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ES2604581T3 - Modulación de la diferenciación de citoblastos y células progenitoras, ensayos y usos de los mismos - Google Patents

Modulación de la diferenciación de citoblastos y células progenitoras, ensayos y usos de los mismos Download PDF

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ES2604581T3
ES2604581T3 ES03721642.1T ES03721642T ES2604581T3 ES 2604581 T3 ES2604581 T3 ES 2604581T3 ES 03721642 T ES03721642 T ES 03721642T ES 2604581 T3 ES2604581 T3 ES 2604581T3
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ES
Spain
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cells
cytoblasts
dione
amino
differentiation
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES03721642.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Robert J. Hariri
David I. Stirling
Kyle W. H. Chan
Laure A. Moutouh-De Parseval
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Celgene Corp
Signal Pharmaceuticals LLC
Clarity Acquisition II LLC
Original Assignee
Celgene Corp
Signal Pharmaceuticals LLC
Anthrogenesis Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

Un método para suprimir la generación de BFU-E y CFU-E mientras se acrecienta la generación de CFUGM y se potencia la producción de CFU-Total, comprendiendo dicho método: poner en contacto los citoblastos o células progenitoras de mamífero in vitro con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona en condiciones en que dichos citoblastos o células progenitoras se diferencien; y en el que los citoblastos o células progenitoras de mamífero son CD34+ o CD133+.

Description

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DESCRIPCION
Modulacion de la diferenciacion de citoblastos y celulas progenitoras, ensayos y usos de los mismos
Esta solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes provisionales de EE.UU. n° 60/372.348, presentada el 12 de abril de 2002; 60/437.348, presentada el 31 de diciembre de 2002 y 60/437.350, presentada el 31 de diciembre de 2002.
1. introducciOn
La presente invencion se refiere a metodos de modulacion de la diferenciacion de citoblastos y/o celulas progenitoras de mairnfero. Los metodos de la invencion pueden emplearse para regular y controlar la diferenciacion y maduracion de citoblastos y celulas progenitoras de mai^ero, particularmente de ser humano, a lo largo de linajes celulares y tisulares espedficos. Los metodos de la invencion se refieren al uso de ciertas moleculas organicas pequenas para modular la diferenciacion de poblaciones de citoblastos a lo largo de linajes celulares y tisulares espedficos, y en particular a la diferenciacion de citoblastos de tipo embrionario originados en una placenta postparto, o a la modulacion de celulas progenitoras hematopoyeticas tempranas a lo largo de una ruta de diferenciacion espedfica, particularmente una ruta de diferenciacion granulodtica. La invencion se refiere tambien al uso de estas moleculas organicas para modular la diferenciacion de linajes particulares de celulas progenitoras, tales como celulas progenitoras CD34+, CD45+ y CD133+. La invencion se refiere tambien a aspectos temporales del desarrollo de celulas progenitoras y a modelos in vitro basados en estos aspectos temporales. La invencion se refiere ademas al uso de estas celulas moduladas en metodos profilacticos y terapeuticos, incluyendo en composiciones farmaceuticas de dichas celulas y/o compuestos organicos pequenos. Finalmente, la invencion se refiere al uso de dichas celulas diferenciadas en trasplantes y otros tratamientos medicos.
2. ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Hay un considerable interes por la identificacion, aislamiento y generacion de citoblastos y celulas progenitoras humanos. Los citoblastos son celulas precursoras totipotenciales o pluripotenciales capaces de generar una variedad de linajes celulares maduros, y las celulas precursoras son celulas capaces de generar celulas de linajes celulares espedficos. Estas capacidades sirven como base para la diferenciacion y especializacion celulares necesarias para el desarrollo de organos y tejidos.
El reciente exito al trasplantar citoblastos y celulas progenitoras ha proporcionado nuevas herramientas clfnicas para reconstituir y/o suplementar la medula osea despues de mieloablacion debida a enfermedad, exposicion a productos qmmicos toxicos y/o radiacion. Existen evidencias adicionales que demuestran que los citoblastos pueden emplearse para repoblar muchos, si no todos, los tejidos y restaurar la funcionalidad fisiologica y anatomica. La aplicacion de citoblastos en ingeniena de tejidos, suministro de terapia genica y terapia celular esta tambien avanzando rapidamente.
Se han caracterizado muchos tipos diferentes de citoblastos progenitores de marnffero. Por ejemplo, son conocidos los citoblastos embrionarios, celulas germinales embrionarias, citoblastos adultos o citoblastos o celulas progenitoras comprometidos. Ciertos citoblastos no solo se han aislado y caracterizado, sino que se han cultivado tambien en condiciones que permiten la diferenciacion en un grado limitado. Sin embargo, permanece el problema basico; es decir, ha sido diffcil controlar o regular la diferenciacion de citoblastos y celulas progenitoras, tales como celulas progenitores hematopoyeticas. Actualmente, los metodos existentes de modulacion de la diferenciacion de estas celulas son toscos y no regulables, de tal modo que las celulas se diferencian en tipos celulares indeseados en momentos indeseados. Ademas, el rendimiento de las celulas de producto es tfpicamente bajo.
Ademas, es problematico obtener numeros suficientes de citoblastos humanos con fines de terapia o investigacion. El aislamiento de la poblacion de citoblastos o celulas progenitoras que aparecen normalmente en tejidos adultos ha sido tecnicamente diffcil y costoso, debido en parte a la cantidad limitada de citoblastos o celulas progenitoras encontrados en la sangre o tejido, y a la incomodidad significativa implicada en la obtencion de aspirados de medula osea. En general, recolectar citoblastos o celulas progenitoras de fuentes alternativas en cantidades adecuadas con fines de terapia e investigacion es generalmente laborioso implicando, p.ej., recoleccion de celulas o tejidos de un sujeto donante o paciente, cultivo y/o propagacion de las celulas in vitro, diseccion, etc. Con respecto a los citoblastos en particular, la adquisicion de estas celulas a partir de embriones o tejido fetal, incluyendo abortos, ha planteado problemas religiosos y eticos. La creencia ampliamente mantenida de que el embrion y feto humanos constituyen vida independiente ha dado lugar a restricciones gubernamentales sobre el uso de dichas fuentes para todos los fines, incluyendo la investigacion medica. Son por lo tanto deseables fuentes alternativas que no requieran el uso de celulas adquiridas a partir de tejido embrionario o fetal para un progreso adicional en el uso de citoblastos clmicamente. Sin embargo, hay pocas fuentes alternativas viables de citoblastos o celulas progenitoras, particularmente citoblastos o celulas progenitoras humanos, y por tanto el suministro es limitado.
Hu et al. (documento WO00/73421 titulado "Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells", publicado el 7 de diciembre de 2000), divulga celulas epiteliales amnioticas humanas derivadas de placenta en el parto que se afslan, cultivan, crioconservan para uso futuro o se inducen a diferenciar.
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Segun Hu et al., se recolecta la placenta inmediatamente despues del parto y se separa la membrana amniotica del corion, p.ej. mediante diseccion. Se afslan las celulas epiteliales amnioticas de la membrana amniotica segun tecnicas de aislamiento celular estandares. Las celulas divulgadas pueden cultivarse en diversos medios, expandirse en cultivo, crioconservarse o inducirse a diferenciar. Hu et al. divulga que las celulas epiteliales amnioticas son multipotenciales (y posiblemente pluripotenciales) y pueden diferenciarse en tejidos epiteliales tales como epitelio de la superficie cornea o epitelio vaginal. El inconveniente de dichos metodos es, sin embargo, que son laboriosos y el rendimiento de citoblastos es muy bajo.
Los metodos actualmente disponibles para la expansion ex vivo de poblaciones celulares son tambien laboriosos. Por ejemplo, Emerson et al. (Emerson et al., patente de EE.UU. n° 6.326.198 titulada "Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism. GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells", expedida el 4 de diciembre de 2001) divulga metodos y condiciones de medio de cultivo para el cultivo ex vivo de la division de citoblastos humanos y/o la optimizacion de citoblastos progenitores hematopoyeticos humanos. Segun los metodos divulgados, se cultivan los citoblastos o celulas progenitoras humanos derivados de medula osea en un medio de cultivo lfquido que se reemplaza, preferiblemente se perfunde continua o periodicamente, a una tasa de 1 ml de medio por ml de cultivo durante un periodo de aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas. Se retiran los productos metabolicos y se reponen los nutrientes agotados manteniendo el cultivo en condicione fisiologicamente aceptables.
Kraus et al. (Krans et al., patente de EE.UU. n° 6.338.942, titulada “Selective expansion of target cell populations", expedida el 15 de enero de 2002) divulga que una poblacion diana predeterminada de celulas puede expandirse selectivamente introduciendo una muestra de partida de celulas de sangre de cordon o sangre periferica en un medio de crecimiento, causando que las celulas de la poblacion celular diana se dividan, y poniendo en contacto las celulas en el medio de crecimiento con un elemento de seleccion que comprende moleculas de union con afinidad espedfica (tales como un anticuerpo monoclonal de CD34) por una poblacion predeterminada de celulas (tales como celulas CD34), para seleccionar celulas de la poblacion diana predeterminada de las demas celulas del medio de crecimiento.
Rodgers et al. (patente de EE.UU. n° 6.335.195 titulada “Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation", expedida el 1 de enero de 2002) divulga metodos para el cultivo ex vivo de citoblastos hematopoyeticos y mesenquimaticos y la induccion de la proliferacion y diferenciacion celular espedfica de linaje mediante el crecimiento en presencia de angiotensinogeno, angiotensina I (AI), analogos de AI, fragmentos de AI y analogos de los mismos, angiotensina II (AII), analogos de AII, fragmentos de AII o analogos de los mismos o todos los agonistas de receptor de tipo 2 AT2, solos o en combinacion con otros factores de crecimiento y citocinas. Los citoblastos derivan de medula osea, sangre periferica o sangre de cordon umbilical. El inconveniente de dichos metodos es, sin embargo, que dichos metodos ex vivo para inducir la proliferacion y diferenciacion de citoblastos llevan tiempo, como se discute anteriormente, y dan como resultado tambien un bajo rendimiento de citoblastos.
Los citoblastos y celulas progenitoras tienen el potencial de usarse en el tratamiento de una variedad de trastornos, incluyendo malignidades, errores congenitos de metabolismo, hemoglobinopatfas e inmunodeficiencias. Ha sido un campo de uso e investigacion principal que implica citoblastos de sangre de cordon o placenta el uso de dichas celulas para generar pequenas cantidades de celulas para trasplantes de medula osea y otros relacionados. Sin embargo, hasta la fecha, nadie ha descrito un metodo de produccion de numeros sustanciales de citoblastos o celulas progenitoras, tales como celulas progenitoras CD34+ o CD133+ humanas. Unos altos numeros de las ultimas celulas, en particular, facilitanan metodos de tratamiento que usan celulas progenitoras. Los metodos de la invencion divulgados en la presente memoria abordan esta necesidad.
Los retinoides, tales como vitamina A y acido retinoico (RA), son conocidos por afectar a la diferenciacion de citoblastos. Por ejemplo, se ha mostrado que el acido retinoico inhibe la proliferacion de citoblastos hematopoyeticos comprometidos anormalmente (leucemia mielogenosa cronica) (Nadkarni et al. 1984, Tumori 70: 503-505) e induce la diferenciacion y perdida de potencial de autorrenovacion en celulas de leucemia promielodtica (Melchner et al., 1985, Blood 66(6): 1469-1472). Se ha mostrado tambien que el acido retinoico induce la diferenciacion de neuronas a partir de citoblastos embrionarios y reprime la diferenciacion mesodermica espontanea (Slager et al., Dev. Genet. 1993; 14(3): 212-24, Ray et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(30): 18702-18708). Se ha mostrado tambien que el acido retinoico induce la diferenciacion de precursores de celulas germinales transformadas (Damjanov et al., 1993, Labor. Investig. 68(2): 220-232), precursores de celulas placentarias (Yan et al., 2001, Devel. BioI. 235: 422-432) y precursores de celulas endoteliales (Hatzopoulos et al., 1998, Development 125: 1457-1468). Sin embargo, el efecto de los retinoides sobre la diferenciacion tiene que entenderse todavfa completamente de tal modo que pueda usarse como medio regulable de control de la diferenciacion de citoblastos.
Se han estudiado los efectos de analogos de acido folico, tales como aminopterina y ametopterina (metotrexato), sobre la diferenciacion de los citoblastos hematopoyeticos. Los analogos de acido folico se usan como agentes quimioterapeuticos en anemias linfoblasticas agudas y otros trastornos de la proliferacion sangumea y canceres, y se ha mostrado que efectuan la diferenciacion de citoblastos destruyendo ciertas poblaciones de citoblastos (DeLoia et al., 1998, Human Reproduction 13(4): 1063-1069) y, por tanto, no senan una herramienta eficaz para regular la diferenciacion de grandes cantidades de citoblastos para administracion a un paciente.
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Se ha mostrado tambien que varias citocinas, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7 e IL-11, as^ como protemas tales como eritropoyetina, ligando Kit, M-CSF y GM-CSF, dirigen la diferenciacion de citoblastos en tipos celulares espedficos en el linaje hematopoyetico (Dushnik-Levinson et al., 1995, Biol. Neonate 67: 77-83), sin embargo, estos procesos no se comprenden bien y siguen siendo demasiado toscos e imprecisos para permitir un medio regulable de control de la diferenciacion de citoblastos.
Hasta la fecha, nadie ha descrito el uso de compuestos tales como los compuestos inmunomoduladores discutidos a continuacion en la diferenciacion de citoblastos o celulas precursoras.
El documento WO 03/086373 A divulga un metodo de identificacion de moduladores de la angiogenesis que utiliza celulas humanas. Se describen 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona como compuestos antiangiogenicos preferidos.
El documento WO 01/87307 A describe una composicion que comprende talidomida que puede usarse en el tratamiento o la prevencion de cancer.
Dredge et al. (Keith Dredge, J. Blake Marriott, Stephen M. Todryk, George W. Muller, Roger Chen, David I. Stirling y Angus G. Dalgleish; “Protective Antitumor Immunity Induced by a Costimulatory Thalidomide Analog in Conjunction with Whole Tumor Cell Vaccination Is Mediated by Increased Thl-Type Immunity”, The Journal of Immunology, 2002, 168: 4914-4919) demostraron que la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona puede cebar respuestas de tipo Th-1 protectoras duraderas espedficas de tumor in vivo.
En particular, nadie ha demostrado el uso de los compuestos inmunomoduladores discutidos a continuacion para modular la diferenciacion de celulas progenitoras, tales como celulas progenitoras CD34+, lejos de un linaje de celulas dendnticas, una capacidad util en el fomento de la inmunotolerancia a trasplantes. Igualmente, nadie ha descrito el uso de los compuestos descritos en la presente memoria para expandir las poblaciones de celulas progenitoras para producir una composicion farmaceutica que contenga dichas celulas. Dichos cultivos de celulas progenitoras expandidas senan utiles en el tratamiento de la enfermedad del injerto frente al hospedador y el desarrollo de inmunotolerancia. Debido a que el control de la diferenciacion de citoblastos y celulas precursoras puede producir poblaciones celulares que son terapeuticamente utiles, hay una necesidad de la capacidad de controlar y regular la diferenciacion de celulas de linaje celular dendntico mieloide, o celulas progenitoras tempranas tales como celulas progenitoras CD34+ o CD133+ humanas para la produccion controlada de celulas dendnticas y/o granulocitos.
3. COMPENDIO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona metodos de modulacion de la diferenciacion de citoblastos o celulas progenitoras de mairnfero, particularmente de ser humano. En particular, los metodos de la invencion pueden emplearse para regular y controlar la diferenciacion y maduracion de citoblastos humanos a lo largo de linajes celulares y tisulares espedficos. La invencion engloba el uso de compuestos organicos pequenos inmunomoduladores, mas preferiblemente isoindolinas aminosustituidas, particularmente los compuestos 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona para efectuar dicha regulacion y control. La invencion contemplaba ademas la administracion de estos compuestos a celulas progenitoras en momentos espedficos para modular su diferenciacion de modos espedficos.
La presente invencion proporciona un metodo para suprimir la generacion de BFU-E y CFU-E mientras que acrecienta la generacion de CFU-GM y potencia la produccion de CFU-total, comprendiendo dicho metodo: poner en contacto citoblastos o celulas progenitoras de mai^ero in vitro con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3- diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, en condiciones en que se diferencien dichos citoblastos o celulas progenitoras; y en el que los citoblastos o celulas progenitoras son CD34+ o CD133+.
La invencion proporciona tambien un compuesto seleccionado de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3- diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona para uso en un metodo de tratamiento de un individuo necesitado de granulocitos, en el que dicho metodo comprende poner en contacto in vitro citoblastos o celulas progenitoras de marnffero CD34+ o CD133+ con dicho compuesto en condiciones en que se diferencien dichas celulas para suprimir la generacion de BFU-E y CFU-E, mientras que acrecienta la generacion de CFU-GM y potencia la produccion de CFU-total, seguido del trasplante directo de las celulas diferenciadas a dicho individuo.
Los metodos de la invencion engloban la regulacion de la diferenciacion de un citoblasto o celula progenitora en un linaje celular espedfico incluyendo, pero sin limitacion, un linaje mesenquimatico, hematopoyetico, adipogenico, hepatogenico, neurogenico, gliogenico, condrogenico, vasogenico, miogenico, condrogenico u osteogenico. En una realizacion particular, los metodos de la invencion engloban la regulacion de la diferenciacion de citoblastos en una celula de un linaje hematopoyetico.
La invencion engloba tambien la modulacion de una celula comprometida con un tipo celular espedfico, p.ej., una celula mesenquimatica, celula hematopoyetica, adipocito, hepatocito, neuroblasto, glioblasto, condrocito, progenitor de celula endotelial (EC), miocito, condrocito u osteoblasto. En realizaciones espedficas, la invencion engloba la modulacion de una celula progenitora hematopoyetica comprometida a un eritrocito, trombocito o leucocito (globulo
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blanco) tal como un neutrofilo, monocito, macrofago, eosinofilo, basofilo, mastocito, linfocito B, linfocito T o celula plasmatica.
En otra realizacion, los metodos de la invencion se refieren a la modulacion de la diferenciacion de citoblastos en celulas de linaje hematopoyetico, en particular los linajes hematopoyeticos CD34+, CD133+ y CD45+, y a metodos de produccion de composiciones farmaceuticas profilactica o terapeuticamente beneficiosas que contienen dichas celulas. En otra realizacion espedfica, los metodos de la invencion se refieren a la modulacion de la diferenciacion de celulas progenitoras tempranas en celulas de linaje celular dendntico o linaje granulocftico, linaje endotelial o linaje cardiomiocftico.
En otra realizacion, la invencion proporciona metodos de regulacion de la diferenciacion de una celula progenitora en un linaje hematopoyetico, particularmente un linaje celular dendntico o granulocftico, linaje endotelial, linaje neural o linaje cardiomiocftico. En una realizacion espedfica, dicha celula progenitora es una celula CD34+ o CD133+. Dichas regulacion se logra poniendo en contacto las celulas progenitoras durante el cultivo con un compuesto de la invencion. Dicho compuesto es 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona. La memoria descriptiva divulga tambien que el compuesto es un inhibidor de la actividad de TNF-a. Se divulga que dicho compuesto es un compuesto inmunomodulador como se describe en la presente memoria o talidomida o una isoindolina aminosustituida.
En otra realizacion espedfica, los metodos de la invencion engloban la supresion de la diferenciacion de celulas progenitoras en una celula dendrftica. En otra realizacion espedfica, la invencion proporciona un metodo para la modulacion de la diferenciacion de celulas progenitoras durante los seis primeros dfas de cultivo, produciendo un cultivo expandido de dicha celulas progenitoras. En otra realizacion, los metodos de la invencion engloban la promocion del desarrollo de celulas progenitoras tempranas a un granulocito, que puede ser util para combatir infecciones. El aumento de los progenitores comprometidos con el linaje granulocftico (celulas CD15+) puede ser de uso potencial en la reduccion de la neutropenia y sus complicaciones infecciosas subsiguientes que representan la toxicidad limitante de dosis mas comun de la quimioterapia del cancer. En otra realizacion, los metodos de la invencion pueden usarse para suprimir la diferenciacion de celulas dendrfticas, lo que es util para mitigar los efectos de la enfermedad del injerto frente al hospedador.
Las celulas progenitoras de la invencion, moduladas por un compuesto de la invencion, son utiles para trasplantes (concretamente, reconstitucion hematopoyetica) y pueden usarse en medicina regenerativa como fuente renovable de celulas y tejidos de reemplazo (tales como celulas pancreaticas, cardiacas, hepaticas, de rinon, de hugado, de cerebro, de vejiga, intestinales o musculares) para tratar senescencia normal, lesiones o enfermedades tales como enfermedad cardiaca, apoplejfa, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer. Las celulas seran tambien utiles en la determinacion de las rutas bioqmmicas intracelulares que median la accion de los compuestos de la invencion. Estas celulas pueden ser tambien utiles para el cribado de nuevos farmacos y toxinas, por ejemplo para determinar farmacos anticancerosos potenciales, para entender los ongenes de defectos de nacimiento, etc.
Los metodos de la invencion pueden usarse para suprimir espedficamente la generacion de globulos rojos o colonias eritropoyeticas (BFU-E y CFU-E), mientras que tanto acrecientan la generacion de colonias formadoras de leucocitos y plaquetas (CFU-GM) como potencian la produccion de unidades formadoras de colonias totales. Los metodos de la invencion pueden usarse no solo para regular la diferenciacion de citoblastos y celulas progenitoras tales como celulas progenitoras CD34+, sino que pueden usarse tambien para estimular la tasa de formacion de colonias, proporcionando beneficios significativos al trasplante de citoblastos hematopoyeticos al mejorar la velocidad de injerto de medula osea.
Puede usarse cualquier citoblasto de mamfero de acuerdo con los metodos de la invencion incluyendo, pero sin limitacion, citoblastos aislados de sangre de cordon, placenta y otras fuentes. Los citoblastos pueden aislarse de cualquier especie de mairftfero, p.ej., raton, rata, conejo, conejillo de Indias, perro, gato, cerdo, oveja, vaca, caballo, mono, etc., mas preferiblemente un ser humano. Los citoblastos pueden incluir celulas pluripotentes, concretamente, celulas que tienen una versatilidad de diferenciacion completa, que son autorrenovables y que pueden permanecer durmientes o quiescentes en el tejido. Los citoblastos pueden incluir tambien celulas multipotentes o celulas progenitoras comprometidas. En una realizacion preferida, la invencion utiliza citoblastos que son citoblastos viables quiescentes pluripotentes que existen en, o se producen despues por, la placenta a termino, es decir, dichas celulas pueden recuperarse despues de un nacimiento exitoso y expulsion de placenta, desangramiento y perfusion de la placenta, dando como resultado la produccion y recuperacion del orden de mil millones de celulas nucleadas, que procuran de 50 a 100 millones de citoblastos multipotentes y pluripotentes. Se hace referencia a dichas celulas en la presente memoria como citoblastos placentarios humana o citoblastos de tipo embrionario.
En una realizacion particular de la invencion, se exponen las celulas, por ejemplo celulas endogenas de medula osea o de una placenta perfundida postparto incluyendo, pero sin limitacion, citoblastos de tipo embrionario, celulas progenitoras tales como celulas CD34+ o CD133+, celulas pluripotentes y celulas multipotentes, a los compuestos de la invencion y se inducen a diferenciar. Las celulas endogenas pueden propagarse in vitro. En otra realizacion, las celulas endogenas pueden recogerse de la placenta y del medio de cultivo y cultivarse in vitro en condiciones apropiadas y durante un tiempo suficiente para inducir la diferenciacion en el tipo o linaje celular deseado.
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En otra realizacion de la invencion, los citoblastos o celulas progenitoras derivan de otras fuentes tales como sangre de cordon, sangre periferica o sangre de adulto, y se exponen a los compuestos de la invencion y se inducen a diferenciar. En una realizacion preferida, se realiza la diferenciacion in vitro en condiciones apropiadas y durante un tiempo suficiente para inducir la diferenciacion en el linaje o tipo celular deseado. Los compuestos de la invencion se usan en los medios de diferenciacion/cultivo mediante adicion, generacion in situ o de cualquier otra manera que permita el contacto de los citoblastos o celulas progenitoras con los compuestos de la invencion.
Se ha descubierto que el momento de la administracion de los compuestos de la invencion tiene un profundo impacto sobre la diferenciacion de las celulas progenitoras CD34+. Por tanto, en una realizacion de la invencion, la diferenciacion de celulas progenitoras CD34+ en celulas dendnticas se retarda o suprime mediante un metodo que comprende poner en contacto la celula progenitora el primer dfa de cultivo con un compuesto de la invencion. En otra realizacion, se reduce o previene el desarrollo de celulas CD1a+ a partir de celulas progenitoras CD34+ mediante un metodo que comprende poner en contacto dichas celulas progenitoras con un compuesto de la invencion el primer dfa de cultivo. En otra realizacion, se aumenta la persistencia de una poblacion de celulas CD1a+ derivadas de celulas progenitoras CD34+ poniendo en contacto dichas celulas progenitoras con un compuesto de la invencion despues de cultivar dichas celulas progenitoras durante seis dfas en ausencia de dicho compuesto.
La presente invencion engloba tambien metodos de modulacion de la diferenciacion de celulas progenitoras tempranas, tales como celulas CD34+ y CD133+ humanas, que comprenden poner en contacto las celulas progenitoras en diversos momentos durante las fases proliferativa y diferenciativa con uno o mas de los compuestos de la invencion. Por tanto, en una realizacion, la invencion engloba un metodo de modulacion de la diferenciacion de las celulas progenitoras que comprende poner en contacto dichas celulas con uno o mas compuestos de la invencion el primer dfa de cultivo solo. En otra realizacion, se ponen en contacto dichas celulas con dicho compuesto o compuestos en una dosis cualquier dfa entre el primer dfa y el duodecimo dfa de cultivo. En otra realizacion, se ponen en contacto dichas celulas al menos dos veces con dicho compuesto o compuestos, en dfas diferentes, entre los dfas 0-12 inclusive. En aun otra realizacion, se ponen en contacto dichas celulas con uno o mas compuestos dos veces al dfa, una vez al dfa o una vez cada dos dfas durante las fases proliferativa y/o de diferenciacion. En otra realizacion, se efectua dicho contacto in vitro. En aun otra realizacion, se efectua dicho contacto in vivo en un sujeto. En una realizacion mas espedfica, dicho sujeto es un ser humano, un mairnfero no humano, un ave o un reptil.
En suma, la exposicion de citoblastos o celulas progenitoras endogenos o exogenos que pueden cultivarse en una placenta perfundida postparto a compuestos de la invencion puede ocurrir mientras se cultivan las celulas en la placenta, o preferiblemente, puede ocurrir in vitro despues de recuperar y retirar las celulas de la placenta.
La memoria descriptiva divulga el uso de compuestos que tienen actividad de TNF-a como moduladores del desarrollo de citoblastos y/o celulas progenitoras. En realizaciones espedficas, los compuestos son compuestos inmunomoduladores tales como las clases de compuestos conocidos como IMID™, incluyendo pero sin limitacion analogos de talidomida, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona (Celgene Corp., Warren, NJ) y 3-(4- amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona (Celgene Corp, Warren, NJ).
La memoria descriptiva divulga tambien el trasplante de citoblastos o celulas progenitoras pretratados para tratar o prevenir la enfermedad. En una realizacion, se administra tambien a un paciente necesitado de trasplante un compuesto de la invencion antes, durante y/o despues del trasplante.
La memoria descriptiva divulga ademas el uso de una celula progenitora o tipo de celula espedfico producido en un metodo de la invencion. En otras palabras, la memoria descriptiva divulga el uso de leucocitos, granulocitos o celulas dendnticas elaborados a partir de la diferenciacion de un progenitor hematopoyetico, siempre que dicha diferenciacion del progenitor este modulada o regulada usando un compuesto de la invencion.
En otras realizaciones, la invencion engloba un citoblasto y un compuesto de molecula pequena de la invencion para uso en el control o regulacion de citoblastos in vivo mediante la administracion tanto de un citoblasto como de un compuesto de molecula pequena de la invencion a un paciente necesitado de ello.
En una realizacion, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende celulas progenitoras CD34+ o CD133+ que se han puesto en contacto con un compuesto de la invencion, particularmente uno que inhibe la actividad de TNF-a, en los seis primeros dfas de cultivo, en condiciones que promuevan la proliferacion y diferenciacion de dichas celulas progenitoras, y un portador farmaceuticamente aceptable. En una realizacion espedfica, la composicion farmaceutica incluye celulas que se han recogido y crioconservado despues de seis dfas de cultivo. En otra realizacion espedfica, las celulas de la composicion farmaceutica son celulas CD34+CD38'CD34' o CD34+CD38'CD34+. En otra realizacion espedfica, el compuesto con el que se ponen en contacto las celulas es un compuesto inmunomodulador de la invencion, o talidomida o un analogo de talidomida. En otra realizacion espedfica, el compuesto con el que se ponen en contacto las celulas es 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona.
En otra realizacion, la invencion proporciona tambien un metodo para preparar una composicion farmaceutica que comprende poner en contacto celulas progenitoras CD34+ o CD133+ con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, en el que dichas celulas
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progenitoras se cultivan durante seis dfas en un medio de cultivo y en condiciones que permitan la proliferacion y diferenciacion de dichas celulas progenitoras; recoger dichas celulas despues de seis dfas de cultivo y combinar dichas celulas con un portador farmaceuticamente aceptable. En una realizacion espedfica de este metodo, se efectua dicha puesta en contacto el primer dfa de cultivo. En otra realizacion espedfica de este metodo, se efectua dicha puesta en contacto al menos dos veces durante dichos seis d^as de cultivo. La memoria descriptiva divulga tambien que dicho compuesto es un compuesto inmunomodulador pequeno de la invencion. En aun otra realizacion espedfica de este metodo, se han aislado dichas celulas progenitoras de otras celulas sangumeas antes de dicho cultivo. En otra realizacion espedfica de este metodo, dicho medio de cultivo contiene adicionalmente GM-CSF y TNF -a. En una realizacion mas espedfica de este metodo, dicha 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3- diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona esta presente a una concentracion de entre 0,1 y 10,0 |jM. En otra realizacion mas espedfica de este metodo, dicha 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-
1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona esta presente a una concentracion de 1,0 jM. En otra realizacion espedfica de este metodo, dichas celulas se crioconservan despues de dicha recogida.
La invencion proporciona ademas 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona para uso en un metodo para expandir una poblacion de celulas progenitoras en un sujeto mairnfero, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas progenitoras CD34+ o CD133+ y cualquiera de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona a dicho sujeto mamffero receptor. En una realizacion espedfica de este metodo, se diferencian dichas celulas progenitoras en el sujeto mamffero receptor. En otra realizacion espedfica de este metodo, se administran dichas celulas progenitoras a dicho sujeto en una preparacion celular que esta sustancialmente exenta de globulos rojos. En otra realizacion espedfica de este metodo, se administran dichas celulas progenitoras al sujeto mamffero receptor en una preparacion celular que comprende celulas de medula osea, celulas de placenta, celulas de sangre de cordon o PbMc. En otra realizacion espedfica de este metodo, se administran dichas celulas progenitoras al sujeto mam^era receptor junto con un portador. En otra realizacion espedfica de este metodo, dicha celula progenitora es una celula progenitora CD34+CD133+. En otra realizacion espedfica de este metodo, las celulas progenitoras expresan material genetico incorporado de interes.
La presente invencion proporciona tambien celulas que se producen mediante los metodos anteriores que son utiles como composiciones farmaceuticas.
En aun otras realizaciones, la invencion engloba metodos de acondicionamiento de citoblastos o celulas progenitoras, por ejemplo celulas progenitoras CD34+, despues de crioconservacion y descongelacion, para contrarrestar los efectos daninos de la crioconservacion y exposicion a crioconservantes sobre los citoblastos. En ciertas realizaciones, la invencion proporciona metodos de acondicionamiento de citoblastos despues de crioconservacion y descongelamiento, para contrarrestar los efectos daninos de la exposicion a crioconservantes (p.ej., DMSO) sobre la capacidad proliferativa y migratoria de los citoblastos.
3.1. DEFINICIONES
Como se usa en la presente memoria, el termino “biorreactor” hace referencia a un sistema ex vivo para propagar celulas, producir o expresar materiales biologicos y hacer crecer o cultivar tejidos celulares, organoides, virus, protemas, polinucleotidos y microorganismos.
Como se usa en la presente memoria, “celulas DC” hace referencia a celulas dendnticas.
Como se usa en la presente memoria, “celula progenitora temprana” significa una celula progenitora CD34+, una celula progenitora CD133+ o el equivalente de mai^ero, ave o reptil de cualquiera.
Como se usa en la presente memoria, el termino “citoblasto embrionario” hace referencia a una celula que deriva de la masa celular interna de un blastocito (p.ej., un embrion humano de 4 a 5 dfas de edad) y que es pluripotente.
Como se usa en la presente memoria, el termino “citoblasto de tipo embrionario” hace referencia a una celula que no deriva de la masa celular interna de un blastocito. Como se usa en la presente memoria, un “citoblasto de tipo embrionario” puede hacer referencia tambien a un “citoblasto placentario”. Un citoblasto de tipo embrionario es preferiblemente pluripotente. Sin embargo, los citoblastos que pueden obtenerse de la placenta incluyen citoblastos de tipo embrionario, celulas multipotentes y celulas progenitoras comprometidas. Segun los metodos de la invencion, los citoblastos de tipo embrionario derivados de la placenta pueden recogerse de la placenta aislada una vez se ha desangrado y perfundido durante un periodo de tipo suficiente para retirar las celulas residuales. Preferiblemente, los citoblastos de tipo embrionario son humanos, aunque pueden derivar de cualquier marnffero.
Como se usa en la presente memoria, el termino “desangrado” o “desangramiento”, cuando se usa con respecto a la placenta, hace referencia a la retirada y/o drenaje de sustancialmente toda la sangre de cordon de la placenta. De acuerdo con la presente invencion, el desangramiento de la placenta puede conseguirse, por ejemplo, pero no a modo de limitacion, mediante drenaje, flujo de salida inducido por la gravedad, masaje, aplastamiento, bombeo, etc. En una realizacion preferida, el desangramiento de la placenta puede conseguirse ademas por perfusion, enjuagado o aclarado de la placenta con un fluido que puede contener o no agentes tales como anticoagulantes para ayudar al
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desangramiento de la placenta.
Como se usa en la presente memoria, el termino “perfundir” o “perfusion” hace referencia al acto de verter o pasar un fluido sobre o a traves de un organo o tejido, preferiblemente el paso de fluido a traves de un organo o tejido, con suficiente fuerza o presion para retirar cualquier celula residual, p.ej., celulas no adheridas del organo o tejido. Como se usa en la presente memoria, el termino “perfundido” hace referencia al fluido recogido despues de este paso a traves de un organo o tejido. En una realizacion preferida, el perfundido contiene uno o mas anticoagulantes.
Como se usa en la presente memoria, el termino “celula endogena” hace referencia a una celula “no ajena”, concretamente una celula propia o autologa que deriva de la placenta.
Como se usa en la presente memoria, el termino “celula exogena” hace referencia a una celula “ajena”, concretamente una celula heterologa (concretamente, una celula “no propia” derivada de una fuente distinta del donante de placenta) o autologa (concretamente, una celula “propia” derivada del donante de placenta) que deriva de un organo o tejido distinto de la placenta.
Como se usa en la presente memoria, “compuesto inmunomodulador” hace referencia a los compuestos divulgados en la seccion 5.3 siguiente.
Como se usa en la presente memoria, el termino “organoide” hace referencia a una agregacion de uno o mas tipos celulares ensamblados con una apariencia superficial o una estructura real como cualquier organo o glandula del cuerpo de mairnfero, preferiblemente el cuerpo humano.
Como se usa en la presente memoria, el termino “celula multipotente” hace referencia a una celula que tiene la capacidad de crecer en cualquiera de un subconjunto de los aproximadamente 260 tipos celulares del cuerpo de marnffero. Al contrario que una celula pluripotente, una celula multipotente no tiene la capacidad de formar todos los tipos celulares.
Como se usa en la presente memoria, el termino “celula pluripotente” hace referencia a una celula que tiene una versatilidad de diferenciacion completa, concretamente, la capacidad de crecer en cualquiera de los aproximadamente 260 tipos celulares del cuerpo de mamffero. Una celula pluripotente puede ser autorrenovadora y puede permanecer durmiente o quiescente en un tejido. Al contrario que una celula totipotente (p.ej., un ovulo diploide fertilizado), un citoblasto embrionario no puede formar habitualmente un blastocito nuevo.
Como se usa en la presente memoria, el termino “celula progenitora” hace referencia a una celula que esta comprometida a diferenciacion en un tipo espedfico de celula o a formar un tipo espedfico de tejido.
Como se usa en la presente memoria, el termino “citoblasto” hace referencia a una celula maestra que puede reproducirse infinitamente formando celulas especializadas de tejidos y organos. Un citoblasto es una celula de desarrollo pluripotente o multipotente. Un citoblasto puede dividirse produciendo dos citoblastos hijos o un citoblasto hijo y una celula progenitora (“transitoria”) que prolifera entonces en celulas formadas totalmente maduras del tejido.
Como se usa en la presente memoria, el termino “celula totipotente” hace referencia a una celula que es capaz de formar un embrion completo (p.ej., un blastocito).
4. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Grafico de barras que indica los resultados de cultivar celulas CD34+ de cordon en presencia de talidomida (THD), 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-
2.6- diona a concentraciones de 1 pg/ml y 10 pg/ml. Se uso un volumen igual de DMSO como control negativo. Se puntuaron las colonias hematopoyeticas de unidades formadoras de brotes eritroides (BFU-E), unidades formadoras de colonias eritroides (CFU-E), unidades formadoras de colonias de granulocitos-macrofagos (CFU-GM) y numeros totales de colonias (CFU-Total) bajo el microscopio optico el dfa 14 de cultivo. Eje Y: Numeros de colonias. Vease la seccion 6.1 para detalles.
FIG. 2(A-F). Citogramas de flujo. La exposicion de celulas CD45+ de sangre de cordon humanas a 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona inhibe la
eritropoyesis y expansion de celulas CD34+CD38-. Se cultivaron celulas CD45+ de sangre de cordon durante 14 dfas con las citocinas IL3, IL6, G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma indican los porcentajes de poblacion celular que expresan una combinacion particular de marcadores. A. Control, inmunoglobulina (Ig). B. Control, sin compuesto anadido. C. DMSO (5 pg/ml). D. Talidomida ("Thal") (5 pg/ml). E. 4- (Amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona (5 pg/ml). F. 3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-
2.6- diona (5 pg/ml). Eje X: Intensidad relativa de la tincion de Gly-A (FL1-H). Eje Y: Intensidad relativa de la tincion de CD34 (F 2-H). Vease la seccion 6.1 para detalles.
FIG. 3(A-F). Citogramas de flujo. La exposicion de celulas CD45+ de sangre de cordon humanas a 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona inhibe la
expresion de CXCR4 en celulas CD34+ de sangre de cordon humanas a los 14 dfas de cultivo con las citocinas IL3,
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KL y G-CSF. Los porcentajes indicados en cada citograma indican el porcentaje de poblacion celular que expresa una combinacion particular de marcadores. A. Control, inmunoglobulina (Ig). B. Control, celulas CD45+. C. DMSO (0,3 |jg/ml). D. Thal (0,3 jg/ml), E. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona (0,3 jg/ml). F. 3-(4-Amino- 1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona (0,3 jg/ml). Eje X: Intensidad relativa de la tincion de CD34 (FL1-H). Eje Y: Intensidad relativa de la tincion de CXCR4 (FL2-H). Vease la seccion 6.2 para detalles.
FIG. 4(A-F). Citogramas de flujo. La exposicion de celulas CD45+ de sangre de cordon humanas a 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona estimula la expansion de poblaciones de celulas CD34+ y/o CD34+CD38-. Se cultivaron celulas CD45+ de sangre de cordon durante 14 dfas con las citocinas IL3, IL6, GCSf, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma indican el porcentaje de poblacion celular que expresa una combinacion particular de marcadores. A. Control, inmunoglobulina (Ig). B. Control, sin compuesto anadido. C. DMSO (0,3 jg/ml). D. ThaI (0,3 jg/ml). E. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona (0,3 jg/ml). F. 3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona (0,3 jg/ml). Eje X: Intensidad relativa de la tincion de CD38 (FL1-H). Eje Y: Intensidad relativa de la tincion de Cd34 (FL2-H). Vease la seccion 6.2 para detalles.
FIG. 5(A-F). Citogramas de flujo. La exposicion de celulas CD45+ de sangre de cordon humanas a 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona produce una conservacion significativa de las celulas progenitoras de sangre de cordon humanas. Se cultivaron celulas CD45+ de sangre de cordon durante 14 dfas con las citocinas IL3, IL6, G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma indican el porcentaje de poblacion celular que expresa una combinacion particular de marcadores. A Control, inmunoglobulina (Ig). B. Control, sin compuesto anadido. C. DMSO (5 jg/ml). D. ThaI (5 jg/ml). E. 4- (Amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona (5 jg/ml). F. 3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-
2,6-diona (5 jg/ml). Eje X: Intensidad relativa de la tincion de CD38 (FL1-H). Eje Y: Intensidad relativa de la tincion de CD34 (FL2-H). Vease la seccion 6.2 para detalles.
FIG. 6(A-F). Citogramas de flujo. La exposicion de celulas CD45+ de sangre de cordon humanas a 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona inhibe la expresion de CXCR4 y expande la poblacion de celulas CD45+. Se cultivaron celulas CD45+ de sangre de cordon durante 14 dfas con las citocinas IL3, IL6, GC-SF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma indican el porcentaje de poblacion celular que expresa una combinacion particular de marcadores. A. Control, inmunoglobulina (Ig). B. Control, sin compuesto anadido. C. DMSO (5 jg/mlJ. D. Thal (5 jg/mlJ. E. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona (5 jg/mlJ. F. 3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona (5 jg/ml). Eje X: Intensidad relativa de tincion de cD45 (FL1-H). Eje Y: Intensidad relativa de tincion de CXCR4 (FL2-H). Vease la seccion 6.2 para detalles.
FIG. 7(A-F). Citogramas de flujo. La exposicion de celulas CD45+ de sangre de cordon humanas a 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona produce una expansion del numero de celulas progenitoras CD34+ y aumenta la produccion de granulocitos y monocitos. Se cultivaron celulas CD45+ de sangre de cordon durante 14 dfas con las citocinas IL3, IL6, G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma indican el porcentaje de poblacion celular que expresa una combinacion particular de marcadores. A. Control, inmunoglobulina (Ig). B. Control, sin compuesto anadido. C. DMSO (5 jg/mlJ. D. Thal (5 jg/mlJ. E. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona (5 jg/mlJ. F. 3-(4-Amino-1-oxo-1,3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona (5 jg/ml). Eje X: Intensidad relativa de tincion de CD11b (FL1-H). Eje Y: Intensidad relativa de tincion de CD34 (FL2-H). Vease la seccion 6.2 para detalles.
FIG. 8(A-F). Citogramas de flujo. La exposicion de celulas CD45+ de sangre de cordon humanas a 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona expande las celulas progenitoras CD34+ y contrarresta la represion mediada por DMSO de la produccion de monocitos. Se cultivaron celulas CD45+ de sangre de cordon durante 14 dfas con las citocinas IL3, IL6, G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma indican el porcentaje de poblacion celular que expresa una combinacion particular de marcadores. A. Control, inmunoglobulina (Ig). B. Control, sin compuesto anadido. C. DMSO (5 jg/mlJ. D. Thal (5 jg/mlJ. E. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona (5 jg/mlJ. F. 3-(4-Amino-1-oxo-1,3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona (5 jg/ml). Eje X: Intensidad relativa de tincion de CD14 (FL1-H). Eje Y: Intensidad relativa de tincion de CD34 (FL2-H). Vease la seccion 6.3 para detalles.
FIG. 9(A-F). Citogramas de flujo. La exposicion de celulas CD45+ de sangre de cordon humanas a 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona muestra efectos supresores menores sobre la diferenciacion de linfocitos B. Se cultivaron celulas CD45+ de sangre de cordon durante 14 dfas con las citocinas IL3, IL6, G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma indican el porcentaje de poblacion celular que expresa una combinacion particular de marcadores. A. Control, inmunoglobulina (Ig). B. Control, sin compuesto anadido. C. DMSO (5 jg/mlJ. D. Thal (5 jg/mlJ. E. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona (5 jg/mlJ. F. 3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona (5 jg/ml). Eje X: Intensidad relativa de tincion de CD38 (FL1-H). Eje Y: Intensidad relativa de tincion de CD19 (FL2-H). Vease la seccion 6.3 para detalles.
FIG. 10(A-F). Citogramas de flujo. La exposicion de celulas CD45+ de sangre de cordon humanas a 4-(amino)-2-
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(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona supera la represion de CXCR5 producida por la exposicion a DMSO. Se cultivaron celulas CD45+ de sangre de cordon durante 14 dfas con las citocinas IL3, IL6, G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma indican el porcentaje de poblacion celular que expresa una combinacion particular de marcadores. A. Control, inmunoglobulina (Ig). B. Control, sin compuesto anadido. C. DMSO (5 pg/mlj. D. Thal (5 pg/mlj. E. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona (5 pg/mlj. F. 3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona (5 pg/ml). Eje X: Intensidad relativa de tincion de CXCR5 (FL1-H). Eje Y: Intensidad relativa de tincion de CD34 (FL2-H). Vease la seccion 6.3 para detalles.
FIG. 11(A-F). Citogramas de flujo. La exposicion de celulas mononucleadas de sangre de cordon (MNC) humanas a 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona aumenta la poblacion de celulas CD34+CD38+. Los porcentajes indicados en cada citograma indican el porcentaje de poblacion celular que expresa una combinacion particular de marcadores. A. Control, inmunoglobulina (lg). B. Control, sin compuesto anadido. C. DMSO (5 pg/mlj. D. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona (5 pg/mlj. E. 3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona (5 pg/ml). Eje X: Intensidad relativa de tincion de cD38 (FL1-H). Eje Y: Intensidad relativa de tincion de CD34 (FL2-H). Vease la seccion 6.3 para detalles.
FIG. 12(A-F). Citogramas de flujo. La exposicion de MNC a 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y
3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona regula negativamente la poblacion de celulas CXCR4+CD45+, pero aumenta la poblacion de celulas CXCR4+CD45-. Los porcentajes indicados en cada citograma indican el porcentaje de poblacion celular que expresa una combinacion particular de marcadores. A. Control, inmunoglobulina (Ig). B. Control, sin compuesto anadido. C. DMSO (5 pg/mlj. D. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona (5 pg/mlj. E. 3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona (5 pg/ml). Eje X: Intensidad relativa de tincion de cD45 (FL1-H). Eje Y: Intensidad relativa de tincion de CXCR4 (FL2-H). Vease la seccion 6.3 para detalles.
FIG. 13(A-E). Citogramas de flujo. Efecto de talidomida, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona sobre el compromiso de linaje de progenitores hematopoyeticos diferenciadores en la fraccion celular nucleada de sangre de cordon umbilical. Los citogramas de flujo muestran que la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y la 3-(4-amino-1-oxo-1,3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona aumentan el porcentaje de celulas de linaje monocftico en comparacion con el control, indicando que hay una modulacion de la diferenciacion que se desplaza hacia linajes que dan lugar a celulas linfoides y mieloides. A. Control, inmunoglobulina (Ig). B. DMSO (5 pg/ml). C. Thal (5 pg/ml). D: 4-(Amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona (5 pg/ml). E. 3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona (5 pg/ml). Vease la seccion 6.4 para detalles.
FIG. 14. Resumen del estudio del efecto de la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona sobre la diferenciacion de celulas CD34+ y la maduracion en celulas DC. Se cultivaron las celulas CD34+ en presencia o ausencia de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona 1,0 pM y DMSO (dimetilsulfoxido) durante cualquiera de la fase de expansion y maduracion (dfa 1 a dfa 12) o durante la fase de maduracion (dfa 6 a dfa 12). Se valoraron los marcadores inmunohistoqmmicos el dfa 6 o el dfa 12 usando anticuerpos monoclonales conjugados con FITC y PE. Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 15(A-D). Citogramas de flujo que muestran las caractensticas fenotfpicas de celulas CD34+ el dfa 6 expuestas a 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona desde el dfa 1. La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona supriirna casi completamente el desarrollo de celulas CD86+CD1a+. Se marcaron doblemente las celulas con CD1a FITC y CD14 Pe o CD1a FITC y CD86 PE. A: Celulas CD86+CD1 + generadas a partir de celulas CD34+ tratadas con DMSO (control). B: Celulas CD14+CD1+ generadas a partir de celulas CD34+ tratadas con DMSO (control). C: Celulas CD86+CD1+ generadas a partir de celulas CD34+ tratadas con 4-(amino)-2- (2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona. D: Celulas CD14+CD1+ generadas a partir de celulas CD34+ tratadas con
4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona. Los porcentajes en cada citograma indican el porcentaje de celulas que expresan una combinacion particular de marcadores. Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 16(A-D). Citogramas de flujo que muestran el efecto de la exposicion a 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona el dfa 6 durante la fase de expansion (dfa 1 a dfa 6) sobre celulas CD34+. Las celulas CD34+CD38" expuestas a 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona se diferenciaban en celulas CD34+CD38"CD33+ despues de 6 dfas. Se marcaron doblemente las celulas con CD33 FITC y CD83 PE o C38 PE y CD34 PE. A: Celulas tratadas con DMSO y marcadas para CD34 y CD38. B: Celulas tratadas con DMSO y marcadas para CD83 y CD33. C: Celulas tratadas con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y marcadas para CD34 y CD38. D: Celulas tratadas con. Los porcentajes en cada citograma indican el porcentaje de celulas que expresan una combinacion particular de marcadores. Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 17. La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona induce un desplazamiento en las poblaciones celulares derivadas de celulas CD34+ del dfa de cultivo 0 al dfa 6. Se cultivaron las celulas del dfa 0 al dfa 6 en presencia de diferentes concentraciones de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona, se marcaron doblemente entonces con CD34 y CD38 o CD1a y CD14. La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona causa un marcado aumento de las celulas CD34+CD38" y una disminucion de las celulas CD1a+CD14". Vease la
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seccion 6.6 para detalles.
FIG. 18. Modificaciones fenotfpicas el dfa 6 de celulas CD34+ tratadas durante diversos tiempos con 4-(amino)-2- (2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona. Se sembraron las celulas y se cultivaron durante 6 dfas. Se trataron las celulas con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona del dfa 0 al dfa 1 solo, del dfa 0 al dfa 2 solo, del d^a 0 al dfa 3 solo, del dfa 0 al d^a 4 solo, del dfa 0 a dfa 5 solo o del dfa 0 al d^a 6 solo. Para incubaciones de menos de 6 dfas, se elimino por lavado la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona el dfa indicado y se resuspendieron las celulas en DMSO. A los 6 dfas, se marcaron las celulas con CD34 y CD38 o CD1a y CD14. Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 19(A-B). Modificaciones fenotfpicas el dfa 6 de celulas progenitoras CD34+ tratadas con una dosis unica o multiple de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona. FIG. 19A: Condicion 1: dosis unica de 4-(amino)- 2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona el d^a 0; condicion 2: 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3- diona administrada el dfa 0 y el d^a 4; condicion 3: 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona administrada el d^a 0, el dfa 2 y el dfa 4. El eje Y indica el porcentaje de celulas que expresan el marcador particular o combinacion de marcadores. FIG. 19B: Condicion 1: dosis unica de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-
1,3-diona el dfa 0; condicion 2: 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona administrada el dfa 0, el dfa 4, el d^a 6 y el dfa 8; condicion 3: 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona administrada el d^a 0, el dfa 2, el dfa 4, el d^a 6 y el dfa 8. Se valoro en las celulas la expresion de CD11c y CD15, un marcador granulocftico. El eje Y indica el porcentaje de celulas CD11c+CD15" y CD11c"CD15+ puestas en contacto con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona o DMSO (control). Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 20(A-F). Citogramas de flujo de celulas dendnticas el dfa 12 generadas a partir de celulas CD34+ expuestas a 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona (1 jM) del dfa 1 al d^a 12. La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona causa la disminucion de las moleculas coestimulatorias CD86 y CD80 el dfa 12 en comparacion con el control. Se marcaron doblemente las celulas con anticuerpos de CD1a FITC y CD86 PE, anticuerpos de CD1a FITC y CD80 PE o anticuerpos de CD1a FITC y CD14 PE. A: Celulas tratadas con DMSO y tenidas el dfa 12 para CD86 y CD1a. B: Celulas tratadas con DMsO y tenidas el dfa 12 para CD80 y CD1a. C: Celulas tratadas con DMSO y tenidas el dfa 12 para CD14 y CD1a. D: Celulas tratadas con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo- (3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y tenidas el dfa 12 para CD86 y CD1a. E: Celulas tratadas con 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y tenidas el dfa 12 para CD80 y CD1a. F: Celulas tratadas con 4-(amino)-2- (2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y tenidas el dfas 12 para CD14 y CD1a. Los porcentajes en cada citograma indican el porcentaje de celulas que expresan una combinacion particular de marcadores. Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 21(A-D). Citogramas de flujo de celulas dendnticas el dfa 12 generadas a partir de celulas CD34+ expuestas a 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona (1 jM) del dfa 1 al dfa 12. La exposicion a 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona da como resultado una modulacion de la expresion de la molecula de adhesion CD54, causando una disminucion de la expresion de CD54bnght y un aumento de la expresion de CD54dim respecto al control (comparar los subpaneles B y F en la FIG. 21D). A: Celulas tratadas con DMSO y tenidas para HlA-DR y con IgG1. B: Celulas tratadas con DmSo y tenidas para CD54 y CD40. C: Celulas tratadas con 4-(amino)- 2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y tenidas para hLA-DR y con IgG1. D: Celulas tratadas con 4-(amino)- 2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y tenidas para CD54 y CD40. Los porcentajes en cada citograma indican el porcentaje de celulas que expresan una combinacion particular de marcadores. Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 22(A-B). La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona promueve la diferenciacion granulocftica de celulas progenitoras CD34+. Citogramas de flujo de celulas CD34+ crecidas durante 12 dfas en presencia de DMSO (FIG. 22a) o 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona (FIG. 22B), y marcadas entonces con anticuerpo del marcador granulocftico CD15. Los porcentajes en cada citograma indican el porcentaje de celulas que expresan una combinacion particular de marcadores. Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 23(A-D). La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona no induce la apoptosis de precursores de CD1a+ o cD14+. Citogramas de flujo de celulas aisladas CD1a+CD14- y CD1a'CD14+ (progenitores de DC). Se cultivaron celulas progenitoras CD34+ durante un periodo de 6 dfas en presencia de SCF, Flt-3L, GM-CSF y TNF-a. El dfa 6, se aislaron las celulas CD1a+CD14- y CD1a'CD14+ mediante clasificacion celular magnetica (Miltenyi) y se cultivaron las poblaciones de CD1a+CD14- y CD1a'CD14+ purificadas durante 2 dfas adicionales en presencia de GM-CSF y TNF-a con o sin 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona (1 jM). Se monitorizaron entonces las celulas apoptoticas usando tincion con anexina V-FITC, un marcador de apoptosis, en combinacion con yoduro de propidio (PI), una sonda de viabilidad. Los porcentajes en cada citograma indican el porcentaje de celulas de tincion positiva por anexina V-FITC y/o yoduro de propidio. El numero de celulas positivas de anexina V-FITC era comparable en las celulas tratadas con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y de control (comparar particularmente B3 y B4 en cada citograma). A: Celulas cD1a+CD14- tratadas con DMSO. B: Celulas CD1a+CD14- tratadas con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona. C: Celulas CD1a'CD14+ tratadas con DMSO. D: Celulas CD1a'CD14+tratadas con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona. Vease la seccion 6.6 para detalles.
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FIG. 24(A-D). Citogramas de flujo de celulas CD34+ crecidas durante 12 dfas en presencia o ausencia de 4-(amino)- 2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona. La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona causa una disminucion de la endocitosis mediada por receptor de manosa, como se demuestra por la captacion disminuida de dextrano marcado con FITC respecto al control de DMSO. A: DMSO y 4 °C. B. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona y 4 °C. C: DMSO y 37 °C. B. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 37 °C. El porcentaje en cada citograma indica la fraccion de celulas que exhiben endocitosis. Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 25(A-D). Citogramas de flujo de celulas CD34+ cultivadas durante 12 dfas y cultivadas en presencia o ausencia de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona los dfas 6-12. El cultivo en presencia de 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona los dfas 6-12, despues de cultivo los dfas 1-5 en ausencia de 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona, da como resultado una endocitosis mediada por receptor de manosa comparable a la del control de DMSO. El porcentaje en cada citograma indica la fraccion de celulas que exhiben endocitosis. A: DMSO y 4 °C. B. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 4 °C. C: DMSO y 37 °C. B. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 37 °C. Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 26. La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona reduce la capacidad de las celulas CD34+ cultivadas durante 12 dfas de presentar antigeno. Se cultivaron celulas CD34+ durante 12 dfas en presencia o ausencia de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona. Las celulas tratadas con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo- (3-piperidil))isoindolin-1,3-diona el dfa 12 muestran un mdice de estimulacion sustancialmente disminuido en comparacion con el control de DMSO. Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 27. La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona tiene poca actividad de reduccion de APC sobre celulas CD34+ cultivadas en 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona del dfa 6 al dfa 12. Se cultivaron las celulas CD34+ durante cinco dfas y se cultivaron entonces en presencia o ausencia de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona. La capacidad presentadora de antfgeno de las celulas tratadas es comparable a la de las celulas tratadas con DMSO de control. Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 28. Ruta de diferenciacion de celulas progenitoras hematopoyeticas CD34+ cultivadas en presencia de GM-CSF y TNF-a.
FIG. 29. Grafica resumen que muestra el efecto de la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona sobre la ruta de diferenciacion de celulas progenitoras hematopoyeticas CD34+ cultivadas en presencia de GM-CSF y TNF- a. Vease la seccion 6.6 para detalles.
FIG. 30. Diagrama que muestra las condiciones de maduracion de celulas progenitoras hematopoyeticas Sca+Lin-. Se hicieron crecer las celulas durante 9 dfas en presencia de factor citoblastico (SCF), Flt-3L, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF) y factor estimulante de colonias de macrofagos (MCSF) en presencia de DMSO al 0,1 % (control), 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona 10 pM o acido todo- trans-retionoico (ATRA) 10 pM para impulsar las celulas a un fenotipo precursor de DC. Se cultivaron entonces las celulas del dfa 9 al dfa 12 en presencia de GM-CSF y TNF-a, mas DMSO, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona o ATRA, para impulsar la diferenciacion de las celulas de murido a celulas dendnticas inmaduras. Vease la seccion 6.8 para detalles.
FIG. 31(A-E). Celulas de murido presentes el dfa 9 en condiciones de cultivo normales (vease el Ejemplo 1, Materiales y metodos, descripcion de la FIG. 30). Se marcaron las celulas con anticuerpos de CD80 (FIG. 31A), CD11 (FIG. 31B), CD32/16 (FIG. 31C), MHC II ((I-Ab) (FIG. 31D), CD14 (FIG. 31E) o Gr-1 (FIG. 31F). Las celulas del dfa 9 exhidan marcaje con los marcadores CD88, CD11 y CD32/16, poco marcaje con los anticuerpos del marcador I-Ah y ninguno con cD14 o Gr-1. Vease la seccion 6.8 para detalles.
FIG. 32(A-I). Citogramas de flujo de celulas de murido del dfa 12 tratadas con DMSO, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona o ATRA. Se marcaron las celulas con anticuerpos de CD86 y CD11b. FIG. 32A-32C (fila superior): citogramas que muestran los porcentajes de celulas que expresan CD86 (eje Y) cuando se tratan con DMSO (control), 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona o acido todo-trans-retinoico (ATRA). FIG. 32D-32F (fila media): porcentaje de celulas que expresan el marcador de histocompatibilidad mayor II (MHC II); tratamiento como en la fila superior. FIG. 32G-32I (fila inferior): porcentaje de celulas que expresan CD11b; tratamiento coo en la fila superior. Vease la seccion 6.8 para detalles.
5. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invencion esta basada, en parte, en el inesperado descubrimiento de que la exposicion de citoblastos o celulas progenitoras a los compuestos de la invencion da como resultado un medio regulable de control de la diferenciacion de citoblastos o celulas progenitoras en poblaciones espedficas de celulas progenitoras o la diferenciacion de celulas progenitoras en tipos celulares espedficos, tales como celulas dendnticas, granulocitos, celulas endoteliales y celulas neurales. En particular, la exposicion de los citoblastos o celulas progenitoras a los compuestos de la invencion da como resultado la diferenciacion regulable y la expansion de poblaciones espedficas de celulas hematopoyeticas, incluyendo celulas CD34+, CD38+ y CD133+. Dicha regulacion de la diferenciacion se
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logra sin una perdida significativa de rendimiento debido a la muerte celular o diferenciacion en tipos celulares o linajes celulares indeseados; en otras palabras, los compuestos de la invencion no causan la apoptosis de una o mas poblaciones celulares. Ademas, la exposicion de las celulas progenitoras hematopoyeticas a los compuestos de la invencion da como resultado una diferenciacion regulable y la expansion de tipos celulares espedficos.
Por tanto, la presente invencion proporciona metodos de modulacion de la diferenciacion de citoblastos humanos, espedficamente celulas progenitoras hematopoyeticas CD34+, y de diferenciacion de celulas progenitoras CD133+. En particular, la presente invencion proporciona metodos que emplean 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-
1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona para modular la diferenciacion de poblaciones de celulas progenitoras a lo largo de linajes celulares y tisulares espedficos. Ademas, la invencion engloba metodos de expansion de celulas progenitoras tempranas, tales como celulas CD133+ o CD34+ humanas, particularmente CD34+CD38", para trasplante en mairnferos, aves o reptiles, que comprenden exponer celulas progenitoras hematopoyeticas a un inhibidor o antagonista de TNF-a, en los que el inhibidor o antagonista es una molecula pequena. La invencion proporciona tambien metodos de produccion de otros tipos celulares a partir de estas celulas progenitoras tempranas incluyendo, pero sin limitacion, celulas de cerebro, rinon, tracto intestinal y musculo. Los compuestos de la invencion actuan tambien suprimiendo la diferenciacion de celulas dendnticas y promueven la diferenciacion de celulas granulodticas a partir de celulas progenitoras tempranas tales como celulas progenitoras CD34+ humanas.
Los compuestos de molecula pequena que pueden usarse en conexion con la invencion son 4-(amino)-2-(2,6-dioxo- (3-piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona. Los compuestos se describen con detalle en la seccion 5.3. Los compuestos preferidos divulgados en la memoria descriptiva son analogos de talidomida, aunque pueden usarse tambien productos de hidrolisis de talidomida, metabolitos, derivados y precursores de talidomida. En realizaciones particularmente preferidas, los compuestos son IMID™ (Celgene) tales como 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-
2,6-diona.
Los metodos de la invencion engloban la regulacion de la diferenciacion de un citoblasto o celula progenitora en un linaje celular espedfico incluyendo, pero sin limitacion, un linaje mesenquimatico, hematopoyetico, adipogenico, hepatogenico, neurogenico, gliogenico, condrogenico, vasogenico, miogenico, condrogenico u osteogenico, que comprende incubar el citoblasto o celula progenitora con un compuesto de la invencion, preferiblemente in vitro, durante un periodo de tiempo suficiente para dar como resultado la diferenciacion de la celula en una celula de un linaje celular deseado. En una realizacion espedfica, se modula la diferenciacion de un citoblasto o celula progenitora en una celula de linaje hematopoyetico. En particular, pueden usarse los metodos de la invencion para modular la generacion de colonias de celulas sangumeas a partir de celulas progenitoras hematopoyeticas CD34+, CD133+ y CD45+ de manera sensible a la dosis.
Los metodos de la invencion engloban tambien la regulacion de la diferenciacion de una celula progenitora CD34+ en celulas dendnticas, que comprende incubar la celula progenitora con un compuesto de la invencion, preferiblemente in vitro, durante un periodo de tiempo suficiente para dar como resultado la diferenciacion de la celula en una celula de un linaje celular deseado. En una realizacion espedfica, se modula la diferenciacion de dicha celula progenitora en una celula de linaje celular dendntico mediante la puesta en contacto de dicha celula con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo- (3-piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona o un analogo o profarmaco de cualquiera. En otra realizacion espedfica, se modula la diferenciacion de una celula progenitora CD34+ para suprimir la diferenciacion a lo largo de un linaje mieloide y fomentar la diferenciacion a lo largo de un linaje granulodtico. En una realizacion mas espedfica, se modula la diferenciacion de una celula progenitora CD34+ en una celula de un linaje celular granulodtico mediante un metodo que comprende poner en contacto una celula progenitora CD34+ con un compuesto de la invencion el primer dfa en que se cultivan dichas celulas progenitoras.
Puede usarse cualquier citoblasto o celula progenitora de marnffero de acuerdo con los metodos de la invencion incluyendo, pero sin imitacion, citoblastos aislados de sangre de cordon (celulas “CB”), placenta y otras fuentes. Los citoblastos pueden incluir celulas pluripotentes, concretamente celulas que tienen una versatilidad de diferenciacion completa, que se autorrenuevan y que pueden permanecer durmientes o quiescentes en tejido Los citoblastos pueden incluir tambien celulas multipotentes o celulas progenitoras comprometidas. En una realizacion preferida, la invencion utiliza citoblastos que son citoblastos viables quiescentes pluripotentes que existen en la placenta a termino y pueden recuperarse despues de un parto exitoso y expulsion de la placenta, desangramiento y perfusion, dando como resultado la recuperacion de citoblastos multipotentes y pluripotentes.
En otra realizacion preferida, las celulas progenitoras son celulas progenitoras tempranas, particularmente celulas CD34+ o CD133+. Preferiblemente, las celulas progenitoras CD34+ o CD133+ derivan de medula osea, placenta o sangre de cordon humanas. Pueden usarse tambien equivalentes de estas celulas de otros mamfferos. En ratones, pueden usarse por ejemplo celulas progenitoras Sca+ en los metodos de la invencion. Pueden usarse tambien celulas progenitoras tempranas equivalentes de aves o reptiles.
En una realizacion particular de la invencion, se exponen celulas endogenas de placenta, o producidas por una placenta postparto perfundida incluyendo, pero sin limitacion, citoblastos de tipo embrionario, celulas progenitoras, celulas pluripotentes y celulas multipotentes, a los compuestos de la invencion y se inducen a diferenciar mientras se
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cultivan en una placenta aislada y perfundida. Las celulas endogenas propagadas en la placenta postparto perfundida pueden recogerse y/o recuperarse las moleculas bioactivas del perfundido, medio de cultivo o de las celulas de placenta mismas.
En otra realizacion de la invencion, se exponen citoblastos o celulas progenitoras que derivan de fuentes distintas de placenta postparto a los compuestos de la invencion y se inducen a diferenciar mientras se cultivan in vitro. Por tanto, la invencion engloba metodos para diferenciar citoblastos de mairnfero en celulas progenitoras espedficas, que comprenden diferenciar los citoblastos en condiciones y/o medios adecuados para la diferenciacion deseada y en presencia de un compuesto de la invencion
Ademas, la invencion engloba metodos para modular o regular la diferenciacion de una poblacion de una celula progenitora espedfica en tipos celulares espedficos, que comprenden diferenciar dicha celula progenitora en condiciones adecuadas para dicha diferenciacion y en presencia de uno o mas compuestos de la invencion. Como alternativa, el citoblasto o celula progenitora puede exponerse a un compuesto de la invencion y diferenciarse subsiguientemente usando condiciones adecuadas. Los ejemplos de condiciones adecuadas incluyen formulaciones de medios nutrientes suplementadas con suero humano y matrices de cultivo celular tales como MATRIGEL® suplementadas con factores de crecimiento.
El metodo de la invencion contempla tambien que pueden producirse diferentes poblaciones celulares mediante la puesta en contacto de la celula o celulas progenitoras con un compuesto de la invencion en diversos momentos durante el cultivo, en la etapa de proliferacion o diferenciacion. Vease la seccion 5.4, particularmente la seccion 5.4.2 siguiente.
En una realizacion espedfica, la presente invencion proporciona metodos que emplean moleculas pequenas de amida e imida, particularmente aminoconjugados de talidomida, para modular y regular la hematopoyesis en el contexto de un acondicionamiento pretrasplante de progenitores hematopoyeticos.
La presente invencion proporciona tambien metodos que emplean las moleculas pequenas de la invencion para modular y regular la hematopoyesis en el contexto del acondicionamiento ex vivo de progenitores hematopoyeticos. Los metodos de la invencion engloban la regulacion de citoblastos o celulas progenitoras in vitro, seguido del trasplante directo de las celulas diferenciadas a un sujeto.
La invencion engloba tambien un citoblasto o celula progenitora y un compuesto de la invencion para uso en el control o regulacion de citoblastos o celulas progenitoras in vivo mediante la administracion tanto de un citoblasto o celula progenitora como un compuesto de la invencion a un paciente necesitado de ello.
La memoria descriptiva divulga tambien el trasplante de citoblastos o celulas progenitoras pretratados para tratar o prevenir enfermedades. En una realizacion, se administra tambien a un paciente necesitado de trasplante un compuesto de la invencion antes, durante y/o despues del trasplante. En otra realizacion, se administra tambien a un paciente necesitado de trasplante citoblastos o celulas progenitoras no tratados, p.ej. celulas de sangre de cordon, celulas de sangre adultas, celulas de sangre perifericas o celulas de medula osea. En otra realizacion, la invencion incluye la administracion de los compuestos de la invencion para uso en un sujeto que es el receptor de los citoblastos o celulas progenitoras no acondicionados con fines de desencadenar un efecto modulador sobre los citoblastos que ya se han trasplantado.
En ciertas realizaciones, el trasplante de medula osea comprende trasplantar sangre de cordon (o citoblastos obtenidos de sangre de cordon), sangre periferica (concretamente, adulta) (o citoblastos obtenidos de sangre periferica), en el que dicha sangre de cordon o citoblastos se han pretratado con un compuesto de la invencion. Ademas, la memoria descriptiva divulga el uso de globulos blancos elaborados a partir de celulas progenitoras hematopoyeticas que se han diferenciado en presencia de un compuesto de la invencion. Por ejemplo, los globulos blancos producidos mediante la diferenciacion de progenitor hematopoyetico pueden usarse en el trasplante o pueden mezclarse con sangre de cordon o citoblastos de sangre de cordon antes del trasplante.
En otras realizaciones, la memoria descriptiva divulga un trasplante de medula osea que comprende trasplantar celulas progenitoras tempranas, tales como celulas progenitoras CD34+ o CD133+, obtenidas segun los metodos de la invencion, en el que dichas celulas progenitoras se han pretratado con un compuesto de la invencion. En una realizacion de la invencion, dichos precursores de celulas dendnticas son celulas precursoras CD34+CD38-CD33+ o CD34+CD38-CD33-. Ademas, la invencion engloba el uso de celulas elaboradas a partir de celulas progenitoras CD34+ que se han diferenciado en presencia de un compuesto de la invencion. Por ejemplo, pueden usarse en trasplante celulas precursoras CD34+CD38-CD33+, celulas precursoras CD34+CD38-CD33-, granulocitos, etc. producidos mediante la diferenciacion de celulas progenitoras CD34+, usando los compuestos de la invencion. Las celulas diferenciadas a partir de celulas CD133+, usando los compuestos de la invencion, estan tambien englobadas por la presente invencion.
La invencion engloba tambien metodos de acondicionamiento de citoblastos despues de crioconservacion y descongelamiento, para contrarrestar los efectos nocivos de la crioconservacion y exposicion a crioconservantes sobre los citoblastos. En ciertas realizaciones, la invencion proporciona metodos de acondicionamiento de
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citoblastos despues de crioconservacion y descongelamiento, para contrarrestar los efectos nocivos de la exposicion a crioconservantes (p.ej., DMSO) sobre la capacidad proliferativa y migratoria de los citoblastos.
5.1. MODULACION DE LA DIFERENCIACION DE CITOBLASTOS Y CELULAS PROGENITORAS CD34+ O CD133+
5.1.1. Citoblastos
La presente invencion proporciona metodos de modulacion de la diferenciacion de citoblastos humanos. En ciertas realizaciones, los metodos de la invencion engloban la regulacion de la diferenciacion de citoblastos o celulas progenitoras in vitro, que comprenden incubar los citoblastos con el compuesto in vitro, seguido del trasplante directo de las celulas diferenciadas a un sujeto. La invencion hace tambien referencia a 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona para uso en la regulacion de la diferenciacion de citoblastos o celulas progenitoras in vivo, en las que la regulacion de la diferenciacion de citoblastos o celulas progenitoras comprende suministrar los compuestos a un sujeto que es el receptor de citoblastos no acondicionados, seguido de la administracion directa del compuesto al sujeto.
Los citoblastos de tipo embrionario obtenidos mediante los metodos de la invencion pueden inducirse a diferenciar a lo largo de linajes celulares espedficos incluyendo, pero sin limitacion, linaje mesenquimatico, hematopoyetico, adipogenico, hepatogenico, neurogenico, gliogenico, condrogenico, vasogenico, miogenico, condrogenico u osteogenico.
En ciertas realizaciones, los citoblastos de tipo embrionario obtenidos segun los metodos de la invencion se inducen a diferenciar para uso en los protocolos de trasplante y tratamiento ex vivo. En ciertas realizaciones, se inducen a diferenciar los citoblastos de tipo embrionario obtenidos mediante los metodos de la invencion en un tipo celular particular y se genomanipulan para proporcionar un producto genico terapeutico. En una realizacion espedfica, se incuban los citoblastos de tipo embrionario obtenidos mediante los metodos de la invencion con un compuesto tal como una molecula organica pequena, in vitro, lo que les induce a diferenciar, seguido de trasplante directo de las celulas diferenciadas a un sujeto. En una realizacion preferida, los compuestos que se usan para controlar o regular la diferenciacion de citoblastos no son polipeptidos, peptidos, protemas, hormonas, citocinas, oligonucleotidos u acidos nucleicos.
Los citoblastos que pueden usarse de acuerdo con la invencion incluyen, pero sin limitacion, celulas de sangre de cordon (CB), celulas de placenta, citoblastos de tipo embrionario, citoblastos trofoblasticos, celulas progenitoras, citoblastos de medula osea y celulas multipotentes, pluripotentes y totipotentes.
En particular, los metodos de la invencion engloban la regulacion de la diferenciacion de poblaciones de citoblastos, ademas de a citoblastos mesenquimaticos, a linajes tisulares espedficos. Por ejemplo, los metodos de la invencion pueden emplearse para regular la diferenciacion de un citoblasto multipotente en celulas de linaje condrogenico, vasogenico, miogenico y osteogenico mediante la promocion de la regeneracion y reparacion musculoesqueleticas espedficas, la neoangiogenesis y repoblacion de tejidos musculares espedficos, tales como miocardio y musculo esqueletico, y la revascularizacion de una variedad de organos y tejidos incluyendo, pero sin limitacion, cerebro, medula espinal, hngado, pulmon, rinon y pancreas. Los metodos de la invencion pueden emplearse para regular la diferenciacion de un citoblasto multipotente en celulas de linaje adipogenico, condrogenico, osteogenico, neurogenico o hepatogenico.
El agente usado para modular la diferenciacion puede introducirse en la placenta postparto perfundida para inducir la diferenciacion de las celulas que se cultivan en la placenta. Como alternativa, el agente puede usarse para modular la diferenciacion in vitro despues de recoger o retirar las celulas de la placenta.
Los metodos de la invencion engloban la regulacion de la diferenciacion de citoblastos progenitores en una celula de linaje hematopoyetico, que comprenden incubar los citoblastos progenitores con el compuesto in vitro durante un periodo de tiempo suficiente para dar como resultado la diferenciacion de estas celulas en un linaje hematopoyetico. En particular, los metodos de la invencion pueden usarse para modular la generacion de colonias de celulas sangumeas a partir de celulas progenitoras hematopoyeticas CD34+, CD133+ y CD45+ de manera sensible a la dosis (para la discusion de la dosificacion, vease la seccion 5.7).
Preferiblemente, los metodos de la invencion pueden usarse para suprimir espedficamente la generacion de colonias de globulos rojos o eritropoyeticas (BFU-E y CFU-E), mientras que se acrecienta tanto la generacion de colonias formadoras de leucocitos y plaquetas (CFU-GM) como la potenciacion de la produccion de unidades formadoras de colonias totales. Los metodos de la invencion pueden usarse no solo para regular la diferenciacion de citoblastos, sino que pueden usarse tambien para estimular la tasa de formacion de colonias, proporcionando beneficios significativos al trasplante de citoblastos hematopoyeticos al mejorar la velocidad de injerto de medula osea y la recuperacion de la produccion de leucocitos y/o plaquetas.
En otras realizaciones, pueden usarse los metodos de la invencion para regular la diferenciacion de, p.ej., una celula precursora neuronal o neuroblasto en un tipo de celula neuronal espedfico tal como una neurona sensorial (p.ej., una celula retiniana, una celula olfativa, una neurona mecanosensorial, una neurona quimiosensorial, etc.), una
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neurona motora, una neurona cortical o una interneurona. En otras realizaciones, pueden usarse los metodos de la invencion para regular la diferenciacion de tipos celulares que incluyen, pero sin limitacion, neuronas colinergicas, neuronas dopaminergicas, neuronas GABAergicas, celulas gliales (incluyendo oligodendrocitos, que producen mielina) y celulas ependimarias (que revisten el sistema ventricular cerebral). En aun otras realizaciones, pueden usarse los metodos de la invencion para regular la diferenciacion de celulas que son constituyentes de organos incluyendo, pero sin limitacion, celulas de Purkinje del corazon, epitelio biliar del fugado, celulas de islote beta de pancreas, celulas renales corticales o medulares y celulas fotorreceptores retinianos del ojo.
La valoracion del estado de diferenciacion de los citoblastos obtenidos segun los metodos de la invencion puede identificarse mediante la presencia de marcadores de superficie celular. Los citoblastos de tipo embrionario de la invencion, por ejemplo, pueden distinguirse por los siguientes marcadores de superficie celular: OCT-4+ y ABC-pt. Ademas, la invencion engloba citoblastos de tipo embrionario que tienen los siguientes marcadores de superficie celular: CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, SH2, SH3, SH4, OcT-4 y ABC-p, o que carecen de los siguientes marcadores de superficie celular: CD34, CD38, CD45, SSEA3 y SSEA4, como se describe en la presente memoria anteriormente. Dichos marcadores de superficie celular se determinan rutinariamente segun metodos bien conocidos en la materia, p.ej., mediante citometna de flujo, seguido de lavado y tincion con un anticuerpo anti-marcador de superficie celular. Por ejemplo, para determinar la presencia de CD34 o CD38, las celulas pueden lavarse con PBS y tenirse doblemente entonces con anti-CD34 ficoeritrina y anti-CD38 isotiocianato de fluorescema (BectonDickinson, Mountain View, CA).
5.1.2. Celulas progenitoras tempranas CD34+ y CD133+
La presente invencion proporciona tambien metodos de modulacion de la diferenciacion de celulas CD34+ o CD133+ humanas. En ciertas realizaciones, los metodos de la invencion engloban la regulacion de la diferenciacion de citoblastos o celulas progenitoras in vitro, que comprenden incubar los citoblastos con el compuesto in vitro, seguido del trasplante directo de las celulas diferenciadas a un sujeto.
Las celulas progenitoras obtenidas mediante los metodos de la invencion pueden inducirse a diferenciar a lo largo de linajes celulares espedficos incluyendo, pero sin limitacion, para celulas progenitoras CD34+, un linaje mieloide o granulocftico y, para celulas CD133+, un linaje de celulas endoteliales o neurales. En ciertas realizaciones, se inducen las celulas progenitoras a diferenciar para uso en protocolos de trasplante y tratamiento ex vivo. En ciertas realizaciones, se inducen las celulas progenitoras a diferenciar en un tipo celular particular y se genomanipulan para proporcionar un producto genico terapeutico. En una realizacion espedfica, se incuban las celulas progenitoras con un compuesto, tal como una molecula organica pequena, in vitro, que las induce a diferenciar, seguido del trasplante directo de las celulas diferenciadas a un sujeto. En una realizacion preferida, los compuestos que se usan para controlar o regular la diferenciacion de citoblastos no son polipeptidos, peptidos, protemas, hormonas, citocinas, oligonucleotidos o acidos nucleicos. En otra realizacion preferida, se hace que la celula progenitora se diferencie en una celula progenitora CD34+CD38"CD33+ o CD34+CD38"CD33".
Preferiblemente, pueden usarse los metodos de la invencion para suprimir espedficamente la generacion de globulos rojos o colonias eritropoyeticas (BFU-E y CFU-E), mientras que tanto se acrecienta la generacion de colonias formadoras de leucocitos y plaquetas (CFU-GM) como se potencia la produccion de unidades formadoras de colonias totales. Los metodos de la invencion pueden usarse no solo para regular la diferenciacion de citoblastos, sino que pueden usarse tambien para estimular la tasa de formacion de colonias, proporcionando beneficios significativos al trasplante de citoblastos hematopoyeticos al mejorar la velocidad de injerto de medula osea y la recuperacion de la produccion de leucocitos y/o plaquetas.
En otras realizaciones, pueden usarse los metodos de la invencion para reducir la diferenciacion de celulas progenitoras CD34+ en celulas CD1a+, particularmente celulas CD86+CD1a+. En otra realizacion, pueden usarse los metodos de la invencion para reducir o prevenir la diferenciacion de celulas progenitoras CD34+ en celulas CD14+CD1a". Las celulas CD14+CD1a" son celulas progenitoras de celulas dendnticas dermicas o monocitos/macrofagos. En otra realizacion, pueden usarse los metodos de la invencion para reducir la expresion en celulas progenitoras CD34+ proliferantes de las moleculas coestimulantes CD80 y CD86. En otra realizacion, pueden usarse los metodos de la invencion para reducir la diferenciacion de celulas progenitoras CD34+ proliferantes en celulas CD54bright y para fomentar la diferenciacion en celulas CD54dim. En otra realizacion, pueden usarse los metodos de la invencion para aumentar el numero de celulas CD133+, que son celulas progenitoras de celulas endoteliales. En aun otra realizacion, pueden usarse los metodos de la invencion para disminuir la diferenciacion de celulas CD34+ proliferantes en celulas CD11c"CD15+ y para aumentar la diferenciacion en celulas CD11c+CD15", desplazando por tanto la diferenciacion de un linaje de celulas dendnticas mieloides a un linaje granulocftico.
La valoracion del estado de diferenciacion de los citoblastos obtenidos segun los metodos de la invencion puede identificarse mediante la presencia de marcadores de superficie celular. Las celulas progenitoras de la invencion, por ejemplo, pueden distinguirse por los marcadores de superficie celular CD34+ o CD133+. Ademas, la invencion engloba celulas progenitoras proliferantes que poseen, o muestran una expresion aumentada respecto a un control de, uno o mas de los siguientes marcadores: CD15, CD34, CD33, CD133 o CD54dim, como se describe anteriormente en la presente memoria. La invencion engloba tambien celulas progenitoras proliferantes que carecen, o muestran una expresion reducida respecto a un control, de uno o mas de los siguientes marcadores: HLA-DR,
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CD1a, CD11c, CD38, CD80, CD86, CD54bright o CD14. En una realizacion preferida, las celulas progenitoras proliferantes de la invencion exhiben CD34+CD38-CD33+ o CD34+CD38'CD33'. Dichos marcadores de superficie celular se determinan rutinariamente segun metodos bien conocidos en la materia, p.ej., mediante lavado y tincion con un anticuerpo anti-marcador de superficie celular, seguido de citometna de flujo. Por ejemplo, para determinar la presencia de CD34 o CD38, las celulas pueden lavarse con PBS y entonces tenirse doblemente con anti-CD34 ficoeritrina y anti-CD38 isotiocianato de fluorescema (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
En ciertas realizaciones, las celulas diferenciadas pueden caracterizarse caracterizando la capacidad fagodtica de las celulas diferenciadas. La capacidad de fagocitosis de las celulas diferenciadas o en diferenciacion puede valorarse, por ejemplo, marcando dextrano con FITC y determinando la cantidad de captacion por metodos conocidos. La capacidad de las celulas diferenciadas o en diferenciacion de estimular linfocitos T puede valorarse en una reaccion de leucocitos mixtos (MLR), en la que se mezclan hipoteticamente celulas cargadas con antfgeno con linfocitos T y se determina el nivel de activacion de linfocitos T.
5.1.3. Identificacion y caracterizacion de celulas
En ciertas realizaciones, las celulas diferenciadas pueden identificarse caracterizando genes expresados diferencialmente (por ejemplo, caracterizando un conjunto de genes de una celula o celulas progenitoras indiferenciadas de interes frente a un conjunto de genes de una celula diferenciada derivada de la celula progenitora). Por ejemplo, pueden usarse metodos de amplificacion de acido nucleico tales como reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) o metodos de amplificacion basada en la transcripcion (p.ej., transcripcion in vitro (IVT)) para determinar el perfil de la expresion genica en diferentes poblaciones de celulas, p.ej., mediante el uso de una micromatriz de polinucleotido. Dichos metodos para determinar el perfil de expresion genica diferencial son bien conocidos en la materia (veanse, p.ej., Wieland et al., Proc. Natl. Acad: Sci. USA 87: 2720-2724 (1990; Lisitsyn et al., Science 259: 946-951 (1993); Lisitsyn et al., Meth. Enzymology 254: 291-304 (1995); patente de EE.UU. n° 5.436.142; patente de EE.UU. n° 5.501.964; Lisitsyn et al., Nature Genetics 6: 57-63 (1994); Hubank y Schatz,1994, Nucleic Acids Research 22: 5640-5648; Zeng et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4381-4385; patente de EE.UU. n° 5.525.471; Linsley et al., patente de EE.UU. n° 6.271.002, titulada “Metodo de amplificacion de ARN”, expedida el 7 de agosto de 2001; Van Gelder et al., patente de EE.UU. n° 5.716.785, titulada “Procesos para manipulaciones geneticas usando promotores", expedida el 10 de febrero de 1998; Stoflet et al., 1988, Science 239: 491-494, 1988; Sarkar y Sommer, 1989, Science 244: 331-334; Mullis et al., patente de EE.UU. n° 4.683.195; Malek et al., patente de EE.UU. n° 5.130.238; Kacian y Fultz, patente de EE.UU. n° 5.399.491; Burg et al., patente de EE.UU. n° 5.437.990; R.N Van Gelder et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1663; D.J. Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnol. 14, 1675; Shannon, patente de EE.UU. n° 6.132.997; Lindemann et al., patente de EE.UU. n° 6.235.503, titulada “Procedimiento para la hibridacion sustractiva y el analisis de diferencias”, expedida el 22 de mayo de 2001).
Estan disponibles kits comercialmente disponibles para determinar el perfil genico, p.ej., la serie de kits displayPROFILE™ (Qbiogene, Carlsbad, CA), que usan un enfoque basado en gel para la determinacion del perfil de expresion genica. Los kits utilizan una PCR de exhibicion diferencial de fragmentos de restriccion (RFDD-PCR) para comparar los patrones de expresion genica en celulas eucarioticas. Pueden usarse tambien un kit de sustraccion PCR-Select (Clontech) y un kit de cribado diferencial PCR-Select (Clontech), que permiten la identificacion de clones expresados diferencialmente en una coleccion de sustraccion. Despues de generar conjuntos de genes expresados diferencialmente con el kit de sustraccion PCR-Select, se usa el kit de cribado diferencial PCR-Select. Se hibrida la coleccion de sustraccion con sondas sintetizadas directamente a partir de poblaciones de muestra y de referencia, una sonda compuesta por ADNc con sustraccion y una sonda compuesta por ADNc con sustraccion inversa (una segunda sustraccion efectuada a la inversa). Los clones que hibridan con las sondas de muestra pero no de referencia se expresan diferencialmente; sin embargo, las sondas sin sustraccion no son suficientemente sensibles para detectar mensajes escasos. Las sondas con sustraccion estan enriquecidas en gran medida en ADNc expresados diferencialmente, pero pueden dar resultados falsos positivos. Usar tanto sondas con sustraccion como sin sustraccion segun las instrucciones del fabricante (Clontech) identifica genes expresados diferencialmente.
En otra realizacion, se identifican y caracterizan los citoblastos o celulas progenitoras diferenciados mediante un ensayo de unidades formadoras de colonias que es comunmente conocido en la materia, tal como el medio Mesen Cult™ (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver, Columbia britanica).
La determinacion de que un citoblasto o celula progenitora se ha diferenciado en un tipo celular particular puede lograrse mediante metodos bien conocidos en la materia, p.ej., midiendo los cambios en la morfologfa y marcadores de superficie celular usando tecnicas tales como citometna de flujo o inmunocitoqmmica (p.ej., tenir celulas con anticuerpos espedficos de tejido o espedficos de marcador celular), mediante el examen de la morfologfa de celulas usando microscopia optica o confocal o midiendo los cambios en la expresion genica usando tecnicas bien conocidas en la materia, tales como PCR y determinacion del perfil de expresion genica.
5.2. POBLACIONES DE CITOBLASTOS Y CELULAS PROGENITORAS
La presente invencion proporciona metodos de modulacion de la diferenciacion de citoblastos humanos. Puede
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usarse cualquier citoblasto de mairnfero en los metodos de la invencion incluyendo, pero sin limitacion, citoblastos aislados de sangre de cordon (celulas CB), sangre periferica, sangre adulta, medula osea, placenta, citoblastos mesenquimaticos y otras fuentes. En una realizacion no preferida, los citoblastos son celulas que se han aislado de fuentes distintas de placenta pero no son de celulas embrionarias.
Las fuentes de citoblastos mesenquimaticos incluyen medula osea, saco vitelino embrionario, placenta, cordon umbilical, piel fetal y adolescente y sangre. Las celulas de medula osea pueden obtenerse, por ejemplo, de cresta ilfaca, femures, tibias, espina dorsal, costillas u otros espacios medulares.
Los citoblastos para usar de acuerdo con los metodos de la presente invencion pueden incluir celulas pluripotentes, concretamente celulas que tienen una versatilidad de diferenciacion completa, que son autorrenovables y pueden permanecer durmientes o quiescentes en el tejido. Los citoblastos pueden incluir tambien celulas multipotentes, celulas progenitoras comprometidas y celulas fibroblastoides. En una realizacion preferida, la invencion utiliza citoblastos que son citoblastos pluripotentes viables quiescentes aislados de una placenta a termino desangrada perfundida.
Las poblaciones de citoblastos pueden consistir en citoblastos placentarios obtenidos mediante un servicio comercial, p.ej., LifeBank USA (Cedar Knolls, NJ), ViaCord (Boston MA), Cord Blood Registry (San Bruno, CA) y Cryocell (Clearwater, FL).
Las poblaciones de citoblastos pueden consistir tambien en citoblastos placentarios recogidos segun los metodos divulgados en la publicacion de solicitud de EE.UU. n° US 20020123141, publicada el 5 de septiembre de 2002, titulada "Metodo de recogida de citoblastos placentarios” y la publicacion de solicitud de EE.UU. n° US 20030032179, publicada el 13 de febrero de 2003, titulada “Placenta de mamffero postparto, su uso y citoblastos placentarios a partir de la misma”.
En una realizacion, pueden usarse citoblastos de sangre de cordon. Se hace referencia a la primera recogida de sangre de la placenta como sangre de cordon, que contiene predominantemente celulas progenitoras hematopoyeticas CD34+ y CD38+. En las primeras veinticuatro horas de perfusion postparto, pueden aislarse altas concentraciones de celulas progenitoras hematopoyeticas CD34+CD38- de la placenta. Despues de aproximadamente veinticuatro horas de perfusion, pueden aislarse altas concentraciones de celulas CD34-CD38- de la placenta junto con las celulas mencionadas anteriormente. La placenta perfundida aislada de la invencion proporciona una fuente de grandes cantidades de citoblastos enriquecidos en citoblastos CD34+CD38- y citoblastos CD34-CD38+: la placenta aislada que se ha perfundido durante veinticuatro horas o mas proporciona una fuente de grandes cantidades de citoblastos enriquecidos en citoblastos CD34- y CD38-.
Las celulas preferidas para usar de acuerdo con la presente invencion son citoblastos de tipo embrionario que se originan en placenta desangrada perfundida, o celulas que derivan de citoblastos placentarios de tipo embrionario. Los citoblastos de tipo embrionario de la invencion pueden caracterizarse midiendo los cambios de morfologfa y marcadores de superficie celular usando tecnicas tales como citometna de flujo e inmunocitoqmmica, y midiendo los cambios en la expresion genica usando tecnicas tales como PCR. En una realizacion de la invencion, dichos citoblastos de tipo embrionario pueden caracterizarse por la presencia de los siguientes marcadores de superficie celular: CD10, Cd29, CD44, cD54, CD90, SH2, SH3, SH4, OCT-4 y ABC-p, o por la ausencia de los siguientes marcadores de superficie celular: CD34, CD38, CD45, SSEA3 y SSEA4. En una realizacion preferida, dichos citoblastos de tipo embrionario pueden caracterizarse por la presencia de los marcadores de superficie celular OCT- 4 y APC-p. Dichos marcadores de superficie celular se determinan rutinariamente segun metodos bien conocidos en la materia, p.ej., mediante citometna de flujo, seguida de lavado y tincion con un anticuerpo anti-marcador de superficie celular. Por ejemplo, para determinar la presencia de celulas CD34 o CD38, las celulas pueden lavarse con PBS y entonces tenirse doblemente con anti-CD34 ficoeritrina y anti-CD38 isotiocianato de fluorescema (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
Los citoblastos de tipo embrionario originarios de placenta tienen caractensticas de los citoblastos embrionarios, pero no derivan del embrion. En otras palabras, la invencion engloba el uso de celulas OCT-4+ y ABC-p+ que son citoblastos indiferenciados que se afslan de placenta postparto perfundida. Dichas celulas son tan versatiles (p.ej., pluripotentes) como los citoblastos embrionarios humanos. Como se menciona anteriormente, pueden aislarse una serie de diferentes citoblastos pluripotentes o multipotentes de placenta perfundida en diferentes puntos temporales, p.ej., celulas hematopoyeticas CD34+CD38+, CD34+CD38- y CD34-CD38-. Segun los metodos de la invencion, se usa placenta humana despues del nacimiento como fuente de citoblastos de tipo embrionario.
Por ejemplo, despues de la expulsion desde la matriz, se desangra la placenta lo mas rapidamente posible para prevenir o minimizar la apoptosis. Posteriormente, lo antes posible despues del desangramiento, se perfunde la placenta para retirar sangre, celulas residuales, protemas, factores y cualquier otro material presente en el organo. Pueden retirarse tambien los materiales de desecho de la placenta. La perfusion continua normalmente con un perfundido apropiado durante al menos dos a mas de veinticuatro horas. En varias realizaciones adicionales, la placenta se perfunde durante al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22 horas. En otras palabras, esta invencion esta basada al menos en parte en el descubrimiento de que las celulas de una placenta postparto pueden activarse mediante desangramiento y perfusion durante una cantidad de tiempo suficiente. Por lo tanto, la placenta puede
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usarse facilmente como una fuente rica y abundante en citoblastos de tipo embrionario, pudiendo usarse dichas celulas para investigacion, incluyendo el descubrimiento de farmacos, el tratamiento y la prevencion de enfermedades, en particular cirugfas o terapias de trasplante, y la generacion de celulas, tejidos y organoides comprometidos. Vease la solicitud en tramitacion junto con la presente de n° de serie 10/004.942, presentada el 5 de diciembre de 2001, titulada "Metodo de recogida de citoblastos placentarios” y la solicitud n° de serie 10/076.180, presentada el 13 de febrero de 2002, titulada “Placenta de mairnfero postparto, su uso y los citoblastos placentarios de la misma”.
Los citoblastos de tipo embrionario se extraen de una placenta drenada mediante una tecnica de perfusion que utiliza cualquiera o ambas de la arteria umbilical y la vena umbilical. La placenta se drena preferiblemente por desangramiento y recogida de la sangre residual (p.ej., sangre de cordon umbilical residual). Se procesa entonces la placenta drenada de tal manera que se establezca un entorno de biorreactor natural ex vivo en que se reclutan citoblastos de tipo embrionario residentes en el parenquima y el espacio extravascular. Los citoblastos de tipo embrionario migran a la microcirculacion vada drenada donde, segun los metodos de la invencion, se recogen, preferiblemente por lavado en un recipiente de recogida por perfusion.
Se contempla espedficamente como parte de la invencion la modulacion de celulas progenitoras CD34+ y CD133+ en celulas mieloides, particularmente celulas dendnticas o granulodticas. Informes recientes indican que dichas celulas son pluripotentes; por tanto, la invencion contempla tambien la modulacion del desarrollo de estos progenitores en celulas de cerebro, rinon, tracto intestinal, tngado o musculo.
Puede usarse cualquier citoblasto o celula progenitora CD34+ o CD133+ de mai^ero, ave o reptil en los metodos de la invencion incluyendo, pero sin limitacion, citoblastos aislados de sangre de cordon (celulas CB), sangre periferica, sangre adulta, medula osea, placenta incluyendo placenta perfundida (vease la publicacion de solicitud de EE.UU. n° US 20030032179, publicada el 13 de febrero de 2003, titulada “Placenta de marnffero postparto, su uso y citoblastos placentarios de la misma”, citoblastos mesenquimaticos y otras fuentes. En una realizacion preferida, los citoblastos son citoblastos hematopoyeticos o celulas que se han aislado de medula osea. Dichas celulas pueden obtenerse de otros organos o tejidos, pero dichas fuentes son menos preferidas.
En una realizacion, pueden usarse celulas progenitoras de sangre de cordon o de placenta postparto. Como se senala anteriormente, la sangre de cordon contiene predominantemente celulas progenitoras hematopoyeticas CD34+ y CD38+. En las primeras veinticuatro horas de perfusion postparto, pueden aislarse altas concentraciones de celulas progenitoras hematopoyeticas CD34+CD38- de una placenta perfundida aislada. Despues de aproximadamente veinticuatro horas de perfusion, pueden aislarse altas concentraciones de celulas CD34-CD38- de la placenta junto con las celulas anteriormente mencionadas. En otra realizacion, pueden obtenerse poblaciones de celulas progenitoras mediante un servicio comercial, p.ej., Life Bank USA (Cedar Knolls, NJ), ViaCord (Boston MA), Cord Blood Registry (San Bruno, CA) y Cryocell (Clearwater, FL).
5.3. LOS COMPUESTOS DE LA INVENCION
Se hace referencia a los compuestos divulgados en la presente memoria como “compuestos inmunomoduladores” e incluyen compuestos inmunomoduladores que son racemicos, estereoisomericamente enriquecidos o estereoisomericamente puros y sales, solvatos, hidratos, estereoisomeros, clatratos y profarmacos farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los compuestos preferidos usados en la invencion son moleculas organicas pequenas que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 1000 g/mol y no son protemas, peptidos, oligonucleotidos, oligosacaridos u otras macromoleculas.
Como se usa en la presente memoria y a menos que se indique otra cosa, el termino “estereoisomericamente puro” significa una composicion que comprende un estereoisomero de un compuesto y esta sustancialmente exento de otros estereoisomeros de ese compuesto. Por ejemplo, una composicion estereoisomericamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral estara sustancialmente exenta del enantiomero opuesto del compuesto. Una composicion estereoisomericamente pura de un compuesto que tiene dos centros quirales estara sustancialmente exenta de otros diastereomeros del compuesto. Como se usa en la presente memoria y a menos que se indique otra cosa, el termino “enantiomericamente puro” significa una composicion estereoisomericamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral. Como se usa en la presente memoria y a menos que se indique otra cosa, el termino “estereoisomericamente enriquecido” significa una composicion que comprende mas de aproximadamente un 60 % en peso de un estereoisomero de un compuesto, preferiblemente mas de aproximadamente un 70 % en peso, mas preferiblemente mas de aproximadamente un 80 % en peso de un estereoisomero de un compuesto. Como se usa en la presente memoria, el termino “enantiomericamente puro” significa una composicion estereoisomericamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral. De forma similar, el termino “enantiomericamente enriquecido” significa una composicion estereoisomericamente enriquecida de un compuesto que tiene un centro quiral.
Como se usa en la presente memoria y a menos que se indique otra cosa, el termino “compuestos inmunomoduladores” o “IMID™” (Celgene Corporation) usado en la presente memoria engloba moleculas organicas pequenas que inhiben notablemente la produccion de IL1 p e IL12 monodticas inducidas por TNF-a y LPS e inhiben parcialmente la produccion de IL6. Los compuestos inmunomoduladores espedficos de la invencion se discuten a continuacion. Estos compuestos pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, en Celgene, o prepararse de
acuerdo con los metodos descritos en las patentes o publicaciones enumeradas en la presente memoria.
El TNF-a es una citocina inflamatoria producida por macrofagos y monocitos durante la inflamacion aguda. El TNF-a es responsable de un diverso intervalo de eventos de senalizacion en celulas. El TNF-a puede desempenar un papel patologico en el cancer. Sin limitarse a teona particular alguna, uno de los efectos biologicos ejercidos por los 5 compuestos inmunomoduladores de la invencion es la reduccion de la smtesis de TNF-a. Los compuestos inmunomoduladores de la invencion potencian la degradacion de ARNm de TNF-a.
Ademas, sin limitarse a teona particular alguna, los compuestos inmunomoduladores usados en la invencion pueden ser tambien coestimulantes potentes de linfocitos T y aumentar la proliferacion celular drasticamente de manera dependiente de la dosis. Los compuestos inmunomoduladores de la invencion pueden tener tambien un mayor 10 efecto coestimulante sobre el subconjunto de linfocitos T CD8+ que sobre el subconjunto de linfocitos T CD4+. Ademas, los compuestos tienen preferiblemente propiedades antiinflamatorias y coestimulan eficazmente los linfocitos T.
Los ejemplos espedficos de compuestos inmunomoduladores divulgados en la presente memoria incluyen, pero sin limitacion, derivados de ciano y carboxi de estirenos sustituidos tales como los divulgados en la patente de EE.UU. 15 n° 5.929.117; 1-oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-il)isoindolinas y 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3- il)isoindolinas tales como aquellas descritas en la patente de EE.UU. n° 5.874.448; las 2-(2,6-dioxopiperdin-3-il)-1- oxoisoindolinas tetrasustituidas descritas en la patente de EE.UU. n° 5.798.368; 1-oxo- y 1,3-dioxo-2-(2,6- dioxopiperidin-3-il)isoindolinas (p.ej., derivados de 4-metilo de talidomida y EM-12) incluyendo, pero sin limitacion, aquellas divulgadas en la patente de EE.UU. n° 5.635.517 y una clase de amidas dclicas no polipeptfdicas 20 divulgadas en las patentes de EE.UU. n° 5.698.579 y 5.877.200. Los compuestos inmunomoduladores de la invencion no incluyen talidomida.
Otros compuestos inmunomoduladores espedficos divulgados en la presente memoria incluyen, pero sin limitacion, 1-oxo- y 1,3 dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolinas sustituidas con amino o amino sustituido en el anillo de benceno como se describen en la patente de EE.UU. n° 5.635.517. Estos compuestos tienen la estructura I:
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en que uno de X e Y es C=O, el otro de X e Y es C=O o CH2 y R2 es hidrogeno o alquilo inferior, en particular metilo. Los compuestos inmunomoduladores espedficos incluyen, pero sin limitacion:
1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-aminoisoindolina;
1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-5-aminoisoindolina;
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1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-7-aminoisoindolina;
1,3-dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-aminoisoindolina
y 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-5-aminoisoindolina.
Otros compuestos inmunomoduladores espedficos divulgados en la presente memoria pertenecen a la clase de 235 (2,6-dioxopiperidin-3-il)ftalimidas sustituidas y 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindoles sustituidos, tales como
aquellos descritos en las patentes de EE.uU. n° 6.281.230, 6.316.471, 6.335.349 y 6.476.052 y la solicitud de patente internacional n° PCT/US97/13375 (publicacion internacional n° WO 98/03502).
Los compuestos representativos de esta clase son de formulas:
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en las que R1 es hidrogeno o metilo. En una realizacion separada, la memoria descriptiva divulga el uso de formas enantiomericamente puras (p.ej., enantiomeros (R) o (S) opticamente puros) de estos compuestos.
Todav^a otros compuestos inmunomoduladores espedficos divulgados en la presente memoria pertenecen a una clase de isoindolimidas divulgadas en las solicitudes de patente de EE.UU. n° 10/032.286 y 09/972.487 y la solicitud internacional n° PCT/US01/50401(publicaci6n internacional n° WO 02/059106). Los compuestos representativos son de formula II:
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y sales, hidratos, solvatos, clatratos, enantiomeros diastereomeros, racematos y mezclas de estereoisomeros farmaceuticamente aceptables de los mismos, en la que:
uno de X e Y es C=O y el otro es CH2 o C=O;
R1 es H, alquilo (C-i-Cs), cicloalquilo (C3-C7), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, alquil (C0-C4)- heterocicloalquilo (C1-C6), alquil (C0-C4)-heteroarilo (C2-C5), C(O)R3, C(S)R3, C(O)OR4, alquil (CrC8)-N(R6)2, alquil (C1-C8)-OR5, alquil (C1-C8)-C(O)OR5, C(O)NHR3, C(S)NHR3, C(O)NR3R3, C(S)NR3R3' o alquil (C1-C8)-O(CO)R5;
R2 es H, F, bencilo, alquilo (C1-C8), alquenilo (C2-C8) o alquinilo (C2-C8);
R3 y R3 son independientemente alquilo (C1-C8), cicloalquilo (C3-C7), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, alquil (C0-C4)-heterocicloalquilo (C1-C6), alquil (C0-C4)-heteroarilo (C2-C5), alquil (C0-C8)-N(R6)2, alquil (C1-C8)- OR5, alquil (C1-C8)-C(O)OR5, alquil (C1-C8)-O(CO)R5 o C(O)OR5;
R4 es alquilo (C1-C8), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), alquil (C1-C4HOR5, bencilo, arilo, alquil (C0-C4)-
heterocicloalquilo (C1-C6) o alquil (C0-C4)-heteroarilo (C2-C5);
R5 es alquilo (C1-C8), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo o heteroarilo (C2-C5);
cada aparicion de R6 es independientemente H, alquilo (C1-C8), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, heteroarilo (C2-C5) o alquil (Cq-C8)-C(0)0-R5 o los grupos R6 pueden unirse formando un grupo heterocicloalquilo;
n es 0 o 1; y
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* representa un centro de carbono quiral.
En compuestos espedficos de formula II, cuando n es 0 entonces R1 es cicloalquilo (C3-C7), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, alquil (C0-C4)-heterocicloalquilo (C1-C6), alquil (C0-C4)-heteroarilo (C2-C5), C(O)R3, C(O)OR4, alquil (C1-C8)-N(R6)2, alquil (C1-C8)-OR5, alquil (C1-C8)-C(O)OR5, C(S)NHR3 o alquil (C1-C8)-O(CO)R5;
R2 es H o alquilo (C1-C8) y
R3 es alquilo (C1-C8), cicloalquilo (C3-C7), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, alquil (C0-C4)-
heterocicloalquilo (C1-C6), alquil (C0-C4)-heteroarilo (C2-C5), alquil (C5-C8)-N(R6)2; alquil (C0-C8)-NH-C(O)OR5; alquil (Ci-C8)-OR5, alquil (Ci-C8)-c(o)Or5, alquil (Ci-C8)-O(CO)R5 o C(O)OR5; y las demas variables tienen las mismas definiciones.
En otros compuestos espedficos de formula II, R2 es H o alquilo (C1-C4).
En otros compuestos espedficos de formula II, R1 es alquilo (C1-C8) o bencilo.
En otros compuestos espedficos de formula II, R1 es H, alquilo (C-i-Cs), bencilo, CH2OCH3, CH2CH2OCH3 0
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En otra realizacion de los compuestos de formula II
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R1 es
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o
en las que Q es O o S, y cada aparicion de R7 es independientemente H, alquilo (C1-C8), bencilo, CH2OCH3 o CH2CH2OCH3.
En otros compuestos espedficos de formula II, R1 es C(O)R3
En otros compuestos espedficos de formula II, R3 es alquil (C0-C4)-heteroarilo (C2-C5), alquilo (C1-C8), arilo o alquil (C0-C4)-OR5.
En otros compuestos espedficos de formula II, el heteroarilo es piridilo, furilo o tienilo.
En otros compuestos espedficos de formula II, R1 es C(O)OR4
En otros compuestos espedficos de formula II, el H de C(O)NHC(O) puede reemplazarse por alquilo (C1-C4), arilo o bencilo.
Todavfa otros compuestos inmunomoduladores espedficos de la invencion pertenecen a una clase de isoindolimidas divulgadas en la solicitud de patente de Ee.UU. n° de serie 09/781.179, la publicacion internacional n° WO 98/54170 y la patente de EE.UU. n° 6.395.754. Los compuestos representativos son de formula III:
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y las sales, hidratos, solvatos, clatratos, enantiomeros, diastereomeros, racematos y mezclas de estereoisomeros farmaceuticamente aceptables de los mismos, en la que:
uno de X e Y es C=O y el otro es CH2 o C=O;
R es H o CH2OCOR';
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(i) cada uno de R1, R2, R3 o R4, independientemente de los demas, es halogeno, alquilo de 1 a 4 atomos de carbono o alcoxi de 1 a 4 atomos de carbono o (ii) uno de R1, R2, R3 o R4 es nitro o -NHR5 y el resto de R1, R2, R3 o R4 son hidrogeno;
R5 es hidrogeno o alquilo de 1 a 8 carbonos;
R6 es hidrogeno, alquilo de 1 a 8 atomos de carbono, benceno, cloro o fluoro;
R' es R7-CHR10-N(R8R9);
R7 es m-fenileno o p-fenileno o -(CnH2n)- en que n tiene un valor de 0 a 4;
cada uno de R8 y R9 tornados independientemente entre sf es hidrogeno o alquilo de 1 a 8 atomos de carbono, o R8 y R9 tornados conjuntamente son tetrametileno, pentametileno, hexametileno o -CH2CH2[X]X1CH2CH2- en que [X]X1 es -O-, -S- o -NH-;
R10 es hidrogeno, alquilo de a 8 atomos de carbono o fenilo; y * representa un centro de carbono quiral.
Los compuestos inmunomoduladores de la invencion son 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il) y pueden obtenerse mediante metodos sinteticos estandares (vease, p.ej., la patente de EE.UU. n° 5.635.517). Los compuestos estan disponibles en Celgene Corporation, Warren, N.J. La 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona tiene la siguiente estructura qmmica:
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La 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona tiene la siguiente estructura qmmica:
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5.4. METODOS DE CULTIVO DE CITOBLASTOS
En ciertas realizaciones de la invencion, se exponen los citoblastos o celulas progenitoras, incluyendo pero sin limitacion, citoblastos de tipo embrionario, celulas progenitoras, celulas pluripotentes, celulas totipotentes, celulas multipotentes, celulas endogenas de una placenta postparto perfundida, celulas de sangre de cordon, citoblastos o celulas progenitoras derivados de sangre periferica o sangre adulta o celulas de medula osea a los compuestos de la invencion y se inducen a diferenciar. Estas celulas pueden propagarse in vitro usando metodos bien conocidos en la materia o, como alternativa, pueden propagarse en una placenta postparto perfundida.
En ciertas realizaciones, pueden recogerse celulas endogenas de una placenta postparto perfundida de la placenta y el medio de cultivo y cultivarse in vitro en condiciones apropiadas y durante un tiempo suficiente para inducir la diferenciacion en el tipo o linaje celular deseado. Vease la publicacion de solicitud de Ee.UU. n° US 20030032179, publicada el 13 de febrero de 2003, titulada “Placenta de mairnfero postparto, su uso y citoblastos placentarios de la misma”.
En otra realizacion de la invencion, los citoblastos o celulas progenitoras no derivan de una placenta postparto perfundida, sino que en lugar de ello se afslan de otras fuentes tales como sangre de cordon, medula osea, sangre periferica o sangre adulta, se exponen a los compuestos de la invencion y se inducen a diferenciar. En una realizacion preferida, se realiza la diferenciacion in vitro en condiciones apropiadas y durante un tiempo suficiente para inducir la diferenciacion en el linaje o tipo celular deseado. Los compuestos de la invencion se usan en los medios de diferenciacion/cultivo mediante adicion, generacion in situ o cualquier otra manera que permita el contacto de los citoblastos o celulas progenitoras con los compuestos de la invencion.
En otra realizacion, los citoblastos cultivados, p.ej. citoblastos cultivados in vitro o en una placenta postparto
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perfundida, se estimulan a proliferar en cultivo, por ejemplo, mediante la administracion de eritropoyetina, citocinas, linfocinas, interferones, factores estimulantes de colonias (CSF), interferones, quimiocinas, interleucinas, factores de crecimiento hematopoyeticos humanos recombinantes incluyendo ligandos, factores de citoblastos, trombopoyetina (Tpo), interleucinas y factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) u otros factores de crecimiento.
Despues de la recogida y/o aislamiento de las celulas cultivadas, pueden identificarse y caracterizarse mediante un ensayo de unidad formadora de colonias, que es comunmente conocido en la materia, tal como el medio Mesen Cult™ (Stem cell Technologies, Inc., Vancouver, Columbia britanica).
Los metodos para cultivar citoblastos o celulas progenitoras in vitro son bien conocidos en la materia, p.ej. veanse Thomson et al., 1998, Science 282: 1145-47 (citoblastos embrionarios); Hirashima et al., 1999, Blood 93(4): 1253-63 y Hatzopoulos et al., 1998, Development 125: 1457-1468 (progenitores celulares endoteliales); Slager et al., 1993, Dev. Genet. 14(3): 212-24 (progenitores neuronales o musculares); Genbachev et al., 1995, Reprod. Toxicol. 9(3): 245-55 (citotrofoblastos, concretamente, progenitores de celulas epiteliales placentarias); Nadkarni et al. 1984, Tumori 70: 503-505, Melchner et al., 1985, Blood 66(6): 1469-1472, publicacion internacional PCT WO 00/27999 publicada el 18 de mayo de 2000, Himori et al., 1984, Intl. J. Cell Cloning 2: 254-262 y Douay et al., 1995, Bone Marrow Transplantation 15: 769-775 (celulas progenitoras hematopoyeticas); Shamblott et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726-31 (celulas germinales primordiales); Yan et al., 2001, Devel. Biol. 235: 422-432 (citoblastos trofoblasticos). Dichos metodos pueden adaptarse facilmente para uso en los metodos de la invencion, a condicion de que el cultivo de las celulas progenitoras incluya una etapa o etapas de cultivo de celulas con un compuesto de la invencion, en los momentos indicados, produciendo la poblacion o poblaciones deseadas de celulas diferenciadas.
5.4.1. Cultivo de citoblastos in vitro
Los metodos de la invencion engloban la regulacion de la diferenciacion de citoblastos o celulas progenitoras in vitro, que comprenden incubar las celulas con un compuesto tal como una molecula organica pequena de la presente invencion, in vitro, que las induzca a diferenciar en celulas de un linaje celular deseado, seguido de trasplante directo de las celulas diferenciadas a un sujeto. En una realizacion preferida, se inducen las celulas a diferenciar en un linaje celular hematopoyetico.
En ciertas realizaciones, los citoblastos cultivados de interes se exponen in vitro a una concentracion 0,1 pg/ml, 0,2 |jg/ml, 0,3 pg/ml, 0,4 pg/ml, 0,5 pg/ml, 1 pg/ml, 5 pg o 10 pg/ml de un compuesto de la invencion. Preferiblemente, se exponen las celulas de interes a una concentracion de talidomida de aproximadamente 0,005 pg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, una concentracion de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona de aproximadamente 0,005 pg/ml a aproximadamente 5 mg/ml (Celgene Corp., Warren, NJ), una concentracion de 3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona de aproximadamente 0,005 pg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, una concentracion de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona de aproximadamente 0,005 pg/ml a aproximadamente 5 mg/ml o una concentracion de 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6- diona de aproximadamente 0,005 pg/ml a aproximadamente 5 mg/ml (vease tambien la seccion 5.7, “Composiciones farmaceuticas”).
En ciertas realizaciones, los citoblastos de tipo embrionario se inducen a propagar en el biorreactor de placenta mediante la introduccion de nutrientes, hormonas, vitaminas, factores de crecimiento o cualquier combinacion de los mismos en la disolucion de perfusion. Pueden anadirse suero y otros factores de crecimiento a la solucion o medio de perfusion de propagacion. Los factores de crecimiento son habitualmente protemas e incluyen, pero sin limitacion: citocinas, linfocinas, interferones, factores estimulantes de colonias (CSF), interferones, quimiocinas e interleucinas. Otros factores de crecimiento que pueden usarse incluyen factores de crecimiento hematopoyeticos humanos recombinantes incluyendo ligandos, factores de citoblastos, trombopoyetina (Tpo), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor inhibidor de leucemia, factor de crecimiento fibroblastico basico, factor de crecimiento derivado de placenta y factor de crecimiento epidermico.
Los factores de crecimiento introducidos en la disolucion de perfusion pueden estimular la propagacion de citoblastos de tipo embrionario indiferenciados, celulas progenitoras comprometidas o celulas diferenciadas (p.ej., celulas hematopoyeticas diferenciadas). Los factores de crecimiento pueden estimular la produccion de materiales biologicos y moleculas bioactivas incluyendo, pero sin limitacion, inmunoglobulinas, hormonas, enzimas o factores de crecimiento como se describen anteriormente. La placenta cultivada debena “alimentarse” periodicamente para retirar los medios gastados, despoblar de celulas liberadas y anadir medio reciente. La placenta cultivada debena almacenarse en condiciones esteriles para reducir la posibilidad de contaminacion, y mantenerse a presion de forma intermitente y periodica para crear condiciones que mantengan un suministro adecuado de nutrientes a las celulas de la placenta. Debena reconocerse que la perfusion y cultivo de la placenta puede tanto automatizarse como informatizarse para una eficacia y capacidad aumentadas.
5.4.2. Cultivo de celulas progenitoras in vitro
Los metodos de la invencion engloban tambien la regulacion y modulacion del desarrollo de celulas progenitoras, particularmente celulas progenitoras CD34+ y CD133+. En una realizacion de la invencion, se inducen las celulas
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progenitoras a diferenciar en un linaje celular hematopoyetico. En una realizacion espedfica, el linaje es un linaje granulocftico. En una realizacion alternativa, se inducen celulas CD133+ a diferenciar en celulas endoteliales, celulas de cerebro, celulas de rinon, celulas de hftgado o celulas de tracto intestinal.
Las celulas progenitoras pueden cultivarse mediante metodos estandares, como se senala anteriormente. Adicionalmente, el cultivo de las celulas progenitoras puede comprender poner en contacto las celulas en diversos momentos o marcos temporales durante el cultivo, para impulsar la diferenciacion de celulas progenitoras a linajes celulares diferentes.
Por tanto, en un metodo de cultivo de celulas progenitoras CD34+ o CD133+, se siembran celulas el dfa 0 en medio que contiene factor de citoblastos (SCF), Flt-3L, GM-CSF y TNF-a y se cultivan durante seis dfas. El sexto dfa, se resiembran las celulas en medio que contiene GM-CSF y TNF-a y se continua el cultivo durante seis dfas adicionales. Este metodo da como resultado la generacion de celulas dendnticas. En una variacion de este metodo, se siembran inicialmente las celulas en medio que contiene GM-CSF e IL-4 y se cambia entonces el sexto dfa a medio acondicionado para monocitos (vease Steinman et al., publicacion internacional n° WO 97/29182). Para producir una poblacion de celulas progenitoras CD34+CD38-CD33+ o CD34+CD38-CD33-, se ponen en contacto las celulas progenitoras con un compuesto de la invencion el dfa 0, y se recogen las celulas progenitoras CD34+CD38-CD33+ o CD34+CD38-CD33- el dfa 6.
Los inventores han descubierto que el momento de la adicion del compuesto o compuestos de la invencion, 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, tiene un efecto sustancial sobre la ruta de diferenciacion de celulas CD34+ en celulas de linajes particulares, y sobre la diferenciacion de celulas CD133+. Las celulas progenitoras CD34+, cultivadas en condiciones estandares, siguen una ruta o linaje de desarrollo mieloide, concretamente se vuelven celulas dendnticas al cabo de 12 dfas despues de la siembra inicial (concretamente, despues del cultivo inicial). Sin embargo, la adicion de un compuesto de la invencion en uno de varios momentos particulares durante los primeros seis dfas de cultivo altera sustancialmente esta ruta. Por ejemplo, si se exponen celulas CD34+, particularmente CD34+ derivadas de medula osea, a un compuesto de la invencion, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona el primer dfa de cultivo, se suprime la diferenciacion a lo largo del linaje mieloide, como se evidencia por el aumento del numero de celulas CD34+CD38- y la disminucion del numero de celulas CD1a+CD14- el dfa 6 de cultivo, respecto a un control no expuesto a un compuesto de la invencion (concretamente, expuesto a DMSO). Ademas, la exposicion a un compuesto de la invencion conduce a la supresion del desarrollo de celulas que expresan marcadores de superficie expresados por celulas en un linaje celular dendntico, tales como CD80 y CD86. La puesta en contacto el dfa inicial de cultivo, o en cualquier punto hasta tres dfas despues del dfa inicial de cultivo, con un compuesto de la invencion conduce a dicha modulacion del desarrollo de celulas progenitoras CD34+. El aumento del numero de celulas CD34+ se intensifica si se procuran multiples dosis de un compuesto de la invencion entre el dfa 0 y el dfa 6, por ejemplo dosis el dfa 0 y el dfa 2, el dfa 0 y el dfa 4, dosis el dfa 3 y el dfa 6 o dosis el dfa 2, el dfa 4 y el dfa 6.
En un aspecto particularmente util de la invencion, la adicion de un compuesto de la invencion el primer dfa de cultivo de celulas progenitoras CD34+ y la continuacion de la exposicion hasta el dfa 12, conduce al desarrollo de una celula progenitora unica que expresa una combinacion unica de marcadores de superficie celular: CD34+CD38-CD33+ o CD34+CD38-CD33-. La poblacion de celulas CD34+CD38-CD33+ o CD34+CD38-CD33- representa una etapa intermedia de diferenciacion. Esta poblacion es util como poblacion expansible de celulas progenitoras que puede trasplantarse facilmente a un paciente necesitado de una poblacion de desarrollo rapido de celulas de linaje hematopoyetico, por ejemplo celulas granulocfticas. En otra realizacion, pueden sembrarse celulas CD34+ y cultivarse durante la fase proliferativa (aproximadamente 6 dfas) en medio estandar (concretamente, no expuesto a 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona, 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin- 2,6-diona o similares), cambiarse entonces al mismo o medio similar que contiene 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona o similar, y continuar el cultivo hasta el dfa 12. En esta realizacion, las celulas en diferenciacion muestran ftpicamente una expresion disminuida de CD80, CD86 y CD14, pero dan como resultado una persistencia aumentada de una poblacion de celulas CD1a+ respecto a los controles. Dichas celulas en diferenciacion no se impiden de volverse celulas dendnticas. En otra realizacion, se tratan celulas CD34+ durante la fase proliferativa (dfas 1-6 despues de la siembra) durante al menos tres dfas consecutivos con 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona, 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona u otro compuesto de la invencion. En aun otra realizacion, se tratan celulas progenitoras CD34+ o CD133+ dos o mas veces con 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona, 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona u otro compuesto divulgado en la presente memoria durante los primeros seis dfas despues de la siembra. Dichos tratamientos multiples dan como resultado un aumento en la proliferacion de las poblaciones tanto de CD34+ como de CD133+. Los tratamientos multiples con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona u otro compuesto de la invencion causan tambien un desplazamiento en la diferenciacion de las celulas progenitoras CD34+ desde un linaje CD11c+CD15- hacia un linaje CD11c-CD15+, concretamente, desde un linaje de celula dendntica mieloide hacia un linaje granulocftico (FIG. 6B).
El tratamiento de las celulas progenitoras desde el dfa 0 de cultivo, particularmente dosis multiples entre el dfa 0 y el dfa 6, da tambien como resultado un aumento del numero de celulas progenitoras CD133+, particularmente un aumento de la poblacion de progenitores CD34+CD133+. CD133 es un marcador hematopoyetico que es una
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alternativa al aislamiento de CD34, ya que las celulas CD133+ pueden expandirse de la misma manera que el subconjunto CD34+ y conservar su capacidad multilinaje (vease Kobari et al., J. Hematother. Stem Cell Res. 10(2): 273-81 (2001)). Se ha resenado que CD133+ esta presente en celulas CD34- de tejido cerebral fetal humano y mostraba potentes injerto, proliferacion, migracion y diferenciacion neural cuando se inyectaba en ratones neonatos (vease Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 19: 97(26): 14720-5 (2000)). Los citoblastos hematopoyeticos CD133+ se ha mostrado que estan enriquecidos en actividad progenitora con capacidad clonogenica aumentada y mayor injerto en ratones NOD-SCID.
A pesar de lo anterior, si un compuesto de la invencion se pone en contacto con celulas progenitoras CD34+ en proliferacion despues de tres dfas de cultivo (concretamente, en cualquier momento entre 3-6 dfas despues del cultivo inicial), las celulas progenitoras en proliferacion, que ya han empezado a expresar el marcador de superficie celular CD1a, muestran una persistencia sustancialmente aumentada de la expresion de este marcador respecto a controles tratados con DMSO. Es importante senalar que no esta asociada citotoxicidad con esta persistencia aumentada. En otras palabras, el tratamiento con Actimid™ no causa la apoptosis de otras poblaciones celulares. El efecto neto es un mantenimiento de la capacidad inmune existente y el desarrollo de una nueva capacidad inmune.
Por tanto, en una realizacion del metodo de la invencion, se modula la diferenciacion de celulas CD34+ en celulas dendnticas (concretamente se suprime) poniendo en contacto las celulas progenitoras CD34+ con un compuesto de la invencion el dfa 0 de cultivo (concretamente, el primer dfa de cultivo). En otra realizacion, se potencia la diferenciacion de celulas CD34+ en celulas granulocfticas poniendo en contacto las celulas progenitoras CD34+ con un compuesto de la invencion el dfa 0 de cultivo (concretamente, el primer dfa de cultivo). En otra realizacion, se potencia la diferenciacion de celulas CD34+ en una poblacion de celulas CD34+CD38-CD33+ o CD34+CD38- CD33- poniendo en contacto las celulas progenitoras CD34+ con un compuesto de la invencion durante los 3 primeros dfas de cultivo. En otra realizacion, se potencia o aumenta una poblacion CD34+CD133+ poniendo en contacto celulas progenitoras con un compuesto de la invencion en dosis multiples del dfa 0 al dfa 6 de cultivo. En otra realizacion, se potencia o aumenta la persistencia de una poblacion de celulas CD1a+ poniendo en contacto las celulas progenitoras CD34+ con un compuesto de la invencion el dfa 6 de cultivo, en la que dichas celulas CD34+ se diferencian en celulas que exhiben el marcador de superficie CD1a y en la que dicho cultivo incluye ningun contacto con dicho compuesto durante hasta seis dfas.
En las realizaciones anteriores, se entendera que dichas variaciones en la administracion de Actimid™, Revimid™ o un compuesto relacionado pueden hacerse en las celulas progenitoras in vivo, p.ej., tal como en un paciente al que se han trasplantado o injertado dichas celulas, asf como en las celulas progenitoras in vitro.
Los metodos de la invencion engloban la regulacion de la diferenciacion de citoblastos o celulas progenitoras in vitro, que comprenden incubar las celulas con un compuesto, tal como una molecula organica pequena de la presente invencion, in vitro, que las induce a diferenciar en celulas de un linaje celular deseado, seguido del trasplante directo de las celulas diferenciadas a un sujeto. En una realizacion preferida, se inducen las celulas a diferenciar en un linaje celular hematopoyetico. En una realizacion alternativa, se inducen las celulas CD133+ a diferenciar en celulas endoteliales, celulas de cerebro, celulas de rinon, celulas de tHgado o celulas de tracto intestinal.
Debena senalarse que los metodos descritos en la presente memoria se contemplan para uso con celulas progenitoras CD34+ o CD133+ derivadas de mairnferos, preferiblemente seres humanos, pero se contemplan tambien para uso con celulas progenitoras de aves o reptiles. Los compuestos de la invencion, sin embargo, son potencial y variablemente potentes dependiendo de la especie de la que deriven las celulas progenitoras. Por lo tanto, se contempla tambien cierta variacion en los metodos de cultivo, particularmente con respecto a la concentracion del compuesto o compuestos administrados. Por ejemplo, las celulas progenitoras de origen murido son menos sensibles a los compuestos de la invencion, por ejemplo 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3- diona, y requerinan mayores concentraciones para conseguir los efectos obtenibles a 1 |jM con celulas progenitoras de origen humano. Los especialistas en la materia entendenan que dichas optimizaciones son rutinarias.
5.5. INGENIERIA GENETICA DE CITOBLASTOS Y CELULAS PROGENITORAS
En otra realizacion preferida de la invencion, se genomanipulan los citoblastos o celulas progenitoras para diferenciar de acuerdo con los metodos de la invencion antes o despues de exposicion a los compuestos de la invencion usando, por ejemplo, un vector vmco tal como u vector adenovmco o retrovmco, o usando medios mecanicos tales como captacion liposomica o mediada qmmicamente del ADN. En realizaciones espedficas, se genomanipulan las celulas progenitoras CD34+, se tratan entonces con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin- 1,3-diona, 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona o un analogo de cualquiera. En otra realizacion, se tratan dichas celulas con un compuesto de la invencion y entonces se genomanipulan.
Puede introducirse un vector que contiene un transgen en una celula de interes mediante metodos bien conocidos en la materia, p.ej., transfeccion, transformacion, transduccion, electroporacion, infeccion, microinyeccion, fusion celular, DEAE-dextrano, precipitacion con fosfato de calcio, liposomas, LIPOFECTIN™, fusion lisosomica, lfpidos cationicos sinteticos, el uso de una pistola genica o un transportador vector de ADN de tal modo que el transgen se transmita a celulas hija, p.ej., los citoblastos de tipo embrionario o celulas progenitoras hijos producidos por la division de un citoblasto de tipo embrionario. Para las diversas tecnicas para la transformacion o transfeccion de
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celulas de mai^ero, veanse Keown et al., 1990, Methods Enzymol. 185: 527-37; Sambrook et al., 2001, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 3a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.
Preferiblemente, se introduce el transgen usando cualquier tecnica, siempre que no sea destructiva para la membrana nuclear de la celula u otras estructuras celulares o geneticas existentes. En ciertas realizaciones, se inserta el transgen en el material genetico nucleico mediante microinyeccion. La microinyeccion de celulas y estructuras celulares es comunmente conocida y practicada en la materia.
Para una transfeccion estable de celulas de mairnfero cultivadas, tales como cultivo de celulas en una placenta, solo una pequena fraccion de celulas puede integrar el ADN extrano en su genoma. La eficacia de integracion depende del vector y de la tecnica de transferencia usados. Para identificar y seleccionar los integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (p.ej., para resistencia a antibioticos) en el citoblasto de tipo embrionario hospedador junto con la secuencia genica de interes. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las celulas transfectadas establemente con el acido nucleico introducido pueden identificarse mediante seleccion farmacologica (p.ej., las celulas que han incorporado el gen marcador seleccionable sobreviviran, mientras que las demas celulas mueren). Dichos metodos son particularmente utiles en metodos que implican recombinacion homologa en celulas de marnffero (p.ej., en citoblastos de tipo embrionario) antes de la introduccion o el trasplante de las celulas recombinantes en un sujeto o paciente.
Pueden usarse una serie de sistemas de seleccion para seleccionar citoblastos hospedadores transformados, tales como celulas de tipo embrionario o celulas progenitoras, tales como celulas progenitoras CD34+ o CD133+. En particular, el vector puede contener marcadores detectables o seleccionables. Otros metodos de seleccion incluyen, pero sin limitacion, seleccionar otro marcador tal como: genes de timidina cinasa de herpesvirus simplex (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hipoxatina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) en celulas tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Tambien puede usarse la resistencia antimetabolito como base de la seleccion de los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, que confiere resistencia a acido micofenolico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicosido G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1)ehygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).
El transgen puede integrarse en el genoma de la celula de interes preferiblemente por integracion aleatoria. En otras realizaciones, el transgen puede integrarse mediante un metodo dirigido, p.ej., mediante recombinacion homologa dirigida (concretamente, “activacion genica” o “desactivacion genica” de un gen de interes en el genoma de la celula de interes), Chappel, patente de EE.UU. n° 5.272.071 y la publicacion PCT n° WO 91/06667, publicada el 16 de mayo de 1991; patente de EE.UU. n° 5.464.764; Capecchi et al., expedida el 7 de noviembre de 1995; patente de EE.UU. n° 5.627.059, Capecchi et al. expedida el 6 de mayo de 1997; patente de EE.UU. n° 5.487.992, Capecchi et al., expedida el 30 de enero de 1996).
Son conocidos en la materia metodos para generar celulas que tienen modificaciones genicas orientadas mediante recombinacion homologa. El constructo comprendera al menos una porcion de un gen de interes con una modificacion genetica deseada, e incluira regiones de homologfa con el locus diana, concretamente la copia endogena del gen diana en el genoma del hospedador. Los constructos de ADN para integracion aleatoria, en contraposicion con aquellos usados para recombinacion homologa, no tienen que incluir regiones de homologfa para mediar la recombinacion. Pueden incluirse marcadores en el constructo orientador o constructo aleatorio para efectuar una seleccion positiva y negativa para insercion del transgen.
Para crear una celula recombinante homologa, p.ej., un citoblasto de tipo embrionario recombinante homologo, celula placentaria endogena o celula exogena cultivada en la placenta, se prepara un vector de recombinacion homologa en que un gen de interes esta flanqueado en sus extremos 5' y 3' por secuencias genicas que son endogenas del genoma de la celula diana, para permitir que aparezca recombinacion homologa entre el gen de interes portado por el vector y el gen endogeno en el genoma de la celula diana. Las secuencias de acido nucleico flanqueantes adicionales son de suficiente longitud para una recombinacion homologa exitosa con el gen endogeno en el genoma de la celula diana. Tfpicamente, se incluyen varias kilobases de ADN flanqueante (en ambos extremos 5' y 3') en el vector. Los metodos para construir vectores de recombinacion homologos y animales recombinantes homologos a partir de citoblastos recombinantes son comunmente conocidos en la materia (veanse, p.ej., Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51: 503; Bradley, 1991, Curr. Opin. Bio/Technol. 2: 823-29 y las publicaciones PCT n° wO 90/11354, WO 91/01140 y WO 93/04169.
En una realizacion espedfica, se usan los metodos de Bonadio et al. (patente de EE.UU. n° 5.942.496, titulada “Metodos y composiciones para transferencia genica multiple en celulas oseas”, expedida el 24 de agosto de 1999 y del documento PCT WO95/22611, titulado “Metodos y composiciones para estimular celulas oseas”, publicado el 24 de agosto de 1995) para introducir acidos nucleicos en una celula de interes, tal como un citoblasto, celula progenitora o celula exogena cultivada en la placenta, p.ej. celulas progenitoras oseas.
5.6. USOS DE CITOBLASTOS Y CELULAS PROGENITORAS ACONDICIONADOS PARA DIFERENCIACION
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5.6.1. Usos generales
Los citoblastos y progenitores CD34+ y CD133+ de la invencion pueden inducirse a diferenciar para uso en protocolos de trasplante y tratamiento ex vivo. En una realizacion, las poblaciones de citoblastos se diferencian en un tipo celular particular y se genomanipulan proporcionando un producto genico terapeutico. En otra realizacion, las poblaciones de celulas progenitoras se expanden en celulas progenitoras tempranas y se genomanipulan, proporcionando un producto genico terapeutico. En otra realizacion, las poblaciones de celulas progenitoras se diferencian en un tipo celular particular, tal como un granulocito, y se genomanipulan, proporcionando un producto genico terapeutico.
Los compuestos de la invencion tienen tambien utilidad en entornos clmicos en que el trasplante tiene el objetivo principal de restaurar la produccion de globulos blancos de medula osea, tal como la reversion de neutropenia y leucopenia, que son el resultado de enfermedad y/o microablacion clmica. Los compuestos tienen tambien utilidad en la restauracion de la produccion de celulas progenitoras tempranas o granulocitos como resultado de enfermedad, diversos efectos secundarios terapeuticos o mieloablacion. Los compuestos de la invencion tienen tambien utilidad en casos en que se prefiera la supresion de la generacion de globulos rojos, sin supresion de medula osea.
En ciertas realizaciones, se administran citoblastos que se han tratado con los compuestos de la invencion junto con celulas no tratadas, tales como citoblastos de sangre de cordon o sangre periferica, a un paciente necesitado de ello. En otras realizaciones, se administran celulas CD34+ o CD133+ que se han tratado con los compuestos de la invencion junto con celulas no tratadas, tales como citoblastos de sangre de cordon o sangre periferica, a un paciente necesitado de ello. En una realizacion, se administran celulas progenitoras CD34+, tratadas desde el primer dfa de cultivo con un compuesto de la invencion, con celulas no tratadas a un paciente necesitado de ello. En una realizacion mas espedfica, la celula progenitora transferida es una celula progenitora CD34+CD38-CD33+ o CD34+CD38-CD33-.
Los citoblastos, p.ej. citoblastos de tipo embrionario o hematopoyeticos, o celulas progenitoras, cuya diferenciacion se ha modulado segun los metodos de la invencion, pueden formularse como inyectable (vease el documento PCT WO 96/39101). En una realizacion alternativa, pueden formularse celulas y tejidos, cuya diferenciacion se ha modulado segun los metodos de la invencion, usando hidrogeles polimerizables o reticulables como se describe en las patentes de EE.UU. n° 5.709.854, 5.516.532 o 5.654.381.
Pueden usarse citoblastos de tipo embrionario en lugar de clases espedficas de celulas progenitoras (p.ej., condrocitos, hepatocitos, celulas hematopoyeticas celulas parenquimaticas pancreaticas, neuroblastos, celulas progenitoras musculares, etc.) en protocolos terapeuticos o de investigacion en que se usanan tfpicamente celulas progenitoras.
5.6.2. Reemplazo o acrecentamiento de tejido
Los citoblastos, particularmente citoblastos de tipo embrionario, y celulas progenitoras de la invencion, cuya diferenciacion se ha modulado segun los metodos de la invencion, pueden usarse para una amplia variedad de protocolos terapeuticos dirigidos al trasplante o infusion de una poblacion celular deseada, tal como una poblacion de citoblastos o celulas progenitoras. Los citoblastos o celulas progenitoras pueden usarse para reemplazar o acrecentar tejidos existentes, para introducir tejidos nuevos o alterados o para unir tejidos o estructuras biologicas.
Se da a conocer en la presente memoria que pueden usarse citoblastos, tales como citoblastos de tipo embrionario de la placenta, o celulas progenitoras tales como celulas progenitoras hematopoyeticas, cuya diferenciacion se ha modulado segun los metodos de la invencion, como trasplantes hematopoyeticos autologos y alogenicos, incluyendo de tipo de HLA coincidente y no coincidente. De acuerdo con el uso de citoblastos de tipo embrionario como trasplantes hematopoyeticos alogenicos, puede ser preferible tratar el hospedador para reducir el rechazo inmunologico de las celulas donantes, tales como aquellas descritas en la patente de EE.UU. n° 5.800.539, expedida el 1 de septiembre de 1998 y la patente de EE.UU. n° 5.806.529, expedida el 15 de septiembre de 1998.
Por ejemplo, pueden usarse citoblastos de tipo embrionario, cuya diferenciacion se ha modulado segun los metodos de la invencion, en protocolos de trasplante terapeutico, p.ej., para acrecentar o reemplazar citoblastos o celulas progenitoras del hfgado, pancreas, rinon, pulmon, sistema nervioso, sistema muscular, hueso, medula osea, timo, bazo, tejido mucoso, gonadas o cabello. Igualmente, pueden usarse celulas progenitoras hematopoyeticas, cuya diferenciacion se ha modulado segun los metodos de la invencion, en lugar de celulas progenitoras de medula osea o endoteliales.
Pueden usarse citoblastos, por ejemplo citoblastos de tipo embrionario, cuya diferenciacion se ha modulado segun los metodos de la invencion, para acrecentar, reparar o reemplazar cartflago, tendon o ligamentos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se recubren protesis (p.ej., protesis de cadera) con constructos de tejido de cartflago de reemplazo crecidos a partir de citoblastos de tipo embrionario de la invencion. En otras realizaciones, se reconstruyen articulaciones (p.ej. rodilla) con constructos de tejido de cartflago crecidos a partir de citoblastos de tipo embrionario. Los constructos de tejido de cartflago pueden emplearse tambien en cirugfa reconstructiva mayor para
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diferentes tipos de articulaciones (para los protocolos vease, p.ej., Resnick, D. y Niwayama, G., eels., 1988, “Diagnosis of Bone and Joint Disorders”, 2a ed., W. B. Saunders Co.).
Los citoblastos y celulas progenitoras tratados segun los metodos de la invencion pueden usarse para reparar el dano de tejidos y organos resultante de enfermedad. En dicha realizacion, pueden administrarse a un paciente citoblastos de tipo embrionario para regenerar o restaurar tejidos u organos que se han danado como consecuencia de la enfermedad, p.ej., potenciar el sistema inmunitario despues de quimioterapia o radiacion o reparar tejido cardiaco despues de infarto de miocardio. Los citoblastos y/o celulas progenitoras tratados segun los metodos y con los compuestos inmunomoduladores, de la invencion, o administrados junto con los compuestos inmunomoduladores de la invencion, pueden trasplantarse a un individuo necesitado de ello para reparar y/o reemplazar tejido hepatico, pancreatico o cardiaco.
Los citoblastos y celulas progenitoras tratados segun los metodos de la invencion pueden usarse tambien para acrecentar o reemplazar celulas de medula osea en trasplante de medula osea. Se usa actualmente el trasplante de medula osea autologo y alogenico humano como terapia para enfermedades tales como leucemia, linfoma y otros trastornos potencialmente mortales. Sin embargo, el inconveniente de estos procedimientos es que debe retirarse una gran cantidad de medula osea donante para asegurar que hay suficientes celulas para el injerto.
Los citoblastos de tipo embrionario recogidos segun los metodos de la invencion pueden proporcionar citoblastos y celulas progenitoras que reducinan la necesidad de una gran donacion de medula osea. Sena tambien, segun los metodos de la invencion, para obtener una pequena donacion de medula osea y expandir entonces el numero de citoblastos y celulas progenitoras cultivando y expandiendo en la placenta antes de infusion o trasplante a un receptor.
Los grandes numeros de citoblastos de tipo embrionario y/o progenitores obtenidos usando los metodos de la invencion reducinan, en ciertas realizaciones, la necesidad de grandes donaciones de medula osea. Deben infundirse aproximadamente 1*108 a 2*108 celulas mononucleares de medula osea por kilogramo de peso de paciente para injerto en un trasplante de medula osea (concretamente, de aproximadamente 70 ml de medula para un donante de 70 kg). Obtener 70 ml requiere una donacion intensiva y una perdida significativa de sangre en el proceso de donacion. En una realizacion espedfica, las celulas de una donacion de medula osea pequena (p.ej., 710 ml) podnan expandirse por propagacion, por ejemplo en un biorreactor placentario, antes de infusion en un receptor. Los citoblastos y celulas progenitoras, particularmente celulas progenitoras CD34+ o CD133+, cuya diferenciacion se ha modulado segun los metodos de la invencion, pueden proporcionar por tanto citoblastos y/o celulas progenitoras que reducinan o eliminanan la necesidad de una gran donacion de medula osea.
Los citoblastos de tipo embrionario aislados de la placenta pueden usarse, en realizaciones espedficas, en terapia de reemplazo enzimatico autologo o heterologo para tratar enfermedades o afecciones espedficas incluyendo, pero sin limitacion, enfermedades de almacenamiento lisosomico tales como de Tay-Sachs, de Niemarm-Pick, smdromes de Fabry, Gaucher, Hunter y Hurler, asf como otras gangliosidosis, mucopolisacaridosis y glicogenosis.
En otras realizaciones, las celulas pueden usarse como portadores transgenicos autologos o heterologos en terapia genica para corregir errores congenitos del metabolismo tales como adrenoleucodistrofia, fibrosis qrnstica, enfermedades de almacenamiento de glicogeno, hipotiroidismo, anemia falciforme, smdrome de Pearson, enfermedad de Pompe, fenilcetonuria (PKU) y enfermedad de Tay-Sachs, porfirias, enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce, homocistinuria, mucopolisacaridosis, enfermedad granulomatosa cronica y tirosinemia o para tratar cancer, tumores u otras afecciones patologicas.
En otras realizaciones, las celulas pueden usarse en terapias o protocolos de regeneracion o reemplazo de tejido autologo o heterologo incluyendo, pero sin limitacion, el tratamiento de defectos epiteliales corneales, reparacion de cartflago, dermoabrasion facial, membranas mucosas, membranas timpanicas, revestimientos intestinales, estructuras neurologicas (p.ej., retina, neuronas auditivas en la membrana basilar, neuronas olfativas en el epitelio olfativo), quemaduras y reparacion de heridas por lesiones traumaticas de la piel, trasplante de cuero cabelludo (cabello) o para la reconstruccion de otros organos o tejidos danados o enfermos.
Ademas, normalmente circulan un pequeno numero de citoblastos y celulas progenitoras por la corriente sangurnea. En otra realizacion, dichos citoblastos exogenos o celulas progenitoras exogenas se recogen por aferesis, un procedimiento en que se extrae la sangre, se retiran selectivamente uno o mas componentes y se reinfunde el resto de la sangre al donante. Las celulas exogenas recuperadas por aferesis se expanden mediante los metodos de la invencion, eliminando por tanto la necesidad de donacion de medula osea completamente.
En otra realizacion, se usa la expansion de celulas progenitoras hematopoyeticas de acuerdo con los metodos de la invencion como tratamiento suplementario ademas de la quimioterapia. La mayona de agentes de quimioterapia usados para orientarse a y destruir celulas cancerosas actuan destruyendo todas las celulas en proliferacion, concretamente celulas que experimentan division celular. Puesto que la medula osea es uno de los tejidos en proliferacion mas activamente del cuerpo, los citoblastos hematopoyeticos frecuentemente se danan o destruyen por agentes de quimioterapia y, en consecuencia, la produccion de celulas sangurneas disminuye o cesa. La quimioterapia debe suspenderse a intervalos para permitir que el sistema hematopoyetico del paciente reponga el
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suministro de celulas sangumeas antes de retomar la quimioterapia. Puede llevar un mes o mas que los citoblastos anteriormente quiescentes proliferen y aumenten el recuento de globulos blancos hasta niveles aceptables de modo que pueda retomarse la quimioterapia (cuando de nuevo se destruyen los citoblastos de medula osea).
Mientras las celulas sangumeas se regeneran entre los tratamientos de quimioterapia, sin embargo el cancer tiene tiempo de crecer y posiblemente volverse mas resistente a los farmacos de quimioterapia debido a la seleccion natural. Por lo tanto, cuanto mas tiempo se procure la quimioterapia y menor sea la duracion entre tratamientos, mayores oportunidades de terminar exitosamente con el cancer. Para acortar el tiempo entre tratamientos de quimioterapia, podnan introducirse en el paciente los citoblastos de tipo embrionario o celulas progenitoras diferenciadas de acuerdo con los metodos de la invencion. Dicho tratamiento reducina el tiempo en que el paciente exhibe un bajo recuento de celulas sangumeas, y por lo tanto permitina una reanudacion mas temprana del tratamiento de quimioterapia.
En otra realizacion, los citoblastos placentarios humanos pueden usarse para tratar o prevenir enfermedades geneticas tale como la enfermedad granulomatosa cronica.
5.6.3. Mejora de la inflamacion
Los citoblastos y celulas progenitoras, cuya diferenciacion se ha modulado segun los metodos de la invencion, pueden usarse como agentes antiinflamatorios generales. Los inventores han descubierto que los citoblastos y celulas progenitoras, por ejemplo, de sangre de cordon, cuando se trasplantan a un paciente, reducen o eliminan sustancialmente la respuesta inflamatoria. Por tanto, en una realizacion, los metodos divulgados en la presente memoria comprenden administrar a un paciente que tiene una respuesta inflamatoria, o que es probable que desarrollen una respuesta inflamatoria, citoblastos o celulas progenitoras cuya diferenciacion se ha modulado por uno o mas de los compuestos de la invencion. En realizaciones espedficas, los citoblastos son citoblastos de tipo embrionario y las celulas progenitoras son citoblastos hematopoyeticos, particularmente celulas progenitoras CD34+ o CD133+.
Los inventores han descubierto tambien que el tratamiento de un individuo con los compuestos de la invencion, concretamente 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2- il)piperidin-2,6-diona, estimula el desarrollo y la diferenciacion de celulas que modulan, mejoran o reducen la respuesta inflamatoria. Por tanto, otra realizacion de la invencion comprende 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona para uso en el tratamiento de un individuo que tiene una respuesta inflamatoria, o que es probable que desarrolle una respuesta inflamatoria, en el que el tratamiento comprende administrar una dosis eficaz de uno o mas compuestos de la invencion a dicho individuo. En otra realizacion, el metodo comprende poner en contacto citoblastos o celulas progenitoras con los compuestos de la invencion antes de la administracion a dicho individuo y la administracion entonces de una dosis terapeuticamente eficaz de dichas celulas a dicho individuo. En aun otra realizacion, la celula asf tratada puede coadministrarse con uno o mas de los compuestos de la invencion a dicho individuo en dosis terapeuticamente eficaces.
En otras realizaciones, la inflamacion puede reducirse mediante la administracion de otros compuestos en combinacion con los compuestos y/o celulas de la invencion. Por ejemplo, dichos compuestos adicionales pueden comprender esteroides tales como prednisona, o cualquiera de los agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como los inhibidores de cox-1/cox-2 acido acetilsalidlico (aspirina), ibuprofeno, acetaminofeno, inhibidores espedficos de cox-1 o derivados de cualquiera de estos compuestos. Dichos agentes antiinflamatorios adicionales pueden suministrarse mediante cualquier via estandar, tal como intravenosa, intradermica o por inhalacion, y pueden suministrarse simultaneamente a los compuestos y/o celulas de la invencion o en momentos diferentes.
Los metodos anteriores pueden usarse para tratar cualquier enfermedad o afeccion asociada a, causada por o que de como resultado inflamacion. Por ejemplo, los metodos pueden usarse para tratar la inflamacion causada por traumatismos tales como lesion accidental. Los metodos pueden usarse tambien para tratar la inflamacion causada por lesion que esta asociada a procedimientos quirurgicos, en particular procedimientos quirurgicos relacionados con los vasos tales como injertos de tejido natural, injertos vasculares sinteticos, valvulas cardiacas o angioplastias. Los metodos pueden usarse tambien para prevenir la estenosis o reestenosis. Los metodos anteriores pueden usarse tambien para tratar la inflamacion resultante de cualquier enfermedad o afeccion incluyendo, pero sin limitacion, enfermedades o afecciones tales como enfermedad cardiaca, ateroesclerosis, alergia o hipersensibilidad, trastornos inmunitarios, trastornos autoinmunitarios tales como artritis o inflamaciones debidas a infecciones. Ademas de tratar una afeccion inflamatoria que ya existe, las celulas y/o compuestos de la invencion pueden administrarse a un individuo profilacticamente, para reducir la aparicion de inflamacion. Esto es particularmente util como forma de terapia preoperatoria, con lo que la reduccion de la respuesta inflamatoria postoperatoria mejora las posibilidades del individuo de un resultado clmico exitoso y reduce el tiempo de estancia hospitalaria y los periodos de incapacidad.
La monitorizacion de la eficacia del efecto antiinflamatorio de los tratamientos anteriores puede lograrse mediante cualquier metodo conocido, tales como inspeccion visual, barridos de IRM o TAC, determinacion de la temperatura sistemica o local, etc. Debido a que una protema conocida como protema C reactiva es un marcador para inflamacion, puede monitorizarse la eficacia de los metodos de tratamiento anteriores ensayando la reduccion de la
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cantidad de protema C reactiva en un individuo, particularmente en la zona que experimento anteriormente inflamacion.
5.6.4. Produccion de poblaciones de celulas dendnticas y celulas granulodticas
Los compuestos de la invencion pueden administrarse espedficamente para modular la diferenciacion de citoblastos y/o celulas progenitoras a lo largo de una ruta de desarrollo granulodtico frente a una ruta de desarrollo de celulas dendnticas. De manera similar, la celula de la invencion puede modularse in vivo o ex vivo, produciendo poblaciones expandidas de celulas dendnticas o granulocitos.
Las celulas dendnticas pueden usarse como reactivos para terapias de base inmunitaria. Por ejemplo, pueden cocultivarse celulas dendnticas con linfocitos T y antigeno de protema in vitro, impulsando por tanto la activacion espedfica de antigeno ex vivo de linfocitos T. Se administran entonces los linfocitos T activados de forma autologa para efectuar una respuesta inmunitaria espedfica de antigeno in vivo (documento WO 97/24438). En otro ejemplo, pueden activarse linfocitos T in vitro mediante la puesta en contacto de los linfocitos T con celulas dendnticas que expresan directamente una protema antigenica a partir de un constructo recombinante. Los linfocitos T activados pueden usarse para infusion autologa (documento Wo 97/29183).
Los linfocitos T activados con peptidos o fragmentos de protema espedficos se vuelven agentes inmunizantes contra las protemas, celulas u organismos de los que derivan los peptidos o fragmentos. Por ejemplo, las celulas dendnticas pueden cargarse con peptidos espedficos de tumor. La aplicacion espedfica de activacion de linfocitos T ex vivo impulsada por DC al tratamiento de cancer de prostata se describe y reivindica en la patente de EE.UU. n° 5.788.963. Mayordomo et al. demostraron que las celulas dendnticas derivadas de medula osea sometidas a pulsos con peptidos tumorales sinteticos desencadenan inmunidad protectora y antitumoral terapeutica (Nature Medicine 1: 1297-1302 (1995); J. Exp. Med., 183: 1357-1365 (1996)). La patente de EE.UU. n° 5.698.679 describe protemas de fusion de inmunoglobulina que suministran peptidos antigenicos a celulas presentadoras de antfgeno (APC) diana, incluyendo celulas dendnticas, in vivo. Puede usarse este mismo enfoque con peptidos o antfgenos derivados de virus, bacterias o parasitos para crear vacunas vmicas, bacterianas o parasitarias.
Las celulas dendnticas son tambien dianas para intervencion terapeutica en el tratamiento de diversos trastornos inmunomediados. Por ejemplo, las celulas dendnticas se han implicado como un actor importante en la patogenesis y patofisiologfa del SIDA (p.ej., sirven como reservorios para el virus VIH). Veanse Zoeteweij et al., J. Biomed. Sci. 5(4): 253-259 (1998); Grouard et al., Curr. Opin. Immunol. 9(4): 563-567 (1997); Weissman et al., Clin. Microbiol. Rev. 10(2): 358-367 (1997). Se describen metodos in vitro para cribar candidatos farmaceuticos a agentes que anulen la infeccion por VIH de DC en la patente de EE.UU. n° 5.627.025. En otro ejemplo, las celulas dendnticas pueden manipularse para inducir insensibilidad ante linfocitos T de tejido u organo donante en un receptor (vease la patente de EE.UU. n° 6.375.950).
Los granulocitos pueden usarse en transfusiones de granulocitos en el tratamiento o la prevencion de infecciones, p.ej., sepsis neonatal bacteriana, infecciones asociadas a neutropenia en pacientes de cancer e infecciones potenciales en pacientes que reciben trasplantes de medula osea. Los granulocitos pueden usarse tambien en la prevencion o el tratamiento de alergia. Por ejemplo, los granulocitos implicados en la inflamacion mediada por IgE (concretamente, granulocitos recubiertos con anticuerpos de IgE, algunos de los cuales tienen especificidad por el alergeno) pueden inactivarse y usarse para aliviar los smtomas de una respuesta inmunitaria ya establecida contra el alergeno (vease la patente de EE.UU. n° 6.383.489).
Por tanto, en una realizacion divulgada en la memoria descriptiva, se expande una poblacion de granulocitos en un individuo a partir de las celulas progenitoras de la invencion mediante un metodo que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la invencion, en la que dicha cantidad es suficiente para inducir la produccion de una pluralidad de granulocitos a partir de celulas CD34+ endogenas de dicho individuo. En otra realizacion, se expande una poblacion de granulocitos en un individuo mediante un metodo que comprende administrar a dicho individuo una poblacion de celulas progenitoras CD34+ o CD133+, en la que dichas celulas se han puesto en contacto con un compuesto de la invencion durante al menos tres dfas, y administrar dicha poblacion de celulas a dicho individuo. En otra realizacion, se expande la poblacion de granulocitos en un individuo mediante un metodo que comprende administrar a dicho individuo una poblacion de celulas progenitoras CD34+ o CD133+ y un compuesto de la invencion, en la que la dosis de dicho compuesto de la invencion es suficiente para causar la diferenciacion de una pluralidad de dicha poblacion de celulas en granulocitos. En una realizacion espedfica de las realizaciones anteriores, dichas celulas progenitoras CD34+ son celulas CD34+CD38-CD33+.
5.6.5. Tratamiento de otras enfermedades y afecciones
Los citoblastos y celulas progenitoras diferenciados de la invencion, o los compuestos de la invencion, pueden usarse tambien, solos o en combinacion, para tratar o prevenir una variedad de otras enfermedades o afecciones. En ciertas realizaciones, por ejemplo, la enfermedad o trastorno incluye, pero sin limitacion, una enfermedad vascular o cardiovascular, ateroesclerosis, diabetes, anemia aplasica, mielodisplasia, infarto de miocardio, trastorno convulsivo, esclerosis multiple, apoplejfa, hipotension, parada cardiaca, isquemia, inflamacion, perdida de funcion cognitiva relacionada con la edad, dano por radiacion, paralisis cerebral, enfermedad neurodegenerativa,
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enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Leigh, demencia por SIDA, perdida de memoria, esclerosis lateral amiotrofica (ELA), enfermedad renal isquemica, traumatismo cerebral o de medula espinal, derivacion cardiopulmonar, glaucoma, isquemia retiniana, traumatismo retiniano, enfermedades de almacenamiento lisosomico tales como smdromes de Tay-Sachs, Niemann-Pick, Fabry, Gaucher, Hunter y Hurler, asf como otras gangliosidosis, mucopolisacaridosis, glicogenosis, errores congenitos del metabolismo tales como adrenoleucodistrofia, fibrosis qmstica, enfermedades de almacenamiento de glicogeno, hipotiroidismo, anemia falciforme, smdrome de Pearson, enfermedad de Pompe, fenilcetonuria (PKU), porfirias, enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce, homocistinuria, mucopolisacaridosis, enfermedad granulomatosa cronica y tirosinemia, enfermedad de Tay-Sachs, cancer, tumores u otras afecciones patologicas o neoplasicas.
En otras realizaciones, pueden usarse las celulas de la invencion (p.ej., que se han expuesto a los compuestos de la invencion) en el tratamiento de cualquier clase de lesion debida a traumatismos, particularmente traumatismos que implican inflamacion. Los ejemplos de dichas afecciones relacionadas con traumatismos incluyen lesiones del sistema nervioso central (SNC), incluyendo lesiones de cerebro, medula espinal o tejido que rodea lesiones del SNC del sistema nervioso periferico (SNP) o lesiones de cualquier otra parte del cuerpo. Dicho traumatismo puede estar causado por accidentes o puede ser el resultado clmico normal o anormal de un procedimiento medico tal como cirugfa o angioplastia. El traumatismo puede estar relacionado con una ruptura u oclusion de un vaso sangumeo, por ejemplo, en apoplejfa o flebitis. En realizaciones espedficas, pueden usarse las celulas en terapias o protocolos de regeneracion o reemplazo de tejido autologo o heterologo incluyendo, pero sin limitacion, el tratamiento de defectos epiteliales corneales, reparacion de cartflago, dermoabrasion facial, membranas mucosas, membranas timpanicas, revestimientos intestinales, estructuras neurologicas (p.ej., retina, neuronas auditivas en membrana bailar, neuronas olfativas en epitelio olfativo), quemaduras y reparacion de heridas por lesiones traumaticas de la piel, o para reconstruccion de otros organos o tejidos danados o enfermos.
En una realizacion espedfica, la enfermedad o trastorno es anemia aplasica, mielodisplasia, leucemia, un trastorno de medula osea o una enfermedad o trastorno hematopoyetico. En otra realizacion espedfica, el sujeto es un ser humano.
5.7. COMPOSICIONES FARMACEUTICAS
La presente invencion engloba composiciones farmaceuticas que comprenden una dosis y/o varias dosis de uno o mas de los compuestos de la invencion, en las que dicha dosis o varias dosis son eficaces tras administracion unica o multiple, antes o despues del trasplante de celulas progenitoras o citoblastos CD34+ o CD133+ humanos acondicionados o no acondicionados a un individuo, ejerciendo un efecto suficiente para inhibir, modular y/o regular la diferenciacion de estos citoblastos y/o celulas progenitoras en tipos celulares espedficos, p.ej., celulas de linaje hematopoyetico, particularmente celulas de linaje mieloide. En este contexto, como en otras partes del contexto de esta invencion, “individuo” significa cualquier individuo al que Se administran los compuestos o celulas, p.ej. un mamffero, ave o reptil.
Por tanto, en una realizacion espedfica, dicha dosis o varias dosis de los compuestos de la invencion, administradas a un individuo, modulan la diferenciacion de celulas progenitoras CD34+ endogenas en celulas dendnticas. En una realizacion mas espedfica, la dosis o varias dosis aumentan el numero de celulas granulodticas en dicho individuo al que se han administrado dicha dosis o varias dosis. En otra realizacion mas espedfica, la dosis o varias dosis aumentan el numero de celulas progenitoras CD34+CD38-CD33+ o CD34+CD38-cD33- en un mamffero al que se han administrado dicha dosis o varias dosis.
En otras realizaciones, se trasplantan celulas progenitoras o citoblastos CD34+ o CD133+ de interes a un sujeto humano o paciente necesitado de ello. Posteriormente al trasplante, se administra un compuesto de la invencion al sujeto humano o paciente para modular la diferenciacion de las celulas trasplantadas de interes in vivo. En una realizacion espedfica, dichas celulas se diferencian in vivo en granulocitos. En aun otras realizaciones, se modula la diferenciacion de celulas progenitoras o citoblastos de interes en un sujeto humano o paciente in situ mediante la administracion de un compuesto de la invencion.
En aun otra realizacion, la invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden poblaciones de citoblastos o celulas progenitoras de sangre de cordon aisladas que se han acrecentado con celulas progenitoras hematopoyeticas que se han diferenciado por exposicion a compuestos que inhiben la actividad de TNF-a, de acuerdo con los metodos de la invencion. En otra realizacion, la invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden sangre de cordon que se suplementa con citoblastos o celulas progenitoras puestos en contacto con los compuestos de la invencion; en una realizacion espedfica, dichos citoblastos o celulas progenitoras se han diferenciado por dichos compuestos.
En aun otra realizacion, la invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden tanto uno o mas de los compuestos inmunomoduladores de la invencion como los citoblastos y/o celulas progenitoras de la invencion. Dichas composiciones pueden prepararse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 dfas antes de la administracion para modular la diferenciacion de los citoblastos y/o celulas progenitoras a lo largo de diferentes rutas de desarrollo/diferenciacion.
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En aun otra realizacion, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden comprender los citoblastos o celulas progenitoras mismos, en las que dichas celulas se han diferenciado segun los metodos divulgados en la presente memoria. Por tanto, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una pluralidad de citoblastos y/o celulas progenitoras, en la que dicha pluralidad de citoblastos y/o celulas progenitoras se ha puesto en contacto con uno o mas de los compuestos inmunomoduladores de la invencion a una concentracion y durante un tiempo suficiente para que dicho compuesto o compuestos modulen la diferenciacion de dichas celulas.
Por tanto, las composiciones farmaceuticas de la invencion comprenden los compuestos de la invencion, administrados a un individuo; las celulas de la invencion, administradas a un individuo en combinacion con los compuestos de la invencion, administrados separadamente y las celulas de invencion puestas en contacto con los compuestos de la invencion administrados a dicho individuo.
La invencion proporciona metodos de tratamiento y prevencion de una enfermedad o trastorno mediante la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto o una composicion de la invencion a un sujeto mairnfero, preferiblemente humano, para efectuar la modulacion de la proliferacion y/o diferenciacion de celulas progenitoras o citoblastos CD34+ o CD133+ trasplantados a, o residentes en, el sujeto. En una realizacion, la invencion proporciona un metodo de modulacion de la diferenciacion de celulas progenitoras o citoblastos CD34+ y CD133+ para aumentar en un marnffero el numero de celulas granulocfticas. En otra realizacion, puede modularse cualquier linaje celular que pueda derivar de una celula progenitora o citoblasto CD34+ y/o CD133+ mediante la administracion de los compuestos de la invencion a un mamffero, preferiblemente un ser humano. El termino “mamffero”, como se usa en la presente memoria, engloba cualquier mamffero. Preferiblemente, el mamffero esta necesitado de dicho tratamiento o prevencion. Los ejemplos de mamfferos incluyen, pero sin limitacion, vacas, caballos, ovejas, cerdos, gatos, perros, ratones, ratas, conejos, conejillos de Indias, monos, etc., mas preferiblemente un ser humano.
La administracion de compuestos de la invencion puede ser sistemica lo local. En la mayona de casos, la administracion a un mamffero dara como resultado la liberacion sistemica de los compuestos de la invencion (concretamente, a la corriente sangumea). Los metodos de administracion incluyen las vfas entericas, tales como administracion oral, bucal, sublingual y rectal; la administracion topica, tal como transdermica e intradermica y la administracion parenteral. Las vfas parenterales adecuadas incluyen inyeccion a traves de una aguja hipodermica o cateter, por ejemplo, las rutas de inyeccion intravenosa, intramuscular, subcutanea, intradermica, intraperitoneal, intraarterial, intraventricular, intratecal, intraocular e intracameral y no inyeccion, tales como administracion intravaginal, rectal o nasal. Preferiblemente, los compuestos y composiciones de la invencion se administran por via oral. En realizaciones espedficas, puede ser deseable administrar uno o mas compuestos de la invencion localmente a la zona necesitada de tratamiento. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante infusion local durante cirugfa, aplicacion topica, p.ej. junto con un aposito de herida despues de cirugfa, mediante inyeccion, mediante un cateter, mediante un supositorio o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas tales como membranas de Silastic o fibras.
Los compuestos de la invencion pueden administrarse mediante sistemas de suministro tfpicos asf como no estandares, p.ej., encapsulacion en liposomas, micropartfculas, microcapsulas, capsulas, etc. Por ejemplo, los compuestos y composiciones de la invencion pueden suministrarse en una vesfcula, en particular un liposoma (veanse Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., en “Liposomes” en “Therapy of Infectious Disease and Cancer'' Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, Nueva York, pag. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibfd., pag. 317327; vease en general ibfd.). En otro ejemplo, los compuestos y composiciones de la invencion pueden suministrarse en un sistema de liberacion controlado. En una realizacion, puede usarse una bomba (veanse Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507 Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 3: 574). En otro ejemplo, pueden usarse materiales polimericos (veanse “Medical Applications of Controlled Release”, Langer and Wise (eds.), CRC Press., Boca Raton, Fla. (1974); “Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance”, Smolen and Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; veanse tambien Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105). En todavfa otro ejemplo, puede disponerse un sistema de liberacion controlada en la proximidad de la zona diana para tratar, p.ej. el tngado, requiriendo por tanto solo una fraccion de la dosis sistemica (vease, p.ej., Goodson, en “Medical Applications of Controlled Release”, supra, vol. 2, pag. 115-138 (1984)). Pueden usarse otros sistemas de liberacion controlada discutidos en la revision por Langer, 1990, Science 249: 1527-1533). Cuando se administra como una composicion, se formulara un compuesto de la invencion con una cantidad adecuada de un vehfculo o portador farmaceuticamente aceptable para proporcionar la forma de administracion apropiada al mai^ero. El termino “farmaceuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerada en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea reconocida generalmente para uso en marnfferos, y mas particularmente en seres humanos. El termino “vetnculo” hace referencia a un diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con que se formula un compuesto de la invencion para administracion a un mamffero. Dichos vehfculos farmaceuticos pueden ser lfquidos, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petroleo, animal, vegetal o sintetico, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. Los vehfculos farmaceuticos pueden ser disolucion salina, goma arabiga, gelatina, pasta de almidon, queratina, sflice coloidal, urea y similares. Ademas,
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pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Preferiblemente, cuando se administran a un mairnfero, los compuestos y composiciones de la invencion y los vetnculos, excipientes o diluyentes farmaceuticamente aceptables son esteriles. Un medio acuoso es un vetnculo preferido cuando se administra el compuesto de la invencion por via intravenosa, tal como agua, disoluciones salinas y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol.
Los presentes compuestos y composiciones pueden tomar la forma de capsulas, comprimidos, pfldoras, aglomerados comprimidos oblongos, polvos, granulos, jarabes, elixires, disoluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios o formulaciones de liberacion mantenida de los mismos, o cualquier otra forma adecuada para administracion a un mamffero. En una realizacion preferida, los compuestos y composiciones de la invencion se formulan para administracion de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composicion farmaceutica adaptada para administracion oral o intravenosa a seres humanos. En una realizacion, el vetnculo farmaceuticamente aceptable es una capsula de gelatina dura. Se describen ejemplos de vetnculos farmaceuticamente adecuados y metodos para la formulacion de los mismos en “Remington: “The Science and Practice of Pharmacy”, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, Pa., 19a ed., 1995, capttulos 86, 87, 88, 91 y 92.
Los compuestos y composiciones de la invencion formulados para suministro oral estan preferiblemente en forma de capsulas, comprimidos, pfldoras o cualquier forma farmaceutica comprimida. Ademas, cuando estan en forma de comprimido o pfldora, los compuestos y composiciones pueden recubrirse para retardar la disgregacion y absorcion en el tracto gastrointestinal, proporcionando asf una accion mantenida durante un periodo extenso de tiempo. Son tambien adecuadas membranas selectivamente permeables que rodean un compuesto impulsor osmoticamente activa para los compuestos y composiciones administrados por via oral de la invencion. En estas ultimas plataformas, se embebe el fluido del entorno que rodea la capsula por el compuesto impulsor, que se hincha para desplazar el agente o composicion de agente a traves de una abertura. Estas plataformas de suministro pueden proporcionar un perfil de suministro de orden esencialmente cero en contraposicion a los perfiles con picos de las formulaciones de liberacion inmediata. Puede usarse tambien un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerol o estearato de glicerol. Las composiciones orales pueden incluir vetnculos, excipientes y diluyentes estandares tales como estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidon, goma arabiga, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, jarabe y metilcelulosa; las formulaciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio, aceite mineral, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspension, agentes conservantes tales como hidroxibenzoatos de metilo y propilo. Dichos vetnculos son preferiblemente de pureza farmaceutica. Los compuestos y composiciones administrados por via oral de la invencion pueden incluir opcionalmente uno o mas agentes edulcorantes tales como fructosa, aspartamo o sacarina; uno o mas agentes aromatizantes tales como menta piperita, aceite de gaulteria o cereza o uno o mas agentes colorantes para proporcionar una preparacion farmaceuticamente palatable.
El regimen de dosificacion terapeuticamente eficaz para el tratamiento de un trastorno o afeccion particular dependera de su naturaleza y gravedad, y puede determinarse mediante tecnicas clmicas estandares segun el criterio de un facultativo medico. Ademas, pueden usarse ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar las dosificaciones optimas. Por supuesto, la cantidad de compuesto de la invencion que constituye una dosis terapeuticamente eficaz depende tambien de la via de administracion. En general, los intervalos de dosificacion adecuados para administracion oral son de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 20 mg de un compuesto de la invencion por kg de peso corporal al dfa, preferiblemente de aproximadamente 0,7 mg a aproximadamente 6 mg, mas preferiblemente de aproximadamente 1,5 mg a aproximadamente 4,5 mg. En una realizacion preferida, se administra por via oral a un mai^ero, preferiblemente un ser humano, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1000 mg de un compuesto de la invencion al dfa, mas preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 300 mg al dfa, o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 250 mg en dosis unica o divididas. Las cantidades de dosificacion descritas en la presente memoria hacen referencia a las cantidades totales administradas; es decir, si se administra mas de un compuesto de la invencion, las dosificaciones preferidas corresponden a la cantidad total de compuestos de la invencion administrados. Las composiciones orales contienen preferiblemente de 10 a 95 % de un compuesto de la invencion en peso. Las formas de dosificacion oral unitarias preferidas incluyen pfldoras, comprimidos y capsulas, mas preferiblemente capsulas. Tfpicamente, dichas formas de dosificacion unitarias contendran aproximadamente 0,01 mg, 0,1 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg o 500 mg de un compuesto de la invencion, preferiblemente de
aproximadamente 5 mg a aproximadamente 200 mg de compuesto por dosificacion unitaria.
En otra realizacion, los compuestos y composiciones de la invencion pueden administrarse por via parenteral (p.ej., por vfas intramuscular, intratecal, intravenosa e intraarterial), preferiblemente intravenosa. Tfpicamente, los compuestos y composiciones de la invencion para administracion intravenosa son disoluciones en vetnculos
acuosos isotonicos esteriles, tales como agua, disolucion salina, disolucion de Ringer o disolucion de dextrosa.
Cuando sea necesario, las composiciones pueden incluir tambien un agente solubilizante. Las composiciones para administracion intravenosa pueden incluir opcionalmente un anestesico local tal como lignocama para aliviar el dolor en el sitio de inyeccion. Para administracion intravenosa, los compuestos y composiciones de la invencion pueden suministrarse como un polvo liofilizado seco esteril o concentrado anhidro en un envase sellado hermeticamente, tal
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como una ampolla o saquito, indicando el envase la cantidad de agente activo. Dicho polvo o concentrado se diluye entonces con un medio acuoso apropiado antes de la administracion intravenosa. Puede proporcionarse una ampolla de agua esteril, disolucion salina u otro medio acuoso apropiado con el polvo o concentrado antes de la administracion. O pueden suministrarse las composiciones en forma premezclada lista para administracion. Cuando se va a administrar un compuesto o composicion de la invencion por infusion intravenosa, puede dispensarse, por ejemplo, con una botella de infusion que contiene agua esteril de pureza farmaceutica, disolucion salina u otro medio adecuado.
La administracion rectal puede efectuarse mediante el uso de supositorios formulados a partir de portadores convencionales tales como manteca de cacao, aceites vegetales modificados y otras bases grasas. Los supositorios pueden formularse mediante metodos bien conocidos usando formulaciones bien conocidas, por ejemplo, vease “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, Pa., 19a ed., 1995, pag. 1591-1597.
Para formular y administrar las formas de dosificacion topicas, pueden usarse medios de suministro transdermico e intradermico bien conocidos tales como lociones, cremas y pomadas y dispositivos de suministro transdermico tales como parches (Ghosh, T. K.; Pfister, W. R.; Yum, S. I. “Transdermal and Topical Drug Delivery Systems'' Interpharm Press, Inc. pag. 249-297). Por ejemplo, un diseno de parche de tipo deposito puede comprender una pelfcula de soporte recubierta con un adhesivo y un compartimento de deposito que comprende un compuesto o composicion de la invencion, que esta separado de la piel por una membrana semipermeable (p.ej., la patente de EE.UU. n° 4.615.699). La capa de soporte recubierta adhesiva se extiende alrededor de los lfmites del deposito, proporcionando un sello concentrico con la piel y manteniendo el deposito adyacente a la piel.
La invencion proporciona tambien paquetes o kits farmaceuticos que comprenden uno o mas envases llenados con uno o mas compuestos de la invencion. Puede estar opcionalmente asociado con dicho envase o envases una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricacion, uso o venta de productos farmaceuticos o productos biologicos, reflejando dicha nota la aprobacion por la agencia de la fabricacion, uso o venta para administracion humana. En una realizacion, el kit contiene mas de un compuesto de la invencion. En otra realizacion, el kit comprende un compuesto de la invencion y otro agente biologicamente activo.
En los compuestos de la invencion se ensaya preferiblemente in vitro e in vivo la actividad terapeutica o profilactica deseada, antes del uso en seres humanos. Por ejemplo, pueden usarse ensayos in vitro para determinar si se prefiere la administracion de un compuesto espedfico de la invencion o una combinacion de compuestos de la invencion. Puede demostrarse que los compuestos y composiciones de la invencion son eficaces y seguros usando sistemas de modelo animal. Seran conocidos otros metodos por el especialista en la materia.
5.8. ENSAYOS QUE USAN LOS METODOS DE LA INVENCION
La metodologfa descrita anteriormente, concretamente el examen del efecto de IMID™ tales como 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona sobre la diferenciacion en celulas progenitoras tempranas, tales como celulas CD34+, puede aplicarse a cualquier compuesto de interes cuyo efecto sobre la diferenciacion se desee conocer. Esto puede lograrse de varios modos.
En una realizacion, compuesto puede sustituirse simplemente por 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3- diona o cualquiera de los demas compuestos de la invencion. Aqrn, las celulas progenitoras CD34+ y/o celulas progenitoras CD133+ pueden ponerse en contacto con el compuesto de interes a concentraciones variables que permitan la proliferacion y/o diferenciacion de las celulas progenitoras en celulas comprometidas y/o totalmente diferenciadas. Pueden usarse los metodos de cultivo divulgados en la presente memoria, particularmente los metodos de cultivo divulgados en la seccion 5.4. El efecto, si lo hubiera, del compuesto de interes se determina valorando el cambio, si lo hubiera, de las poblaciones celulares que se diferencian a partir de las celulas progenitoras, donde el cambio puede monitorizarse mediante cualquier cambio fenotfpico, pero se valora preferiblemente determinando los marcadores de superficie celular que estan presentes o ausentes. Como los metodos de la invencion, el compuesto de interes puede administrarse en una unica dosis en cualquier momento desde el cultivo inicial para conseguir la celula o celulas diferenciadas finalmente. Como alternativa, el compuesto de interes puede administrarse en dosis multiples durante la etapa proliferativa, la etapa de diferenciacion o ambas. El cambio en las caractensticas fenotfpicas de las celulas progenitoras en proliferacion/diferenciacion se compara preferiblemente con un cultivo de control de celulas, tales como celulas tratadas con DMSO. Sena de particular interes cualquier efecto sobre la proliferacion o diferenciacion tales como, pero sin limitacion: modulacion de la tasa de proliferacion, modulacion de la tasa de diferenciacion, modulacion de la diferenciacion de las celulas progenitoras en celulas precursoras comprometidas, bloqueo de la diferenciacion en tipos celulares particulares y potenciacion de la diferenciacion en tipos celulares particulares.
En otra realizacion, el cultivo, proliferacion y diferenciacion tienen lugar como anteriormente, pero el compuesto de interes se pone en contacto con la celula o celulas progenitoras junto con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona. De esta manera, pueden determinarse los efectos, posiblemente sinergicos, de multiples compuestos. Sena de particular interes cualquier compuesto que no tuviera efecto sobre la proliferacion o diferenciacion solo, o ligero, pero que tuviera un efecto significativo en combinacion con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-
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piperidil)isoindolin-1,3-diona. En otra realizacion, pueden ponerse en contacto dos compuestos cualesquiera de interes con las celulas progenitoras en condiciones de cultivo, como anteriormente, que permitan normalmente la proliferacion y diferenciacion de las celulas progenitoras. Aqm, preferiblemente un experimento en que se ponen en contacto celulas precursoras con dos compuestos de interes contiene un control en que se ponen en contacto las celulas progenitoras con solo uno de cada uno de dichos compuestos; un control en que se ponen en contacto las celulas con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y un control en que no se ponen en contacto las celulas con un compuesto, o se ponen en contacto con DMSO. De nuevo, las variaciones en las dosificaciones y el momento de la dosificacion son como se describe anteriormente y en la seccion 5.4.
6. EJEMPLOS DE TRABAJO
6.1. EJEMPLO 1: Efectos de talidomida, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4- amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona sobre la diferenciacion de celulas progenitoras CD34+
En el siguiente ejemplo, se estudiaron los efectos de talidomida (Thal), 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-
1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona sobre la diferenciacion de celulas (progenitoras hematopoyeticas) CD34+ y la generacion de unidades de formacion de colonias (CFU). De forma significativa, los resultados demuestran que pueden usarse 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona para suprimir espedficamente la generacion de colonias eritropoyeticas (BFU-E y CFU-E), mientras que se tanto se acrecienta la generacion de colonias formadoras de leucocitos y plaquetas (CFU-GM) como se potencia la produccion de unidades de formacion de colonias totales (CFU-Total).
Los metodos de la invencion pueden usarse por lo tanto para regular la diferenciacion de citoblastos, y pueden usarse tambien para estimular la tasa de formacion de colonias, proporcionando beneficios significativos para el trasplante de citoblastos hematopoyeticos al mejorar la velocidad de injerto de medula osea y la recuperacion de la produccion de leucocitos y/o plaquetas.
Se sembraron celulas progenitoras hematopoyeticas CD34+ de sangre de cordon en discos de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 1000 celulas por pocillo en IMDM suplementado con suero fetal de ternero al 20 % y citocinas (IL- 3, G-CSF y ligando kit (R&D Systems, Inc.). Se expusieron las celulas a talidomida (Thal), 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, o DMSO (un compuesto de control) y se dejaron cultivar durante 6 dfas. Se sembraron celulas CD34+ de sangre de cordon en discos de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 1000 celulas por pocillo en IMDM suplementado con suero fetal de ternero al 20 % y citocinas (IL-3, GCSF y ligando kit (KL) (R&D Systems, Inc.)). Despues de cultivar, se tineron las celulas y se clasificaron con un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS). Se recolectaron 400 pl de celulas tenidas y se diluyeron a 1,0 ml con suero fetal de ternero al 1 % en disolucion salina tamponada con fosfato (PBS). Se contaron las celulas para determinar el efecto de la modulacion de la diferenciacion de citoblastos. Se muestran en la FIG. 1 los recuentos celulares obtenidos.
Estos resultados demuestran que los compuestos de la invencion son eficaces en la modulacion del compromiso de linaje de los citoblastos progenitores hematopoyeticos. Por tanto, pueden usarse 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona para suprimir espedficamente la generacion de globulos rojos o colonias eritropoyeticas (BFU-E y CFU-E), mientras que tanto se acrecienta la generacion de colonias formadoras de leucocitos y plaquetas (CFU-GM) como se potencia la produccion de unidades formadoras de colonias totales. Los metodos de la invencion pueden usarse por lo tanto para regular la diferenciacion de citoblastos, y pueden usarse tambien para estimular la tasa de formacion de colonias espedficas, proporcionando beneficios significativos al trasplante de citoblastos hematopoyeticos al mejorar la velocidad de injerto de medula osea y la recuperacion de la produccion de leucocitos y/o plaquetas mediante el compromiso de los citoblastos originales hacia linajes injertables deseados. Se representan ademas en la FIG. 2 la inhibicion de la eritropoyesis y la expansion de poblaciones progenitoras CD34+CD38- por 4-(amino)-2-(2,6-dioxo- (3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona.
6.2. EJEMPLO 2: Efectos de talidomida, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4- amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona sobre la proliferacion y diferenciacion de celulas CD34+ de sangre de cordon humanas
En el siguiente ejemplo, se estudiaron los efectos de talidomida, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3- diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona sobre la proliferacion y diferenciacion de celulas mononucleares de sangre de cordon (CB) en celulas (progenitoras hematopoyeticas) CD34+. Las celulas mononucleares de sangre de cordon son una poblacion mixta de celulas que incluyen una pequena poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas (CD34+). Un subconjunto de esta pequena poblacion de celulas CD34+ incluye una poblacion (aproximadamente un 1 % de las celulas mononucleares CB totales) de celulas CD34+CD38+ y una poblacion aun menor (menos de un 1 % de las celulas mononucleares CB totales) de celulas CD34+CD38-. De forma significativa, los resultados demuestran que la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona causa la regulacion positiva (diferenciacion aumentada) de celulas CD34+ y que la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-
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piperidil)isoindolin-1,3-diona y la 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona pueden aparentemente inhibir o retardar la diferenciacion de citoblastos o celulas progenitoras hematopoyeticos en comparacion con los controles positivos y negativos (FIGS. 3-7).
6.2.1. Materiales y metodos
Se iniciaron celulas CB CD34+ a 4*104 celulas/ml en una placa de 24 pocillos en FCS al 20 %/IMDM (suero fetal de ternero/medio de Dulbecco modificado por Iscove) suplementado con citocinas (IL3, GCSF y ligando Kit) (R&D Systems, Inc.). Se incluyeron talidomida (Thal), 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino- 1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona en el cultivo a tres concentraciones diferentes: 5 pg/ml, 1 pg/ml y 0,3 |jg/ml. Se usaron los mismos volumenes de DMSO como controles. Se uso tambien un control negativo sin ningun compuesto (indicado por “ninguno” en las FIG. 3-7). Se cultivaron las celulas a 37 °C y 5 % de CO2 en una incubadora humidificada durante 7 dfas. Se recolectaron entonces las celulas de cada pocillo.
Se determino el numero de celulas totales de cada pocillo contando en un CELL-DYN® 1700 (Abbott Diagnostics) y se analizo la expresion de CXCR4, CD45, CD34, CD38, CD11b y Gly-A por tincion con FACS (clasificacion celular activada por fluorescencia) (FIGS. 3-7).
Se cultivaron celulas CB de dos donantes diferentes (CB2276 y CB2417), se ensayaron y se analizaron separadamente (Tabla 1).
6.2.2. Resultados y discusion
Se ensayaron los efectos de talidomida, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-
1.3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona sobre la expansion estimulada por citocinas de celulas CD34+. Como se muestra en la FIG. 4, talidomida, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona no tienen un efecto significativo sobre la proliferacion de celulas CD34+ que se cultivan en presencia de IL-3, ligando Kit (KL) y G-CSF cuando se comparan con el control negativo (“ninguno”). Sin embargo, talidomida, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2- il)piperidin-2,6-diona parecen inducir el rendimiento de un numero ligeramente mayor de celulas cuando se comparan con el control de DMSO. Considerando que el DMSO tiene generalmente un efecto negativo sobre la proliferacion celular en estos experimentos, estos resultados sugieren que los compuestos talidomida, 4-(amino)-2- (2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona pueden tener un efecto estimulante sobre la proliferacion de celulas CD34+ que se cultivan en presencia de IL-3, Kl y G- CSF, puesto que se usa la misma cantidad de DMSO como portador. A este respecto, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona tienen un mayor efecto que talidomida.
Se analizaron los efectos de talidomida, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-
1.3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona sobre la expresion de la diferenciacion celular por analisis FACS de las protemas de superficie CXCR4 y CD34 (FIG. 3 y 4). 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4- amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, pero no talidomida, mostraban un efecto inhibidor sobre la expresion de CXCR4. La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona tema un efecto mas potente que la 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona.
Con respecto a la protema de superficie CD34+, la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona causaba la regulacion positiva (proliferacion aumentada) de celulas CD34+ tanto en cultivos de CB2276 como de CB2417. Talidomida y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, sin embargo, exhibfan un efecto similar en un donante pero no en el otro donante. De forma interesante, tanto en celulas tratadas con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo- (3-piperidil)isoindolin-1,3-diona como 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, la mayona de celulas CD34+ y CD34- son CD38-, mientras que las celulas en las poblaciones tratadas con control, DMSO y talidomida son principalmente CD38+. Esto indica que pueden usarse 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-
1.3- diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona para suprimir espedficamente la generacion de globulos rojos o colonias eritropoyeticas (BFU-E y CFU-E), mientras que tanto se acrecienta la generacion de colonias formadoras de leucocitos y plaquetas (CFU-GM) como se potencia la produccion de unidades formadoras de colonias totales. Los metodos de la invencion pueden usarse por lo tanto para regular la diferenciacion de citoblastos, y pueden usarse tambien para estimular la tasa de formacion de colonias, proporcionando beneficios significativos al trasplante de citoblastos hematopoyeticos al mejorar la velocidad de injerto de medula osea y la recuperacion de la produccion de leucocitos y/o plaquetas. Vease la Tabla 4 siguiente.
Se analizaron los efectos de talidomida, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-
1.3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona sobre la expresion de la diferenciacion celular por analisis FACS de protemas de superficie de celulas que eran CD34+CD38- frente a CD34+CD38+ o que eran CD11b+. Se exponen los resultados en la Tabla 1.
Tabla 1: Ejemplos de los efectos sobre la diferenciacion celular y la expresion de marcadores de superficie celular de CD34, CD38 y CD11b en celulas progenitoras hematopoyeticas derivadas de sangre de cordon
Poblacion de celulas CD34+CD38-/CD34+CD38+
Ninguno DMSO Thai 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3- piperidil)isoindolin- 1,3-diona 3-(4-amino-1-oxo- 1,3-dihidroisoindol- 2-il)piperidin-2,6- diona
5 |jg/ml
1,2/6,3 2,7/3,7 3,5/6,5 17,3/02
1 jg/ml
1,5/8,5 2,6/5,3 1,0/3,8 15,0/0,2 10,3/1
0,3 jg/ml
ND 1,5/5,7 3,2/15,1 5,9/0,2 9,8/1,7
CB2417
Ninguno DMSO ThaI 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3- piperidil)isoindolin- 1,3-diona 3-(4-amino-1-oxo- 1,3-dihidroisoindol- 2-il)piperidin-2,6- diona
5 jg/ml
0,5/5,7 0,8/5,2 1,1/3,0 14,7/0,1 4,2/0,3
1 jg/ml
0,5/4,9 0,7/3,9 1,0/3,8 12,0/0,8 3,8/0,6
0,3 jg/ml
ND 0,5/4,4 0,8/5,0 5,9/0,2 3,4/0,9
CB2276
Ninguno DMSO ThaI 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3- piperidil)isoindolin- 1,3-diona 3-(4-amino-1-oxo- 1,3-dihidroisoindol- 2-il)piperidin-2,6- diona
5 jg/ml
11,7 % 5,0 % 8,1 % 1,6 % 4,8 %
1 jg/ml
9,1 % 7,3 % 6,2 % 3,8 % 8,6 %
0,3 jg/ml
ND 7,0 % 7,6 % 6,9 % 13,3 %
CB2417
Ninguno DMSO ThaI 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3- piperidil)isoindolin- 1,3-diona 3-(4-amino-1-oxo- 1,3-dihidroisoindol- 2-il)piperidin-2,6- diona
5 jg/ml
12,0 % 7,2 % 6,5 % 2,5 % 5,5 %
1 jg/ml
7,2 % 5,3 % 5,2 % 3,9 % 8,2 %
0,3 jg/ml
ND 5,1 % 7,8 % 8,4 % 11,2 %
No hubo un cambio significativo de tamano de la poblacion de celulas CD11b+ y, en el caso de 3-(4-amino-1-oxo-
1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, se observo una mayor poblacion de celulas CD11b+ a concentraciones menores.
5 Sin embargo, el nivel de expresion de CD11b disminuyo en celulas tratadas tanto con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona como 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, como se determina por la inmunofluorescencia media (MIF), indicando que se repriirna la expresion de CD11b. Esto sugiere que las celulas CD11b+ estan en un estado menos diferenciado cuando se cultivan en presencia de.
6.3. EJEMPLO 3: Efectos de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-
1.3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona sobre celulas MNC de sangre de cordon humana
En los ejemplos anteriores, se mostro que 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-
1.3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona regulan negativamente de forma significativa la expresion de CXCR4 en 5 celulas CD34+ de sangre de cordon y aumentan la poblacion de celulas CD34+CD38-. En este ejemplo, se muestra
que 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6- diona tienen actividades similares sobre las celulas mononucleadas (MNC) de sangre de cordon.
6.3.1. Materiales y metodos
Se aislaron MNC de sangre de cordon, que se habfan crioconservado y descongelado usando metodos estandares, 10 mediante el metodo de separacion de Ficoll estandar y se cultivaron en placas de 24 pocillos a 0,5*106 celulas/ml en FCS al 20 %-IMDM con citocinas (IL6, KL y G-CSF 10 ng/ml cada una) por triplicado. Los grupos experimentales eran ninguno (citocinas solo), DMSO (1,7 jl), 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona (5,0 |jg en 1,7 jl de DMSO), 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona (5 jg en 1,7 jl de DMSO). Se recolectaron las celulas cultivadas y se analizaron por tincion con FACS despues de 1 semana de cultivo. Se resumen los 15 resultados en la Tabla 2 y en las FIG. 8-12. Se expresan los datos como media ± DE de tres pocillos independientes.
Tabla 2
Ninguno DMSO 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil)- isoindolin-1,3-diona 3-(4-amino-1-oxo-1,3- dihidroisoindol-2- il)piperidin-2,6-diona
Celulas totales (1 x 106)
0,50 ± 0,10 0,30 ± 0,17 0,223 ± 0,06 0,30 ± 0
CD34(%)
2,50 ± 0,33 2,73 ± 0,07 3,31 ± 0,64 2,34 ± 0,22
Celulas CD34+ totales
7933± 7310 8133±4623 7800 ± 2600 7166± 802
CD34+CD38- (%)
0,05 ± 0,01 0,06 ± 0,04 1,70 ± 0,22 0,80 ± 0,29
CXCR4+CD45+ (%)
8,7 ± 0,54 12,1 ± 1,30 2,9 ± 0,5 3,6 ± 0,9
CXCR4+CD45- (%)
0,48 ± 0,15 0,66 ± 0,04 4,27 ± 0,23 3,28 ± 0,89
6.3.2. Resultados y discusion
Como se muestra en la Tabla 2 y en las FIG. 8-12, el numero de celulas totales de MNC cultivadas con DMSO, 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona 20 era menor que en el grupo de control (“Ninguno”, citocinas solo). Esto puede ser el resultado de los efectos del DMSO. Los cultivos celulares que se cultivaron con MID 1 exhibfan un mayor porcentaje de celulas CD34+ que todos los demas grupos, mientras que los numeros totales de celulas CD34+ eran similares en todos los grupos. Los numeros de celulas CD34+CD38- eran significativamente mayores en celulas tratadas con IMJD1 y 3-(4-amino-1- oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, lo que es consistente con los resultados de tratar celulas CD34+ 25 purificadas con los compuestos. Esta bien aceptado que las celulas CD34+CD38- son celulas progenitoras hematopoyeticas menos diferenciadas que injertan y proliferan despues del trasplante con mayor eficacia que las celulas CD34+CD38+ (Dao et al. 1998, Blood 91 (4): 1243-55; Huang et al., 1994, Blood 83(6): 1515-26).
El DMSO parece estimular la expresion de CXCR4 en MNC de sangre de cordon. 4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona inhibfan significativamente 30 la expresion de CXCR4 en celulas CD45+ en comparacion con ambos grupos de control.
Una mayona de celulas CXCR4+ en los cultivos de celulas tratadas con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-
1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona eran negativas de CD45. Esta poblacion celular era significativamente mayor en las celulas tratadas con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3- diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona.
35 Los resultados indican que la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y la 3-(4-amino-1-oxo-1,3- dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona son utiles en el acondicionamiento de citoblastos para contrarrestar los efectos daninos de la crioconservacion, descongelamiento y/o exposicion a crioconservantes sobre los citoblastos. Los resultados indican ademas que la supresion por DMSO de la produccion de celulas CD34+ y CD14+ puede contrarrestarse tratando con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3- 40 dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, lo que potencia esa capacidad proliferativa de las celulas CD34+ y CD14+.
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6.4. EJEMPLO 4. Efectos de talidomida, 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4- amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona sobre la produccion de monocitos
6.4.1. Materiales y metodos
Se cultivaron celulas CD34+ de sangre de cordon humana purificada (mas de 90 % de CD34+) en medio de FCS al 20 %-IMDM suplementado con citocinas (IL3, IL6, G-CSF, KL y Epo) a 4*104 celulas/ml durante 14 dfas a 37 °C en una incubadora humidificada con 5 % de CO2. Los grupos experimentales consistian en un grupo en que (i) no se anadieron DMSO ni compuestos qmmicos (“Ninguno”), (ii) DMSO solo, (iii) talidomida disuelta en dMsO, (iv) 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona disuelta en DMSO y (v) 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2- il)piperidin-2,6-diona disuelta en DMSO. Se recolectaron alfcuotas de celulas y se tineron con anticuerpo monoclonal conjugado con CD34-PE y anticuerpo monoclonal conjugado con CD14-FITC.
6.4.2. Resultados y discusion
Los resultados mostraron que en el grupo “Ninguno”, solo un 0,95 % de las celulas totales eran CD34+. En el grupo tratado con DMSO, solo un 0,17 % de las celulas eran CD34+, sugiriendo que el DMSO tiene un efecto negativo sobre la expansion y conservacion de CD34+. En el grupo tratado con talidomida, un 0,24 % de las celulas eran CD34+, que no es significativamente diferente de las celulas tratadas con DMSO. En los grupos tratados con 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, sin embargo, habfa un porcentaje significativamente mayor de celulas CD34+ (18,7 % y 7,1 %, respectivamente). (Veanse tambien los resultados experimentales resumidos en la FIG. 13 y la leyenda de la figura acompanante).
CD14 es un marcador para monocitos. En el grupo “Ninguno”, un 11,5 % de las celulas eran CD14+, mientras que en el grupo tratado con DMSO, un 3,7 % eran CD14+, indicando que disminma la produccion de monocitos. Como era el caso para la expresion de CD34 anterior, los resultados del grupo tratado con talidomida y el grupo tratado con DMSO eran similares. Puesto que los grupos tratados con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona se expusieron a DMSO tambien, puede deducirse que la produccion de monocitos que se inhibe por DMSO se supera por el tratamiento con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona.
6.5. EJEMPLO 5: Efectos del pretratamiento con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona sobre celulas nucleadas trasplantadas de sangre de cordon umbilical y placenta
Este experimento demuestra que el pretratamiento con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona aumenta la supervivencia de celulas nucleadas placentarias (PLNC) trasplantadas, celulas nucleadas de sangre de cordon umbilical (UCBNC) y celulas de medula osea (BMNC).
6.5.1. Materiales y metodos
Se obtuvieron celulas nucleadas placentarias (PLNC), celulas nucleadas de sangre de cordon umbilical (UCBNC) y celulas de medula osea (BMNC) de donantes humanos. Se obtuvieron las PLNC y UCBNC de placenta y cordon umbilical usando metodos descritos en la seccion 5.4 anterior.
Se pretrataron las celulas por incubacion en DMEM suplementado con suero CB humano al 2 % con 4-(amino)-2- (2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona 10 g/ml durante 24 horas. Se lavaron entonces las celulas, se resuspendieron en plasma autologo y se administraron por via intravenosa a ratones SJL/L adultos receptores (Jackson Laboratories) que teman ablacion de medula osea producida por una irradiacion mortal (900 cGy) segun metodos estandares. Dicha irradiacion es mas de un 90 % mortal a los 50 dfas despues de la irradiacion (Ende et al., 2001, Life Sciences 69(13): 1531-1539; Chen y Ende, 2000, J. Med. 31: 21-30; Ende et al., 2000, Life Sci. 67(1): 53-9; Ende y Chen, 2000, Am. J. Clin. Pathol. 114: 89).
6.5.2. Resultados y discusion
Se muestran en la Tabla 3 siguiente los efectos del pretratamiento con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-
1,3-diona sobre PLNC, UCBNC y BMNC trasplantadas. Como puede verse en la Tabla 3, el pretratamiento con 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona aumenta la supervivencia de celulas nucleadas placentarias (PLNC), celulas nucleadas de sangre de cordon umbilical (UCBNC) y celulas de medula osea (BMNC) trasplantadas.
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Tabla 3
Grupo experimental
Tratamiento N° de animales irradiados N° de animales muertos a los 50 dias % del peso corporal inicial a los 50 dias
1
PLNC 5 x 106 intravenoso 3 1 84
2
PLNC 50 x 106 intravenoso 3 0 89
3
PLNC 5 x 106 + pretratamiento intravenoso con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona 4 0 102
4
UCBNC 100 x 106 intravenoso 3 0 81
5
UCBNC 10 x 106 + pretratamiento intravenoso con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona 3 0 84
6
UCBNC 10 x 106 intravenoso 1 78
7
BMNC 0,5 x 106 3 3 79
8
BMNC 5 x 106 3 3 74
9
BMNC 50 x 106 3 2 83
10
Control 12 11 N/A
Abreviaturas:
PLNC: celulas nucleadas placentarias
UCBNC: celulas nucleadas de sangre de cordon umbilical
BMNC: celulas de medula osea
N/A: no aplicable
6.6. Modulacion de la diferenciacion de celulas progenitoras CD34+
6.6.1. Materiales y metodos
Se obtuvieron celulas progenitoras CD34+ de medula osea y sangre de cordon en Clonetics y se cultivaron en MDM de Iscove con BIT 95000 (StemCell Technologies) en presencia de SCF, Flt-3L, GM-CSF y TNF-a durante 6 dfas, y despues en presencia de GM-CSF y TNF-a durante 6 dfas adicionales.
Analisis del fenotipo de superficie celular: Se procesaron las celulas para tincion doble (30 min a 4 °C) el dfa 6 y el dfa 12 usando AcM conjugados con FITC y PE. Los anticuerpos usados eran de BD Pharmingen: CD34 (PE), cD38 (FITC), CD33 (FITC), CD1a (FITC), CD86(PE), CD14(PE), CD83 (PE), CD54 (PE), CD11b (PE), CD11c (PE), HLA- DR (PE), CD15 (FITC) y CD133 (PE) de Miltenyi. Se efectuo el analisis de fluorescencia en un citometro de flujo FACScan despues de la adquisicion de 10.000 eventos (Coulter). Los resultados presentados son representativos de cuatro experimented independientes.
Deteccion de la apoptosis: Se determino la exposicion a fosfatidilserina usando tincion con anexina V-FITC en combinacion con yoduro de propidio (kit I de deteccion de la apoptosis de BD Pharmingen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Fagocitosis: Se analizo la actividad endodtica de las celulas midiendo la captacion de FITC-dextrano. Se incubaron las celulas con dextrano-FITC 1 mg/ml (Sigma) en medio completo a 37 °C durante 1 hora y a 4 °C durante 1 hora como control negativo. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.
Ensayo de proliferacion de linfocitos T: Despues de 13 dfas de cultivo, se recogieron celulas DC derivadas de CD34+ y, despues de tratamiento con mitomicina C (50 pg/ml, Sigma), se usaron como celulas estimuladoras para linfocitos T CD3+ adultos alogenicos purificados a partir de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de voluntarios sanos. Los linfocitos T sensibles CD3+ se usaron a una concentracion de 5*104 celulas/pocillo. Se anadieron celulas
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estimuladoras en dosis graduadas a los linfocitos T en placas de cultivo de tejido de fondo transparente negras de fondo plano de 96 pocillos para deteccion de quimioluminiscencia. Se efectuaron los cultivos en medio RPMI 1640 suplementado con FBS termoinactivado al 10 %, glutamina y penicilina-estreptomicina. Despues de 6 dfas de cultivo, se midio la proliferacion celular con el ensayo de quimioluminiscencia BrdU (Roche, Nutley N.J.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan como media ± DE obtenidos de cultivos por triplicado.
6.6.2. Resultados y discusion
Se encontro que la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona altera significativamente el desarrollo de DC a partir de progenitores CD34+. Para estudiar el efecto de la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3- diona sobre la generacion de DC, se cultivaron celulas progenitoras CD34+ con o sin 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona (1 jM) durante un periodo de 12 dfas durante la fase de expansion y maduracion (dfa 1 a dfa 12) o un periodo de 6 dfas durante la fase de maduracion (dfa 6 a dfa 12) (FIG. 14). La adicion de 4-(amino)-2- (2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona del d^a 1 al dfa 12 inhi^a la adquisicion del fenotipo de DC (FIG. 15) y, lo mas importante, aumentaba la poblacion de celulas CD34+CD38-, alterando la diferenciacion normal de celulas CD34+CD38- en celulas CD34+CD38+ (FIG. 16). Sin embargo, las celulas CD34+ tratadas con 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona adquinan el marcador mieloide CD33, y estas celulas presentaban un fenotipo CD34+cD38-CD33+ el dfa 6. La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona prevema casi completamente la generacion de celulas CD1a+ para el dfa 6, y particularmente la generacion de celulas dobles positivas CD86+CD1a+. Esta poblacion doble positiva se cree que es la precursora de DC de Langerhans epidermicas. La 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona disminma tambien la generacion de celulas CD14+CD1a- que pueden dar lugar tanto a DC dermicas como a monocitos/macrofagos. El aumento en la poblacion de progenitores tempranos (celulas CD34+CD38-) y el bloqueo de los progenitores de DC mieloides (celulas CD1a+CD14- y CD1a-CD14+) eran dependientes de la dosis y alcanzaban el maximo a 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-
1,3-diona 1 jM (FIG. 17). Este efecto era reversible y se observaba interferencia con la ruta de diferenciacion de CD34 solo si los progenitores CD34+ se cultivaban durante al menos 3 dfas con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona (FIG. 18).
Dosis multiples de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona entre los dia 0 y 6 intensificaban el aumento de la poblacion de cD34+ (FIG. 19A).
Las celulas progenitoras CD34+ cultivadas en presencia de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona exhibfan tambien el dfa 12 una expresion disminuida de moleculas coestimulantes (CD86, CD80) (FIG. 20). La molecula de adhesion CD54 estaba alterada, con la expresion disminuida de las poblaciones de CD54bright y la expresion aumentada de las de CD54dim (FIG. 21). Se redujo la expresion de moleculas HLA-DR en progenitores CD34+ tratados con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona.
Cuando se anadio 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona el dfa 6, despues de cultivo durante los dfas 0-6 sin tratamiento, y cuando la poblacion de CD1a+ se habfa generado ya, la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona aumentaba la persistencia de la poblacion de CD1a+ (Tabla 1). El cultivo tratado con 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona contema relativamente mas precursores de CD1a+ el dfa 12 que el control de DMSO. La adicion de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona a celulas CD34+ diferenciadas el dfa 6 disminma tambien considerablemente la generacion de precursores de CD14+ y la expresion de moleculas coestimulantes (CD86, CD80).
Tabla 1. Caracterizacion fenotfpica el dfa 12 de DC generadas a partir de celulas progenitoras CD34+ en presencia de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona del dfa 6 al dfa 12
Dia 12
DMSO del dia 6 al dia 12 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)-isoindolin-1,3-diona del dia 6 al dia 12
CD1a+
8,5 % 11,5%
CD14+
19,0 % 8,0 %
CD86+
28,8 % 18,5 %
CD80+
19,6 % 13,8 %
La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona promueve la diferenciacion granulocftica: para determinar si el bloqueo de la generacion de DC estaba asociado a un cambio a una ruta de diferenciacion mieloide diferente, se monitorizo la expresion del marcador granulocftico CD15. La expresion de la molecula de superficie CD15 aumentaba en celulas progenitoras CD34+ cultivadas en presencia de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-
1,3-diona (FIG. 22). En presencia de un coctel de citocinas que impulsa la diferenciacion a DC, la adicion de 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona desviaba la expansion/maduracion de las celulas progenitoras a
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un fenotipo de tipo mas granulocftico. Se estudio tambien el sesgo en la diferenciacion mieloide monitorizando la expresion de 2 marcadores: CD11c, expresado por progenitores de DC mieloides de celulas de Langerhans y DC intersticiales, y CD15 expresado por progenitores granulocfticos. La disminucion en la poblacion de CD11c+CD15- estaba asociada a un aumento simultaneo de la poblacion granulocftica CD11c-CD15+ (FIG. 19B). De forma interesante, dosis multiples de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona potenciaban el desplazamiento hacia el linaje granulocftico.
El bloqueo en la generacion de DC no esta mediado por una destruccion espedfica de los progenitores de DC: para determinar si la disminucion de los progenitores de DC estaba mediada por una destruccion espedfica, se cultivaron celulas progenitoras CD34+ durante un periodo de 6 dfas en presencia de SCF, Flt-3L, GM-CSF y TNF-a. El dfa 6, se aislaron celulas CD1a+CD14- y CD1a-CD14+ (progenitoras de DC) mediante clasificacion celular magnetica (Miltenyi). Se cultivaron las poblaciones purificadas durante 2 dfas adicionales en presencia de GM-CSF y TNF-a con o sin 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona (1 |jM). No hada un aumento significativo del nivel de poblaciones de anexina V+-PI- (apoptosis temprana) y anexina V+-PI+ (apoptosis tardfa) tras el tratamiento con 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona (FIG. 23).
La actividad funcional de DC generadas a partir de progenitores CD34+ se altera: se ensayo la capacidad fagocftica de celulas derivadas de celulas progenitoras CD34+ cultivadas con citocinas con o sin 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona mediante endocitosis mediada por receptor de manosa de dextrano-FITC el dfa 12. Cuando se anadfa 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona del dfa 1 al dfa 12, hada una fuerte disminucion de la capacidad fagocftica en comparacion con el control de DMSO (FIG. 24). Cuando se anadfa 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona del d^a 6 al dfa 12, la capacidad fagocftica era comparable con la de las celulas de control de DMSO (FIG. 25).
Se evaluo la capacidad de presentacion de antfgeno (APC) de celulas CD34+ cultivadas con citocina con o sin 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona midiendo su capacidad de inducir la proliferacion de linfocitos T alogenicos CD3+ en un ensayo de reaccion leucocitaria mixta (MLR) el dfa 12. Cuando se anadfa 4-(amino)-2-(2,6- dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona del d^a 1 al dfa 12, las celulas CD34+ mostraban una capacidad reducida de estimular la proliferacion de linfocitos T en comparacion con el control de DMSO (FIG. 26). En contraposicion, cuando se anadfa 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona del dfa al dfa 12, la capacidad de estimular la proliferacion de linfocitos T era comparable a la de celulas de control de DMSO (FIG. 27). La ruta de diferenciacion normal seguida por las celulas CD34+ se representa en la FIG. 28.
Estos resultados indican que la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona atenuaba drasticamente la diferenciacion de celulas progenitoras CD34+ en celulas dendrfticas. Como consecuencia, las celulas tratadas con 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona presentaban una baja capacidad fagocftica y una capacidad de APC reducida. De forma mas importante, la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona aumentaba los progenitores hematopoyeticos tempranos, las celulas CD34+CD38-. Se ha mostrado que estos progenitores hematopoyeticos tempranos dan un mejor injerto y repoblacion en el modelo de raton NOD-SCID (Tamaki et al., J. Neurosci. Res. 69(6): 976-86 (2002)). Ademas, la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona sesgaba la diferenciacion de celulas CD34+ al cambiar la diferenciacion mieloide hacia el linaje granulocftico, incluso cuando la presion de citocinas esta a favor de la diferenciacion de celulas dendrfticas. Ademas, se encontro que la 4-(amino)- 2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona no tiene efectos toxicos sobre las celulas CD34+ y no perjudica la capacidad de las celulas de proliferar. Esta modulacion de la funcion de DC y la promocion de la diferenciacion granulocftica puede tener una utilidad terapeutica significativa para el tratamiento de diversos canceres, trastornos inmunologicos y enfermedades infecciosas, y en trasplantes de organo y medicina regenerativa.
Vease la FIG. 29 para un resumen grafico de lo anterior.
6.7. La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona modula la diferenciacion de celulas progenitoras CD133+
Las multiples dosis de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona, ademas de intensificar el aumento de la poblacion de CD34+, aumentan tambien la expresion de CD133, que se expresa habitualmente por celulas progenitoras hematopoyeticas CD34bright y algunas subpoblaciones de CD34- primitivas (FIG. 19A, 19B). La 4- (amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona, al enriquecer en celulas hematopoyeticas CD34+CD133+ primitivas, debena tener implicacion clrnica para la recuperacion hematopoyetica despues del trasplante de citoblastos. Ademas, los citoblastos CD133+ pueden dar lugar tambien al linaje endotelial y contribuyen en terminos de la curacion de heridas. Las multiples dosis de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona no exacerbaban el bloqueo de la generacion de precursores de DC de Langerhans.
6.8. Generacion de celulas dendrfticas de murido a partir de celulas progenitoras hematopoyeticas Sca+ de medula osea (BM)
6.8.1. Materiales y metodos
Se obtuvo medula osea de raton de ratones C57BL/6 endogenicos en Clonetics. Se enriquecieron los progenitores
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Sca+Lin- usando el coctel de enriquecimiento de progenitores de murido SpinSep (StemCell Technologies) y se cultivaron en MDM de Iscove con BIT 95000 (StemCell Technologies) en presencia de los factores de crecimiento de murido SCF, Flt3L, GM-CSF y M-CSF durante 9 dfas para promover la expansion de celulas Sca+ y un fenotipo precursor de DC, y entonces en presencia de GM-CSF y TNF-a durante 3 dfas adicionales para impulsar a las celulas a un fenotipo de DC inmaduro. Vease la FIG. 30. Se cultivaron las celulas Sca+Lin- enriquecidas en presencia de DMSO (al 0,1 %), 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona 10 |jM o acido todo-trans- retinoico (ATRA) (ICN Biomedicals) 10 jM desde el dfa 0. Se anadieron los compuestos a las celulas el dfa 0 y el dfa 9.
Analisis del fenotipo de superficie celular de murido: se procesaron las celulas de murido para doble tincion (14 min a TA) el dfa 9 y el dfa 12, usando AcM conjugados con FlTC y PE. Los anticuerpos usados eran de BD Pharmingen: Sca (PE), CD11b (FITC), Gr-1 (FITC), CD86 (PE), CD14 (PE), CD80 (PE), I-Ab (PE), CD40 (PE) y CD32.1/16.1 (FITC) de Miltenyi. Se efectuo el analisis de fluorescencia en un citometro de flujo FACScan (Coulter) despues de la adquisicion de 10.000 eventos.
6.8.2. Resultados y discusion
Se encontro que la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona altera el desarrollo de DC de murido a partir de progenitores Sca+. El dfa 9, las celulas presentaban un fenotipo precursor de DC con alta expresion en superficie de los marcadores dendnticos/mieloides CD32/16 (receptores de Fc), CD11b, CD80, baja expresion de I- Ab y CD86 y falta de expresion de los marcadores de linaje como CD14 y Gr-1 (FIG. 31). La 4-(amino)-2-(2,6-dioxo- (3-piperidil)isoindolin-1,3-diona no mostraba un efecto significativo sobre la expresion de marcadores de superficie celular para el dfa 9, mientras que el ATRA mostraba una regulacion negativa notable de la expresion de CD80, I-Ab y Sca+ (datos no mostrados). Sin embargo, para el dfa 12, la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona mostraba regulacion negativa de CD86 y expresion brillante de I-Ab y regulacion positiva de la expresion de CD11b (FIG. 32). El ATRA mostraba efectos similares pero mas pronunciados que la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona. Ademas, la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona no mostraba efectos sobre la expresion de CD40 y CD80, mientras que el ATRA mostraba una regulacion negativa marcada de estas moleculas (no mostrado).
Estos resultados sugieren que la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona inhibe la diferenciacion de precursores de DC en DC inmaduras mediante la regulacion negativa de la expresion de CD86 y MHC II. Los efectos del compuesto no son tan drasticos como aquellos observados en progenitores hematopoyeticos humanos, y esto en paralelo a la baja actividad de la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona en raton in vitro e in vivo en otros modelos. El efecto de la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona es mucho menos pronunciado que el del ATRA, que es un teratogeno en ratones.
6.9. Aplicacion del ensayo de diferenciacion a compuestos distintos de IMID
La metodologfa descrita anteriormente, concretamente el examen del efecto de los IMID tales como 4-(amino)-2- (2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona sobre la diferenciacion de celulas progenitoras tempranas tales como celulas CD34+, puede aplicarse a cualquier compuesto de interes cuyo efecto sobre la diferenciacion se desee conocer. Como ejemplo de la extension de este metodo de ensayo a otros compuestos, se comparo el efecto de acido retinoico (ATRA) y aspirina con el de la 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona sobre la diferenciacion de celulas CD34+ hacia el linaje de DC frente a las celulas de control (tratadas con DMSO). Se estudio el acido retinoico debido a su efecto conocido sobre la proliferacion y diferenciacion celulares, su uso terapeutico en algunos canceres y su efecto teratogenico conocido. A la inversa, se estudio el efecto de la aspirina porque es un farmaco antiinflamatorio usado comunmente sin propiedades inmunomoduladoras. Se presentan a continuacion en la Tabla 2 los resultados del dfa 6 de celulas progenitoras CD34+ cultivadas en presencia de SCF, Flt-3L, GM-CSF y TNF-a, con o sin compuesto durante un periodo de 6 dfas (la flecha ascendente indica un aumento de la poblacion celular; la flecha descendente indica una disminucion).
Tabla 2. Comparacion del efecto de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona, acido retinoico y aspirina sobre la diferenciacion de celulas progenitoras CD34+
Poblacion celular
4-(Amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil)isoindolin-1,3-diona RA todo trans
CD34+ CD38-
T
CD34- CD38+
T
CD1a+ CD14-
CD1a- CD14+
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Aspirina
Sin cambios Sin cambios Sin cambios Sin cambios
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CD15+ f f Sin cambios
En la bibliograffa, se ha mostrado que otros farmacos modulan la diferenciacion celular, por ejemplo, un artfculo reciente resena la modulacion por corticosteroides de la generacion de DC a partir de celulas progenitoras CD34+. El perfil difiere de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil)isoindolin-1,3-diona, con un aumento de la poblacion de CD1a+ y una disminucion de la poblacion de CD14+.
6.10. EJEMPLO 10: Induccion de la diferenciacion en tipos celulares particulares
Se inducen celulas de sangre de cordon y/o citoblastos de tipo embrionario a diferenciar en un tipo celular particular mediante exposicion a un factor de crecimiento. Los factores de crecimiento que se usan para inducir la induccion incluyen, pero sin limitacion: GM-CSF, IL-4, Flt3L, CD40L, IFN-alfa, TNF-alfa, FN-gamma, IL-2, IL-6, acido retinoico, factor de crecimiento de fibroblastos basico, TGF-beta-1, TGF-beta-3, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento epidermico, cardiotropina-1, angiotensinogeno, angiotensina I (AI), angiotensina II (AII), agonistas de receptor de tipo 2 de AII AT2 o analogos o fragmentos de los mismos.
6.10.1. Induccion de la diferenciacion en neuronas
Este ejemplo describe la induccion de celulas de sangre de cordon y/o citoblastos de tipo embrionario a diferenciar en neuronas. Se emplea el siguiente protocolo para inducir la diferenciacion neuronal:
1. Se hacen crecer citoblastos placentarios durante 24 h en medio de preinduccion consistente en DMEM/FBS al 20 % y beta-mercaptoetanol 1 mM.
2. Se retira el medio de preinduccion y se lavan las celulas con PBS.
3. Se anade medio de induccion neuronal consistente en DMEM y beta-mercaptoetanol 1-10 mM. Como
alternativa, puede usarse medio de induccion consistente en DMEM/DMSO al 2 %/hidroxianisol butilado 200 pM para potenciar la eficacia de la diferenciacion neuronal.
4. En ciertas realizaciones, pueden aparecer cambios morfologicos y moleculares tan pronto como 60 minutos
despues de la exposicion a medio exento de suero y beta-mercaptoetanol (Woodbury et al., J. Neurosci. Res., 61:
364-370). Puede usarse RT/PCR para valorar la expresion, p.ej., de genes de receptor de factor de crecimiento nervioso y de cadena pesada de neurofilamentos.
6.10.2. Induccion de la diferenciacion en adipocitos
Este ejemplo describe la induccion de celulas de sangre de cordon y/o citoblastos de tipo embrionario a diferenciar en adipocitos. Se emplea el siguiente protocolo para inducir la diferenciacion adipogenica.
1. Se hacen crecer citoblastos en MSCGM (Bio Whittaker) o DMEM suplementado con suero de sangre de cordon al 15 %.
2. Se usan tres ciclos de induccion/mantenimiento. Cada ciclo consiste en alimentar los citoblastos placentarios con medio de induccion de la adipogenesis (Bio Whittaker) y cultivar las celulas durante 3 dfas (a 37 °C, 5 % de CO2), seguido de 1-3 dfas de cultivo en medio de mantenimiento de la adipogenesis (Bio Whittaker). Se usa un medio de induccion que contiene dexametasona 1 pM, indometacina 0,2 mM, insulina 0,01 mg/ml, IBMX 0,5 mM, DMEM rico en glucosa, FBS y antibioticos.
3. Despues de 3 ciclos completos de induccion/mantenimiento, se cultivan las celulas durante 7 dfas adicionales en medio de mantenimiento de la adipogenesis, reemplazando el medio cada 2-3 dfas.
4. La adipogenesis puede valorarse mediante el desarrollo de multiples vesfculas lipfdicas intracitoplasmaticas que pueden observarse facilmente usando el tinte lipofilo aceite rojo 0. Se emplean ensayos de rT/PCR para examinar la expresion de genes de lipasa y protema de union a acido graso.
6.10.3. Induccion de la diferenciacion en condrocitos
Este ejemplo describe la induccion de celulas de sangre de cordon y/o citoblastos de tipo embrionario a diferenciar en condrocitos. Se emplea el siguiente protocolo para inducir la diferenciacion condrogenica:
1. Se mantienen citoblastos placentarios en MSCGM (Bio Whittaker) o DMEM suplementado con suero de sangre de cordon al 15 %.
2. Se toman alfcuotas de citoblastos placentarios en un tubo de polipropileno esteril. Se centrifugan las celulas (150xg durante 5 minutos) y se lavan dos veces en medio de condrogenesis incompleto (Bio Whittaker).
3. Despues del ultimo lavado, se resuspenden las celulas en medio de condrogenesis completo (Bio Whittaker) que contiene TGF-beta-3 0,01 pg/ml a una concentracion de 5*10(5) celulas/ml.
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4. Se toman alfcuotas de 0,5 ml de celulas en un tubo de cultivo de polipropileno de 15 ml. Se sedimentan las celulas a 150xg durante 5 minutos. Se deja intacto el sedimento en el medio.
5. Se incuban tubos tapados sin apretar a 37 °C y 5 % de CO2 durante 24 horas.
6. Se alimentan los sedimentos celulares cada 2-3 dfas con medio de condrogenesis completo recien preparado.
7. Se mantienen los sedimentos suspendidos en el medio mediante agitacion diaria usando un vortex de baja velocidad.
8. Se recolectan los sedimentos de celulas condrogenicas despues de 14-28 dfas de cultivo.
9. La condrogenesis puede caracterizarse, p.ej., mediante la observacion de la produccion de matriz eosinofila, valoracion de la morfologfa celular y/o RT/PCR para examen de la expresion genica de colageno 2 y colageno 9.
6.10.4. Induccion de la diferenciacion en osteocitos
Este ejemplo describe la induccion de celulas de sangre de cordon y/o citoblastos de tipo embrionario a diferenciar en osteocitos. Se emplea el siguiente protocolo para inducir la diferenciacion osteogenica:
1. Se cultivan cultivos adherentes de citoblastos placentarios en MSCGM (Bio Whittaker) o DMEM suplementado con suero de sangre de cordon al 15 %.
2. Se dejan reposar los cultivos durante 24 horas en matraces de cultivo de tejido.
3. Se induce la diferenciacion osteogenica reemplazando el MSCGM por medio de induccion osteogenico (Bio Whittaker) que contiene dexametasona 0,1 jM, 2-fosfato de acido ascorbico 0,05 mM y beta-glicerofosfato 10 mM.
4. Se alimentan las celulas cada 3-4 dfas durante 2-3 semanas con medio de induccion osteogenico.
5. Se ensaya la diferenciacion usando un tinte espedfico de calcio y RT/PCR para la expresion genica de fosfatasa alcalina y osteopontina.
6.10.5. Induccion de la diferenciacion en hepatocitos
Este ejemplo describe la induccion de celulas de sangre de cordon y/o citoblastos de tipo embrionario a diferenciar en hepatocitos. Se emplea el siguiente protocolo para inducir la diferenciacion hepatogenica:
1. Se cultivan citoblastos placentarios en DMEM/CBS al 20 % suplementado con factor de crecimiento de hepatocitos 20 ng/ml y factor de crecimiento epidermico 100 ng/ml. Puede usarse sustituto de suero KnockOut en lugar de FBS.
2. Se anade IL-6 50 ng/ml a los matraces de induccion.
6.10.6. Induccion de la diferenciacion en celulas pancreaticas
Este ejemplo describe la induccion de celulas de sangre de cordon y/o citoblastos de tipo embrionario a diferenciar en celulas pancreaticas. Se emplea el siguiente protocolo para inducir la diferenciacion pancreatica:
1. Se cultivan citoblastos placentarios en DMEM/CBS al 20 % suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos basico 10 ng/ml y factor transformante beta 1 2 ng/ml. Puede usarse sustituto de suero KnockOut en lugar de CBS.
2. Se anade medio acondicionado de cultivos de celulas neuronales positivas de nestina al medio a una concentracion 50/50.
3. Se cultivan las celulas durante 14-28 dfas, realimentando cada 3-4 dfas.
4. Se caracteriza la diferenciacion ensayando la protema insulina o la expresion genica de insulina por RT/PCR.
6.10.7. Induccion de la diferenciacion en celulas cardiacas
Este ejemplo describe la induccion de celulas de sangre de cordon y/o citoblastos de tipo embrionario a diferenciar en celulas cardiacas. Se emplea el siguiente protocolo para inducir la diferenciacion miogenica:
1. Se cultivan citoblastos placentarios en DMEM/CBS al 20 % suplementado con acido retinoico 1 jM, factor de crecimiento de fibroblastos basico 10 ng/ml, factor de crecimiento transformante beta-1 2 ng/ml y factor de
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crecimiento epidermico 100 ng/ml. Puede usarse sustituto de suero KnockOut en lugar de CBS.
2. Como alternativa, se cultivan citoblastos placentarios en DMEM/CBS al 20 % suplementado con cardiotropina-1 50 ng/ml durante 24 horas.
3. Como alternativa, se mantienen los citoblastos placentarios en medio exento de protema durante 5-7 dfas, se estimulan entonces con extracto de miocardio humano (analisis de dosis crecientes). Se produce extracto de miocardio homogeneizando 1 g de miocardio humano en tampon HEPES al 1 % suplementado con suero de sangre de cordon al 1 %. Se incuba la suspension durante 60 minutos, se centrifuga entonces y se recoge el sobrenadante.
4. Se cultivan las celulas durante 10-14 dfas, realimentando cada 3-4 dfas.
5. Se valora la diferenciacion usando ensayos de expresion genica RT/PCR de actina cardiaca.
6.10.8. Caracterizacion de celulas de sangre de cordon y/o citoblastos de tipo embrionario antes y/o despues de la diferenciacion
Los citoblastos de tipo embrionario, las celulas de sangre de cordon y/o las poblaciones de celulas de sangre de cordon adicionadas con citoblastos de tipo embrionario se caracterizan antes y/o despues de la diferenciacion midiendo los cambios de morfologfa y marcadores de superficie celular usando tecnicas tales como citometna de flujo e inmunohistoqmmica, y midiendo los cambios en la expresion genica usando tecnicas tales como PCR. Las celulas que se han expuesto a factores de crecimiento y/o que se han diferenciado se caracterizan por la presencia o ausencia de los siguientes marcadores de superficie celular: CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y ABC-p+. Preferiblemente, los citoblastos de tipo embrionario se caracterizan, antes de la diferenciacion, por la presencia de los marcadores de superficie celular OCT-4+, APC-p+, CD34- y CD38-. Los citoblastos portadores de estos marcadores son tan versatiles (p.ej., pluripotentes) como los citoblastos embrionarios humanos. Las celulas de sangre de cordon se caracterizan, antes de la diferenciacion, por la presencia de los marcadores de superficie celular CD34+ y CD38+. Las celulas diferenciadas derivadas de citoblastos de tipo embrionario, celulas de sangre de cordon y/o poblaciones de celulas de sangre de cordon adicionadas con citoblastos de tipo embrionario preferiblemente no expresan estos marcadores.
La presente invencion no esta limitada en el alcance por las realizaciones espedficas descritas en la presente memoria. Es mas, resultaran evidentes diversas modificaciones de la invencion ademas de aquellas descritas en la presente memoria para los especialistas en la materia a partir de la descripcion anterior. Dichas modificaciones se pretende que entren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
7. bibliografJa
La cita de cualquier publicacion es para su divulgacion antes de la fecha de presentacion y no debena considerarse como la admision de que la presente invencion no tiene derecho a preceder dicha publicacion en virtud de la invencion anterior.

Claims (18)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para suprimir la generacion de BFU-E y CFU-E mientras se acrecienta la generacion de CFU- GM y se potencia la produccion de CFU-Total, comprendiendo dicho metodo:
    poner en contacto los citoblastos o celulas progenitoras de mairnfero in vitro con 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3- piperidil))isoindolin-1,3-diona o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona en condiciones en que dichos citoblastos o celulas progenitoras se diferencien; y
    en el que los citoblastos o celulas progenitoras de mai^ero son CD34+ o CD133+.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dichos citoblastos o celulas progenitoras se diferencian en celulas hematopoyeticas despues de dicho contacto.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dichos citoblastos son citoblastos placentarios, citoblastos de sangre de cordon, citoblastos de sangre periferica o citoblastos de medula osea.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la concentracion de dicho compuesto es de aproximadamente 0,005 |jg/ml a aproximadamente 5 mg/ml.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que los citoblastos o celulas progenitoras son citoblastos o celulas progenitoras humanos.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dichos citoblastos o celulas progenitoras son celulas CD34+.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que dichas celulas se diferencian en celulas CD38"CD33+ como resultado de dicho contacto o en el que dichas celulas se diferencian como resultado de dicho contacto en celulas que exhiben:
    una expresion de CD11c reducida respecto a un control;
    una expresion de CD38 reducida respecto a un control;
    una expresion de CD80 reducida respecto a un control;
    una expresion de CD86 reducida respecto a un control;
    una expresion de CD1a aumentada respecto a un control;
    una expresion de CD14 reducida respecto a un control;
    una expresion de HLA-DR reducida respecto a un control;
    una expresion de CD15 aumentada respecto a un control;
    una expresion de CD33 aumentada respecto a un control;
    una expresion de CD54 aumentada respecto a un control;
    una expresion de CD133 aumentada respecto a un control;
    o una combinacion de cualquiera de las caractensticas marcadoras anteriores;
    en el que dicho control son celulas CD34+ cultivadas en las mismas condiciones que dichas celulas en ausencia de dicho compuesto.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dichas celulas CD34+ o CD133+ se han crioconservado y descongelado antes de dicha diferenciacion.
  9. 9. Un compuesto seleccionado de 4-(amino)-2-(2,6-dioxo-(3-piperidil))isoindolin-1,3-diona y 3-(4-amino-1-oxo- 1,3-dihidroisoindol-2-il)piperidin-2,6-diona para uso en un metodo de tratamiento de un individuo necesitado de granulocitos, en el que dicho metodo comprende poner en contacto in vitro citoblastos o celulas progenitoras de marnffero CD34+ o CD133+ con dicho compuesto en condiciones en que dichas celulas se diferencien para suprimir la generacion de BFU-E y CFU-E, mientras se acrecienta la generacion de CFU-GM y la potenciacion de la produccion de CFU-Total, seguido de trasplante directo de las celulas diferenciadas a dicho individuo.
  10. 10. El compuesto para uso de la reivindicacion 9, en el que dicho individuo tiene infeccion, enfermedad granulomatosa cronica, alergia o neutropenia.
  11. 11. El compuesto para uso de la reivindicacion 10, en el que dicha infeccion es infeccion asociada a
    5
    10
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    25
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    neutropenia, sepsis neonatal bacteriana o infeccion en un paciente que recibe trasplante de medula osea.
  12. 12. El compuesto para uso de la reivindicacion 9, en el que dichos citoblastos o celulas progenitoras se diferencian en celulas hematopoyeticas despues de dicho contacto.
  13. 13. El compuesto para uso de la reivindicacion 9, en el que dichos citoblastos son citoblastos placentarios, citoblastos de sangre de cordon, citoblastos de sangre periferica o citoblastos de medula osea.
  14. 14. El compuesto para uso de la reivindicacion 9, en el que el compuesto se prepara para usar a una concentracion de aproximadamente 0,005 pg/ml a aproximadamente 5 mg/ml.
  15. 15. El compuesto para uso de la reivindicacion 9, en el que los citoblastos o celulas progenitoras son citoblastos o celulas progenitoras humanos.
  16. 16. El compuesto para uso de la reivindicacion 9, en el que dichos citoblastos o celulas progenitoras son celulas CD34+.
  17. 17. El compuesto para uso de la reivindicacion 16, en el que dichas celulas se diferencian en celulas CD38- CD33+ como resultado de dicho contacto o en el que dichas celulas se diferencian como resultado de dicho contacto en celulas que exhiben:
    una expresion de CD11c reducida respecto a un control;
    una expresion de CD38 reducida respecto a un control;
    una expresion de CD80 reducida respecto a un control;
    una expresion de CD86 reducida respecto a un control;
    una expresion de CD1a aumentada respecto a un control;
    una expresion de CD14 reducida respecto a un control;
    una expresion de HLA-DR reducida respecto a un control;
    una expresion de CD15 aumentada respecto a un control;
    una expresion de CD33 aumentada respecto a un control;
    una expresion de CD54 aumentada respecto a un control;
    una expresion de CD133 aumentada respecto a un control;
    o una combinacion de cualquiera de las caractensticas marcadoras anteriores;
    en el que dicho control son celulas CD34+ cultivadas en las mismas condiciones que dichas celulas en ausencia de dicho compuesto.
  18. 18. El compuesto para uso de la reivindicacion 9, en el que dichas celulas CD34+ o CD133+ se han crioconservado y descongelado antes de dicha diferenciacion.
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