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ES2603379T3 - Compuestos antagonistas de ARN para la modulación de PCSK9 - Google Patents

Compuestos antagonistas de ARN para la modulación de PCSK9 Download PDF

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ES2603379T3
ES2603379T3 ES11181596.5T ES11181596T ES2603379T3 ES 2603379 T3 ES2603379 T3 ES 2603379T3 ES 11181596 T ES11181596 T ES 11181596T ES 2603379 T3 ES2603379 T3 ES 2603379T3
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lna
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seq
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Ellen Marie Straarup
Niels Fisker Nielsen
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Roche Innovation Center Copenhagen AS
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Abstract

Un oligonucleótido antisentido, capaz de inhibir la expresión de PCSK9 humana, en el que dicho oligonucleótido antisentido es de 10-25 nucleobases de longitud y es complementario de una región correspondiente de SEQ ID NO 2; en el que el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido gapmer de fórmula A-B-C, en el que: A consiste en o comprende 1-6 análogos de nucleótidos, y B consiste en o comprende entre 4 y 12 nucleobases de ADN consecutivas, y C consiste en o comprende 1-6 análogos de nucleótidos; en el que los análogos de nucleótidos de A y C aumentan la Tm de la doble cadena de oligonucleótido/diana.

Description

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En una realización preferida, el compuesto puede dirigirse a un ácido nucleico diana que es un transcrito o transcritos de ARN del gen o los genes que codifican las proteínas diana, tales como ARNm o pre ARNm.
El compuesto de la invención es un oligonucleótido antisentido.
Convenientemente, cuando el oligonucleótido antisentido se introduce en la célula que expresa el gen de PCSK9, da como resultado la reducción del nivel de ARNm de PCSK9, dando como resultado la reducción del nivel de expresión de la PCSK9 en la célula.
Los oligómeros que se dirigen al ARNm de PCSK9 pueden hibridar con cualquier sitio a lo largo del ácido nucleico de ARNm diana, tal como el líder 5’ no traducido, exones, intrones y cola 3’ no traducida. Sin embargo, se prefiere que los oligómeros que se dirigen al ARNm de PCSK9 hibriden con la forma de ARNm madura del ácido nucleico diana.
Cuando se diseñan como un inhibidor antisentido, por ejemplo, los oligonucleótidos de la invención se unen con el ácido nucleico diana y modulan la expresión de su proteína afín. Preferentemente, dicha modulación produce una inhibición de la expresión de al menos 10 % o 20 % en comparación con el nivel de expresión normal, más preferentemente al menos una inhibición de 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % en comparación con el nivel de expresión normal. Convenientemente, dicha modulación se ve cuando se usan concentraciones entre 5 y 25 nM del compuesto de la invención. En la misma realización o una diferente, la inhibición de la expresión es menor del 100 %, tal como menor del 98 % de inhibición, menor del 95 % de inhibición, menor del 90 % de inhibición, menor del 80 % de inhibición, tal como menor del 70 % de inhibición. La modulación del nivel de expresión se determina midiendo los niveles de proteínas, por ejemplo, mediante los métodos tales como SDS-PAGE seguido de trasferencia de western usando anticuerpos adecuados inducidos contra la proteína diana. Como alternativa, la modulación de los niveles de expresión puede determinarse midiendo los niveles de ARNm, por ejemplo mediante transferencia de northern o RT-PCR cuantitativa. Cuando se mide mediante los niveles de ARNm, el nivel de regulación negativa cuando se usa una dosificación apropiada, tal como concentraciones entre 5 y 25 nM, es, en una realización, típicamente hasta un nivel de entre 10 y 20 % de los niveles normales en ausencia del compuesto de la invención.
El compuesto de acuerdo con la invención es un oligonucleótido antisentido.
El compuesto no es un ARNip.
En una realización, el compuesto de la invención no comprende ARN (unidades).
La longitud de un oligómero (o secuencia de nucleobases contiguas) se determinará por la que dé como resultado inhibición de la diana. Para una coincidencia perfecta con la diana, la secuencia de nucleótidos contiguos u oligómero tan pocas como 8 bases pueden ser suficientes, pero generalmente serán más, por ejemplo 10 o 12, y preferentemente entre 12 y 16. El tamaño máximo del oligómero se determinará por factores tales como el coste y la conveniencia de producción, la capacidad de manipular el oligómero e introducirlo en una célula que porte el ARNm diana, y también la afinidad de unión deseada y la especificidad diana. Si es demasiado largo, puede tolerar de forma indeseable un número mayor de desapareamientos, lo que puede conducir a unión inespecífica.
El compuesto (oligómero o compuesto oligomérico) de la invención consiste en o comprende entre 10 y 25 nucleobases, tales como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 nucleobases.
Son compuestos particularmente preferidos oligonucleótidos antisentido que comprenden de aproximadamente 12 a 25 nucleobases y en una realización son compuestos antisentido que comprenden 13-18 nucleobases tales como 13, 14, 15, 16 o 17 nucleobases. En una realización, el oligómero de acuerdo con la invención consiste en no más de 22 nucleobases. En una realización se prefiere que el compuesto de la invención comprenda menos de 20 nucleobases.
En una realización, el oligómero de acuerdo con la invención consiste en no más de 22 nucleobases, tal como no más de 20 nucleobases, tal como no más de 18 nucleobases, tal como 15, 16 o 17 nucleobases, opcionalmente conjugadas con una o más entidades no de nucleobases, tal como un conjugado.
En una realización, el oligómero o secuencia de nucleobases contiguas tiene una longitud de entre 10 y 22 nucleobases.
En una realización, el oligómero o secuencia de nucleobases contiguas tiene una longitud de entre 10 y 18 nucleobases.
En una realización, el oligómero o secuencia de nucleobases contiguas tiene una longitud de entre 10 y 16 nucleobases.
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NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 118, SEQ ID NO 136 y SEQ ID NO 139.
Los compuestos preferidos consisten en 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleobases continuas (tales como contiguas) que corresponden a una secuencia de nucleótidos presente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 y SEQ ID NO 8, o preferentemente SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4.
Se muestran compuestos preferidos adicionales en las Tablas 2 y 3 del documento US 60/828.735 y la Tabla 4 del documento US 60/972.932, que se incorporan específicamente por la presente en la presente memoria descriptiva (como se indica en la lista específica de realizaciones enumerada en el presente documento).
Convenientemente, el oligómero de acuerdo con la invención consiste en o comprende una de las secuencias SEQ ID anteriormente mencionadas.
Complementariedad y desapareamientos
El compuesto de la invención consiste en una secuencia de nucleobases (contiguas) que es complementaria de una región correspondiente (contigua) de la SEQ ID NO 2.
En referencia a los principios por los que el compuesto puede inducir su acción terapéutica, la diana de la presente invención puede ser el ARNm derivado de la secuencia correspondiente presente en el ácido nucleico que codifica el polipéptido de PCSK9, tal como SEQ ID NO 2 o variantes alélicas de origen natural del mismo.
Se reconocerá que cuando se hace referencia a un motivo de secuencias de nucleótidos preferido o secuencia de nucleótidos, que consiste solamente en nucleótidos, los compuestos de la invención que se definen por esa secuencia pueden comprender un análogo de nucleótido correspondiente en lugar de uno o más de los nucleótidos presentes en dicha secuencia, tales como unidades de LNA u otros análogos de nucleótidos que elevan la Tm de la doble cadena de oligonucleótido/diana, tal como los análogos de nucleótidos descritos posteriormente, particularmente LNA y/o nucleótidos 2’ sustituidos (2’ modificados).
Análogos de nucleótidos
En una realización, al menos una de las nucleobases presentes en el oligómero es una nucleobase modificada seleccionada del grupo que consiste en 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina.
Se reconocerá que cuando se hace referencia a un motivo de secuencia de nucleótidos o secuencia de nucleótidos preferido, que consiste solamente en nucleótidos, los oligómeros de la invención que se definen por esa secuencia pueden comprender un análogo de nucleótido correspondiente en lugar de uno o más de los nucleótidos presentes en dicha secuencia, tales como unidades de LNA u otros análogos de nucleótidos, que aumentan la estabilidad de doble cadena/Tm de la doble cadena de oligómero/diana (es decir análogos de nucleótidos potenciadores de la afinidad).
Además, los análogos de nucleótidos pueden potenciar la estabilidad del oligómero in vivo.
La incorporación de análogos de nucleótidos potenciadores de la afinidad en la secuencia de nucleobases del oligómero, tales como LNA o azúcares 2’-sustituidos, preferentemente LNA, puede permitir que se reduzca el tamaño del oligonucleótido de unión específica, y también puede reducir el límite superior del tamaño del oligonucleótido antes de que tenga lugar unión no específica o aberrante. Un análogo de nucleótidos potenciador de la afinidad es uno que, cuando se inserta en la secuencia de nucleobases del oligómero da como resultado una Tm aumentada del oligómero cuando se forma en una doble cadena con un ARN complementario (tal como la diana de ARNm), en comparación con un oligómero equivalente que comprende un nucleótido de ADN en lugar del análogo de nucleótido potenciador de la afinidad. Se proporcionan ejemplos de análogos de nucleótidos adecuados y preferidos por el documento WO2007/031091 o se hace referencia a ellos en el mismo.
En algunas realizaciones al menos uno de dichos análogos de nucleótidos es 2’-MOE-ARN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 unidades de nucleobases de 2’-MOE-ARN.
En algunas realizaciones al menos uno de dichos análogos de nucleótidos es 2’-fluoro-ADN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 unidades de nucleobases 2’-fluoro-ADN.
Se describen ejemplos específicos de análogos de nucleósidos que pueden utilizarse en los oligómeros de la presente invención por ejemplo en Freier y Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 y Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, y en el Esquema 1 y 2.
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Preferentemente, el LNA usado en el oligómero de la invención comprende al menos una unidad de LNA de acuerdo con cualquiera de las fórmulas
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5 en las que Y es -O-, -S-, -NH-, o N(RH); Z y Z* se seleccionan independientemente de entre un enlace internucleosídico, un grupo terminal o un grupo protector; B constituye un resto de base nucleotídica natural o no natural; y RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4.
Preferentemente, el ácido nucleico bloqueado (LNA) usado en el compuesto oligomérico, tal como un oligonucleótido
10 antisentido, de la invención comprende al menos un nucleótido que comprende una unidad de ácido nucleico bloqueado (LNA) de acuerdo con cualquiera de las fórmulas mostradas en el Esquema 2 del documento WO2007/031091.
Preferentemente, el LNA usado en el oligómero de la invención comprende enlaces internucleosídicos
15 seleccionados de -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, donde RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4.
Se muestran unidades de LNA específicamente preferidas en el Esquema 2: imagen10
20 β-D-oxi-LNA α-L-oxi-LNA
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β-D-tio-LNA β-D-ENA
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β-D-amino-LNA Esquema 2
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La expresión "tio-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en el que al menos una de X o Y en la fórmula general anterior se selecciona de S o -CH2-S-. Tio-LNA puede estar en configuración tanto beta-D como alfa-L.
La expresión "amino-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en el que al menos uno de X o Y en la fórmula general anterior se selecciona de -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, y -CH2-N(R)-donde R se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4. Amino-LNA puede estar en configuración tanto beta-D como alfa-L.
La expresión "oxi-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en el que al menos uno de X o Y en la fórmula general anterior representa -O-o -CH2-O-. Oxi-LNA puede estar en configuración tanto beta-D como alfa-L.
La expresión "ena-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en el que Y en la fórmula general anterior es -CH2-O(donde el átomo de oxígeno de -CH2-O-se une a la posición 2’ relativa a la base B).
En una realización preferida LNA se selecciona de beta-D-oxi-LNA, alfa-L-oxi-LNA, beta-D-amino-LNA y beta-D-tio-LNA, en particular beta-D-oxi-LNA.
Preferentemente, dentro del compuesto de acuerdo con la invención, tal como un oligonucleótido antisentido, que comprende LNA, todos los restos C de LNA son 5’metil-citosina.
Preferentemente las unidades de LNA del compuesto, tales como un oligonucleótido antisentido, de la invención se seleccionan de uno o más de los siguientes: tio-LNA, amino-LNA, oxi-LNA, ena-LNA y/o alfa-LNA en las configuraciones D-beta o L-alfa o combinaciones de las mismas. Beta-D-oxi-LNA es un LNA preferido para su uso en los compuestos oligoméricos de la invención. Tio-LNA también puede preferirse para su uso en los compuestos oligoméricos de la invención. Amino-LNA también puede preferirse para su uso en los compuestos oligoméricos de la invención. Oxi-LNA también puede preferirse para su uso en los compuestos oligoméricos de la invención. Ena-LNA también puede preferirse para su uso en los compuestos oligoméricos de la invención. Alfa-LNA también puede preferirse para su uso en los compuestos oligoméricos de la invención.
El ácido nucleico bloqueado (LNA) usado en el compuesto, tal como un oligonucleótido antisentido, de la invención tiene la estructura de la fórmula general mostrada en el Esquema 1 del documento WO2007/031091. Las expresiones "tio-LNA", "amino-LNA", "oxi-LNA", "ena-LNA", "alfa-L-LNA", "derivados de LNA ", "nucleótido bloqueado " y "nucleobase bloqueada" también se usan como se define en el documento WO2007/031091.
Convenientemente, cuando la secuencia de nucleobases del oligómero, o la secuencia de nucleobases contiguas, no es completamente complementaria de la región correspondiente de la secuencia diana de PCSK9, en una realización, cuando el oligómero comprende análogos de nucleótidos potenciadores de afinidad, dichos análogos de nucleótidos forman un complemento con su nucleótido correspondiente en la diana de PCSK9.
El oligómero puede por tanto comprender o consistir en una secuencia sencilla de los nucleótidos naturales, preferentemente 2’-desoxinucleótidos (denominados en general en el presente documento "ADN"), pero también posiblemente ribonucleótidos (denominados en el presente documento en general "ARN"), o podría comprender uno
o más (y posiblemente consistir completamente en) “análogos” de nucleótidos.
Los “análogos” de nucleótidos son variantes de nucleótidos de ADN o ARN naturales en virtud de modificaciones en el azúcar y/o base y/o partes de fosfato. El término “nucleobase” se usará para abarcar nucleótidos naturales (tipo ADN o ARN) así como "análogos" de los mismos. Los análogos podrían en principio ser únicamente “silenciosos” o "equivalentes" a los nucleótidos naturales en el contexto del oligonucleótido, es decir no tener efecto funcional en la manera en que el oligonucleótido actúa con respecto a la expresión de PCSK9. Dichos análogos "equivalentes" pueden no obstante ser útiles si, por ejemplo, son más fáciles o más baratos de fabricar, o son más estables frente a condiciones de almacenamiento o fabricación, o presentan un marcador o una etiqueta. Preferentemente, sin embargo, los análogos tendrán un efecto funcional en la manera en que el oligonucleótido actúa para inhibir la expresión; por ejemplo produciendo afinidad de unión aumentada por la diana y/o resistencia aumentada para nucleasas intracelulares y/o facilidad aumentada de transporte a la célula.
Los ejemplos de dicha modificación del nucleótido incluyen modificación del resto de azúcar para proporcionar un grupo 2’-sustituyente o para producir una estructura enlazada (ácido nucleico bloqueado) que potencia la afinidad de unión y probablemente también proporcione alguna resistencia a nucleasa aumentada; modificación del enlace internucleotídico de su fosfodiéster normal a uno que es más resistente a ataque de nucleasa, tal como fosforotioato
o boranofosfato, siendo estos dos escindibles por RNasa H, también permiten esa vía de inhibición antisentido en la modulación de la expresión de PCSK9.
En algunas realizaciones, el oligómero comprende de 3 a 8 análogos de nucleótidos, por ejemplo 6 o 7 análogos de nucleótidos. En las realizaciones con mucho más preferidas, al menos uno de dichos análogos de nucleótidos es un ácido nucleico bloqueado (LNA); por ejemplo al menos 3 o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o al menos 7, u 8, de los análogos de nucleótidos pueden ser LNA. En algunas realizaciones todos los análogos de nucleótidos pueden ser LNA.
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En algunas realizaciones los análogos de nucleótidos presentes dentro del oligómero de la invención en las regiones A y C mencionadas en el presente documento se seleccionan independientemente de, por ejemplo: unidades de 2’-O-alquil-ARN, unidades de 2’-amino-ADN, unidades de 2’-fluoro-ADN, unidades de LNA, unidades de ácido arabino nucleico (ANA), unidades de 2’-fluoro-ANA, unidades de HNA, unidades de INA (ácido nucleico intercalante) y unidades de 2’MOE. También se considera que los análogos de nucleótidos presentes en un oligómero de la invención son todos iguales, aunque permitiendo una variación de bases.
Son análogos de nucleótidos preferidos 2’-O-metoxietil-ARN (2’MOE), monómeros de 2’-fluoro-ADN y LNA y como tal el oligonucleótido de la invención puede comprender análogos de nucleótidos que se seleccionan independientemente de estos tres tipos de análogos, o puede comprender solamente un tipo de análogo seleccionado de los tres tipos.
Los compuestos de acuerdo con la invención son, en una realización, los que consisten en o comprenden una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 y SEQ ID NO 8,
o preferentemente SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4, en los que, en una realización los nucleótidos presentes en el compuesto pueden sustituirse con un análogo de nucleótido correspondiente,
Son compuestos preferidos de acuerdo con la invención los que consisten en o comprenden SEQ ID NO 3 o 4, en los que contienen al menos un análogo de ácido nucleico, en el que en una realización, las unidades de LNA pueden sustituirse con un análogo de nucleótido correspondiente alternativo.
Se prefieren análogos de nucleótidos que aumenten la Tm del oligonucleótido/ácido nucleico diana, en comparación con el nucleótido equivalente.
Preferentemente, el compuesto de acuerdo con la invención comprende al menos un análogo de nucleótido, tal como unidad de ácido nucleico bloqueado (LNA), tal como 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 análogos de nucleótidos, tales como unidades de ácido nucleico bloqueado (LNA), preferentemente entre 4 y 9 análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA, tales como 6-9 análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA, más preferentemente 6, 7 u 8 análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA.
El término LNA se usa como se define en la solicitud de PCT WO2007/031091.
Preferentemente las unidades de LNA comprenden al menos una unidad o unidades beta-D-oxi-LNA tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de beta-D-oxi-LNA. El compuesto de la invención, tal como el oligonucleótido antisentido, puede comprender más de un tipo de unidad de LNA. Convenientemente, el compuesto puede comprender tanto beta-D-oxi-LNA como una o más de las siguientes unidades de LNA: tio-LNA, amino-LNA, oxi-LNA, ena-LNA y/o alfa-LNA en las configuraciones D-beta o L-alfa o combinaciones de las mismas.
Preferentemente, el compuesto, tal como un oligonucleótido antisentido, puede comprender ambos análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA y unidades de ADN. Preferentemente el total combinado de nucleobases, tales como, unidades de LNA y ADN, es entre 10 y 20, tal como 14-20, tal como entre 15 y 18, tal como 15, 16 o 17 unidades de nucleobases, o es un shortmer como se indica en el presente documento. Preferentemente la relación de análogos de nucleótidos con respecto a ADN presente en el compuesto oligomérico de la invención es de entre 0,3 y 1, más preferentemente entre 0,4 y 0,9, tal como entre 0,5 y 0,8.
Preferentemente, el compuesto de la invención, tal como un oligonucleótido antisentido, consiste en un total de 10 25, o 12-25 nucleótidos y/o análogos de nucleótidos, en los que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8 nucleótidos o análogos de nucleótidos, localizándose dicha subsecuencia dentro de (es decir correspondiente a) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 18 y SEQ ID No 19.
En un aspecto de la invención, los nucleótidos (y/o análogos de nucleótidos) se unen entre sí por medio de un grupo de fosforotioato. Una realización interesante de la invención se dirige a compuestos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 y SEQ ID NO 8, en el que cada grupo de enlace dentro de cada compuesto es un grupo de fosforotioato. Dichas modificaciones se indican por el subíndice S.
Las tablas indicadas en el presente documento proporcionan secuencias de nucleobases adicionales de compuestos de la invención.
En realizaciones adicionales, el compuesto de la invención, tal como el oligonucleótido antisentido de la invención puede comprender o consistir en 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleobases.
Preferentemente el compuesto de acuerdo con la invención, tal como un oligonucleótido antisentido, comprende o consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA, en particular 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA, tales como entre 1 y 10
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análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA tales como entre 2 y 8 análogos de nucleótidos tales como unidades de LNA.
Reclutamiento de RNAsaH
Es preferible que dicha subsecuencia o secuencia de nucleobases combinadas comprenda una secuencia continua (contigua) de al menos 7 restos de nucleobases, tales como al menos 8 o al menos 9 restos de nucleobases, incluyendo 7, 8 o 9 nucleobases, que, cuando se forman en una doble cadena con el ARN diana complementario correspondiente a cada uno de dichos polinucleótidos que codifican dicha PCSK9 de mamífero sean capaces de reclutar RNasaH, tales como nucleótidos de ADN.
El tamaño de la secuencia contigua que es capaz de reclutar RNAsaH puede ser mayor, tal como 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 unidades de nucleobases.
La secuencia contigua que es capaz de reclutar RNAsaH puede ser región B como se indica en el contexto de un gapmer como se describe en el presente documento.
El documento EP 1 222 309 proporciona métodos in vitro para determinar actividad RNasaH, que puede usarse para determinar la capacidad de reclutar RNasaH. Un compuesto se considera capaz de reclutar RNasaH si, cuando se proporciona con la diana de ARN complementaria, tiene una velocidad inicial, como se mide en pmol/l/min, de al menos 1 %, tal como al menos 5 %, tal como al menos 10 % o menos del 20 % del oligonucleótido solamente de ADN equivalente, sin sustituciones 2’, con grupos de enlace de fosforotioato entre todos los nucleótidos en el oligonucleótido, usando la metodología proporcionada por el Ejemplo 91 -95 del documento EP 1 222 309.
Un compuesto se considera esencialmente incapaz de reclutar RNasaH si, cuando se proporciona con la diana de ARN complementaria, y RNasaH, la velocidad inicial de RNasaH, como se mide en pmol/l/min, es menor del 1 %, tal como menor del 5 %, tal como menor del 10 % o menor del 20 % de la velocidad inicial determinada usando el oligonucleótido de solamente ADN equivalente, sin sustituciones 2’, con grupos de enlace de fosforotioato entre todos los nucleótidos en el oligonucleótido, usando la metodología proporcionada por el Ejemplo 91 -95 del documento EP 1 222 309.
Sin embargo, también se reconoce que los oligonucleótidos antisentido pueden actuar mediante degradación no mediada por RNasaH de ARNm mediada, tal como mediante impedimento estérico de la traducción, u otros métodos.
El compuesto de la invención puede comprender una secuencia de nucleobases que comprende tanto nucleótidos como análogos de nucleótidos, y puede estar en forma de un gapmer, un headmer o un mixmer.
Un headmer se define por un tramo contiguo de análogos de nucleótidos en el extremo 5’ seguido de un tramo contiguo de ADN o unidades de nucleobases modificadas reconocibles y escindibles por la RNasaH hacia el extremo 3’ (tal como al menos 7 de dichas nucleobases), y un tailmer se define por un tramo contiguo de ADN o monómeros modificados reconocibles y escindibles por la RNasaH en el extremo 5’ (tal como al menos 7 de dichas nucleobases), seguido de un tramo contiguo de análogos de nucleótidos hacia el extremo 3’. Otras quimeras de acuerdo con la invención, denominadas mixmers que consisten en una composición alternativa de ADN o monómeros modificados reconocibles y escindibles por RNasaH y análogos de nucleótidos. Algunos análogos de nucleótidos también pueden ser capaces de mediar en la unión y escisión de RNasaH. Ya que α-L-LNA recluta actividad RNasaH en un cierto grado, podría requerirse huecos más pequeños de ADN o monómeros modificados reconocibles y escindibles por la RNasaH para la construcción de gapmer, y podría introducirse más flexibilidad en la construcción de mixmer.
Gapmers
Preferentemente, el compuesto de la invención es un oligonucleótido antisentido que es un gapmer.
Preferentemente el gapmer comprende una secuencia de (poli)nucleobases de fórmula (5’ a 3’), A-B-C (y opcionalmente D), en la que A (región 5’) consiste en o comprende al menos un análogo de nucleótido, tal como al menos una unidad de LNA, tal como entre 1 y 6 análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA, preferentemente entre 2 y 5 análogos de nucleótidos, tales como 2-5 unidades de LNA, tales como 3 o 4 análogos de nucleótidos, tales como 3 o 4 unidades de LNA y B (dominio central), preferentemente inmediatamente 3’ (es decir contiguo) de A, consiste en o comprende al menos una unidad de azúcar de ADN, tal como 1-12 unidades de ADN, preferentemente entre 4 y 12 unidades de ADN, más preferentemente entre 6 y 10 unidades de ADN, tal como entre 7 y 10 unidades de ADN, más preferentemente 8, 9 o 10 unidades de ADN; y C (región 3’) preferentemente inmediatamente 3’ de B, consiste en o comprende en al menos un análogo de nucleótido, tal como al menos una unidad de LNA, tal como entre 1 y 6 análogos de nucleótidos, tal como entre 2 y 5 análogos de nucleótidos, tal como entre 2 y 5 unidades de LNA, más preferentemente 3 o 4 análogos de nucleótidos, tales como 3 o 4 unidades de LNA. Se desvelan diseños de gapmer preferidos en el documento WO2004/046160.
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enlaces internucleosídicos dentro de regiones A y C de degradación por endonucleasa, tal como cuando las regiones A y C comprenden nucleobases de LNA.
Los enlaces internucleobases en el oligómero pueden ser fosfodiéster, fosforotioato o boranofosfato para permitir la escisión por RNAsa H de ARN diana. Se prefiere fosforotioato, para resistencia a nucleasa mejorada y otras razones, tales como facilidad de fabricación.
En un aspecto del oligómero de la invención, las nucleobases (nucleótidos y/o análogos de nucleótidos) se unen entre sí por medio de grupos de fosforotioato.
En algunas realizaciones la región A comprende al menos un enlace de fosfodiéster entre dos unidades de análogos de nucleótidos, o una unidad de análogo de nucleótido y una unidad de nucleobase de la región B. En algunas realizaciones la región C comprende al menos un enlace de fosfodiéster entre dos unidades de análogos de nucleótidos, o una unidad de análogo de nucleótido y una unidad de nucleobase de la región B.
En algunas realizaciones, la región C comprende al menos un enlace de fosfodiéster entre una unidad de análogo de nucleótido y una unidad de nucleobase de la región D.
En algunas realizaciones el enlace internucleobase entre el análogo de nucleótidos 3’ de la región A y la nucleobase 5’ de la región B es un fosfodiéster.
En algunas realizaciones el enlace internucleobase entre la nucleobase 3’ de la región B y el análogo de nucleótido 5’ de la región C es un fosfodiéster.
En algunas realizaciones el enlace internucleobase entre los dos análogos de nucleótidos adyacentes en el extremo 5’ de la región A es fosfodiéster.
En algunas realizaciones el enlace internucleobase entre los dos análogos de nucleótidos adyacentes en el extremo 3’ de la región C es fosfodiéster.
En algunas realizaciones el enlace internucleobase entre los dos análogos de nucleótidos adyacentes en el extremo 3’ de la región A es fosfodiéster.
En algunas realizaciones el enlace internucleobase entre los dos análogos de nucleótidos adyacentes en el extremo 5’ de la región C es fosfodiéster.
En algunas realizaciones la región A tiene una longitud de 4 análogos de nucleótidos y el enlace internucleobase entre los dos análogos de nucleótidos medios de la región A es fosfodiéster.
En algunas realizaciones la región C tiene una longitud de 4 análogos de nucleótidos y el enlace internucleobase entre los dos análogos de nucleótidos medios de la región C es fosfodiéster.
En algunas realizaciones todos los enlaces internucleobase entre análogos de nucleótidos presentes en el compuesto de la invención son fosfodiéster.
En algunas realizaciones, tales como las realizaciones indicadas anteriormente, cuando sea adecuado y no se indique específicamente, todos los enlaces internucleobases restantes son fosfodiéster o fosforotioato, o una mezcla de los mismos.
En algunas realizaciones todos los grupos de enlace internucleobase son fosforotioato.
Cuando se hace referencia a secuencias oligonucleotídicas de gapmer específicas, tales como las proporcionadas en el presente documento se entenderá que, en una realización, cuando los enlaces son enlaces fosforotioato, pueden usarse enlaces alternativos, tales como los desvelados en el presente documento, por ejemplo pueden usarse enlaces fosfato (fosfodiéster), particularmente para enlaces entre unidades de análogos de nucleótidos, tales como LNA. De forma similar, cuando se hace referencia a secuencias polinucleotídicas de gapmer específicas, tales como las proporcionadas en el presente documento, cuando se anotan los restos C como citosina 5’metil modificada, en una realización, una o más de las C presentes en el oligonucleótido pueden ser restos de C no modificados.
Método de identificación y preparación de compuestos de la invención:
Los compuestos de la invención, que modulan la expresión de la diana, pueden identificarse mediante experimentación o mediante diseño racional basándose en la información de secuencia en la diana y conocimientos técnicos sobre cómo diseñar mejor un compuesto oligomérico contra una diana deseada. Las secuencias de estos compuestos son realizaciones preferidas de la invención. De forma similar, los motivos de secuencia en la diana
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para los que esos compuestos oligoméricos preferidos son complementarios (denominados "puntos calientes") son sitios preferidos para dirección.
En muchos casos la identificación de un compuesto oligomérico, tal como un oligonucleótido LNA, eficaz en la modulación de la expresión o actividad de PCSK9 in vivo o clínicamente se basa en información de secuencia en el gen diana (tal como SEQ ID NO 2). Sin embargo, un experto habitual en la materia apreciará que dichos compuestos oligoméricos también pueden identificarse mediante ensayos empíricos. También están dentro del alcance de la invención compuestos oligoméricos que tienen, por ejemplo, menos homología de secuencia, más o menos nucleótidos modificados, o longitudes mayores o menores, en comparación con los de las realizaciones preferidas, pero que no obstante demuestran respuestas en tratamientos químicos. Los ejemplos proporcionan métodos adecuados para realizar ensayos empíricos.
En una realización preferida, el compuesto de la invención comprende una subsecuencia o una secuencia de nucleobases contiguas que tiene al menos 10, tal como al menos 11, tal como al menos 12, tal como al menos 14, tal como al menos 16, tal como al menos 18, tal como 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 nucleobases contiguas que son 100 % complementarias con ácidos nucleicos tanto humanos como de ratón, o tanto humanos como de rata, o tanto humanos como de mono, o humanos, de ratón y de mono o humanos, de rata y de mono que codifican PCSK9. En una realización la secuencia de polinucleobases del compuesto es 100 % complementaria con ácidos nucleicos tanto humanos como de ratón, tanto humanos como de rata, o tanto humanos como de mono, o humanos, de ratón y de mono o humanos, de rata y de mono que codifican PCSK9. En una realización, cuando se hace referencia a compuestos de la invención que son 100 % complementarios con más de una especie de mamífero como se ha enumerado anteriormente, pueden existir uno o dos desapareamientos entre 1 o más de las secuencias, aunque se prefiere que no haya desapareamientos. La Figura 17 ilustra un alineamiento entre los ácidos nucleicos humanos y de ratón que codifican los polipéptidos de PCSK9 humanos y de ratón respectivos. La Tabla 1 proporciona polinucleótidos de PCSK9 adecuados y los polipéptidos correspondientes proporcionados por los números de referencia de Genbank del NCBI, ciertas variantes alélicas conocidas y homólogos conocidos de otras especies de mamífero pueden identificarse fácilmente realizando búsquedas de BLAST usando las secuencias a las que se hace referencia en la Tabla 1.
Tabla 1
Ácido nucleico (secuencia de ARNm/ADNc)Polipéptido(deducido)
Ser humano
NM_174936 NP_777596
Ratón
NM_153565 NP_705793.1
Rata
NM_199253 NP_954862.2
Chimpancé
NC_006468 (genómico -ARNm anotado) XP_001154126
Mono (macaco rhesus)
BV166576
La homología de aminoácidos y polinucleótidos puede determinarse usando algoritmo ClustalW usando ajustes convencionales: véase http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html, método: EMBOSS:agua (local): hueco abierto = 10,0, extensión de hueco = 0,5, usando Blosum 62 (proteína), o DNAfull para secuencias de nucleótidos. Como se ilustra en la Figura 17, dichos alineamientos también pueden usarse para identificar regiones de los ácidos nucleicos que codifican PCSK9 de ser humano y una especie de mamífero diferente, tal como mono, ratón y/o rata, en los que hay suficientes tramos de complementariedad de ácido nucleico para permitir el diseño de oligonucleótidos que se dirigen tanto a ácido nucleico diana de PCSK9 humano como a los ácidos nucleicos correspondientes presentes en las diferentes especies de mamífero, tales como regiones de al menos 10, tal como al menos 12, tal como al menos 14, tal como al menos 16, tal como al menos 18, tal como 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 nucleobases contiguas que son 100 % complementarias tanto con el ácido nucleico que codifica PCSK9 de seres humanos como con el ácido nucleico o los ácidos nucleicos que codifican PCSK9 de las diferentes especies de mamífero.
Definiciones
Cuando se determina la “homología” entre los compuestos oligoméricos de la invención (o subsecuencia o secuencia de nucleobases contiguas combinada) y el ácido nucleico que codifica la PCSK9 de mamífero, tal como los desvelados en el presente documento (incluyendo SEQ ID No 2), la determinación de homología puede realizarse por un alineamiento sencillo con la secuencia de nucleobases correspondiente del compuesto de la invención y la región correspondiente del ácido nucleico que codifica la PCSK9 de mamífero (o ácido nucleico diana), y la homología se determina contando el número de bases que se alinean y dividiendo por el número total de bases contiguas en el compuesto de la invención, y multiplicando por 100. En dicha comparación, si existen huecos, es preferible que dichos huecos sean únicamente desapareamientos en lugar de áreas en las que el número de nucleobases dentro del hueco difieren entre la secuencia de nucleobases de la invención y el ácido nucleico diana.
Las expresiones “localizado dentro de” y “correspondiente a” / “corresponde a” se refieren a la comparación entre la secuencia de nucleobases del oligómero o secuencia de nucleobases contiguas y la secuencia de nucleótidos equivalente de la diana de ácido nucleico tal como el ARNm que codifica la proteína diana de PCSK9, tal como SEQ ID NO 2, o el complemento inverso de la diana de ácido nucleico. Los análogos de nucleótidos se comparan
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directamente con sus nucleótidos equivalentes o correspondientes.
Se pretende que las expresiones "análogo de nucleótido correspondiente" y "nucleótido correspondiente" indiquen que la nucleobase en el análogo de nucleótido y el nucleótido son idénticos. Por ejemplo, cuando la unidad de 2desoxirribosa del nucleótido se une con una adenina, el “análogo de nucleótido correspondiente” contiene una unidad de pentosa (diferente de 2-desoxirribosa) unida a una adenina.
El término "continuo" en relación con una secuencia de nucleobases, es intercambiable con el término “continuo”.
El término "nucleobase" se usa como un término colectivo que abarca tanto nucleótidos como análogos de nucleótidos. Una secuencia de nucleobases es una secuencia que comprende al menos dos nucleótidos o análogos de nucleótidos. En una realización la secuencia de nucleobases puede comprender solamente nucleótidos, tales como unidades de ADN, en una realización alternativa, la secuencia de nucleobases puede comprender solamente análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA.
La expresión "ácido nucleico" se define como una molécula formada por enlace covalente de dos o más nucleótidos.
Las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en el presente documento.
Las siguientes expresiones se usan como se definen en el documento WO2007/031091: "nucleótido", "análogo de nucleótido", "localizado dentro de ", "correspondiente a"/ "corresponde a", "análogo de nucleótido correspondiente" y "nucleótido correspondiente", "nucleobase", "ácido nucleico" y "polinucleótido", "compuesto" cuando se usa en el contexto de un "compuesto de la invención", "compuesto oligomérico", "oligonucleótido", "oligonucleótido antisentido", y "oligo", "unidad", "LNA", "al menos uno", "grupo de enlace", "conjugado", "sales farmacéuticamente aceptables", "alquilo C1-4", "gen", "antagonista de ARN", "ARNm", "complementario", "desapareamiento o desapareamientos".
La expresión "ácido nucleico diana", como se usa en el presente documento se refiere al ADN que codifica polipéptido de PCSK9 humano, y ácidos nucleicos de ARN derivados del mismo, preferentemente ARNm, tal como pre-ARNm, aunque preferentemente ARNm maduro. En una realización, por ejemplo cuando se usa en investigación
o diagnóstico el "ácido nucleico diana" puede ser un ADNc o un oligonucleótido sintético derivado de las dianas de ácido nucleico de ADN o ARN anteriores. El compuesto oligomérico de acuerdo con la invención es preferentemente capaz de hibridar con el ácido nucleico diana.
La expresión "variante de origen natural del mismo" se refiere a variantes del polipéptido de PCSK9 de secuencia de ácido nucleico que existen en la naturaleza dentro del grupo taxonómico definido, tal como mamífero, tal como ratón, rata, mono, chimpancé y preferentemente ser humano. Típicamente cuando se hace referencia a “variantes de origen natural” de un polinucleótido la expresión también puede abarcar variantes del ADN genómico que codifica PCSK9 que se encuentra en el locus NARC1, o un locus directamente derivado del locus NARC-1, por ejemplo mediante translocación o duplicación cromosómica, y el ARN, tal como ARNm derivado del mismo. Cuando se hace referencia a una secuencia polipeptídica específica, por ejemplo SEQ ID NO 1, la expresión también incluye formas de origen natural de la proteína que pueden por lo tanto procesarse, por ejemplo mediante modificaciones co o postraduccionales, tales como escisión de péptido señal, escisión proteolítica, glucosilación, etc.
Se prefiere que el compuesto de acuerdo con la invención sea una molécula lineal o se sintetice como una molécula lineal.
Se pretende que la expresión “grupo de enlace” signifique un grupo capaz de acoplar covalentemente entre sí dos nucleótidos, dos análogos de nucleótidos, y un nucleótido y un análogo de nucleótido, etc. Los ejemplos específicos y preferidos incluyen grupos fosfato y grupos fosforotioato.
En el presente contexto se pretende que el término "conjugado" indique una molécula heterogénea formada por la unión covalente de un compuesto como se describe en el presente documento (es decir un compuesto que comprende una secuencia de análogos de nucleótidos) con uno o más restos no nucleotídicos/ no análogos de nucleótidos o no polinucleotídicos. Los ejemplos de restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos incluyen agentes macromoleculares tales como proteínas, cadenas de ácidos grasos, restos de azúcares, glucoproteínas, polímeros o combinaciones de los mismos. Típicamente las proteínas pueden ser anticuerpos para una proteína diana. Los polímeros típicos pueden ser polietilenglicol. Cuando el compuesto de la invención consiste en una secuencia de nucleobases puede, en una realización adicional comprender una parte no nucleobase, tal como los conjugados anteriores.
La expresión "al menos uno" comprende los números enteros mayores que o iguales a 1, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 y así sucesivamente.
En una realización, tal como cuando se hace referencia a las dianas de ácido nucleico o proteínas de los compuestos de la invención, la expresión "al menos uno" incluye las expresiones "al menos dos" y "al menos tres" y
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"al menos cuatro", de forma similar la expresión "al menos dos" puede comprender las expresiones "al menos tres" y "al menos cuatro".
Como se usa en el presente documento, la expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales que conservan la actividad biológica deseada de los compuestos identificados en el presente documento y muestran efectos toxicológicos no deseados mínimos. Pueden formarse ejemplos no limitantes de dichas sales con aminoácidos orgánicos y sales de adición de bases formadas con cationes metálicos tales como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio y similares, o con un catión formado de amoniaco, N,N-dibenciletilen-diamina, D-glucosamina, tetraetilamonio o etilendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b); por ejemplo, una sal de tanato de cinc o similares.
En el presente contexto, se pretende que la expresión "alquilo C1-4 " signifique una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada saturada en la que la cadena tiene de uno a cuatro átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo y terc-butilo.
Como se usa en el presente documento, el término "gen" significa el gen que incluye exones, intrones, regiones 5’ y 3’ no codificantes y elementos reguladores y todas las variantes conocidas en la actualidad de los mismos y cualquier variante adicional, que pueda dilucidarse.
Como se usa en el presente documento, la expresión “antagonista de ARN” se refiere a un oligonucleótido que se dirige a cualquier forma de ARN (incluyendo pre-ARNm, ARNm, miARN, ARNip, etc.).
La expresión “trastornos relacionados” cuando se hace referencia a hipercolesterolemia se refiere a una o más de las afecciones seleccionadas del grupo que consiste en: aterosclerosis, hiperlipidemia, desequilibrio de colesterol HDL/LDL, dislipidemias, por ejemplo, hiperlipidemia combinada familiar (FCHL), hiperlipidemia adquirida, hipercolesterolemia resistente a estatina, enfermedad de las arterias coronarias (CAD) y enfermedad cardiaca coronaria (CHD).
En una realización, la expresión "compuesto oligomérico" se refiere a un oligonucleótido que puede inducir un efecto terapéutico deseado en seres humanos mediante, por ejemplo, unión por enlace de hidrógeno con un ácido nucleico diana. También se prevé que los compuestos oligoméricos desvelados en el presente documento pueden tener aplicaciones no terapéuticas, tales como aplicaciones de diagnóstico.
Como se usa en el presente documento, el término “modulación” significa bien un aumento (estimulación) o bien una reducción (inhibición) de la expresión de un gen. En la presente invención, la inhibición es la forma preferida de modulación de la expresión génica y ARNm es una diana preferida.
Como se usa en el presente documento, "hibridación" significa enlace de hidrógeno, que puede ser Watson-Crick, Holstein, enlaces de hidrógeno de Holstein invertidos, etc., entre bases de nucleótidos complementarias. Watson y Crick mostraron hace aproximadamente cincuenta años que el ácido desoxirribonucleico (ADN) está compuesto de dos cadenas que se mantienen unidas en una configuración helicoidal mediante enlaces de hidrógeno formados entre nucleobases complementarias opuestas en las dos cadenas. Las cuatro nucleobases, habitualmente halladas en ADN son guanina (G), adenina (A), timina (T) y citosina (C) de las que la nucleobase G se empareja con C, y la nucleobase A se empareja con T. En ARN la nucleobase timina se reemplaza por la nucleobase uracilo (U), que de forma similar a la nucleobase T se empareja con A. Los grupos químicos en las nucleobases que participan en la formación de dobles cadenas convencionales constituyen la cara de Watson-Crick. Hoogsteen mostró un par de años después que las nucleobases purínicas (G y A) además de su cara Watson-Crick tienen una cara Hoogsteen que puede reconocerse desde el exterior de una doble cadena, y usarse para unir oligonucleótidos de pirimidina mediante enlaces de hidrógeno, formando de este modo una estructura de triple hélice.
Se prefiere en gran medida que los compuestos de la invención sean capaces de hibridar con el ácido nucleico diana, tal como el ARNm.
En una realización preferida, los oligonucleótidos son capaces de hibridar contra el ácido nucleico o los ácidos nucleicos diana, tales como el ARNm o los ARNm de PCSK9 correspondientes, para formar una doble cadena con una Tm de al menos 37 °C, tal como al menos 40 °C, al menos 50 °C, al menos 55 °C o al menos 60 °C. En un aspecto la Tm es de entre 37 °C y 80 °C, tal como entre 50 y 70 °C, o entre 40 y 60 °C, o entre 40 y 70 °C. En una realización, la Tm es menor de 80 °C, tal como menor de 70 °C o menor de 60 °C o menor de 50 °C.
Medición de Tm
Se mezcla una solución 3 μM del compuesto en fosfato sódico 10 mM/ NaCl 100 mM/ EDTA 0,1 nM, pH 7,0 con su oligonucleótido de ADN o ARN del complemento a una concentración 3 μM en fosfato sódico 10 mM/ NaCl 100 mM/ EDTA 0,1 nM, pH 7,0 a 90 °C durante un minuto y se permite que se enfríe a temperatura ambiente. La curva de fusión de la doble cadena se determina después midiendo la absorbancia a 260 nm con una velocidad de calentamiento de 1 °C/min en el intervalo de 25 a 95 °C. La Tm se mide como el máximo de la primera derivada de la
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curva de fusión.
Conjugados
En una realización de la invención el compuesto oligomérico se une a ligandos/conjugados, que pueden usarse, por ejemplo, para aumentar la captación celular de oligonucleótidos antisentido. El documento WO2007/031091 proporciona ligandos y conjugados adecuados.
La invención también proporciona un conjugado que comprende el compuesto de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento, y al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico unido covalentemente con dicho compuesto. Por lo tanto, en una realización en la que el compuesto de la invención consiste en un ácido nucleico específico, como se desvela en el presente documento, el compuesto también puede comprender al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico (por ejemplo que no comprende uno o más nucleótidos o análogos de nucleótidos) unido covalentemente con dicho compuesto.
Aplicaciones
Los compuestos oligoméricos de la presente invención pueden utilizarse, por ejemplo, como reactivos de investigación para diagnóstico, terapia y profilaxis.
Algunos de los beneficios de utilizar LNA, y métodos para preparar y purificar LNA y oligonucleótidos de LNA se desvelan en el documento WO2007/031091.
Los compuestos oligoméricos de la invención, tales como los compuestos oligonucleotídicos que contienen LNA de la presente invención, también pueden utilizarse como reactivos de investigación para diagnóstico, terapia y profilaxis.
En investigación, dichos oligonucleótidos antisentido pueden usarse para inhibir específicamente la síntesis de genes de PCSK9 en células y animales experimentales facilitando de este modo el análisis funcional de la diana o una evaluación de su utilidad como una diana para intervención terapéutica.
En diagnóstico los oligonucleótidos antisentido puede usarse para detectar y cuantificar expresión de PCSK9 en células y tejidos por transferencia de Northern, hibridación in situ o técnicas similares.
Para terapia, un animal o un ser humano, que se sospecha que tiene una enfermedad o un trastorno, que puede tratarse modulando la expresión de PCSK9 se trata administrando compuestos antisentido de acuerdo con la presente invención. Se proporciona además el uso en el tratamiento de un animal, en particular ratón y rata y tratamiento de un ser humano, que se sospecha que tiene o es propenso a una enfermedad o afección, asociado con la expresión de PCSK9 administrando una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los compuestos antisentido o composiciones de la invención.
La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede usarse para tratamiento de afecciones asociadas con niveles anómalos de PCSK9, tales como hipercolesterolemia y trastornos relacionados.
También se proporcionan dosificaciones, formulaciones, vías de administración, composiciones, formas de dosificación, combinaciones con otros agentes terapéuticos, formulaciones profarmacológicas adecuados en el documento WO2007/031091, aunque debería reconocerse que los aspectos del documento WO2007/031091 que son solamente aplicables de forma específica al tratamiento del cáncer pueden no ser apropiados en las composiciones terapéuticas/farmacéuticas y métodos de la presente invención.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto o un conjugado como se describe en el presente documento o un conjugado, y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. El documento WO2007/031091 proporciona diluyente, vehículo y adyuvantes farmacéuticamente aceptables adecuados y preferidos.
Composiciones farmacéuticas que comprenden más de un principio activo
La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede comprender además otros principios activos, incluyendo los que se indican como útiles para el tratamiento de hipercolesterolemia y/o trastornos relacionados.
Una de dichas clases de compuestos son estatinas. Las estatinas son inhibidores de HMG-CoA reductasa que forman una clase de agentes hipolipidémicos, usados como productos farmacéuticos para reducir los niveles de colesterol en personas en riesgo de enfermedad cardiovascular debido a hipercolesterolemia. Actúan inhibiendo la enzima HMG-CoA reductasa, la enzima que determina la velocidad de síntesis de colesterol. La inhibición de esta enzima en el hígado estimula los receptores de LDL, lo que da como resultado una eliminación aumentada de LDL del torrente sanguíneo y una reducción de los niveles de colesterol en sangre. Los ejemplos de estatinas incluyen
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Atorvastatin™, Cerivastatin™, Fluvastatin™, Lovastatin™, Mevastatin™, Pravastatin™, Pravastatin™, Rosuvastatin™ y Simvastatin™. El uso combinado del compuesto de la invención y las estatinas puede permitir una reducción de la dosis de las estatinas, superando de este modo los efectos secundarios asociados con la dosificación habitual de estatinas, que incluyen, por ejemplo, mialgias, calambres musculares, síntomas gastrointestinales, trastornos de enzimas hepáticas, miositis, miopatía, rabdomiolisis (la degradación patológica del músculo esquelético) que pueden conducir a insuficiencia renal aguda cuando los productos de degradación muscular dañan los riñones.
Los fibratos, una clase de ácidos carboxílicos anfipáticos es una clase alternativa de compuesto que se combina con frecuencia con el uso de estatina, a pesar de una mayor frecuencia de rabdomiolisis que se ha indicado con el uso combinado de estatinas y fibratos. La composición de acuerdo con la invención puede comprender además por lo tanto fibratos, y opcionalmente estatinas.
La composición de acuerdo con la invención puede comprender además moduladores de apolipoproteína B (Apo-B), particularmente agentes que son capaces de reducir la expresión de la función de Apo-B. Convenientemente, los moduladores de Apo-B pueden ser oligonucleótidos antisentido (por ejemplo oligómeros), tales como los desvelados en los documentos WO 00/97662, WO 03/11887 y WO 2004/44181. Una combinación preferida es con el compuesto ISIS 301012 (ilustrado como SEQ ID NO 13).
La composición de acuerdo con la invención puede comprender además moduladores de la expresión de FABP4, tales como oligonucleótidos antisentido (por ejemplo oligómeros) que se dirigen a FABP4, la composición puede usarse en regulación negativa simultanea de la expresión tanto de FABP4 como de PSCK9, dando como resultado un efecto sinérgico con respecto a colesterol en suero sanguíneo y por lo tanto ventajas cuando se trata la hipercolesterolemia y/o trastornos relacionados. Dichas composiciones que comprenden tanto los compuestos de la invención como moduladores de FABP4, tales como los oligonucleótidos antisentido indicados en el presente documento, también pueden comprender adicionalmente estatinas. La solicitud provisional de Estados Unidos 60/969.016 incorporada por la presente por referencia desvela moduladores de FABP4 adecuados.
También se prevé que la composición puede comprender oligonucleótidos antisentido que comprenden análogos de nucleótidos, tales como los desvelados en el documento WO2007/031081. Los oligonucleótidos de LNA específicos, como se desvela o se destaca que se prefieren en el documento WO2007/031091 son especialmente adecuados para los inventores en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención.
La invención también proporciona un kit de partes en el que una primera parte comprende el compuesto, el conjugado y/o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención y una parte adicional comprende un oligonucleótido antisentido capaz de reducir la expresión de Apo-B o FABP4. Se prevé por lo tanto que el kit de partes pueda usarse en un método de tratamiento, como se indica en el presente documento, en el que el método comprende administrar tanto la primera parte como la parte adicional, bien simultáneamente o bien una después de la otra.
Métodos médicos y uso
Las afecciones adicionales que pueden asociarse con niveles anómalos de PCSK9 y que por lo tanto pueden tratarse usando las composiciones, conjugados y compuestos de acuerdo con la invención incluyen trastornos seleccionados del grupo que consiste en: hiperlipoproteinemia, hiperlipoproteinemia familiar de tipo 3 (disbetalipoproteinemia familiar), e hiperalfalipoproteinemia familiar; hiperlipidemia, hiperlipidemias mixtas, hiperlipidemia de tipo lipoproteína múltiple e hiperlipidemia combinada familiar; hipertrigliceridemia, hipertrigliceridemia familiar y lipoproteína lipasa familiar; hipercolesterolemia, hipercolesterolemia resistente a estatina, hipercolesterolemia familiar, hipercolesterolemia poligénica y apolipoproteína B defectuosa familiar; trastornos cardiovasculares incluyendo aterosclerosis y enfermedad de las arterias coronarias; trombosis; enfermedad vascular periférica y obesidad.
Las afecciones adicionales que pueden asociarse con niveles anómalos de PCSK9, y que por lo tanto pueden tratarse usando las composiciones, conjugados y composiciones de acuerdo con la invención incluyen trastornos seleccionados del grupo que consiste en: enfermedad de von Gierke (enfermedad de almacenamiento de glucógeno, tipo I); lipodistrofias (formas congénitas y adquiridas); síndrome de Cushing; enanismo ateloítico sexual (deficiencia de hormona de crecimiento aislada); diabetes mellitus; hipertiroidismo; hipertensión; anorexia nerviosa; síndrome de Werner; porfiria intermitente aguda; cirrosis biliar primaria; obstrucción extra hepática biliar 5; hepatitis aguda; hepatoma; lupus eritematoso sistémico; gammapatías monoclonales (incluyendo mieloma, mieloma múltiple, macroglobulinemia, y linfoma); endocrinopatías; obesidad; síndrome nefrótico; síndrome metabólico; inflamación; hipotiroidismo; uremia (hiperurecemia); impotencia; enfermedad obstructiva hepática; hipercalcemia idiopática; disglobulinemia; niveles de insulina elevados; síndrome X; contractura de Dupuytren; SIDA; y enfermedad de Alzheimer y demencia.
Los compuestos de la invención pueden usarse en métodos para inhibir la unión de partículas de colesterol con endotelio vascular que comprende la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la
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Se reconoce que cuando la composición de acuerdo con la invención también comprende moduladores de la expresión de Apo-B100 o FABP4, tales como oligonucleótidos antisentido que se dirigen a ApoB-100 o FABP4, la composición puede usarse en regulación negativa simultánea de la expresión tanto de PCSK9 como de ApoB-100 (o FABP4), dando como resultado un efecto sinérgico con respecto a colesterol en suero sanguíneo y por lo tanto
5 ventajas cuando se trata la hipercolesterolemia y/o trastornos relacionados. Dichas composiciones que comprenden tanto los compuestos de la invención como moduladores de ApoB o FABP4, tales como los oligonucleótidos antisentido indicados en el presente documento, también pueden comprender además estatinas.
Tabla 2: diseños de compuestos específicos/ oligonucleótidos antisentido de LNA. Obsérvese que los números
10 indicados en los Ejemplos y las Figuras se refieren a los números de ID de compuesto. La Tabla anterior proporciona tanto n.º de ID de compuesto, como la SEQ ID correspondiente usada en el listado de secuencias y el motivo ID, también indicado en el listado de secuencias. Se muestran motivos de secuencias de oligómeros adicionales de acuerdo con la invención en la Tabla 3.
Compuesto ID n.º
Longitud Secuencia SEQ ID SEQ ID de motivo
262
16 5'-Gs o m cs o m cs o ts gs ts cs ts gs ts gs gs as As oGs omCo -3’ 10 3
80
14 5'-Gs oAs o Gsots as gs as gs gs cs as Gs oGs omCo -3' 20 30
338
16 5'-mcs oAs oAs o gs ts ts as cs as as as as gs mcs oAs oAo -3’ 11 4
341
16 5'-Gs oAs oGs oas ts as cs as cs cs ts cs cs As omCs omCo -3' 9 5
301
16 5'-Ts omCs o m Cs o ts cs as gs gs gs as as cs cs As o Gs oGo -3' 21 31
317
16 5'-mcs oTs oGs o gs as gs cs as gs cs ts cs as Gs omCs oAo -3' 22 32
323
16 5'-mCs oAs oTs ogs gs cs as gs cs as gs gs as As oGs omCo -3', 23 33
98
14 5'-Gs oAs oTs o as cs as cs cs ts cs cs As o m Cs o m Co -3' 24 34
101
14 5'-mCsoTs oGs o ts cs ts gs ts gs gs as As oGs o mCo -3' 25 35
9
13 5'-Gs°Ts°s°cs ts gs ts gs gs as as Gs°Cs°G° -3' 26 36
11
13 5 As°Ts°gs as gs gs gs ts gs cs cs mGs omCo -3' 27 37
16
13 5'-As oTs o as as as cs ts cs cs as Gs oGs omCo -3' 28 38
18
13 5'-Ts oAs o gs as cs as cs cs cs ts mCs oAs omCo -3' 29 39
15 Ejemplos
Ejemplo 1: Síntesis de monómeros
Los componentes básicos de monómeros de LNA y derivados de los mismos se prepararon siguiendo los 20 procedimientos publicados y las referencias citadas en los mismos, véase:
Documento WO 03/095467 A1
D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808. 25
M. D. Sørensen, L. Kværnø, T. Bryld, A. E. Håkansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengel (2002) α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid (α-I-LNA): Synthesis and Properties, J. Am. Chem. Soc., 124, 21642176.
30 S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2’-Amino-and 2’Thio-LNA Monomeric Nucleosides, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079.
C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sørensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003)
Synthesis of 2’-amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1,655-663. 35
D. S. Pedersen, T. Koch (2003) Analogues of LNA (Locked Nucleic Acid). Synthesis of the 2’-Thio-LNA Thymine and 5-Methyl Cytosine Phosphoramidites, Synthesis 4, 578-582.
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