ES2695101T3

ES2695101T3 - Análisis automatizado de células tumorales circulantes

Info

Publication number: ES2695101T3
Application number: ES12816215T
Authority: ES
Inventors: Gary Pestano; Ryan Dittamore; Karl Garsha; Michael Otter; Chol Yun; Alexandra Dea Nagy
Original assignee: Ventana Medical Systems Inc
Current assignee: Ventana Medical Systems Inc
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2019-01-02
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: EP2798355B1; US20160349262A1; WO2013101989A1; EP2798355A1; US20130171642A1; DK2798355T3; US10082508B2

Abstract

Un procedimiento de análisis de una muestra que contiene células tumorales circulantes (CTC) usando un instrumento automatizado, que comprende: depositar una muestra de un sujeto con cáncer de próstata sobre un sustrato configurado para su uso con el instrumento automatizado, fijar la muestra con formol al 0,4 % durante 1 a 5 minutos seguido de formol tamponado neutro (FTN) al 10 % durante 5 a 15 minutos y metanol durante 1 a 5 minutos, permeabilizar la muestra con Tween 20 al 0,2 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS), retener al menos un 90 % de las CTC en la muestra sobre el sustrato tras la fijación y permeabilización, disponer el sustrato en el instrumento automatizado, recuperar las dianas de moléculas de proteína y ácido nucleico en la muestra, en el que la recuperación se hace mediante el instrumento automatizado, en el que la recuperación comprende: (i) poner en contacto la muestra con reactivos de identificación de CTC, en el que el contacto de la muestra con reactivos de identificación de CTC se hace mediante el instrumento automatizado, (ii) poner en contacto la muestra con sondas de ácido nucleico dirigidas al gen relacionado con ETS (ERG), homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN) y centrómero 10 (CEN-10), en el que el contacto de la muestra con las sondas de ácido nucleico se hace mediante el instrumento automatizado, obtener imágenes de la muestra, (iii) localizar las CTC en la muestra sobre el sustrato localizando los reactivos de identificación de CTC, en el que los reactivos de identificación de CTC son reactivos inmunohistoquímicos dirigidos a una proteína CD45, una proteína citoqueratina (CQ), una proteína ERG, un receptor androgénico (RA), una proteína PSMA, o combinaciones de los mismos, en el que la localización de los reactivos inmunohistoquímicos se hace mediante el instrumento automatizado, y (iv) obtener imágenes espectrales de las CTC por localización para detectar las sondas de ácido nucleico, en el que la obtención de imágenes espectrales de las CTC se hace mediante el instrumento automatizado, y analizar la muestra analizando las imágenes espectrales y los reactivos de caracterización de CTC detectados.

Description

DESCRIPCION

Analisis automatizado de celulas tumorales circulantes

Campo

La divulgacion proporciona procedimientos para la caracterizacion automatizada de celulas tumorales circulantes (CTC), por ejemplo, usando sistemas de tincion de tejidos automatizados.

Antecedentes

Las celulas tumorales circulantes (CTC) son celulas del tumor primario que se han propagado al sistema vascular y estan potencialmente presentes en el cuerpo, en particular, en el torrente circulatorio. Las CTC pueden servir como moleculas de partida para las metastasis en localizaciones divergentes del tumor primario, lo que plantea un riesgo sustancial para la salud del enfermo de cancer. La investigacion indica que las CTC derivan de clones en el tumor primario y que desempenan un papel importante en la diseminacion metastasica de los carcinomas. Se ha demostrado que las CTC reflejan las caracterlsticas moleculares de las celulas en el tumor primario, posibilitando, por tanto, la caracterizacion del tumor sin una biopsia del tumor primario. Las CTC tambien representan metastasis en accion, y, por lo tanto, el seguimiento y el analisis de las CTC son indicativos del estado de la enfermedad del enfermo. Las CTC no se analizan facilmente porque estan presentes en numeros muy pequenos en la sangre. Por ejemplo, las CTC se pueden encontrar en frecuencias de aproximadamente 1-10 CTC por ml de sangre entera en enfermos con una enfermedad metastasica. Este pequeno numero contrasta con los demas componentes celulares en un ml de sangre (por ejemplo, algunos millones de globulos blancos, mil millones de globulos rojos). Por tanto, usar CTC para propositos de diagnostico depende de la capacidad para aislar o identificar las CTC dentro en una amplia matriz de otras celulas. Ademas, la escasez de las celulas en una muestra potencia el valor de la muestra como dianas anallticas. En la actualidad, se sabe que las CTC estan presentes en varios canceres epiteliales (por ejemplo, de mama, prostata, pulmon y colon) y las pruebas clinicas indican que los enfermos con lesiones metastasicas tienen mas probabilidad de tener CTC aislables.

Attard et al. (Cancer Research 2009, 69(7): 2912-2918) divulgan el aislamiento de las CTC con un procedimiento de seleccion inmunomagnetica anti-EpCAM, que se analizan posteriormente en ensayos de hibridacion in situ con fluorescencia (FISH). Para estos ensayos, las muestras se fijaron usando metanol/acido acetico 3:1.

Leversha et al. (Clinical Cancer Research 2009, 15(6): 2091-2097) divulgan la caracterizacion de la alteracion del numero de copias genicas mediante el ensayo de FISH con CTC. Sin proporcionar ningun dato adicional, Leversha et al. divulgan el uso de un “fijador para citologla” en relacion con la fijacion de las CTC.

Xueying et al. (Asian Journal of Andrology 2008, 10(3): 467-473) abordan el analisis de la frecuencia de las fusiones genicas TMPRSS2:ERG y TMPRSS2:ETV en las CTC de enfermos de cancer de prostata. La fijacion de las CTC se realiza dejando caer las CTC sobre portaobjetos de vidrio y fijandolas in situ con etanol.

El documento WO 2009/051734 divulga dispositivos basados en microchips que pueden capturar CTC en una unica etapa a partir de sangre entera. Esto se logra, entre otras cosas, sin fijacion previa o cualquier otra etapa de procesamiento. Sin embargo, se describe un procedimiento de fijacion de las CTC capturadas en el documento WO 2009/051734 que es, sin embargo, un tratamiento con PFA al 1 % en PBS seguido de una etapa de lavado con Triton X-100 al 0,2 % en PBS para inducir la permeabilidad celular. Aunque el documento WO 2009/051734 trata sobre la mejora de la captura de las celulas CTC, se centra en el uso de dispositivos con determinadas estructuras microfluldicas que proporcionan la captura de un gran numero de CTC viables en una muestra.

Sumario

Se proporcionan procedimientos para analizar una muestra que se sabe o sospecha que contiene celulas tumorales circulantes (CTC) usando un instrumento automatizado. Ademas, en el presente documento se proporcionan procedimientos de caracterizacion del cancer de prostata.

El procedimiento de analisis de una muestra que contiene celulas tumorales circulantes (CTC) usando un instrumento automatizado comprende: depositar una muestra de un sujeto con cancer de prostata sobre un sustrato configurado para su uso con el instrumento automatizado, fijar la muestra con formol al 0,4 % durante 1 a 5 minutos seguido de formol tamponado neutro (FTN) al 10 % durante 5 a 15 minutos y metanol durante 1 a 5 minutos, permeabilizar la muestra con Tween 20 al 0,2 % en solucion salina tamponada con fosfato (PBS), retener al menos un 90 % de las CTC en la muestra sobre el sustrato tras la fijacion y permeabilizacion, disponer el sustrato en el instrumento automatizado, recuperar las dianas de moleculas de protelna y acido nucleico en la muestra usando el instrumento automatizado poniendo en contacto la muestra con reactivos de identificacion de CTC usando el instrumento automatizado, y poniendo en contacto la muestra con sondas de acido nucleico dirigidas al gen relacionado con ETS (ERG), homologo de fosfatasa y tensina (PTEN) y centromero 10 (CEN-10), en el que el contacto de la muestra con las sondas de acido nucleico se hace mediante el instrumento automatizado, obtener imageries de la muestra, localizar las CTC en la muestra sobre el sustrato localizando los reactivos de identificacion de CTC usando el instrumento automatizado, en el que los reactivos de identificacion de CTC son reactivos inmunohistoquimicos dirigidos a una protelna CD45, una protelna citoqueratina (CQ), una protelna ERG, un receptor androgenico (RA), una protelna PSMA, o combinaciones de los mismos, obtener imagenes espectrales de las CTC por localizacion usando el instrumento automatizado para detectar las sondas de acido nucleico y analizar la muestra analizando las imagenes espectrales y los reactivos de caracterizacion de CTC detectados. En un ejemplo, el procedimiento incluye enriquecer el contenido de CTC de la muestra usando un anticuerpo de captura especifico para una protelna gen relacionado con ETS (ERG), una protelna antigeno prostatico especifico de membrana (PSMA) o una proteina molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM), en el que el enriquecimiento del contenido de CTC de la muestra se produce antes de depositar o disponer la muestra sobre el sustrato.

Ademas, en el presente documento se divulga que los reordenamientos del gen relacionado con ETS (ERG) y las deleciones del gen homologo de fosfatasa y tensina (PTEN), junto con el centromero 10 (CEN-10), se pueden detectar de manera simultanea o coincidente en las CTC, por ejemplo, usando sondas de acido nucleico marcadas (tales como las marcadas con puntos cuanticos). Los procedimientos se pueden automatizar. Basandose en si se detectan reordenamientos de ERG y/o deleciones de PTEN, se puede caracterizar un cancer de prostata.

Las sondas de acido nucleico se marcan, por ejemplo, con uno o mas puntos cuanticos. Por ejemplo, cada una de la(s) sonda(s) de acido nucleico especifica(s) para ERG, PTEN y CEN-10 se puede marcar con un punto cuantico diferente para permitir que las sondas se distingan entre si. Despues de permitir que las sondas de acido nucleico se hibriden a ERG, PTEN y CEN-10, se detectan senales del uno o mas puntos cuanticos en la una o mas sondas de acido nucleico, por ejemplo, usando imagenes espectrales. A continuacion, se analizan las senales para determinar si en las CTC aisladas se reordenan uno o mas ERG, si se delecionan uno o mas genes PTEN y si se detecta CEN-10. Basandose en si se reordenan uno o mas ERG, si se delecionan uno o mas genes PTEN y si se detecta CEN-10, se caracteriza el cancer de prostata.

La caracterizacion de un cancer de prostata puede incluir predecir la probabilidad de que el cancer de prostata responda a un tratamiento particular, tal como un inhibidor de la poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP) (tal como olaparib o MK4827), abiraterona u otro inhibidor de la via hormonal, o radioterapia, predecir la probabilidad de recidiva de la enfermedad despues del tratamiento (tal como una prostatectomia), predecir la probabilidad de progresion del cancer de prostata, predecir la probabilidad de metastasis del cancer de prostata, predecir la probabilidad del tiempo de supervivencia o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la caracterizacion de un cancer de prostata puede incluir predecir que el cancer de prostata respondera a un inhibidor de PARP o abiraterona, pero no radioterapia, cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN, predecir que el cancer de prostata tiene una probabilidad mas alta de recidiva (por ejemplo, despues de una prostatectomia) cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN, predecir que el cancer de prostata tiene una probabilidad mas alta de progresar cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN, predecir que es mas probable que el cancer de prostata metastatice cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN, predecir un tiempo de supervivencia de menos de 5 anos cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN o combinaciones de los mismos.

Los anteriores y otros objetivos y caracteristicas de la divulgacion seran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada, que prosigue con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripcion de los dibujos

El documento de la patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado en color. Las copias de esta publicacion de patente o solicitud de patente con dibujo(s) en color se proporcionaran por la Oficina bajo peticion y pago de la tasa necesaria.

La FIG. 1 es una imagen digital a 40 aumentos de celulas LNCaP aplicadas sobre un portaobjetos de vidrio usando una citocentrifugadora, fijadas y tenidas con anticuerpos especificos para pancitoqueratina (marcados con punto cuantico que emite a 605 nm) y CD45 (marcados con punto cuantico que emite a 705 nm). Las celulas tambien se tineron con DAPI para mostrar los nUcleos. Las celulas LNCaP fueron positivas para CQ, pero negativas para CD45.

Las FIGS. 2 y 3 son imagenes digitales de CTC aplicadas sobre un portaobjetos de vidrio usando una citocentrifugadora, fijadas y marcadas con sondas para ERG en extremo 5', ERG en extremo 3', PTEN y CEN 10. Las celulas tambien se tineron con DAPI para mostrar los nucleos.

La FIG. 4 es un esquema que muestra un procedimiento que comienza con una muestra que muestra etapas ilustrativas para conseguir una evaluacion de las CTC.

La FIG.5 es un esquema que muestra un procedimiento para el analisis automatizado de CTC.

Listado de secuencias

Las secuencias de acidos nucleicos y aminoacidos enumeradas en el listado de secuencias adjunto se muestran usando abreviaturas de letras estandar para las bases nucleotidicas y codigos de tres letras para los aminoacidos. Solo se muestra una cadena de cada secuencia de acidos nucleicos, pero se entiende que se incluye la cadena complementaria por cualquier referencia a la cadena presentada. Se entiende que todos los numeros de acceso a la base de datos de secuencias a los que se hace referencia en el presente documento se refieren a la version de la secuencia identificada por ese numero de acceso segun estaba disponible en la fecha de presentacion de esta solicitud. En la lista de secuencias adjunta:

Las SEQ ID NOS: 1 y 2 son una secuencia codificante de acido nucleico del gen relacionado con ETS (ERG) humano y la correspondiente secuencia de proteinas, respectivamente.

Las SEQ ID NOS: 3 y 4 son una secuencia codificante de acido nucleico del homologo de fosfatasa y tensina (PTEN) en seres humanos y la correspondiente secuencia de proteinas, respectivamente.

La SEQ ID NO: 5 es una sonda de acido nucleico ejemplar especifica para centromero 10. Este clon es de la American Type Culture Collection (n.° de cat. de la ATCC 61397; pA10RP8). El tamano de la insercion es de 1,36 kb. La secuencia mostrada en los nucleotidos 160 a 498 se repite en el clon.

Descripcion detallada

I. Terminos

A menos que se explique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica a la que pertenece una invencion divulgada. Las definiciones de terminos comunes en biologia molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicada por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De forma similar, la palabra “o” pretende incluir “y” a menos que el contexto indique claramente lo contrario. “Que comprende” significa “que incluye”, de ahi que “que comprende A o B” signifique “que incluye A” o “que incluye B” o “que incluye A y B”.

A continuacion, se describen procedimientos y materiales adecuados para la practica y/o las pruebas de modos de realizacion de los procedimientos divulgados. Dichos procedimientos y materiales solo son ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Tambien se pueden usar otros procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento. Por ejemplo, se describen procedimientos convencionales bien conocidos en la tecnica a la que pertenece una invencion divulgada en diversas referencias generales y mas especificas, que incluyen, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (y suplementos hasta 2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4.a ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; y Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

A fin de facilitar la revision de los diversos modos de realizacion divulgados, se proporcionan las siguientes explicaciones de terminos especificos:

Receptor androgenico (RA): (OMIM 313700): Un tipo de receptor nuclear que se activa uniendo las hormonas androgenicas testosterona o bien dihidrotestosterona en el citoplasma y, a continuacion, translocandose en el nucleo. La funcion principal del receptor androgenico es como un factor de transcripcion de union a ADN que regula la expresion genica. El gen RA se localiza en el cromosoma X. Las secuencias de RA estan disponibles publicamente, por ejemplo, de GenBank® (por ejemplo, con los numeros de acceso NP_000035, AAA51772.1 y P10275.2 (proteinas) y Nm_000044.3 y NMJ301011645.2 (acidos nucleicos)).

Los anticuerpos especificos para proteinas RA estan disponibles publicamente, por ejemplo, de Abcam (con los numeros de catalogo ab47569 y ab9474), Cell Signaling Technology (con los numeros de catalogo 7395 y 5153) y Santa Cruz Biotechnology, Inc. (con los numeros de catalogo sc-7305, sc-52309 y sc-52984.

Anticuerpo: Un ligando de polipeptido que incluye al menos una region variable de inmunoglobulina de la cadena ligera o de la cadena pesada que especificamente reconoce y se une a un epitopo de un antigeno, tal como un marcador endotelial o fragmento del mismo. Los anticuerpos se componen de una cadena pesada y de una cadena ligera, cada una de las cuales tiene una region variable, denominada la region pesada variable (VH) y la region ligera variable (V^l). En conjunto, la region V^hy la region V^lson responsables de la union del antigeno reconocido por el anticuerpo. En un ejemplo, un anticuerpo se une especificamente a una protelna EpCAM, CQ o CD45, pero no a otras protelnas.

Esto incluye inmunoglobulinas inalteradas y las variantes y porciones de ellas bien conocidas en la tecnica, tales como fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, protelnas Fv monocatenarias (“scFv”) y protelnas Fv estabilizadas con disulfuro (“dsFv”). Una protelna scFv es una protelna de fusion en la que una region variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina y una region variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina se unen mediante un conector, mientras que en las dsFv, las cadenas se han mutado para introducir un enlace disulfuro para estabilizar la asociacion de las cadenas. El termino tambien incluye formas genomanipuladas, tales como anticuerpos quimericos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados) y anticuerpos heteroconjugados (tales como anticuerpos biespecificos). Vease tambien, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3.a Ed., W.H. Freeman & Co., Nueva York, 1997.

Tipicamente, una inmunoglobulina natural tiene cadenas pesadas (H) y cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Hay dos tipos de cadena ligera, lambda (A) y kappa (k). Hay cinco clases principales de cadenas pesadas (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molecula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.

Cada cadena pesada y ligera contiene una region constante y una region variable (las regiones tambien se conocen como “dominios”). En combinacion, las regiones variables de la cadena pesada y de la ligera se unen especificamente al antigeno. Las regiones variables de la cadena ligera y pesada contienen una region “estructural” interrumpida por tres regiones hipervariables, tambien llamadas “regiones determinantes de la complementariedad” o “CDR”. Se ha definido la extension de la region estructural y de las CDR (vease, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). La base de datos de Kabat ahora se encuentra actualizada en linea. Las secuencias de las regiones estructurales de diferentes cadenas ligeras o pesadas estan relativamente conservadas en una especie. La region estructural de un anticuerpo, es decir, las regiones estructurales combinadas de las cadenas ligera y pesada constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.

Las CDR son fundamentalmente responsables de la union a un epitopo de un antigeno. Las CDR de cada cadena se denominan tipicamente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente comenzando desde el extremo N, y tambien se identifican tipicamente mediante la cadena en la que se localiza la CDR particular. Por tanto, una CDR3 de VH se localiza en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una CDR1 de VL es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra. Por ejemplo, un anticuerpo que se une a CR tendra una region VH especifica y la secuencia de la region VL, y, por tanto, secuencias de CDR especificas. Los anticuerpos con diferentes especificidades (es decir, diferentes sitios de combination para diferentes antigenos) tienen diferentes CDR. Aunque son las CDR las que varian de anticuerpo a anticuerpo, solo se implica directamente un numero limitado de posiciones de aminoacidos en las CDR en la union a antigeno. Estas posiciones en las CDR se llaman residuos determinantes de la especificidad (SDR).

Las referencias a “VH” o “VH” se refieren a la region variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo la de un Fv, scFv, dsFv o Fab. Las referencias a “VL” o “VL” se refieren a la region variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, incluyendo la de un Fv, scFv, dsFv o Fab.

Un “anticuerpo monoclonal” es un anticuerpo producido mediante un unico clon de linfocitos B o mediante una celula en la que se han transfectado los genes de la cadena ligera y pesada de un unico anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales se producen mediante procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, preparando celulas hibridas formadoras de anticuerpos a partir de una fusion de celulas de mieloma con celulas inmunitarias de bazo. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanizados.

Un “anticuerpo policlonal” es un anticuerpo que deriva de diferentes lineas de linfocitos B. Los anticuerpos policlonales son una mezcla de moleculas de inmunoglobulina secretadas frente a un antigeno especifico, reconociendo cada una un epitopo diferente. Estos anticuerpos se producen mediante procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, mediante inyeccion de un antigeno en un mamifero adecuado (tal como un raton, conejo o cabra) que induzca a los linfocitos B a producir inmunoglobulinas IgG especificas para el antigeno que, a continuation, se purifican del suero del mamifero.

Un “anticuerpo quimerico” tiene residuos estructurales de una especie, tal como el ser humano, y CDR (que, en general, confieren union a antigeno) de otra especie, tal como un anticuerpo murino que se une especificamente a un marcador endotelial.

Una inmunoglobulina “humanizada” es una inmunoglobulina que incluye una region estructural humana y una o mas CDR de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, una de raton, rata o sintetica). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina “donante” y la inmunoglobulina humana que proporciona la region estructural se denomina “aceptora”. En un ejemplo, todas las CDR son de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. Las regiones constantes no necesitan estar presentes, pero si lo estan, son sustancialmente identicas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, por ejemplo, al menos aproximadamente un 85-90 %, tal como aproximadamente un 95 % identicas o mas. De ahl que todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, sean sustancialmente identicas a las correspondientes partes de las secuencias de inmunoglobulinas humanas naturales. Se pueden construir inmunoglobulinas humanizadas por medio de genomanipulacion (vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.585.089).

Afinidad de union: La afinidad de una molecula por otra, tal como un anticuerpo por un antigeno (por ejemplo, una protelna EpCAM, CQ, ERG, PTEN, PSMA, RA o CD45). En un ejemplo, la afinidad se calcula mediante una modificacion del procedimiento de Scatchard descrito por Frankel et al., Mol. Immunol., 16:101-106, 1979. En otro ejemplo, la afinidad de union se mide mediante una velocidad de disociacion antigeno/anticuerpo. En otro ejemplo mas, una alta afinidad de union se mide mediante un radioinmunoanalisis de competicion. En varios ejemplos, una alta afinidad de union es al menos aproximadamente 1 x 10-8 M. En otros ejemplos, una alta afinidad de union es al menos aproximadamente 1,5 x 10-8, al menos aproximadamente 2,0 x 10-8, al menos aproximadamente 2,5 x 10-8, menos aproximadamente 3,0 x 10-8, al menos aproximadamente 3,5 x 10-8, al menos aproximadamente 4,0 x 10-8, menos aproximadamente 4,5 x 10-8 o al menos aproximadamente 5,0 x 10-8 M.

Cancer: Neoplasia maligna, por ejemplo, una que ha experimentado una anaplasia caracterlstica con perdida de diferenciacion, velocidad de crecimiento incrementada, invasion del tejido circundante y que puede metastatizar.

CD45: (OMIM 151460): Un miembro de la familia de la protelna tirosina fosfatasa (PTP) que se expresa especificamente en celulas hematopoyeticas. El gen CD45 (tambien conocido como protelna tirosina fosfatasa, tipo de receptor C (PTPRC)) humano se localiza en el cromosoma 1 (1q31-q32). Las secuencias de CD45 estan disponibles publicamente, por ejemplo, de GenBank® (por ejemplo, con los numeros de acceso NP_002829.2 y NP_035340 (proteinas) y NM_002838.3 y NM_011210 (acidos nucleicos)).

Los anticuerpos especificos para proteinas CD45 estan disponibles publicamente, por ejemplo, de Abcam (con el numero de catalogo ab10558), Millipore (con los numeros de catalogo FCMAB126F, 05-1410 y FCMAB118P) y Santa Cruz Biotechnology, Inc. (con los numeros de catalogo sc-25590, sc-70686, sc-66201 y sc-20056).

Centromero 10 (CEN-10): La region del cromosoma 10 (por ejemplo, 10p11.1-q11.1) en la que se localiza el centromero. Su presencia se puede detectar usando sondas de acido nucleico especificas para centromero 10.

Celulas tumorales circulantes (CTC): Celulas tumorales producidas durante la carcinogenesis encontrada en la sangre periferica o medula osea (en la medula osea se denominan celulas tumorales diseminadas, CTD), que pueden dar como resultado una enfermedad metastasica. Las CTC se encuentran en frecuencias de aproximadamente de 1 a 10 CTC por ml de sangre entera en enfermos con una enfermedad metastasica. Las celulas CTC son positivas para EpCAM, negativas para CD45 y positivas para CQ (tal como positivas cuando se usa un anticuerpo panqueratina).

Complementaria: Se dice que una molecula de acido nucleico es “complementaria” con otra molecula de acido nucleico si las dos moleculas comparten un numero suficiente de nucleotidos complementarios para formar una doble helice o triple helice estable cuando las cadenas se unen (se hibridan) entre si, por ejemplo, formando pares de bases de Watson-Crick, de Hoogsteen o de Hoogsteen inversos. Se produce la union estable cuando una molecula de acido nucleico (por ejemplo, una sonda o cebador de acido nucleico) permanece unida de manera detectable a una secuencia de acidos nucleicos diana (por ejemplo, una secuencia de acidos nucleicos diana para ERG, PTEN o CEN-10) en las condiciones requeridas.

La complementariedad es el grado en que las bases en una molecula de acido nucleico (por ejemplo, una sonda o cebador de acido nucleico) se aparean en cuanto a sus bases con las bases en una segunda molecula de acido nucleico (por ejemplo, una secuencia de acidos nucleicos diana). La complementariedad se describe convenientemente mediante porcentajes, es decir, la proporcion de nucleotidos que forman pares de bases entre dos moleculas o en una region o dominio especifico de dos moleculas. Por ejemplo, si 10 nucleotidos de una region de nucleotidos contiguos de una sonda o cebador de acido nucleico forman pares de bases con una molecula de acido nucleico diana, se dice que esa region de la sonda o cebador tiene un 66,67 % de complementariedad con respecto a la molecula de acido nucleico diana.

En la presente divulgacion, “suficiente complementariedad” significa que existe un numero suficiente de pares de bases entre una molecula de acido nucleico o region del mismo (tal como una region de una sonda o cebador) y una secuencia de acidos nucleicos diana (por ejemplo, una secuencia de acidos nucleicos de ERG o PTEN) para lograr una union detectable. Se proporciona un tratamiento minucioso de las consideraciones cualitativas y cuantitativas implicadas en el establecimiento de las condiciones de union por Beltz et al. Methods Enzymol. 100:266-285, 1983 y por Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Contacto: Disposicion en asociacion fisica directa, que incluye tanto en forma solida como liquida, en condiciones que permitan interactuar a los agentes. Por ejemplo, se puede incubar una CTC (o poblacion de CTC aisladas en un portaobjetos) con un agente de union especifica (por ejemplo, una sonda de acido nucleico o anticuerpos), tal como una o mas sondas para ERG, sondas para PTEN y sondas para CEN-10, permitiendo, de este modo, la deteccion de moleculas de acido nucleico en las CTC que tengan suficiente complementariedad con respecto a la sonda.

Control: Una muestra o patron usado para su comparacion con una muestra de prueba, tal como una muestra biologica, por ejemplo, una muestra biologica obtenida de un enfermo (o una pluralidad de enfermos) o un cultivo de celulas. En algunos modos de realizacion, el control es una muestra obtenida de un paciente (o una pluralidad de pacientes) sano (tambien denominado en el presente documento control “normal”), tal como una muestra normal (por ejemplo, una que no tiene cancer de prostata, tal como una muestra de prostata normal). En algunos ejemplos, el control es una CTC o una pluralidad de CTC obtenidas de un enfermo (o una pluralidad de enfermos) con CPRC o CPRCm que se sabe que tienen reordenamientos de ERG y/o deleciones de PTEN. En otros ejemplos, el control es una CTC o una pluralidad de CTC obtenidas de un enfermo (o una pluralidad de enfermos) con CPRC o CPRCm que se sabe que no tienen reordenamientos de ERG y/o deleciones de PTEN. En algunos ejemplos, el control es un valor de control o patron historico (es decir, una muestra o grupo de muestras de control sometido a prueba previamente que representa los valores de referencia o normales).

Citoqueratinas (CQ): Proteinas de filamentos intermedios que contienen queratina encontradas en el citoesqueleto intracitoplasmico del tejido epitelial. Hay aproximadamente 20 genes CQ epiteliales diferentes. Los subconjuntos de citoqueratinas expresadas por una celula epitelial particular dependen principalmente del tipo de epitelio, el momento en el transcurso de la diferenciacion terminal y la fase de desarrollo. Los ejemplos de CQ incluyen las queratinas 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14 y 18. Los anticuerpos especificos para las proteinas CQ estan disponibles publicamente. Por ejemplo, un anticuerpo panqueratina puede detectar multiples CQ, tales como las CQ 4, 5, 6, 8, 10, 13 y 18 o las citoqueratinas de 56,5 kD, 50 kD, 50 kD, 48 kD y 40k D de la subfamilia acida y las citoqueratinas de 65-67 kD, 64 kD, 59 kD, 58 kD, 56 kD y 52 kD de la subfamilia basica. Los anticuerpos para CQ ejemplares estan disponibles de Ventana (con los numeros de catalogo 760-2595 y 760-2135), Cell Signaling Technology (con los numeros de catalogo 4528 y 4545), Abcam (con el numero de catalogo ab8068) y Thermo Scientific (con el numero de catalogo MS-744-A).

Detectar: Determinar si un agente (por ejemplo, una molecula de proteina o acido nucleico) esta presente o ausente. Por ejemplo, el uso de una sonda especifica para un gen particular (por ejemplo, ERG o PTEN) permite la deteccion de la molecula de acido nucleico deseada en una CTC, tal como un reordenamiento de ERG o delecion de PTEN. Por ejemplo, el uso de un anticuerpo especifico para una proteina particular (por ejemplo, CQ o EpCAM) permite la deteccion de la proteina deseada en una CTC, tal como CQ o EpCAM. En algunos ejemplos, esto puede incluir ademas una cuantificacion. En ejemplos particulares, se detecta una senal de emision de un marcador (tal como un punto cuantico). La deteccion puede ser en masa, de modo que se pueda observar de manera simultanea un numero macroscopico de moleculas. La deteccion tambien puede incluir la identificacion de senales de moleculas unicas usando microscopia y tecnicas tales como reflexion interna total para reducir el ruido de fondo.

Diagnostico: El procedimiento de identificacion de una afeccion medica o enfermedad, por ejemplo, a partir de los resultados de uno o mas procedimientos de diagnostico. En un ejemplo, los procedimientos divulgados permiten el diagnostico de una forma de un cancer de prostata de mayor malignidad si se detecta un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN en celulas CTC del enfermo con cancer de prostata.

Molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM) (OMIM 185535): Un antigeno de diferenciacion panepitelial expresado en la mayoria de las celulas cancerosas. El gen EpCAM humano (tambien conocido como transductor de senal de calcio asociado a tumor 1 (TACSTD1) y CD326) se localiza en el cromosoma 2 (2p21). Las secuencias de EpCAM estan disponibles publicamente, por ejemplo, de GenBank® (por ejemplo, con los numeros de acceso NP_002345.2, AAH14785.1 y NP_032558.2 (proteinas) y NM_002354 y NM_008532.2 (acidos nucleicos)) y de UniProt (por ejemplo, con los numeros de acceso P16422 (proteina)).

Los anticuerpos especificos para proteinas EpCAM estan disponibles publicamente, por ejemplo, de Abcam (con el numero de catalogo ab20160), Millipore (con los numeros de catalogo CP63-100UG, OP187-100UG, MAB4444 y CBL251) y de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (con los numeros de catalogo sc-71059, sc-73491, sc-23788 y sc-73942).

Gen: Una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, ADN genomico, ADNc o ARN) que comprende secuencias codificantes necesarias para la produccion de un polipeptido, precursor o ARN (por ejemplo, ARNm). El polipeptido se puede codificar mediante una secuencia codificante de longitud completa o mediante cualquier porcion de la secuencia codificante siempre que se retenga(n) la actividad deseada o las propiedades funcionales (por ejemplo, actividad enzimatica, union a ligando, transduccion de senales, inmunogenia, etc.) de la longitud completa o fragmento. El termino tambien engloba la region codificante de un gen estructural y las secuencias localizadas adyacentes a la region codificante en tanto los extremos 5' como 3' para una distancia de aproximadamente 1 kb o mas en cada extremo de tal manera que el gen corresponde al ARNm de longitud completa. Las secuencias localizadas en 5' de la region codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias no traducidas en 5'. Las secuencias localizadas en 3' o en direccion 3' de la region codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias no traducidas en 3'. El gen como esta presente en (o aislado de) un genoma contiene las regiones codificantes (“exones”) interrumpidas con secuencias no codificantes denominadas “intrones”. Los intrones estan ausentes en el transcrito de ARN (por ejemplo, ARNm) procesado. En el presente documento se proporcionan procedimientos que permiten la deteccion de reordenamientos de ERG y deleciones de genes PTEN.

Hibridacion: Los oligonucleotidos y sus analogos se hibridan mediante enlaces de hidrogeno, lo que incluye enlaces de hidrogeno de Watson-Crick, de Hoogsteen o de Hoogsteen inversos, entre bases complementarias. En general, las moleculas de acido nucleico se componen de bases nitrogenadas que son pirimidinas (citosina (C), uracilo (U) y timina (T)) o bien purinas (adenina (A) y guanina (G)). Estas bases nitrogenadas forman enlaces de hidrogeno entre una pirimidina y una purina, y la union de la pirimidina a la purina se denomina “apareamiento de bases”. Mas especificamente, A se unira con enlaces de hidrogeno a T o U, y G se unira a C. “Complementario” se refiere al apareamiento de bases que se produce entre dos secuencias de acidos nucleicos distintas. Por ejemplo, una sonda de oligonucleotidos puede ser complementaria a una secuencia del gen ERG o PTEN (o a una porcion de la misma) o a una secuencia de CEN-10 (o a una porcion de la misma).

“Especificamente hibridable” y “especificamente complementario” son terminos que indican un grado suficiente de complementariedad, de tal manera que se produzca una union estable y especifica entre el oligonucleotido y la diana de acido nucleico. La sonda de oligonucleotidos no necesita ser un 100 % complementaria a su secuencia diana para ser especificamente hibridable.

Las condiciones de hibridacion que dan como resultado grados particulares de rigurosidad variaran dependiendo de la naturaleza del procedimiento de hibridacion de eleccion y de la composicion y longitud de las secuencias de acidos nucleicos que se hibridan. En general, la temperatura de hibridacion y la fuerza ionica (en especial, la concentracion de Na+) del tampon de hibridacion determinaran la rigurosidad de la hibridacion, aunque los tiempos desaprovechados tambien influyen en la rigurosidad. La hibridacion de una secuencia de oligonucleotidos se puede modificar incorporando bases no naturales en la secuencia, tal como incorporando acidos nucleicos bloqueados o acidos peptidonucleicos.

Inmunohistoquimica (IHQ): Un procedimiento de determinacion de la presencia, cantidad o distribucion de un antigeno (tal como una proteina) en una muestra (por ejemplo, una CTC) detectando la interaccion del antigeno con un agente de union especifica, tal como un anticuerpo. Se incuba una muestra que se sospecha que contiene CTC y, por tanto, un antigeno EpCAM, con un anticuerpo en condiciones que permitan la union anticuerpo-antigeno. La union anticuerpo-antigeno se puede detectar por medio de un marcador detectable conjugado al anticuerpo (deteccion directa) o por medio de un marcador detectable conjugado a un anticuerpo secundario, que se produce frente al anticuerpo primario (por ejemplo, deteccion indirecta). Los marcadores detectables ejemplares que se pueden usar para IHQ incluyen, pero no se limitan a, isotopos radioactivos, fluorocromos (tales como fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina y rodamina) y enzimas (tales como peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina).

Aislado: Un componente biologico “aislado” (por ejemplo, una molecula de acido nucleico o proteina) o una celula (tal como una CTC) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biologicos u otras celulas en las que el componente se produce de manera natural. Por ejemplo, un componente biologico se puede separar o purificar sustancialmente de otros ADN y ARN cromosomicos y extracromosomicos, proteinas y/u organulos. Para las CTC aisladas, dichas CTC se separan o purifican sustancialmente de otras celulas en la sangre o medula osea, tales como linfocitos y los E. Los acidos nucleicos y las proteinas que se han “aislado” incluyen acidos nucleicos y proteinas purificados mediante procedimientos de purificacion estandar. El termino tambien engloba acidos nucleicos y proteinas preparados mediante expresion recombinante en una celula huesped, asi como acidos nucleicos sintetizados quimicamente, tales como sondas para la deteccion de reordenamientos de ERG, deleciones de PTEN y CEN-10.

Marcador: Un agente que puede detectar, por ejemplo, mediante espectrofotometria, obtencion de imagenes espectrales, citometria de flujo o microscopia. Por ejemplo, se pueden acoplar uno o mas marcadores a un anticuerpo, permitiendo, de este modo, la deteccion de una proteina diana (tal como EpCAM, CD45 o CQ). Ademas, se puede acoplar uno o mas marcadores a una molecula de acido nucleico, permitiendo, de este modo, la deteccion de una molecula de acido nucleico diana (tal como ERG, PTEN o CEN-10). Los marcadores ejemplares incluyen isotopos radioactivos, fluoroforos, puntos cuanticos, cromoforos, ligandos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y combinaciones de los mismos.

Celulas o tejido normales: Celulas y tejido no malignos, no tumorales.

Sonda: Un acido nucleico aislado que se puede hibridar a un acido nucleico diana (tal como una secuencia de acidos nucleicos de ERG, PTEN o CEN-10), que puede incluir un marcador detectable o molecula indicadora. Los marcadores ejemplares incluyen puntos cuanticos, isotopos radioactivos, sustratos enzimaticos, cofactores, ligandos, agentes quimioluminiscentes o fluorescentes, haptenos y enzimas. En un ejemplo particular, una sonda incluye al menos un punto cuantico. Los procedimientos para el marcado y guia en la eleccion de los marcadores apropiados para diversos propositos se analizan, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y Wiley-Intersciences (1987).

Las sondas tienen, en general, al menos 50 nucleotidos de longitud, tal como al menos 51, al menos 52, al menos 53, al menos 54, al menos 55, al menos 56, al menos 57, al menos 58, al menos 59, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 120, al menos 140, al menos 160, al menos 180, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450, al menos 500 o mas nucleotidos contiguos complementarios a la molecula de acido nucleico diana (tal como ERG, PTEN o CEN-10), tal como 20-500 nucleotidos, 100-500 nucleotidos, 100-250 nucleotidos o 20-250 nucleotidos. En algunos ejemplos, una sonda comprende una pluralidad de diferentes secuencias de sonda que se pueden unir cada una a la molecula de acido nucleico diana.

Pronostico: El procedimiento de determinacion del desenlace clinico probable de que un sujeto tenga una enfermedad (por ejemplo, cancer de prostata) en ausencia de tratamiento adicional. En un ejemplo, los procedimientos divulgados permiten el pronostico de una forma de un cancer de prostata de mayor malignidad si se detectan reordenamientos de ERG y/o deleciones de PTEN en las CTC del enfermo. Por ejemplo, se puede relacionar el pronostico con la prediccion de acontecimientos futuros, tales como la esperanza de vida (por ejemplo, probabilidad de supervivencia en 1 ano, 3 anos o 5 anos), prediccion de la probable de recidiva del cancer de prostata despues de la prostatectomla y/o la prediccion de la probable metastasis de un cancer de prostata (por ejemplo, despues de una prostatectomla).

Antigeno prostatico especifico de membrana (PSMA): (OMIM 600934): Una glucoprotelna de membrana integral de tipo 2 encontrada en la prostata y otros tejidos. Tambien conocida como folato hidrolasa 1. El PSMA tiene dos actividades enzimaticas, una como folato hidrolasa de membrana integral especifico de prostata y la otra como carboxipeptidasa. El gen PSMA humano se localiza en el cromosoma 11 (11 p11.12). Las secuencias de PSMA estan disponibles publicamente, por ejemplo, de GenBank® (por ejemplo, con los numeros de acceso AAA60209.1, AAM34479.1 y AAC83972.1 (protelnas) y NM_004476.1 y NG_029170.1 (acidos nucleicos)).

Los anticuerpos especificos para protelnas PSMA estan disponibles publicamente, por ejemplo, de Abcam (con el numero de catalogo ab403, ab53774, ab53690), Leica Microsystems (numero de clon PSMA-L-A) y Santa Cruz Biotechnology, Inc. (con los numeros de catalogo sc-10269, sc-69665, sc-130546 y sc-59674).

Determinacion cuantitativa o cuantificacion: Determinar o medir una cantidad (tal como una cantidad absoluta o relativa) de una molecula, tal como la cantidad de un gen ERG o PTEN, tal como un numero de reordenamientos de ERG, deleciones de PTEN o CEN-10 presentes en CTC aisladas.

Puntos cuanticos: Se pueden acoplar nanoparticulas cristalinas semiconductoras inorganicas que emiten fluorescencia de manera estable y poseen un area de superficie uniforme que se puede acoplar a una sonda de acido nucleico o anticuerpo, permitiendo, de este modo, la deteccion de la diana de la sonda de acido nucleico o anticuerpo. Aunque, en general, son esfericos, los puntos cuanticos acoplados a las sondas de acidos nucleicos o anticuerpos pueden tener cualquier forma (tal como esferica, tubular, piramidal, conica o cubica), pero las nanoparticulas particularmente adecuadas son esfericas.

En general, se pueden preparar puntos cuanticos con monodispersidad relativa (por ejemplo, variando el diametro del nucleo aproximadamente menos de un 10 % entre puntos cuanticos en la preparacion), como se ha descrito previamente (Bawendi et al., J. Am. Chem. Soc. 115:8706, 1993). Los puntos cuanticos conocidos en la tecnica tienen, por ejemplo, un nucleo seleccionado del grupo que consiste en CdSe, CdS y CdTe (denominados colectivamente “CdX”).

Senal: Un cambio o impulso detectable en una propiedad fisica que proporciona informacion. En el contexto de los procedimientos divulgados, los ejemplos incluyen senales electromagneticas, tales como luz, por ejemplo, luz de una cantidad o longitud de onda particular. En determinados ejemplos, la senal es la desaparicion de un acontecimiento fisico, tal como la extincion de la luz. Una senal caracteristica es la senal particular esperada cuando una sonda de acido nucleico particular se hibrida especificamente a su secuencia de acidos nucleicos complementaria en las CTC. Por ejemplo, una senal caracteristica puede ser la senal resultante emitida a partir de un punto cuantico presente en la sonda de acido nucleico, que se puede predecir mediante el punto cuantico particular acoplado a o asociado a la sonda de acido nucleico.

Union especifica (o derivaciones de dicha frase, tales como se une especificamente, especifico para, etc.):

La interaccion particular entre un ligando (tal como una sonda especifica de gen o anticuerpo especifico de proteina) y otro ligando (tal como una diana de una sonda especifica de gen o anticuerpo especifico de proteina). Dicha interaccion se media mediante uno o, tipicamente, mas enlaces no covalentes entre los ligandos (o, a menudo, entre una region o porcion especifica de cada ligando). Por tanto, un oligonucleotido se une de manera estable a un acido nucleico diana (por ejemplo, PTEN, ERG, CEN-10) si una cantidad suficiente del oligonucleotido forma pares de bases o se hibrida a su acido nucleico diana.

A diferencia de los sitios de union no especifica, los sitios de union especifica son saturables. En consecuencia, una manera ejemplar para caracterizar la union especifica es mediante una curva de union especifica. Una curva de union especifica muestra, por ejemplo, la cantidad de un ligando (el primer ligando) unido a una cantidad fijada del otro ligando como una funcion de la concentracion del primer ligando. A medida que la concentracion del primer ligando se incrementa en estas condiciones, la cantidad del primer ligando unido se saturara. En contraste con los sitios de union no especifica, se pueden eliminar (o desplazar) de manera competitiva los ligandos especificos implicados en una asociacion directa entre si (por ejemplo, una interaccion sonda-ARNm o anticuerpo-proteina) de dicha asociacion mediante cantidades en exceso de cualquier ligando especifico. Dichos ensayos de competicion (o ensayos de desplazamiento) se conocen bien en la tecnica.

Sujeto: Incluye cualquier organismo vertebrado pluricelular, tal como mamiferos humanos y no humanos (por ejemplo, sujetos veterinarios, tales como gatos o perros). En algunos ejemplos, un sujeto o enfermo es alguien que tiene cancer o se sospecha que tiene cancer, tal como cancer de prostata, tal como cancer de prostata resistente a la castracion (CPRC) o cancer de prostata metastasico, tal como cancer de prostata resistente a la castracion metastasico (CPRCm).

Sustrato: Un material o superficie a la que se pueden acoplar otras moleculas (tales como CTC aisladas). En ejemplos particulares, el sustrato se hace de material biocompatible que sea transparente a la luz, incluyendo vidrio y cuarzo. Por ejemplo, el sustrato puede ser un portaobjetos de vidrio (tal como uno que sea de 3 cm de largo por 1 cm de ancho por 0,25 cm de grosor). Los portaobjetos de vidrio estan disponibles comercialmente y se venden pretratados, lo que da como resultado portaobjetos cargados de manera positiva. En un ejemplo, las superficies de vidrio cargadas de manera positiva se preparan mediante reaccion quimica de los portaobjetos con 3-aminopropiltrietoxisilano (APES).

En condiciones suficientes para: Cualquier entorno que permita la actividad deseada, por ejemplo, que permita que un anticuerpo se una a un antigeno, tal como EpCAM, CD45, ERG, RA, PSMA o CQ, o que permita que una sonda de acido nucleico se una a su secuencia diana complementaria, tal como como ERG, PTEN o CEN-10, y la interaccion que se va a detectar.

Un ejemplo incluye poner en contacto una sonda de acido nucleico con CTC en condiciones suficientes para permitir la hibridacion de la sonda de acido nucleico que es una molecula de acido nucleico complementaria en las CTC (si estan presentes), por ejemplo, para determinar si la molecula de acido nucleico complementaria esta presente en las CTC, tal como reordenamientos de ERG o deleciones de PTEN.

Senal de emision unica: Una senal de emision que transmite informacion sobre un acontecimiento especifico, tal como el espectro de emision para un marcador determinado (tal como un punto cuantico), que se puede distinguir de otras senales (tales como senales del espectro de emision de otros marcadores). Los ejemplos en asociacion con los procedimientos divulgados incluyen asociar uno o mas marcadores individuales (tales como un punto cuantico) con cada tipo diferente de sonda de acido nucleico (tal como una sonda de acido nucleico especifica para PTEN frente a una sonda de acido nucleico especifica para ERG), de tal manera que la hibridacion de la sonda de acido nucleico con su secuencia complementaria en las CTC da como resultado una senal unica o una combinacion de senales (tales como puntos cuanticos que emiten a diferentes longitudes de onda unicas). Cada marcador tiene una senal de emision unica correspondiente a una sonda especifica de acido nucleico particular. Esta senal se puede usar para determinar que sonda de acido nucleico se ha hibridado con exito a su secuencia complementaria en las CTC.

II. Analisis automatizado de CTC

Un aspecto de los analisis de sangre es que se pueden realizar con seguridad en muchos puntos durante el tratamiento o diagnostico del cancer, mientras que las biopsias de tumores solidos son, a menudo, invasivas y solo se pueden realizar de manera intermitente. La capacidad de realizar un seguimiento de la progresion de la enfermedad a lo largo del tiempo permite modificaciones apropiadas en el tratamiento, por ejemplo, para mejorar la calidad de vida de un enfermo. Con este fin, los procedimientos divulgados se desarrollaron para mejorar las vidas de las personas afectadas de cancer. La automatizacion y las tecnologias implementadas a traves de los procedimientos divulgados proporcionan la sensibilidad y reproducibilidad requeridas para detectar las CTC en enfermos con enfermedad metastasica. En particular, se han desarrollado procedimientos que permiten la deteccion simultanea o coincidente de multiples marcadores geneticos y de proteinas en una unica muestra. Por ejemplo, en el presente documento se demuestra la deteccion coincidente de ERG, PTEN y CEN-10 en la misma CTC.

Se puede automatizar una o mas etapas del procedimiento. En ejemplos ilustrativos, los procedimientos incluyen etapas de tratamiento quimico automatizadas para disminuir la variabilidad entre los ensayos, para lograr una consistencia en la deteccion, o ambas. Por ejemplo, se puede automatizar una o mas de las etapas, tal como las etapas de hibridacion y deteccion. Las hibridaciones manuales pueden tener una velocidad de separacion variable de CTC del portaobjetos, mientras que la automatizacion es mas fiable. La automatizacion proporciona resultados y tiempos de obtencion de resultados mas rapidos y reduce la variabilidad de sitio a sitio. En un ejemplo, la automatizacion permite que se sometan a prueba de manera simultanea o coincidente al menos 30 muestras (tal como al menos 50, al menos 100 o incluso al menos 500 muestras, tal como 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 250, 500 o 1000 muestras).

En el presente documento se proporcionan procedimientos de analisis de una muestra, tal como una que se sabe o se sospecha que contiene CTC, usando un instrumento automatizado. Dichos procedimientos pueden incluir depositar o aplicar la muestra sobre un sustrato configurado para su uso con el instrumento automatizado, disponer el sustrato en el instrumento automatizado, recuperar las dianas en la muestra usando el instrumento automatizado, poner en contacto la muestra con reactivos de identification de CTC usando el instrumento automatizado, poner en contacto la muestra con reactivos de caracterizacion de CTC usando el instrumento automatizado, obtener imagenes de la muestra, localizar las CTC localizando los reactivos de identificacion de CTC, obtener imagenes espectrales de las CTC por localization, analizar la muestra analizando las imagenes espectrales o combinaciones de los mismos.

En un ejemplo, el procedimiento incluye enriquecer el contenido de CTC de la muestra usando un anticuerpo de captura especifico para una protelna ERG, una protelna antigeno prostatico especifico de membrana (PSMA) o una protelna molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM), en el que el enriquecimiento del contenido de CTC de la muestra se produce antes de depositar o disponer la muestra sobre el sustrato. En algunos ejemplos, la muestra se usa directamente, mientras que en otros ejemplos la muestra se manipula (por ejemplo, se concentra, se diluye, se trata para enriquecer o separar las celulas CTC, se trata para eliminar las celulas no deseadas (tales como L o E, por ejemplo, lisando E) o combinaciones de los mismos). En algunos ejemplos, una muestra de sangre se fracciona y la fraccion de suero se usa para un analisis posterior.

En un ejemplo, los reactivos de identificacion de CTC y los reactivos de caracterizacion de CTC se seleccionan de modo que el procedimiento proporcione un valor medico, por ejemplo, que el procedimiento proporcione information que sea medicamente aplicable.

En un modo de realization, los reactivos de identificacion de CTC incluyen reactivos inmunohistoquimicos (IHQ) dirigidos a (o especificos para) marcadores de protelnas de CTC, tales como uno o mas de protelna CD45, protelna citoqueratina (CQ), protelna ERG, receptor androgenico (RA) o protelna PSMA. Dichos reactivos de identificacion de CTC permiten la determination de que una celula particular sea una celula CTC. En un ejemplo, los reactivos de identificacion de CTC pueden incluir anticuerpos u otros agentes de union especifica para marcadores de protelnas de CTC, tales como uno o mas de CD45, CQ, ERG, RA o PSMA. Por ejemplo, los reactivos de identificacion de CTC incluyen anticuerpos especificos para 1, 2, 3, 4 o todos de CD45, CQ, ERG, RA, PSMA o combinaciones de los mismos. Dichos reactivos de identificacion pueden incluir un marcador detectable, tal como un punto cuantico. En algunos ejemplos, por ejemplo, si se usan varios anticuerpos en la misma muestra, cada anticuerpo especifico para una proteina particular incluye un marcador detectable diferente. Por ejemplo, la FIG. 1 muestra una linea de celulas de cancer de prostata (LNCaP) que presenta tincion CQ+, mientras que es negativa para CD45, como se detecta mediante reactivos de identificacion de CTC (anticuerpos para CQ y CD45).

En un ejemplo, los reactivos de caracterizacion de CTC incluyen sondas de acido nucleico dirigidas a marcadores genomicos, tales como 1, 2, 3, 4 o 5 marcadores genomicos diferentes, tales como marcadores genomicos para el diagnostico o pronostico del cancer. Dichos reactivos de caracterizacion de CTC permiten la caracterizacion de la celula CTC, por ejemplo, para permitir el diagnostico o pronostico de un enfermo con cancer. Dichas sondas pueden incluir un marcador detectable, tal como un punto cuantico. En algunos ejemplos, por ejemplo, si se usan varias sondas en la misma muestra, cada sonda especifica para una diana particular incluye un marcador detectable diferente. En un modo de realizacion, los marcadores genomicos se analizan para determinar la expresion genica y/o reordenamientos/deleciones geneticas. Por ejemplo, los marcadores genomicos se pueden detectar usando una sonda de expresion genica y una combination de sondas para reordenamientos/deleciones. En un ejemplo particular, los reactivos de caracterizacion de CTC incluyen sondas de acido nucleico especificas para (por ejemplo, se pueden hibridar selectivamente al) gen relacionado con ETS (ERG), homologo de fosfatasa y tensina (PTEN) y centromero 10 (CEN-10). En algunos ejemplos, los reactivos de caracterizacion de CTC incluyen sondas de acido nucleico especificas para diferentes regiones del mismo gen (tal como una sonda especifica para el extremo 5' y una segunda sonda especifica para el extremo 3' de un gen).

En un modo de realizacion particular, los reactivos de caracterizacion de CTC incluyen sondas de acido nucleico dirigidas a marcadores genomicos (tales como al menos 2, al menos 3 o al menos 4 marcadores genomicos) y los reactivos de identificacion de CTC incluyen reactivos IHQ dirigidos a marcadores de protelnas de CTC. En un modo de realizacion, los marcadores genomicos incluyen ERG, PTEN y CEN-10 y los marcadores de protelnas de CTC incluyen uno o mas de proteina CD45, proteina CQ, protelna ERG, RA y protelna PSMA. En algunos ejemplos, las CTC tambien se tinen con DAPI. Como se muestra en las FIGS. 2 y 3, se puede lograr un ensayo de FISH multiple con puntos cuanticos usando sondas para ERG en extremo 5', para ERG en extremo 3', para PTEN y para CEN-10 (marcadas con puntos cuanticos que emiten a 655 nm, 565 nm, 605 nm y 585 nm, respectivamente) como se describe en el presente documento (ejemplo 1).

El procedimiento de analisis de una muestra que se sabe o se sospecha que contiene CTC circulantes puede incluir una etapa de obtencion de imagenes. En un ejemplo, obtener imagenes incluye inmunofluorescencia para obtener imagenes de los reactivos de identificacion de CTC (por ejemplo, detectando el marcador asociado con cada anticuerpo usado). En otro ejemplo, obtener imageries incluye usar filtros de paso de banda multiespectrales. La inmunofluorescencia puede proceder de anticuerpos marcados directa o indirectamente con fluoroforos o la inmunofluorescencia puede resultar de la excitacion de los fluoroforos con luz visible filtrada espectralmente. En un ejemplo, la luz visible filtrada espectralmente incluye un primer intervalo seleccionado para excitar un primer fluoroforo y un segundo intervalo seleccionado para excitar un segundo fluoroforo, en la que el primer intervalo seleccionado no excita significativamente el segundo fluoroforo y el segundo intervalo seleccionado no excita significativamente el primer fluoroforo. Obtener imagenes de la muestra puede incluir adquirir una primera imagen de inmunofluorescencia de la muestra excitada por el primer intervalo seleccionado y adquirir una segunda imagen de inmunofluorescencia de la muestra excitada por el segundo intervalo seleccionado (y adquirir imagenes de inmunofluorescencia adicionales para cada marcador si se usaron mas de dos reactivos de identificacion de CTC) y localizar o identificar las CTC localizando o visualizando los reactivos de identificacion de CTC, lo que puede incluir la comparacion o superposicion de la primera imagen de inmunofluorescencia y la segunda imagen de inmunofluorescencia (e imagenes adicionales si se obtienen de esta manera). Por ejemplo, obtener imagenes de la primera imagen de inmunofluorescencia puede identificar celulas CQ+ y la segunda imagen de inmunofluorescencia puede identificar celulas CD45+, en las que la comparacion o superposicion incluye identificar celulas que sean CQ+ y CD45-. En otro ejemplo, localizar las CTC localizando los reactivos de identificacion de CTC incluye analizar algorltmicamente la primera imagen de inmunofluorescencia y la segunda imagen de inmunofluorescencia (e imagenes de inmunofluorescencia adicionales si se obtienen) usando un ordenador. Analizar algorltmicamente puede incluir examinar digitalmente las imagenes para medir el tamano de la celula, la localizacion del compartimento de la celula de los marcadores y/o la intensidad de la expresion del marcador.

En un ejemplo, la obtencion de imagenes espectrales de las CTC incluye la luminiscencia de imagenes espectrales de los reactivos de caracterizacion de CTC, procediendo la luminiscencia de restos de union especifica marcados (tales como sondas de acido nucleico), tales como sondas de acido nucleico marcadas con puntos cuanticos. Los restos de union especifica se pueden marcar directamente (por ejemplo, con los puntos cuanticos) o se pueden marcar indirectamente (por ejemplo, con los puntos cuanticos) (procediendo la luminiscencia de los puntos cuanticos que marcan los anticuerpos secundarios antihapteno, siendo los anticuerpos secundarios antihapteno especificos para haptenos que marcan los restos de union especifica). Obtener imagenes espectrales de las CTC pueden incluir excitar el marcador (por ejemplo, puntos cuanticos) con radiacion, tal como radiacion UV o UV cercano. En un ejemplo, la radiacion tiene un perfil de emision espectral con un maximo entre 300 nm y 400 nm. Las imagenes espectrales de las CTC pueden incluir de forma alternativa imagenes multiespectrales o imagenes hiperespectrales. La obtencion de imagenes espectrales se puede guiar mediante la etapa de localizar las CTC en las regiones de interes con exclusion de las regiones que carecen de interes. Las regiones ejemplares de interes incluyen las CTC. En otro ejemplo, la luz visible filtrada espectralmente no da como resultado una luminiscencia de puntos cuanticos significativa.

En un ejemplo, la obtencion de imagenes de la muestra incluye inmunofluorescencia para obtener imagenes multiespectrales de los reactivos de identificacion de CTC y la obtencion de imagenes espectrales de las CTC incluye obtener imagenes hiperespectrales de los reactivos de caracterizacion de CTC. En un ejemplo, la obtencion de imagenes multiespectrales e hiperespectrales diferencia al menos cuatro reactivos de identificacion de CTC y/o reactivos de caracterizacion de CTC, al menos cinco reactivos de identificacion de CTC y/o reactivos de caracterizacion de CTC o al menos seis reactivos de identificacion de CTC y/o reactivos de caracterizacion de CTC. En otro ejemplo, la obtencion de imagenes multiespectrales diferencia al menos dos reactivos de identificacion de CTC (tal como 2, 3, 4 o 5 reactivos de identificacion de CTC) y la obtencion de imagenes hiperespectrales diferencia al menos cuatro reactivos de caracterizacion de CTC (tal como 4, 5, 6, 7 u 8 reactivos de caracterizacion de CTC).

La FIG. 4 es un esquema que muestra un procedimiento ilustrativo 100 de analisis de una muestra 101 que contiene celulas tumorales circulantes (CTC) usando un instrumento automatizado. En este modo de realizacion particular, una primera etapa opcional es enriquecer las CTC 102. Las CTC se depositan sobre un sustrato 103, lo que da como resultado que las CTC esten presentes sobre un sustrato 104. Posteriormente, las CTC se identifican 105 y se caracterizan 106.

La FIG. 5 muestra un modo de realizacion de un procedimiento de tratamiento de CTC 200 posterior a que las CTC se depositen sobre un sustrato 104. En este modo de realizacion, el procedimiento incluye permeabilizar las CTC 201, recuperar las dianas 202, poner en contacto la muestra con reactivos de identificacion de CTC 203 (por ejemplo, los que se pueden usar para inmunofluorescencia, IF, o inmunohistoquimica, IHQ). El procedimiento puede incluir opcionalmente una segunda etapa de recuperacion de dianas 204. El procedimiento prosigue poniendo en contacto la muestra con los reactivos de caracterizacion de CTC 205 (por ejemplo, los que se pueden usar para la hibridacion in situ, FISH, CISH, SISH, IF o IHQ), localizando las CTC localizando los reactivos de identificacion de CTC 206 (por ejemplo, guia de IF o IHQ) y obteniendo imagenes espectrales de las CTC por localizacion 207. Despues de la obtencion de imagenes, se pueden analizar los datos obtenidos a traves del procedimiento de obtencion de imagenes, informando, por tanto, al usuario o patologo sobre la naturaleza de las CTC analizadas.

Se puede automatizar una o mas etapas de los procedimientos descritos en el presente documento. Los sistemas automatizados ejemplares disponibles a traves de Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, incluyen el sistema de tincion SYMPHONY® (con n.° de catalogo: 900-SYM3), los sistemas automatizados de preparacion de portaobjetos BenchMark de VENTANA® (con n.° de catalogo: N750-BMKXT-FS, N750-BMKU-FS) y el sistema de tincion automatizado de portaobjetos para tinciones especiales BenchMark de VENTANA®. Estos sistemas emplean un sistema controlado por microprocesador que incluye una rueda giratoria que soporta portaobjetos posicionados radialmente. Un motor de velocidad gradual gira la rueda, disponiendo cada portaobjetos debajo de uno de una serie de distribuidores de reactivos posicionados por encima de los portaobjetos. Los codigos de barras en los portaobjetos y distribuidores de reactivos permiten el posicionamiento controlado por ordenador de los distribuidores y portaobjetos de modo que se puedan realizar diferentes tratamientos con reactivos para cada una de las diversas muestras de tejido mediante la programacion apropiada del ordenador.

Los sistemas de instrumentacion ilustrativos se disenan para aplicar secuencialmente reactivos a secciones de tejido u otras muestras (tales como una muestra de sangre) montadas en portaobjetos de vidrio de una por tres pulgadas en condiciones ambientales controladas. El instrumento realiza varias funciones basicas, tales como la aplicacion de reactivos, lavado (para eliminar un reactivo aplicado previamente), drenaje con chorro (para reducir el volumen de tampon residual en un portaobjetos despues del lavado), la aplicacion de un aceite fluido (para que contenga los reactivos y prevenga la evaporacion) y otras funciones del instrumento. Los instrumentos de tincion ejemplares procesan los portaobjetos en una rueda giratoria. Los portaobjetos mantienen una posicion estacionaria y una rueda de distribuidor gira los reactivos por encima de los portaobjetos fijos. Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar usando diversas configuraciones fisicas. El procedimiento de clarification y tincion de tejido u otra muestra biologica en un portaobjetos consiste en la repetition secuencial de las funciones basicas del instrumento descritas anteriormente. Esencialmente, se aplica un reactivo a la muestra y, a continuation, se incuba durante un tiempo especificado a una temperatura especifica. Cuando se complete el tiempo de incubation, el reactivo se elimina por lavado del portaobjetos y se aplica el siguiente reactivo, se incuba, se elimina por lavado, etc., hasta que se hayan aplicado todos los reactivos y se haya completado el procedimiento de tincion.

Para la divulgation relacionada, se hace referencia a Richards et al., pat. de EE. UU. n.° 6.296.809, que describe un aparato y procedimientos para tenir o tratar automaticamente multiples muestras de tejidos montadas en portaobjetos de modo que cada muestra pueda recibir un protocolo de tincion o tratamiento individualizado incluso cuando dichos protocolos requieran diferentes parametros de temperatura. Mas especificamente, se describe un aparato que comprende un instrumento de tincion accionado por codigo de barras y controlado por ordenador que aplica automaticamente reactivos quimicos y biologicos a tejido o celulas montadas o fijadas a portaobjetos de vidrio estandar. Una pluralidad de portaobjetos se monta en un conjunto circular sobre una rueda que gira, dirigida mediante el ordenador, a una localization de distribution, disponiendo cada portaobjetos debajo de una serie de distribuidores de reactivos sobre una segunda rueda giratoria posicionada por encima de los portaobjetos. Cada portaobjetos recibe los reactivos seleccionados (por ejemplo, sondas de ADN y/o anticuerpos) y se lava, mezcla y/o calienta en una secuencia optima y durante el periodo de tiempo requerido. La muestra se puede montar en un portaobjetos de vidrio. El portaobjetos de vidrio se puede configurar para que sea compatible con un instrumento automatizado de tincion en portaobjetos.

A. Evaluation de CTC del cancer de prostata

En 2008, se estimo que solo el cancer de prostata representara un 25 % de todos los canceres en hombres y representara un 10 % de todas las muertes por cancer en hombres (Jemal et al., CA Cancer J. Clin. 58:71-96, 2008). El cancer de prostata, tipicamente, se diagnostica con un tacto rectal (“DRE”) y/o un cribado con respecto al antigeno prostatico especifico (PSA). Un hallazgo anomalo en el DRE y/o un nivel de PSA en suero elevado (por ejemplo, >4 ng/ml) pueden indicar la presencia de cancer de prostata. Cuando una prueba de PSA o DRE es anomala, se puede usar ecografla transrectal para explorar la prostata y mostrar cualquier area sospechosa. Se usan biopsias de diversos sectores de la prostata para determinar si el cancer de prostata esta presente.

Los oncologos tienen una serie de opciones de tratamiento disponibles, incluyendo diferentes combinaciones de antineoplasicos que se caracterizan como “tratamientos habituales” y una serie de farmacos que no llevan una information contenida en la ficha tecnica para un cancer particular, pero para los que hay pruebas de eficacia en ese cancer. La mejor posibilidad de obtener un buen desenlace clinico con el tratamiento requiere que los enfermos reciban de inmediato (un) tratamiento(s) del cancer optimo(s) y disponible(s) y que dicho(s) tratamiento(s) se inicie(n) lo mas rapido posible tras el diagnostico. Por otro lado, algunos tratamientos del cancer tienen efectos adversos significativos sobre la calidad de vida; por tanto, es igualmente importante que los enfermos de cancer no reciban innecesariamente (un) tratamiento(s) potencialmente danino(s) y/o ineficaz/ineficaces.

Actualmente, los siguientes productos terapeuticos estan disponibles para el tratamiento del cancer de prostata resistente a la castration (CPRC): inmunoterapia con sipuleucel-T, quimioterapia con docetaxel, cabazitaxel, radioterapia osea con radio 223, MDV-3100 antiandrogenico y tratamiento hormonal con abiraterona. Comprender el mejor tratamiento y la secuencia de tratamientos no se comprende bien, dado que cada tratamiento tiene tanto pacientes que no responden al tratamiento como pacientes que responden muy bien al tratamiento. Dado el entorno metastasico del CPRCm, se puede realizar un seguimiento de las CTC en estos enfermos usando un recuento. Ademas, los enfermos con una respuesta positiva a los tratamientos citotoxicos (docetaxel y cabitaxel) y de inmunoterapia (sipuleucel-T) tienen gammagraflas oseas y mediciones de PSA heterogeneas. Como tal, PSA y las gammagraflas oseas no siempre son un marcador indirecto fiable de la progresion en enfermos de CPRC. Muchos enfermos tambien albergan resistencia de novo a los tratamientos citotoxicos o de inmunoterapia, sin ningun buen marcador de la progresion.

Dado que algunos canceres de prostata no se necesitan tratar, mientras que otros casi siempre son mortales, y, ademas, dado que el tratamiento de la enfermedad puede ser desagradable en el mejor de los casos, hay una fuerte necesidad de obtener procedimientos que permitan a los cuidadores predecir la evolucion esperada de la enfermedad, incluyendo la probabilidad de recidiva del cancer, supervivencia a largo plazo del enfermo, respuesta esperada a un tratamiento particular, y similares, y seleccionar la opcion de tratamiento mas apropiada en consecuencia. Un procedimiento automatizado de analisis de CTC y kits para el mismo proporcionarla un valioso beneficio a los enfermos de cancer. Puesto que la sangre es accesible y facil de extraer, es de gran necesidad un analisis automatizado de CTC para la detection del cancer en estadio temprano, asl como para el seguimiento de la progresion neoplasica y de la recidiva.

Por tanto, se proporcionan procedimientos de caracterizacion de un cancer de prostata, tal como cancer de prostata resistente a la castration (CPRC) o CPRC metastasico (CPRCm). Dichos procedimientos pueden incluir obtener o aislar las CTC de un sujeto que tiene cancer de prostata. El procedimiento puede incluir ademas detectar una o mas moleculas relacionadas con el cancer de prostata en las CTC (o en una muestra de cancer de prostata separada), por ejemplo, usando sondas de acido nucleico o anticuerpos marcados especificos para dichas moleculas relacionadas con el cancer de prostata. En algunos ejemplos, la molecula relacionada con el cancer de prostata detectada se compara con la expresion de la una o mas de otras moleculas relacionadas con el cancer de prostata en la muestra de cancer de prostata con respecto a un control que representa la expresion de la una o mas de otras moleculas relacionadas con el cancer de prostata esperadas en una muestra de prostata normal. Las moleculas relacionadas con el cancer de prostata incluyen aquellas cuya expresion se sabe que esta alterada (tal como incrementada o disminuida) en una muestra de cancer de prostata, en relation con una muestra de cancer de prostata normal. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: protelna de arresto celular especifico 1 (GAS1; OMIM 139185), miembro de la familia del sitio de integration de MMTV de tipo wingless 5 (WNT5A; OMIM 164975), timidina cinasa 1 (TK1; OMIM 188300), homologo del oncogen virico del sarcoma murino V-raf B1 (BRAF; OMIM 164757), variante de translocation de ETS 4 (ETV4; OMIM 600711), protelna tumoral p63 (OMIM 603273), BCL-2 (OMIM 151430), Ki67 (OMIM 176741), ERK5 (OMIM 602521), receptor androgenico (RA; OMIM 313700), antigeno prostatico especifico (PSA; OMIM 176820), variante de translocacion de ETS 1 (ETV1; OMIM 600541), antigeno prostatico especifico de membrana (PSMA; OMIM 600934), inhibidor de serina proteasa 1, de tipo Kazal (SPINK1; OMIM 167790), medidas de morfologia nuclear (incluyendo caracteristicas de variation de tamano y forma nucleares) o combinaciones de los mismos.

El uso de ambas sondas para PTEN y para CEN-10 incrementa la precision de la determination de que este presente una deletion de PTEN. Por ejemplo, en ensayos previos, solo se usaron sondas para PTEN. Si no habia senal detectable de la sonda para PTEN, se deducia que la muestra tenia una delecion de PTEN. Sin embargo, dichos procedimientos no explican otras razones por las que no se detecto ninguna senal, lo que incrementa, por tanto, el numero de determinaciones de deleciones de PTEN falsas. Para incrementar la precision, los procedimientos divulgados tambien usan una sonda especifica para centromero 10. La delecion de PTEN no da como resultado la delecion del centromero 10. Por tanto, solo si se obtiene una senal positiva de la sonda para CEN-10, se considera la senal de la sonda para PTEN. Por ejemplo, si no se detecta ninguna senal en la muestra que contiene CTC para la sonda para CEN-10, el ensayo se descarta como defectuoso. Sin embargo, si se detecta una senal en la muestra que contiene CTC para la sonda para CEN-10 (que indica la presencia de CEN-10), a continuation, se considera la senal o la ausencia de senal de la sonda para PTEN, en la que una senal positiva para CEN-10 y negativa para PTEN indica una delecion de PTEN, mientras que una senal positiva para CEN-10 y positiva para PTEN indica la ausencia de una delecion de PTEN. En algunos ejemplos, el procedimiento incluye ademas comparar las senales detectadas de las sondas de acido nucleico para ERG, PTEN y CEN-10 con una celula CTC que tenga (1) ningun reordenamiento de ERG, ninguna delecion de PTEN y un CEN-10 detectable o (2) uno o mas reordenamientos de ERG, una o mas deleciones de PTEN y un CEN-10 detectable.

En modos de realization ilustrativos, se usa un procedimiento de analisis de una muestra que contiene CTC usando un instrumento automatizado que se refiere a un sujeto que tiene cancer de prostata. En un modo de realizacion, el cancer de prostata es un cancer de prostata resistente a la castracion (CPRC). En otro modo de realizacion, el CPRC es un CPRC metastasico (CPRCm). En un modo de realizacion, se caracterizan cuatro marcadores genomicos, incluyendo los cuatro marcadores ERG, PTEN y CEN-10. En un modo de realizacion especifico, las sondas de acido nucleico son una sonda para ERG en 5', una sonda para ERG en 3', una sonda para PTEN y una sonda para CEN-10.

B. Aislamiento de las celulas tumorales circulantes

Se conocen procedimientos para aislar o enriquecer las CTC, por ejemplo, de sangre, fracciones de la misma (tal como suero) o medula osea. Sin embargo, antes de la presente divulgation, esos procedimientos no han podido proporcionar una muestra que se pueda trasladar a un sistema de tincion de tejidos automatizado. En un ejemplo, las CTC se aislan de una muestra usando anticuerpos u otros agentes de union especifica frente a uno o mas antigenos de superficie celular presentes en las CTC (pero no presentes en los globulos sanguineos, tales como leucocitos). Un antigeno ejemplar es la molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM). Por ejemplo, se puede usar el sistema CellSearch (Veridex) para aislar las CTC, que usa ferrofluidos cargados con un anticuerpo para EpCAM para capturar las CTC. En algunos ejemplos, las CTC se obtienen y aislan de un enfermo despues del diagnostico de cancer, y, en algunos ejemplos, despues de la prostatectomla u otro tratamiento. En ejemplos ilustrativos, el aislamiento de las CTC genera aproximadamente 900 gl de una suspension celular que contiene las CTC y otras celulas (por ejemplo, globulos blancos). En un ejemplo, las celulas enriquecidas se unen a microesferas magneticas.

Los procedimientos de aislamiento de las CTC incluyen enfoques que se basan en las propiedades fisicas, la expresion de biomarcadores o las caracterlsticas funcionales de las CTC. En un ejemplo, se obtiene una muestra de sangre o medula osea del enfermo que se sospecha que tiene, se sabe que tiene o ha tenido cancer (tal como cancer de prostata, por ejemplo, un CPRC o CPRCm) y se usa para aislar las CTC. En algunos ejemplos, las CTC se obtienen y aislan despues del diagnostico de cancer, por ejemplo, despues de la prostatectomla u otros tratamientos. En algunos ejemplos, el enfermo tiene cancer de prostata confirmado bioquimica o histologicamente, PSA elevado o ambos. El sujeto puede ser un ser humano u otro mamifero (tal como un perro o un gato) con cancer. Un sujeto tipico con cancer de prostata es un varon humano; sin embargo, cualquier mamifero que tenga un cancer de prostata puede servir como fuente de CTC. En un ejemplo, se obtienen de 1 a 10 ml de sangre, tal como 7,5 ml. En algunos ejemplos, la sangre se fracciona y las CTC se aislan de la fraccion de suero. En algunos ejemplos, las CTC se aislan sometiendo la muestra de sangre a lisis diferencial para eliminar los globulos rojos. En algunos ejemplos, las CTC se aislan de la medula osea.

En un ejemplo, las CTC se aislan usando anticuerpos frente a uno o mas antigenos de superficie celular presentes en las CTC (pero no presentes en los globulos sanguineos, tales como leucocitos). Las CTC expresan marcadores de superficie de celulas epiteliales que estan ausentes de los leucocitos normales. Por ejemplo, la molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM) se expresa en celulas de origen epitelial, pero esta ausente en los globulos sanguineos. Por lo tanto, se pueden usar anticuerpos especificos para EpCAM para aislar las CTC, tales como un anticuerpo policlonal o monoclonal, o fragmento del mismo. Dichos anticuerpos estan disponibles comercialmente. En un ejemplo, los anticuerpos especificos para EpCAM se conjugan a un sustrato solido, tal como una microesfera, un portaobjetos o una placa de microvaloracion, por ejemplo, microesferas magneticas. Esto posibilita una purificacion facil de las CTC unidas a los anticuerpos para EpCAM, de tal manera que las celulas no unidas a los anticuerpos para EpCAM se pueden separar facilmente de las CTC. Las CTC unidas a los anticuerpos para EpCAM y, por tanto, el soporte solido, se pueden purificar, por ejemplo, lavando las celulas no unidas o capturando las celulas unidas a traves de un campo magnetico. En un ejemplo especifico, se usa el sistema CellSearch (Veridex) para aislar las CTC. Este procedimiento usa ferrofluidos cargados con un anticuerpo para EpCAM para capturar las CTC. En algunos ejemplos, las CTC aisladas tambien se tinen con DAPI.

Las CTC aisladas se pueden analizar adicionalmente para garantizar que las celulas aisladas sean CTC. Por ejemplo, se pueden analizar las celulas aisladas usando reactivos de identificacion de CTC, tal como determinar si las citoqueratinas (CQ) epiteliales citoplasmicas y CD45 estan presentes o ausentes. Se usa el marcador especifico de leucocitos CD45 como control para excluir leucocitos contaminantes. Las CTC son aquellas celulas capturadas por EpCAM que son tanto positivas para citoqueratinas como negativas para CD45. Por ejemplo, se pueden usar sondas de acido nucleico, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y/o policlonales) u otros agentes de union especifica (tales como aptameros) especificos para CQ o CD45. Los anticuerpos se pueden detectar mediante marcado directo de los propios anticuerpos, por ejemplo, con marcadores radioactivos, marcadores fluorescentes, marcadores de haptenos, tales como biotina, o una enzima, tal como peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina. De forma alternativa, se usa un anticuerpo primario no marcado junto con un anticuerpo secundario marcado, que comprende antisueros, antisueros policlonales o un anticuerpo monoclonal especifico para el anticuerpo primario.

En un ejemplo, las CTC se aislan basandose en sus propiedades fisicas. Varias propiedades fisicas distinguen a las CTC de la mayoria de los globulos sanguineos normales. Estas incluyen el tamano mas grande de la mayoria de las celulas epiteliales y las diferencias en densidad, carga, propiedades migratorias y algunas propiedades de tipos de celulas especificos (por ejemplo, granulos melanociticos en celulas de melanoma). Se pueden usar diferencias en la densidad de flotacion para separar las celulas mononucleadas, incluyendo las CTC, de los globulos rojos a traves de centrifugacion con gradiente. El aislamiento de las CTC en virtud de su tamano incrementado, en comparacion con los leucocitos, se puede conseguir usando enfoques basados en filtracion, tales como aislamiento por tamano de celulas tumorales epiteliales y sistemas microelectromecanicos. Aunque la mayoria de las CTC derivadas de canceres epiteliales son mas grandes que los leucocitos, hay una variacion significativa en su intervalo de tamanos. En un ejemplo, las CTC se aislan usando procedimientos basados en filtros.

En un ejemplo, se usa una plataforma microfluidica para el aislamiento en una unica etapa de CTC de muestras de sangre no procesadas (por ejemplo, vease Nagrath et al., Nature. 450:1235-1239, 2007; Stott et at., Sci. Transl. Med. 2:25ra23, 2010). Por ejemplo, el chip para CTC es una camara de silicio trazada con 78.000 micropostes que estan recubiertos con un anticuerpo anti-EpCAM. La sangre entera fluye a traves del chip, permitiendo la captura de las CTC en los micropostes. En otro ejemplo, se usa un chip de espina de pescado, que hace uso de un microdispositivo de mezclado con agitadora vertical (Stott et at., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107:18392-18397, 2010). En lugar de usar micropostes tridimensionales para romper las ilneas de flujo y potenciar las colisiones celulares con los postes recubiertos de anticuerpo, el chip para HB usa patrones de flujo microfluldicos calibrados para hacer que las celulas entren en contacto con las paredes recubiertas de anticuerpo del dispositivo.

C. Aplicacion de las CTC a sustratos solidos

Las CTC, tales como las CTC aisladas o las presentes en una muestra (tal como sangre o una fraccion de la misma, o medula osea), se pueden aplicar sobre un sustrato (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio). Por ejemplo, despues de aislar las CTC, se pueden adherir a un sustrato. En otro ejemplo, despues de obtener la muestra (y en algunos ejemplos, lisar los globulos rojos), se pueden adherir los globulos blancos restantes y las CTC a un sustrato.

En ejemplos ilustrativos, las CTC se pueden procesar por citoespin o frotis (es decir, el procedimiento de rodillo) o inmunorrecubrir (por ejemplo, adherir a un recubrimiento de anticuerpos para PSMA) sobre el sustrato. Los sustratos solidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, un sustrato de policarbonato, un sustrato de vidrio (tal como un portaobjetos de vidrio que este cargado de manera positiva) u otro sustrato adecuado. La superficie del sustrato se puede recubrir o modificar mediante medios quimicos o fisicos, tales como un recubrimiento de protelnas o aminoacidos.

En un ejemplo, las CTC se pueden aplicar a un sustrato citocentrifugando las celulas sobre un portaobjetos de vidrio, en general, siguiendo los protocolos publicados. Por ejemplo, se pueden centrifugar las celulas sobre portaobjetos de vidrio recubiertos previamente disponibles comercialmente (por ejemplo, portaobjetos VWR, Superfrost Plus) a 400 rpm durante 4 minutos usando una citocentrifugadora (por ejemplo, Cytospin 4, Shandon Thermo Scientific). Debido a que la integridad de las celulas se puede perder debido a las fuerzas centrlfugas, se puede usar un procedimiento de deposito de diseminacion de las celulas como una citocentrifugacion alternativa. El procedimiento de diseminacion es mas suave que el de citocentrifugacion, preservando mejor, de este modo, la forma y el volumen celulares antes de la fijacion. Este procedimiento tambien tiende a aplicar las CTC a un sustrato de una manera, en general, homogenea. En ejemplos ilustrativos, se usa un procedimiento de rodillo para depositar las CTC sobre el sustrato.

Los componentes de la celula suspendidos en un liquido sobre una superficie se pueden distribuir homogeneamente sobre un sustrato como sigue: posicionar un portador liquido que tenga una superficie superior sobre una mesa, posicionar una barra de distribucion por encima de la superficie superior del portador liquido a una distancia desde aproximadamente 50 pm a aproximadamente 1000 pm (tal como de 350 pm a aproximadamente 1000 pm), aplicar un liquido que comprenda componentes de la celula suspendidos en el mismo sobre la superficie superior del portador liquido y mover una o mas de las barras de distribucion, la mesa y el portador liquido para distribuir uniformemente los componentes de la celula suspendidos en el liquido sobre la superficie superior del portador liquido. En un ejemplo, el liquido se adhiere lo suficiente a la barra de distribucion para posibilitar el movimiento y la distribucion del liquido uniformemente sobre la superficie superior del portador liquido. En otro ejemplo, se separan los componentes de la celula en el liquido. En otro ejemplo, los componentes de la celula en el liquido comprenden las CTC. La superficie superior del portador liquido puede incluir un recubrimiento u otra propiedad de retention de las celulas. En un ejemplo, la superficie del portador liquido posicionado sobre la mesa tiene una superficie cargada al menos parcialmente de manera electrostatica o un recubrimiento de uno o mas anticuerpos y/o moleculas lipofilas sobre la misma.

En otros ejemplos mas, el procedimiento incluye ademas al menos una de estas etapas: a. eliminar el liquido despues de que el liquido se haya distribuido homogeneamente sobre la superficie del portador liquido, en el que una capa uniforme de componentes de la celula se retiene sobre la superficie del portador; b. secar el portador liquido para retener los componentes de la celula posicionados uniformemente sobre la superficie del portador; y c. aplicar fluido o fluidos adicional(es) a la superficie superior del portador liquido despues de secar el portador liquido, tal como con propositos de fijacion o tincion de los componentes de la celula retenidos en la misma. En un ejemplo, los componentes de la celula suspendidos en el liquido incluyen al menos un subgrupo que se va a detectar. En otro ejemplo, el portador liquido es un portaobjetos. Se hace referencia a la solicitud de EE. UU. en tramitacion conjunta n.° de serie 61/621.107 para la divulgation relacionada con el procedimiento de rodillo.

D. Fijacion y permeabilizacion

En algunos ejemplos, despues de que las CTC se acoplan a un sustrato, se fijan, por ejemplo, con un agente de reticulation, tal como FTN. Por ejemplo, se pueden fijar las CTC despues del acoplamiento en FTN al 10 % (por ejemplo, a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos, al menos 15 minutos o al menos 20 minutos, tal como de 5 a 30, de 10 a 30 o de 15 a 30 minutos, tal como 20 minutos), seguido de aclaramiento en solution salina tamponada con fosfato (PBS) (tal como 3x 5 minutos a temperatura ambiente). A continuation, se pueden sumergir los portaobjetos en PBST (Tween 20 al 0,2 % en PBS) para su permeabilizacion (por ejemplo, a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos, al menos 15 minutos o al menos 20 minutos, tal como de 5 a 30, de 10 a 30 o de 15 a 30 minutos, tal como 20 minutos), aclarar en agua DI y deshidratar en series de contenido de alcohol ascendente (por ejemplo, EtOH al 80 %, al 90 % y absoluto, 1 minuto cada una), seguido de secado al aire. Las muestras se pueden almacenar a -20 °C hasta su uso en cajas hermeticas.

Otros fijadores ejemplares para las preparaciones de celulas y tejido montados se conocen bien en la tecnica e incluyen, sin limitacion, fijador de Bouin alcoholico al 95 %; fijador de alcohol al 95 %; fijador B5, fijador de Bouin, fijador de formol, fijador de Kamovsky (glutaraldehido), fijador de Hartman, fijador de Hollande, solucion de Orth (fijador de dicromato) y fijador de Zenker (vease, por ejemplo, Carson, Histotechology: A Self-Instructional Text, Chicago:ASCP Press, 1997). En algunos ejemplos, las celulas se tratan despues de su fijacion con enzimas, tales como proteasas, para abrir estructuras celulares y, de este modo, hacer que las dianas esten mas disponibles para sus ligandos, tales como sondas de acido nucleico o anticuerpos.

En algunos ejemplos, el procedimiento tambien incluye fijar las CTC sobre el portaobjetos, por ejemplo, usando una solucion de formol tamponado neutro (FTN) al 10 %, que es aproximadamente formaldehido al 3,7 % en solucion salina tamponada con fosfato, preservando, de este modo, las moleculas de acido nucleico diana en las CTC.

Los inventores han identificado procedimientos de fijacion y permeabilizacion que previenen la perdida de numeros significativos de celulas. La perdida de celulas es perjudicial para el analisis de CTC debido al muy bajo numero de estas celulas disponibles para el analisis. Una perdida sesgada de las CTC harla que un procedimiento, como se describe en el presente documento, fuera relativamente inadecuado para el proposito de la evaluacion de CTC. Sin embargo, incluso una perdida no sesgada de celulas en el portaobjetos disminuye la sensibilidad de la evaluacion. En consecuencia, se dedico una experimentacion considerable a establecer las etapas de fijacion y permeabilizacion que previnieran la perdida significativa de celulas durante la evaluacion posterior. La perdida de celulas de interes es el numero de celulas perdidas desde antes de la fijacion hasta posteriormente a la obtencion de imagenes. De acuerdo con una medida, la perdida significativa de celulas se describe como la perdida de celulas que es estadlsticamente significativa en comparacion con la desviacion estandar en tres regiones contadas que tienen un numero de celulas en exceso de 1000 celulas. De acuerdo con otra medida, la perdida significativa de celulas es la perdida de mas de aproximadamente un 10 % de las celulas. Por tanto, en un ejemplo, los procedimientos divulgados retienen al menos un 90 % de las celulas CTC, al menos un 95 % de las celulas CTC o al menos un 98 % de las celulas CTC, tal como un 90-100 %, 90-98 % o 90-95 % de las CTC retenidas.

Los ejemplos de los efectos de diferentes condiciones de fijacion y tratamiento se muestran en las tablas 1-3. La tabla 1 muestra los efectos de una fijacion con FTN al 10 % de 10 minutos y una fijacion con metanol de 3 minutos sobre la retencion de las celulas posterior a cytochex (>30 minutos) y una fijacion previa con formol al 0,4 % de 2 minutos. Los valores de retencion de las celulas se determinaron identificando tres regiones de interes por portaobjetos, en los que una region de interes es una de 1 mm x 1 mm. Se conto el numero de nucleos tenidos con DAPI y se evaluo para cada region de interes a 20 aumentos. Se calcula el promedio y la desviacion estandar a partir de las tres regiones de interes.

La tabla 1 muestra dos de los procedimientos de fijacion que dieron como resultado una perdida no significativa de retencion de las celulas. En este caso, la perdida de celulas es menor que la desviacion estandar del procedimiento de recuento de las celulas, por tanto, se considera insignificante.

Tabla 1: Efecto de la fijacion sobre la retencion de las celulas.

La tabla 2 muestra dos de los procedimientos de fijacion a medida que se realiza un seguimiento de la perdida de celulas a traves de un procedimiento de IF y FISH con etapas de recuperacion de dianas ejemplares. En este caso, la perdida de celulas es menor que la desviacion estandar del procedimiento de recuento de las celulas, por tanto, se considera insignificante. La tercera y cuarta lineas indican que el experimento se realizo por duplicado en un segundo portaobjetos con los resultados que se muestran en las mismas.

Tabla 2: Retencion de las celulas a traves de IF y FISH.

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La tabla 3 muestra dos de los procedimientos de fijacion a medida que se realiza un seguimiento de la perdida de celulas a traves de un procedimiento de IF y FISH con etapas de recuperacion de dianas ejemplares para realizar un seguimiento del efecto de PBST (una solucion salina tamponada con fosfato con tensioactivo TWEEN®-20 al 0,2 %). En este caso, la perdida de celulas es menor que la desviacion estandar del procedimiento de recuento de las celulas, por tanto, se considera insignificante.

Tabla 3: Efecto de PBST sobre la retencion de las celulas a traves de IF y FISH.

Por tanto, en algunos ejemplos, las CTC se fijan usando una fijacion previa con formol (tal como formol del 0,1 % al 1 %, por ejemplo, formol al 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 %) de 1-5 minutos (tal como de 1, 2, 3, 4 o 5 minutos) seguido de una fijacion con FTN (tal como FTN del 1 % al 20 %, por ejemplo, FTN al 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 20 %) de 5-15 minutos (tal como de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 minutos) y una fijacion con metanol de 1-5 minutos (tal como de 1, 2, 3, 4 o 5 minutos), tal como usando una fijacion previa con formol al 0,4 % de 2 minutos seguida de una fijacion con FTN al 10 % de 10 minutos y una fijacion con metanol de 3 minutos.

E. Recuperacion de dianas

El procedimiento de analisis de una muestra que contiene CTC usando un instrumento automatizado puede incluir una etapa de recuperacion de dianas en la muestra. La recuperacion de dianas puede incluir poner en contacto la muestra con un reactivo de recuperacion de dianas. Los reactivos de recuperacion de dianas ejemplares para dianas de acido nucleico (ISH) pueden incluir una solucion que incluya acido etilendiaminotetraacetico (EDTA). Los reactivos de recuperacion de dianas ejemplares para dianas proteicas (IHQ) pueden incluir una solucion de acondicionamiento de celulas, tal como un tampon de acido borico. En un ejemplo, la recuperacion de dianas incluye poner en contacto la muestra con un tampon basado en tris que tenga un pH ligeramente basico y aplicar calor de modo que se rompan los enlaces covalentes resultantes de la fijacion. En otro ejemplo, el procedimiento incluye poner en contacto la muestra con una proteasa. En otro ejemplo, el procedimiento incluye poner en contacto la muestra con un tampon de citrato que tenga un pH ligeramente acido y aplicar calor de modo que se rompan los enlaces covalentes resultantes de la fijacion. En otro ejemplo mas, la recuperacion de dianas incluye poner en contacto la muestra con un tampon basado en tris que tenga un pH ligeramente basico y aplicar calor de modo que se rompan los enlaces covalentes resultantes de la fijacion y poner en contacto la muestra con una proteasa antes de ponerla en contacto con reactivos de identificacion de CTC y el procedimiento comprende ademas poner en contacto la muestra con un tampon de citrato que tenga un pH ligeramente acido y aplicar calor de modo que se rompan los enlaces covalentes resultantes de la fijacion y poner en contacto la muestra con una proteasa antes de poner en contacto la muestra con reactivos de caracterizacion de CTC. En un ejemplo (por ejemplo, si la diana es un acido nucleico), el contacto se puede hacer a una temperatura de aproximadamente 95 °C durante entre aproximadamente 2 y aproximadamente 90 minutos. En un ejemplo (por ejemplo, si la diana es una protelna), el contacto se puede hacer a una temperatura de aproximadamente 100 °C durante entre aproximadamente 2 y aproximadamente 90 minutos. Una lista parcial de posibles reactivos aparece en Analytical Morphology, Gu, ed., Eaton Publishing Co. (1997) en las pp. 1-40. Se pueden incluir dodecilsulfato de sodio (SDS) y/o etilenglicol en la solucion de acondicionamiento. Ademas, se pueden anadir iones de metal u otros materiales a estos reactivos para incrementar la eficacia del acondicionamiento de celulas. Las soluciones de acondicionamiento de celulas ejemplares estan disponibles de Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ (acondicionamiento de celulas 1 (CC1), con n.° de catalogo: 950-124; acondicionamiento de celulas 2 (CC2), con n.° de catalogo: 950-123; SSC (10X), con n.° de catalogo: 950-110; acondicionamiento de celulas UlTrA (ULTRA CC1), con n.° de catalogo: 950-224; acondicionamiento de celulas ULTRA (ULTRA CC2), con n.° de catalogo: 950-223, proteasa 1, con n.° de catalogo: 760-2018; proteasa 2, con n.° de catalogo: 760-2019; proteasa 3, con n.° de catalogo: 760-2020). En un ejemplo, la aplicacion del reactivo de union IHQ o el reactivo de union de hibridacion in situ se produce posteriormente a la aplicacion del reactivo de acondicionamiento de celulas y antes de la aplicacion del reactivo cromogenico.

Como se describe en el presente documento en asociacion con las etapas de fijacion y permeabilizacion, la seleccion de los reactivos de recuperacion de dianas influye en la retencion de las celulas y en la expresion de las dianas. Tras tratar una muestra con un procedimiento de recuperacion de dianas que sea demasiado intensivo, se puede producir una perdida significativa de celulas del sustrato, se pueden desnaturalizar las dianas de modo que sean indetectables o combinaciones de los mismos. Por el contrario, tras tratar una muestra con un procedimiento de recuperacion de dianas que no sea adecuado, las senales asociadas con las dianas no seran evidentes durante la obtencion de imagenes. Confundir la identificacion de las etapas de recuperacion de dianas apropiadas es que el procedimiento se relaciona inversamente con la fijacion en tanto que una mayor fijacion requiere una mayor recuperacion y, por tanto, los cambios en la fijacion necesitan el nuevo desarrollo de procedimientos de recuperacion apropiados. Ademas, confundir la identificacion de las etapas de recuperacion de dianas apropiadas es que se descubrio que las dianas proteicas y las dianas genicas requieren habitualmente diferentes condiciones de recuperacion para la deteccion adecuada. Puesto que el presente procedimiento incluye la deteccion de tanto dianas proteicas como genicas, se desarrollo un enfoque de recuperacion que posibilitaba este doble analisis genicoproteico y se divulga en el presente documento. De acuerdo con un enfoque, las protelnas se recuperan en primer lugar. A continuacion, las protelnas se marcan con un resto de union especifica (por ejemplo, un anticuerpo) antes de recuperar las dianas genicas. Este enfoque posibilita el uso de reactivos de recuperacion de dianas genicas que, sin la interaction con union especifica, desnaturalizarlan la diana al grado que no se podria detectar posteriormente. Por el contrario, preservar la diana proteica darla como resultado el uso de reactivos de recuperacion de genes que expresan de manera inadecuada las dianas genicas.

Un procedimiento de analisis de una muestra que contiene CTC usando un instrumento automatizado puede incluir aplicar un reactivo de aclaramiento. Entre las diversas etapas descritas en el presente documento y como parte del sistema descrito en el presente documento, se pueden anadir etapas de aclaramiento para eliminar reactivos residuales que no han reaccionado de la etapa anterior. Las etapas de aclaramiento pueden incluir ademas incubaciones que incluyan mantener un reactivo de aclaramiento en la muestra durante un tiempo determinado previamente a una temperatura determinada previamente con o sin mezclado. Las condiciones apropiadas para las etapas de aclaramiento pueden ser distintas entre las diversas etapas. Los reactivos de aclaramiento ejemplares estan disponibles de Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ (tampon de reaction (10x), con n.° de catalogo: 950-300; lavado de tinciones especiales (10x), con n.° de catalogo 860-015).

F. Identificacion de las CTC

En algunos ejemplos, el procedimiento de analisis de una muestra que contiene CTC usando un instrumento automatizado incluye poner en contacto la muestra con reactivos de identificacion de CTC usando el instrumento automatizado. Los reactivos de identificacion de CTC permiten la determinacion de que una celula sea una celula CTC. Los marcadores de protelnas de CTC ejemplares incluyen CD45, citoqueratina, ERG, receptor androgenico y PSMA. En un modo de realization, el procedimiento incluye inmunofluorescencia para obtener imagenes de los reactivos de identificacion de CTC (tales como anticuerpos marcados para obtener imagenes especificos para los marcadores de protelnas de CTC). La obtencion de imagenes de la muestra puede incluir usar filtros de paso de banda multiespectrales. En algunos modos de realizacion, la inmunofluorescencia procede de anticuerpos marcados directamente con fluoroforos o la inmunofluorescencia resulta de la excitation de los fluoroforos con luz visible filtrada espectralmente. La luz visible filtrada espectralmente puede incluir un primer intervalo seleccionado para excitar un primer fluoroforo y un segundo intervalo seleccionado para excitar un segundo fluoroforo, en la que el primer intervalo seleccionado no excita significativamente el segundo fluoroforo y el segundo intervalo seleccionado no excita significativamente el primer fluoroforo. Un experto en la tecnica apreciara que se pueden excitar fluoroforos adicionales en el intervalo apropiado, por ejemplo, si se van a detectar mas de dos protelnas. En otro ejemplo, obtener imagenes de la muestra incluye adquirir una primera imagen de inmunofluorescencia de la muestra excitada por el primer intervalo seleccionado y adquirir una segunda imagen de inmunofluorescencia de la muestra excitada por el segundo intervalo seleccionado y localizar las CTC localizando los reactivos de identificacion de CTC incluye comparar o superponer la primera imagen de inmunofluorescencia y la segunda imagen de inmunofluorescencia. Un experto en la tecnica apreciara que se pueden obtener y superponer imagenes adicionales, por ejemplo, si se van a detectar mas de dos protelnas. Por ejemplo, la obtencion de imagenes de la primera imagen de inmunofluorescencia identifica celulas CQ+ y la segunda imagen de inmunofluorescencia identifica celulas CD45+, en la que la comparacion o superposition incluye identificar celulas que sean CQ+ y CD45-. En otro ejemplo, localizar las CTC localizando los reactivos de identificacion de CTC incluye analizar algoritmicamente la primera imagen de inmunofluorescencia y la segunda imagen de inmunofluorescencia (o incluso mas imagenes) usando un ordenador. En otro ejemplo, analizar algoritmicamente incluye examinar digitalmente las imagenes para medir el tamano de la celula, la localization del compartimento de la celula de los marcadores y/o la intensidad de la expresion del marcador. En un ejemplo, la obtencion de imagenes espectrales de las CTC incluye la obtencion de imagenes multiespectrales.

El procedimiento puede incluir aplicar un reactivo cromogenico de modo que la muestra se tina especificamente. En un ejemplo, tenir especificamente incluye la aplicacion de una tincion primaria que tine selectivamente porciones de la muestra a traves de la adhesion asociada con hidrofobia, intercalation u otras asociaciones sin reconocimiento. En otros ejemplos ilustrativos, el procedimiento incluye aplicar un reactivo de union inmunohistoquimico (IHQ) o de inmunofluorescencia (IF). Como los terminos se usan en el presente documento, IF e IHQ difieren solo en la manera en la que se detectan. En particular, IF implica que la interaccion especifica se detecta usando fluorescencia (por ejemplo, usando microscopia de campo oscuro) e IHQ implica que la interaccion especifica se detecta usando cromogenos (por ejemplo, usando microscopia de campo claro). Como se usa en el presente documento de diversas maneras, el termino “IF” implica que se podria usar “IHQ” y viceversa. IHQ incluye el uso de anticuerpos que se unen especificamente a los epitopos de interes. Los epitopos, tambien denominados antigenos o secuencias antigenicas, son porciones de proteinas que se han establecido como un marcador de interes clinico. Por ejemplo, el epitopo puede ser una forma mutada de una proteina, un sitio de union proteina-proteina o una proteina normal que se expresa a una concentracion mas alta o bien mas baja que la normal, tal como en una muestra de control. La deteccion y/o cuantificacion de epitopos en diversas muestras biologicas se han usado para muchos propositos clinicos.

Tanto IHQ como ISH implican un acontecimiento de reconocimiento especifico entre una sonda de acido nucleico (ISH) o un anticuerpo (IHQ) y una diana en la muestra. Esta interaccion especifica marca la diana. El marcador se puede visualizar directamente (marcador directo) u observar indirectamente usando procedimientos quimicos de deteccion adicionales. La deteccion cromogenica, que implica el deposito de una sustancia cromogenica en las proximidades del marcador, implica etapas de deteccion adicionales para amplificar la intensidad de la senal para facilitar la visualizacion. La visualizacion de la senal amplificada (por ejemplo, el uso de moleculas indicadoras) permite que un observador localice dianas en la muestra.

La deteccion cromogenica ofrece un procedimiento de deteccion simple y rentable. Los sustratos cromogenicos han funcionado tradicionalmente mediante precipitacion cuando actuan mediante la enzima apropiada. Es decir, la sustancia cromogenica tradicional se convierte de un reactivo soluble en un precipitado coloreado insoluble tras ponerse en contacto con la enzima. El precipitado coloreado resultante no requiere ningun equipo especial para su procesamiento o visualizacion. La tabla 4 es una lista no exhaustiva de sistemas de cromogenos utiles dentro del alcance de la presente divulgacion:

Tabla 4: Reactivos de deteccion cromogenica.

La tabla 4, aunque no es exhaustiva, proporciona una vision de las variedades de sustancias cromogenicas disponibles en la actualidad (vease tambien el documento WO2012/024185, Kelly et al. “Substrates for Chromogenic detection and methods of use in detection assays and kits”).

Las CTC en el portaobjetos se pueden identificar como aquellas celulas que son CQ+ y CD45- (por ejemplo, usando anticuerpos para pan-CQ y CD45 como se describe a continuacion). En algunos ejemplos, las CTC tambien se tinen con DApI.

G. Caracterizacion de las CTC

En algunos ejemplos, el procedimiento de analisis de una muestra que contiene CTC incluye poner en contacto la muestra con reactivos de caracterizacion de CTC usando el instrumento automatizado. Los reactivos de caracterizacion de CTC son reactivos que permiten el analisis de un trastorno, tal como el pronostico o diagnostico de cancer, tal como cancer de prostata. En un modo de realizacion, los reactivos de caracterizacion de CTC incluyen sondas de acido nucleico dirigidas a marcadores genomicos (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 marcadores genomicos). Los marcadores genomicos se pueden analizar para determinar la expresion genica y/o reordenamientos/deleciones geneticas. Por ejemplo, los marcadores genomicos pueden incluir una sonda de expresion genica y una combinacion de sondas para reordenamientos/deleciones. En un modo de realizacion especifico, los marcadores genomicos incluyen ERG, PTEN y CEN-10. Por ejemplo, las sondas de acido nucleico pueden ser una sonda para ERG en 5', una sonda para ERG en 3', una sonda para PTEN y una sonda para CEN-10. En un modo de realizacion, los reactivos de caracterizacion de CTC incluyen sondas de acido nucleico dirigidas a marcadores genomicos y los reactivos de identificacion de CTC incluyen reactivos IHQ dirigidos a marcadores de protelnas de CTC. En un modo de realizacion especifico, los marcadores genomicos incluyen ERG, PTEN y CEN-10 y los marcadores de protelnas de CTC incluyen uno o mas de CD45, CQ, ERG, RA y PSMA (tales como 2, 3, 4 o 5 de estas protelnas).

En algunos modos de realizacion, los procedimientos para analizar una muestra que contiene CTC usando un instrumento automatizado incluyen obtener imagenes de la muestra. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir la obtencion de imagenes espectrales de las CTC por localizacion o la luminiscencia de imagenes espectrales de los reactivos de caracterizacion de CTC (por ejemplo, procediendo la luminiscencia de restos de union especifica marcados con puntos cuanticos). Los restos de union especifica se pueden marcar directamente (por ejemplo, con puntos cuanticos) o se marcan indirectamente (por ejemplo, con los puntos cuanticos, procediendo la luminiscencia de los puntos cuanticos que marcan los anticuerpos secundarios antihapteno, siendo los anticuerpos secundarios antihapteno especificos para haptenos que marcan los restos de union especifica). En un modo de realizacion, los restos de union especifica son sondas de acido nucleico y/o anticuerpos. En un modo de realizacion, la obtencion de imagenes espectrales de las CTC incluye excitar los puntos cuanticos con radiacion, tal como radiacion UV o UV cercano. En un ejemplo, la radiacion tiene un perfil de emision espectral con un maximo entre 300 y 400 nm. En otro ejemplo, la obtencion de imagenes espectrales de las CTC incluye la obtencion de imagenes hiperespectrales. La obtencion de imagenes espectrales se puede guiar mediante la etapa de localizar las CTC en las regiones de interes con exclusion de las regiones que carecen de interes. En otro ejemplo, las regiones de interes incluyen las CTC. En otro ejemplo, la luz visible filtrada espectralmente no da como resultado una luminiscencia de puntos cuanticos significativa. En otro ejemplo mas, la obtencion de imagenes de la muestra incluye inmunofluorescencia para obtener imagenes multiespectrales de los reactivos de identificacion de CTC y la obtencion de imagenes espectrales de las CTC incluye obtener imagenes hiperespectrales de los reactivos de caracterizacion de CTC. En un ejemplo, la obtencion de imagenes multiespectrales e hiperespectrales diferencia al menos aproximadamente cuatro reactivos de identificacion de CTC y/o reactivos de caracterizacion de CTC, al menos aproximadamente cinco reactivos de identificacion de CTC y/o reactivos de caracterizacion de CTC o al menos aproximadamente seis reactivos de identificacion de CTC y/o reactivos de caracterizacion de CTC. En otro ejemplo, la obtencion de imagenes multiespectrales diferencia al menos aproximadamente dos reactivos de identificacion de CTC y la obtencion de imagenes hiperespectrales diferencia al menos aproximadamente cuatro reactivos de caracterizacion de CTC.

Por ejemplo, el procedimiento puede incluir poner en contacto las CTC presentes sobre el portaobjetos de vidrio (u otro sustrato) con una o mas sondas de acido nucleico especificas para ERG, PTEN y CEN-10 (tal como 3, 4 o 5 sondas diferentes), en condiciones suficientes para que las sondas se hibriden a su secuencia diana complementaria en las CTC (si estan presentes), y poner en contacto las celulas presentes sobre el portaobjetos de vidrio (u otro sustrato) con uno o mas anticuerpos especificos para al menos dos de CD45, CQ, ERG, RA y PSMA (para confirmar que la celula es una celula CTC, como se describe en el presente documento). Las sondas pueden ser una unica sonda de acido nucleico o una poblacion de varias sondas de acido nucleico diferentes. El uso de una sonda especifica para ERG, PTEN o CEN-10 permite la deteccion de alternancias en la secuencia genomica de una celula CTC, tal como reordenamiento de al menos un alelo de ERG, amplificacion de al menos un alelo de ERG, fusion de al menos un alelo de ERG, delecion de al menos un alelo de PTEN o combinaciones de los mismos. Se pueden detectar ERG y PTEN a nivel genomico, por ejemplo, detectando (una) alteracion/alteraciones en la(s) secuencia(s) genomica(s) de ERG o PTEN, tal como detectar un reordenamiento de TMPRSS-ERG o delecion de PTEN. El uso de anticuerpos especificos para dos o mas de CD45, CQ, ERG, RA y PSMA permite la identificacion de celulas CTC.

Las sondas de acido nucleico pueden incluir puntos cuanticos para permitir la deteccion de la hibridacion. Por ejemplo, cada una de las sondas de acido nucleico especificas para ERG, PTEN y CEN-10 se puede marcar con un punto cuantico diferente (u otro marcador detectable), de tal manera que la senal de cada punto cuantico (o marcador) sea distinguible. Por ejemplo, se puede marcar una sonda para ERG en extremo 5' con un primer punto cuantico (tal como un punto cuantico que emita a 565 nm), se puede marcar una sonda para ERG en extremo 3' con un segundo punto cuantico (tal como un punto cuantico que emita a 655 nm), se puede marcar una sonda para PTEN con un tercer punto cuantico (tal como un punto cuantico que emita a 605 nm) y se puede marcar una sonda para CEN-10 con un cuarto punto cuantico (tal como un punto cuantico que emita a 585 nm). Por tanto, cuando una sonda de acido nucleico se hibrida a su correspondiente secuencia complementaria en las CTC, su presencia se indica mediante la emision de una senal caracteristica que indica la hibridacion de una sonda de acido nucleico particular con una diana particular (por ejemplo, ERG, PTEN o CEN-10).

De forma similar, como se advierte en el presente documento, los anticuerpos pueden incluir puntos cuanticos u otros marcadores para permitir la deteccion de la union especifica. Por ejemplo, cada uno de los anticuerpos especificos para CD45, CQ, ERG, RA y PSMA se pueden marcar con un punto cuantico diferente (u otro marcador detectable), de tal manera que la senal de cada punto cuantico (o marcador) sea distinguible. Por ejemplo, un anticuerpo especifico para CD45 se puede marcar con un primer punto cuantico, un anticuerpo especifico para CQ se puede marcar con un segundo punto cuantico y asi sucesivamente. Por tanto, cuando un anticuerpo se une a su proteina diana en las CTC, su presencia se indica mediante la emision de una senal caracteristica que indica la union especifica de un anticuerpo particular con una diana particular (por ejemplo, CD45, CQ, ERG, RA o PSMA).

En un ejemplo, la una o mas sondas de acido nucleico especificas para ERG incluye dos sondas o poblacion de sondas: una especifica para el extremo 5' de ERG y una especifica para el extremo 3' de ERG. Dicha sonda se puede denominar sonda de separacion. Por ejemplo, si esta ausente un reordenamiento de ERG, las senales de la sonda para ERG en extremo 5' y de la sonda para ERG en extremo 3' se solaparan sustancialmente. Por ejemplo, si la sonda para ERG en extremo 5' incluye un punto cuantico que emite una senal verde (por ejemplo, 565 nm) y la sonda para ERG en extremo 3' incluye un punto cuantico que emite una senal roja (por ejemplo, 655 nm), si esta ausente un reordenamiento de ERG, las senales roja y verde, en general, se solaparan, mientras que si esta presente un reordenamiento de ERG las senales roja y verde se separaran sustancialmente. Por tanto, para ERG hay cuatro acontecimientos mensurables, (1) dos senales roja y verde colocalizadas es un ERG normal, (2) una colocalizacion mas una division de rojo y verde es un reordenamiento de ERG a traves de insercion, (3) una colocalizacion mas una senal roja (sin verde) es un reordenamiento de ERG a traves de delecion en 5' y (4) una colocalizacion y multiples senales rojas es una delecion y amplificacion de ERG). En un ejemplo, cada una de la sonda para ERG en extremo 5' y la sonda para ERG en extremo 3' incluye una poblacion de una pluralidad de sondas de acido nucleico, cada una de las cuales es de al menos 50 kb, tal como de al menos 100 kb o al menos 150 kb, tal como de al menos 170 kb. En un ejemplo, la sonda para ERG en extremo 5' abarca aproximadamente 370 kb en el extremo 5' del gen ERG, y la sonda para ERG en extremo 3' abarca aproximadamente 317 kb en el extremo 3' del gen ERG.

En un ejemplo, la una o mas sondas de acido nucleico especificas para PTEN incluyen una poblacion de una pluralidad de sondas de acido nucleico, cada una de las cuales es de al menos 50 kb, tal como de al menos 100 kb, al menos 150 kb, al menos 200 kb o al menos 240 kb, tal como de aproximadamente 200 a 300 kb. En ejemplos particulares, la sonda para PTEN no se hibrida especificamente a una region codificante de PTEN.

En un ejemplo, la una o mas sondas de acido nucleico especificas para CEN-10 es una sonda plasmidica, tal como pA10RP8 (disponible de American Type Culture Collection).

En algunos ejemplos, el procedimiento tambien incluye exponer las CTC a la luz ultravioleta, en condiciones suficientes para excitar los puntos cuanticos en las sondas de acido nucleico que se han hibridado a las dianas de acido nucleico en las CTC, dando como resultado la emision de una senal unica para cada tipo de punto cuantico.

El procedimiento tambien incluye detectar senales del uno o mas puntos cuanticos en la una o mas sondas de acido nucleico o anticuerpos, por ejemplo, usando obtencion de imagenes espectrales o microscopia de fluorescencia o ambas. En un ejemplo, se adquieren senales de 400 - 700 nm en incrementos de 5 nm. En algunos ejemplos, las senales del uno o mas puntos cuanticos se detectan de manera simultanea o coincidente. Basandose en las senales detectadas, se realiza una determinacion sobre si las CTC obtenidas del sujeto tienen un reordenamiento de ERG, delecion del gen PTEN y si se detecta CEN-10. Si no se detecta la sonda para CEN-10, se descartan los resultados. Si se detecta la sonda para CEN-10, se determinan los resultados. Ademas, basandose en las senales detectadas, se realiza una determinacion sobre si la proteina CD45, CQ, ERG, RA y/o PSMA esta presente en las celulas.

Por ejemplo, si se detecta la sonda para CEN-10, pero no se detecta ninguna senal de sonda para PTEN, esto indica que se delecionan ambos genes PTEN. Si se detecta la sonda para CEN-10, pero solo se detecta una senal de sonda para PTEN, esto indica que se deleciona un gen PTEN. Si se detecta la sonda para CEN-10 y se detectan ambas senales de sonda para PTEN, esto indica que ambos de los genes PTEN estan inalterados. Si se detecta la sonda para CEN-10, y la sonda para ERG en extremo 5' y la sonda para ERG en extremo 3' producen dos senales colocalizadas, esto indica dos genes ERG normales. Si se detecta la sonda para CEN-10, y la sonda para ERG en extremo 5' y la sonda para ERG en extremo 3' producen una senal colocalizada y una division de cada senal (division de la senal de la sonda para ERG en extremo 5' y la senal de la sonda para ERG en extremo 3'), esto es un reordenamiento de ERG traves de insercion. Si se detecta la sonda para CEN-10, y la sonda para ERG en extremo 5' y la sonda para ERG en extremo 3' producen una senal colocalizada, ninguna senal de la sonda para ERG en extremo 5', sino una senal de la sonda para ERG en extremo 3', esto es un reordenamiento de ERG a traves de una delecion en 5' de ERG. Si se detecta la sonda para CEN-10, y la sonda para ERG en extremo 5' y la sonda para ERG en extremo 3' producen una senal colocalizada y multiples senales de la sonda para ERG en extremo 3', esto es una delecion y amplificacion de ERG.

Basandose en la determinacion sobre si se reordenan uno o mas genes ERG y/o si se delecionan uno o mas genes PTEN, se caracteriza el cancer de prostata. Por ejemplo, la caracterizacion un cancer de prostata puede incluir predecir la probabilidad de que el cancer de prostata responda a un tratamiento particular, tal como el tratamiento con un inhibidor de la poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP) (por ejemplo, olaparib, MK4827 e iniparib), el tratamiento con un agente que bloquea la via hormonal (por ejemplo, abiraterona) o el tratamiento con radioterapia; predecir la probabilidad de recidiva de la enfermedad despues de la prostatectomia; predecir la probabilidad de progresion del cancer de prostata; predecir la probabilidad de metastasis del cancer de prostata; predecir la probabilidad del tiempo de supervivencia; o combinaciones de los mismos. Por tanto, en algunos ejemplos, el procedimiento es de pronostico, en tanto que predice la probabilidad de que el cancer de prostata sea de mayor o menor malignidad, por ejemplo, la probabilidad de que el cancer progrese, metastatice o recidive (por ejemplo, despues de una prostatectomia) o la probabilidad de supervivencia. En otros ejemplos, el procedimiento es de diagnostico, en tanto que determina que el cancer de prostata sea de mayor o menor malignidad, por ejemplo, la probabilidad de que el cancer progrese, metastatice o recidive (por ejemplo, despues de una prostatectomla) o la probabilidad de supervivencia (tal como la probabilidad de sobrevivir al menos 1 ano, al menos 3 anos o al menos 5 anos).

Por ejemplo, se puede usar el procedimiento para predecir que el cancer de prostata respondera a un inhibidor de PARP cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN; predecir que el cancer de prostata respondera a un inhibidor de AKT o PI3K cuando las CTC tengan una delecion de PTEN; predecir que el cancer de prostata no respondera a la radioterapia cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN; predecir que el cancer de prostata respondera a un inhibidor de via hormonal (tal como la abiraterona) cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN; predecir que el cancer de prostata tiene una probabilidad mas alta de recidiva despues de un tratamiento (tal como la recidiva en los 5 anos tras la prostatectomla u otro tratamiento) cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN; predecir que el cancer de prostata tiene una probabilidad mas alta de progresar cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN; predecir que es mas probable que el cancer de prostata metastatice cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN; predecir un tiempo de supervivencia de menos de 5 anos cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN; o combinaciones de los mismos.

En algunos ejemplos, el procedimiento puede incluir ademas la deteccion de una o mas moleculas constitutivas en las CTC (o en una muestra de cancer de prostata separada), por ejemplo, usando sondas de acido nucleico o anticuerpos marcados especificos para dichas moleculas constitutivas. En algunos ejemplos, la molecula constitutiva detectada se compara con la expresion de la una o mas moleculas constitutivas en la CTC o muestra de cancer de prostata con un control que representa la expresion de la una o mas moleculas constitutivas esperadas en una muestra de prostata normal. Las moleculas constitutivas se conocen en la tecnica e incluyen aquellas cuya expresion es similar (por ejemplo, varla en menos de un 10 %, menos de un 5 % o menos de un 1 %) en una muestra de cancer de prostata en relacion con una muestra de cancer de prostata normal. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: GAPDH (gliceraldehido 3-fosfatodeshidrogenasa), SDHA (succinato deshidrogenasa), HPRT1 (hipoxantina fosforribosil transferasa 1), HBS1L (protelna similar a HBS1), p-actina y AHSP (protelna de estabilizacion de hemoglobina alfa).

En un ejemplo ilustrativo, el procedimiento de analisis de una muestra que contiene CTC puede incluir poner en contacto la muestra con reactivos de caracterizacion de CTC que incluye un reactivo dirigido hacia una o mas moleculas constitutivas en las CTC, en el que el analisis de la muestra incluye comparar la expresion de la una o mas moleculas constitutivas en las CTC con respecto a un control que representa la una o mas moleculas constitutivas esperadas en una muestra de prostata normal. En otro modo de realization, el analisis de la muestra incluye detectar una o mas de otras moleculas relacionadas con el cancer de prostata en las CTC y comparar la expresion de la una o mas de otras moleculas relacionadas con el cancer de prostata en las CTC con un control de la una o mas de otras moleculas relacionadas con el cancer de prostata esperadas en una muestra de prostata normal.

H. Sondas para el cancer de prostata

Se pueden usar sondas de acido nucleico especificas para ERG, PTEN y CEN-10 en los procedimientos divulgados. Dichas sondas permiten determinar si se reordenan (por ejemplo, mediante insertion o delecion en 5') o amplifican uno o mas alelos de ERG, si se delecionan uno o mas genes PTEN, si se detecta el centromero 10 (CEN-10) o combinaciones de los mismos. La divulgation no se limita al uso de secuencias de sonda especificas. En un ejemplo, el ensayo es multiple, de modo que se detecta mas de un acido nucleico en la misma muestra, tal como en la misma CTC o poblaciones de CTC (tal como las presentes en un portaobjetos de vidrio u otro sustrato). Por ejemplo, se pueden detectar ERG, PTEN y CEN-10 en la misma CTC (o poblacion de CTC en un portaobjetos), tal como la detection de un reordenamiento o amplification de ERG, delecion del gen PTEN, CEN-10 o combinaciones de los mismos, en la misma CTC.

Por tanto, despues de aislar las CTC de un enfermo, tal como uno con CPRC o CPRCm, las CTC se fijan y, a continuation, se ponen en contacto o incuban con una o mas sondas especificas para ERG, PTEN y CEN-10, y se dejan hibridar a la temperatura pertinente, y la sonda en exceso se elimina por lavado. En algunos ejemplos, las sondas se marcan directamente, por ejemplo, con un punto cuantico, de modo que se puede determinar la localization y cantidad de la sonda en las celulas (por ejemplo, usando obtencion de imagenes espectrales). En algunos ejemplos, por ejemplo, si no se marca la sonda, el procedimiento incluye ademas su incubacion con una sonda complementaria marcada (tal como marcada con una marca radioactiva, fluorescente o antigenica), de modo que se puedan determinar la localizacion y cantidad de la sonda en las CTC.

Las alteraciones del gen en el genoma (por ejemplo, amplificacion genica, delecion genica, fusion genica u otros reordenamientos cromosomicos o duplicaciones cromosomicas (por ejemplo, polisomia) o perdida de uno o mas cromosomas) se pueden determinar usando cualquier tecnica conocida en la tecnica. Las tecnicas ejemplares incluyen, por ejemplo, procedimientos basadosen el analisis de hibridacion de polinucleotidos (por ejemplo, secuencias de acidos nucleicos genomicos), asi como procedimientos basados en la secuenciacion de polinucleotidos.

En consecuencia, en algunos modos de realizacion, se detectan alteraciones genomicas, por ejemplo, usando hibridacion in situ de sondas genomicas especificas de gen. La preparacion de sondas genomicas especificas de gen se conoce bien en la tecnica (veanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.os 5447841, 5756696, 6872817, 6596479, 6500612, 6607877, 6344315, 6475720, 6132961, 7115709, 6280929, 5491224, 5663319, 5776688, 5663319, 5776688, 6277569, 6569626, 7.763.421, la sol. de pat. de EE. UU. n.° 11/849,060 y las sol. de PCT n.os PCT/US07/77444 y PCT/US2010/062485). En algunos procedimientos ejemplares, la deteccion de alteraciones genomicas se facilita comparando el numero de sitios de union para una sonda genomica especifica de gen con una sonda genomica de control (por ejemplo, una sonda genomica especifica para el centromero del cromosoma sobre el que se localiza el gen de interes, tal como centromero 10). En algunos ejemplos, la delecion del gen se puede determinar mediante la proporcion de la sonda genomica especifica de gen con respecto a una sonda de control (por ejemplo, centromerica). Por ejemplo, una proporcion menor de uno indica la delecion del gen (o la region cromosomica) a la que se une la sonda especifica de gen.

En algunos ejemplos, las alteraciones genomicas o regiones de un genoma se detectan usando tecnicas de hibridacion in situ, tal como hibridacion in situ con fluorescencia. En estos procedimientos, se ponen en contacto ligandos especificos, tales como sondas marcadas con un punto cuantico o fluoroforo especificas para un gen diana (por ejemplo, un gen ERG o PTEN) o region de un cromosoma (por ejemplo, un CEN-10) con una muestra, tal como las CTC montadas sobre un sustrato (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio). Los ligandos especificos forman interacciones detectables especificas (por ejemplo, se hibridan a) sus dianas afines en la muestra. Por ejemplo, la hibridacion entre las sondas y el acido nucleico diana se puede detectar, por ejemplo, detectando un marcador asociado con la sonda. En algunos ejemplos, se usa obtencion de imagenes espectrales o microscopia de fluorescencia.

En algunos ejemplos, el medio usado para detectar alternancias genomicas de PTEN y ERG, y la presencia de CEN-10, es una molecula de acido nucleico, tal como una sonda o cebador. Por ejemplo, las sondas de acido nucleico especificas para PTEN, para ERG y para CEN-10 se pueden obtener de una fuente disponible comercialmente (tal como Ventana Medical Systems (Tucson, AZ) y Vysis (IL)) o preparar usando tecnicas comunes en la tecnica (tales como las descritas en los documentos PCT/US2010/062485 o US 7.763.421). Las sondas y cebadores de acido nucleico son moleculas de acido nucleico que se pueden hibridar con una molecula de acido nucleico diana (por ejemplo, una molecula de acido nucleico diana genomico o centromero). Por ejemplo, las sondas especificas para PTEN o para ERG, cuando se hibridan con la diana, se pueden detectar directa o bien indirectamente, por ejemplo, mediante un marcador (tal como un punto cuantico) presente en la sonda. Por tanto, las sondas y los cebadores permiten la deteccion, y, en algunos ejemplos, la cuantificacion, de una molecula de acido nucleico diana, tal como PTEN, ERG y CEN-10.

Las sondas y los cebadores se pueden “hibridar” a una secuencia de acidos nucleicos diana formando pares de bases con regiones complementarias de la molecula de acido nucleico diana (por ejemplo, ADN o ARN, tal como ADN genomico, ADNc o ARNm), formando, de este modo, una molecula con doble helice. Las condiciones de hibridacion que dan como resultado grados particulares de rigurosidad variaran dependiendo de la naturaleza del procedimiento de hibridacion y de la composicion y longitud de las secuencias de acidos nucleicos que se hibridan. En general, la temperatura de hibridacion y la fuerza ionica (tal como la concentracion de Na+) del tampon de hibridacion determinaran la rigurosidad de la hibridacion. Los calculos relativos a las condiciones de hibridacion para conseguir determinados grados de rigurosidad se analizan en Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (capitulos 9 y 11). Lo que sigue es un conjunto ejemplar de condiciones de hibridacion y no es limitante:

Rigurosidad muy alta (detecta secuencias que comparten al menos un 90 % de identidad)

Hibridacion: 5x SSC a 65 °C durante 16 horas

Lavar dos veces: 2x SSC a temperatura ambiente (TA) durante 15 minutos cada uno

Lavar dos veces: 0,5x SSC a 65 °C durante 20 minutos cada uno

Rigurosidad alta (detecta secuencias que comparten al menos un 80 % de identidad)

Hibridacion: 5x-6x SSC a 65 °C-70 °C durante 16-20 horas

Lavar dos veces: 2x SSC a TA durante 5-20 minutos cada uno

Lavar dos veces: 1x SSC a 55 °C-70 °C durante 30 minutos cada uno

Rigurosidad baja (detecta secuencias que comparten al menos un 50 % de identidad)

Hibridacion: 6x SSC a TA a 55 °C durante 16-20 horas

Lavar al menos dos veces: 2x-3x SSC a TA a 55 °C durante 20-30 minutos cada uno.

Un experto en la tecnica puede identificar las condiciones suficientes para que una sonda se hibride especificamente a un gen diana, tal como un gen ERG, un gen PTEN o CEN-10 presentes en una muestra de CTC. Por ejemplo, un experto en la tecnica puede determinar experimentalmente las caracterlsticas (tales como la longitud, la composicion de bases y el grado de complementariedad) que posibilitaran que una sonda de acido nucleico se hibride con su acido nucleico diana (por ejemplo, un gen ERG, gen PTEN o CEN-10) en condiciones de rigurosidad seleccionada, mientras se minimiza la hibridacion no especifica a otras sustancias o moleculas. Tipicamente, la secuencia de acidos nucleicos de una sonda tendra suficiente complementariedad con respecto al correspondiente gen para posibilitar que se hibride en condiciones de hibridacion rigurosas seleccionadas, por ejemplo, hibridacion a aproximadamente 37 °C o mas alta (tal como aproximadamente 37 °C, 42 °C, 44 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C o mas alta, por ejemplo, a aproximadamente de 37 °C a 70 °C, de 37 °C a 50 °C, tal como a 44 °C).

Los procedimientos de generation de una sonda o cebador especifico para un acido nucleico diana (por ejemplo, PTEN, ERG o CEN-10) son habituales en la tecnica. En un ejemplo, la sonda de acido nucleico es una poblacion de sondas de acido nucleico, tal como una poblacion que incluye fragmentos de la secuencia diana (tal como fragmentos de al menos 50 nucleotidos (nt), al menos 75 nt, al menos 100 nt, al menos 200 nt, al menos 500 nt, tal como de 50 a 1000 nt o de 100 a 500 nt), en la que los fragmentos se amplifican y, a continuation, se ligan al azar entre si. Por ejemplo, la poblacion de sondas resultante puede incluir sondas individuales que son de al menos 10 kb, tal como de al menos 20 kb, de al menos 50 kb o de al menos 100 kb, tal como de 10 a 1000 kb, de 10 a 500 kb o de 20 a 200 kb. Por tanto, por ejemplo, una sonda para ERG, PTEN o CEN-10 puede incluir una poblacion de sondas de acido nucleico que incluya fragmentos de un gen ERG, gen PTEN o CEN-10 (tal como fragmentos de al menos 50 nt, al menos 75 nt, al menos 100 nt, al menos 200 nt, al menos 500 nt, tal como de 50 a 1000 nt o de 100 a 500 nt de un gen ERG, gen PTEN o CEN-10, respectivamente), y la poblacion de sondas resultante puede incluir sondas individuales que son de al menos 10 kb, tal como de al menos 20 kb, de al menos 50 kb o de al menos 100 kb, tal como de 10 a 1000 kb, de 10 a 500 kb o de 20 a 200 kb. En un ejemplo, las sondas de acido nucleico especificas para las SEQ ID NO: 1 o 3 pueden ser especificas para al menos 12, al menos 50, al menos 100 o al menos 1000 nucleotidos contiguos de dicha secuencia (o su cadena complementaria). En algunos ejemplos, los fragmentos se delecionan lo suficiente de las secuencias repetidas. La sonda se puede acoplar directa o indirectamente a un “marcador”, lo que hace que la sonda sea detectable. Por ejemplo, se pueden incorporar nucleotidos marcados en una sonda mediante una variedad de procedimientos que incluyen transcription in vitro con las ARN polimerasas SP6, T3 o T7, marcado en el extremo 3' con desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), ADN polimerasa T4 o ADN polimerasa T7, marcado de ADN con cebador al azar con el fragmento de Klenow, marcado de ADNc con transcriptasa inversa AMV o M-MuLV, marcado por desplazamiento de mella con ADNasa 1 y ADN polimerasa 1 y marcado por PCR con ADN polimerasas termofilas como Taq o Pfu. En algunos ejemplos, se marcan las sondas usando desplazamiento de mella (usando nucleotidos marcados con hapteno, por ejemplo), seguido de un anticuerpo antihapteno marcado, tal como los marcados con un punto cuantico. Los nucleotidos marcados con hapteno ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los que incluyen nitropirazol (NP) o tirosulfonamida (TS).

En un ejemplo, la sonda es una sonda ISH de al menos 1000 pb, tal como de al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000 o al menos 6000, tal como de 1000 a 6000 pb, que abarca desde aproximadamente 300 kb a 800 kb.

En un ejemplo, la una o mas sondas de acido nucleico especificas para ERG incluye dos sondas o poblacion de sondas: una especifica para el extremo 5' de ERG y una especifica para el extremo 3' de ERG. Dicha sonda se puede denominar sonda de separation. En un ejemplo, cada una de la sonda para ERG en extremo 5' y la sonda para ERG en extremo 3' incluyen una poblacion de una pluralidad de sondas de acido nucleico. En un ejemplo, cada una de la poblacion de sondas para la sonda para ERG en extremo 5' es de al menos 50 kb, tal como de al menos 100 kb, al menos 150 kb, tal como de al menos 188 kb. En un ejemplo, la sonda para ERG en extremo 5' abarca aproximadamente 370,38 kb en el extremo 5' del gen ERG. En un ejemplo, se marca la sonda para ERG en extremo 5' usando nucleotidos con digoxigenina especificamente unidos a anticuerpos antihapteno marcados (marcados con el punto cuantico 565). En un ejemplo, cada una de la poblacion de sondas para la sonda para ERG en extremo 3' es de al menos 50 kb, tal como de al menos 100 kb, al menos 150 kb, tal como de al menos 177 kb. En un ejemplo, la sonda para ERG en extremo 3' abarca aproximadamente 317,176 kb en el extremo 3' del gen ERG. En un ejemplo, se marca la sonda para ERG en extremo 3' usando nucleotidos con 2,4-dinitrofenilo (DNP) unidos especificamente a anticuerpos antihapteno marcados (marcados con el punto cuantico 655).

En un ejemplo, una sonda de acido nucleico especifica para PTEN incluye una poblacion de fragmentos genomicos de PTEN que abarcan aproximadamente 765 kb en el area de la region cromosomica 10q23.31. En un ejemplo, la una o mas sondas de acido nucleico especificas para PTEN incluyen una poblacion de una pluralidad de sondas de acido nucleico, cada una de las cuales es de al menos 50 kb, tal como de al menos 100 kb, al menos 150 kb, al menos 200 kb o al menos 240 kb, tal como de aproximadamente 200 a 300 kb. En ejemplos particulares, la sonda para PTEN no se hibrida especificamente a una region codificante de PTEN (y, por tanto, la sonda no es complementaria a una secuencia codificante de PTEN). En un ejemplo, se marca la sonda para PTEN usando nucleotidos con hapteno tirosulfonimida unidos especificamente a anticuerpos antihapteno marcados (marcados con el punto cuantico 605).

En un ejemplo, una sonda de acido nucleico especifica para CEN-10 incluye una poblacion de fragmentos genomicos de CEN-10 que abarcan aproximadamente 1,36 kb en el area de la region cromosomica 10q11.1-q.11.1. En un ejemplo, la sonda de acido nucleico especifica para CEN-10 es una sonda plasmidica, tal como pA10RP8 (disponible de American Type Culture Collection). En un ejemplo, se marca la sonda para CEN-10 usando nucleotidos marcados con hapteno nitropirazol unidos especificamente a anticuerpos antihapteno marcados (marcados con el punto cuantico 585). La SEQ ID NO: 5 muestra una sonda para CEN-10 ejemplar que se puede usar para confirmar una delecion de PTEN (si PTEN esta inalterado, se esperan 2 pares de CEN-10 y PTEN en el cromosoma 10; si PTEN es heterocigotico, se espera 1 par de PTEN/CEN-10 y un unico CEN-10 en la otra copia del cromosoma 10; si PTEN es homocigotico solo 2 unicas senales para CEN-10 - una en cada brazo del cromosoma 10).

I. Marcadores detectables

Los marcadores detectables adecuados para los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen aquellos detectables mediante medios espectroscopicos, fotoquimicos, bioquimicos, inmunoquimicos, electricos, opticos o quimicos. Los marcadores utiles incluyen biotina para tincion con conjugado de estreptavidina marcada, microesferas magneticas (por ejemplo, DYNABEADS™), colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceina, rojo Texas, rodamina, proteina fluorescente verde y similares), puntos cuanticos, radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina y otras usadas comunmente en un ELISA) y marcadores colorimetricos, tales como microesferas de oro coloidal o vidrio o plastico coloreado (por ejemplo, de poliestireno, polipropileno, latex, etc.). Los medios de deteccion de dichos marcadores tambien se conocen bien. Por tanto, por ejemplo, se pueden detectar radiomarcadores usando contadores de centelleo o pelicula fotografica, se pueden detectar marcadores fluorescentes usando un fotodetector para detectar la luz emitida. Los marcadores enzimaticos se detectan tipicamente proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reaccion producido mediante la accion de la enzima sobre el sustrato, y los marcadores colorimetricos se detectan visualizando simplemente el marcador coloreado.

En un ejemplo especifico, el marcador es una nanoparticula, tal como una particula de oro o un nanocristal semiconductor). Se pueden usar nanocristales semiconductores cromogenicos y/o fluorescentes, a menudo tambien denominados puntos cuanticos, como marcadores detectables. Los puntos cuanticos nanocristalinos son particulas nanocristalinas semiconductoras y sin limitar la presente divulgacion, para su uso con emisores de luz de particulas de un tamano particular, tipicamente varian desde 2-10 nm de tamano. Los puntos cuanticos son tipicamente fluoroforos estables, a menudo son resistentes al fotoblanqueamiento y tienen un amplio intervalo de longitudes de onda de excitacion con un espectro de emision estrecha. Se pueden seleccionar puntos cuanticos que tengan caracteristicas de emision particulares, tales como emisiones a longitudes de onda particulares, de tal manera que se puedan usar diferentes puntos cuanticos plurales que tengan diferentes caracteristicas de emision plurales para identificar diferentes dianas plurales. Los bioconjugados de puntos cuanticos se caracterizan por rendimientos cuanticos comparables a los colorantes fluorescentes tradicionales mas brillantes disponibles. Ademas, estos fluoroforos basados en puntos cuanticos absorben de 10-1000 veces mas luz que los colorantes fluorescentes tradicionales. La emision de los puntos cuanticos es estrecha y simetrica, lo que significa que se minimiza el solapamiento con otros colores, dando como resultado una minima contaminacion de la senal en canales de deteccion adyacentes y la filtracion atenuada en otro canal, lo que puede dar lugar a la multiplexacion simultanea de puntos cuanticos que emiten de manera diferencial para propositos de deteccion. Los espectros de emision simetricos y ajustables se pueden variar de acuerdo con el tamano y la composicion del material de las particulas, lo que permite un espaciamiento flexible y cercano de diferentes puntos cuanticos sin un solapamiento espectral sustancial. Ademas, sus espectros de absorcion son amplios, lo que hace posible excitar todas las variantes de color de los puntos cuanticos de manera simultanea usando una unica longitud de onda de excitacion, minimizando, de este modo, la autofluorescencia de la muestra. Ademas, se ha descubierto que la pegilacion, la introduccion de grupos de polietilenglicol en los conductos de puntos cuanticos, puede disminuir sustancialmente la interaction no especifica proteina:punto cuantico. Determinados puntos cuanticos estan disponibles comercialmente, tal como los productos Qdot™ de Life Technologies, Inc.

Los modos de realization de trabajo ejemplares utilizan nanoparticulas de puntos cuanticos, tales como los nanocristales Qdot™565 y Qdot™655, donde el numero usado en dicha nomenclatura se refiere a la longitud de onda aproximada del maximo de emision de la nanoparticula. Por ejemplo, un nanocristal Qdot™565 emite luz que tiene una longitud de onda de 565 nm y produce un color verde claro. Por tanto, se pueden seleccionar puntos cuanticos para proporcionar una senal detectable a una longitud de onda particular. La deteccion se realiza a traves de una variedad de medios, por ejemplo, un microscopio de fluorescencia, fluorometro, escaner fluorescente, etc., dependiendo de una aplicacion dada.

Por ejemplo, se puede realizar el analisis inmunohistoquimico fluorescente con puntos cuanticos con sondas de acido nucleico. El analisis de imagenes se puede realizar capturando inicialmente cubos de imagen en una camara de obtencion de imagenes espectrales. La excitacion se puede efectuar con una fuente de luz UV (mercurio). A continuation, se pueden analizar los cubos de imagen. En resumen, se pueden recuperar cubos de imagen en la aplicacion y los datos se pueden extraer e informar basandose en las intensidades de los pixeles de los puntos cuanticos esperados que emitan a la longitud de onda especifica para los puntos cuanticos usados en las sondas (tales como 585 nm, 565 nm, 605 nm y 655 nm).

Como ejemplo, se puede medir la fluorescencia con el sistema de obtencion de imagenes multiespectrales (tal como los disponibles de Ventana, Tucson, AZ; Nuance™, Cambridge Research & Instrumentation, Woburn, MA; o SpectrView™, Applied Spectral Imaging, Vista, CA). La obtencion de imagenes multiespectrales es una tecnica en la que se recopila information espectroscopica en cada pixel de una imagen y los datos resultantes se analizan con un programa informatico de procesamiento de imagenes espectrales. Por ejemplo, se puede obtener una serie de imagenes a diferentes longitudes de onda (tal como segmentos a 5 nm desde 400 a 700 nm) que sean seleccionables electronica y continuamente y, a continuacion, utilizar con un programa de analisis disenado para manipular dichos datos. Se puede obtener de manera simultanea informacion cuantitativa de multiples marcadores, incluso cuando los espectros de los colorantes se solapan mucho o cuando se colocalizan, o se producen en el mismo punto en la muestra, siempre que las curvas espectrales sean diferentes. Muchos materiales biologicos presentan autofluorescencia o emiten luz de menor energla cuando se excitan con luz de energla mas alta. Esta senal puede dar como resultado imagenes con menor contraste y datos. Las camaras de alta sensibilidad sin capacidad de obtencion de imagenes multiespectrales solo incrementan la senal de autofluorescencia junto con la senal de fluorescencia. La obtencion de imagenes multiespectrales puede separar o filtrar por separation la autofluorescencia de tejidos y, de este modo, incrementar la proportion senal-ruido que se puede lograr.

Esta disponible una variedad de programas informaticos y equipos perifericos disponibles comercialmente para digitalizar, almacenar y analizar un video digitalizado o imagen optica digitalizada, por ejemplo, usando ordenadores PC (ordenadores basados en DOS™, OS2™ WINDOWS™, WINDOWS NT™ o WINDOWS7™ con chips compatibles con Intelx86 o Pentium) o basados en MACINTOSH™ o UNIX (por ejemplo, SUN™, SGI™ u otra estacion de trabajo).

J. Resultados de deteccion

Tras la deteccion de las sondas para ERG, para PTEN y para CEN-10, si estan presentes alteraciones genomicas de ERG y de PTEN y si se detecto CEN-10, asi como los resultados del ensayo, se pueden registrar hallazgos, diagnosticos, predicciones y/o recomendaciones de tratamiento y comunicar a los tecnicos, medicos y/o enfermos, por ejemplo. Por ejemplo, se pueden usar ordenadores para comunicar dicha informacion a las partes interesadas, tales como a los enfermos y/o a los medicos adjuntos. Por ejemplo, los resultados se pueden visualizar en un monitor, imprimir o almacenar en la memoria. Basandose en la medicion, se puede modificar el tratamiento administrado a un sujeto.

Por ejemplo, se puede comunicar un diagnostico, prediction y/o recomendacion de tratamiento basandose en si se reordena ERG o se deleciona PTEN (o en combination con otros diagnosticos, tales como los de un nomograma para el cancer de prostata, tales como el valor de PSA y grado de Gleason) a las partes interesadas tan pronto como sea posible despues de que se complete el ensayo y se genere el diagnostico y/o la prediccion. Los resultados y/o informacion relacionada se pueden comunicar al sujeto por el medico responsable del sujeto. De forma alternativa, los resultados se pueden comunicar directamente a las partes interesadas mediante cualquier medio de comunicacion, incluyendo por escrito, tal como, proporcionando un informe escrito, formas de comunicacion electronicas, tales como correo electronico, o por telefono. La comunicacion se puede facilitar mediante el uso de un ordenador, tal como en el caso de las comunicaciones por correo electronico. Por ejemplo, la comunicacion que contiene los resultados de una prueba de diagnostico y/o las conclusiones extraidas de y/o recomendaciones de tratamiento basadas en la prueba, se pueden generar y entregar automaticamente a las partes interesadas usando una combinacion de equipos informaticos y programas informaticos que seran familiares para los expertos en las telecomunicaciones. Un ejemplo de un sistema de comunicaciones orientado a la asistencia sanitaria se describe en la pat. de EE. UU. n.° 6.283.761; sin embargo, la presente divulgation no se limita a los procedimientos que utilizan este sistema de comunicaciones particular. En determinados modos de realization de los procedimientos de la divulgacion, todas o algunas de las etapas del procedimiento, incluyendo el ensayo de las CTC, diagnostico o pronostico del cancer de prostata y la comunicacion de los resultados del ensayo o diagnosticos o pronosticos, se pueden llevar a cabo en diversas jurisdicciones (por ejemplo, extranjeras).

1. Deteccion

Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para detectar las sondas que se han hibridado con su diana genomica. En algunos ejemplos, las sondas incluyen un marcador detectable y la deteccion de la presencia de la(s) sonda(s) incluye detectar el marcador detectable. En algunos ejemplos, las sondas se marcan con diferentes marcadores detectables. Por ejemplo, una sonda para ERG en 5' puede incluir un primer marcador, una sonda para ERG en 3' puede incluir un segundo marcador, una sonda para PTEN puede incluir un tercer marcador y una sonda para CEN-10 puede incluir un cuarto marcador. En un ejemplo especifico, una sonda para ERG en 5' puede incluir un primer punto cuantico (tal como uno que emita a 565 nm), una sonda para ERG en 3' puede incluir un segundo punto cuantico (tal como uno que emita a 655 nm), una sonda para PTEN puede incluir un tercer punto cuantico (tal como uno que emita a 605 nm) y una sonda para CEN-10 puede incluir un cuarto punto cuantico (tal como uno que emita a 585 nm). En otros ejemplos, las sondas se detectan indirectamente, por ejemplo, mediante hibridacion con un acido nucleico marcado. Por tanto, por ejemplo, examinando las imagenes de las CTC incubadas con dichas sondas, se puede determinar que puntos coloreados estan presentes (en los que cada color es especifico para una sonda particular) y determinar el ordenamiento de dichos puntos, permitiendo, de este modo, una determinacion sobre si se reordenan o amplifican uno o mas ERG, si se deleciona uno o mas genes PTEN, o combinaciones de los mismos.

K. Biomarcadores del cancer de prostata

1. Gen relacionado con ETS (ERG) (OMIM: 165080)

El gen relacionado con ETS (ERG) humano (tambien conocido como erg-3 y p55) se localiza en el cromosoma 21 (21q22.3) y es un miembro de la familia de factores de transcripcion ETS. Las secuencias de ERG estan disponibles publicamente, por ejemplo, de GenBank® (por ejemplo, con los numeros de acceso NP_001129626 y NP_598420.1 (protelnas) y NM_133659.2, NM_001136154.1 y NM_001838708.2 (acidos nucleicos)).

La protelna ERG (vease, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2) es un regulador transcripcional que se une a las secuencias ricas en purina. Se ha demostrado que la fusion del gen ERG con otros genes se asocia con diferentes canceres. Por ejemplo, la translocacion t(16;21)(p11;q22) del gen ERG fusionado con el gen fusionado en sarcoma (FUS) se asocia con leucemia mieloide humana. Las fusiones EWS-ERG se asocian a la familia de tumores de Ewing. La fusion ERG con la region 5' no traducida de la proteasa transmembranaria, la serina 2 (TMPRSS2) (localizada en el cromosoma 21 humano) se asocia con el cancer de prostata. Los genes TMPRS22 y ERG estan dispuestos en tandem en el cromosoma 21q22. La fusion TMPRSS2/ERG liga normalmente los exones 1 o 2 de TMPRSS2 a los exones 2, 3 o 4 de ERG, lo que da como resultado la activacion del factor de transcripcion ERG. Los reordenamientos de TMPRSS/ERG se producen en aproximadamente un 50 % de los canceres de prostata y un 20 % de las lesiones de neoplasias intraepiteliales prostaticas anaplasicas (HGPIN), dando como resultado una regulacion por incremento de ERG. El reordenamiento de TMPRSS/ERG da como resultado una lesion similar a PIN que puede pasar a un estado invasor mediante regulacion por incremento de la via PI3K.

Los anticuerpos ERG estan disponibles publicamente, por ejemplo, de Ventana (Epitomics EPR 3864) y Biocare (clon 9F4).

2. Homologo de fosfatasa y tensina (PTEN) (OMIM 601728)

El gen PTEN humano se localiza en el cromosoma 10 (10q23.31) y el gen PTEN de raton se localiza en el cromosoma 19. Las secuencias de PTEN (tanto naturales como mutantes) estan disponibles publicamente, por ejemplo, de GenBank® (por ejemplo, con los numeros de acceso NP_000305.3, AAD13528.1, EAW50174.1, EAW50173.1, EAW50172.1, AAH05821.1 y NP_032986.1 (protelnas) y NM_000314.4 y NM_008960.2 (acidos nucleicos)).

PTEN, tambien conocido como fosfatasa MMAC (mutada en multiples canceres avanzados), es un gen supresor tumoral implicado en una amplia variedad de canceres humanos. La protelna PTEN (por ejemplo, SEQ ID NO: 4) es una fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato 3-fosfatasa, que incluye un dominio similar a tensina, asi como un dominio catalitico. A diferencia de la mayoria de las protelnas tirosina fosfatasas, PTEN desfosforila preferentemente los sustratos de fosfoinositidos. PTEN regula de manera negativa los niveles intracelulares de fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato en las celulas y funciona como un supresor tumoral regulando de manera negativa la via de senalizacion Akt/PKB. Se ha demostrado que las mutaciones y deleciones de PTEN se asocian a canceres.

Los anticuerpos para PTEN estan disponibles publicamente, por ejemplo, de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (con los numeros de catalogo sc-7974; sc-133197; sc-133242) y Cell Signaling Technology (clon 138G6).

3. Secuencias variantes

Ademas de las secuencias especificas proporcionadas en el presente documento (por ejemplo, las SEQ ID NO: 1-4) y las secuencias que actualmente estan disponibles publicamente para ERG, PTEN, CEN-10, EpCAM, CD45 y CQ, un experto en la tecnica apreciara que las variantes de dichas secuencias pueden estar presentes en un sujeto particular. Por ejemplo, pueden estar presentes polimorfismos para un gen o proteina particular. Ademas, una secuencia puede variar entre diferentes organismos. En ejemplos particulares, una secuencia variante retiene la actividad biologica de su correspondiente secuencia natural. Por ejemplo, una secuencia del gen ERG, PTEN, EpCAM, CD45 o CQ presente en un sujeto particular puede codificar cambios conservadores de aminoacidos (tales como sustituciones muy altamente conservadas, sustituciones altamente conservadas o sustituciones conservadas), tales como de 1 a 5 o de 1 a 10 sustituciones conservadoras de aminoacidos. Las sustituciones conservadoras de aminoacidos ejemplares se muestran en la tabla 5.

Tabla 5: Sustituciones conservadoras de aminoacidos ejemplares.

Una secuencia de ERG, PTEN, EpCAM, CD45 o CQ puede ser una variante de secuencia de una secuencia de ERG, PTEN, EpCAM, CD45, o CQ natural, respectivamente, tal como una secuencia de acidos nucleicos o protelnas que tenga al menos un 99 %, al menos un 98 %, al menos un 95 %, al menos un 92 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 65 % o al menos un 60 % de identidad de secuencia con respecto a las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 1-4 (o dicha cantidad de identidad de secuencia con respecto al numero de acceso a GenBank® al que se hace referencia en el presente documento), en la que la variante resultante retenga la actividad biologica de ERG, PTEN, EpCAM, CD45 o CQ. “Identidad de secuencia” es una expresion usada comunmente para describir la similitud entre dos secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos). La identidad de secuencia se expresa tipicamente en terminos de identidad en porcentaje; cuanto mas alto sea el porcentaje, mas similares seran las dos secuencias.

Los procedimientos para alinear secuencias para su comparacion y determinacion de la identidad de secuencia se conocen bien en la tecnica. Diversos programas y algoritmos de alineacion se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research, 16:10881-10890, 1988; Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165, 1992; Pearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331, 1994; Tatiana et al., FEMS Microbiol. Lett., 174:247-250, 1999. Altschul et al. presentan una consideration detallada de procedimientos de alineacion de secuencias y calculos de homologla (J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990).

La herramienta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™, Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990) del National Center for Biotechnology Information (NCBI) esta disponible publicamente de varias fuentes, incluyendo el National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) y en internet para su uso en conexion con los programas de analisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Una description de como determinar la identidad de secuencia usando este programa esta disponible en Internet en la section de ayuda para BLAST™.

Para las comparaciones de secuencias de aminoacidos de mas de aproximadamente 15 aminoacidos se emplea la funcion “2 secuencias de Blast” del programa BLAST™ (Blastp), que usa la matriz BLOSUM62 por defecto ajustada con respecto a parametros por defecto (coste por apertura de hueco [por defecto = 5]; coste por extension de hueco [por defecto = 2]; penalization por emparejamiento erroneo [por defecto = 3]; recompensa por emparejamiento [por defecto = 1]; valor esperado (E) [por defecto = 10,0]; medida de los fragmentos [por defecto = 3]; y numero de descripciones en una linea (V) [por defecto = 100]. Al alinear peptidos cortos (de menos de alrededor de 15 aminoacidos), la alineacion se debe realizar usando la funcion 2 secuencias de Blast “Buscar emparejamientos cortos practicamente exactos”, que emplea la matriz PAM30 ajustada con respecto a los parametros por defecto (umbral esperado = 20000, medida de los fragmentos = 2, costes por hueco: existencia = 9 y extension = 1), que usa estadlsticas basadas en la composition.

L. Caracterizacion de un cancer de prostata

Esta divulgacion demuestra que se pueden detectar, por ejemplo, de manera simultanea reordenamientos de ERG (tales como por medio de 30 inserciones o deleciones y/o amplificaciones), deleciones de PTEN, o combinaciones de los mismos, en la misma CTC. Basandose en estos resultados, se pueden usar los procedimientos divulgados para pronosticar y diagnosticar el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) basandose en si las CTC aisladas de dichos enfermos tienen uno o mas reordenamientos de ERG y deleciones de PTEN. Basandose en la determinacion sobre si se reordenan uno o mas genes ERG y/o si se delecionan uno o mas genes PTEN, se caracteriza el cancer de prostata. En un ejemplo, un diagnostico o pronostico de que el cancer es de mayor malignidad indica que se predice que el cancer de prostata recidivara en 1 ano, en 3 anos o en 5 anos, por ejemplo, en dicho plazo tras una prostatectomla. En un ejemplo, un diagnostico o pronostico de que el cancer es de mayor malignidad indica que se predice que el cancer de prostata metastatizara en 1 ano, en 3 anos o en 5 anos, por ejemplo, en dicho plazo tras una prostatectomla. En un ejemplo, un diagnostico o pronostico de que el cancer es de mayor malignidad indica que se espera que el enfermo fallezca de cancer de prostata en 1 ano, en 3 anos o en 5 anos, por ejemplo, en dicho plazo tras una prostatectomla.

En un ejemplo, un diagnostico o pronostico de que el cancer es de menor malignidad (por ejemplo, no se reordena ERG, no se deleciona PTEN) indica que se predice que el cancer de prostata no recidivara en 1 ano, en 3 anos o en 5 anos, por ejemplo, en dicho plazo tras una prostatectomla. En un ejemplo, un diagnostico o pronostico de que el cancer es de menor malignidad indica que no se predice que el cancer de prostata metastatizara en 1 ano, en 3 anos o en 5 anos, por ejemplo, en dicho plazo tras una prostatectomla. En un ejemplo, un diagnostico o pronostico de que el cancer es de menor malignidad indica que no se espera que el enfermo fallezca de cancer de prostata en un ano, en 3 anos o en 5 anos, por ejemplo, en dicho plazo tras una prostatectomla.

En un ejemplo, el procedimiento incluye predecir la probabilidad de que el cancer de prostata responda a un tratamiento particular, tal como el tratamiento con inhibidores de la enzima poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP). Los inhibidores de PARP ejemplares incluyen, pero no se limitan a, olaparib, rucaparib, veliparib, CEP 9722, BMN-673, 3-aminobenzamida, MK4827 e iniparib. Si se reordenan uno o mas genes ERG y/o se delecionan uno o mas genes PTEN, (tal como la presencia de reordenamiento del gen ERG y delecion de PTEN) se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) respondera a los inhibidores de PARP. Por el contrario, si los genes ERG son normales (por ejemplo, no reordenados) y/o los genes PTEN estan inalterados (no delecionados) (tal como una ausencia de reordenamientos del gen ERG y deleciones de PTEN), se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) no respondera a los inhibidores de PARP.

En un ejemplo, el procedimiento incluye predecir la probabilidad de que el cancer de prostata responda a un tratamiento con inhibidores de la via hormonal, tales como inhibidores del receptor androgenico (o inhibidores de la via RA, tal como un inhibidor de CYP17A1). Los ejemplos de dichos inhibidores incluyen, pero no se limitan a: MDV3100 (4-(3-(4-ciano-3-(trifluorometil)fenil)-5,5-dimetil-4-oxo-2-tioxoimidazolidin-1-il)-2-fluoro-N-metilbenzamida), abiraterona (inhibidor de CYP17A1), TAK-700 (orteronel, 6-(7-hidroxi-6,7-dihidro-5H-pirrolo[1,2-c]imidazol-7-il)-N-metilnaftaleno-2-carboxamida; inhibidor de CYP17A1) y TOK-001 (galeterona, inhibidor de cYp 17A1). Si se reordenan uno o mas genes ERG y/o se delecionan uno o mas genes PTEN, tal como la presencia de reordenamiento del gen ERG y delecion de PTEN, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) respondera a dichos inhibidores. Por el contrario, si los genes ERG son normales (por ejemplo, no reordenados) y/o los genes PTEN estan inalterados (no delecionados), tal como una ausencia de reordenamientos del gen ERG y deleciones de PTEN, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) no respondera a los inhibidores de PARP.

En un ejemplo, el procedimiento incluye predecir la probabilidad de que el cancer de prostata responda a un tratamiento con radioterapia. Los ejemplos de radioterapia incluyen, pero no se limitan a: tratamiento con radiacion con haz de electrones (EBRT), tratamiento con radiacion conformal tridimensional (3D-CRT), radiacion de intensidad modulada (IMRT), radioterapia con haz de protones y radioterapia osea con radio 223. Si se reordenan uno o mas genes ERG y/o se delecionan uno o mas genes PTEN, tal como la presencia de reordenamiento del gen ERG y delecion de PTEN, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) no respondera a la radioterapia. Por el contrario, si los genes ERG son normales (por ejemplo, no reordenados) y/o los genes PTEN estan inalterados (no delecionados), tal como la presencia de genes ERG y PTEN normales, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) respondera a la radioterapia.

En un ejemplo, el procedimiento incluye predecir la probabilidad de que el cancer de prostata responda a un tratamiento con inmunoterapia. Los ejemplos de inmunoterapia incluyen, pero no se limitan a: ipilimumab (un anticuerpo CTLA-4) y sipuleucel-T. Si se reordenan uno o mas genes ERG y/o se delecionan uno o mas genes PTEN, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) no respondera a la inmunoterapia, tal como la presencia de reordenamiento del gen ERG y delecion de PTEN. Por el contrario, si los genes ERG son normales (por ejemplo, no reordenados) y/o los genes PTEN estan inalterados (no delecionados), tal como la presencia de genes ERG y PTEN normales, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) respondera a la inmunoterapia.

En un ejemplo, el procedimiento incluye predecir la probabilidad de que el cancer de prostata responda a un tratamiento con quimioterapia. Los ejemplos de quimioterapia incluyen, pero no se limitan a: docetaxel y cabazitaxel. Si se delecionan uno o mas genes PTEN, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) no respondera a la quimioterapia. Por el contrario, si los genes ERG se reordenan o son normales y/o los genes PTEN estan inalterados (no delecionados), tal como la presencia de genes ERG y PTEN normales, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) respondera a la quimioterapia.

En un ejemplo, el procedimiento incluye predecir la probabilidad de que el cancer de prostata responda a un tratamiento con un inhibidor de la via fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K)/AKT. Los ejemplos de inhibidores de la via PI3K/AKT incluyen, pero no se limitan a: XL147 (Exelixis), BEZ235 (Novartis), GDG0941 (Genentech), inhibidores del dominio catalltico de AKT selectivos a isoformas, inhibidores del dominio de PH, perifosina, G5K690693 (GlaxoSmithKline), MK2206 (Merck, Inc), PI-103, XL765 y BEZ-235. Si se delecionan uno o mas genes PTEN, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) respondera a los inhibidores de la via PI3K/AKT. Por el contrario, si los genes PTEN estan inalterados (no delecionados), se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) no respondera a los inhibidores de la via PI3K/AKT.

En un ejemplo, el procedimiento incluye predecir la probabilidad de recidiva de la enfermedad. Recidiva significa que el cancer de prostata ha regresado despues de un tratamiento(s) inicial(es) (o posterior(es)), por ejemplo, recidiva en 1, 2, 3, 4 o 5 anos tras el tratamiento). Los tratamientos iniciales representativos incluyen tratamiento con radiacion, quimioterapia, tratamiento antihormonal, cirugla (por ejemplo, una prostatectomla), inmunoterapia, tratamiento focal, crioterapia y/o radioterapia. Si se reordenan uno o mas genes ERG y/o se delecionan uno o mas genes PTEN, tal como la presencia de reordenamiento del gen ERG y delecion de PTEN, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) probablemente recidivara despues del tratamiento. Por tanto, por ejemplo, los procedimientos se pueden usar para predecir una probabilidad mas alta de que fracase un tratamiento intensivo (por ejemplo, una prostatectomla) y una necesidad incrementada de un tratamiento no quirurgico o alternativo para el cancer de prostata. Por el contrario, si los genes ERG son normales (por ejemplo, no reordenados) y/o los genes PTEN estan inalterados (no delecionados), tal como la presencia de genes ERG y PTEN normales, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) probablemente no recidivara despues del tratamiento. Tipicamente, despues de un tratamiento inicial del cancer de prostata, los niveles de PSA en la sangre disminuyen a un nivel estable y bajo y, en algunos casos, con el tiempo se vuelven casi indetectables. En algunos ejemplos, la recidiva del cancer de prostata se marca mediante niveles de PSA crecientes (por ejemplo, mas de 2,0-2,5 ng/ml) y/o mediante la identificacion de celulas de cancer de prostata en la sangre, en una biopsia o aspirado de prostata, en los ganglios linfaticos (por ejemplo, en la pelvis o en otro lugar) o en un sitio metastasico (por ejemplo, los musculos que ayudan a controlar la miccion, el recto, la pared pelvica, en los huesos u otros organos). Los niveles de PSA en suero se pueden caracterizar como sigue (aunque algunas variaciones de los siguientes intervalos son comunes en la tecnica):

En un ejemplo, el procedimiento incluye predecir la probabilidad de progresion del cancer de prostata, tal como metastasis. La progresion del cancer de prostata significa que uno o mas indicadores de cancer de prostata (por ejemplo, niveles de PSA en suero) muestran que la enfermedad avanza independientemente del tratamiento. En algunos ejemplos, la progresion del cancer de prostata se marca mediante niveles de PSA crecientes (por ejemplo, mas de 2,0-2,5 ng/ml) y/o mediante la identificacion de (o numeros en incremento de) celulas de cancer de prostata en la sangre, en una biopsia o aspirado de prostata, en los ganglios linfaticos (por ejemplo, en la pelvis o en otro lugar) o en un sitio metastasico (por ejemplo, los musculos que ayudan a controlar la miccion, el recto, la pared pelvica, en los huesos u otros organos). Si se reordenan uno o mas genes ERG y/o se delecionan uno o mas genes PTEN, tal como la presencia de reordenamiento del gen ERG y delecion de PTEN, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) probablemente progresara o metastatizara. Se puede cuantificar una probabilidad incrementada de progresion del cancer de prostata o recidiva del cancer de prostata mediante cualquier parametro conocido. Por ejemplo, una probabilidad incrementada puede significar al menos un 10 % de posibilidad de que se produzca (tal como al menos un 25 % de posibilidad, al menos un 50 % de posibilidad, al menos un 60 % de posibilidad, al menos un 75 % de posibilidad o incluso mas de un 80 % de posibilidad de que se produzca). Una probabilidad incrementada de progresion del cancer de prostata o recidiva del cancer de prostata puede indicar la presencia de un cancer de prostata de mayor malignidad, lo que puede indicar un peor pronostico para el enfermo (por ejemplo, tiempo de supervivencia disminuido), una probabilidad incrementada de progresion de la enfermedad (por ejemplo, metastasis), fracaso (o inadecuacion) del tratamiento y/o la necesidad de tratamientos alternativos (o adicionales). Por el contrario, si los genes ERG son normales (por ejemplo, no reordenados) y/o los genes PTEN estan inalterados (no delecionados), tal como la presencia de genes ERG y PTEN normales, se predice que el cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) probablemente no progresara o metastatizara. Se puede cuantificar una probabilidad disminuida de progresion del cancer de prostata o recidiva del cancer de prostata mediante cualquier parametro conocido. Por ejemplo, una probabilidad disminuida puede significar menos de un 50 % de posibilidad de que recidive (tal como menos de un 25 % de posibilidad, menos de un 20 % de posibilidad, menos de un 10 % de posibilidad, menos de un 5 % de posibilidad o incluso menos de un 1 % de posibilidad de que recidive). Esto puede indicar la presencia de un cancer de prostata de menor malignidad o sin malignidad, lo que puede indicar un mejor pronostico para el enfermo (por ejemplo, tiempo de supervivencia incrementado), una probabilidad disminuida de progresion de la enfermedad (por ejemplo, metastasis), exito del tratamiento y/o la necesidad de tratamientos menos intensivos (o incluso inexistentes).

En un ejemplo, el procedimiento incluye predecir la probabilidad del tiempo de supervivencia. Si se reordenan uno o mas genes ERG y/o se delecionan uno o mas genes PTEN, tal como la presencia de reordenamiento del gen ERG y delecion de PTEN, se predice que el enfermo con cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) tendra un tiempo de supervivencia mas corto (tal como menos de 5 anos, menos de 4 anos, menos de 3 anos, menos de 2 anos o menos de 1 ano) y, por tanto, un mal pronostico. Un mal (o peor) pronostico es probable para un sujeto con un cancer de mayor malignidad. En algunos modos de realizacion del procedimiento, un mal pronostico es una supervivencia menor a 5 anos (tal como una supervivencia menor a 1 ano o una supervivencia menor a 2 anos) del enfermo despues del diagnostico inicial de cancer de prostata. Por el contrario, si los genes ERG son normales (por ejemplo, no reordenados) y/o los genes PTEN estan inalterados (no delecionados) (tal como que ambos genes ERG son normales y ambos genes PTEN estan inalterados), se predice que el enfermo con cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm) tendra un tiempo de supervivencia mas largo (tal como al menos 5 anos, al menos 6 anos, al menos 7 anos, al menos 8 anos, al menos 9 anos o al menos 10 anos), y, por tanto, un buen pronostico. En algunos modos de realizacion del procedimiento, un buen pronostico es una supervivencia mayor a 2 anos (tal como una supervivencia mayor a 3 anos, una supervivencia mayor a 5 anos o una supervivencia mayor a 7 anos) del enfermo despues del diagnostico inicial de cancer de prostata.

En algunos ejemplos, los procedimientos divulgados se pueden usar para identificar aquellos sujetos que se beneficiaran de un tratamiento mas o menos intensivo. Por ejemplo, si a un enfermo se le diagnostica o pronostica una forma de cancer de prostata de gran malignidad (se reordenan uno o mas genes ERG y/o se delecionan uno o mas genes PTEN), se puede seleccionar al enfermo para un tratamiento mas intensivo y un seguimiento frecuente. Por el contrario, si a un enfermo se le diagnostica o pronostica una forma de cancer de prostata de menor malignidad (los genes ERG y PTEN son normales), se puede seleccionar al enfermo para un tratamiento menos intensivo y/o un seguimiento menos frecuente. Por ejemplo, dichos procedimientos de diagnostico o pronostico se pueden realizar antes de que el sujeto se someta al tratamiento. En otros ejemplos, se utilizan estos procedimientos para predecir la supervivencia del sujeto o la eficacia de un tratamiento dado, o combinaciones de los mismos. Por tanto, los procedimientos de la presente divulgacion son herramientas valiosas para los medicos en ejercicio para tomar decisiones sobre el tratamiento rapidas relativas a como tratar el cancer de prostata, tal como CPRC o CPRCm. Estas decisiones sobre el tratamiento pueden incluir la administracion de un agente para tratar el cancer de prostata y las decisiones para realizar un seguimiento de un sujeto para detectar la recidiva o metastasis de un cancer de prostata.

M. Uso en combinacion con otros ensayos de diagnostico y pronostico

Los procedimientos divulgados se pueden usar en combinacion con uno o mas de otros ensayos que se usan para diagnosticar o pronosticar los desenlaces clinicos para el cancer de prostata. Por ejemplo, se pueden usar las puntuaciones de Gleason de un enfermo de cancer de prostata basadas en una revision histopatologica, puntuaciones segun PSA y nomogramas (tales como las tablas de coeficientes de Partin) en combinacion con los procedimientos divulgados para permitir capacidades potenciadas de diagnostico y pronostico del cancer de prostata, tales como los que han metastatizado.

Por ejemplo, se pueden usar nomogramas para el cancer de prostata para predecir la probabilidad de que el cancer de un enfermo recidive (por ejemplo, despues de una prostatectomla radical), es decir, la probabilidad de que en dos, cinco, siete y 10 anos el nivel de PSA en suero del enfermo se vuelva detectable y comience a elevarse constantemente. Los nomogramas incluyen informacion sobre uno o mas de los PSA previos al tratamiento del enfermo, edad, grado de Gleason (primario, secundario y total), ano de la prostatectomla, meses sin cancer, si los margenes quirurgicos fueron o no positivos, si hubo o no extension capsular adicional (penetracion); si hubo o no afectacion de la vesicula seminal, si hubo o no afectacion de los ganglios linfaticos, si el enfermo recibe o no hormonas prequirurgicas y si el enfermo recibe o no tratamiento con radiacion antes de la prostatectomla radical. Por tanto, se pueden incorporar el estado de reordenamiento de ERG y delecion de PTEN del enfermo a los nomogramas disponibles actualmente para incrementar aun mas la precision de dichas predicciones.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar determinadas caracteristicas y/o modos de realizacion particulares. Estos ejemplos no se deben interpretar como que limitan una invencion divulgada a las caracteristicas o modos de realizacion particulares descritos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Deteccion de ERG y PTEN en lineas de celulas de cancer de prostata

Este ejemplo describe procedimientos usados para mostrar que se pueden detectar el reordenamiento del gen ERG y las deleciones del gen PTEN en lineas de celulas de cancer de prostata cuando las celulas se aplican a un portaobjetos de vidrio y se marcan con anticuerpos y sondas para imitar como se procesarian las celulas tumorales circulantes.

Se aplicaron lineas de celulas de cancer de prostata (LNCaP y VCaP) sobre un portaobjetos de vidrio usando citocentrifugacion. En resumen, se uso una Shandon Cytospin 4 (Shandon Thermo Scientific) con ajuste a 400 rpm/4 min. Se ensamblo un megaembudo EZ (Shandon Thermo Scientific) o bien un embudo biselado de Shandon (individual) con portaobjetos de vidrio cargados de manera positiva y se pipetearon 1 ml o 200 gl de suspension de celulas en los embudos, respectivamente. Despues de que se completara el ciclo de citoespin establecido, se retiraron los portaobjetos y se secaron al aire durante 30 min a temperatura ambiente. A continuation, las celulas se fijaron en FTN al 10 % a temperatura ambiente durante 20 minutos, seguido de aclaramiento en solution salina tamponada con fosfato (PBS). A continuacion, se sumergieron los portaobjetos en PBST (Tween 20 al 0,2 % en PBS) para su permeabilizacion, se aclararon en agua desionizada y se deshidrataron en series de contenido de alcohol ascendente (EtOH al 80 %, 90 % y abs.), seguido de secado al aire. Las muestras se almacenaron a -20 °C hasta su uso en cajas hermeticas.

A continuacion, se tineron las CTC montadas y fijadas utilizando la plataforma de tincion automatizada BenchMark (Ventana) con pancitoqueratina (CQ) (anti-AE1 y AE3, marcados con un punto cuantico que emite a 605 nm), CD45 (marcado con un punto cuantico que emite a 705 nm) y anticuerpos para el receptor androgenico (RA) a traves de IHQ fluorescente o con puntos cuanticos. Estas tinciones IHQ se usan para identificar las celulas tumorales circulantes (CTC). Las celulas CTC tienen tincion positiva para CQ, tincion negativa para CD45, localizacion de RA (en celulas CTC de canceres de prostata sensibles a androgenos el RA esta en el nucleo; en las celulas CTC de canceres de prostata no sensibles a androgenos el RA esta en el citoplasma) y sobreexpresion de proteinas RA. Usando estas tinciones IHQ, se puede registrar y utilizar una identification manual o por programas informaticos de las CTC para las tinciones posteriores. Como se muestra en la FIG. 1, las celulas LNCaP fueron positivas para CQ, pero negativas para CD45.

Despues de que se identificara esta localization, se realizo una FISH multiple con puntos cuanticos mediante hibridacion de las sondas para ERG en extremo 5', para ERG en extremo 3', para PTEN y para CEN-10 con respecto a las lineas de celulas de cancer de prostata, con la detection asociada a puntos cuanticos. El ensayo de FISH multiple incluye la hibridacion de las sondas al ADN diana y la deteccion de los hibridos. Estas etapas tambien se realizaron en la plataforma de tincion automatizada (serie BenchMark). Las muestras se desnaturalizaron junto con las sondas a 80 °C y se hibridaron a 44 °C durante 6-8 horas. Los lavados posteriores a la hibridacion se completaron a 68-74 °C. La deteccion de los hibridos se realizo con puntos cuanticos. Las senales de IHQ y FISH se visualizaron utilizando imagenes espectrales (Ventana).

Se demostro que en estas lineas de celulas se observo un reordenamiento del gen ERG con un estado de PTEN normal (VCAP) o bien un estado del gen ERG normal con una deletion de PTEN (LN CAP).

Ejemplo 2: Deteccion de reordenamiento de ERG y delecion de PTEN en celulas tumorales circulantes (CTC)

Este ejemplo describe los procedimientos usados para demostrar que los reordenamientos del gen ERG y deleciones del gen PTEN se pudieron detectar en las CTC de enfermos de CPRCm.

Se aislaron las CTC de muestras de sangre entera de enfermos de CPRCm usando el kit Profile del sistema CellSearch™ (Veridex). Las CTC aisladas se transfirieron a portaobjetos de vidrio, se fijaron en FTN, se trataron con proteasa, esencialmente como se describe en el ejemplo 1. Las CTC se hibridaron a sondas que utilizaban la plataforma de tincion automatizada BenchMark (Ventana) con FISH multiple con puntos cuanticos, incluidas sondas para ERG en extremo 5', para ERG en extremo 3', para PTEN y para CEN-10 (marcadas con puntos cuanticos que emiten a 655 nm, 565 nm, 605 nm y 585 nm, respectivamente) como se describe en el ejemplo 1. Las celulas tambien se tineron con DAPI. Las senales de FISH se visualizaron utilizando imagenes espectrales (Ventana) como se describe en el ejemplo 1, por ejemplo, como se muestra en las FIGS. 2 y 3.

A medida que se aprueban mas productos terapeuticos para su uso en enfermos de CPRCm, la capacidad para caracterizar molecularmente el tipo de CTC que accionan la masa tumoral desempenara un papel significativo en la optimization del abordaje del enfermo determinando el tipo y la secuencia de futuros tratamientos dirigidos. En el presente documento se muestra por primera vez un procedimiento para caracterizar molecularmente las CTC de enfermos en una plataforma automatizada que es tributaria de uso clinico estandar.

Ejemplo 3: Hibridacion in situ para detectar el estado de los genes ERG y PTEN

Este ejemplo proporciona procedimientos ejemplares que se pueden usar para detectar reordenamientos del gen ERG y deleciones del gen PTEN usando hibridacion in situ, tal como FISH. Aunque se proporcionan materiales y procedimientos particulares, un experto en la tecnica apreciara que se pueden hacer variaciones.

Las CTC (por ejemplo, aisladas de la sangre de enfermos con cancer de prostata (tal como CPRC o CPRCm), se aisian y montan sobre un portaobjetos, en condiciones que permiten la deteccion de moleculas de acido nucleico presentes en la muestra. En algunos ejemplos, las celulas se fijan. En un ejemplo, se puede detectar ADN genomico en la muestra.

El portaobjetos se incuba con sondas de acido nucleico que tienen suficiente complementariedad para hibridarse con ADN genomico en las CTC en condiciones de rigurosidad alta o muy alta. Las sondas pueden ser ARN o ADN. Las sondas separadas que son especificas para ADN genomico de ERG y PTEN (por ejemplo, secuencias humanas), asl como para CEN-10, se incuban con la muestra de manera simultanea o secuencial. Por ejemplo, cada sonda puede incluir un punto cuantico diferente para permitir la diferenciacion entre las sondas. Despues de poner en contacto las sondas con las CTC en condiciones que permitan la hibridacion de la sonda a su diana genica, se elimina la sonda no hibridada (por ejemplo, se elimina por lavado) y se detecta la senal restante, por ejemplo, usando adquisicion espectral. En algunos ejemplos, la senal se cuantifica.

En algunos ejemplos, antes de la incubacion con las sondas para ERG, PTEN y CEN-10, las CTC se incuban con anticuerpos especificos para CQ y CD45, para garantizar que las CTC analizadas sean CQ+ y CD45-. Solo se analizan las CTC que son CQ+ y CD45-.

Se detectan las senales de hibridacion resultantes para CEN-10, ERG y PTEN. Si se detecta CEN-10, el analisis prosigue. Si no se detecta ninguna senal para CEN-10, se descarta la muestra. Si se detecta CEN-10, se realiza una determination sobre si se reordena ERG y/o se deleciona PTEN. La deletion de PTEN se confirma si no se detecta la senal de la sonda para PTEN. Es posible que una unica CTC pueda tener un gen PTEN inalterado (senal detectada) y otro gen PTEN delecionado (senal ausente). Para ERG, hay cuatro acontecimientos posibles, suponiendo que se usen una sonda en extremo 5' (por ejemplo, en verde) y una sonda en extremo 3' (por ejemplo, en rojo): 1) dos senales roja y verde colocalizadas es un ERG normal, (2) una colocalizacion mas una division de rojo y verde es un reordenamiento de ERG a traves de insertion, (3) una colocalizacion mas una senal roja (sin verde) es un reordenamiento de ERG a traves de delecion en 5' y (4) una colocalizacion y multiples senales rojas es una delecion y amplificacion de ERG.

En vista de los muchos modos de realizacion posibles a los que se pueden aplicar los principios de la divulgacion, se debe reconocer que los modos de realization ilustrados son solamente ejemplos de la divulgation y no se deben tomar como limitantes del alcance de la invention. En cambio, el alcance de la divulgacion se define mediante las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de analisis de una muestra que contiene celulas tumorales circulantes (CTC) usando un instrumento automatizado, que comprende:

depositar una muestra de un sujeto con cancer de prostata sobre un sustrato configurado para su uso con el instrumento automatizado,

fijar la muestra con formol al 0,4 % durante 1 a 5 minutos seguido de formol tamponado neutro (FTN) al 10 % durante 5 a 15 minutos y metanol durante 1 a 5 minutos,

permeabilizar la muestra con Tween 20 al 0,2 % en solucion salina tamponada con fosfato (PBS),

retener al menos un 90 % de las CTC en la muestra sobre el sustrato tras la fijacion y permeabilizacion,

disponer el sustrato en el instrumento automatizado,

recuperar las dianas de moleculas de protelna y acido nucleico en la muestra, en el que la recuperacion se hace mediante el instrumento automatizado, en el que la recuperacion comprende:

(i) poner en contacto la muestra con reactivos de identificacion de CTC, en el que el contacto de la muestra con reactivos de identificacion de CTC se hace mediante el instrumento automatizado,

(ii) poner en contacto la muestra con sondas de acido nucleico dirigidas al gen relacionado con ETS (ERG), homologo de fosfatasa y tensina (PTEN) y centromero 10 (CEN-10), en el que el contacto de la muestra con las sondas de acido nucleico se hace mediante el instrumento automatizado,

obtener imagenes de la muestra,

(iii) localizar las CTC en la muestra sobre el sustrato localizando los reactivos de identificacion de CTC, en el que los reactivos de identificacion de CTC son reactivos inmunohistoquimicos dirigidos a una protelna CD45, una protelna citoqueratina (CQ), una protelna ERG, un receptor androgenico (RA), una protelna PSMA, o combinaciones de los mismos, en el que la localizacion de los reactivos inmunohistoquimicos se hace mediante el instrumento automatizado, y

(iv) obtener imagenes espectrales de las CTC por localizacion para detectar las sondas de acido nucleico, en el que la obtencion de imagenes espectrales de las CTC se hace mediante el instrumento automatizado, y

analizar la muestra analizando las imagenes espectrales y los reactivos de caracterizacion de CTC detectados.

2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la fijacion de la muestra comprende fijar la muestra con formol al 0,4 % durante 2 minutos seguido de formol tamponado neutro (FTN) al 10 % durante 10 minutos y metanol durante 3 minutos.

3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que la permeabilizacion de la muestra comprende permeabilizar la muestra con Tween 20 al 0,2 % en PBS durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que depositar la muestra sobre un sustrato comprende usar un procedimiento de rodillo.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra es una muestra de sangre o medula osea.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el cancer de prostata es un cancer de prostata resistente a la castracion (CPRC), opcionalmente en el que el CPRC es un CPRC metastasico (CPRCm).

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas enriquecer el contenido de CTC de la muestra usando un anticuerpo de captura especifico para una proteina gen relacionado con ETS (ERG), una proteina antigeno prostatico especifico de membrana (PSMA) o una proteina molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM), en el que el enriquecimiento del contenido de CTC de la muestra se produce antes de depositar la muestra sobre el sustrato.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el gen relacionado con ETS (ERG), homologo de fosfatasa y tensina (PTEN) y centromero 10 (CEN-10) se analizan para determinar la expresion genica y/o reordenamientos/deleciones geneticas.

9. El procedimiento de la reivindicacion 8, en el que las sondas de acido nucleico son una sonda para ERG en 5', una sonda para ERG en 3', una sonda para PTEN y una sonda para CEN-10.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la obtencion de imagenes de la muestra comprende inmunofluorescencia para obtener imagenes de los reactivos inmunohistoquimicos, opcionalmente en el que la inmunofluorescencia procede de anticuerpos dirigidos a una protelna CD45, una protelna citoqueratina (CQ), una protelna ERG, un receptor androgenico (RA), una protelna PSMA, o combinaciones de los mismos, en el que los anticuerpos se marcan directamente con fluoroforos.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la obtencion de imagenes espectrales de las CTC comprende la luminiscencia de imagenes espectrales de las sondas de acido nucleico, procediendo la luminiscencia de las sondas de acido nucleico, en el que las sondas de acido nucleico se marcan directamente con puntos cuanticos, o en el que las sondas de acido nucleico se marcan indirectamente con puntos cuanticos, procediendo la luminiscencia de los puntos cuanticos que marcan los anticuerpos secundarios antihapteno, siendo los anticuerpos secundarios antihapteno especificos para haptenos que marcan las sondas de acido nucleico.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el analisis de la muestra comprende detectar una o mas de otras moleculas relacionadas con el cancer de prostata en las CTC y comparar la expresion de la una o mas de otras moleculas relacionadas con el cancer de prostata en las CTC con un control de la una o mas de otras moleculas relacionadas con el cancer de prostata esperadas en una muestra de prostata normal.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende ademas:

predecir que el cancer de prostata respondera a un inhibidor de la poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP) cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN;

predecir que el cancer de prostata no respondera a la radioterapia cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN;

predecir que el cancer de prostata respondera a un bloqueador hormonal cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN;

predecir que el cancer de prostata tiene una probabilidad mas alta de recidiva en los 5 anos tras una prostatectomia cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN en comparacion con un cancer de prostata sin un reordenamiento de ERG y sin una delecion de PTEN;

predecir que el cancer de prostata tiene una probabilidad mas alta de progresar cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN en comparacion con un cancer de prostata sin un reordenamiento de ERG y sin una delecion de PTEN;

predecir que es mas probable que el cancer de prostata metastatice en los 5 anos tras una prostatectomia cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN en comparacion con un cancer de prostata sin un reordenamiento de ERG y sin una delecion de PTEN;

predecir un tiempo de supervivencia de menos de 5 anos cuando las CTC tengan un reordenamiento de ERG y/o una delecion de PTEN; o

combinaciones de los mismos.

14. Un procedimiento de caracterizacion de un cancer de prostata, que comprende:

diseminar las celulas tumorales circulantes (CTC) aisladas de un sujeto que tiene cancer de prostata sobre un portaobjetos de vidrio para formar una capa homogenea;

fijar las CTC sobre el portaobjetos de vidrio con formol al 0,4 % durante 1 a 5 minutos seguido de formol tamponado neutro (FTN) al 10 % durante 5 a 15 minutos y metanol durante 1 a 5 minutos;

permeabilizar las CTC sobre el portaobjetos de vidrio con Tween 20 al 0,2 % en solucion salina tamponada con fosfato (PBS), en el que al menos un 90 % de las CTC sobre el portaobjetos de vidrio se retienen tras la fijacion y permeabilizacion;

poner en contacto las CTC sobre el portaobjetos de vidrio con una o mas sondas de acido nucleico especificas para ERG, PTEN y CEN-10, en el que cada sonda comprende uno o mas puntos cuanticos;

detectar senales del uno o mas puntos cuanticos en la una o mas sondas de acido nucleico;

determinar si se reordena uno o mas ERG, si se deleciona uno o mas genes PTEN y si se detecta CEN-10; y caracterizar el cancer de prostata basandose en si se reordena uno o mas ERG, si se deleciona uno o mas genes PTEN y si se detecta CEN-10.