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ES2602119T3 - Aptámero contra IL-17 y uso del mismo - Google Patents

Aptámero contra IL-17 y uso del mismo Download PDF

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ES2602119T3
ES2602119T3 ES09797926.4T ES09797926T ES2602119T3 ES 2602119 T3 ES2602119 T3 ES 2602119T3 ES 09797926 T ES09797926 T ES 09797926T ES 2602119 T3 ES2602119 T3 ES 2602119T3
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ES
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aptamer
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agau
aggagagaggu
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Yoshikazu Nakamura
Shoji Ohuchi
Akira Ishiguro
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University of Tokyo NUC
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Abstract

Un aptámero que se une a IL-17 y/o inhibe la unión de IL-17 y el receptor de IL-17, en donde: (a) el aptámero comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 60; (b) el aptámero comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 3 a 5, 22 a 28, 32 a 36, 45 a 48, 50 y 51 (con la condición de que el uracilo puede ser timina); o (c) el aptámero comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 3 a 5, 22 a 28, 32 a 36, 45 a 48, 50 y 51 (con la condición de que el uracilo puede ser timina) en donde se sustituyen, suprimen, insertan o añaden uno de cinco nucleótidos, y cada grupo hidroxi en la posición 2' de la ribosa de los nucleótidos contenidos en el aptámero (a) - (c) anteriores está independientemente sin sustituir o sustituido con un átomo o un grupo seleccionado del grupo que consiste en un átomo de hidrógeno, un grupo metoxi y un átomo de flúor.

Description

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mencionado anteriormente, preferiblemente un átomo o grupo seleccionado del grupo que consiste en un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi y un grupo metoxi, en la posición 2’ de la ribosa.
En los aptámeros de la presente invención, todos los nucleótidos de purina son los mismos o diferentes y cada uno puede ser un nucleótido sustituido por un grupo hidroxi en la posición 2’ de la ribosa, o un nucleótido sustituido por cualquier átomo o grupo mencionado anteriormente, preferiblemente un átomo o un grupo seleccionado del grupo que consiste en un átomo de hidrógeno, un grupo metoxi, y un átomo de flúor en la posición 2’ de la ribosa.
El aptámero de la presente invención también puede ser uno en donde todos los nucleótidos comprenden idénticamente un grupo hidroxi, o cualquier átomo o grupo mencionado anteriormente, por ejemplo, el grupo idéntico seleccionado por el grupo que consiste en un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, un grupo hidroxi y un grupo – O-Me, en la posición 2’ de la ribosa.
El aptámero de la presente invención también puede poseer la característica de ser capaz de inhibir la actividad de IL-17, pero no ser capaz de inhibir la actividad de IL-17F. El aptámero de la presente invención también puede poseer la característica de ser capaz de inhibir la unión de IL-17 y el receptor de IL-17, pero no ser capaz de inhibir la unión de IL-17F y el receptor de IL-17. La IL-17F es una proteína de la familia de IL-17 que tiene una homología de un 44%, siendo la más similar a IL-17.
El aptámero de la presente invención también puede ser:
a.
un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 58, 59, 60, 3 a 5, 22 a 28, 32 a 36, 45 a 48, 50 o 51 (con la condición de que el uracilo puede ser timina);
b.
un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 3 a 5, 22 a 28, 32 a 36, 45 a 48, 50 y 51 (con la condición de que el uracilo puede ser timina), en donde están sustituidos, suprimidos, insertados o añadidos de uno cinco nucleótidos. Se describe también un conjugado seleccionado del grupo que consiste en conjugados plurales de aptámeros (a) anteriores, conjugados plurales de aptámeros (b) anteriores, y conjugados plurales de aptámeros (a) y (b) anteriores.
Preferidos de los anteriores (a) -(b) son (a) -(b) en donde la secuencia de nucleótidos se selecciona de las SEQ ID NO: 58, 59 o 60.
El número de nucleótidos sustituidos, suprimidos, insertados o añadidos no es más de 5, más preferiblemente 4, 3, 2
o 1. Se puede conseguir la conjugación por unión en tándem. En la conjugación, se puede utilizar un conector. Como conectores se pueden mencionar, cadenas de nucleótidos (p. ej., de 1 a aproximadamente 20 nucleótidos) y cadenas de no-nucleótidos (p. ej.., -(CH2)n-conector, -(CH2CH2O)n-conector, conector hexaetilénglicol, conector TEG, conector que contiene péptido, conector que contiene enlace –S-S-, conector que contiene enlace –CONH-, conector que contiene enlace –OPO3-). La pluralidad, como se menciona en los conjugados plurales descritos anteriormente, no está particularmente limitada, con tal de que sean dos o más, y la pluralidad puede ser, por ejemplo, 2, 3 o 4.
Cada uno de los nucleótidos anteriores, sea el mismo o diferente, puede ser un nucleótido que comprende un grupo hidroxi en la posición 2’ de la ribosa, o un nucleótido sustituido por cualquier grupo (p. ej., átomo de hidrógeno, átomo de flúor o grupo –O-Me) en la posición 2’ de la ribosa (p. ej., nucleótido de ribosa o pirimidina).
Por ejemplo, el aptámero de la presente invención puede ser un aptámero en donde los nucleótidos contenidos en los anteriores (a)-(b) son tales que:
i. cada posición 2’ de la ribosa del nucleótido de pirimidina es la misma o diferente y está sustituida por un átomo de flúor o sustituida por cualquier átomo o grupo mencionado anteriormente, preferiblemente átomo
o grupo seleccionado del grupo que consiste en átomo de hidrógeno, grupo hidroxi y grupo metoxi; y
ii. cada posición 2’ de la ribosa del nucleótido de purina es la misma o diferente y está sustituida por un grupo hidroxi o sustituida por cualquier átomo o grupo mencionado anteriormente, preferiblemente átomo o grupo seleccionado del grupo que consiste en átomo de hidrógeno, grupo metoxi y átomo de flúor.
La presente invención también proporciona el aptámero descrito anteriormente.
El aptámero puede ser uno en donde un resto de azúcar (p. ej., ribosa) de cada nucleótido se ha modificado para aumentar la actividad de unión de IL-17, estabilidad, administrabilidad del medicamento y similares. Como ejemplos de modificación en un resto de azúcar se pueden mencionar sustitución de un átomo de oxígeno en la posición 2’, en la posición 3’ y/o en la posición 4’ del resto de azúcar con otro átomo, y similares. Como tipo de modificación se pueden mencionar fluoración, O-alquilación (p. ej., O-metilación, O-etilación), O-arilación, S-alquilación (p. ej., Smetilación, S-etilación), S-arilación, y aminación (p. ej., -NH2). Tales alteraciones en el resto de azúcar se pueden realizar por un método conocido en sí mismo (adviértase en, por ejemplo, Sproat et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145).
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glicina, y polvo de naranja; conservantes como benzoato sódico, bisulfito de sodio, metilparabeno, y propilparabeno; estabilizadores como ácido cítrico, citrato sódico, y ácido acético; agentes de suspensión como metilcelulosa, polivinilpirrolidona, y estearato de aluminio; agentes dispersantes como surfactantes; diluyentes como agua, solución salina fisiológica, y zumo de naranja; ceras de base como mantequilla de cacao, polietilénglicol, y queroseno; y similares, aunque estos no son limitantes.
Preparaciones adecuadas para la administración oral son una solución preparada disolviendo una cantidad efectiva de ligando en un diluyente como agua, solución salina fisiológica, o zumo de naranja; cápsulas, bolsitas o tabletas que comprenden una cantidad efectiva de ligando en forma sólida o granular; una suspensión preparada por suspensión de una cantidad efectiva de ingrediente activo en un dispersante apropiado; una emulsión preparada dispersando y emulsionando una solución de una cantidad efectiva de ingrediente activo en un dispersante apropiado, y similares.
El fármaco de la presente invención se puede recubrir por un método conocido en sí con el propósito de enmascarar el sabor, disolución entérica, liberación sostenida y similares. Como ejemplos de agentes de recubrimiento para el recubrimiento se usan, hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, polioxietilénglicol, Tween 80, Pluronic F68, ftalato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato succinato de hidroximetilcelulosa, Eudragit (fabricado por Rohm, Alemania, copolímero de ácido metacrílico/ácido acrílico), pigmentos (p. ej., óxido de hierro rojo, dióxido de titanio y similares) y similares. El fármaco puede ser una preparación de liberación rápida o una preparación de liberación sostenida. Ejemplos de bases de liberación sostenida incluyen liposomas, atelocolágeno, gelatina, hidroxiapatito, PLGA y similares.
Como preparaciones adecuadas para administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, administración subcutánea, administración intramuscular, administración tópica, administración intraperitoneal, administración intranasal, administración pulmonar y similares) están disponibles líquidos inyectables estériles isotónicos acuosos y no acuosos, que pueden comprender un antioxidante, una solución tampón, un agente bacteriostático, un agente isotonizante, y similares. También se pueden mencionar suspensiones estériles acuosas y no acuosas, que pueden comprender un agente de suspensión, un solubilizante, un espesante, un estabilizante, un antiséptico y similares. Se puede incluir la preparación en un envase como una ampolla o un vial en volumen de dosificación unitaria o en varias dosis divididas. Un ingrediente activo y un excipiente farmacéuticamente aceptable también puede ser liofilizado y almacenado en un estado que se puede disolver o suspender en un vehículo estéril apropiado antes de su uso. Además de inyecciones líquidas también se aceptan, inhalantes y ungüentos. En el caso de un inhalante, se microniza y se administra mediante inhalación un ingrediente activo en estado liofilizado usando un dispositivo de inhalación apropiado. Un inhalante se puede formular como adecuado con surfactantes usados convencionalmente, aceite, condimento, ciclodextrina o derivados de la misma y similares, según sea necesario.
Aquí, como ejemplos de tensioactivos, se pueden mencionar ácido oleico, lecitina, dietilénglicol dioleato, tetrahidrofuril oleato, etil oleato, isopropil miristato, gliceril trioleato, gliceril monolaurato, gliceril monooleato, gliceril monoesterato, gliceril monolisionato, alcohol cetílico, estearil alcohol, polietilénglicol 400, cloruro de cetilpirinidinio, trioleato de sorbitán (nombre comercial, Span 85), monooleato de sorbitán (nombre comercial, Span 80), monolaurato de sorbitán (marca comercial, Span 20), polioxietileno endurecido con aceite de ricino (nombre comercial, HCO-60), polioxietilen (20) sorbitán monolaurato (nombre comercial, Tween 20), polioxietilen (20) sorbitán monooleato (nombre comercial, Tween 80), lecitina de origen de recursos naturales (nombre comercial, EPICLON), polioxietilen (2) oleil éter (nombre comercial, Brij 92), polioxietilén(2) estearil éter (nombre comercial, Brij 72), polioxietilén(4) lauril éter (nombre comercial, Brij 30), oleilpolioxietilen (2) éter (nombre comercial, Genapol 0-020), copolímero bloqueado de oxetileno y oxipropileno (nombre comercial, Synperonic) y similares. Como ejemplos de aceite se pueden mencionar, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de algodón, aceite de girasol y similares. En el caso de un ungüento, una base farmacéuticamente aceptable (vaselina amarilla, vaselina blanca, parafina, plastibase, silicona, ungüento blanco, cera de abejas, manteca de cerdo, aceites vegetales, ungüento hidrofílico, vaselina hidrofílica, lanolina purificada, lanolina hidrolizada, ungüento que absorbe agua, plastibase hidrofílica, ungüento macrogol y similares) se mezcla con un ingrediente activo, y se usa como una preparación.
Se puede fabricar un inhalante según un método convencional. Específicamente, se puede fabricar un inhalante por espolvoreado o licuado del aptámero o complejo de la presente invención anteriormente descrito mezclándolo con un propulsor de inhalación y/o excipiente, y llenándolos en un recipiente de inhalación apropiado. Cuando el aptámero o complejo de la presente invención descrito anteriormente es un polvo, se puede usar un inhalador de polvo mecánico; en el caso de un líquido, se puede usar un inhalador como un nebulizador. Aquí, como propulsor, puede ser uno convencionalmente conocido ampliamente usado; se pueden mencionar compuestos de las series de clorofluorocarbono como clorofluorocarbono-11, clorofluorocarbono-12, clorofluorocarbono-21, clorofluorocarbono22, clorofluorocarbono-113, clorofluorocarbono-114, clorofluorocarbono-123, clorofluorocarbono-142c, clorofluorocarbono-134a, clorofluorocarbono-227, clorofluorocarbono-C318, y 1, 1, 1, 2-tetrafluoroetano, hidrocarburos como propano, isobutano, y n-butano, éteres como dietil éter, gases comprimidos como gas nitrógeno y gas dióxido de carbono y similares.
La dosis del fármaco de la presente invención varía dependiendo de la clase y la actividad del ingrediente activo, gravedad de la enfermedad, especies animales que son sujeto de la administración, la tolerancia del medicamento del sujeto de administración, peso corporal, edad y similares, y la dosis usual, basada en la cantidad de ingrediente
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activo por día para un adulto, puede ser de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 10 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 1 mg/kg.
También se describe un portador de fase sólida que tiene un aptámero o el complejo de la presente invención inmovilizado sobre el mismo. Como ejemplos de portadores de fase sólida se pueden mencionar, un sustrato, una resina, una placa (p. ej., placa multipocillo), un filtro, un cartucho, una columna, y un material poroso. El sustrato puede ser uno usado en chips de DNA, chips de proteína y similares; por ejemplo, se pueden mencionar, sustratos de níquel-PTFE (politetrafluoroetileno), sustratos de vidrio, sustratos de apatito, sustratos de silicio, sustratos de alúmina y similares, y sustratos preparados por recubrimiento de estos sustratos con un polímero y similares. Como ejemplos de la resina se pueden mencionar, partículas de agarosa, partículas de sílice, un copolímero de acrilamida y N,N’-metilenbisacrilamida, partículas de divinilbenceno entrecruzadas con poliestireno, partículas de dextrano entrecruzadas con epiclorhidrina, fibra de celulosa, polímeros entrecruzados de arildextrano y N,N’metilenbisacrilamida, polímeros sintéticos monodispersos, polímeros hidrofílicos monodispersos, Sepharosa, Toyopearl y similares, y también se incluyeron resinas preparadas por unión de varios grupos funcionales a estas resinas. El portador de fase sólida de la presente invención puede ser útil en, por ejemplo, purificación, detección y cuantificación de IL-17.
El aptámero o el complejo de la presente invención se puede inmovilizar sobre un portador de fase sólida por un método conocido en sí mismo. Por ejemplo, se pueden mencionar un método que introduce una sustancia de afinidad (p. ej., aquellas anteriormente descritas) o un grupo funcional predeterminado dentro del aptámero o del complejo de la presente invención, e inmovilizando después el aptámero o complejo sobre un portador de fase sólida a través de la sustancia de afinidad o del grupo funcional predeterminado. La presente invención también proporciona tales métodos. El grupo funcional predeterminado puede ser un grupo funcional que se puede someter a una reacción de acoplamiento; por ejemplo, se pueden mencionar, un grupo amino, un grupo tiol, un grupo hidroxi, y un grupo carboxilo. La presente invención también proporciona un aptámero que posee tal grupo funcional introducido al mismo.
La presente invención también proporciona un método de purificación y de concentración de IL-17. En particular, la presente invención lo hace posible el separar IL-17 de las proteínas de otras familias de proteínas. El método de purificación y concentración de la presente invención puede comprender la adsorción de IL-17 al portador de fase sólida, y la elución de IL-17 adsorbida con un eluyente. La adsorción de IL-17 al portador de fase sólida de la presente invención se puede lograr mediante un método conocido en sí mismo. Por ejemplo, se introduce una muestra que contiene IL-17 (p. ej., cultivo bacteriano o celular o sobrenadante de cultivo, sangre) dentro del portador de fase sólida de la presente invención o una composición que contiene la misma. Se puede eluir IL-17 usando un eluyente como una solución neutra. No existe limitación en el eluyente neutro, que tiene un pH de, por ejemplo, aproximadamente de 6 a aproximadamente 9, preferiblemente aproximadamente de 6,5 a aproximadamente 8,5, y más preferiblemente aproximadamente de 7 a aproximadamente 8. La solución neutra puede también comprender, por ejemplo, una sal sódica (p. ej., NaCl), una sal potásica (p. ej., KCl), una sal magnésica (p. ej., MgCl2), un tensioactivo (p. ej., Tween 20, Tritón NP40), y glicerina. El método de purificación y concentración de la presente invención puede comprender además lavado del portador de fase sólida usando una solución de lavado después de la adsorción de IL-17. Ejemplos de la solución de lavado incluyen aquellas que contienen urea, un agente quelante
(p. ej., EDTA), Tris, un ácido, un álcali, RNA de transferencia, DNA, tensioactivos como Tween 20, sales como NaCl y similares. El método de purificación y concentración de la presente invención todavía puede comprender además el calentamiento del portador de fase sólida. Esta etapa permite la regeneración y esterilización del portador de fase sólida.
El aptámero o complejo de la presente invención se puede utilizar como una sonda de detección, particularmente como una sonda para la detección de IL-17. El método de marcaje del aptámero no está particularmente limitado; se pueden aplicar métodos conocidos en sí mismos. Tales métodos incluyen, por ejemplo, marcaje con un radioisótopo, marcaje con un colorante fluorescente o proteína fluorescente, y similares.
La presente invención también proporciona un método de detección de IL-17. En particular, la presente invención hace posible detectar y cuantificar por separado IL-17 de las proteínas de otras proteínas de la familia. El método de detección y cuantificación de la presente invención puede comprender la medida de IL-17 utilizando el aptámero de la presente invención (p. ej., por el uso del complejo y el portador de fase sólida de la presente invención). El método de detección y cuantificación de IL-17 se puede realizar de la misma manera que un método inmunológico, excepto que se usa el aptámero de la presente invención en lugar de un anticuerpo. Por lo tanto, usando el aptámero de la presente invención como sonda en lugar de un anticuerpo, se pueden realizar de la misma manera que tales métodos como, enzimoinmunoensayo (EIA) (p. ej., ELISA competitivo directo, ELISA competitivo indirecto, ELISA sándwich), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo fluorescente (FIA), usar en lugar de un anticuerpo secundario en la técnica de transferencia de Western, método de tinción inmunohistoquímico, método separación celular, detección y cuantificación. Estos métodos pueden ser útiles en, por ejemplo, medida del contenido de IL-17 en muestras de organismos vivos o biológicas, y en diagnóstico de una enfermedad asociada con IL-17.
La presente invención se describe con más detalle de aquí en adelante en esta memoria por medio de los siguientes Ejemplos, los que, sin embargo, nunca limitan el alcance de la invención.
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gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggu(F)ggagu(F)c(F)agu(F)gagc(F)gu(F)u(F)gac(F)c(F)ggc(F)aau(F)c(F)ac(F)c (F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
SEQ ID NO: 12: gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)gau(F)c(F)gu(F)u(F)gc(F)c(F)ggac(F)u(F)u(F)gc(F)c(F) c(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
SEQ ID NO: 13:
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)gu(F)u(F)gaac(F)c(F)ggagc(F)au(F)c(F)c(F) u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga SEQ ID NO: 14: gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gau(F)gac(F)aggagu(F)c(F)agau(F)au(F)au(F)gc(F)ac(F)au(F)u(F)u(F)gac(F)c
(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga SEQ ID NO: 15: gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggu(F)u(F)aggu(F)ggagu(F)c(F)agggaaaaaac(F)c(F)gu(F)u(F)u(F)gc(F)c(F)u(
F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga SEQ ID NO: 16: gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gu(F)agagu(F)ggagu(F)c(F)agau(F)au(F)agc(F)c(F)u(F)ac(F)aagu(F)c(F)c(F)c
(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga SEQ ID NO: 17: gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gu(F)aau(F)aggggagu(F)c(F)agau(F)au(F)ac(F)c(F)aac(F)gaagac(F)c(F)u(F)a
u(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga SEQ ID NO: 18: gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gu(F)aggu(F)gu(F)gagu(F)ggagu(F)c(F)agaaau(F)agc(F)c(F)gc(F)ac(F)c(F)u(
F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga SEQ ID NO: 19: gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gc(F)gau(F)c(F)gu(F)ac(F)gc(F)ggggggggagu(F)c(F)agau(F)au(F)ac(F)c(F)u(
F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga SEQ ID NO: 20: gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gu(F)gau(F)agu(F)ac(F)gc(F)ggaaggggagu(F)c(F)agau(F)au(F)ac(F)c(F)u(F)a
u(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga SEQ ID NO: 21: gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gc(F)aaggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)gu(F)gac(F)au(F)u(F)ggc(F)c(F)c(F)
u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga SEQ ID NO: 22: gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gc(F)u(F)au(F)gc(F)c(F)gc(F)ac(F)aaac(F)ac(F)gu(F)au(F)gagu(F)gc(F)u(F)c(
F)ac(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga SEQ ID NO: 23: gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggu(F)u(F)ac(F)u(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aaaagu(F)c(F)au(F)aaau(F)ggggu(F)u(F)
ac(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga SEQ ID NO: 24: gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggaggagac(F)agu(F)aau(F)c(F)gu(F)u(F)gac(F)c(F)gc(F)u(F)u(F)c(F)gu(F)gc(
F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga SEQ ID NO: 25:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gu(F)gau(F)agc(F)gaaggc(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)ac(F)au(F)u(F)aaac(F)c(F) u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
SEQ ID NO: 26:
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gggc(F)agc(F)agaggau(F)gc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)u(F)au( F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
SEQ ID NO: 27:
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gc(F)c(F)u(F)ggu(F)aggc(F)gu(F)agagaagu(F)c(F)au(F)u(F)gau(F)c(F)agc(F)c (F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
SEQ ID NO: 28:
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gu(F)u(F)au(F)aaaagc(F)u(F)u(F)aagu(F)gc(F)u(F)gu(F)c(F)aac(F)u(F)u(F)c(F )u(F)ac(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
SEQ ID NO: 29:
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gc(F)gau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)gu(F)gu(F)c(F)c(F)aac( F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
SEQ ID NO: 30:
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F) u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
SEQ ID NO: 31:
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggaagu(F)ggagu(F)c(F)agau(F)au(F)agc(F)aau(F)au(F)u(F)au(F)gac(F)c(F)u( F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
SEQ ID NO: 32:
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gggc(F)agc(F)ggaggau(F)ggc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gggc(F)gc(F)c(F)u(F)a u(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)ggu(F)ggag
SEQ ID NO: 33:
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggaggagc(F)c(F)agu(F)gau(F)c(F)gu(F)u(F)gac(F)c(F)u(F)c(F)aau(F)gc(F)ac( F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
SEQ ID NO: 34:
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggaggagac(F)agu(F)gau(F)c(F)gu(F)u(F)gac(F)c(F)c(F)ac(F)c(F)gggu(F)c(F)c (F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
SEQ ID NO: 35:
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggaggaggc(F)agu(F)aau(F)c(F)gu(F)u(F)gac(F)u(F)ggu(F)aaac(F)c(F)c(F)c(F) u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
SEQ ID NO: 36:
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gu(F)au(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gac(F)aaagc(F)c(F)ggc(F)c(F) u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
Se evaluaron las actividades de unión de IL-17 de los ácidos nucleicos mostrados en las SEQ ID NO: 1-6 y 29-36 mediante método de resonancia de plasmones superficiales. Se tomaron las mediciones usando BIAcore 2000. Se usó el chip SA como chip sensor, que tenía estreptavidina inmovilizada en él. Unida a la misma había aproximadamente 600 RU de un Poly dT de 16 nucleótidos con biotina unida al extremo 5’ del mismo. El ácido nucleico ligando tiene un Poly A de 16 nucleótidos añadida al extremo 3’ del mismo, y estaba inmovilizado sobre el chip SA a través de un enlace entre dT y A. La cantidad inmovilizada era aproximadamente de 800 RU. Se inyectaron 20 l de IL-17 humana para analito, preparada a 0,5 M, con la adición tRNA a 0,1 mg/ml para disminuir la adsorción no específica. Se usó solución A como tampón de migración. Como resultado de la medida, se encontró que todos los ácidos nucleicos mostrados en las SEQ ID NO: 1-6 y 29-36 unían significativamente más IL-17 que el control negativo 30N. En este caso, 30N se refiere al grupo de ácido nucleico usado para la primera ronda de SELEX, que comprende una secuencia aleatoria de 30 nucleótidos. Como un ejemplo, se muestra en la Fig. 7 un sensograma que muestra un estado de unión del aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 1 (Apt1) e IL-17 humana. De
imagen11
5
10
15
20
25
30
35
40
45
SEQ ID NO: 44: Un aptámero de 33 nucleótidos de longitud que tiene una alteración del aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 30
ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)
Ejemplo 3: Preparación de mutantes del aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 40
Se prepararon los mutantes mediante la inducción de una mutación al aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 40, y se evaluaron sus actividades de unión para IL-17 mediante el método de resonancia plasmónica de superficie. Se muestran a continuación las secuencias y modificaciones de los mutantes.
SEQ ID NO: 45: Un aptámero preparado induciendo la mutación (u(F)16:c(F)16) al aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 40
ggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)c(F)gagc(F)gc(F)c(F)
SEQ ID NO: 46: Un aptámero preparado induciendo la mutación (g21:a21) al aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 40
ggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)ac(F)c(F)
SEQ ID NO: 47: Un aptámero preparado induciendo la mutación (c(F)7:a(M)7) al aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 40
ggau(F)aga(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)
SEQ ID NO: 48: Un aptámero preparado induciendo la mutación (u(F)12:a(M)12) al aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 40
ggau(F)agc(F)gaaga(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)
SEQ ID NO: 40-2: Un aptámero preparado añadiendo la mutación una modificación OMe a la a3 del aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 40
gga(F)u(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)
SEQ ID NO: 40-3: Un aptámero preparado reemplazando la c(F)7 del aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 40 con c(M)7
ggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)
SEQ ID NO: 40-4: Un aptámero preparado añadiendo una modificación OMe a la g19 del aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 40
ggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gag(F)c(F)gc(F)c(F)
Todos estos aptámeros se unen a IL-17. Esto muestra que el aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 40 retiene la actividad de unión para IL-17 incluso cuando se introducen varias mutaciones o se modifica el método de modificación.
Ejemplo 4: Aptámeros que inhiben la unión de IL-17 y el receptor de IL-17
Se determinó si los aptámeros mostrados en las SEQ ID NO: 1-6 y 29-44 inhibían la unión de IL-17 al receptor de IL17 (IL-17R) usando el método de resonancia plasmónica de superficie.
Como se indica en el protocolo de la compañía BIAcore, se inmovilizó Proteína A (21181, PIERCE) sobre un chip sensor CM5. Aproximadamente 900 RU de IL-17R-Fc humana se fusionó con la porción Fc de la IgG (177-IR, R&D sytems) se inmovilizaron sobre el mismo. Como analito, se alimentó una mezcla de IL-17 (0,11 M) y cada aptámero (0,33 M) después de dejar reposar durante 15 minutos. Si el aptámero inhibe la unión de IL-17 al IL-17R, no se espera que aumente la señal del sensograma; si el aptámero no inhibe la unión, se formará un complejo terciario y se espera que la señal aumente. Antes de comenzar el experimento de inhibición, se confirmó que IL-17 se unía al IL-17R. Para el control negativo, se usó una mezcla de IL-17 y 30N. 30N se refiere al grupo de ácido nucleico usado para la primera ronda de SELEX, que comprende una secuencia aleatoria de 30 nucleótidos. Como resultado del experimento, se encontró que todos los aptámeros mostrados en las SEQ ID NO: 1-6 y 29-44 inhibían la unión de IL17 al IL-17R. Mientras, 30N no presentaba actividad inhibidora. Como un ejemplo, se muestra un sensograma que muestra que el aptámero mostrado en la SEQ ID NO: 1 inhibe la unión de IL-17 al IL-17R en la Fig.11.
De lo anterior, se demostró que los aptámeros mostrados en las SEQ ID NO: 1-6 y 29-44 se pueden usar como inhibidores de IL-17.
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Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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