ES2698114T3

ES2698114T3 - Materiales y procedimiento para identificar portadores de atrofia muscular espinal

Info

Publication number: ES2698114T3
Application number: ES12797596T
Authority: ES
Inventors: Lisa Edelmann; Robert J Desnick
Original assignee: Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Current assignee: Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Priority date: 2011-06-07
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2019-01-31
Anticipated expiration: 2032-06-07
Also published as: WO2012170725A2; EP2718466B1; IL229825A; US20140199695A1; WO2012170725A3; IL249396A0; IL249396B; EP2718466A2; US11279977B2; US20180340227A1; PL2718466T3; EP3460073A1; US9994898B2; EP2718466A4

Abstract

Un procedimiento para identificar un sujeto humano como un portador de un alelo de duplicación de SMN1 que comprende: (a) analizar un ácido nucleico de una muestra de un sujeto humano determinando (i) la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 11678 de la SEQ ID NO: 1; o (ii) la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 15774 de la SEQ ID NO: 1; o (iii) la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 22804 de la SEQ ID NO: 1; o (iv) la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 26190 de la SEQ ID NO: 1; o (v) la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1, o (vi) si se ha delecionado el dinucleótido A-T correspondiente a las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1; y (b) identificar al sujeto humano como un portador de un alelo de duplicación de SMN1 si (i) el nucleótido correspondiente a la posición 11678 de la SEQ ID NO: 1 no es G o hay un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 11678 y 11679 de la SEQ ID NO: 1; (ii) el nucleótido correspondiente a la posición 15774 de la SEQ ID NO: 1 no es G o hay un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 15774 y 15775 de la SEQ ID NO: 1; (iii) el nucleótido correspondiente a la posición 22804 de la SEQ ID NO: 1 no es G o hay un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 22804 y 22805 de la SEQ ID NO: 1; (iv) el nucleótido correspondiente a la posición 26190 de la SEQ ID NO: 1 no es A o hay un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 26190 y 26191 de la SEQ ID NO: 1; (v) el nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1 no es T o hay, al menos, un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 27134 y 27135 de la SEQ ID NO: 1; o (vi) está delecionado el dinucleótido A-T correspondiente a las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Materiales y procedimiento para identificar portadores de atrofia muscular espinal

Campo

La tecnología desvelada generalmente se relaciona con el campo del asesoramiento genético y, de manera más particular, con los procedimientos de identificación de portadores de determinantes genéticos asociados con afecciones deletéreas.

Antecedentes

La atrofia muscular espinal es una de las enfermedades autosómicas recesivas más comunes y graves, con una incidencia general de aproximadamente 1 por cada 6.000 a 10.000 nacidos vivos y una frecuencia de portador de 1 por cada 35 a 1 por cada 117, según la etnia. La enfermedad se caracteriza por la degeneración progresiva y la pérdida de células del asta anterior en la médula espinal y los núcleos del tronco encefálico que causan debilidad muscular simétrica y atrofia, y los subtipos clínicos se basan principalmente en la edad de inicio. La enfermedad de tipo I (enfermedad de Werdnig-Hoffmann, MIM n° 253300), que se presenta en el 60-70% de los pacientes, se caracteriza por la aparición de insuficiencia respiratoria al nacer o antes de los seis meses de edad, lo que lleva a la muerte dentro de los dos primeros años. Los pacientes de tipo I nunca se sientan o caminan. El inicio de la enfermedad de Tipo II (MIM n° 253550) ocurre generalmente después de los 6 meses de edad; estos bebés pueden sentarse, pero nunca caminar sin ayuda y tienen reducida significativamente la esperanza de vida. Los pacientes con enfermedad de tipo III (síndrome de Kugelberg-Welander, MIM n° 253400),se presentan después de los 18 meses de edad, se ponen de pie y caminan, pero a menudo quedan limitados a una silla de ruedas durante la infancia o la edad adulta temprana. La enfermedad de tipo IV (MIM n° 271150) se caracteriza por el inicio en la edad adulta (edad promedio de 35 años) y la progresión lenta de la enfermedad.

Las mutaciones homocigóticas del gen SMN1 en el cromosoma 5q13.2 son la causa principal de AME (Lefebvre y col., Cell 80: 155-165, 1995). En aproximadamente el 95-98% de los pacientes con AME, ambas copias de los exones 7 y 8 de SMN1 se eliminan o se vuelven no funcionales debido a la conversión génica de SMNl a SMN2 (Ogino y col., J. Hum. Genet. 12:1015-1023 (2004)). El 2-5% restante de los pacientes son heterocigotos compuestos que portan una(s) mutación(es) intragénica(s) en un alelo y una mutación por deleción o de conversión génica en el otro alelo (Wirth y col., Am J. Hum. Genet. 64:1340-1356, 1999). SMN1 y SMN2 están separados por aproximadamente 1.4 Megabases y comprenden los miembros teloméricos y centroméricos, respectivamente, de un conjunto de genes, incluido el NAIP, presente dentro de una duplicación segmentaria en 5q13.2. Los genes SMN1 (secuencia de referencia NCBI NG_008691) y SMN2 tienen una alta similitud de secuencia incluso en las regiones promotoras y no hay diferencias de aminoácidos codificados. Sin embargo, un solo cambio de base que afecta a un potenciador de empalme supuesto en el exón 7 (840C> T; posición 27006 de la SEQ ID NO: 1), da cuenta de las diferencias de empalme de manera que la mayoría de los transcritos de SMN2 carecen del exón 7 (Lorson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 96: 6307-6311 (1999)). Aunque se han establecido algunas correlaciones genotipo/fenotipo entre los pacientes que portan mutaciones puntuales de SMN1, la presencia de copias adicionales de SMN2 modifica positivamente el pronóstico clínico (Wirth y col., 1999).

La mayoría de las mutaciones que causan los cuatro tipos de AME (es decir, los Tipos I-IV) implican la pérdida de número de copias de SMN1. La detección de mutaciones generalmente implica la amplificación por PCR del exón 7 de SMN1, que está ausente de manera homocigótica en la mayoría de los individuos afectados. El análisis de portadores, sin embargo, se realiza mediante procedimientos sensibles a la dosis pero no sensibles a la ubicación que pueden distinguir SMN1 y SMN2, pero que no proporcionan información sobre la ubicación del gen. Estos análisis de portadores se realizan actualmente utilizando PCR cuantitativa (qPCR), Amplificación de Sondas dependiente de Ligandos Múltiples (MLPA) y/o tecnología cuantitativa Taqman. Estos procedimientos no pueden determinar el número de copias de SMN1 presentes en cromosomas individuales. Dado el estrecho vínculo de los genes SMN1 y SMN2 relacionados estructuralmente y la oportunidad para la conversión de genes, así como la duplicación o deleción de genes, no es sorprendente que estos procedimientos muestren una detectabilidad que varíe entre el 71 y el 94% debido a la incapacidad de identificar a los individuos que son portadores silenciosos de AME, tales como portadores silenciosos (2+0). Se necesita urgentemente información sobre la ubicación de los genes para permitir que el asesoramiento genético considere los efectos de la segregación en la producción de células germinales y sus implicaciones para la descendencia. Los individuos con dos copias de SMN1 en un cromosoma (un alelo de duplicación) y ninguna copia en el otro (un alelo de deleción), se denominan portadores silenciosos (2+0), ya que la mayoría de los individuos con dos copias de SMN1 intactas, una copia en cada cromosomas (1 1) no son portadores (fig. 1). Por lo tanto, la detección de portadores de AME mediante técnicas actuales que no son sensibles a la ubicación genera resultados negativos falsos.

La frecuencia de portadores silenciosos (2+0) varía según la etnia y es directamente proporcional al producto de la frecuencia de alelos de deleción y duplicación en una población dada. Entre los judíos Askenazis, se ha informado que la frecuencia de portadores de AME es de 1 por cada 41 con una detectabilidad de aproximadamente el 90%. Del 10% restante, aproximadamente el 8% son portadores silenciosos (2+0) y el resto portan mutaciones intragénicas. La frecuencia de portadores silenciosos de SMN1 (2+0) en cualquier población modifica el riesgo de ser portador después de un resultado de análisis negativo. Por ejemplo, en la población afroamericana (AA), la frecuencia de duplicación (2+1) de los individuos es relativamente alta (47%) y, en consecuencia, hay más portadores silenciosos (2+0), de modo que la tasa de detección de portadores es solo del 71% con un riesgo residual de 1 por cada 121 después de un resultado negativo.

En consecuencia, existe una necesidad en la técnica de analizar procedimientos para AME y para los portadores de AME que son sensibles a la ubicación además de ser sensibles al número de copias, por ejemplo, números de copias de alelos SMN1 y/o SMN2. Una evaluación precisa del riesgo de producir descendencia con AME requiere el conocimiento tanto de los números de copias de SMN1 y/o SMN2 como de la ubicación de los alelos que se encuentran en un genoma dado. Tal información es vital para el asesoramiento genético competente de los futuros padres.

Sumario

La tecnología desvelada en el presente documento resuelve al menos uno de los problemas mencionados anteriormente en la técnica. De manera más específica, la divulgación proporciona procedimientos para identificar portadores de AME, tales como portadores de AME silenciosos, como se ejemplifica por portadores de AME silenciosos (2+0). La capacidad de identificar portadores silenciosos (2+0) mejoraría significativamente la detección de portadores y, por lo tanto, los esfuerzos se dirigieron a identificar los alelos fundadores de deleción y/o duplicación de SMN1 específico de etnia mediante el análisis de un genotipo único para los alelos de deleción o duplicación presentes en portadores silenciosos (2+0).

La divulgación proporciona alelos fundadores en AJ para SMN1, incluido uno que está presente en aproximadamente la mitad del total de individuos AJ con duplicación de SMN1 (2+1). Este haplotipo de duplicación se puede identificar por dos polimorfismos altamente específicos estrechamente vinculados en SMN1 (SEQ ID NO: 1), g.27134T> G (posición 27134 de la SEQ ID NO: 1) en el intrón 7 y g.27706_27707delAT (posiciones 27706 y 27707 de la SEQ ID NO: 1) en el exón 8. Estos polimorfismos, y otras características genéticas observadas en esta divulgación, llevan la numeración utilizada para la secuencia de referencia SMN1 presentada en Genbank con el número de acceso NG_008691.1 (secuencia de referencia de ARNm afín NM_000344.3; secuencia de referencia de aminoácidos codificada NP_000335.1). Estos polimorfismos se pueden usar junto con procedimientos sensibles a la dosis para detectar portadores silenciosos (2+0) y mejorar la tasa de detección general de portadores en un grupo étnico particular, como el grupo judío Askenazi y en otros grupos étnicos o raciales, como Caucásicos, Asiáticos, Afroamericanos e Hispanos. Por ejemplo, cualquiera de estos polimorfismos o ambos se pueden detectar utilizando cualquier técnica conocida, incluyendo, pero sin limitación, la hibridación de sonda en condiciones rigurosas, en donde la secuencia de la sonda es perfectamente complementaria a una secuencia que incluye el sitio polimórfico, una amplificación por PCR acoplada al análisis de secuencia, polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción, y similares. En vista de los polimorfismos desvelados en el presente documento, además, se contempla que estos puntos calientes relativos podrían producir otras formas de cambios localizados en la secuencia de ácido nucleico, tales como deleciones de 1-5 o 1-10 nucleótidos, inserciones de 1-5 o 1-10 nucleótidos y sustituciones en la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1 en las que cualquier nucleótido convencional reemplaza la T/U de tipo salvaje y/o la AT de tipo salvaje en las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1.

Los aspectos particulares de la divulgación se describen en los siguientes párrafos enumerados.

1. Un procedimiento para identificar un sujeto humano como un portador de un alelo de duplicación de SMN1 que comprende:

(a) analizar un ácido nucleico de una muestra de un sujeto humano determinando

(i) la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 11678 de la SEQ ID NO: 1; o

(ii) la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 15774 de la SEQ ID NO: 1; o

(iii) la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 22804 de la SEQ ID NO: 1; o

(iv) la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 26190 de la SEQ ID NO: 1; o

(v) la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1, o

(vi) si se ha delecionado el dinucleótido A-T correspondiente a las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1; y

(b) identificar al sujeto humano como un portador de un alelo de duplicación de SMN1 si

(i) el nucleótido correspondiente a la posición 11678 de la SEQ ID NO: 1 no es G o hay un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 11678 y 11679 de la SEQ ID NO: 1; (ii) el nucleótido correspondiente a la posición 15774 de la SEQ ID NO: 1 no es G o hay un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 15774 y 15775 de la SEQ ID NO: 1; (iii) el nucleótido correspondiente a la posición 22804 de la SEQ ID NO: 1 no es G o hay un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 22804 y 22805 de la SEQ ID NO: 1; (iv) el nucleótido correspondiente a la posición 26190 de la SEQ ID NO: 1 no es A o hay un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 26190 y 26191 de la SEQ ID NO: 1; (v) el nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1 no es T o hay, al menos, un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 27134 y 27135 de la SEQ ID NO: 1; o

(vi) está delecionado el dinucleótido A-T correspondiente a las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1.

2. El procedimiento de acuerdo con el párrafo 1 en el que el sujeto humano se identifica como un portador de un alelo de duplicación de SMN1 basándose en la presencia de una estructura de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en una T correspondiente al nucleótido en la posición 11678 o 11679 de la SEQ ID NO: 1, una A correspondiente al nucleótido en la posición 15774 o 15775 de la SEQ ID NO: 1, una A correspondiente a la posición 22804 o 22805 de la SEQ iD NO: 1, una G correspondiente al nucleótido en la posición 26190 o 26191 de la SEQ ID NO: 1, una G correspondiente al nucleótido en la posición 27134 o 27135 de la SEQ ID NO: 1 y una deleción AT correspondiente a los nucleótidos en las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1.

3. Un procedimiento para identificar un portador silencioso humano (2+0) de Atrofia Muscular Espinal (AME) que comprende:

(a) analizar el ácido nucleico de un sujeto humano determinando

(i) la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1, o

(ii) si se ha delecionado el dinucleótido A-T correspondiente a las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1; y

(b) identificar un individuo como un portador silencioso (2+0) de AME si el nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1 no es una T o si está delecionado el dinucleótido AT correspondiente a las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1, o ambas cosas.

4. Un procedimiento para identificar un portador silencioso humano (2+0) de Atrofia Muscular Espinal (AME) que comprende:

(a) determinar la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1;

(b) determinar además si se ha delecionado el dinucleótido A-T correspondiente a las posiciones 27706 27707 de la SEQ ID NO: 1; y

(c) identificar un individuo como un portador silencioso (2+0) de AME si el nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1 es G o si está delecionado el dinucleótido AT correspondiente a las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1.

5. El procedimiento de acuerdo con el párrafo 4, en el que la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1 y las identidades de los nucleótidos correspondientes a las posiciones 27706 y 27707 de la SEQ ID NO: 1 se determinan mediante polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción.

6. El procedimiento de acuerdo con el párrafo 4, en el que se identifica una G en la posición correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1 por polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción utilizando la endonucleasa de restricción HpyCH4lIl.

Otros rasgos y ventajas de la presente divulgación serán evidentes a partir de las siguientes descripciones detalladas, incluidos los dibujos. Debería entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas, se proporcionan solo con fines ilustrativos, ya que se harán evidentes diversos cambios y modificaciones dentro del ámbito de la invención para los expertos en la materia a partir de la descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Se proporciona un esquema de los alelos SMN1 y SMN2 en el cromosoma 5q13. (A) Tipo salvaje con una copia de SMN1 y SMN2 en cada cromosoma 5 (1 1) (B) Portador de AME con una copia de SMN1 en un cromosoma 5 y pérdida de SMN1 en el otro cromosoma (1+0). (C) Duplicación con dos copias de SMN1 una en un cromosoma 5 y una copia en el otro cromosoma (2+1) (D) Portador silencioso de AME con dos copias de SMN1 en un cromosoma 5 y pérdida de SMN1 en el otro cromosoma (2+0).

Figura 2. Se muestra un esquema de Locus AME y Marcadores de Microsatélites de Flanqueo en 5q13.2. En la parte superior de la figura se encuentran los marcadores de microsatélites utilizados para el análisis de individuos AJ con deleciones o duplicaciones de SMN1 (coordenadas genómicas obtenidas del navegador de UCSC Genome Browser, NCBI36/HG18). Se muestran a continuación los locus AME, incluidas las repeticiones de copia baja con SMN2 en la copia proximal y SMN1 en la copia distal, desde las coordenadas genómicas 68.9 Mb a 70.36 Mb en 5q13.2. La orientación de cada uno de los genes se indica mediante la dirección de las flechas y se tomó a partir del contig genómico NT_006713.14.

Figura 3. Los polimorfismos g.27134T> G y g.27706_27707delAT en SMN1 (N° de acceso en Genbank NG_008691.1). (A) Secuencia genómica parcial de SMN1. Los exones están sombreados. Las secuencias de cebadores utilizadas para la amplificación y secuenciación se indican con *. Los polimorfismos se denotan con la designación dbSNP o mediante coordenadas genómicas y se indican encima de la secuencia y se denotan con asteriscos arriba (cebadores directos) o abajo (cebadores inversos). (B) trazas de secuencia que corresponden a (a) homocigoto g.27134T, (c) heterocigoto g.27l34T/G, (e) homocigoto g.27134G y g.27706_27707delAT (b) de tipo salvaje, (d) heterocigoto g.27706_27707delAT y (f) homocigoto g.27706_27707delAT. (C) Ganancia de un sitio de restricción hpyCH4III creado en g.27134T> G. Los carriles 10, 11 y 12 representan resultados con g.27134T (371 pb), los carriles 2-7 representan resultados con individuos heterocigotos para g.27134T/G (371 pb, 218 pb y 153 pb) y los carriles 1 y 9 muestran resultados para individuos homocigotos para g.27134G (218 pb y 153 pb). M es el carril marcador con una escalera mostrada de 50 pb.

Descripción detallada

La Atrofia Muscular Espinal (AME) es la enfermedad hereditaria letal más común en niños. Aproximadamente el 94% de los individuos humanos afectados muestran una pérdida bialélica del exón 7 de SMN1 y se sabe que dichas pérdidas son el resultado de mutaciones puntuales intragénicas que alteran los patrones de empalme del ARNm de SMN1, deleciones intragénicas que eliminan al menos parte del exón 7 así como la pérdida de la región de codificación SMN1 a través de la deleción. Dispuestos en el cromosoma 5 humano están SMN1 (SEQ ID NO: 1) y SMN2 (que difiere de la secuencia de SMN1 expuesta en la SEQ ID NO: 1 por C> T en la posición 27006 de la s EQ ID NO: 1). Estos dos genes son altamente homólogos, con una ubicación relativa telomérica para SMN1 y una ubicación relativa centromérica para SMN2. La secuencia del gen SMN2 difiere de la secuencia de SMN1 en el exón 7 debido a una mutación puntual y esta diferencia es suficiente por si sola para producir AME. Dada la proximidad relativa de SMN1 y SMN2, y dada la presencia de repeticiones en esta región localizada del cromosoma 5 (es decir, 5q13.2), la genética de AME se complica por la posibilidad de conversión génica así como de duplicaciones y/o deleciones. Aunque los procedimientos actuales pueden identificar mutaciones individuales en términos de variación de secuencia e incluso pueden proporcionar una medida del número de copias de SMN1, estos procedimientos no pueden discriminar más allá del número de copias para identificar portadores de AME que tienen, por ejemplo, excesivas copias del gen SMN1 en un cromosoma y ninguna copia de SMN1 en el otro cromosoma. En ejemplos particulares, el número de copias de dos de tipo salvaje para SMN1 está presente en el genoma de los portadores de AME debido a un desequilibrio de SMN1 en los homólogos del cromosoma 5 (es decir, ambas copias de SMN1 en un miembro del par de cromosomas 5). La divulgación promueve los esfuerzos para identificar portadores de AME al proporcionar procedimientos para identificar portadores silenciosos de Atrofia Muscular Espinal (AME) que contienen una carga de SMN1 cromosómicamente desequilibrada, tal como los portadores de AME silenciosos (2+0).

Para ayudar a comprender la descripción detallada de las composiciones y procedimientos de acuerdo con la divulgación, se proporcionan algunas definiciones expresas para facilitar una divulgación no ambigua de los diversos aspectos de la divulgación.

Un "polimorfismo" es una diferencia en la secuencia de ADN o ARN entre individuos, grupos, o poblaciones que dan origen a diferentes alelos. Los alelos pueden ser alelos de un gen que codifica un producto génico, como SMN1, y el polimorfismo puede implicar un cambio de secuencia (en relación con la secuencia de tipo salvaje) en la región codificante, en la región transcrita pero no traducida asociada con un gen, en la región de control de la expresión de un gen, en el entorno de ácido nucleico proximal de un gen o ubicado a cierta distancia del gen. Normalmente, los polimorfismos de interés en la identificación de portadores de AME estarán vinculados genéticamente al gen SMN1. Los polimorfismos ejemplares incluyen sustituciones de uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos, deleciones de una región polinucleotídica que comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 500, 1.000 o más nucleótidos e inserciones de nucleótidos en una región polinucleotídica en el que la inserción es de una longitud definida anteriormente en el contexto de las deleciones de direccionamiento.

Un "SNP" es un polimorfismo de nucleótido único, o una diferencia de un único nucleótido en la secuencia de ácido nucleico en relación con la secuencia de tipo salvaje.

Tal como se usa en el presente documento, un "haplotipo" es un genotipo parcial de al menos un determinante que contiene al menos un polimorfismo, como el polimorfismo de nucleótido único (SNP), una deleción o una inserción, en un cromosoma. Para los haplotipos que comprenden más de un polimorfismo, los polimorfismos individuales muestran un desequilibrio de enlace estadísticamente significativo. Los polimorfismos ejemplares son sustituciones, inserciones o deleciones de nucleótidos únicos o múltiples y cada polimorfismo se puede localizar en un determinante que es un gen reconocido en la técnica, tal como SMN1, un nuevo gen o una región extragénica de un cromosoma.

"Número de copia" se refiere al número de copias físicas de un determinante genético, como un gen o región del genoma de un organismo.

Un "portador" o "portador genético" es un individuo que contiene al menos una copia de un alelo de un determinante genético involucrado en la elaboración de un fenotipo dado, tal como AME, siempre que el individuo que contiene la copia o copias del determinante no muestre el fenotipo.

Un "portador silencioso" es un portador que no puede detectarse utilizando una técnica convencional de diagnóstico basada en el número de copias en la técnica.

AME es una enfermedad panétnica, y se conoce la frecuencia del número de copias del exón 7 de SMN1 en varios grupos étnicos. En particular, las frecuencias genotípicas del exón 7 de copia única varían desde el 2,7% (1 de 37) en la población Caucásica, el 2.2% (1 de 46) en la población judía Askenazi, el 1.8% (1 de 56) en la población Asiática, el 1.1% (1 de 92) en la población Afroamericana, hasta el 0.8% (1 de 125) en la población Hispana. Hendrickson y col., J. Med. Genet. 46:641-644 (2009). Por lo tanto, la divulgación no se limita a la aplicación ejemplificada de identificación de portadores en la población judía Askenazi, sino que se extiende a la identificación de portadores de AME como los portadores de a Me silenciosos (2+0) en cualquier población étnica, incluidas las poblaciones caracterizadas en el presente documento.

La identificación de alelos fundadores de deleción/duplicación proporciona un enfoque general para la detección de portadores silenciosos y mejorar la detección de portadores en varios grupos étnicos/raciales, como lo ejemplifican los datos desvelados en el presente documento que se relacionan con la población judía Askenazi (AJ). Los datos identifican alelos fundadores en la población judía Askenazi (AJ). El análisis de portadores de 692 adultos sanos AJ se realizó mediante un análisis de sondas dependiente de ligandos múltiples (MLPA), que identificó 1 de 46 (2,2%) portadores de deleción (1+0), y 1 de 7 individuos de duplicación (2+1). Estos datos indican que la detectabilidad del portador que utiliza solamente la dosis del gen SMN1 en esta población es alrededor del 90%. Los análisis de microsatélites de marcadores que flanquean el locus AME identificaron dos haplotipos de deleción y un haplotipo causante de duplicación principal. Cabe destacar que, se detectaron dos polimorfismos estrechamente vinculados a SMN1, es decir, g.27134T> G en el intrón 7 (posición 27006 de SEQ ID NO: 1, véase número de acceso en Genbank NG_008691.1) y g.27706_27707delAT en el exón 8 (posiciones 27706-27707 de SEQ ID NO: 1, véase número de acceso en Genbank Acc. NG_008691.1), en el alelo de duplicación principal de AJ, pero no en 351 individuos AJ con dos copias de SMN1, lo que hace que el haplotipo sea altamente específico para alelos de duplicación y aumente de manera eficaz la precisión de detección de portadores. Se espera obtener la mayor precisión diagnóstica cuando se analicen los dos polimorfismos identificados anteriormente, pero la divulgación comprende procedimientos diagnósticos que analizan el polimorfismo solo o junto con uno o más polimorfismos. Se espera que la identificación de marcadores específicos para alelos de duplicación o deleción mejore la detectabilidad del portador y reduzca el riesgo residual actual debido a la incapacidad de detectar portadores silenciosos (2+0) en cualquier población.

En 2008, El Colegio Americano de Genética Médica (ACMG) recomendó ofrecer pruebas de análisis de AME a todas las parejas sin importar la raza o la etnia. El asesoramiento genético para AME antes de la concepción se complica por la naturaleza de las mutaciones, que implican la pérdida del número de copias de SMNl por deleción o conversión de genes con la copia centromérica altamente homóloga, SMN2, así como la alta tasa de mutaciones de novo en el locus. Dado que la mayoría de las mutaciones implican la pérdida del número de copias, la detectabilidad del portador está limitada por la tasa de falsos negativos que varía del 4% al 27%, según el origen étnico, debido a la incapacidad de detectar portadores silenciosos (2+0) con dos copias de SMN1 en un cromosoma y ninguno en el otro.

Para superar esta limitación y aumentar la detectabilidad de los portadores de AME en la población AJ, se buscaron alelos fundadores con polimorfismos únicos para distinguir los portadores silenciosos (2+0) de los individuos de tipo salvaje (1 1). El análisis de 692 individuos A^jpor MLPA estableció las frecuencias de los alelos SMN1 normales, delecionados y duplicados e identificó los individuos con deleción (1+0) y duplicación (2+1) para buscar haplotipos de alelo único de deleción y/o duplicación alrededor del locus SMN1. Los estudios de haplotipos de la población AJ se vieron favorecidos por la disponibilidad de mutaciones causantes identificadas en bloques de haplotipos compartidos, lo que facilitó la detección de portadores de trastornos recesivos prevalentes entre los individuos AJ. Para buscar posibles alelos fundadores, se realizaron análisis de microsatélites con marcadores que flanqueaban el locus SMN1 y se realizaron estudios de asociación de rasgos de marcador con cuatro de los marcadores más estrechamente vinculados (D5S681-D5S435-MS1-D5S610; SEQ ID NO: 5, 6, 2 y 7, respectivamente), tal como se describe en los siguientes ejemplos. Se presentó D5S681 en Morrison y col., Hum Mol Genet. 2(10):1753 (1993); Soares y col., Genomics. 15(2):365-71 (1993) presentó D5S435; para D5S610, véase Velasco y col., Eur J Hum Genet. 3(2):96-101 (1995). MS1 es un marcador de microsatélites recientemente identificado, al igual que MS2 (SEQ ID NO: 3) y MS3 (SEQ ID NO: 4). Los microsatélites también se denominan repeticiones de secuencias simples y constituyen una clase de polimorfismos genéticos comúnmente utilizados para el mapeo, el análisis de enlace y el rastreo de patrones de herencia. Normalmente, los microsatélites son secuencias repetidas en tándem. El número de veces que se repite la unidad en un microsatélite dado puede ser muy variable, una característica que los hace útiles como marcadores genéticos.

Una comparación de las frecuencias de haplotipos en los individuos con deleción (1+0) y duplicación (2+1) con los controles AJ no portadores, identificó dos haplotipos específicos de dos deleciones y tres duplicaciones con valores de p <0,001 (Tabla 3). De estos haplotipos, uno apareció en aproximadamente el 46,4% (32/69) de los alelos de duplicación probados, pero estuvo ausente en los 78 individuos AJ control, lo que lo hace altamente específico. Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones de la divulgación. El Ejemplo 1 desvela materiales y procedimientos utilizados en los estudios descritos en el presente documento. El Ejemplo 2 proporciona los resultados del análisis genético de la población AJ para las deleciones e inserciones asociadas con SMN1, junto con una determinación de la frecuencia de portadores silenciosos (2+0) de mutaciones de SMN1 asociadas con AME. En el Ejemplo 3 se desvelan los resultados de los análisis genéticos de los grupos de mutación por deleción (1+0) y duplicación (2+1) en la población AJ. El ejemplo 4 desvela la reconstrucción de haplotipos en individuos con deleciones (1+0) o duplicaciones (2+1). El ejemplo 5 describe la secuenciación del alelo de duplicación principal en la población AJ, la identificación de dos polimorfismos adicionales y la caracterización de estos polimorfismos en varias poblaciones humanas. El ejemplo 6 proporciona los resultados de los análisis de RFLP basados en el SNP g.27134T> G del exón 7 de SMNl. El Ejemplo 7 desvela datos y análisis de los mismos que establecen la identificación mejorada de portadores de AME, por ejemplo, portadores de AME silenciosos (2 0), en varios grupos raciales y étnicos.

Ejemplo 1

Recolección de muestras y aislamiento de ADN

El ADN genómico se obtuvo con el consentimiento informado de las muestras de sangre periférica de individuos anónimos de ascendencia Judía Askernazi, Afroamericana, Hispana y Europea que viven en el área metropolitana de Nueva York. Se aisló el ADN utilizando el kit de purificación de ADN Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.

Amplificación de Sondas Dependiente de Ligandos Múltiples (MLPA)

Se utilizó un total de 200 ng de ADN genómico de cada muestra para el análisis de sondas dependiente de ligandos múltiples (MLPA) con el kit Salsa MLPA SMA P021 (MRC-Holanda, Ámsterdam, Países Bajos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR de MLPA se separaron por electroforesis capilar utilizando el analizador genético ABI-3130XL (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA). Los resultados se importaron como archivos html al software GeneMarker (Softgenetics, LLC., State College, PA) para el análisis de datos de MLPA utilizando la normalización de la población con la proporción de MLPA como procedimiento de análisis y la altura de pico como procedimiento de cuantificación. Las alturas de los picos para cada uno de los 38 productos de ligandos de la sonda MLPA en la muestra de prueba se compararon con las alturas de los picos promedio de al menos tres controles normales, y se determinaron las proporciones de picos de altura de muestra de prueba/tipo salvaje para cada producto de ligandos de la sonda. Las proporciones pico-altura menores que 0,8 y/o mayores que 1,3 indicarían la pérdida o ganancia del número de copias para cada sonda, respectivamente.

Análisis de Microsatélites

El análisis de microsatélites se realizó con los marcadores descritos anteriormente, D5S681, D5S435, D5S610, que flanquean los genes SMN1 y SMN2 en 5q13 (Scheffer y col., Eur. J. Hum. Genet. 9:484-494 (2001)). Tres marcadores nuevos, MS1 (SEQ ID NO:2), MS2 (SEQ ID NO: 3) y MS3 (SEQ ID NO: 4), se basaron en la secuencia genómica humana disponible públicamente usando la base de datos de genoma UCSC. Los siguientes pares de cebadores se diseñaron para amplificar MS1: MS1F(5'-TAAATGTCAAATTTATGTATGGG-3'; SEQ ID No :12) y MS1R (5-CTGTGATTGAAAC AAAGACACCT-3'; SEQ ID NO: 13); MS2: MS2F(5'-TCCATGGATACGGAGAGCTG-3'; SEQ ID NO:16) y MS2R (5'- TGATGGCACCACAACCATGC-3'; SEQ ID NO: 17; y MS3: MS3F (5'-TCAGGACCCTCCTCATCATC-3'; SEQ ID NO:18) y MS3R (5'- CGGGATCTCTTCTCCACAGA-3'; SEQ ID NO:19). Todos los cebadores directos fueron marcados con 6-carboxifluoresceína o marcados con 6-FAM (Invitrogen). Cada par de cebadores se amplificó por separado en un volumen total de 25 pl utilizando 200 ng de ADN genómico, tampón de PCR 1X (Invitrogen), MgCh 1,5 mM, cebadores directos e inversos 0,3 pM y 0,3 pl de polimerasa Taq de platino (Invitrogen). Las amplificaciones se iniciaron con 10 minutos a 94°C, seguidas de 35 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 58°C y 30 segundos a 72°C, con una extensión final de 10 minutos a 72°C. Los productos de PCR se diluyeron a 1:10 y se procesaron en un analizador de ADN ABI 3730 (Applied Biosystems) y se analizaron los resultados con el software GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems).

PCR de largo alcance y Secuenciación

Se llevó a cabo la PCR de largo alcance que abarca el fragmento entre el exón 7 y el exón 8 (1025 pb) del gen SMN1 en individuos AJ identificados con tres copias del gen SMN1 por MLPA utilizando reactivos de ^pC^rde largo alcance (Qiagen) con cebadores SMN1-E7F (5 '-TCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3'; SEQ ID NO:20) y SMN1-E8R (5'-CTGTGATTGAAAC CCATGTCCAC-3'; SEQ ID NO:21). Se diseñó el cebador SMN1-E7F para amplificar preferentemente SMN1 mediante la inclusión de c.840C del Exón 7 en el extremo 3'. La amplificación por PCR se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante en 50 pl de mezcla de reacción que contenía dNTP 500 mM, tampón de PCR 1X, MgCl²2,5 mM, 2 unidades (U) de enzima de largo alcance, 400 nM de cada cebador y 250 ng de ADN purificado. Después de 3 minutos de desnaturalización a 93°C, se llevaron a cabo 35 ciclos de amplificación de la siguiente manera: 15 segundos a 93°C, 30 segundos a 59°C y 1,5 minutos a 68°C.

Los amplicones de PCR se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen). El fragmento se secuenció utilizando el kit de secuenciación de ciclos BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems) y los productos se procesaron en el secuenciador automático ABI 3730 (Applied Biosystems). Se usaron también los mismos cebadores utilizados para la amplificación por PCR en las reacciones de secuenciación. Se diseñaron los cebadores adicionales SMN1-I7F2 (5-AGGAAATGC TGGCATAGAGC-3 '; SEQ ID NO:22) y SMNE8Ra (5'-CTGCTCTATGCCAGCATTTC-3'; SEQ ID NO:23) para confirmar los resultados de la secuencia en ambas direcciones. Se analizaron las trazas de secuencia utilizando el software Mutation Surveyor v3.01 (SoftGenetics) y Sequencher ™ versión 4.8 (Gene Codes, Ann Arbor, MI) y mediante examen visual.

Clonación de TA

Se sometieron a clonación de TA los fragmentos de PCR de largo alcance (1025 pb) de cinco alelos de duplicación mayor de AJ (2+1) (ver a continuación). En resumen, se purificaron los amplicones en gel (Qiagen) y se clonaron en el vector de PCR del kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se aislaron doce clones de cada uno de estos individuos portadores de duplicación para el análisis por PCR. Se subcultivaron los clones con el tamaño de inserto esperado (1025 pb) posteriormente y se purificaron los plásmidos utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) y se secuenciaron como se describe anteriormente utilizando cebadores M13 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

Análisis de Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP)

Se realizaron reacciones de PCR para amplificar un fragmento de 372 pb que contiene la alteración de un nucleótido único g.27134T> G con los cebadores SMN1-E7F (arriba) y SMN1-I7R1 (5 'AAAAGTCTGCTGGTCTGCCTAC-3'; SEQ ID NO:24). La amplificación se llevó a cabo en una mezcla de reacción de 25 pl con 400 nM de cada cebador, dNTP 200 pM, MgCl²1.5 mM y 1 U de ADN polimerasa Platinum®Taq (Invitrogen, Carlsbad, California). Las condiciones de ciclos fueron las siguientes: 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 59°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto y una extensión final de 72°C durante 10 minutos. La alteración de un nucleótido único g.27134T> G dio lugar a una ganancia de un sitio de restricción para la enzima HypCH4III. Después de la amplificación, se digirieron 5 pl de producto de PCR con 4 U de HypCH4III (New England Biolabs, Ipswich, MA) a 37°C durante 4 horas y se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% o gel de agarosa al 1,5%, visualizado con transiluminador UV y fotografiado.

Análisis estadístico

Las frecuencias de genotipo para cada marcador de microsatélites se probaron para el equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) utilizando el análisis X2. Los haplotipos de los marcadores, D5S681-D5S435-MS1-D5S610, se estimaron para los controles AJ y AJ con deleción de SMN1 (1+0), duplicación (2+1) y silenciosos (2+0) utilizando SAS/Genetics versión 9.2. Se proporcionan en la Tabla 8 las longitudes de los diversos alelos para cada marcador de microsatélites. Los haplotipos supuestos se infirieron a partir de su frecuencia entre todos los individuos examinados y se reconstruyeron en función de la combinación más probable de alelos. Se analizaron las diferencias en las frecuencias de haplotipos entre la cohorte de control AJ y la cohorte individuos AJ con deleción o duplicación de SMN1 mediante análisis X2. Los valores de P para las comparaciones globales y por pares se calcularon para los cuatro haplotipos marcadores con el umbral de 0,05 considerado estadísticamente significativo. Se estimó la mejora en la tasa de detección con la adición de nuevos marcadores utilizando el enfoque bayesiano.

Ejemplo 2

Análisis de población AJ para deleciones y duplicaciones de SMB1

Para determinar la frecuencia de individuos con deleción (1+0) y duplicación (2+1) de AME en la población AJ, se examinaron 692 individuos de ascendencia 100% AJ (con cuatro abuelos AJ) mediante un ensayo MLPA específico de SMN1 y SMN2, que detecta el número de copias de 38 regiones genómicas diferentes en una sola reacción. Específicamente, este ensayo determinó los números de copias individuales de SMN1 y SMN2 exón 7 y exón 8 para cada uno de SMN1 y SMN2, así como el número combinado de copias SMN1 y SMN2 de sus respectivos exones 1, 4, 6 y 8. Se identificaron quince portadores de deleción de SMNl (1+0) (1 de 46 o 2.1%), que es similar a la frecuencia reportada en otras poblaciones europeas. No obstante, Se identificaron 99 individuos con duplicación de SMN1 (2+1) (1 de 7 o 14%), que es el doble de la frecuencia en los europeos. No se identificaron individuos con cuatro copias de SMN1 (es decir, dos alelos de duplicación, 2+2), aunque la frecuencia esperada de individuos (2+2) fue de 0.5% (Tabla 2). Las frecuencias observadas no se desviaron significativamente del equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) (p> 0,05 exacto) y se muestran en la Tabla 1 junto con las frecuencias esperadas.

Frecuencia de portadores silenciosos AJ (2+0)

Utilizando la frecuencia de deleciones (1+0) (2.2%) y duplicaciones (2+1) (14.3%), asumiendo el equilibrio de HardyWeinberg para cada uno de los tres alelos (SMN1 = 0, 1 o 2 copias), se estimó que los portadores silenciosos (2 0) se producen a una frecuencia de 2pr, (donde p es la frecuencia de 1 copia del alelo de tipo salvaje (WT) y r es la frecuencia de 0 copias o alelos de deleción) que fue de 1 en 531 individuos AJ. Basándose en este cálculo, la frecuencia global de portadores para AME entre los individuos AJ fue aproximadamente 1 de 41.1 (2.4%), lo que incluye portadores identificados por MLPA con pérdida de una copia de SMN1 (1+0), portadores silenciosos (2+0) no detectados por procedimientos sensibles a la dosis, sensibles a la ubicación y la pequeña fracción de individuos que portan mutaciones intragénicas (0.00047). Estos valores asumen que r2 es 0,00014 (Pearns, J Med Genet 15: 409 413 (1978)) y que el 2% de los individuos afectados tienen una mutación intragénica, como se informó anteriormente (Wirth y col., 1999). La tasa de detección de portadores en la población AJ mediante ensayos de MLPA fue de aproximadamente el 90% basándose en este análisis con aproximadamente un 8% de portadores silenciosos (2+0) y aproximadamente un 2% de portadores de mutación intragénica. Por lo tanto, el riesgo residual de ser un portador después de un resultado de análisis negativo fue 1/402 (Tabla 2).

Ejemplo 3

Grupos de mutación entre AJ con Deleciones (1+0) o Duplicaciones (2+1)

Se identificaron un total de 23 portadores AJ de deleción (1+0) para estos estudios, incluidos 15 del análisis de la población descrito anteriormente y ocho que fueron identificados posteriormente por MLPA. Se encontraron cuatro grupos principales de mutación: 1del) solamente deleción de SMN1; 2del) deleciones de SMN1 y SMN2; 3del) deleciones de los exones 7 y 8 de SMN1 y deleción de SMN2, o una deleción de SMN1 y deleción de los exones 7 y 8 de SMN2, y 4del) deleción de los exones 7 y 8 de SMN1 solamente (Tabla 5). De forma interesante, el 32% de los individuos AJ con dos copias de SMN1 portaban una deleción de SMN2, lo que indica que la pérdida de SMN2 es un polimorfismo común en la población AJ y que puede haber una superposición significativa entre los grupos 1del y 2del.

Para el grupo de duplicación de ganancia de copia, fueron analizados un total de 72 individuos AJ con duplicación (2+1) por MLPA, incluyendo tres con cuatro copias SMN1 (2+2), y se identificaron tres grupos principales: 1dup) tres copias SMN1 sin copia SMN2; 2dup) tres copias SMN1 con una copia SMN2, y 3dup) tres copias SMN1 con dos copias SMN2 (Tabla 6). De los 72 individuos con duplicación (2+1) examinados, 26 (36.1%) no tenían copias de s MN2 y los 32 adicionales (44.4%) tenían una copia SMN2, lo que indica que la duplicación en estos 58 individuos surgió por un evento de conversión de genes que reemplaza secuencias SMN2 con secuencias SMN1. Como se señala en el presente documento, puede haber una superposición significativa entre los grupos 1dup y 2dup debido a la alta incidencia de deleciones de SMN2. De los individuos con duplicación de SMN1 (2+1), 11 (15,3%) tenían dos copias de SMN2 y, sin desear quedar ligado a teoría alguna, se espera que esas duplicaciones surjan por un mecanismo diferente, como la recombinación homóloga no alélica (NAHR) o un evento de conversión de genes en individuos con duplicación de SMN2. Las duplicaciones de SMN2 no son infrecuentes, y se observaron por MLPA en la población AJ con una frecuencia de 1 de 38 (2.6%).

Ejemplo 4

Reconstrucción de haplotipos en AJ con Deleciones (1+0) o Duplicaciones (2+1)

Para determinar si los haplotipos fundadores estaban presentes para los alelos de eliminación de SMN1 (1+0), fueron genotipificados 20 portadores de los grupos 1del, 2del y 3del (véase Ejemplo 3) que fueron identificados por MLPA con seis marcadores de microsatélites que abarcan 3.9 Mb en 5q13.2 que rodea el locus SMN1. Incluyeron D5S681 (Genbank NT_006713.15; SEQ ID NO:5), D5S435 (Genbank NT_006713.15; SEQ ID NO:6) y D5S610 ( NT_006713.15; SEQ ID NO: 7) que flanquean los genes SMN1 y SMN2 (Scheffer y col., 2001), y tres marcadores nuevos, MS1 (Genbank NT006713.15; SEQ ID NO:2), MS2 (Genbank NT006713.15; SEQ ID NO:3) y MS3 (Genbank NT006713.15; SEQ ID NO: 4) que se crearon a partir de la secuencia de referencia genómica humana disponible públicamente utilizando el navegador de base de datos del genoma UCSC. Se presenta una representación esquemática de esta región del genoma humano en la Fig. 2. Usando estos marcadores, se genotipificaron 78 individuos AJ control con dos copias de SMN1 (1 1). Según estos resultados, los cuatro loci consecutivos elegidos para los estudios de asociación de marcadores fueron D5S681-D5S435-MS1-D5S610. Sus configuraciones de marcadores más probables se muestran en la Tabla 3. Los haplotipos para estos marcadores se construyeron para los 20 portadores de deleción de SMN1 (1+0), incluidos todos los individuos de los grupos 1del, 2del y 3del (Tabla 5). El grupo 4del fue excluido porque los tres individuos solamente tuvieron pérdida de las secuencias de los exones 7 y 8.

Se enriquecieron significativamente dos supuestos haplotipos fundadores (p<0,001) en los portadores de deleción (1+0) en comparación con los controles. La combinación de alelos más común entre los 20 (1+0) portadores examinados, 2-5-4-5, fue asignada en 22,5% de los portadores y era posible en ocho portadores adicionales (40%). El haplotipo 2-5-4-5 también se asignó a un solo cromosoma de 78 controles (0,6%), lo que indica que este haplotipo no fue específico de los alelos de deleción. El otro haplotipo de alelo específico de portador, 2-1-4-5, no se asignó a ningún individuo control; sin embargo, dos individuos control podrían potencialmente portarlo. Uno de los portadores del grupo 4del con la deleción de los exones 7 y 8 de SMN1 solo podría tener el haplotipo 2-5-4-5, lo que indica que puede no ser específico a los alelos de pérdida de copia del gen completo de SMN1 o que puede ser el haplotipo de alelo de tipo salvaje en el portador no. 23 (Tabla 5).

Para analizar los individuos con duplicación (2+1) para los haplotipos compartidos únicos, se genotipificaron seis marcadores de microsatélites en 69 de los 99 individuos AJ identificados con tres copias de SMN1 y en tres individuos AJ adicionales que posteriormente se identificaron con cuatro copias de SMN1 (Tabla 6). Se utilizaron los mismos cuatro genotipos de marcadores, D5S681-D5S435-MS1-D5S610, en la reconstrucción de haplotipos para 42 individuos con duplicación (2+1) de los grupos 1dup y 2dup. De estos, 26 individuos tenían tres copias de SMN1 y ninguna copia de SMN2 y 16 tenían tres copias de SMN1 y una copia de SMN2; 31 de estos individuos con duplicación (2+1) seleccionados para el análisis tenían el alelo 6 de MS1 (Tabla 8). Se realizó un análisis separado para los nueve individuos del grupo 3dup que portaban tres copias SMN1 y dos copias SMN2, ya que probablemente representaban un grupo de duplicación separado.

Los haplotipos de marcadores más probables para los tres grupos se muestran en la Tabla 3. Un haplotipo de marcador de duplicación principal, 2-5-6-10, se enriqueció significativamente en los Grupos 1dup y 2dup (19%). Este haplotipo estuvo completamente ausente en la población de control y fue altamente específico para los portadores de duplicación (p <0,0001). De los 58 individuos del grupo 1dup y 2dup, 23 (39.7%) tenían el haplotipo completo de cuatro marcadores y ocho (13.8%) tenían el haplotipo parcial 2-5-6. Además, uno de los individuos del grupo 3dup (no. 59, Tabla 6) tenía el haplotipo 2-5-6-10 que indica que este individuo probablemente portaba una duplicación de SMN2 en el alelo de tipo salvaje. El haplotipo de duplicación principal también fue positivo en dos de los individuos con cuatro copias de SMN1, una de las cuales fue homocigótica para el haplotipo 5-6-10 (n° 70, Tabla 6). Hubo dos haplotipos que se enriquecieron significativamente en los individuos del grupo 3dup, 2-5-4-5 y 2-5-9-4, en comparación con los controles (p <0,0001). El haplotipo 2-5-4-5 fue también el haplotipo de deleción principal, que también estaba presente en una pequeña fracción de los controles.

Ejemplo 5

Secuenciación del Alelo de Duplicación de AJ Principal

Varios supuestos haplotipos fundadores de AJ se infirieron de manera informática en los alelos de deleción y duplicación de SMN1. Solo el haplotipo de duplicación principal, 2-5-6-10, o el haplotipo parcial, 2-5-6, estuvo presente en la mayoría (51.7%) de individuos AJ con duplicación (2+1) con 0 o 1 copia de SMN2 genotipificado (Tabla 6) y estuvo ausente en la población AJ control. El alelo de duplicación principal se examinó adicionalmente mediante secuenciación. Se amplificó un fragmento de 1025 pb específico para SMN1 entre los exones 7 y 8 de cinco individuos AJ diferentes con el alelo de duplicación principal utilizando el cebador SMN1-E7F, que incluye c.840C en el extremo 3' y el cebador SMN1-E8R (Fig. 3A ).

Se identificaron dos variantes de secuencia en el gen SMN1, g.27134T> G en el intrón 7 y g.27706_27707delAT en el exón 8 (véase el número de registro en Genbank NG_008691.1; Fig. 3B). Ninguno de estos polimorfismos ha sido presentado previamente en la base de datos NCBI ENTREZ (SNP). Un análisis de secuencia adicional indicó que ambos polimorfismos estaban presentes en todos los individuos que portaban el haplotipo de duplicación principal (2-5-6-10) o haplotipo parcial (2-5-6) y estaban ausentes de todos los demás individuos con duplicación. Por lo tanto, cada una de estas secuencias polimórficas solas es diagnóstica de duplicación, al igual que la combinación de ambas secuencias de polimorfismo. Usando una combinación de PCR de largo alcance y análisis de clonación de TA, la presencia de los dos polimorfismos dentro del mismo clon en los 12 individuos con duplicación (2+1) probados indicó que estos polimorfismos residían en el mismo alelo SMN1. No se identificaron otras variantes de secuencia específicas para el alelo de duplicación principal dentro de los 1025 pb que se analizaron.

La secuenciación de 1025 pb entre el intrón 7 y el exón 8 de SMN1 en individuos que portaban el haplotipo de duplicación principal identificó dos polimorfismos estrechamente vinculados, es decir, g.27134T> G en el intrón 7 y g.27706_27707delAT en el exón 8. Ninguno de estos polimorfismos ha sido descrito en la literatura o en la base de datos NCBI ENTREZ (SNP) como encontrado en o asociado con los genes SMN1 o SMN2. La transversión de g.27134T> G introdujo un sitio de restricción hpyCH4III que estaba presente en la mayoría de los individuos con duplicación (2+1), pero no en ninguno de los 315 controles AJ sanos probados (1+1). Por lo tanto, un individuo AJ con dos copias de SMN1 determinado por MLPA (u otro procedimiento sensible a la dosis) que sea positivo para el sitio de escisión hpyCH4III generado de g.27134T> G y su polimorfismo vinculado en g.27706_27707delAT, es altamente probable que sea un portador SMN1 silencioso (2+0). Por lo tanto, la detección de g.27134T> G y/o g.27706_27707delAT aumentaría la detección de portador de AME en la población AJ del 90% al 94% y reduciría el riesgo residual después de un resultado negativo de análisis de portadores de 1 de aproximadamente 400 a 1 de aproximadamente 700 (Tabla 2). Debido a que el 83,5% (tabla 1) de los individuos AJ tendrá un resultado negativo de análisis de portadores (con dos copias de SMN1), este ensayo se puede realizar de forma rutinaria para detectar los portadores silenciosos (2+0) entre ellos, lo que aumenta la detectabilidad del portador de AME. Un experto reconocerá, además, que se pueden realizar análisis de RFLP convenientes para detectar portadores de AME con cualquier endonucleasa de restricción que tenga un sitio que dependa de la presencia o ausencia de un alelo marcador que abarque ese sitio. Por lo tanto, HpyCH4III distinguirá los alelos de tipo salvaje de los alelos que albergan la transversión g.27134T> G, al igual que cualquier otra endonucleasa de restricción que requiera la "T" o la "G" en la posición 27134. En la presente divulgación se contemplan todas estas realizaciones del análisis basadas en RFLP o los ensayos basados en diagnóstico.

De forma interesante, los dos polimorfismos vinculados también estaban presentes en diferentes frecuencias entre AA, AS y HI, pero no en la población Europea. En las poblaciones AA, AS y HI, los polimorfismos de g.27134T> G y g.27706_27707 fueron más frecuentes en individuos con duplicación (2+1) que en aquellos con 1 o 2 copias de SMN1. Por ejemplo, en la población AS, los polimorfismos vinculados fueron exclusivos de individuos con duplicaciones de SMN1, aunque solo estuvieron presentes en aproximadamente el 11,5% (3 de 26) de los alelos de duplicación examinados. La prueba de estos polimorfismos aumentaría la detección de portadores de AME en aproximadamente un 0,7% en la población AS y aumentaría la detectabilidad del portador a aproximadamente el 93,3% (Tabla 2). En las poblaciones AS y HI, los polimorfismos vinculados no eran específicos de los alelos de duplicación y estaban presentes en una minoría de alelos de copia única SMN1. La población AA tiene la tasa más baja de detección de portadores de AME (71%) debido a la alta prevalencia de alelos de duplicación. Tanto g.27134T> G como g.27706_27707delAT estuvieron presentes en la mayoría de los alelos de duplicación AA (83.7%), lo que indica que probablemente surgieron de un alelo antiguo que participó en el evento original de conversión/recombinación de genes que llevó a la duplicación de SMN1, que está presente en las poblaciones AJ, AA, AS y HI. Ninguno de los individuos con duplicación (2+1) examinados en las poblaciones AA, Hⁱo AS que tenían los polimorfismos g.27134T> G y g.27706_27707delAT tenían el alelo 6 del marcador de MS1, que estaba presente en todos los individuos AJ con el haplotipo de duplicación principal. Se espera que el examen del haplotipo SNP de SMN1 extendido en individuos con g.27134T> G y g.27706_27707delAT permita la estimación de la fecha de origen del alelo de duplicación y confirme si es de origen similar en otras poblaciones. La expansión de estos estudios a grupos étnicos o demográficos adicionales será útil para encontrar haplotipos específicos que delimitan las deleciones o duplicaciones de SMN1 y facilitan la identificación de portadores silenciosos (2+0) que actualmente escapan a la detección.

Ejemplo 6

Análisis de RFLP para el polimorfismo g.27134T> G (Intrón7)

La digestión de los amplicones de PCR que contienen el polimorfismo g.27134T> G con hpyCH4III reveló una ganancia de sitio de restricción (Fig. 3C) atribuible al polimorfismo. El análisis de RFLP de 315 individuos AJ control con dos copias de SMN1 reveló que ninguno tenía el sitio de restricción hpyCH4III, lo que indica que el polimorfismo era específico del alelo principal de duplicación de AJ. De forma interesante, el individuo n° 69 (Tabla 6), que era homocigoto para la combinación de alelos 2-5-6-10 (Tabla 6) con cuatro copias de SMN1 y sin copias de SMN2, era heterocigoto para el sitio de restricción, produciendo fragmentos tanto no digeridos (391 pb) como digeridos (153 pb y 218 pb) después de la exposición a hypCH4III, consistente con el polimorfismo que está presente en una sola copia de la duplicación de SMN1. Este hallazgo también confirmó la heterocigosidad observada para los polimorfismos g.27134T> G y g.27706_27707delAT entre todos los individuos AJ con duplicación (2+1) que se secuenciaron. Un total de 49 de los 99 individuos con duplicación (2+1) identificados durante el análisis de la población portaban el polimorfismo 27134T> G tal y como se determinó por el análisis de RFLP. Por lo tanto, la prueba de este polimorfismo en la población AJ aumentaría la detección de portadores de AME en aproximadamente un 4%, identificando aproximadamente la mitad de los portadores silenciosos (2+0), para una tasa de detección total del 94%. Además, el riesgo residual de ser un portador de AME después de un resultado del análisis negativo disminuiría de 1 de aproximadamente 400 a 1 de aproximadamente 700.

Para determinar si el polimorfismo g.27134T> G también estaba presente en los alelos de duplicación de SMN1 en otros grupos étnicos, se realizaron análisis de MLPA y RFLP en ADN genómicos de 276 individuos afroamericanos (AA), 250 asiáticos (AS), 262 hispanos (HI) y 137 europeos (UE). Los resultados, resumidos en la Tabla 4, indican que g.27134T> G estaba presente en alelos de duplicación en todas las poblaciones examinadas, excepto para los individuos de la UE. En la población AA, el RFLP se observó en individuos con 1, 2, 3 o 4 copias de SMN1, lo que indica que no es específico de sus alelos de duplicación. Sin embargo, la mayoría (81%) de los individuos AA con duplicación (2+1), eran heterocigotos para g.27134T> G, mientras que solo el 21% de los individuos con dos copias (1 1) de SMN1 eran positivos para el polimorfismo. Cabe destacar que, uno de los cinco AA portadores de deleción fue positivo para el RFLP, probablemente en el alelo de tipo salvaje. De forma similar, el RFLP estaba presente en aproximadamente la mitad de los individuos HI con duplicación (2+1), pero también estaba presente en aproximadamente el 5,5% de los alelos de tipo salvaje. Por el contrario, en la población AS, el RFLP no se encontró en alelos de tipo salvaje, pero estaba presente solamente en aproximadamente el 14% de los individuos con duplicación (2+1). La secuenciación se realizó en 142 individuos AA, 2 AS y 5 HI que resultaron positivos para el RFLP para confirmar que las variantes tanto g.27134T> G como g.27706_27707delAT estaban presentes en los alelos positivos para el RFLP. En todos los casos examinados, los dos polimorfismos se produjeron juntos dentro del mismo alelo SMN1, independientemente de cuántas copias de SMN1 estuvieran presentes.

Ejemplo 7

Identificación Mejorada de Portadores de AME en Varios Grupos Raciales y Étnicos

Los resultados prometedores desvelados en los ejemplos anteriores establecieron que el procedimiento de detección de cargas de SMN1 cromosómicamente desequilibradas, como el que se encuentra en los portadores de AME silenciosos (2+0), puede mejorar notablemente la identificación de portadores de AME en grupos étnicos y raciales, y en particular, en la población judía askenazi (AJ). Los datos mostraron además que la identificación de portador de AME mejoró en los asiáticos, y dio algunos indicios de que el procedimiento tenía un intervalo aún más amplio de mejorar la detección de cargas de SMN1 cromosómicamente desequilibradas en varios grupos étnicos y raciales. Los datos proporcionados en la Tabla 9 revelan los riesgos residuales de ser portadores después del análisis positivo y negativo para g.27134T> G en el intrón 7 y g.27706_27707delAT en el exón 8. Lo que se desprende de la Tabla 9 es que el procedimiento de identificación desvelado en el presente documento mejora la detección de cargas SMN1 cromosómicamente desequilibradas, llevando a una mayor detección de portadores de AME, tales como portadores silenciosos de AME (2+0), en una variedad de grupos étnicos y raciales, incluyendo AJ, Asiáticos, Afroamericanos e Hispanos.

Las implicaciones de estos resultados para el asesoramiento genético y la planificación familiar son importantes. Con el procedimiento desvelado en el presente documento, se puede hacer una evaluación más precisa del riesgo modificado de tener un hijo con AME si uno de la pareja es un portador conocido y el otro tiene dos copias de SMN1, como se desvela en la Tabla 10. Los datos muestran que añadir el procedimiento sensible a la dosis y sensible a la ubicación para identificar portadores de AME lleva a una reducción significativa en los resultados falsos negativos potencialmente devastadores, en los cuales los padres potenciales creen erróneamente que pueden reproducirse sin un riesgo significativo de descendientes con AME. Los datos en la Tabla 10 establecen que el beneficio de reducir la frecuencia de resultados falsos negativos atribuibles al procedimiento desvelado en el presente documento abarca grupos étnicos y raciales y, por lo tanto, tiene un valor generalizado para las poblaciones humanas.

Más allá de los polimorfismos desvelados en los ejemplos anteriores, se espera que los polimorfismos adicionales sean útiles para evaluar el riesgo residual de AME debido al estado de portador de uno o ambos padres. Tal como se catalogó en la Tabla 11, estos nuevos polimorfismos pueden ocurrir en todo el gen SMN1, incluidos los intrones 1, 2a, 6, 7 y 8. Con estos polimorfismos y los polimorfismos desvelados anteriormente, se minimiza el riesgo de error en la identificación del estado de portador de AME, lo que permite que los padres potenciales, guiados por asesores genéticos, estén mejor informados para tomar decisiones de planificación familiar.

Tabla 1. Análisis de portadores de SMN1 de 692 individuos judíos Askenazis Número de copias de Genotipo n _SMN1 % Esperado* (n) Esperado* (%)

0 0+0 0 0 0,1 0,01

1 1+0 15 2 14 2

2 1+1 578 84 583 84

2+0 - - 1 0,2

3 1+2 99 14 91 13

4 2+2 0 0,0 4 0,5

* Las frecuencias esperadas se calcularon utilizando el tipo salvaje observado (p2 con 2 copias de SMN1) y la frecuencia de portadores observada (2pq con 1 copia de SMN1) y la ecuación p2+2pq+q2+2qr+2pr+r2=1_____

Tabla 2 Detección de portadores de AME y Riesgo Residual con la adición de SMN1 g.27134T> G y

.277 277 7 lAT

Tabla 3 Análisis de haplotipos para Locus AME.

Marcador D5S681 D5S435 MS1 D5S610 Frecuencia de haplotipos Frecuencia de Valor p en WT, % (N=78) Haplotipos en Portadores, % Portadores 2 1 4 4 0 7,5 1,0 de deleción 2 1 4 5 0 10,0 0,001 de SMN1 2 5 4 5 0,6 22,5

(N=20) 2 5 7 5 1,4 5,0 0,19 Valor P general <,0001

Duplicación 2 3 7 5 0 4,7 0,01 de SMN1 2 5 3 4 2,6 3,6 0,12 (continuación)

Marcador D5S681 D5S435 MS1 D5S610 Frecuencia de haplotipos Frecuencia de Valor p en WT, % (N=78) Haplotipos en Portadores, % Grupos 2 5 6 0 19,0 <.

1dup y 2dup 0001 (N = 42) 2 5 9 1,8 4,8 0,19

4 3 4 0 3,4 0,03 4 5 4 0,8 3,6 0,003

Valor P general <,0001

Duplicación 2 4 9 5 0 5,6 0,035 de SMN1 2 5 4 5 0,6 11,1

Grupo 3dup 2 5 7 2 0 5,6 1,0 (N=9) 2 5 9 4 0 16,7

4 1 4 10 0 5,6 1,0 4 5 4 9 1,8 11,1 0,02 6 4 4 5 0 5,6 0,025 7 3 2 5 0 5,6 0,003 Valor P general <,0001

Los haplotipos mostrados en negrita representan un significado en comparación con las frecuencias de tipo salvaje (WT) (2 copias). Solamente se muestran los haplotipos con una frecuencia superior al 3% en portadores.

Tabla 4 Datos del Análisis Poblacional RFLP de SMN1 para g.27134T> G Etnia ^{Número de c}

₁ ^{opias de}RFLP Negativo R _SMN FLP Heterocigoto RFLP Homocigoto Total Judía Askenazi 2 315 0 0 315

1 4 0 1 5 Afroamericana ^{2 108 26 2 136}

_{3 21 86 4 111}

Asiática ^{2 222 0 0 222}

_{3 20 2 0 22}4 1 1 0 2 1 1 0 0 1 Hispana ^{2 206 12 1 219}

_{3 20 20 0 40}4 0 2 0 2 1 12 0 0 12 Europea ^{2 413 2 0 415}

_{3 23 4 0 27}4 2 2 0 4

Tabla 5 Análisis de Microsatélites de los Portadores de Deleción AJ

continuación

Tabla 6 Análisis de Microsatélites de los Portadores de Du licación AJ

continuación

continuación

Tabla 7 Análisis de Microsatélites de los^ Controles AJ - 2 co ias de SMN1

(continuación)

Tabla 8 Lon itudes de marcadores alélicos

Tabla 9 Detección de portadores de AME y Riesgo Residual con la adición de SMN1 g.27134T> G y

.277 277 7 lAT

Tabla 10 Riesgo de tener un hijo con AME si un miembro de una pareja es un portador conocido y el otro tiene dos co ias de SMN1

Claims

REIVINDICACIONES

(a) analizar un ácido nucleico de una muestra de un sujeto humano determinando

(i) el nucleótido correspondiente a la posición 11678 de la SEQ ID NO: 1 no es G o hay un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 11678 y 11679 de la SEQ ID NO: 1;

(ii) el nucleótido correspondiente a la posición 15774 de la SEQ ID NO: 1 no es G o hay un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 15774 y 15775 de la SEQ ID NO: 1;

(iii) el nucleótido correspondiente a la posición 22804 de la SEQ ID NO: 1 no es G o hay un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 22804 y 22805 de la SEQ ID NO: 1;

(iv) el nucleótido correspondiente a la posición 26190 de la SEQ ID NO: 1 no es A o hay un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 26190 y 26191 de la SEQ ID NO: 1;

(v) el nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1 no es T o hay, al menos, un nucleótido insertado entre los nucleótidos correspondientes a las posiciones 27134 y 27135 de la SEQ ID NO: 1; o

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el sujeto humano se identifica como un portador de un alelo de duplicación de SMN1 basándose en la presencia de una estructura de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en una T correspondiente al nucleótido en la posición 11678 o 11679 de la SEQ ID NO: 1, una A correspondiente al nucleótido en la posición 15774 o 15775 de la SEQ ID NO: 1, una A correspondiente a la posición 22804 o 22805 de la SEQ ID NO: 1, una G correspondiente al nucleótido en la posición 26190 o 26191 de la SEQ ID NO: 1, una G correspondiente al nucleótido en la posición 27134 o 27135 de la SEQ ID NO: 1 y una deleción AT correspondiente a los nucleótidos en las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1.

(a) analizar un ácido nucleico de una muestra de un sujeto humano determinando

(b) identificar un individuo como un portador silencioso (2+0) de AME si el nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1 no es una T o si está delecionado el dinucleótido A-T correspondiente a las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1, o ambas cosas.

4. El procedimiento según la reivindicación 3 que comprende:

(b) determinar además si se ha delecionado el dinucleótido A-T correspondiente a las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1; y

(c) identificar un individuo como un portador silencioso (2+0) de AME si el nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1 es G o si está delecionado el dinucleótido A-T correspondiente a las posiciones 27706-27707 de la SEQ ID NO: 1.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la identidad del nucleótido correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1 y las identidades de los nucleótidos correspondientes a las posiciones 27706 y 27707 de la SEQ ID NO: 1 se determinan mediante polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que se identifica una G en la posición correspondiente a la posición 27134 de la SEQ ID NO: 1 por polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción utilizando la endonucleasa de restricción HpyCH4III.