ES2604821T3

ES2604821T3 - Formulación y fabricación de liposomas

Info

Publication number: ES2604821T3
Application number: ES13729068.0T
Authority: ES
Inventors: Yoram Richter; Yehuda Zelig; Omar ELMALAK; Dror Eyal
Original assignee: Biorest Ltd
Current assignee: Biorest Ltd
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2017-03-09
Anticipated expiration: 2033-03-14
Also published as: ES2685581T3; AU2019201468B2; CN107753432A; ES2874305T3; IL251080A0; CN105188674B; WO2014140670A1; IL240823A; AU2016273962A1; JP2016512222A; EP3406240B1; CA2906273A1; CN105188674A; IL240823A0; CA2906273C; HK1212624A1; AU2019201468A1; JP6176548B2; AU2013382087B2; CN107753432B

Abstract

Liposoma que tiene un componente lipídico y que encapsula un agente terapéutico, que tiene una razón en masa de dicho agente terapéutico con respecto a lípidos de aproximadamente 1:5 a 1:8, en el que el componente lipídico comprende DSPC, DSPG y colesterol en una razón molar de aproximadamente 3:1:2, y dicho liposoma tiene una compresibilidad menor de 0,70 ml/g.

Description

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FORMULACION Y FABRICACION DE LIPOSOMAS DESCRIPCION

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a una formulacion de liposomas novedosa y a un procedimiento de fabricacion para la formulacion de liposomas

Antecedentes de la invencion

Se conoce bien en la tecnica que los liposomas funcionan como portadores para administrar agentes terapeuticos a celulas seleccionadas como diana para tratar una variedad de estados medicos. En una aplicacion, pueden formularse liposomas para encapsular un agente farmaceutico que puede fagocitarse selectivamente por macrofagos. Una vez fagocitado, el liposoma libera el agente intracelularmente, inhibiendo las funciones inflamatorias de los macrofagos, entre otros efectos.

La tecnica describe varios metodos para preparar tales liposomas (vease por ejemplo, Monkkonen, J. et al., 1994, J. Drug Target, 2:299-308; Monkkonen, J. et al., 1993, Calcif. Tissue Int., 53:139-145; Lasic DD., Liposomes Technology Inc., Elsevier, 1993, 63-105 (capffulo 3); Winterhalter M, Lasic DD, Chem Phys Lipids, 1993; 54(1-3):35- 43). En un metodo de este tipo, se forman liposomas para dar apilamientos de bicapas cristalinas ffquidas que se hidratan para dar laminas lipfdicas hidratadas, que se desprenden durante la agitacion y se cierran sobre sf mismas para formar vesfculas multilamelares (MLV) grandes, conocida como tecnica de hidratacion de peffcula lipfdica. Una vez que se forman estas parffculas, el tamano de la parffcula es dependiente del metodo usado en las siguientes etapas del procedimiento, por ejemplo, energfa sonica (sonicacion) o energfa mecanica (extrusion). La sonicacion normalmente produce vesfculas unilamelares pequenas (SUV) y requiere sonicadores de punta de sonda y/o bano. Alternativamente, la extrusion de ffquidos que fuerza una suspension de ffpidos a traves de una serie de filtros de policarbonato (normalmente membranas de 0,8, 0,4, 0,2 y 0,1 |im) a alta presion (hasta 500 psi), produce parffculas que tienen un diametro proximo al tamano de poro del filtro usado. Estos metodos estan limitados a producciones de lotes pequenos, usados principalmente para fines de investigacion. Ademas, las tecnicas de extrusion a alta presion se asocian con altos costes y tiempo de funcionamiento. Por tanto, sigue existiendo la necesidad en la tecnica de un metodo de produccion de liposomas util para la fabricacion a escala comercial que sea reproducible y que aborde cuestiones incluyendo calidad, control, estabilidad, escalabilidad y esterilizacion de la produccion de liposomas.

Ademas, las formulaciones liposomicas conocidas en la tecnica no son sustancialmente uniformes en tamano y forma, lo que es una caractenstica cntica de una composicion farmaceutica para proporcionar un producto esteril y evitar efectos secundarios potencialmente toxicos de liposomas grandes aberrantes. Actualmente, resulta diffcil fabricar una formulacion de liposomas que tenga un tamano uniforme. El procedimiento de extrusion de vesfculas multilamelares a traves de una serie de filtros incluyendo, por ejemplo, filtros de policarbonato de 100 nm, no produce de manera sistematica una formulacion que tenga una poblacion de liposomas sustancialmente uniforme que tengan un tamano de 100 nm. De hecho, dependiendo de las caractensticas ffsicas de los liposomas, tales como la compresibilidad y/o estabilidad, el diametro medio de vesfcula para las vesfculas extruidas puede variar considerablemente dependiendo del tipo y del tamano de los filtros usados Por tanto, existe la necesidad de un metodo de fabricacion que pueda producir liposomas sustancialmente uniformes en tamano y forma.

Ademas, muchas caractensticas ffsicas de la formulacion de liposomas afectan a la respuesta celular al liposoma y afectan a la eficacia del liposoma como composicion farmaceutica. Las caractensticas ffsicas de la formulacion de liposomas estan influidas en muchos aspectos por el procedimiento de fabricacion. Sin embargo, la tecnica no aborda como pueden controlarse las propiedades liposomicas en el procedimiento de formulacion para manipular la eficacia de fabricacion y la estabilidad del liposoma. Por tanto, existe la necesidad de un procedimiento de fabricacion a gran escala que sea rentable, que todavfa pueda controlar las caractensticas de la formulacion de liposomas para producir liposomas que sean sustancialmente uniformes y adecuados para el uso cffnico.

Sumario de la invencion

La presente invencion describe liposomas novedosos que encapsulan agentes terapeuticos. La invencion tambien se refiere a formulaciones liposomicas que tienen un alto grado de uniformidad de tamano lo que da como resultado minimizar los efectos secundarios y aumentar la confianza en los procedimientos de esterilizacion. La invencion tambien describe un procedimiento de fabricacion eficaz y rentable, para la produccion de liposomas en condiciones de extrusion a baja presion. Los liposomas formulados mediante este procedimiento tienen caractensticas deseables y propiedades terapeuticas eficaces.

La formulacion de liposomas se caracteriza por liposomas que tienen composicion y caractensticas ffsicas deseables. El liposoma comprende componentes lipfdicos que encapsulan un agente terapeutico. Segun un aspecto de la presente invencion, los componentes lipfdicos comprenden diastearoilfosfatidilcolina (DSPC), diastearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y colesterol, preferiblemente en una razon molar de 3:1:2 (DSPC:DSPG:col).

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El liposoma esta compuesto por un componente lip^dico y el agente terapeutico, que tienen una razon de la masa del agente terapeutico con respecto a la del componente lipfdico, denominada la razon farmacodpido, aproximadamente de 1:5 a 1:8 en peso, preferiblemente de 1:6 a 1:7. Esta razon farmacodpido potencia la estabilidad y la eficacia, y tambien afecta a la liberacion del farmaco y a la integridad del liposoma. Estas y otras caractensticas estructurales confieren beneficios inesperados a la presente formulacion.

Los liposomas de la presente invencion estan en el intervalo de tamano de 30-500 nm, preferiblemente, 70-120 nm, 100-300 nm, 100-180 nm y 70-150 nm, dependiendo del tipo de agente terapeutico y/o el portador usado. En una realizacion preferida, los liposomas pueden tener un tamano de 80+5 nm.

Otras caractensticas ffsicas de la composicion del liposoma tambien contribuyen significativamente a su estabilidad y eficacia. Por ejemplo, la conductividad del liposoma, que puede afectar a la captacion selectiva en celulas fagodticas. En una realizacion, la conductividad es de entre 13,5-17,5 ms/cm. De manera similar, la osmolalidad externa e interna de la formulacion afecta a la estabilidad y la eficacia. Preferiblemente, la osmolalidad externa se corresponde con la del cuerpo humano mientras que la osmolalidad interna es suficientemente baja como para potenciar la estabilidad de la formulacion. En una realizacion de la invencion, la osmolalidad interna es de entre 340440 osmol/kg. Otro parametro favorable es el pH del liposoma y/o la formulacion de liposomas. Por ejemplo, un pH interno de aproximadamente 6,9 para la formulacion liposomica tiene un efecto beneficioso sobre la estabilidad a largo plazo asf como sobre la tasa de fuga y la capacidad de encapsulacion de farmacos.

Los liposomas de la invencion son relativamente ngidos en comparacion con los de en la tecnica, ya que se caracterizan por tener membranas liposomicas que son menos compresibles. Los liposomas de la invencion tienen una compresibilidad menor de 0,7 ml/g. Debido a su gran rigidez, los liposomas de la presente invencion tienen estabilidad y vida util de almacenamiento mejoradas.

La formulacion de liposomas tambien tiene caractensticas novedosas y utiles. La formulacion de liposomas de la presente invencion se compone de liposomas que son sustancialmente uniformes en distribucion de tamano y forma, a la vez que son relativamente ngidos. La formulacion tiene poca variacion de tamano de un liposoma a otro. La uniformidad de los liposomas, medida mediante el mdice de polidispersidad (“PDI”), es menor de 0,075, preferiblemente esta en el intervalo de aproximadamente 0,02-0,05, lo que significa una composicion que tiene alta uniformidad. Por consiguiente, la formulacion de liposomas de la presente invencion reduce ventajosamente la incidencia de acontecimientos adversos asociados con los liposomas grandes y permite que se realice la filtracion esteril de manera eficaz.

Otro aspecto de la invencion es un procedimiento para fabricar una formulacion liposomica. El metodo de fabricacion incluye las etapas de (1) mezclar un agente terapeutico con lfpidos preseleccionados para formar vesfculas, (2) extruir las vesfculas en una unica fase a traves de un filtro de tamano unico, y (3) someter a ultrafiltracion. Tras la ultrafiltracion, el producto puede normalizarse opcionalmente a la concentracion final deseada. Puesto que la extrusion de la etapa 2 se realiza en una extrusion de una unica fase a baja presion, el presente metodo ahorra costes y tiempo de funcionamiento y aumenta el rendimiento con respecto a las extrusiones a alta presion que utilizan multiples fases. Estas etapas de fabricacion pueden adaptarse para la produccion a gran escala.

En una realizacion del procedimiento de fabricacion, la formulacion se prepara (1) mezclando un agente terapeutico con lfpidos que comprenden DSPC, DSPG y colesterol en una razon molar de aproximadamente 3:1:2 para formar vesfculas de manera que la razon en masa de dicho agente terapeutico con respecto a lfpidos esta en el intervalo de aproximadamente 1:5 a 1:8, (2) extruyendo las vesfculas en una unica fase a traves de un filtro que tiene un tamano de poro de aproximadamente 100 nm, y (3) sometiendo a ultrafiltracion.

Aun otro aspecto de esta invencion es una formulacion de liposomas obtenida segun las etapas de fabricacion anteriores. La formulacion comprende una pluralidad de liposomas, compuestos por una cantidad de componente lipfdico que encapsula un agente terapeutico. Por ejemplo, comprendiendo dicho componente lipfdico DSPC, DSPG y colesterol en una razon molar de aproximadamente 3:1:2, y la razon en masa de dicho agente terapeutico con respecto a componente lipfdico puede estar en el intervalo de aproximadamente 1:5 a 1:8. La formulacion se fabrica mediante las siguientes etapas: (1) mezclar un agente terapeutico con lfpidos preseleccionados para formar vesfculas, (2) extruir las vesfculas en una unica fase a traves de un filtro de tamano unico, y (3) someter a ultrafiltracion. Tras la ultrafiltracion, el producto puede normalizarse opcionalmente a la concentracion final deseada. De manera preferible, la formulacion obtenida segun este metodo tiene un PDI menor de 0,075, mas preferiblemente en el intervalo de entre 0,02 y 0,05. Este procedimiento produce una formulacion de liposomas que tiene caractensticas novedosas y utiles, incluyendo, por ejemplo, la razon de 3:1:2 del componente lipfdico, razon farmacodpido, PDI, rigidez, pH, osmolalidad y conductividad.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 es un diagrama de flujo del procedimiento de fabricacion de la formulacion liposomica de la presente invencion.

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La figura 2 representa un diagrama de flujo que resume el procedimiento de fabricacion de 1 litro de alendronate liposomico para infusion i.v. para una concentracion de dosificacion de 5 mg/ml, y sus parametros de control del procedimiento segun un aspecto de la invencion.

La figura 3 es una imagen de TEM del alendronato liposomico segun un aspecto de la invencion.

La figura 4 es un grafico que compara la compresibilidad espedfica de diversas formulaciones de liposomas.

La figura 5A es un grafico de la distribucion de tamano de la formulacion de liposomas de la invencion.

La figura 5B es un grafico de la distribucion de tamano de una formulacion de liposomas en la tecnica.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a una formulacion de liposomas novedosa y a un metodo de obtencion de la misma para su uso en el tratamiento de diversas enfermedades. La formulacion comprende una pluralidad de liposomas que encapsulan un agente terapeutico, o un “agente encapsulado.” Las caractensticas ffsicas de cada liposoma facilitan la estabilidad y la eficacia de la formulacion liposomica. La formulacion se caracteriza por liposomas que son sustancialmente uniformes en tamano y forma. Ademas, la invencion describe un procedimiento de fabricacion eficaz y rentable para la formulacion de liposomas, a la vez que cumple las necesidades de la produccion a gran escala. Ademas, la invencion se refiere a una formulacion que tiene propiedades novedosas y utiles producida mediante dicho procedimiento de fabricacion.

A. Componentes del liposoma

La presente invencion se refiere a formas novedosas y utiles de un liposoma. Pueden usarse diferentes componentes de liposoma para formar el liposoma de la invencion. Preferiblemente, el componente lipfdico son ffpidos biocompatibles no toxicos, tales como, por ejemplo, ffpidos preparados a partir de fosfatidil-colina, fosfoglicerol y/o colesterol. En una realizacion de la presente invencion, el componente lipfdico comprende diastearoilfosfatidilcolina (DSPC), diastearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y colesterol, preferiblemente en una razon molar de aproximadamente 3:1:2 (DSPC:DSPG:col).

El componente lipfdico encapsula un agente terapeutico, en el que ambos componentes tienen una masa preseleccionada. Tal como se usa en el presente documento, la “razon de farmaco con respecto a ffpido” (o razon farmaco:ffpido) se refiere a las cantidades relativas del farmaco con respecto al componente lipfdico, en masa, que comprenden el liposoma y/o la formulacion. En una realizacion de la invencion, el liposoma tiene una razon farmaco:ffpido de entre aproximadamente 1:5 y 1:8, preferiblemente, de entre 1:6 y 1:7 en peso.

B. Propiedades ffsicas de los liposomas

Diversas caractensticas y parametros ffsicos de los liposomas pueden afectar a la uniformidad, la estabilidad y la eficacia de la formulacion. Estas caractensticas ffsicas incluyen (1) osmolalidad (interna y externa al liposoma), (2) conductividad (interna y externa al liposoma), (3) razon de farmaco con respecto a ffpido, (4) el pH (interno y externo al liposoma) y (5) el tipo de ffpidos y farmacos usados en la composicion.

La osmolalidad es la medida de la concentracion de solutos de la formulacion liposomica. Tal como se usa en el presente documento, el termino “osmolalidad” se refiere a la medida de concentracion de solutos definida por el numero de moleculas soluto en osmoles (osmol) de soluto por kilogramo de disolvente (osmol/kg). La osmolalidad interna es la concentracion de solutos dentro del liposoma, siendo la osmolalidad externa la concentracion de solutos fuera del liposoma. En una realizacion de la invencion, el liposoma tiene una osmolalidad liposomica interna baja. La osmolalidad interna puede ajustarse variando la cantidad de farmaco que esta encapsulado dentro del liposoma. La tecnica describe liposomas que contienen la mayor cantidad de farmaco posible, lo que da como resultado liposomas con alta osmolalidad (alta razon de encapsulacion). Sin embargo, la presente invencion da a conocer liposomas que tienen una osmolalidad inferior (o baja razon de encapsulacion) en comparacion con los de la tecnica. La osmolalidad inferior, es decir, de entre aproximadamente 340-440 osmol/kg, tal como se da a conocer en el presente documento mejora la estabilidad de los liposomas y la uniformidad de los liposomas dentro de la formulacion. Un modo de lograr una baja osmolalidad interna es disminuir la cantidad de agente terapeutico encapsulado en la formulacion de liposomas. Otro modo de reducir la osmolalidad interna, que no requiere variar la razon farmaco:ffpido, utiliza un agente no cargado, tal como determinados polisacaridos o azucares conocidos en la tecnica.

La osmolalidad externa es preferiblemente isotonica con respecto a la del cuerpo, especialmente para formulaciones inyectables, para que sean isotonicas con respecto a la del cuerpo. Como tal, la osmolalidad externa es de manera preferible relativamente constante. La osmolalidad interna y externa de la invencion da como resultado un producto que tiene alta estabilidad, baja tasa de fuga de farmaco y capacidad de encapsulacion de farmacos apropiada del

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Tal como se usa en el presente documento, el termino “conductividad” se refiere a la capacidad del liposoma para conducir la electricidad basandose en el contenido ionico de la disolucion. Conductividad se refiere al contenido ionico del liposoma y afecta a la estabilidad, la tasa de fuga de farmaco y la capacidad de encapsulacion de farmacos de la formulacion de liposomas. La conductividad del liposoma esta en el intervalo de aproximadamente 13,5-17,5 ms/cm. En una realizacion de la invencion, el agente farmacologico encapsulado esta cargado. Se observa que un farmaco cargado tiene una correlacion de uno a uno entre la conductividad y la osmolalidad del liposoma. Por tanto, la alteracion de la cantidad de un agente cargado que va a encapsularse afecta proporcionalmente a ambas propiedades. En una realizacion alternativa, puede usarse un agente farmacologico neutro (no cargado). Cuando se usa un agente neutro tal como un polisacarido, por ejemplo, para ajustar la conductividad, la osmolalidad depende de la concentracion del farmaco y por tanto puede controlarse independientemente de la concentracion del agente.

Otro aspecto novedoso de los liposomas de la presente invencion es la rigidez relativa de la composicion, es decir, la estabilidad del liposoma en diferentes condiciones corporales internas y del entorno, y su propension a romperse. La rigidez del liposoma es una medida de la resistencia de la membrana del liposoma y de su capacidad a resistir el esfuerzo cortante y la presion, lo que puede mejorar la vida util de almacenamiento de los liposomas. La rigidez de los liposomas esta relacionada inversamente con su compresibilidad. Los liposomas que tienen baja compresibilidad tienen mayor rigidez. Un metodo a modo de ejemplo de determinacion de la rigidez de los liposomas es a traves de densitometna y velocimetna por ultrasonidos. Se conocen en la tecnica metodos de determinacion de la rigidez de los liposomas y se detallan en, por ejemplo, Cavalcanti, Leide P., et al., “Compressibility study of quaternary phospholipid blend monolayers”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 85(2011) 153-160; y Hianik, Tibor, et al., “Specific volume and compressibility of bilayer lipid membranes with incorporated Na, K-ATPase”, General Physiology and Biophysics 30(2011) 145-153, cuyos contenidos completos se incorporan en el presente documento mediante referencia.

El liposoma tiene un pH tanto para el disolvente externo al liposoma (el pH externo) como para la parte encapsulada interna del liposoma (el pH interno). El pH afecta a la estabilidad, la tasa de fuga de farmaco del liposoma y la capacidad de encapsulacion de farmacos de la formulacion de liposomas. Una realizacion de la formulacion tiene un pH interno en el intervalo de aproximadamente 6,8-7,0. El pH interno de 6,8-7,0 es beneficioso para la estabilidad de la formulacion. El pH del disolvente para el agente terapeutico puede mantenerse, entre otros medios, valorando de manera continua la disolucion para que permanezca en el intervalo de pH de 6,8-7,0 o manteniendolo a un pH particular tal como, por ejemplo, aproximadamente pH 6,9 cuando el agente terapeutico se disuelve usando un tampon conocido. El pH interno del liposoma puede ser diferente del pH externo del liposoma. Puede lograrse un pH diferente variando el pH de las disoluciones que constituyen los entornos interno y externo del liposoma.

C. La formulacion

La formulacion liposomica de la presente invencion comprende una pluralidad de liposomas que tienen las caractensticas descritas anteriormente y que son sustancialmente uniformes en tamano y forma, es decir, que tienen poca variacion de tamano de un liposoma a otro liposoma. La uniformidad de la formulacion se mide mediante su mdice de polidispersidad (PDI). El PDI se mide en una escala no lineal de 0 a 1, donde un valor de 0 es una preparacion perfectamente uniforme, mientras que una composicion que tiene un PDI de 1 tiene alta diversidad (no uniformidad). La formulacion de la presente invencion tiene un PDI menor de 0,075, preferiblemente en el intervalo de entre 0,02-0,05. Los valores de PDI pueden calcularse tal como se indica en el manual de usuario del dispositivo Zetasizer serie nano, 2003, Malvern Instruments, pags. 5,5-5,6 y Kazuba M., Nano Series and HPPS Training Manual, capttulo 1, 2003, Malvern Instruments, pags. 9, cuyos contenidos se incorporan como referencia. De hecho, el PDI de la presente formulacion es proximo al de patrones de dimensionamiento donde el PDI es menor de 0,02. Las formulaciones conocidas previamente en la tecnica tienen una uniformidad sustancialmente diferente que la de la presente invencion, con un PDI normalmente de aproximadamente 0,3. Como el PDI esta a una escala no lineal, el PDI de la presente invencion es sustancialmente distinto del de las formulaciones en la tecnica. De hecho, el bajo PDI de la presente invencion evita ventajosamente los efectos toxicos asociados con los liposomas grandes, y produce una formulacion mas adecuada para la esterilizacion con filtro.

La formulacion de la presente invencion contiene liposomas de rigidez y uniformidad aumentadas, mejorando su estabilidad y vida util de almacenamiento. Ademas, se contempla que las formulaciones de la presente invencion son eficaces. Banai, Shmuel, et al., “Targeted antiinflammatory systemic therapy for restenosis: The Biorest Liposomeal Alendronate with Stent sTudy (BLAST) - a double blind, randomized clinical trial”, Am Heart J. (2013) 165(2): 234-40.

Liposomas de la presente formulacion estan dimensionados espedficamente para su captacion por macrofagos y monocitos. Los liposomas pueden estar en el intervalo de tamano de 30-500 nm. Sin embargo, dependiendo del tipo de agente y/o el portador usado, los intervalos incluyen, pero no se limitan a, 70-120 nm, 100-500 nm, 100-300 nm, 100-180 nm y 80-120 nm. Sin embargo, estos intervalos son ejemplos y se reconoceran en la tecnica otros tamanos particulares adecuados para su captacion a traves de fagocitosis sin apartarse del espmtu o el alcance de la

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invention. En una realization preferida, el tamano del liposoma dentro de la formulation es de aproximadamente 80+5 nm.

Puede encapsularse una variedad de agentes terapeuticos mediante los liposomas de la invencion. Una vez que el liposoma se fagocita, el agente terapeutico es una sustancia que puede disminuir o inhibir la actividad de y/o eliminar la cantidad de celulas fagocticas en un paciente. El agente terapeutico puede ser cualquier entidad qmmica, incluyendo moleculas grandes o pequenas, una mezcla de compuestos qmmicos, compuestos organicos o inorganicos, macromoleculas biologicas tales como protemas, hidratos de carbono, peptidos, anticuerpos y acidos nucleicos. Los agentes terapeuticos pueden ser productos naturales derivados de organismos conocidos o compuestos sinteticos.

Un tipo de agente terapeutico que es util en esta invencion son los bisfosfonatos. Los bisfosfonatos (denominados anteriormente difosfonatos) son compuestos caracterizados por dos uniones C-P. Si las dos uniones se ubican en el mismo atomo de carbono (P-C-P) se denominan bisfosfonatos germinales. Los bisfosfonatos son analogos del pirofosfato inorganico endogeno que esta implicado en la regulation de la formation y reabsorcion oseas. Los bisfosfonatos pueden formar a veces cadenas polimericas. Al ser altamente hidrofilos y estar cargados negativamente, los bisfosfonatos en su forma libre son casi completamente incapaces de atravesar las membranas celulares.

El termino bisfosfonato tal como se usa en el presente documento, indica bisfosfonatos tanto germinales como no germinales. Un agente preferido, un bisfosfonato, tiene la siguiente formula (I):

OH R, OH

I l I

o=p—c—p=o

I I I

OH R2 OH

(I)

en la que R1 es H, OH o un atomo de halogeno; y R2 es halogeno; alquilo C1-C10 o alquenilo C2-C10 lineal o ramificado opcionalmente sustituido por heteroarilo o heterociclil-alquilamino C1-C10 o cicloalquilamino C3-C8 donde el amino puede ser primario, secundario o terciario; -NHY donde Y es hidrogeno, heteroarilo, arilo o cicloalquilo C3- C8; o R2 es -SZ donde Z es fenilo o piridinilo sustituido con cloro.

Un ejemplo de un agente de bisfosfonato es alendronato, que tiene la siguiente formula (II):

OH OH OH

I I I

o=p—c-------p=o

I I I

OH (CH2)3 OH

I

nh2

(II)

Muchos bisfosfonatos tienen actividades similares a las del alendronato y son utiles como agentes terapeuticos para la invencion. Tales bisfosfonatos pueden seleccionarse partiendo de la base de su capacidad para imitar la actividad biologica del alendronato. Esta incluye, por ejemplo: actividad in vitro en la inhibition de la actividad de celulas fagocticas, por ejemplo, macrofagos y fibroblastos una vez dentro de tales celulas; inhibicion de la secretion de IL-1 y/o IL-6 y/o TNF -a a partir de macrofagos; y actividad in vivo, por ejemplo, la capacidad de las formulaciones sometidas a prueba para reducir o inhabilitar monocitos de la sangre en un modelo animal o en seres humanos o para tratar el infarto de miocardio y reducir la zona de infarto.

Los bisfosfonatos aplicables en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, clodronato, tiludronato, acido 3- (N,N-dimetilamino)-1-hidroxipropano-1,1-difosfonico, por ejemplo dimetil-APD; acido 1-hidroxi-etiliden-1,1- bisfosfonico, por ejemplo etidronato; acido 1-hidroxi-3(metilpentilamino)-propiliden-bisfosfonico, (acido ibandronico), por ejemplo ibandronato; acido 6-amino-1-hidroxihexano-1,1-difosfonico, por ejemplo amino-hexil-BP; acido 3-(N- metil-N-pentilamino)-1-hidroxipropano-1,1-difosfonico, por ejemplo metil-pentil-APD; acido 1-hidroxi-2-(imidazol-1- il)etano-1,1-difosfonico, por ejemplo acido zoledronico; acido 1-hidroxi-2-(3-piridil)etano-1,1-difosfonico (acido resedronico), por ejemplo risedronato; acido 3-[N-(2-feniltioetil)-N-metilamino]-1-hidroxipropano-1,1-bisfosfonico; acido 1-hidroxi-3-(pirrolidin-1-il)propano-1,1-bisfosfonico, acido 1-(N-fenilaminotiocarbonil)metano-1,1-difosfonico, por ejemplo FR 78844 (Fujisawa); ester tetraetflico del acido 5-benzoil-3,4-dihidro-2H-pirazol-3,3-difosfonico, por

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ejemplo U81581 (Upjohn); y acido 1-hidroxi-2-(imidazo[1,2-a]piridin-3-il)etano-1,1-difosfonico, por ejemplo, YM 529.

En determinadas realizaciones, tales como, por ejemplo, alendronato sodico encapsulado en DSPC, DSPG y colesterol, puede usarse una razon farmaco:Upido de 1:5,7 en masa (igual a aproximadamente una razon molar de 1:3 para alendronato sodico). Cuando se encapsula clodronato disodico, otro agente terapeutico, se encapsula en el mismo componente lipfdico, puede usarse una razon en masa de aproximadamente 1:5,4 (que equivale a una razon molar de 1:3). En la presente invencion pueden encapsularse otros agentes terapeuticos que inhiben o reducen las celulas fagodticas eliminando, retrasando la proliferacion y/o regulando por disminucion la actividad de las celulas fagodticas. Los agentes terapeuticos espedficos incluyen cualquier agente que sea citotoxico o citoestatico, incluyendo pero sin limitarse a, por ejemplo, galio, oro, sflice, 5-fluorouracilo, cisplatino, agentes alquilantes, mitramicina y paclitaxol. En cualquiera de los agentes terapeuticos anteriores, la razon farmacodpido del liposoma es de entre aproximadamente 1:5 y 1:8, preferiblemente de entre 1:6 y 1:7 en peso.

En una realizacion, la formulacion contiene el agente terapeutico encapsulado que puede entrar en una celula a traves de fagocitosis y seleccionar como diana selectivamente a macrofagos y monocitos sin afectar a otras celulas no fagodticas. Puesto que los macrofagos y los monocitos, en su estado normal, se reclutan hasta una zona danada celularmente y promueven la inflamacion mas alla de la producida por la enfermedad o el estado solo, la inhibicion y/o reduccion de monocitos/macrofagos puede atenuar la zona danada subyacente. Una vez dentro de las celulas fagodticas, el agente se libera e inhibe, inactiva, deshabilita, elimina y/o reduce los monocitos y/o macrofagos para el tratamiento de diversos estados que implican una respuesta inmunitaria fagoctica, tal como, por ejemplo, lesion por reperfusion isquemica o lesion inflamatoria, tal como, por ejemplo, infarto de miocardio, reduccion en la zona final de infarto y mejora de la reparacion y el desenlace cardiacos tras infarto de miocardio agudo. Los liposomas de la formulacion tienen caractensticas espedficas, que incluyen tamano, carga, pH, conductividad y osmolalidad que permiten la captacion principalmente a traves de fagocitosis.

Tras captarse por los monocitos/macrofagos, el agente tiene una actividad inhibidora sostenida sobre los monocitos/macrofagos. Esta actividad sostenida es suficiente para modular la accion inflamatoria de los monocitos/macrofagos. Por tanto, no se requiere la liberacion prolongada del agente con el fin de mantener la inhibicion. Por consiguiente, el metodo de tratamiento de determinadas enfermedades inhibiendo monocitos/macrofagos, tal como, por ejemplo, mediante el uso de un agente encapsulado, es preferiblemente una terapia sistemica, porque la formulacion selecciona como objetivo los monocitos y macrofagos circulantes. Dependiendo del tipo de agente terapeutico encapsulado, las celulas fagocticas pueden responder de diferente manera. Por ejemplo, liposomas con alendronato encapsulado producen apoptosis, mientras que liposomas con clodronato encapsulado producen necrosis. Las celulas no fagocticas son relativamente incapaces de captar la formulacion debido a las propiedades fisicoqmmicas particulares de la formulacion liposomica.

Ademas, los liposomas de la presente invencion no solo retienen el agente terapeutico durante un tiempo suficiente de modo que el agente no se libere a los fluidos corporales, sino que tambien descargan eficazmente el agente dentro de la celula diana. Los liposomas de la presente invencion administran una cantidad eficaz del agente a las celulas seleccionadas como diana. El termino “cantidad eficaz” indica una cantidad de la formulacion que es eficaz para lograr el resultado terapeutico deseado, por ejemplo, tratamiento de endometriosis, restenosis, lesion por reperfusion isquemica (IRI), infarto de miocardio u otros estados relacionados. Por ejemplo, la disminucion en el numero y/o la actividad de los macrofagos y monocitos activados reduce la zona de infarto y/o mejora la remodelacion cuando la lesion se refiere a dano miocardico. La cantidad eficaz tambien puede depender de varios factores incluyendo, pero sin limitarse a: peso y sexo del individuo tratado; el modo de administracion de la formulacion (concretamente si se administra de manera sistemica o directamente al sitio); el regimen terapeutico (por ejemplo, si la formulacion se administra una vez al dfa, varias veces al dfa, una vez cada pocos dfas, o en una unica dosis); indicadores clmicos de inflamacion; factores clmicos que influyen en la velocidad de desarrollo del estado subyacente que va a tratarse, tabaquismo, hipercolesterolemia, estados proinflamatorios, enfermedades renales; y de la forma de dosificacion de la composicion. El suministro y la administracion satisfactorios de la formulacion liposomica dependen de su estabilidad y eficacia. El numero de moleculas de agente terapeutico encapsuladas en cada liposoma (carga util), el tamano de vesmula y el nivel de material no encapsulado libre son los parametros importantes que determinan el mdice terapeutico del producto.

D. Dosificacion y administracion

Las formulaciones liposomicas pueden administrarse mediante cualquier via que transporte eficazmente los liposomas al sitio de accion apropiado o deseable. Los modos de administracion preferidos incluyen intravenoso (i.v.) e intraarterial (i.a.) (particularmente adecuado para administracion mediante via). Otros modos adecuados de administracion incluyen intramuscular (i.m.), subcutanea (s.c.) e intraperitoneal (i.p.). Una administracion de este tipo puede ser infusiones o inyecciones en bolo. Otro modo de administracion puede ser mediante administracion perivascular. La formulacion puede administrarse directamente o tras dilucion. Tambien pueden usarse combinaciones de cualquiera de las vfas de administracion anteriores segun la invencion. Puede utilizarse cualquier via de administracion siempre que las partmulas esten en contacto con celulas fagocticas (por ejemplo, monocitos circulantes o macrofagos peritoneales).

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Las composiciones farmaceuticas para su uso segun la presente invencion pueden formularse usando uno o mas portadores fisiologicamente aceptables que comprenden excipientes y agentes auxiliares conocidos en la tecnica, que facilitan el procesamiento de los principios activos para dar preparaciones que pueden usarse farmaceuticamente.

La cantidad y el intervalo de dosificacion pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles plasmaticos de la formulacion suficientes para inducir o suprimir el efecto biologico (concentracion eficaz mmima, “MEC”). La MEC variara para cada preparacion, pero puede determinarse a partir de datos in vitro. Las dosificaciones necesarias para lograr la MEC dependeran de caractensticas individuales y de la via de administracion. Pueden usarse ensayos de deteccion para determinar las concentraciones plasmaticas.

Dependiendo de la gravedad y de la capacidad de respuesta del estado que va a tratarse, la dosificacion puede ser con una unica o con una pluralidad de administraciones, durando el curso de tratamiento desde varias horas hasta varias semanas o hasta que se realiza el tratamiento. La frecuencia de administracion puede variar dependiendo del estado y de la gravedad. En una realizacion, la formulacion puede administrarse periodicamente. La dosificacion puede formularse en cualquier cantidad o volumen segun se requiera para el tratamiento deseado. Por ejemplo, puede administrarse una dosis de o bien 1 |ig o bien 10 |ig a pacientes que se someten a un procedimiento intravascular, por ejemplo, implantacion de endoprotesis, con el fin de prevenir la incidencia y la gravedad de perdida posterior de endoprotesis. Como ejemplo adicional, la dosificacion puede ser de al menos 100 |ig. A este respecto, la formulacion puede administrarse como una dosis unica, multiples dosis y/o de manera continua, por ejemplo, mediante infusion/infusiones continua(s) a lo largo de un periodo de tiempo. Por ejemplo, las dosificaciones pueden administrarse segun lo descrito en Banai, Am Heart J. (2013), citado anteriormente.

E. Procedimiento de fabricacion de liposomas

Otro aspecto de la invencion se refiere a un procedimiento de obtencion del liposoma y la formulacion liposomica para la fabricacion comercial del producto. Este metodo de fabricacion permite la manipulacion de las caractensticas ffsicas descritas anteriormente, asf como el control de determinados parametros del procedimiento, incluyendo la razon de agua con respecto a disolvente, la composicion del disolvente y las razones de disolvente, la temperatura de preparacion de las vesfculas, la velocidad de corte de la preparacion de vesfculas, la temperatura de extrusion, la presion de extrusion y el tamano de la membrana de extrusion y el tipo de membrana.

La preparacion de la formulacion de liposomas incluye las etapas de (1) mezclar un agente terapeutico y ffpidos preseleccionados para formar vesfculas, (2) extruir las vesfculas en una unica fase a traves de un filtro de tamano unico, y (3) someter a ultrafiltracion. Las extrusiones mediante filtro de una unica fase tal como se usa esta expresion significa que la etapa de extrusion usa una etapa de filtracion de un unico tamano de poro. Puede incluir multiples pases a traves del filtro de tamano unico pero evita la necesidad de pases multiples y/o secuenciales a traves de filtros de diferente tamano tal como se conoce en la tecnica anterior, por ejemplo, pases a traves de membranas de 1,0, 0,8, 0,6, 0,4 y 0,2 |im secuencialmente. Tras la ultrafiltracion, el producto puede normalizarse a la concentracion final deseada. Puesto que la extrusion de la etapa (2) se realiza como una extrusion de una unica fase a baja presion, el presente metodo ahorra costes y tiempo de funcionamiento y aumenta el rendimiento a lo largo de extrusiones de alta presion utilizando multiples fases. La figura 1 ilustra las etapas del procedimiento de fabricacion.

La primera etapa comprende mezclar un agente terapeutico y componentes lipfdicos preseleccionados en una disolucion para formar vesfculas. En muchos casos, el agente terapeutico y el componente lipfdico se solubilizaran en una disolucion de agente terapeutico y disolucion de componente lipfdico antes de mezclar los dos. En esta realizacion, la disolucion de agente terapeutico tendra determinadas caractensticas ffsicas, incluyendo un pH, osmolalidad y conductividad. La disolucion de agente terapeutico comprende el entorno interno de la formulacion de liposomas. Como tal, el pH, la conductividad, la osmolalidad de la disolucion de agente terapeutico influyen en el pH interno, la conductividad, la osmolalidad de la formulacion liposomica. La osmolalidad liposomica interna esta preferiblemente en el intervalo de entre 340-440 osmol/kg mientras que la osmolalidad liposomica externa es de entre 270-340 osmol/kg. Se pretende que el pH de la disolucion mantenga la disolucion de agente terapeutico en el intervalo de pH deseado. Por tanto, si se usa un agente terapeutico acido, por ejemplo, un bisfosfonato, puede usarse una disolucion de pH basico para mantener el pH de la disolucion entre 6,8 y 7,0. Por ejemplo, puede prepararse una disolucion de agente terapeutico a partir de alendronato sodico disuelto en una disolucion de NaOH, siendo el pH resultante de la disolucion de alendronato de aproximadamente 6,8 y la conductividad de aproximadamente 18,0 ms/cm. La disolucion puede calentarse opcionalmente durante el procedimiento. En una realizacion alternativa, puede usarse clodronato sodico o alendronato monohidratado. La disolucion puede calentarse hasta una temperatura que facilite la solubilizacion del bisfosfonato en el disolvente basico, que oscila entre 55° y 75°C, tal como, por ejemplo, 70°C. Dependiendo de la cantidad de agente terapeutico y de otros excipientes disueltos, la disolucion puede tener una osmolalidad (que se convierte en la osmolalidad interna) en el intervalo de 340-400 osmol/kg. Tambien dependiendo de la cantidad de agentes terapeuticos y excipientes, la disolucion puede tener una conductividad (que se convierte en la conductividad interna) en el intervalo de 14,021,0 ms/cm. El pH, la osmolalidad, la conductividad internos son factores en la estabilidad y la eficacia de la formulacion liposomica. En una realizacion, la concentracion de la disolucion de agente terapeutico puede estar en el

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intervalo de 20-120 g/l durante la etapa (1) del procedimiento de fabricacion. La disolucion de agente terapeutico puede prepararse aparte de y/o antes del procedimiento de fabricacion comentado en el presente documento.

Los componentes lip^dicos pueden estar en forma de una disolucion que contiene la cantidad de partida deseada del componente lipfdico en un volumen de uno o mas disolventes lipfdicos. Puede usarse cualquier componente lip^dico y disolvente lipfdico adecuados. Por ejemplo, los componentes lipfdicos pueden comprender DSPC, DSPG y colesterol en una razon molar de 3:1:2, respectivamente, antes de la formacion del liposoma. El liposoma resultante formado segun esta combinacion de lfpidos tambien puede tener una razon molar de 3:1:2 de DSPC, DSPG y colesterol. Ademas, el disolvente lipfdico puede comprender, por ejemplo, t-butanol, etanol y agua en una razon de 77/77/6 v/v/v, respectivamente. Otros disolventes lipfdicos que pueden usarse para formular los liposomas de la invencion incluyen cloroformo o metanol. Los componentes lipfdicos se disuelven en el disolvente lipfdico. El disolvente lipfdico puede calentarse hasta una temperatura que facilita la solubilizacion de los componentes lipfdicos, que oscila entre 55° y 75°C, tal como, por ejemplo 70°C para generar la disolucion lipfdica. La concentracion de la disolucion lipfdica disuelta puede estar en el intervalo de 50-350 g/l. La disolucion lipfdica puede prepararse a parte de y/o antes del procedimiento de fabricacion comentado en el presente documento.

El mezclado de la disolucion de agente terapeutico y la disolucion lipfdica forma vesfculas multilamelares (MLV). La razon farmaco:lfpido puede controlarse variando la cantidad de disolucion lipfdica o disolucion de agente terapeutico. Puede usarse opcionalmente calentamiento suave de las dos disoluciones para ayudar en el mezclado de las disoluciones entre sf. Este procedimiento da como resultado la encapsulacion eficaz del agente terapeutico en vesfculas multilamelares. En un ejemplo, la disolucion lipfdica puede anadirse a una disolucion de agente terapeutico en 5,3 partes de lfpido con respecto a 1 parte de agente terapeutico. Esta razon de lfpido con respecto a farmaco (en peso) aumenta la estabilidad de la formulacion de liposomas sin poner en peligro significativo la administracion. De hecho, este procedimiento permite varia la razon farmaco:lfpido en el intervalo de 1:4 a 1:8 en peso, preferiblemente en el intervalo de 1:5 a 1:6. Ademas, puede ajustarse la concentracion de disolvente antes de la etapa de extrusion sin poner en peligro la integridad del liposoma.

La siguiente etapa en el metodo de fabricacion de la formulacion comprende extruir las vesfculas en una unica fase a traves de un filtro de tamano unico. La extrusion de las vesfculas reduce el tamano de las vesfculas multilamelares descritas anteriormente. El metodo usa una extrusion de una unica fase y baja presion, lo que produce liposomas que son altamente uniformes en tamano y forma. El procedimiento de extrusion puede implicar el uso de un microfluidizador u otro homogeneizador convencional. Los homogeneizadores se basan en la energfa de corte para fragmentar liposomas grandes dando otros mas pequenos. Los homogeneizadores adecuados para su uso en el presente documento incluyen microfluidizadores producidos por una variedad de fabricantes, por ejemplo, Microfluidics en Boston, MA. La distribucion de tamano de partfcula puede monitorizarse mediante discriminacion de tamano de partfcula por haz de laser convencional. La extrusion de liposomas a traves de una membrana de policarbonato o una membrana de ceramica asimetrica es un metodo eficaz para reducir los tamanos de liposoma hasta una distribucion de tamano relativamente bien definida. La temperatura de extrusion esta preferiblemente por encima de la temperatura de fase transitoria del liposoma para permitir la reduccion de tamano. Por ejemplo, en el caso de DSPG, DSPC y colesterol, pueden ser deseables aproximadamente 55°C. Pueden usarse otros lfpidos y su temperatura de fase transitoria es una medida de la temperatura deseada para la etapa de extrusion. Pueden requerirse multiples pases para lograr el tamano de vesfcula y la homogeneidad deseados. Pueden analizarse muestras en tiempo real para evaluar el tamano de vesfcula asf como el recuento bacteriano durante esta etapa.

La etapa de extrusion se realiza en un procedimiento de baja presion de una fase de la tecnica de extrusion. En el procedimiento de extrusion, se procesan las MLV en una fase extruyendo directamente a traves de una membrana mientras se aplica baja presion (en lugar de crear pequenos liposomas unilamelares mediante extrusiones de multiples fases donde se hacen pasar liposomas mas grandes a traves de membranas sucesivamente mas pequenas mediante prensas extrusoras a alta presion (tal como se poma en practica en los metodos de la tecnica anterior). En una realizacion, el procedimiento de extrusion de una unica fase se lleva a cabo directamente con una membrana de ceramica o policarbonato de 0,1 |im de tamano de poro mientras se aplica baja presion de 60-90 psi para obtener liposomas de 100 nm de tamano. Ademas, el procedimiento usa una baja presion de 60-90 psi, en contraposicion con una presion mas alta (de hasta 500 psi) de las extrusiones a alta presion.

Eliminando las membranas multiples y extruyendo a baja presion, el procedimiento de la invencion tiene varias ventajas. En primer lugar, el procedimiento de extrusion de una fase tiene la ventaja de realizar el procedimiento de extrusion en menos tiempo que los procedimientos de extrusion de multiples fases. Ademas, la eliminacion de la necesidad de extrusiones a alta presion ahorra ventajosamente el alto coste asociado con el equipo de extrusion a alta presion. Las presas extrusoras a baja presion son significativamente menos costosas. Un ejemplo de una prensa extrusora adecuada para la presente invencion es la prensa extrusora LIPEX™, disponible de Northern Lipids, Inc. Ademas, los materiales usados para las prensas extrusoras a baja presion, por ejemplo, aire comprimido, generalmente cuestan menos que los de para las prensas extrusoras a alta presion, por ejemplo, nitrogeno. Ademas, la reduccion de las extrusiones de multiples fases a una extrusion de fase unica se corresponde con una reduccion similar en desechos y rendimientos superiores.

La ultima etapa del presente metodo comprende la ultrafiltracion de las vesfculas extruidas para dar una disolucion

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tamponada. Aunque el procedimiento de extrusion produce liposomas que son uniformes en tamano y forma, la ultrafiltracion implica aplicar presion a la formulacion a traves de una membrana con el fin de separar los liposomas encapsulados de los lfpidos, disolventes y agentes terapeuticos no encapsulados. Esta etapa se lleva a cabo preferiblemente por debajo de la temperatura de fase transitoria de los lfpidos usados en la formulacion, por ejemplo por debajo de 45°C en la mayona de los casos. Pueden usarse diferentes tipos de membranas de filtracion durante el procedimiento de ultrafiltracion. Una realizacion de la etapa de ultrafiltracion usa una membrana de fibras huecas, donde se empuja la formulacion a traves de las almas huecas abiertas de la fibra y se filtran las micromoleculas (es decir, disolvente, bisfosfonatos no encapsulados, lfpidos) a traves de la membrana exterior de la fibra mientras que los liposomas relativamente grandes permanecen dentro de la fibra. La ultrafiltracion da como resultado una formulacion que tiene mas de o igual al 96% de agente terapeutico encapsulado.

La etapa de ultrafiltracion puede incluir ademas una etapa de dializacion en la que se dializa la formulacion frente a un volumen de disolucion tamponada. Un ejemplo de una disolucion tamponada es una solucion salina tamponada con fosfato (PBS), pero puede usarse cualquier tampon que contenga un equilibrio de iones positivos y negativos mantenidos a una osmolalidad fisiologica. Se conocen en la tecnica otros aditivos de tampon y pueden incluir, por ejemplo, sacarosa, glicina, succinato de sodio y/o albumina. La disolucion tamponada refleja preferiblemente el entorno externo de la formulacion final, de modo que pueden monitorizarse cuidadosamente el pH y la conductividad de esta disolucion. Preferiblemente, la disolucion tamponada es isotonica y no toxica para las celulas. La disolucion tamponada puede filtrarse para reducir adicionalmente los contaminantes y puede prepararse antes del procedimiento de fabricacion. El punto final de la dialisis esta marcado al alcanzarse el pH y la conductividad de la formulacion deseados.

Al final de la etapa de ultrafiltracion, la formulacion puede filtrarse opcionalmente para obtener la esterilizacion, es decir, para mantener un control de la carga biologica. En una realizacion del procedimiento, se conecta un filtro de esterilizacion a un recipiente a presion que contiene la formulacion de liposomas. El filtro de esterilizacion se conecta adicionalmente a un tanque de recepcion esteril. La aplicacion de presion a la formulacion liposomica fuerza a la formulacion a traves del filtro de esterilizacion. Ademas, puede tomarse otra muestra para determinar el contenido bacteriano durante esta etapa. El tamano de poro del filtro de esterilizacion puede estar en el intervalo de 0,2 a 0,45 |im. Puesto que los liposomas de la formulacion son sustancialmente uniformes y estan ausentes los liposomas grandes, la filtracion para obtener esterilizacion puede realizarse de manera relativamente libre de complicaciones.

Tras la fabricacion, puede normalizarse la formulacion. La normalizacion final produce un lote de formulacion de liposomas que tiene una concentracion convencional. La normalizacion analiza el rendimiento, el tamano, la composicion lipfdica y el contenido en farmaco libre y la concentracion del producto. El analisis de la concentracion puede realizarse mediante un metodo conocido en la tecnica, tal como, por ejemplo, HPLC, ensayo de fosfato a traves de espectrofotometro. Tras confirmar la concentracion del producto sometido a ultrafiltracion, se usa un volumen de la disolucion tamponada para diluir la formulacion hasta una concentracion convencional. La normalizacion final tambien implica filtracion esteril del producto liposomico. Por ejemplo, puede diluirse una formulacion de bisfosfonato encapsulada tras la ultrafiltracion con la cantidad apropiada de la disolucion tamponada para llegar a una concentracion final. De manera similar, el producto sometido a ultrafiltracion puede separarse en multiples lotes que van a usarse en diferentes concentraciones finales mediante el uso de cantidades diferentes de diluyente de disolucion tamponada en los diferentes lotes. Puede tomarse una muestra para determinar la concentracion lograda del agente terapeutico.

Este procedimiento de fabricacion tiene la ventaja de que pueden controlarse, monitorizarse y reproducirse las caractensticas fisiologicas y qmmicas del liposoma. Por ejemplo, el pH interno del liposoma puede controlarse mediante la composicion de la disolucion en la que se disuelve el agente terapeutico. La osmolalidad interna tambien puede manipularse de manera similar variando la cantidad de agente terapeutico o, por ejemplo, dependiendo de si es un agente cargado o no cargado. La razon farmaco:lfpido puede controlarse mediante la seleccion de los componentes lipfdicos que comprende el liposoma o la cantidad de lfpidos anadidos al principio activo disuelto. El aumento de la cantidad de componente lipfdico disminuye la razon farmaco:lfpido, y viceversa. Una razon farmaco:lfpido baja tambien reduce la osmolalidad interna de la formulacion de liposomas. El pH externo y la osmolalidad externa de la composicion estan influidos en parte por la composicion de la disolucion tamponada que contiene el producto final. La conductividad puede controlarse por la naturaleza del agente terapeutico y otros excipientes encapsulados dentro del liposoma. Otros factores, incluyendo pero sin limitarse a la viscosidad, calidad del excipiente, esterilidad, compatibilidad con solucion salina, kits y jeringas de infusion (para preparaciones inyectables), y compatibilidad con equipo de procesamiento, tambien pueden controlarse independientemente mediante el procedimiento de la invencion.

Segun la descripcion anterior, en una realizacion preferida del procedimiento de fabricacion, la formulacion se prepara (1) mezclando una disolucion que contiene un agente terapeutico con una disolucion que contiene lfpidos que comprende DSPC, DSPG y colesterol en una razon molar de aproximadamente 3:1:2 para formar vesfculas de manera que la razon en masa de dicho agente terapeutico con respecto a lfpidos esta en el intervalo de aproximadamente 1:5 a 1:8, (2) extruyendo las vesfculas en una unica fase a traves de un filtro que tiene un tamano de poro de aproximadamente 100 nm, y (3) sometiendo a ultrafiltracion.

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Otro aspecto de esta invencion es una formulacion de liposomas obtenida segun las etapas de fabricacion anteriores en la que la formulacion comprende DSPC, DSPG y colesterol en una razon molar de aproximadamente 3:1:2, y la razon en masa de dicho agente terapeutico con respecto a lfpidos esta en el intervalo de aproximadamente 1:5 a 1:8 y se fabrica mediante las siguientes etapas: (1) mezclar una disolucion que contiene un agente terapeutico con una disolucion que contiene componentes lipfdicos para formar vesfculas, (2) extruir las vesfculas en una unica fase a traves de un filtro de tamano unico, y (3) someter a ultrafiltracion. Tras la ultrafiltracion, el producto puede normalizarse a la concentracion final deseada. La formulacion obtenida segun este metodo tiene un PDI menor de 0,075, preferiblemente en el intervalo de entre 0,02 y 0,05. Este procedimiento produce una formulacion de liposomas que tiene caractensticas novedosas y utiles tal como se describio anteriormente, incluyendo, por ejemplo, la razon de 3:1:2 del componente lipfdico, una razon farmaco:lfpido de entre 1:5 a 1:8. Ademas, pueden controlarse independientemente las caractensticas liposomicas individuales, incluyendo, pH, osmolalidad, conductividad y rigidez, tal como se explico resumidamente antes.

Ejemplo 1 - Preparacion de lotes de formulacion de liposomas

Segun el procedimiento descrito anteriormente, se preparo un lote de ejemplo. Claramente puede variarse el tamano del lote, segun se desee para la produccion comercial. En este ejemplo, se produjo un lote de un litro de alendronato liposomico encapsulado en liposomas que conteman colesterol, DSPC y DSpG, y disperso en solucion salina tamponada con fosfato. El alendronato liposomico puede proporcionarse en dos concentraciones, por conveniencia clmica: 5 mg/ml y 0,5 mg/ml, como una dispersion liposomica blanquecina esteril. Estas concentraciones pueden formularse adicionalmente para obtener una cantidad deseada de agente terapeutico en cualquier volumen espedfico. Los componentes lipfdicos se compoman de colesterol, DSPC y DSPG. La dispersion tambien contema una solucion salina tamponada con fosfato para el control del pH, la idoneidad de la infusion y para el mantenimiento de la isotonicidad. Al menos se encapsulo el 96% del farmaco en el producto final en los liposomas. Para su administracion, se diluyo el contenido del vial (o parte del mismo, segun sea necesario) con solucion salina y luego se administro como una infusion.

En la tabla 1 a continuacion se presenta una formula de lote que incluye la cantidad y la calidad de los componentes usados en el procedimiento de fabricacion y sus cantidades en un lote de un litro.

Tabla 1 - Alendronato liposomico para infusion i.v., formula de lote para 1 litro

Componente: Cantidad Calidad

Alendronato Sodio trihidratado: 68-80,7 g 100,5%

NaOH: 6,8-8,0 g Extra pura

Colesterol: 10 + 0,2 g >99%

DSPC: 30 + 0,4 g >99%

DSPG: 10 + 0,2 g >99%

Etanol: 77 +1,1 ml Absoluta, extra pura

t-butanol: 77 +1,1 ml Para analisis

Agua para inyeccion: 850 + 13 ml USP

6+0,1 ml

PBS, pH 7: -6000 ml

Na2HPO4*2H2O: 13,86 g + 1,5% Extra pura

NaH2PO4*2H2O: 6,54 g + 1,5% Extra pura

NaCl: 50,82 g + 1,5% Extra pura

Agua para inyeccion: 60000 ml USP

En la tabla 2 a continuacion se resumen los contenidos y la composicion cuantitativa de alendronato liposomico para infusion i.v. producido en el lote de 1 litro de la tabla 1. Se observa que en este lote, la razon molar de DSPC:DSPG:colesterol fue de 3:1:2. Ademas, se calculo que la razon farmacodpido era de aproximadamente 1:5,761,5 p:p.

Tabla 2 - Composicion de alendronato liposomico para infusion i.v.

Componente: Composicion


: 0,5 mg/ml 5 mg/ml

Principio activo: Alendronato sodico trihidratado 0,5 + 0,05 mg/ml = 0,0015 mmol/ml 5,0 + 0,2 mg/ml = 0,015 mmol/ml

Lfpidos liposomicos: Colesterol 0,6 + 0,1 mg/ml = 0,0015 mmol/ml 5,2 + 0,8 mg/ml = 0,013 mmol/ml

DSPC (1,2-Distearoil-sn-glicero-3-: 1,7 + 0,3 mg/ml = 0,0022 mmol/ml 15,65 + 2,35 mg/ml = 0,020 mmol/ml

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: fosfocolina)

DSPC (1,2-Distearoil-sn-glicero-3- fosforac-glicerol): 0,6 + 0,1 mg/ml = 0,0007 mmol/ml 5,2 + 0,8 mg/ml = 0,006 mmol/ml

Disolucion tampon (pH 7): NaH2PO4*2H2O 1,09 mg/ml 1,09 mg/ml

Na2HPO4*2H2O: 2,31 mg/ml 2,31 mg/ml

NaCl: 8,47 mg/ml 8,47 mg/ml

Agua para inyeccion (WFI): ~ 1 ml ~ 1 ml

En la tabla 3 a continuacion se presenta una formulacion de alendronate liposomico para infusion i.v. producida realmente mediante el procedimiento de fabricacion novedoso descrito en el presente documento.

Tabla 3 - Especificaciones para la forma de dosificacion de 5 mg/ml

Pruebas: Especificacion

Aspecto: Dispersion blanquecina

Identificacion: Conforme

Ensayo de alendronato (HPLC): 5,0 + 0,2 mg/ml

Encapsulacion de alendronato: > 96%

Ensayo de DSPC (HPLC): 13,3-18,0 mg/ml

Ensayo de DSPG (HPLC): 4,4-6,0 mg/ml

Ensayo de colesterol (HPLC): 4,4-6,0 mg/ml

Razon farmaco:lfpido (p:p) incluyendo colesterol: 1: 5,3 +1,0

Tamano de vesteula: Diametro medio de partteula 80 + 5 nM

pH: 6,7 -7,3

Etanol: <0,5%

t-Butanol: <0,5%

Osmolalidad: 270-340 osmol/kg

Esterilidad: Esteril

Pirogenos: Pasa

La figura 2 representa un diagrama de flujo que resume el procedimiento de fabricacion de 1 litro de alendronato liposomico para infusion i.v. para una concentracion de dosificacion de 5 mg/ml, y sus parametros de control del procedimiento. El procedimiento de fabricacion para la concentracion de dosificacion de 0,5 mg/ml es igual que para la concentracion de dosificacion de 5 mg/ml. Solo la etapa de normalizacion final difiere en la formacion de una concentracion de formulacion final diferente para su administracion. El experto en la tecnica entiende que pueden fabricarse otras dosificaciones de conformidad con este procedimiento sin experimentacion indebida.

La disolucion de agente terapeutico (disolucion de alendronato) y la disolucion liptelica se prepararon tal como sigue:

Disolucion de alendronato. Se peso NaOH (6,8-8,0 g) y se disolvio en 850 ml de agua para inyeccion (WFI), con una temperatura a 70 + 3°C, 600 + 150 RPM. Se verifico la disolucion completa mediante inspeccion visual. Se disolvio alendronato sodico (de 68 a 80,75 g) en la disolucion de NaOH, con una temperatura a 70 + 3°C, agitando a 600 + 150 RPM. Se verifico la disolucion completa mediante inspeccion visual (es decir, disolucion transparente), se verificaron la conductividad y las mediciones de pH (pH = 6,8 + 0,3. Conductividad=18,0 + 1 ms/cm).

Disolucion lipfdica. Se pesaron lfpidos que comprendfan 30 g de DSPC (37,9 mmoles), 10 g de DSPG (12,5 mmoles) y 10 g de colesterol (25,8 mmoles) (DSPC/DSPG/colesterol; 3/1/2 mol/mol/mol) y se disolvieron en un vaso de precipitados de 250 ml con un agitador magnetico calentado en 160 ml de t-butanol/EtOH/H2O (77/77/6, v/v/v) a una temperatura de 70 + 3°C, formando una disolucion liptelica con una concentracion de 312 mg/ml. Se formo una disolucion amarilla transparente una vez que la temperatura estuvo dentro de los lfmites.

Formulacion de MLV. Se anadio la disolucion lipfdica a la disolucion de alendronato (1 parte de farmaco; 5,3 partes de lfpido) mientras se mezclaba a 600 + 150 RPM y a una temperatura de mantenimiento de 70 + 3°C. Tras al menos 5 minutos, se anadieron 100 ml de WFI (10% del volumen total) para reducir la concentracion del disolvente antes de la extrusion. Se mezclo la formulacion durante 10 minutos adicionales.

Extrusion. Se sometio la formulacion a extrusion mediante una prensa extrusora de acero inoxidable calentada de 1,2 l con una membrana de ceramica de 0,14 |im o con dos membranas de policarbonato (por ejemplo, un prefiltro de 0,2 y una membrana de 0,1 |im) para reducir el tamano de las vesteulas y mejorar la homogeneidad de las vesteulas a una presion = 90 + 15 psi y una temperatura = 68 + 5°C. El procedimiento requirio 12-18 pases para lograr vesteulas de 80-100 nm. Se tomaron como muestras pases de extrusion en tiempo real para verificar el tamano de las vesteulas antes de la ultrafiltracion. Se analizo el tamano de la formulacion de liposomas usando un

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analizador Nano ZS de Malvern (Ifmites de aceptacion: 95 + 20 nm). Tambien se analizo una muestra de extrusion para el recuento de bacterias aerobias (control de la carga biologica). El lfmite de aceptacion fue <100 UFC/ml.

Ultrafiltracion y diafiltracion. En primer lugar, se dejo enfriar la formulacion hasta <45°C antes de someterla a ultrafiltracion. Se realizo la ultrafiltracion en un sistema QuixStand de Amersham con una membrana de fibras huecas de 500 K. Se concentro la formulacion usando una presion de entrada que no superaba los 25 psi. Tras alcanzar un volumen mmimo, se dializo la formulacion con 10 volumenes iniciales (~7 l) de una solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Se preparo la disolucion de PBS disolviendo NaCl 145 mM, Na2HPO4 13 mM y NaH2PO4 7 mM en 10 l de WFI. La PBS tema un pH de aproximadamente 6,9 y una conductividad de aproximadamente 16,9 ms/cm. Se filtro la PBS a traves de un filtro de 0,2 |im. Se marco el fin de la diafiltracion midiendo el pH y la conductividad de la formulacion dializada. Se dreno la formulacion del sistema de ultrafiltracion no superando el 120% del volumen inicial (~1,2 litros). Se tomo una muestra para el analisis general y para el recuento de bacterias aerobias (control de la carga biologica). El lfmite de aceptacion fue <1,000 UFC/ml.

Al final de la dialisis, se filtro la formulacion a traves de un filtro de 0,2 |im para mantener el control de la carga biologica. Se conecto un recipiente a presion que contema la formulacion a un filtro esteril de 0,2 |im (Sartobran P de Sartorius). El filtro estaba montado previamente en un tanque de recepcion esteril. Se realizo la filtracion aplicando una presion de 5-30 psi sobre el recipiente a presion. Se tomo una muestra para el analisis general y para el recuento de bacterias aerobias (control de la carga biologica). El lfmite de aceptacion fue <100 UFC/ml.

Normalizacion final. Se analizo la formulacion para determinar el tamano, la composicion de lfpido/agente terapeutico en el liposoma, el contenido en farmaco y agente terapeutico libre mediante HPLC. El rendimiento esperado en este ejemplo fue una formulacion de un litro que contema aproximadamente 6 mg/ml de alendronato encapsulado y 35 mg/ml de lfpidos. Basandose en los resultados de la concentracion de alendronato, se calculo la dilucion requerida para lograr aproximadamente un litro de concentracion de formulacion final de 5 mg/ml o 0,5 mg/ml. Para producir la formulacion de 5 mg/ml, se diluyeron aproximadamente 900 ml de alendronato liposomico tras la ultrafiltracion con aproximadamente 100 ml de PBS, preparada tal como se describio anteriormente. Adicionalmente, para producir la formulacion de 0,5 mg/ml, se diluyeron aproximadamente 100 ml de alendronato liposomico tras la ultrafiltracion con aproximadamente 900 ml de PBS para una concentracion de 0,5 mg/ml. Se tomo una muestra para determinar la concentracion de alendronato lograda.

Tras la produccion de la concentracion de formulacion convencional, se conecto una botella que contema la formulacion a dos filtros esteriles secuenciales de 0,2 |im (Sartobran P de Sartorius) ubicados en una sala de clase 100 o una campana biologica esteril. Se monto previamente el filtro en una bolsa o botella de recepcion desechable esterilizada previamente. Se realizo la filtracion mediante una bomba peristaltica o nitrogeno a presion. La presion no supero los 10 psi. Cuando finalizo la filtracion se sometio el filtro a prueba para determinar la integridad.

El alendronato en liposomas para infusion i.v. producido en el ejemplo anterior tema varias propiedades deseables, por ejemplo (i) estabilidad de tres anos de al menos el alendronato y los lfpidos a 5° (intervalo de 2-8°C); (ii) diametro promedio de vesfcula de 80 + 5 sin materia particulada; (iii) una concentracion de alendronato sodico de hasta 5 mg/ml (intervalo de 0,1 - 5,0 mg/ml); (iv) encapsulacion de alendronato mayor del o igual al 96%; (v) composicion lipfdica de distearoilfosfatidilcolina / distearoilfosfatidilglicerol / colesterol (DSPC/DSPG/CHOL) de 3/1/2 mol/mol/mol; (vi) osmolalidad fisiologica de 270-340 osmol/kg, (vii) viscosidad similar a la del agua, es decir, viscosidad dinamica de aproximadamente 1,0 mPa s a 20°C; (viii) pH 6,8 (intervalo de 6,8-7,0); (ix) aceptabilidad mundial de calidad para excipiente segun la farmacopea de los EE.UU. o EP; (x) cumple las directrices de la USP para la esterilidad y los pirogenos tal como se publica en la USP 24-NF 19; (xi) compatibilidad (uso) con solucion salina, kits yjeringas de infusion; y (xii) compatibilidad (procedimiento) con filtros, vidrio y acero inoxidable de tubos.

La figura 3 es una imagen de TEM del alendronato liposomico fabricado en el ejemplo anterior. Se observo buena homogeneidad y uniformidad de la poblacion de liposomas, y los liposomas mostrados tienen un tamano de entre 40 y 120 nm.

Ejemplo 2 - Pruebas de rigidez de los liposomas

Se analizaron cuatro muestras de liposomas unilamelares grandes (diametro de aproximadamente 100 nm) para determinar la rigidez. Los liposomas vados disueltos en PBS obtenidos segun la presente invencion se marcaron como LPO. Las formulaciones de liposomas que conteman 5,0 mg/ml de alendronato obtenidas segun la presente invencion se marcaron como LSA. Se obtuvieron otras dos muestras de liposomas, marcadas como KS y HU, disueltas en HEPES, segun el metodo de la tecnica anterior descrito en Epstein-Barash, Hila, et al., “Physicochemical parameters affecting liposomal bisphosphonates bioactivity for restenosis therapy: Internalization, cell inhibition, activation of cytokines and complement, and mechanism of cell death”, J. Controlled Release 146 (2010) 182-195

Se analizo cada muestra para determinar la compresibilidad volumetrica espedfica de los liposomas. Usando velocimetna por ultrasonidos, se evaluaron las propiedades elasticas de los liposomas basandose en la siguiente

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relacion:

Q 1

Ps =------2 (1)

p •u

donde Ps, p y u son la compresibilidad adiabatica, la densidad y la velocidad del sonido de la suspension, respectivamente. Hianik T., Haburcak M., Lohner K., Prenner E., Paltauf F., Hermetter A. (1998): Compressibility and density of lipid bilayers composed of poliunsaturated phospholipids and cholesterol, Coll. Surf. A 139, 189-197; Hianik T., Rybar P., Krivanek R. Petnkova M., Milena Roudna M. Hans-Jurgen Apell, HJ. (2011): Specific volume and compressibility of bilayer lipid membranes with incorporated Na, K-ATPase. Gen. Physiol. Biophys. 30, 145-153. Por tanto, midiendo los cambios de la velocidad del sonido y la densidad, tambien pueden determinarse los cambios de compresibilidad.

La velocidad del ultrasonido se midio usando un velodmetro diferencial de trayectoria fija que consistfa en dos resonadores de cavidad acustica casi identicos (Sarvazyan A.P. (1991): Ultrasonic velocimetry of biological compounds, Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 20, 321-342; Sarvazyan A.P., Chalikian T.V. (1991): Theoretical analysis of an ultrasonic interferometer for precise measurements at high pressures, Ultrasonics 29, 119-124) operado a frecuencias de alrededor de 7,2 MHz. Se midieron las frecuencias de resonancia de las celulas usando un analizador de redes controlado por ordenador (USAT, EE.UU.). El volumen de muestra fue de 0,7 ml. Las celulas del resonador estaban equipadas con agitadores magneticos para garantizar muestras dispersas de manera homogenea durante las mediciones. Un resonador contema la disolucion de liposoma en una concentracion de 10 mg/ml con respecto a fosfolfpidos, mientras que el otro se lleno con la misma disolucion tampon (PBS o HEPES) sin vesfculas como referencia. Cuando comenzaron una serie de mediciones, se compararon en primer lugar las frecuencias de resonancia de ambos resonadores midiendo ambas celulas con lfquido de referencia identico. Como la densidad de energfa de la senal sonica era pequena por todas partes (la amplitud de presion en la onda ultrasonica fue menor de 103 Pa), se evito cualquier efecto de la onda de sonido sobre las propiedades estructurales de las vesfculas. En general, la velocimetna ultrasonica permite la determinacion de la velocidad del sonido [u] o mas bien sus incrementos dependientes de la concentracion (Sarvazyan A.P. (1982): Development of methods of precise measurements in small volumes of liquids, Ultrasonics 20, 151-154) tal como se define por la ecuacion:

[u ]

u - u

V

u0c

(2)

donde c es la concentracion de soluto en mg/ml, y el subrndice “0” se refiere al disolvente (tampon). El valor de [u] puede determinarse directamente a partir de los cambios de las frecuencias de resonancia f y f0 de ambos resonadores (f es la frecuencia de resonancia de la muestra, y fg es la del tampon de referencia):

r 1 u -u0 f -f0 .

[u ] =--------0 =-------0 (1 + y) (3)

uoc uoc

(el coeficiente cumple la condicion y << 1 y puede despreciarse en los calculos).

Un sistema densitometrico de alta precision (DMA 60 con dos camaras de muestra DMA 602 M, Anton Paar KG, Graz, Austria) que funcionaba segun el principio del tubo vibrante (Kratky O., Leopold H., Stabinger H. (1973): Se uso la determinacion del volumen espedfico parcial de protemas mediante la tecnica del oscilador mecanico, En: Methods in Enzymology (Ed. E. Grell), vol. 27, pags. 98-110, Academic Press, Londres) para determinar la densidad (p) de la disolucion de vesfculas. Se calcularon los volumenes parciales espedficos aparentes (pV) a partir de los datos de densidad usando la ecuacion:

pV

p - Po c

Po

[p]

(4)

donde el subrndice 0 se refiere de nuevo al disolvente de referencia y [p] = (p-p0)/(p0c) indica el incremento con la concentracion de la densidad. Se controlo la temperatura de las celulas a dentro de +0,02°C con un ultratermostato Lauda RK 8 CS (Lauda, Alemania).

La determinacion del volumen espedfico ademas del incremento de la concentracion con la velocidad del sonido permitio la estimacion de la compresibilidad aparente espedfica reducida, pk/P0, de las vesfculas, basandose en la siguiente ecuacion:

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9 = -2|ul - — + *Pv (5)

Po Po

donde Po es el coeficiente de la compresibilidad y po es la densidad de tampon (Sarvazyan 1991). El valor de ^k/Po indica la compresibilidad volumetrica de los liposomas en relacion con el tampon. El valor mas alto de ^k/Po significa una compresibilidad mayor (es decir, menos rigidez) de liposomas.

Con el fin de determinar la compresibilidad volumetrica espedfica de los liposomas, se midieron el incremento con la concentracion de la velocidad del ultrasonido, [u] y la densidad, p. Entonces, se determinaron el volumen espedfico, 9V y la compresibilidad aparente espedfica, ^k/Po por medio de ecuaciones (4,5).

La figura 4 demuestra que los liposomas de la presente invencion son sustancialmente ngidos en comparacion con otras formulaciones de liposomas y liposomas vados. Tal como se muestra en la figura 4, la compresibilidad espedfica (a la inversa de la rigidez) de los liposomas LSA es significativamente inferior que la de los liposomas vados obtenidos mediante las formulaciones convencionales de la tecnica anterior. La compresibilidad de los liposomas LSA es de alrededor de 0,70, mientras que la de los liposomas vados es de alrededor de 0,90. La compresibilidad espedfica de los liposomas KS y HU es significativamente diferente en 0,75. Este ejemplo demuestra que las propiedades mecanicas son sensibles a la formulacion y la presencia del farmaco dentro de los liposomas.

Ejemplo 3 -Analisis de la estabilidad de los liposomas

En las tablas 4 y 5 se ejemplifica la estabilidad de la formulacion de liposomas obtenida segun el ejemplo 1. La tabla 4 demuestra que los liposomas de la presente invencion son estables cuando se almacenan a 4 grados C al menos durante 36 meses, y la formulacion cumple todas las especificaciones necesarias.

Tabla 4 - Estabilidad a 4°C

: Espec. Base 1 mes 7 meses 12 meses 24 meses 36 meses

Aspecto: dispersion blanquecina conforme conforme conforme conforme conforme conforme

Alendronato (mg/ml): 0,5+0,05 0,49 0,53 0,54 0,51 0,52 0,52

Porcentaje de encapsulacion (%): >96 98% 98% 96 >98% >99% >99%

DSPC (mg/ml): 1,4-2,0 1,9 1,8 2 1,6 1,8 1,8

DSPG (mg/ml): 0,5-0,7 0,6 0,6 0,6 0,5 0,6 0,6

Col. (mg/ml): 0,5-0,7 0,55 0,59 0,56 0,58 0,6 0,61

razon farmaco:lfpido: 1:5,7+1,0 1;6,2 1;5,6 1;5,9 1;5,3 1;5,8 1;5,8

tamano de vesfcula (nm): diametro de 100 + 30 92 nm 92 nm 92 nm 92 nm 91 nm 91 nm

pH: 6,7-7,3 6,9 6,9 6,9 7 7 6,9

osmolalidad (mo/kg): 270-340 309 nd 317 316 312 312

La tabla 5 demuestra que los liposomas de la presente invencion son estables cuando se almacenan a 25 grados C al menos durante 7 meses, y la formulacion cumple todas las especificaciones necesarias.

Tabla 5 - Estabilidad a 25°C

: Espec. Base 1 mes 2 meses 7 meses

Aspecto: dispersion blanquecina conforme conforme conforme conforme

Alendronato (mg/ml): 0,5 + 0,05 0,49 0,52 0,51 0,51

Porcentaje de encapsulacion (%): >96 98% 98 >99 98

DSPC (mg/ml): 1,4-2,0 1,9 1,9 1,9 1,9

DSPG (mg/ml): 0,5-0,7 0,6 0,6 0,6 0,6

Col. (mg/ml): 0,5-0,7 0,55 0,59 0,58 0,57

razon farmacodpido: 1:5,7 + 1,0 01:06,0

tamano de vesfcula (nm): diametro de 100 + 30 92 nm 92 92 93

______________________________: 6,7-7,3 6,9 7 6,9 6,9

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| osmolalidad (mol/kg)__________| 270-340____________| 309 | nd | nd | 315 |

Ejemplo 4 -Analisis de la uniformidad de los liposomas

Se sometio a ensayo la uniformidad de la formulacion de liposomas usando el sistema de dimensionamiento de partfculas Nano zs de Malvern. Este procedimiento determina la uniformidad del tamano de vesfcula de la formulacion liposomica mediante dispersion de luz dinamica (DLS) y caracteriza la distribucion de tamano de partfculas suspendidas en medios lfquidos. Esta tecnica es sensible a una distribucion de tamano de partfcula en el intervalo de 10-1000 nm, y es util para un intervalo de partfculas incluyendo emulsiones de liposomas, nanopartfculas y polfmeros sinteticos. La tecnica puede usarse para proporcionar un diametro promedio de una preparacion de liposomas homogenea, as^ como una indicacion de la heterogeneidad de la formulacion. Tras normalizar el sistema de tamano de partfcula Nano-zs de Malvern de conformidad con las instrucciones de funcionamiento, se diluyeron en primer lugar muestras de liposomas de 0,5 mg/ml a 1/3 en PBS. Se confirmo la Xmax de UV a 600 nm de la disolucion diluida usando un espectrofotometro 2100pro UVNIS de Ultraspec. Se diluyo de nuevo la muestra de liposomas hasta que se logro un valor de densidad optica (D.O.) de 10 + 0,02. De nuevo, se confirmo que la Xmax de UV a 600 nm de la disolucion de segunda dilucion tema un valor de D.O. de 0,10 + 0,02. Entonces, se colocaron 1,0-1,5 ml de la muestra diluida en un tubo de cultivo, y se analizaron para determinar el tamano de vesfcula mediante el sistema de analisis de tamano de partfcula Nano-zs de Malvern. El analisis se llevo a cabo a temperatura ambiente (23°C + 2°C) a un angulo fijo de 173°, longitud de onda de laser de 633 nm. Se acumularon los datos para lograr 150-500 Kcps (kilocuentas por segundo).

La tabla 6 ilustra las mediciones de una formulacion obtenida segun esta invencion. El tamano promedio de liposoma es de 80,41 nm, con un PDI de 0,04.

Tabla 6

N.° de medicion: Tamano (nm) PDI

1: 80,28 0,042

2: 80,49 0,024

3: 80,29 0,052

4: 80,82 0,022

5: 80,69 0,041

6: 79,68 0,042

7: 80,57 0,043

8: 80,56 0,030

9: 80,33 0,028

Promedio: 80,41 0,04

Desviacion estandar: 0,330 0,010

%DER: 0,41 28,50

Se analizaron los liposomas HU, los liposomas de la tecnica anterior descritos en el ejemplo 2 anterior, para determinar la uniformidad de conformidad con el procedimiento descrito anteriormente. El tamano promedio Z de los liposomas HU fue de 176,5 nm.

Las figuras 5A y 5B ilustran de la distribucion de tamano de los liposomas obtenidos segun esta invencion y de los liposomas HU, respectivamente. La figura 5A muestra que la formulacion de liposomas de la invencion tiene un diametro medio de aproximadamente 88 nm, y el tamano de diametro oscila estrechamente entre 69 y 107 nm. En cambio, la figura 5B muestra que la formulacion de liposomas HU tiene un diametro medio de alrededor de 201 nm, teniendo los liposomas diametros de desde tan solo 80 nm hasta mas de 500 nm. El PDI de la formulacion en la figura 5A fue de 0,025. El PDI de la formulacion HU de la figura 5B fue de 0,118.

Claims

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3.

15 4.
5.

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6.

25 7.
8.

30
9.
10. 35
11.

40 12.
13.

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50

55 14.

60

REIVINDICACIONES

Liposoma que tiene un componente lipfdico y que encapsula un agente terapeutico, que tiene una razon en masa de dicho agente terapeutico con respecto a lfpidos de aproximadamente 1:5 a 1:8, en el que el componente lipfdico comprende DSPC, DSPG y colesterol en una razon molar de aproximadamente 3:1:2, y dicho liposoma tiene una compresibilidad menor de 0,70 ml/g.

Formulacion que comprende una pluralidad de liposomas, teniendo dichos liposomas un componente lipfdico y un agente terapeutico, en la que el componente lipfdico comprende DSPC, DSPG y colesterol en una razon molar de aproximadamente 3:1:2, y teniendo la formulacion un PDI menor de 0,07.

Liposoma segun la reivindicacion 1 o formulacion segun la reivindicacion 2, en donde el liposoma esta cargado negativamente.

Liposoma segun la reivindicacion 1 o formulacion segun la reivindicacion 2, en donde el liposoma tiene osmolalidad interna al liposoma en el intervalo de 340-440 osmol/kg.

Liposoma segun la reivindicacion 1 o formulacion segun la reivindicacion 2, en donde el liposoma tiene conductividad interna al liposoma en el intervalo de 13,5-17,5 ms/cm.

Liposoma segun la reivindicacion 1 o formulacion segun la reivindicacion 2, en donde el agente terapeutico es un bisfosfonato, que tiene preferiblemente un intervalo de concentracion de bisfosfonato de 0,5 a 5 mg/ml dentro del liposoma.

Liposoma segun la reivindicacion 1 o formulacion segun la reivindicacion 2, en donde el liposoma tiene un pH liposomico interno de aproximadamente 6,9.

Formulacion segun la reivindicacion 2, en la que los liposomas tienen un tamano promedio de aproximadamente 80 + 5 nm.

Formulacion segun la reivindicacion 2, en la que al menos el 96% del agente terapeutico dentro de dicha formulacion esta encapsulado.

Formulacion segun la reivindicacion 2, que tiene una razon en masa de dicho agente terapeutico con respecto a dicho componente lipfdico de aproximadamente 1:5 a 1:8.

Formulacion segun la reivindicacion 2, en la que los liposomas tienen una compresibilidad no mayor de 0,70 ml/g.

Formulacion segun la reivindicacion 2, en la que el PDI es de entre 0,02 y 0,05.

Metodo de fabricacion de una formulacion terapeutica que tiene una pluralidad de liposomas, comprendiendo dicho metodo las siguientes etapas:

(a) mezclar una disolucion que contiene un agente terapeutico con una disolucion que contiene lfpidos que comprende DSPC, DSPG y colesterol en una razon molar de aproximadamente 3:1:2 para formar vesfculas de manera que la razon en masa de dicho agente terapeutico con respecto a lfpidos esta en el intervalo de aproximadamente 1:5 a 1:8,

(b) extruir, en donde dicha extrusion consiste esencialmente en extruir repetidamente las vesfculas a traves de un unico filtro multiples veces, teniendo dicho filtro un tamano de poro de aproximadamente 100 nm, y

(c) someter las vesfculas a ultrafiltracion.

Formulacion que comprende una pluralidad de liposomas que se componen de una cantidad de componente lipfdico y agente terapeutico, comprendiendo dicho componente lipfdico DSPC, DSPG y colesterol en una razon molar de aproximadamente 3:1:2, y la razon en masa de dicho agente terapeutico con respecto a lfpidos esta en el intervalo de aproximadamente 1:5 a 1:8, fabricandose dicha formulacion mediante las siguientes etapas:

(a) mezclar una disolucion que contiene un agente terapeutico con una disolucion que contiene lfpidos que comprende DSPC, DSPG y colesterol en una razon molar de aproximadamente 3:1:2 para formar vesfculas de manera que la razon en masa de dicho agente terapeutico con respecto a lfpidos esta en el intervalo de aproximadamente 1:5 a 1:8,

(b) extruir las vesfculas, lo que consiste esencialmente en extruir repetidamente a traves de un unico filtro

5 15.

multiples veces, teniendo dicho filtro un tamano de poro de aproximadamente 100 nm, y (c) someter las vesfculas a ultrafiltracion. Metodo segun la reivindicacion 13, que comprende ademas la etapa de: (d) diluir la formulacion con solucion salina tamponada con fosfato para formar una concentracion final de agente terapeutico de la formulacion terapeutica.
16. 10

Metodo segun la reivindicacion 13, en el que la formulacion terapeutica tiene un pH de aproximadamente 6,9.
17.

Metodo segun la reivindicacion 13 o formulacion segun la reivindicacion 14, en donde dicho disolvente lipfdico comprende etanol, t-butanol y agua; y en donde preferiblemente la razon en volumen de etanol, t- butanol y agua es de 77/77/6.
15 18.

Metodo segun la reivindicacion 13 o formulacion segun la reivindicacion 14, en donde la extrusion de la etapa (b) se lleva a cabo entre 55° - 75°C.
19. 20

Metodo segun la reivindicacion 13 o formulacion segun la reivindicacion 14, en donde la extrusion de la etapa (b) se realiza a una presion de entre 60-90 psi.
20.

Metodo segun la reivindicacion 13 o formulacion segun la reivindicacion 14, en donde la extrusion de la etapa (b) se repite 10-18 veces antes de la ultrafiltracion.

CM LO CM

Formulacion segun la reivindicacion 14, formada ademas con la etapa de: (d) diluir la formulacion con solucion salina tamponada con fosfato para formar una concentracion final de dicha formulacion.
22.

Formulacion segun la reivindicacion 14, en la que la formulacion tiene un pH de aproximadamente 6,9.

CO CM O CO

Formulacion segun la reivindicacion 14, donde la formulacion tiene un PDI menor de 0,07.