrado, se evaluo la relacion IgG1/IgG2a para cada grupo: insensibilizacion por via epicutanea (VE), no tratado (NT) y de control (figura 8). La relacion IgG1/IgG2a disminuyo solo en el caso de los ratones tratados que mostraron una potenciacion del perfil Th1 con el fin de obtener un perfil Th2/Th1 mas equilibrado.

2.3 Histamina

La histamina es uno de los principales mediadores de la reaccion anafilactica. La histamina se analizo en muestras de plasma recogidas 30 minutos despues de inoculaciones orales como un marcador de la desgranulacion de los mastocitos. Despues de 16 semanas de insensibilizacion, se cuantifico la liberacion de histamina en los ratones de cada grupo (tratados o no) (figura 9). Los ratones tratados por via epicutanea con el PPE mostraron una liberacion significativamente menor de histamina. Este resultado confirma una mejora del estado alergico de los ratones.

2.4 IgA espedfica durante la inmunoterapia

La titulacion de la IgA espedfica se realizo en muestras de suero despues de 8 semanas de insensibilizacion (figura 10). La IgA espedfica aumento significativamente en ratones tratados por via epicutanea con el PPE despues de 8 semanas de insensibilizacion. No se observo ninguna modificacion en los ratones no tratados. La IgA espedfica no se detecto en los ratones de control.

Se describe que la IgA espedfica tiene una accion similar a la IgG4 durante la inmunoterapia. Su efecto inmunomodulador podna conducir a la produccion de IL-10 y a la expresion de TGFp (Francis et al., 2008).

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Conclusion

La via epicutanea muestra un modo potente y original de insensibilizacion en ratones sensibilizados a los cacahuetes.

La insensibilizacion epicutanea condujo a una desviacion inmunitaria desde un perfil Th2 dominante hasta un perfil Th2/Th1 reequilibrado y al aumento de la IgA espedfica. Como marcador de la alergenicidad (desgranulacion de los mastocitos), la liberacion de histamina se redujo en ratones tratados por via epicutanea.

Referencias

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Lauer et al., Allergy, Volume 63, s88, Abstracts of the XXVII EAACI Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology, Barcelona, Spain on 7-11 June 2008, Page 158-611

Pajno et al., J Allergy Clin Immunol. 2005 Dec, 116(6):1380-1

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Nelson et al., J Allergy Clin Immunol, 1997, 99:744-51

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Rabjohn et al., J Clin Invest, 1999, 103:535-42

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Skolnick et al., J Allergy Clin Immunol, 2001, 107(2):367-74

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REIVINDICACIONES

1. Una composicion de alergenos de cacahuete para uso en el aumento de la tolerancia a los cacahuetes en un sujeto alergico a los cacahuetes, en donde dicha composicion comprende una o mas protemas seleccionadas de Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3 o sus isoformas, sin adyuvante, y en donde dicha composicion se administra repetidamente a dicho sujeto por via epicutanea por medio de un dispositivo de parche para la piel que comprende un soporte, estando adaptada la periferia de dicho soporte para crear con la piel una camara hermeticamente cerrada, en donde el parche comprende dicha composicion en una dosis suficiente para inducir y controlar una reaccion inflamatoria sobre la piel de dicho sujeto despues de la aplicacion del dispositivo de parche a la piel, conduciendo dicha administracion, por repeticion, a un aumento progresivo en el sujeto de la tolerancia a los cacahuetes.
2. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha composicion comprende un extracto de cacahuete o protemas de cacahuete purificadas.
3. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dichas una o mas protemas estan en forma seca.
4. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde dicha una o mas protemas estan en forma de partmulas y unidas al soporte sin adhesivo, por medio de fuerzas electrostaticas y/o de Van der Waals.
5. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde dicha una o mas protemas estan en forma de partmulas y unidas al soporte por medio de un recubrimiento adhesivo sobre el soporte.
6. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichas una o mas protemas se cargan en el soporte por medio de un proceso de secado por pulverizacion.
7. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dichas una o mas protemas estan disueltas o dispersadas en un lfquido.
8. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde dichas una o mas protemas en forma lfquida se mantienen sobre el soporte en un deposito de material adsorbente.
9. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la periferia del soporte tiene propiedades adhesivas.
10. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la aplicacion del dispositivo de parche se repite al menos una vez a la semana, durante un penodo de 1 mes a varios anos.
11. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la duracion del contacto del parche con la piel para cada aplicacion esta comprendida entre 1-24 horas.
12. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el parche se aplica directamente a la piel, en una parte sin pelo del cuerpo, sin tratamiento previo de la piel.
13. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la aplicacion del parche provoca un aumento en los niveles de la IgG espedfica.
14. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con la reivindicacion 13, que provoca un aumento en los niveles de la IgG4 espedfica.
15. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la aplicacion del parche provoca el aumento de una respuesta Th1 a las protemas administradas.
16. La composicion de alergenos de cacahuete para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la aplicacion del parche provoca una desviacion inmunitaria desde un perfil Th2 dominante hasta un perfil Th1/Th2 mas equilibrado.