ES2695169T3

ES2695169T3 - Métodos de cultivo de células

Info

Publication number: ES2695169T3
Application number: ES14775649T
Authority: ES
Inventors: Holly Prentice
Original assignee: Momenta Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Momenta Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2019-01-02
Anticipated expiration: 2034-03-12
Also published as: US20160068881A1; US10144944B2; US9217168B2; US20140274912A1; WO2014159499A1; EP2971040A4; US20170226553A1; EP2971040A1; US9663810B2; EP2971040B1

Abstract

Un método para producir una preparación de proteína recombinante que tiene un valor diana de uno o más de los glicanos fucosilados, Ggicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados, comprendiendo el método: (a) proporcionar una célula genéticamente diseñada para expresar una proteína recombinante; (b) cultivar la célula en un medio de cultivo que comprende 0,1 mg/L a 10 mg/L de putrescina y, opcionalmente, que comprende además uno o más de lisina, amonio, DMSO, cobre, glucosa, un factor de crecimiento, una vitamina, un lípido y una peptona, en condiciones en las que la célula expresa la proteína recombinante; y (c) recoger una preparación de la proteína recombinante producida por la célula que cumpla con un valor diana, en relación con los glicanos totales, de uno o más de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados, en donde (i) el valor diana de los glicanos galactosilados y/o los glicanos sialilados es un nivel al menos un 10% más alto que el nivel, en relación con los glicanos totales, de los glicanos galactosilados y/o los glicanos sialilados en una preparación de la proteína recombinante producida mediante el cultivo de la célula en el medio que no comprende 0,1 mg/L a 10 mg/L de putrescina; (ii) el valor diana de los glicanos con alto contenido de manosa es un nivel al menos 10% más bajo que un nivel, en relación con los glicanos totales con alto contenido de manosa en una preparación de la proteína recombinante producida mediante el cultivo de la célula en un medio que no comprende 0,1 mg/L a 10 mg/L de putrescina; (iii) el valor diana de los glicanos fucosilados es de 70% a 100% de glicanos fucosilados; (iv) el valor diana de los glicanos galactosilados es del 1% al 95% de glicanos galactosilados; (v) el valor diana de los glicanos con alto contenido de manosa es del 0,1% al 20% de los glicanos con alto contenido de manosa; y/o (vi) el valor diana de los glicanos sialilados es de 0,1% a 90% de glicanos sialilados; y, opcionalmente, (d) evaluar el nivel de uno o más de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados en la preparación de proteínas recombinantes; y/o, (e) formular la preparación en un producto farmacológico.

Description

DESCRIPCION

Metodos de cultivo de celulas

CAMPO DE LA INVENCION

[0001] La invencion se refiere en general a metodos de cultivo celular.

ANTECEDENTES

[0002] Los polipeptidos terapeuticos son una clase importante de productos de biotecnolog^a terapeuticos, y anticuerpos terapeuticos (incluyendo murinos, anticuerpos quimericos, humanizados y humanos y fragmentos de los mismos) forman la mayona de los productos biologicos terapeuticos.

[0003] El documento WO 2008/154014 describe un metodo para cultivar celulas de mairnferos para mejorar la produccion de protemas recombinantes.

[0004] El documento US 6673575 describe un metodo para preparar polipeptidos con la glicosilacion apropiada. SUMARIO

[0005] La invencion se define por las reivindicaciones. Los aspectos/instancias de la presente divulgacion que constituyen la invencion se definen mediante las reivindicaciones.

[0006] De acuerdo con la reivindicacion 1, la presente invencion se refiere a un metodo de produccion de una preparacion de protema recombinante que tiene un valor diana de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una celula geneticamente disenada para expresar una protema recombinante; (b) cultivar la celula en un medio de cultivo que comprende 0,1 mg/L a 10 mg/L de putrescina y, opcionalmente, que comprende ademas una o mas de lisina, amonio, DMSO, cobre, glucosa, un factor de crecimiento, una vitamina, un lfpido y una peptona, en condiciones en las que la celula expresa la protema recombinante; y (c) recolectar una preparacion de la protema recombinante producida por la celula que cumpla con un valor diana, en relacion con los glicanos totales, de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados, en donde (i) el valor diana de los glicanos galactosilados y/o los glicanos sialilados es un nivel al menos un 10% mas alto que un nivel, en relacion con los glicanos totales, de los glicanos galactosilados y/o los glicanos sialilados en una preparacion de la protema recombinante producida mediante el cultivo de la celula. el medio que no comprende 0,1 mg/L a 10 mg/L de putrescina; (ii) el valor diana de los glicanos con alto contenido de manosa es un nivel al menos un 10% mas bajo que el nivel, en relacion con los glicanos totales, de los glicanos con alto contenido de manosa en una preparacion de la protema recombinante producida mediante el cultivo de la celula en un medio que no contenga 0,1 mg/L a 10 mg/L putrescina; (iii) el valor diana de los glicanos fucosilados es de 70% a 100% de glicanos fucosilados; (iv) el valor diana de los glicanos galactosilados es del 1% al 95% de glicanos galactosilados; (v) el valor diana de los glicanos con alto contenido de manosa es del 0,1% al 20% de los glicanos con alto contenido de manosa; y/o (vi) el valor diana de los glicanos sialilados es de 0,1% a 90% de glicanos sialilados; y, opcionalmente, (d) evaluar el nivel de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados en la preparacion de protemas recombinantes; y/o, (e) formular la preparacion en un producto farmacologico.

[0007] En un aspecto, la divulgacion presenta un metodo de produccion de una preparacion de protema recombinante que tiene un valor diana de glicanos uno o mas maduros, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una celula manipulada geneticamente para expresar una protema recombinante; (b) cultivar la celula en un medio de cultivo que comprende (por ejemplo, suplementado con) putrescina en condiciones en las que la celula expresa la protema recombinante; (c) recolectar (por ejemplo, purificar o aislar de la celula y/o el medio de cultivo) una preparacion de la protema recombinante producida por la celula; y (d) medir un nivel de uno o mas glicanos maduros, en donde la preparacion tiene el valor diana de uno o mas glicanos maduros. En algunos casos, el medio de cultivo comprende putrescina durante un tiempo y en una cantidad efectiva para modificar (por ejemplo, aumentar o disminuir) uno o mas glicanos maduros de la protema recombinante.

[0008] En algunos casos, el medio de cultivo comprende aproximadamente 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9,5 mg/L, 10 mg/L putrescina. En algunos casos, el medio de cultivo comprende aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 1 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2 mg/L, aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 3 mg/L, aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, aproximadamente 4 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 6 mg/L, aproximadamente 6 mg/L a aproximadamente 7 mg/L, aproximadamente 7 mg/L a aproximadamente 8 mg/L, aproximadamente 8 mg/L a aproximadamente 9 mg/L, aproximadamente 9 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 5 mg/L L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, o aproximadamente 0,5 mg/L a aproximadamente 1 mg/L de putrescina.

[0009] En algunos casos, el valor diana es un nivel de uno o mas glicanos maduros en un producto terapeutico de referencia. En algunos casos, el valor diana es el nivel de uno o mas glicanos maduros en un producto de anticuerpo terapeutico de referencia. En algunos casos, el valor diana es una especificacion predeterminada del producto farmaceutico o un criterio de control de calidad para una preparacion farmaceutica, por ejemplo, un certificado de analisis (CofA), un Certificado de prueba (CofT) o un registro maestro de lotes. En algunos casos, la especificacion del producto es una descripcion del producto en una etiqueta de la FDA, un folleto del medico, una monograffa USP o una monograffa EP.

[0010] En algunos casos, el producto terapeutico de referencia se selecciona de entre el grupo que consiste en: abatacept, abciximab, adalimumab, aflibercept, alefacept, alemtuzumab, basiliximab, bevacizumab, belatacept, certolizumab, cetuximab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, entanercept , gemtuzumab, ibritumomab, infliximab, muromonab-CD3, natalizumab, omalizumab, palivizumab; panitumumab, ranibizumab, rilonacept, rituximab, tositumomab y trastuzumab.

[0011] En algunos casos, el valor diana es uno o mas de: (a) mas de aproximadamente 30% de glicanos maduros, por ejemplo, mas de aproximadamente 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o mas, glicanos maduros; y (b) menos de aproximadamente 90% de manosa alta, glicanos tnbridos, o combinacion de alta manosa e glicanos tnbridos, por ejemplo, menos de aproximadamente 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, o menos, glicanos de alto contenido de manosa, glicanos tnbridos, o una combinacion de glicanos de alto contenido de manosa e tnbridos. En algunos casos, el glicano maduro es uno o mas de los glicanos galactosilados y los glicanos sialilados. En algunos casos, el valor diana es uno o mas de: (a) aproximadamente 1% a aproximadamente 95% de glicanos galactosilados, por ejemplo, al menos aproximadamente 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de glicanos galactosilados; y (b) aproximadamente 0,1% a aproximadamente 90% de glicanos sialilados, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de glicanos sialilados. Los glicanos con alto contenido de manosa pueden ser, por ejemplo, HM3, HM4, HM5, HM6, HM7, HM8, HM9 o combinaciones de los mismos.

[0012] En algunos casos, el valor diana de la uno o mas glicanos maduros es mayor que un nivel correspondiente en una preparacion producida por cultivo de la celula en el medio que no comprende putrescina. En algunos casos, el valor diana es mas alto que el nivel correspondiente en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% o mas del nivel correspondiente.

[0013] En algunos casos, el metodo comprende ademas la evaluacion del nivel de uno o mas glicanos maduros en la preparacion de protema recombinante. En algunos casos, el metodo comprende ademas registrar el nivel en un medio impreso o legible por computadora, por ejemplo, en un informe de prueba, hoja de datos de seguridad del material (MSDS), registro de lotes, certificado de prueba (CofT) o certificado de analisis (CofA).

[0014] En otro aspecto, la divulgacion presenta un metodo para aumentar un nivel de uno o mas glicanos maduros en una preparacion de protema recombinante, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una celula manipulada geneticamente para expresar una protema recombinante; (b) cultivar la celula en un medio de cultivo que comprende putrescina (por ejemplo, un nivel elevado de putrescina, por ejemplo, suplementado con putrescina) en condiciones en las que la celula expresa la protema recombinante; (c) recolectar una preparacion de la protema recombinante producida por la celula; y (d) medir un nivel de uno o mas glicanos maduros. En algunos casos, el medio de cultivo comprende putrescina (por ejemplo, el nivel elevado de putrescina) durante un tiempo y en una cantidad eficaz para aumentar uno o mas glicanos maduros de la protema recombinante. En algunos casos, el metodo comprende ademas el procesamiento (por ejemplo, uno o mas de la formulacion, llenado en un recipiente, etiquetado, envasado) de la preparacion en un producto farmacologico si la preparacion cumple con el valor diana de uno o mas glicanos maduros.

[0015] En algunos casos, el medio de cultivo comprende aproximadamente 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9,5 mg/L, 10 mg/L putrescina. En algunos casos, el medio de cultivo comprende aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 1 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2 mg/L, aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 3 mg/L, aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, aproximadamente 4 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 6 mg/L, aproximadamente 6 mg/L a aproximadamente 7 mg/L, aproximadamente 7 mg/L a aproximadamente 8 mg/L, aproximadamente 8 mg/L a aproximadamente 9 mg/L, aproximadamente 9 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, o aproximadamente 0,5 mg/L a aproximadamente 1 mg/L de putrescina.

[0016] En algunos casos, el metodo comprende ademas la medicion de un nivel de uno o mas glicanos maduros en la preparacion de protema recombinante. En algunos casos, el metodo comprende ademas registrar el nivel en un medio impreso o legible por computadora, por ejemplo, en un informe de prueba, hoja de datos de seguridad del material (MSDS), registro de lotes, Certificado de prueba (CofT) o Certificado de analisis (CofA).

[0017] En algunos casos, el valor diana es uno o mas de: (a) mas de aproximadamente 30% de glicanos maduros, por ejemplo, mas de aproximadamente 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o mas, glicanos maduros; y (b) menos de aproximadamente 90% de manosa alta, glicanos hnbridos, o combinacion de alta manosa e glicanos hnbridos, por ejemplo, menos de aproximadamente 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, glicanos de alto contenido de manosa, glicanos hnbridos, o una combinacion de glicanos de alto contenido de manosa e hnbridos del 10% o menos. En algunos casos, el glicano maduro es uno o mas de los glicanos galactosilados y los glicanos sialilados. En algunos casos, el valor diana es uno o mas de: (a) aproximadamente 1% a aproximadamente 95% de glicanos galactosilados, por ejemplo, al menos aproximadamente 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de glicanos galactosilados; y (b) aproximadamente 0,1% a aproximadamente 90% de glicanos sialilados, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de glicanos sialilados. Los glicanos con alto contenido de manosa pueden ser, por ejemplo, HM3, HM4, HM5, HM6, HM7, HM8, HM9 o combinaciones de los mismos.

[0018] En otro aspecto, la divulgacion presenta un metodo de produccion de una preparacion de protema recombinante que tiene un valor diana de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una celula geneticamente disenada para expresar una protema recombinante; (b) cultivar la celula en un medio de cultivo que comprende (p. ej., suplementado con) putrescina en condiciones en las que la celula expresa la protema recombinante; y (c) recolectar (p. ej., purificar o aislar de la celula y/o del medio de cultivo) una preparacion de la protema recombinante producida por la celula, en donde la preparacion tiene el valor diana de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa, y glicanos sialilados. En algunos casos, el medio de cultivo comprende putrescina durante un tiempo y en una cantidad efectiva para modificar (por ejemplo, aumentar o disminuir) uno o mas de los glicanos fucosilados, galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados de la protema reclinante. .

[0019] En algunos casos, el medio de cultivo comprende aproximadamente 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9,5 mg/L, 10 mg/L putrescina, En algunos casos, el medio de cultivo comprende aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 1 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2 mg/L, aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 3 mg/L, aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, aproximadamente 4 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 6 mg/L, aproximadamente 6 mg/L a aproximadamente 7 mg/L, aproximadamente 7 mg/L a aproximadamente 8 mg/L, aproximadamente 8 mg/L a aproximadamente 9 mg/L, aproximadamente 9 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, o aproximadamente 0,5 mg/L a aproximadamente 1 mg/L de putrescina.

[0020] En algunos casos, el valor diana es un nivel de uno o mas de los glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados en un producto terapeutico de referencia. En algunos casos, el valor diana es un nivel de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados en un producto de anticuerpo terapeutico de referencia. En algunos casos, el valor diana es una especificacion predeterminada del producto farmaceutico o un criterio de control de calidad para una preparacion farmaceutica, por ejemplo, un Certificado de analisis (CofA), un Certificado de prueba (CofT) o un Registro maestro de lotes. En algunos casos, la especificacion del producto es una descripcion del producto en una etiqueta de la FDA, un folleto del medico, una monograffa USP o una monograffa EP.

[0021] En algunos casos, el producto terapeutico de referencia se selecciona de entre el grupo que consiste en: abatacept, abciximab, adalimumab, aflibercept, alefacept, alemtuzumab, basiliximab, bevacizumab, belatacept, certolizumab, cetuximab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, entanercept , gemtuzumab, ibritumomab, infliximab, muromonab-CD3, natalizumab, omalizumab, palivizumab; panitumumab, ranibizumab, rilonacept, rituximab, tositumomab y trastuzumab.

[0022] En algunos casos, el valor diana es uno o mas de: (a) al menos aproximadamente 70% a aproximadamente 100% de glicanos fucosilados, por ejemplo, al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% , 95%, o 100% de glicanos fucosilados; (b) al menos aproximadamente 1% a aproximadamente 95% de glicanos galactosilados, por ejemplo, al menos aproximadamente 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, glicanos galactosilados al 70%, 80%, 90% o 95%; (c) de al menos aproximadamente 0,1% a aproximadamente 20% de glicanos de alto contenido de manosa, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1% , 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, glicanos de alto contenido de manosa; y (d) al menos aproximadamente 0,1% a aproximadamente 90% de glicanos sialilados, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30% , 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de glicanos sialilados. Los glicanos con alto contenido de manosa pueden ser, por ejemplo, HM3, HM4, HM5, HM6, HM7, HM8, HM9 o combinaciones de los mismos.

[0023] En algunos casos, el valor diana del uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, y glicanos sialilados es mayor que un nivel correspondiente en una preparacion producida por cultivo de la celula en el medio que no comprende putrescina. En algunos casos, el valor diana es mas alto que el nivel correspondiente en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% o mas del nivel correspondiente.

[0024] En algunos casos, el valor diana de los glicanos de alto contenido de manosa es inferior a un nivel correspondiente en una preparacion producida por cultivo de la celula en el medio que no comprende putrescina. En algunos casos, el valor diana es mas bajo que el nivel correspondiente en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% del nivel correspondiente.

[0025] En algunos casos, el metodo comprende ademas la evaluacion del nivel de uno o mas de los glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados en la preparacion de protema recombinante. En algunos casos, el metodo comprende ademas registrar el nivel en un medio impreso o legible por computadora, por ejemplo, en un informe de prueba, hoja de datos de seguridad del material (MSDS), registro de lotes, Certificado de prueba (CofT) o Certificado de analisis (CofA).

[0026] En otro aspecto, la divulgacion presenta un metodo de produccion de una preparacion de protema recombinante, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar un valor diana de una o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados; (b) proporcionar una celula geneticamente modificada para expresar una protema recombinante; (c) cultivar la celula en un medio de cultivo que comprende (por ejemplo, suplementado con) putrescina en condiciones en las que la celula expresa la protema recombinante; (d) recolectar una preparacion de la protema recombinante producida por la celula; y (e) procesar (p. ej., uno o mas de formulacion, llenado en un recipiente, etiquetado, envasado) de la preparacion en un producto farmacologico si la preparacion cumple con el valor diana de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa, y glicanos sialilados. En algunos casos, el medio de cultivo comprende putrescina por un tiempo y en una cantidad efectiva para modificar (por ejemplo, aumentar o disminuir) uno o mas de los glicanos fucosilados, galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados de la protema recombinante.

[0027] En algunos casos, el metodo comprende ademas la evaluacion del nivel de uno o mas de los glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados en la preparacion de protemas recombinantes. En algunos casos, el metodo comprende ademas registrar el nivel en un medio impreso o legible por computadora, por ejemplo, en un informe de prueba, hoja de datos de seguridad del material (MSDS), registro de lotes o Certificado de prueba (CofT) o Certificado de analisis (CofA).

[0028] En algunos casos, el medio de cultivo comprende aproximadamente 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9,5 mg/L, 10 mg/L putrescina. En algunos casos, el medio de cultivo comprende aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 1 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2 mg/L, aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 3 mg/L, aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, aproximadamente 4 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 6 mg/L, aproximadamente 6 mg/L a aproximadamente 7 mg/L, aproximadamente 7 mg/L a aproximadamente 8 mg/L, aproximadamente 8 mg/L a aproximadamente 9 mg/L, aproximadamente 9 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, o aproximadamente 0,5 mg/L a aproximadamente 1 mg/L de putrescina.

[0029] En algunos casos, el valor diana es un nivel de uno o mas de los glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados en un producto terapeutico de referencia. En algunos casos, el valor diana es un nivel de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados en un producto de anticuerpo terapeutico de referencia. En algunos casos, el valor diana es una especificacion predeterminada del producto farmaceutico o un criterio de control de calidad para una preparacion farmaceutica, por ejemplo, un Certificado de analisis (CofA), un Certificado de prueba (CofT) o un Registro maestro de lotes. En algunos casos, la especificacion del producto es una descripcion del producto en una etiqueta de la FDA, un folleto del medico, una monograffa USP o una monograffa EP.

[0030] En algunos casos, el producto terapeutico de referencia se selecciona de entre el grupo que consiste en: abatacept, abciximab, adalimumab, aflibercept, alefacept, alemtuzumab, basiliximab, bevacizumab, belatacept, certolizumab, cetuximab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, entanercept , gemtuzumab, ibritumomab, infliximab, muromonab-CD3, natalizumab, omalizumab, palivizumab; panitumumab, ranibizumab, rilonacept, rituximab, tositumomab y trastuzumab.

[0031] En algunos casos, el valor diana es uno o mas de: (a) al menos aproximadamente 70% a aproximadamente 100% de glicanos fucosilados, por ejemplo, al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% , 95%, o 100% de glicanos fucosilados; (b) al menos aproximadamente 1% a aproximadamente 95% de glicanos galactosilados, por ejemplo, al menos aproximadamente glicanos galactosilados al 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%; (c) de al menos aproximadamente 0,1% a aproximadamente 20% de glicanos de alto contenido de manosa, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1% , 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, glicanos de alto contenido de manosa; y (d) al menos aproximadamente 0,1% a aproximadamente 90% de glicanos sialilados, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30% , 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de glicanos sialilados. Los glicanos con alto contenido de manosa pueden ser, por ejemplo, HM3, HM4, HM5, HM6, HM7, HM8, HM9 o combinaciones de los mismos.

[0032] En algunos casos, el valor diana de uno o mas glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, y glicanos sialilados es mayor que un nivel correspondiente en una preparacion producida por cultivo de la celula en el medio que no comprende putrescina. En algunos casos, el valor diana es mas alto que el nivel correspondiente en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% o mas del nivel correspondiente.

[0033] En algunos casos, el valor diana de los glicanos de alto contenido de manosa es inferior a un nivel correspondiente en una preparacion producida por cultivo de la celula en el medio que no comprende putrescina. En algunos casos, el valor diana es mas bajo que el nivel correspondiente en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% del nivel correspondiente.

[0034] En otro aspecto, la divulgacion presenta un metodo para aumentar un nivel de uno o mas de los glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, y glicanos sialilados en una preparacion de protema recombinante, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una celula por ingeniena genetica para expresar una protema recombinante; (b) cultivar la celula en un medio de cultivo que comprende un nivel elevado de putrescina (por ejemplo, suplementado con putrescina) en condiciones en las que la celula expresa la protema recombinante; y (c) recolectar una preparacion de la protema recombinante producida por la celula, en donde la preparacion tiene un nivel incrementado de uno o mas de los glicanos fucosilados, glicanos galactosilados y glicanos sialilados en relacion con un nivel correspondiente en una preparacion de la protema recombinante producida cultivando la celula en el medio que no comprende el nivel elevado de putrescina. En algunos casos, el medio de cultivo comprende el nivel elevado de putrescina durante un tiempo y en una cantidad efectiva para aumentar uno o mas de los glicanos fucosilados, los glicanos galactosilados y los glicanos sialilados de la protema recombinante. En algunos casos, el metodo comprende ademas el procesamiento (por ejemplo, uno o mas de la formulacion, llenado en un recipiente, etiquetado, envasado) de la preparacion en un producto farmacologico si la preparacion cumple con el valor diana de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, y glicanos sialilados.

[0035] En algunos casos, el medio de cultivo comprende aproximadamente 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9,5 mg/L, 10 mg/L de putrescina. En algunos casos, el medio de cultivo comprende aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 1 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2 mg/L, aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 3 mg/L, aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, aproximadamente 4 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 6 mg/L, aproximadamente 6 mg/L a aproximadamente 7 mg/L, aproximadamente 7 mg/L a aproximadamente 8 mg/L, aproximadamente 8 mg/L a aproximadamente 9 mg/L, aproximadamente 9 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, o aproximadamente 0,5 mg/L a alrededor de 1 mg/L de putrescina.

[0036] En algunos casos, el metodo comprende ademas la medicion de un nivel de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, y glicanos sialilados en la preparacion de protema recombinante. En algunos casos, el metodo comprende ademas registrar el nivel en un medio impreso o legible por computadora, por ejemplo, en un informe de prueba, hoja de datos de seguridad del material (MSDS), registro de lotes, Certificado de prueba (CofT) o Certificado de analisis (CofA).

[0037] En algunos casos, el aumento del nivel de uno o mas glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, y glicanos sialilados es mas alto que el nivel correspondiente en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% o mas, del nivel correspondiente. En algunos casos, el nivel aumentado es uno o mas de: (a) al menos aproximadamente 70% a aproximadamente 100% de glicanos fucosilados, por ejemplo, al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100% de glicanos fucosilados; (b) al menos aproximadamente 1% a aproximadamente 95% de glicanos galactosilados, por ejemplo, al menos aproximadamente 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de glicanos galactosilados; y (c) al menos aproximadamente 0,1% a aproximadamente 90% de glicanos sialilados, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de glicanos sialilados.

[0038] En otro aspecto, la divulgacion presenta un metodo para disminuir un nivel de uno o mas de los glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, y glicanos sialilados en una preparacion de protema recombinante, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una celula por ingeniena genetica para expresar una protema recombinante; (b) cultivar la celula en un medio de cultivo que comprende un nivel reducido de putrescina en condiciones en las que la celula expresa la protema recombinante; y (c) recolectar una preparacion de la protema recombinante producida por la celula, en donde la preparacion tiene un nivel disminuido de uno o mas de los glicanos fucosilados, glicanos galactosilados y glicanos sialilados en relacion con un nivel correspondiente en una preparacion de la protema recombinante producida por el cultivo de la celula en el medio que no comprende el nivel reducido de putrescina. En algunos casos, el medio de cultivo comprende el nivel reducido de putrescina durante un tiempo y en una cantidad efectiva para disminuir un nivel de uno o mas de los glicanos fucosilados, galactosilados y glicanos sialilados de la protema recombinante. En algunos casos, el metodo comprende ademas el procesamiento (por ejemplo, uno o mas de la formulacion, llenado en un recipiente, etiquetado, envasado) de la preparacion en un producto farmacologico si la preparacion cumple con el valor diana de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, y glicanos sialilados.

[0039] En algunos casos, el medio comprende menos de aproximadamente 10 mg/L, 9,5 mg/L, 9 mg/L, 8,5 mg/L, 8 mg/L, 7,5 mg/L, 7 mg/L, 6,5 mg/L, 6 mg/L, 5,5 mg/L, 5 mg/L, 4,5 mg/L, 4 mg/L, 3,5 mg/L, 3 mg/L, 2,5 mg/L, 2 mg/L, 1,5 mg/L, 1 mg/L, 0,9 mg/L, 0,8 mg/L, 0,7 mg/L, 0,6 mg/L, 0,5 mg/L, 0,4 mg/L, 0,3 mg/L, 0,2 mg/L, 0,1 mg/L, 0,05 mg/L, 0,01 mg/L, o menos de putrescina.

[0040] En algunos casos, el metodo comprende ademas la medicion de un nivel de uno o mas glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, y glicanos sialilados en la preparacion de protema recombinante. En algunos casos, el metodo comprende ademas registrar el nivel en un medio impreso o legible por computadora, por ejemplo, en un informe de prueba, hoja de datos de seguridad del material (MSDS), registro de lotes, Certificado de prueba (CofT) o Certificado de analisis (CofA).

[0041] En algunos casos, la disminucion del nivel de uno o mas glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, y glicanos sialilados es mas bajo que el nivel correspondiente en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% del nivel correspondiente. En algunos casos, el nivel disminuido es uno o mas de: (a) menos de aproximadamente el 100% de glicanos fucosilados, por ejemplo, menos de aproximadamente el 100%, 95%, 90%, 80%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60% o menos de glicanos fucosilados; (b) menos de al menos aproximadamente el 95% de glicanos galactosilados, por ejemplo, menos de aproximadamente el 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% de glicanos galactosilados; y (c) menos de aproximadamente 90% de glicanos sialilados, por ejemplo, menos de aproximadamente 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% o menos de glicanos sialilados.

[0042] En otro aspecto, la divulgacion presenta un metodo para disminuir un nivel de uno o mas de los glicanos de alto contenido de manosa y glicanos G0F en una preparacion de protema recombinante, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una celula manipulada geneticamente para expresar una protema recombinante; (b) cultivar la celula en un medio de cultivo que comprende un nivel elevado de putrescina (por ejemplo, suplementado con putrescina) en condiciones en las que la celula expresa la protema recombinante; y (c) recolectar una preparacion de la protema recombinante producida por la celula, en donde la preparacion tiene un nivel reducido de uno o mas de los glicanos con alto contenido de manosa y glicanos G0F en relacion con un nivel correspondiente en una preparacion de la protema recombinante producida mediante el cultivo de celula en el medio que no comprende el nivel elevado de putrescina. En algunos casos, el medio de cultivo comprende el nivel elevado de putrescina durante un tiempo y en una cantidad efectiva para disminuir el nivel de uno o mas de glicanos de alto contenido de manosa y glicanos G0F de la protema recombinante. En algunos casos, el metodo comprende ademas el procesamiento (por ejemplo, uno o mas de la formulacion, llenado en un recipiente, etiquetado, envasado) de la preparacion en un producto farmaceutico si la preparacion cumple con el valor diana de uno o mas de glicanos de alto contenido de manosa y glicanos G0F.

[0043] En algunos casos, el medio de cultivo comprende aproximadamente 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9,5 mg/L, 10 mg/L de putrescina. En algunos casos, el medio de cultivo comprende aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 1 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2 mg/L, aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 3 mg/L, aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, aproximadamente 4 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 6 mg/L, aproximadamente 6 mg/L a aproximadamente 7 mg/L, aproximadamente 7 mg/L a aproximadamente 8 mg/L, aproximadamente 8 mg/L a aproximadamente 9 mg/L, aproximadamente 9 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, o aproximadamente 0,5 mg/L a aproximadamente 1 mg/L de putrescina.

[0044] En algunos casos, el metodo comprende ademas la medicion de un nivel de uno o mas de los glicanos de alto contenido de manosa y glicanos G0F en la preparacion de protema recombinante. En algunos casos, el metodo comprende ademas registrar el nivel en un medio impreso o legible por computadora, por ejemplo, en un informe de prueba, hoja de datos de seguridad del material (MSDS), registro de lotes, Certificado de prueba (CofT) o Certificado de analisis (CofA).

[0045] En algunos casos, la disminucion del nivel de uno o mas glicanos de alto contenido de manosa y glicanos G0F es menor que el nivel correspondiente en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% o mas, del nivel correspondiente. En algunos casos, el nivel disminuido es uno o mas de: (a) menos de aproximadamente 20% de glicanos de alto contenido de manosa, por ejemplo, menos de aproximadamente 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, o menos, glicanos con alto contenido de manosa; y (b) menos de aproximadamente 90% de glicanos G0F, por ejemplo, menos de aproximadamente 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos de glicanos G0F. Los glicanos con alto contenido de manosa pueden ser, por ejemplo, HM3, HM4, HM5, HM6, HM7, HM8, HM9 o combinaciones de los mismos.

[0046] En otro aspecto, la divulgacion presenta un metodo para aumentar un nivel de uno o mas de los glicanos de alto contenido de manosa y glicanos G0F en una preparacion de protema recombinante, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una celula manipulada geneticamente para expresar una protema recombinante; (b) cultivar la celula en un medio de cultivo que comprende un nivel reducido de putrescina en condiciones en las que la celula expresa la protema recombinante; y (c) recolectar una preparacion de la protema recombinante producida por la celula, en donde la preparacion tiene un nivel incrementado de uno o mas de los glicanos con alto contenido de manosa y glicanos G0F en relacion con un nivel correspondiente en una preparacion de la protema recombinante producida cultivando el celula en el medio que no comprende el nivel reducido de putrescina. En algunos casos, el medio de cultivo comprende un nivel reducido de putrescina durante un tiempo y en una cantidad efectiva para aumentar el nivel de uno o mas de glicanos de alto contenido de manosa y glicanos G0F de la protema recombinante. En algunos casos, el metodo comprende ademas el procesamiento (por ejemplo, uno o mas de la formulacion, llenado en un recipiente, etiquetado, envasado) de la preparacion en un producto farmaceutico si la preparacion cumple con el valor diana de uno o mas de glicanos de alto contenido de manosa y glicanos G0F.

[0047] En algunos casos, el medio comprende menos de aproximadamente 10 mg/L, 9,5 mg/L, 9 mg/L, 8,5 mg/L, 8 mg/L, 7,5 mg/L, 7 mg/L, 6,5 mg/L, 6 mg/L, 5,5 mg/L, 5 mg/L, 4,5 mg/L, 4 mg/L, 3,5 mg/L, 3 mg/L, 2,5 mg/L, 2 mg/L, 1,5 mg/L, 1 mg/L, 0,9 mg/L, 0,8 mg/L, 0,7 mg/L, 0,6 mg/L, 0,5 mg/L, 0,4 mg/L, 0,3 mg/L, 0,2 mg/L, 0,1 mg/L, 0,05 mg/L, 0,01 mg/L, o menos de putrescina.

[0048] En algunos casos, el metodo comprende ademas la medicion de un nivel de uno o mas de los glicanos de alto contenido de manosa y glicanos G0F en la preparacion de protema recombinante. En algunos casos, el metodo comprende ademas registrar el nivel en un medio impreso o legible por computadora, por ejemplo, en un informe de prueba, hoja de datos de seguridad del material (MSDS), registro de lotes, Certificado de prueba (CofT) o Certificado de analisis (CofA).

[0049] En algunos casos, el aumento del nivel de uno o mas glicanos de alto contenido de manosa y glicanos G0F es mas alto que el nivel correspondiente en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% o mas, del nivel correspondiente. En algunos casos, el nivel incrementado es uno o mas de: (a) mas de aproximadamente 0,1% de glicanos de alto contenido de manosa, por ejemplo, mas de aproximadamente 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% o mas, glicanos con alto contenido de manosa; y (b) mas de aproximadamente 1% de glicanos G0F, por ejemplo, mas de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40% o mas, glicanos G0F.

[0050] En algunos aspectos descritos en el presente documento, la etapa de cultivo comprende una primera etapa y una segunda etapa. En algunos casos, la primera etapa comprende cultivar la celula en el medio de cultivo que comprende un primer nivel de putrescina, y la segunda etapa comprende cultivar la celula en el medio de cultivo que comprende un segundo nivel de putrescina. En algunos casos, el primer nivel comprende un nivel reducido de (por ejemplo, no comprende) putrescina en relacion con el segundo nivel, y el segundo nivel comprende un nivel elevado de putrescina en relacion con el primer nivel. En algunos casos, el primer nivel comprende un nivel elevado de putrescina, y el segundo nivel comprende un nivel reducido de (por ejemplo, no comprende) putrescina.

[0051] En algunos casos, la primera etapa comprende cultivar la celula en el primer nivel de putrescina durante aproximadamente 1 a aproximadamente 8 dfas, por ejemplo, 1-7, 1-6, 1-5 dfas. En algunos casos, la segunda etapa comprende cultivar la celula en el segundo nivel de putrescina durante aproximadamente 1 a aproximadamente 12 dfas, por ejemplo, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6 dfas. En algunos casos, la primera etapa es una etapa de crecimiento. En algunos casos, la segunda etapa es una etapa de produccion.

[0052] En algunos aspectos descritos en el presente documento, el medio de cultivo comprende ademas una o mas de lisina, cistema, amonio, manganeso, cobalto, cobre, una peptona, glucosa, galactosa, glucosamina, glutamina, un Kpido (por ejemplo, colesterol), DMSO y sulfato de dextrano.

[0053] En algunos aspectos descritos en este documento, la celula es una celula de mairnfero. En algunos casos, la celula de mamffero es una celula CHO (por ejemplo, CHO-K1, DG44, CHO-DXB11, CHOK1SV, CHO-S) Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK o HEK-293.

[0054] En algunos aspectos descritos en el presente documento, la protema recombinante es un producto terapeutico recombinante. En algunos casos, la protema recombinante es un producto de anticuerpo terapeutico recombinante. En algunos casos, la protema recombinante es una protema de fusion terapeutica recombinante. En algunos casos, la protema recombinante es abatacept, abciximab, adalimumab, aflibercept, alefacept, alemtuzumab, basiliximab, bevacizumab, bevacizumab, belatacept, certolizumab, cetuximab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, entanercept, gemtuzumab, ibritumomab, infliximab, muromonab-CD3, natalizumab, omalizumab, palivizumab; panitumumab, ranibizumab, rilonacept, rituximab, tositumomab y trastuzumab.

[0055] En algunos aspectos descritos en el presente documento, las condiciones en que las celulas (por ejemplo, celulas de mai^ero) expresan protemas recombinantes comprenden (i) un medio que tiene un pH de aproximadamente 6, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,7, aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,9, aproximadamente 7, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,4, aproximadamente 7,5, o aproximadamente 8; (ii) una temperatura de aproximadamente 25°C, aproximadamente 26°C, aproximadamente 27°C, aproximadamente 28°C, aproximadamente 29°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 31°C, aproximadamente 32°C, aproximadamente 33°C, aproximadamente 34°C, aproximadamente 35°C, aproximadamente 36°C, aproximadamente 37°C, aproximadamente 38°C, aproximadamente 39°C, o aproximadamente 40°C; y/o (iii) un volumen de cultivo de aproximadamente 100 mL, aproximadamente 200 mL, aproximadamente 300 mL, aproximadamente 400 mL, aproximadamente 500 mL, aproximadamente 600 mL, aproximadamente 700 mL, aproximadamente 800 mL, aproximadamente 900 mL, aproximadamente 1 L, aproximadamente 2 L, aproximadamente 3 L, aproximadamente 5 L, aproximadamente 10 L, aproximadamente 20 L, aproximadamente 30 L, aproximadamente 40 L, aproximadamente 50 L, aproximadamente 100 L, aproximadamente 200 L, aproximadamente 300 L, aproximadamente 400 L, aproximadamente 500 L, aproximadamente 600 L, aproximadamente 700 L, aproximadamente 800 L, aproximadamente 900 L, aproximadamente 1000 L, 5.000 L, 10.000 L, 20.000 L, o mas.

[0056] En otro aspecto, la divulgacion presenta una preparacion de una protema recombinante producida utilizando un metodo descrito en este documento.

[0057] En otro aspecto, la divulgacion presenta un metodo de produccion de una preparacion de anticuerpo terapeutico recombinante (por ejemplo, abciximab, adalimumab, alemtuzumab, basiliximab, bevacizumab, certolizumab, cetuximab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, gemtuzumab, ibritumomab, infliximab, muromonab-CD3, natalizumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, ranibizumab, rituximab, tositumomab o trastuzumab), comprendiendo el metodo: (a) proporcionar un valor diana (por ejemplo, una especificacion de producto farmaceutico predeterminado o un criterio de control de calidad para una preparacion farmaceutica, por ejemplo, un Certificado de analisis (CofA), un Certificado de prueba (CofT) o un Registro maestro de lotes de un producto de anticuerpo terapeutico de referencia) de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa (por ejemplo, HM3, HM4, HM5, HM6, HM7, HM8, HM9, o combinaciones de los mismos), y glicanos sialilados; (b) proporcionar una celula CHO modificada por ingeniena genetica para expresar un anticuerpo recombinante; (c) cultivar la celula en un medio de cultivo que comprende putrescina (por ejemplo, aproximadamente 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9,5 mg/L, 10 mg/L de putrescina) en condiciones en las que la celula expresa el anticuerpo recombinante; (d) recolectar (por ejemplo, purificar o aislar de la celula y/o el medio de cultivo) una preparacion del anticuerpo recombinante producido por la celula; y (e) formular (p. ej., uno o mas de formulacion, llenado en un recipiente, etiquetado, envasado) de la preparacion en un producto farmacologico si la preparacion cumple con el valor diana de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa, y glicanos sialilados.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0058] Las presentes ensenanzas descritas en este documento se entenderan mas completamente a partir de la siguiente descripcion de varios ejemplos ilustrativos, cuando se lean junto con los dibujos que se acompanan. Debe entenderse que los dibujos que se describen a continuacion son solo para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de las presentes ensenanzas de ninguna manera.

FIG. 1 es una ilustracion esquematica de una molecula de anticuerpo IgG.

FIG. 2 es una representacion grafica de los niveles de glicanos fucosilados en preparaciones de un anticuerpo modelo de celulas cultivadas en un medio que tiene diferentes niveles de putrescina.

FIG. 3 es una representacion grafica de los niveles de glicano G0F, G1F y G2F en preparaciones de un anticuerpo modelo de celulas cultivadas en un medio que tiene diferentes niveles de putrescina.

FIG. 4 es una representacion grafica de los niveles totales de glicanos con alto contenido de manosa y los niveles de glicanos sialilados en preparaciones de un anticuerpo modelo de celulas cultivadas en un medio que tiene diferentes niveles de putrescina.

DESCRIPCION DETALLADA

[0059] Los inventores han descubierto que las preparaciones de polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) que tienen niveles diana de glicanos (por ejemplo, glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados) pueden ser producidas a partir de celulas cultivadas en un medio que tiene putrescina, por ejemplo, un nivel particular de putrescina eficaz para causar dicho efecto. La presente divulgacion abarca preparaciones de polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) que tienen niveles espedficos de glicanos (por ejemplo, glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados), metodos para fabricar tales polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) y metodos de uso tales polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos).

Definiciones

[0060] Como se usa en el presente documento, "purificado" (o "aislado") se refiere a una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, un polinucleotido) o una secuencia de aminoacidos (por ejemplo, un polipeptido) que esta sustancialmente libre de otros componentes. En algunos casos, un polinucleotido purificado o un polipeptido purificado se elimina o se separa de otros componentes presentes en su entorno natural. Por ejemplo, un polipeptido aislado es uno que se separa de otros componentes de una celula en la que se produjo (por ejemplo, el retmulo endoplasmico o protemas citoplasmicas y ARN). Un polinucleotido aislado es uno que esta separado de otros componentes nucleares (p. ej., Histonas) y/o de secuencias de acidos nucleicos en sentido ascendente o descendente. Una secuencia aislada de acido nucleico o secuencia de aminoacidos puede estar libre al menos en un 60%, o al menos libre en un 75%, o libre al menos en un 90%, o libre al menos en un 95% de otros componentes presentes en el entorno natural de la secuencia de acido nucleico indicada o secuencia de aminoacidos.

[0061] Como se usa en el presente documento, "polinucleotido" (o "secuencia de nucleotidos" o "molecula de acido nucleico") se refiere a un oligonucleotido, nucleotido, o polinucleotido, y fragmentos o porciones de los mismos, y a ADN y ARN de origen genomico o origen sintetico, que puede ser de cadena simple o doble, y representa la cadena sentido o antisentido.

[0062] Como se usa en el presente documento, "polipeptido" (o "secuencia de aminoacidos" o "protema") se refiere a un oligopeptido, peptido, polipeptido o secuencia de protema, y fragmentos o porciones de los mismos, y a moleculas de origen natural o sintetico. "Secuencia de aminoacidos" y terminos similares, como "polipeptido" o "protema", no pretenden limitar la secuencia de aminoacidos indicada a la secuencia de aminoacidos nativa completa asociada con la molecula de protema citada.

[0063] El termino "cantidad farmaceuticamente eficaz" o "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad (por ejemplo, dosis) eficaz en el tratamiento de un paciente, que tiene un trastorno o condicion descrita en el presente documento. Tambien debe entenderse en el presente documento que una "cantidad farmaceuticamente eficaz" puede interpretarse como una cantidad que proporciona un efecto terapeutico deseado, ya sea tomada en una dosis o en cualquier dosis o via, tomada sola o en combinacion con otros agentes terapeuticos.

[0064] El termino "tratamiento" o "tratar", como se usa aqrn, se refiere a la administracion de una terapia en una cantidad, de manera, y/o modo eficaz para mejorar una condicion, smtoma o parametro asociado con un trastorno o afeccion o para prevenir o reducir la progresion de un trastorno o afeccion, en un grado detectable para un experto en la materia. Una cantidad, manera o modo efectivo puede variar segun el tema y puede adaptarse al sujeto.

[0065] Tal como se utiliza aqrn, el termino "anticuerpo" se refiere a un polipeptido que incluye al menos una region variable de inmunoglobulina, por ejemplo, una secuencia de aminoacidos que proporciona un dominio variable de inmunoglobulina o secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una region variable de la cadena pesada (H) (abreviada en este documento como VH), y una region variable de la cadena ligera (L) (abreviada en este documento como VL). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de la cadena pesada (H) y dos regiones variables de la cadena ligera (L). El termino "anticuerpo" abarca fragmentos de anticuerpos que se unen a antfgenos (por ejemplo, anticuerpos de cadena simple, Fab, F(ab')², Fd, Fv y fragmentos de dAb), asf como anticuerpos completos, por ejemplo, inmunoglobulinas intactas de los tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (asf como sus subtipos). Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipo kappa o lambda. En algunos casos, un anticuerpo incluye una region Fc. En algunos casos, un anticuerpo es un anticuerpo terapeutico.

[0066] Tal como se utiliza aqrn, el termino "region Fc" se refiere a un dfmero de dos "polipeptidos Fc", cada uno "polipeptido Fc" que comprende la region constante de un anticuerpo excluyendo el primer dominio de la region constante de inmunoglobulina. En algunos casos, una "region Fc" incluye dos polipeptidos Fc unidos por uno o mas enlaces disulfuro, enlazadores qmmicos o enlazadores peptfdicos. "Polipeptido Fc" se refiere a los dos ultimos dominios de inmunoglobulina de region constante de IgA, IgD e IgG, y los tres ultimos dominios de inmunoglobulina de region constante de IgE e IgM, y tambien puede incluir parte o la totalidad de la bisagra N-terminal flexible para estos dominios. Para IgG, el "polipeptido Fc" comprende los dominios de inmunoglobulina Cgamma2 (Cy2) y Cgamma3 (Cy3) y la parte inferior de la bisagra entre Cgammal (Cy1) y Cy2. Aunque los lfmites del polipeptido Fc pueden vanar, el polipeptido Fc de la cadena pesada de la IgG humana generalmente se define para comprender los residuos que comienzan en T223 o C226 o P230, hasta su termino carboxilo, en donde la numeracion es segun el mdice de la UE como en Kabat et al. (1991, NIH Publicacion 91-3242, National Technical Information Services, Springfield, VA). Para IgA, el polipeptido Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Calpha2 (Ca2) y Calpha3 (Ca3) y la parte inferior de la bisagra entre Calphal (Ca1) y Ca2. Una region Fc puede ser sintetica, recombinante, o generada a partir de fuentes naturales como la IVIG.

[0067] Tal como se utiliza aqrn, un "glicano" es un azucar. Los glicanos pueden ser monomeros o polfmeros de residuos de azucar, pero tipicamente contienen al menos tres azucares, y pueden ser lineales o ramificados. Un glicano puede incluir residuos naturales de azucar (por ejemplo, glucosa, N-acetilglucosamina, acido neurammico N-acetilo, galactosa, manosa, fucosa, hexosa, arabinosa, ribosa, xilosa, etc.) y/o azucares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, 2'-desoxirribosa, fosfomanosa, 6'-sulfo N-acetilglucosamina, etc.). El termino "glicano" incluye homopolfmeros y heteropolfmeros de residuos de azucar. El termino "glicano" tambien abarca un componente de glucano de un glucoconjugado (por ejemplo, de una glicoprotema, glicolfpido, proteoglicano, etc.). El termino tambien abarca los glicanos libres, incluidos los glicanos que se han dividido o liberado de otro modo a partir de un glicoconjugado.

[0068] Como se usa en este documento, un "glicano de alto contenido de manosa" se refiere a un glicano que incluye al menos 3 residuos de azucar de manosa y que termina en una manosa en un extremo no reductor del glicano. En algunos casos, un "glicano con alto contenido de manosa" incluye al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 residuos de azucar de manosa.

[0069] Tal como se utiliza aqrn, un "glicano sialilado" se refiere a un glicano que incluye al menos 1 acido sialico. En ciertas ocasiones, un glicano sialilado incluye al menos 1, 2, 3 o 4 acidos sialicos. En algunos casos, un glicano sialilado es un glicano monosialilado (por ejemplo, un glicano ramificado monosialilado en un brazo a1-3 del glicano ramificado (por ejemplo, con un enlace terminal NeuAc-a2,6-Gal)), y/o un glicano desialilado (por ejemplo, un glicano ramificado sialilado en un brazoa1-3 y un brazo a1-6 del glicano ramificado).

[0070] Como se usa en este documento, un "glicano galactosilado" se refiere a un glicano que incluye al menos 1 residuo de azucar de galactosa. En algunos casos, un glicano galactosilado es un glicano G1, G2, G1F, G2F, A1 y/o A2. En algunos casos, un glicano galactosilado incluye una o mas repeticiones de lactosamina. En algunos casos, un glicano galactosilado es un glicano que contiene galactosa-alfa-1-3-galactosa. En algunos casos, un glicano galactosilado es un glicano de tres antenas o un glicano de tres antenas.

[0071] Tal como se utiliza aqrn, un "glicano maduro" se refiere a un glicano que incluye al menos un residuo de azucar, ademas de una estructura de pentasacarido de nucleo, y no incluye mas de tres residuos de azucar de manosa. En algunos casos, un glicano maduro incluye una estructura de pentasacarido central y al menos una N-acetilglucosamina. Para claridad, los glicanos de alto contenido de manosa y los glicanos hubridos no son glicanos maduros.

[0072] Tal como se utiliza aqrn, el termino "preparacion glicoprotema" se refiere a un conjunto de moleculas de glicoprotema individuales, cada uno de los cuales comprende un polipeptido que tiene una secuencia particular de aminoacidos (cuya secuencia de aminoacidos incluye al menos un sitio de glicosilacion) y al menos una glucano unido covalentemente a al menos un sitio de glicosilacion. Las moleculas individuales de una glicoprotema particular dentro de una preparacion de glicoprotema tienen tfpicamente secuencias de aminoacidos identicas pero pueden diferir en la ocupacion de al menos un sitio de glicosilacion y/o en la identidad de los glicanos unidos a al menos uno de los sitios de glicosilacion. Es decir, una preparacion de glicoprotema puede contener solo una glicoforma unica de una glicoprotema particular, pero mas tfpicamente contiene una pluralidad de glicoformas. Diferentes preparaciones de la misma glucoprotema pueden diferir en la identidad de las glicoformas presentes (por ejemplo, una glicoforma que esta presente en una preparacion puede estar ausente de otra) y/o en las cantidades relativas de diferentes glicoformas.

[0073] El termino "glicoforma" se utiliza aqrn para referirse a una forma particular de una glicoprotema. Es decir, cuando una glicoprotema incluye un polipeptido particular que tiene el potencial de estar vinculado a diferentes glicanos o conjuntos de glicanos, entonces cada version diferente de la glicoprotema (es decir, cuando el polipeptido esta vinculado a un glicano o conjunto de glicanos en particular) referido como una "glicoforma".

[0074] La "glicoprotema de referenda", como se usa en el presente documento, se refiere a una glicoprotema que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoacidos (por ejemplo, que tiene aproximadamente 95-100% de aminoacidos identicos de) como una glicoprotema descrita en el presente documento, por ejemplo, una glicoprotema a la que se compara. En algunos casos, una glicoprotema de referencia es una glicoprotema terapeutica descrita en el presente documento, por ejemplo, una glicoprotema terapeutica aprobada por la FDA.

[0075] Como se usa en este documento, un "sitio de N-glicosilacion de una region Fc" se refiere a un residuo de aminoacido dentro de una region Fc a la se N-vincula un glicano.

[0076] "Valor diana", como se usa en el presente documento, se refiere a un nivel predeterminado de uno o mas glicanos particulares, tales como glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados. En algunos casos, un valor diana es un valor absoluto. En algunos casos, un valor diana es un valor relativo. En algunos casos, un valor diana es un nivel de uno o mas glicanos particulares, como los glicanos con alto contenido de manosa (por ejemplo, HM3, HM4, HM5, HM6, HM8, HM8 o combinaciones), glicanos fucosilados (por ejemplo, G0F, g 1f , G2F o combinaciones), glicanos galactosilados (por ejemplo, G1, G2, G1F, G2F, A1, A2 o combinaciones) y/o glicanos sialilados (por ejemplo, monosialilados, desialilados o combinaciones), en un producto de glicoprotema de referencia o descrito en una especificacion o registro de lote maestro para un producto farmaceutico.

[0077] En algunos casos, un valor diana se refiere a un nivel absoluto de (por ejemplo, numero de moles de) uno o mas glicanos (por ejemplo, glicanos de alto contenido de manosa (por ejemplo, una o mas especies de glicanos de alto contenido de manosa), glicanos fucosilados (por ejemplo, una o mas especies de glicanos fucosilados), glicanos galactosilados (por ejemplo, una o mas especies de glicanos galactosilados) y/o glicanos sialilados (por ejemplo, una o mas especies de glicanos sialilados) en una preparacion de glicoprotema. Un valor diana se refiere a un nivel de uno o mas glicanos (p. ej., glicanos de alto contenido de manosa (p. ej., una o mas especies de glicanos de alto contenido de manosa), glicanos fucosilados (p. ej., una o mas especies de glicanos fucosilados), glicanos galactosilados (p. ej., una o mas especies de glicanos galactosilados) y/o glicanos sialilados (por ejemplo, una o mas especies de glicanos sialilados) en una preparacion de glicoprotema en relacion con el nivel total de glicanos en la preparacion de glicoprotema. En algunos casos, un valor diana se expresa como un "por ciento", que se refiere al numero de moles de uno o mas glicanos (p. ej., glicanos Fc) en relacion con los moles totales de glicanos (p. ej., glicanos Fc) en una preparacion de glicoprotema. En algunos casos, "porcentaje" se refiere al numero de moles de uno o mas glicanos Fc liberados con PNGasa F en relacion con el total de moles de glicanos Fc liberados con PNGasa F detectados.

Celulas

[0078] Cualquier celula huesped que puede ser utilizada para expresar un polipeptido de interes (por ejemplo, un anticuerpo) se puede utilizar en los metodos descritos en el presente documento. Las celulas pueden modificarse geneticamente para contener una secuencia de acido nucleico recombinante, por ejemplo, un gen, que codifica un polipeptido de interes (por ejemplo, un anticuerpo). Por ejemplo, las celulas utiles pueden expresar un polipeptido recombinante. La expresion recombinante de un gen que codifica un polipeptido puede incluir la construccion de un vector de expresion que contiene un polinucleotido que codifica el polipeptido. Una vez que se ha obtenido un polinucleotido, se puede producir un vector para la produccion del polipeptido mediante tecnologfa de ADN recombinante usando tecnicas conocidas en la tecnica. Se pueden usar metodos conocidos para construir vectores de expresion que contengan secuencias codificantes de polipeptidos y senales de control de trascripcion y traduccion apropiadas. Estos metodos incluyen, por ejemplo, tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas y recombinacion genetica in vivo.

[0079] Un vector de expresion se puede transferir a una celula huesped mediante tecnicas convencionales y las celulas transfectadas entonces se pueden cultivar mediante tecnicas convencionales, modificadas de acuerdo con la presente descripcion, para producir un polipeptido recombinante. Se puede usar una variedad de sistemas de vectores de expresion del huesped (vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 5.807.715). Dichos sistemas de expresion del huesped (por ejemplo, sistemas de expresion del huesped creados por ingeniena genetica) se pueden usar para producir polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) y, cuando se desee, se purifican posteriormente. Dichos sistemas de expresion del hospedador incluyen, pero no se limitan a, levaduras (por ejemplo, Saccharomyces y Pichia) transformadas con vectores de expresion de levaduras recombinantes que contienen secuencias codificantes de polipeptidos; sistemas de celulas de insecto infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de polipeptidos; sistemas de celulas vegetales infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresion de plasmidos recombinantes (por ejemplo, plasmido Ti) que contienen secuencias codificantes de polipeptidos; o sistemas celulares de mairnferos (por ejemplo, celulas COS, CHO, BHK, 293, NS0 y 3T3) que albergan construcciones de expresion recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de celulas de mamfferos (por ejemplo, promotor de metalotionema) o de virus de mamfferos (por ejemplo, el promotor tardm de adenovirus; el promotor 7,5K del virus vaccinia).

[0080] Para la expresion en celulas huesped de mamfferos, los sistemas de expresion basados en virus pueden utilizarse (vease, por ejemplo, Logan et al, 1984, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 8: 355-359). La eficiencia de la expresion puede mejorarse mediante la inclusion de elementos potenciadores de la transcripcion apropiados, terminadores de la transcripcion, etc. (vease, por ejemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544).

[0081] Ademas, una cepa de celula huesped se puede escoger que module la expresion de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto genico en la forma espedfica deseada. Diferentes celulas huesped tienen mecanismos caractensticos y espedficos para el procesamiento y la modificacion post-traduccionales de protemas y productos geneticos. Se pueden elegir lmeas celulares o sistemas huesped apropiados para asegurar la correcta modificacion y procesamiento del polipeptido (por ejemplo, anticuerpo) expresado. Dichas celulas incluyen, por ejemplo, lmeas celulares de mairffferos establecidas y lmeas celulares de insectos, celulas animales, celulas fungicas y celulas de levadura. Las celulas huesped de mairffferos incluyen, pero no se limitan a, CHO, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0 (una lmea celular de mieloma murino que no produce de manera endogena ninguna cadena de inmunoglobulina), celulas CRL7O3O, HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Ag14 y celulas de hibridoma. Otros ejemplos no limitativos de celulas huesped de animales o mairffferos incluyen celulas de ovario de hamster chino (CHO), como CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12: 555-556 y Kolkekar et al., 1997, Biochem., 36: 10901-10909), CHO-DXB11 (G. Urlaub y LA Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 4216-4220. LH Graf y LA Chasin 1982, Molec. Cell. Biol., 2: 93-96), lmea celular CHO-K1 Tet-On (Clontech), CHO designada ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), CHO clon 13 (GEIMG, Genova, IT), clon B de CHO (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF designado como ECACC 93061607 (Ca MR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), RR-CHOK1 designado como ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHOK1sv (Edmonds et al., Mol. Biotech. 34: 179-190 (2006)), CHO-S (Pichler et al., Biotechnol. Bioeng. 108: 386-94 (2011)), celulas CHO negativas de reductasa de dihidrofolato (CHO/-DHFR, Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77: 4216), y celulas dp12.CHO (patente de EE.UU. n° 5.721.121); celulas CV1 de rinon de mono transformadas por SV40 (celulas COS, COS-7, AtCC CRL-1651); celulas de rinon embrionario humano (por ejemplo, 293 celulas o 293 celulas subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspension, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); celulas de rinon de hamster bebe (BHK, ATCC CCL-10); celulas de rinon de mono (CV1, ATCC CCL-70); Celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); celulas de sertoli de raton (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23: 243 251); celulas de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL-2); celulas renales caninas (MDCK, At CC CCL-34); celulas pulmonares humanas (W138, ATCC CCL-75); celulas de hepatoma humano (HEP-G2, HB 8065); celulas de tumor mamario de raton (MMT 060562, ATCC C^cL-51); celulas de hffgado de rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442); celulas TR1 (Mather, 1982, Ann. NY Acad. Sci., 383: 44-68); celulas MCR 5; y celulas FS4.

[0082] Para la produccion a largo plazo, de alto rendimiento de protemas recombinantes, las celulas huesped se pueden disenar para expresar de forma estable un polipeptido (por ejemplo, anticuerpo). Las celulas hospedadoras pueden transformarse con el ADN controlado por elementos de control de expresion apropiados conocidos en la tecnica, que incluyen promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripcion, sitios de poliadenilacion y marcadores seleccionables. Se pueden usar metodos comunmente conocidos en la tecnica de la tecnologfa de ADN recombinante para seleccionar un clon recombinante deseado. En algunos casos, una celula esta modificada geneticamente para aumentar el nivel de expresion de un polipeptido endogeno, por ejemplo, aumentando la transcripcion de un gen que codifica el polipeptido y/o aumentando la estabilidad del ARNm. En algunos casos, la transcripcion de un gen que codifica un polipeptido aumenta al: alterar la secuencia reguladora del gen endogeno, por ejemplo, en una celula somatica, por ejemplo, mediante la adicion de un elemento regulador positivo, como un potenciador o un sitio de union de ADN para un activador transcripcional; la eliminacion de un elemento regulador negativo, como un sitio de union a ^aDⁿpara un represor transcripcional; y/o la sustitucion de la secuencia reguladora endogena, o elementos en ella, con la de otro gen, permitiendo asf que la region de codificacion del gen se transcriba de manera mas eficiente.

[0083] Una vez que un polipeptido descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente memoria) ha sido producido por expresion recombinante, puede purificarse por cualquier metodo conocido en la tecnica para la purificacion, por ejemplo, por cromatograffa (por ejemplo, intercambio ionico, afinidad, y cromatograffa en columna de tamano), centrifugacion, solubilidad diferencial o cualquier otra tecnica estandar para la purificacion de protemas. Por ejemplo, un anticuerpo se puede aislar y purificar seleccionando y combinando adecuadamente columnas de afinidad como la columna de Protema A con columnas de cromatograffa, filtracion, ultrafiltracion, salado y procedimientos de dialisis (vease, Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Ademas, como se describe en el presente documento, un polipeptido (por ejemplo, un anticuerpo) puede fusionarse con secuencias de polipeptidos heterologos para facilitar la purificacion. Los polipeptidos que tienen cadenas de azucar deseadas se pueden separar con una columna de lectina por metodos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, el documento WO 02/30954).

[0084] De acuerdo con la presente descripcion, se pueden emplear la biologfa molecular convencional, microbiologfa y tecnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia de la tecnica. Estas tecnicas se describen en la literatura (vease, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edicion (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumenes I y II (DN Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (BD Hames & SJ Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (BD Hames & SJ Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (RI Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986)); B.

Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); FM Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Metodos de cultivo

[0085] En general, los polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) que tienen niveles diana de glicanos (por ejemplo, glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados) se pueden producir mediante el cultivo de celulas en medio que contiene putrescina, por ejemplo, un nivel particular y efectivo de putrescina (por ejemplo, durante una o mas etapas de cultivo).

[0086] En algunos casos, las celulas modificadas por ingeniena genetica para expresar un polipeptido son cultivadas (por ejemplo, en una o mas etapas de cultivo) en un medio que incluye putrescina, por ejemplo, un nivel elevado de putrescina, disminuir niveles de glicanos de alto contenido de manosa y/o glicanos G0F en una preparacion del polipeptido expresado por las celulas. En algunos casos, un nivel de glicanos con alto contenido de manosa y/o glicanos G0F disminuye en relacion con el (los) nivel(es) correspondiente(s) en una preparacion del polipeptido producido usando el mismo medio que no incluye putrescina, por ejemplo, un nivel elevado de putrescina. En algunos casos, el nivel disminuido de glicanos con alto contenido de manosa y/o glicanos G0F es inferior al nivel correspondiente en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% del nivel correspondiente.

[0087] En algunos casos, las celulas manipuladas geneticamente para expresar un polipeptido son cultivadas (por ejemplo, en una o mas etapas de cultivo) en un medio que incluye putrescina, por ejemplo, un nivel elevado de putrescina, para aumentar los niveles de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos sialilados, glicanos G1F y/o glicanos G2F, en una preparacion del polipeptido expresado por las celulas. En algunos casos, el nivel de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos sialilados, glicanos G1F y/o glicanos G2F aumenta con respecto al nivel o los niveles correspondientes en una preparacion del polipeptido producido usando el mismo medio que no incluye la putrescina., por ejemplo, un nivel elevado de putrescina. En algunos casos, el aumento del nivel de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos sialilados, glicanos G1F y/o glicanos G2F es superior al nivel correspondiente(s) en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% o mas, del nivel correspondiente.

[0088] En algunos casos, las celulas manipuladas geneticamente para expresar un polipeptido son cultivadas (por ejemplo, en una o mas etapas de cultivo) en un medio que incluye un nivel reducido de putrescina, por ejemplo, no incluye putrescina, a aumentar los niveles de glicanos de alto contenido de manosa y/o glicanos g 0f en una preparacion del polipeptido expresado por las celulas. En algunos casos, un nivel de glicanos con alto contenido de manosa y/o glicanos G0F aumenta con respecto al nivel o los niveles correspondientes en una preparacion del polipeptido producido utilizando el mismo medio que no incluye un nivel reducido de putrescina. En algunos casos, el aumento del nivel de glicanos con alto contenido de manosa y/o glicanos G0F es superior al nivel correspondiente en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%. 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% o mas, del nivel correspondiente.

[0089] En algunos casos, las celulas manipuladas geneticamente para expresar un polipeptido son cultivadas (por ejemplo, en una o mas etapas de cultivo) en un medio que incluye un nivel reducido de putrescina, por ejemplo, no incluye putrescina, disminuir niveles de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos sialilados, glicanos G1F y/o glicanos G2F en una preparacion del polipeptido expresado por las celulas. En algunos casos, el nivel de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos sialilados, glicanos G1F y/o glicanos G2F disminuye con respecto al nivel o los niveles correspondientes en una preparacion del polipeptido producido usando el mismo medio que no incluye reduccion del nivel de putrescina. En algunos casos, el nivel disminuido de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos sialilados, glicanos G1F y/o glicanos G2F es inferior al nivel correspondiente en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% del nivel correspondiente.

[0090] Como se usa en el presente documento, un "nivel elevado de putrescina" significa una mayor concentracion de putrescina que esta presente en un medio estandar, un medio de partida, un medio utilizado en una o mas etapas del cultivo, y/o en un medio en el que se produce un polipeptido. En algunos casos, la putrescina no esta presente en un medio estandar y/o de inicio, un medio utilizado en una o mas etapas diferentes del cultivo y/o en un medio en el que se produce un polipeptido, y un "nivel elevado" es cualquier cantidad de putrescina. Un medio puede incluir un nivel elevado de putrescina inicialmente (es decir, al comienzo de un cultivo), y/o el medio puede complementarse con putrescina para lograr un nivel elevado de putrescina en un momento o momentos en particular (por ejemplo, en una o mas etapas) durante el cultivo.

[0091] En algunos casos, un nivel elevado de putrescina es un aumento de al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 900%, 900%, 950%, 1.000% o mas, en relacion con un nivel de putrescina en un medio estandar, un medio de partida, un medio durante una o mas etapas de cultivo y/o en un medio en el que se produce un polipeptido.

[0092] En algunos casos, un nivel elevado de putrescina es un aumento en el nivel de putrescina en al menos aproximadamente 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1.5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9,5 mg/L, 10 mg/L, o mas.

[0093] En algunos casos, un nivel elevado de putrescina es de aproximadamente 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9,5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, 25 mg/L, 30 mg/L, 35 mg/L, 40 mg/L, o mas. En algunos casos, un nivel elevado de putrescina es de aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 1 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2 mg/L, aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 3 mg/L, aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, aproximadamente 4 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 6 mg/L, aproximadamente 6 mg/L a aproximadamente 7 mg/L, aproximadamente 7 mg/L a aproximadamente 8 mg/L, aproximadamente 8 mg/L a aproximadamente 9 mg/L, aproximadamente 9 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, o aproximadamente 0,5 mg/L a aproximadamente 1 mg/L de putrescina.

[0094] Como se usa en este documento, un "nivel reducido de putrescina" significa una menor concentracion de putrescina que esta presente en un medio estandar, un medio de partida, un medio utilizado en una o mas etapas del cultivo, y/o en un medio en que se produce un polipeptido. Un medio puede incluir un nivel reducido de putrescina inicialmente (es decir, al comienzo de un cultivo), un medio puede diluirse en un momento o momentos particulares (por ejemplo, en una o mas etapas) durante el cultivo para reducir el nivel de putrescina. y/o un medio puede reemplazarse con un medio que tenga un nivel reducido de putrescina en un momento u otros momentos (por ejemplo, en una o mas etapas) durante el cultivo. En algunos casos, un nivel reducido de putrescina no es putrescina o ningun nivel detectable de putrescina en un medio.

[0095] En algunos casos, un nivel reducido de putrescina es una disminucion de al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100%, en relacion con un nivel de putrescina en un medio estandar, un medio de partida, un medio durante una o mas etapas de cultivo, y/o en un medio en el que se produce un polipeptido.

[0096] En algunos casos, un nivel reducido de putrescina es una disminucion en al menos aproximadamente 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9,5 mg/L, 10 mg/L, o mas.

[0097] En algunos casos, un nivel reducido de putrescina es menor de aproximadamente 10 mg/L, 9,5 mg/L, 9 mg/L, 8.5 mg/L, 8 mg/L, 7,5 mg/L, 7 mg/L, 6,5 mg/L, 6 mg/L, 5,5 mg/L, 5 mg/L, 4,5 mg/L, 4 mg/L, 3,5 mg/L, 3 mg/L, 2,5 mg/L, 2 mg/L, 1,5 mg/L, 1 mg/L, 0,9 mg/L, 0,8 mg/L, 0,7 mg/L, 0,6 mg/L, 0,5 mg/L, 0,4 mg/L, 0,3 mg/L, 0,2 mg/L, 0,1 mg/L, 0,05 mg/L, 0,01 mg/L, o menos.

[0098] Las celulas pueden cultivarse en una variedad de medios de cultivo celular conocidos en la tecnica, que estan modificados segun la invencion para incluir putrescina como se describe en el presente documento. Los expertos en la tecnica entienden que el medio de cultivo celular se refiere a una solucion nutritiva en la que se cultivan celulas, tales como celulas de animales o mairnferos. Un medio de cultivo celular generalmente incluye uno o mas de los siguientes componentes: una fuente de energfa (por ejemplo, un carbohidrato como la glucosa); aminoacidos; vitaminas; lfpidos o acidos grasos libres; y elementos traza, por ejemplo, compuestos inorganicos o elementos naturales en el rango micromolar. El medio de cultivo celular tambien puede contener componentes adicionales, como hormonas y otros factores de crecimiento (por ejemplo, insulina, transferrina, factor de crecimiento epidermico, suero y similares); sales (por ejemplo, calcio, magnesio y fosfato); tampones (por ejemplo, HEPES); nucleosidos y bases (p. ej., adenosina, timidina, hipoxantina); antibioticos (por ejemplo, gentamicina); y agentes protectores de celulas (por ejemplo, un poliol Pluronic (Pluronic F68)).

[0099] En algunos casos, ademas de un nivel elevado o reducido de putrescina, un medio de cultivo celular incluye lisina, cistema, amonio, manganeso, cobalto, cobre, una peptona, glucosa, galactosa, galactosamina, glucosamina, glutamina, un lfpido (p. ej., colesterol), DMSO y/o sulfato de dextrano. Por ejemplo, un medio de cultivo puede incluir aproximadamente 0,1 g/L a aproximadamente 30 g/L de lisina (por ejemplo, aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 10 g/L de lisina, aproximadamente 2 g/L a aproximadamente 8 g/L de lisina, aproximadamente 3 g/L a aproximadamente 7 g/L de lisina, aproximadamente 4 g/L a aproximadamente 6 g/L de lisina, aproximadamente 1 g/L de lisina, aproximadamente 2 g/L de lisina, aproximadamente 3 g/L de lisina, aproximadamente 4 g/l L lisina, aproximadamente 5 g/L lisina, aproximadamente 6 g/L lisina, aproximadamente 7 g/L lisina, aproximadamente 8 g/L lisina, aproximadamente 9 g/L lisina, o aproximadamente 10 g/L lisina, o mas); aproximadamente 0,1 g/L a aproximadamente 1 g/L cistema; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM de amonio (por ejemplo, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM de amonio, de aproximadamente 11 mM a aproximadamente 19 mM de amonio, de aproximadamente 12 mM a aproximadamente 18 mM de amonio, de aproximadamente 13 mM a aproximadamente 17 mM de amonio, aproximadamente 14 mM a aproximadamente

16 mM, aproximadamente 10 mM de amonio, aproximadamente 11 mM de amonio, aproximadamente 12 amonio, aproximadamente 1

amonio, aproximadamente 14 mM de amonio, aproximadamente 15 amonio, aproximadamente 1

mM de amonio, aproximadamente 17 mM de amonio, aproximadamente 18 amonio, aproximadamente 19 mM de amonio, aproximadamente 20 mM de amonio, o mas); aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 0,5 mM manganeso; aproximadamente 0,1 mg/L hasta aproximadamente 30 mg/L de cobalto; aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 mM cobre; aproximadamente 0,1 g/L a aproximadamente 10 g/L glucosa; aproximadamente 0,5 g/L a aproximadamente 30 g/L peptona, por ejemplo, una peptona no derivada de animales tal como soja o semilla de algodon; aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 mM galactosamina; aproximadamente 0,1 g/L a aproximadamente 5 g/L glucosamina; aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5% DMSO (por ejemplo, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 2% DMSO, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1% DMSO, aproximadamente 1% a aproximadamente 1,5% DMSO, aproximadamente 0,6% a aproximadamente 1,4% DMSO, aproximadamente 0,7% a aproximadamente 1,3% DMSO, aproximadamente 0,8% a aproximadamente 1,2% DMSO, aproximadamente 0,9% a aproximadamente 1,1% DMSO, aproximadamente 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, o aproximadamente 2% de DMSO, o mas), y/o aproximadamente 0,01 g/L a aproximadamente 0,1 g/L de sulfato de dextrano.

[0100] Los medios que se han preparado o estan disponibles comercialmente pueden modificarse de acuerdo con la presente divulgacion para su utilizacion en los metodos descritos en el presente documento. Ejemplos no limitativos de tales medios incluyen Minimal Essential Medium (MEM, Sigma, St. Louis, Mo.); medio de Ham F10 (Sigma); medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma); Medio RPMI-1640 (Sigma); medio de cultivo celular HyClone (HyClone, Logan, Utah); Power CHO2 (Lonza Inc., Allendale, NJ); y medios qmmicamente definidos (CD), que estan formulados para tipos de celulas particulares, por ejemplo, medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, California). El medio de cultivo adecuado para celulas particulares que se cultivan puede ser determinado por un experto en la tecnica sin experimentacion excesiva, y dicho medio puede alterarse de acuerdo con la descripcion.

[0101] Condiciones de cultivo celular (incluyendo el pH, O², CO², velocidad de agitacion y temperatura) adecuado para la produccion celular de los polipeptidos descritos en este documento (por ejemplo, anticuerpos) son los que se conocen en la tecnica, tales como las condiciones de lote, cultivo de celulas continuoo o alimentado por lotes. Por ejemplo, el pH del medio de cultivo celular generalmente se mantiene entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,2.

[0102] En algunos casos, las celulas se cultivaron en una o mas etapas, y las celulas se pueden cultivar en medio que tiene un nivel elevado o reducido de putrescina en una o mas etapas. Por ejemplo, un metodo de cultivo puede incluir una primera etapa (por ejemplo, usando un medio que tiene un nivel reducido de putrescina) y una segunda etapa (por ejemplo, usando un medio que tiene un nivel elevado de putrescina). En algunos casos, un metodo de cultivo puede incluir una primera etapa (por ejemplo, usando un medio que tiene un nivel elevado de putrescina) y una segunda etapa (por ejemplo, usando un medio que tiene un nivel reducido de putrescina). En algunos casos, un metodo de cultivo incluye mas de dos etapas, por ejemplo, 3, 4, 5, 6 o mas etapas, y cualquier etapa puede incluir un medio que tenga un nivel elevado de putrescina o un nivel reducido de putrescina. La duracion del cultivo no es limitante. Por ejemplo, un metodo de cultivo puede ser 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas dfas. En algunos casos, un metodo de cultivo incluye al menos dos etapas. Por ejemplo, una primera etapa puede incluir el cultivo de celulas en un medio que tenga un nivel reducido de putrescina (por ejemplo, durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas dfas) y la segunda etapa puede incluir el cultivo de celulas en un medio que tenga un nivel elevado de putrescina (por ejemplo, durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas dfas).

[0103] En algunos casos, las celulas se cultivan en un medio inicial que tiene un nivel reducido de putrescina durante 5 dfas, y medio que tiene un nivel elevado de putrescina se anade al cultivo de las celulas en el dfa 6.

[0104] En algunos casos, una primera etapa del cultivo es una etapa de crecimiento. Generalmente, durante una etapa de crecimiento, un cultivo celular experimenta un penodo de crecimiento celular exponencial (la fase de registro) donde las celulas generalmente se dividen rapidamente. En algunos casos, las celulas se cultivan en condiciones tales que se maximiza el crecimiento celular. Una persona con experiencia ordinaria en la tecnica puede determinar el ciclo de crecimiento y las condiciones para maximizar el crecimiento de las celulas huesped para una celula huesped particular sin excesiva experimentacion. En algunos casos, las celulas se mantienen en una etapa de crecimiento durante un penodo de entre 1 y 10 dfas. En algunos casos, las celulas se cultivan en un medio que tiene un nivel reducido de putrescina o un nivel elevado de putrescina para toda o parte de una etapa de crecimiento.

[0105] En algunos casos, una segunda etapa del cultivo es una etapa de produccion. Generalmente, durante una etapa de produccion, el crecimiento celular se ha estancado o se mantiene en un nivel casi constante. Durante una etapa de produccion, ha terminado el crecimiento celular logantmico y aumenta la produccion de polipeptidos.

Durante este penodo de tiempo, un medio generalmente puede complementarse para soportar la produccion continuada de polipeptidos y para lograr un producto polipeptfdico deseado. En algunos casos, las celulas se mantienen en una etapa de produccion durante un penodo de entre 1 y 10 dfas. En algunos casos, las celulas se cultivan en un medio que tiene un nivel reducido de putrescina o un nivel elevado de putrescina para toda o parte de una etapa de produccion.

[0106] En general, los metodos de cultivo de celulas se clasifican como cultivo discontinuo, cultivo continuo, y cultivo por lote alimentado. Cualquiera de estos metodos de cultivo se puede usar para cultivar celulas que producen polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) que tienen niveles espedficos de glicanos (por ejemplo, glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados).

[0107] En algunos casos, polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) que tienen niveles diana de glicanos (por ejemplo, glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados) son producidos mediante el cultivo de celulas en medio que contiene una o mas poliaminas. Tales poliaminas incluyen, sin limitacion, putrescina, espermina, espermidina y cadaverina (vease, por ejemplo, Kusano et al., Planta 228: 367 381 (2008)). En algunos casos, las celulas se cultivan en un medio de cultivo que tiene un nivel elevado o un nivel reducido de una o mas poliaminas.

Cultivo de lotes

[0108] En cultivo discontinuo, se anade una pequena cantidad de solucion de cultivo de siembra a un medio y las celulas se cultivan sin adicion de un nuevo medio o la descarga de solucion de cultivo durante el cultivo. Para la produccion de polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) que tienen niveles espedficos de glicanos (p. ej., glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados) utilizando un cultivo discontinuo, el medio comprende un nivel elevado o un nivel reducido de putrescina en una etapa inicial del cultivo celular.

[0109] En algunos casos, los polipeptidos (p. ej., anticuerpos) que tienen niveles espedficos de glicanos (p. ej., glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados) se producen por cultivo discontinuo de celulas que expresan el polipeptido en un medio Nivel elevado de putrescina. En algunos casos, las celulas se cultivan en un medio que tiene al menos 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9,5 mg/L, 10 mg/L de putrescina. En algunos casos, las celulas se cultivan en un medio que tiene al menos aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 1 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2 mg/L, aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 3 mg/L, aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, aproximadamente 4 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 6 mg/L, aproximadamente 6 mg/L a aproximadamente 7 mg/L, aproximadamente 7 mg/L a aproximadamente 8 mg/L, aproximadamente 8 mg/L a aproximadamente 9 mg/L, aproximadamente 9 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, o aproximadamente 0,5 mg/L a aproximadamente 1 mg/L de putrescina.

[0110] En algunos casos, los polipeptidos (p. ej., anticuerpos) que tienen niveles espedficos de glicanos (glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados) se producen por cultivo en lotes de celulas que expresan el polipeptido en un medio que tiene un nivel reducido de putrescina. En algunos casos, las celulas se cultivan en un medio que tiene menos de aproximadamente 10 mg/L, 9,5 mg/L, 9 mg/L, 8,5 mg/L, 8 mg/L, 7,5 mg/L, 7 mg/L, 6,5 mg/L, 6 mg/L, 5,5 mg/L, 5 mg/L, 4,5 mg/L, 4 mg/L, 3,5 mg/L, 3 mg/L, 2,5 mg/L, 2 mg/L, 1,5 mg/L, 1 mg/L, 0,9 mg/L, 0,8 mg/L, 0,7 mg/L, 0,6 mg/L, 0,5 mg/L, 0,4 mg/L, 0,3 mg/L, 0,2 mg/L, 0,1 mg/L, 0,05 mg/L, 0,01 mg/L, o menos de putrescina.

Cultivo continuo

[0111] El cultivo continuo es un metodo de cultivo en el que se anade un medio y descarga de forma continua durante el cultivo. Este metodo continuo incluye el cultivo de perfusion. Por ejemplo, en la produccion de polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) que tienen niveles espedficos de glicanos (por ejemplo, glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados) utilizando un cultivo continuo, se puede ajustar el nivel de putrescina en el medio o mas etapas de cultivo para dar como resultado un nivel elevado o un nivel reducido de putrescina. En ciertos metodos, el medio de cultivo usado en una primera etapa de cultivo no incluye un nivel elevado o un nivel reducido de putrescina, sino en un punto de tiempo particular durante el cultivo continuo (como durante toda o parte de una etapa de crecimiento y/o etapa de produccion), el medio agregado durante el cultivo es elevado o reducido en el nivel de putrescina.

[0112] Los niveles en algunos casos, polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) que tienen niveles diana de glicanos (por ejemplo, glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa, y glicanos sialilados) son producidos por cultivo continuo de celulas que expresan el polipeptido en un medio que tiene un nivel elevado de putrescina (por ejemplo, durante una o mas etapas de cultivo continuo). En algunos casos, las celulas se cultivan, durante una o mas etapas de cultivo continuo, en un medio que tiene al menos aproximadamente 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9.5 mg/L, 10 mg/L de putrescina. En algunos casos, las celulas se cultivan, durante una o mas etapas de cultivo continuo, en un medio que tiene al menos aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 1 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2 mg/L, aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 3 mg/L, aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, aproximadamente 4

mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 6 mg/L, aproximadamente 6 mg/L a aproximadamente 7 mg/L, aproximadamente 7 mg/L a aproximadamente 8 mg/L, aproximadamente 8 mg/L a aproximadamente 9 mg/L, aproximadamente 9 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, o aproximadamente 0,5 mg/L a aproximadamente 1 mg/L de putrescina.

[0113] En algunos casos, las celulas se cultivan, durante una o mas etapas de cultivo continuo, en un medio que tiene un nivel reducido de putrescina. En algunos casos, las celulas se cultivan, durante una o mas etapas de cultivo continuo, en un medio que tiene menos de aproximadamente 10 mg/L, 9,5 mg/L, 9 mg/L, 8,5 mg/L, 8 mg/L, 7,5 mg/L, 7 mg/L, 6,5 mg/L, 6 mg/L, 5,5 mg/L, 5 mg/L, 4,5 mg/L, 4 mg/L, 3,5 mg/L, 3 mg/L, 2,5 mg/L, 2 mg/L, 1,5 mg/L, 1 mg/L, 0,9 mg/L, 0,8 mg/L, 0,7 mg/L, 0,6 mg/L, 0,5 mg/L, 0,4 mg/L, 0,3 mg/L, 0,2 mg/L, 0,1 mg/L, 0,05 mg/L, 0,01 mg/L, o menos de putrescina.

Cultivo de lotes alimentados

[0114] El cultivo discontinuo alimentado es un metodo entre cultivo discontinuo y cultivo continuo. En un cultivo de alimentacion discontinua, un cultivo celular se alimenta o complementa de forma continua o secuencial durante el cultivo, pero a diferencia del cultivo continuo, la descarga de la solucion de cultivo no se lleva a cabo durante el cultivo. Por ejemplo, para la produccion de polipeptidos (p. ej., anticuerpos) que tienen niveles espedficos de glicanos (p. ej., glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados) que utilizan un cultivo alimentado por lotes, el medio agregado durante una o mas etapas del cultivo puede tener un nivel elevado o un nivel reducido de putrescina.

[0115] En algunos casos, los polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) que tienen niveles espedficos de glicanos (por ejemplo, glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados se producen al agregar medio (en una o mas etapas) a un cultivo alimentado por lotes de celulas que expresan el polipeptido suficiente para lograr (en una o mas etapas) un nivel elevado de putrescina. En algunos casos, al menos aproximadamente 0,1 mg/L, 0,2 mg/L, 0,3 mg/L, 0,4 mg/L, 0,5 mg/L, 0,6 mg/L, 0,7 mg/L, 0,8 mg/L, 0,9 mg/L, 1 mg/L, 1.5 mg/L, 2 mg/L, 2,5 mg/L, 3 mg/L, 3,5 mg/L, 4 mg/L, 4,5 mg/L, 5 mg/L, 5,5 mg/L, 6 mg/L, 6,5 mg/L, 7 mg/L, 7,5 mg/L, 8 mg/L, 8,5 mg/L, 9 mg/L, 9,5 mg/L, 10 mg/L de putrescina en el cultivo el medio se logra (por ejemplo, agregando o complementando con putrescina, por ejemplo, en una o mas etapas). En algunos casos, se alcanza un nivel de putrescina de al menos aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 1 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2 mg/L, aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 3 mg/L, aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, aproximadamente 4 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 6 mg/L, aproximadamente 6 mg/L a aproximadamente 7 mg/L, aproximadamente 7 mg/L a aproximadamente 8 mg/L, aproximadamente 8 mg/L a aproximadamente 9 mg/L, aproximadamente 9 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, o aproximadamente 0,5 mg/L a aproximadamente 1 mg/L.

[0116] En algunos casos, los polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) que tienen niveles espedficos de glicanos (por ejemplo, glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados) se producen mediante la adicion de medio (en una o mas etapas) a una cultivo de alimentacion discontinua de celulas que expresan el polipeptido suficiente para lograr (en una o mas etapas) un nivel reducido de putrescina. En algunos casos, se alcanza menos de aproximadamente 10 mg/L, 9,5 mg/L, 9 mg/L, 8,5 mg/L, 8 mg/L, 7,5 mg/L, 7 mg/L, 6,5 mg/L, 6 mg/L, 5,5 mg/L, 5 mg/L, 4,5 mg/L, 4 mg/L, 3,5 mg/L, 3 mg/L, 2,5 mg/L, 2 mg/L, 1,5 mg/L, 1 mg/L, 0,9 mg/L, 0,8 mg/L, 0,7 mg/L, 0,6 mg/L, 0,5 mg/L, 0,4 mg/L, 0,3 mg/L, 0,2 mg/L, 0,1 mg/L, 0,05 mg/L, 0,01 mg/L, o menos de putrescina en el medio de cultivo (en una o mas etapas).

[0117] De acuerdo con la presente descripcion, el cultivo de celulas puede llevarse a cabo en condiciones para la produccion a gran o pequena escala de polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos), utilizando recipientes de cultivo y/o aparatos de cultivo que se emplean convencionalmente para el cultivo de celulas de mairnfero o animal. Por ejemplo, placas de cultivo de tejidos, matraces T, matraces de agitacion y matraces giratorios se pueden usar a escala de laboratorio. Para el cultivo a gran escala (por ejemplo, 1 L, 10 L, 100 L, 500 L, 5000 L o mas), se puede usar un biorreactor de lecho fluidizado, un biorreactor de fibra hueca, un cultivo en botella con rodillo o un sistema de biorreactor de tanque agitado (por ejemplo, como se describe en las patentes de EE.UU. nos 7.541.164 y 7.332.303).

[0118] En metodos particulares, los niveles de uno o mas glicanos (glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados) en una preparacion de polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) se monitorean durante una o mas veces (por ejemplo, una o mas etapas) del cultivo celular, lo que permite el ajuste (por ejemplo, aumentar o disminuir la cantidad de putrescina en el cultivo) o posiblemente la terminacion del cultivo, por ejemplo, para lograr un nivel objetivo de polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) que tengan niveles diana de glicanos (p. ej., glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados).

Polipeptidos

[0119] En el presente documento se describen preparaciones terapeuticas de polipeptidos (p. ej., glicoprotemas) y metodos para preparar y utilizar dichas preparaciones. Las glicoprotemas incluyen, por ejemplo, cualquiera de una variedad de agentes hematologicos (incluidos, por ejemplo, eritropoyetina, factores de coagulacion sangumea, etc.), interferones, factores estimulantes de colonias, anticuerpos, enzimas y hormonas. La identidad de una glicoprotema particular no pretende limitar la presente divulgacion, y una preparacion terapeutica descrita en el presente documento puede incluir cualquier glicoprotema de interes, por ejemplo, una glicoprotema que tenga una region Fc.

[0120] Una glicoprotema descrita en este documento puede incluir un dominio de union diana que se une a una diana de interes (por ejemplo, se une a un antigeno). Por ejemplo, una glicoprotema, como un anticuerpo, puede unirse a un polipeptido transmembrana (por ejemplo, receptor) o ligando (por ejemplo, un factor de crecimiento). Las dianas moleculares ejemplares (por ejemplo, antfgenos) para las glicoprotemas descritas en este documento (por ejemplo, anticuerpos) incluyen protemas CD tales como CD2, CD3, ^cD4, CD8, CD11, CD19, CD20, CD22, CD25, CD33, CD34, CD40, CD52; miembros de la familia de receptores ErbB tales como el receptor EGF (EGFR, HER1, ErbBI), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) o receptor HER4 (ErbB4); receptores de macrofagos tales como CRIg; factores de necrosis tumoral tales como TNFa o TRAIL/Apo-2; moleculas de adhesion celular tales como LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM y la integrina avp3, incluidas las subunidades a o p de las mismas (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11a, anti-CDl8 o anti CD1lb); factores de crecimiento y receptores tales como eGf , FGFR (por ejemplo, FGFR3) y VEGF; IgE; citocinas tales como IL1; receptores de citoquinas tales como el receptor de IL2; antfgenos del grupo sangumeo; receptor flk2/flt3; receptor de la obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; protema C; neutropilinas; efrinas y receptores; netrinas y receptores; hendidura y receptores; quimiocinas y receptores de quimiocinas tales como CCL5, CCR4, CCR5; beta amiloide; factores del complemento, como el factor D del complemento; lipoprotemas, tales como LDL oxidadas (oxLDL); las linfotoxinas, como la linfotoxina alfa (LTa). Otras moleculares dianas incluyen Tweak, B7RP-1, convertasa de proprotema subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), esclerostina, c-kit, Tie-2, c-fms y anti-M1.

Polipeptidos de referenda

[0121] En algunos casos, se describe en el presente documento un polipeptido terapeutico (por ejemplo, glicoprotema) despues de haber dirigido niveles de glicanos (por ejemplo, glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados), donde los niveles previstos son los niveles de glicanos (por ejemplo, glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados) en un producto polipeptfdico de referencia (p. ej., producto de glicoprotema). Los productos de glicoprotemas de referencia, no limitativos, pueden incluir abatacept (Orencia®, Bristol-Myers Squibb), abciximab (ReoPro®, Roche), adalimumab (Humira®, Bristol-Myers Squibb), aflibercept (Eylea®, Regeneron Pharmaceuticals), alefacept (Amevive®, Astellas Pharma), alemtuzumab (Campath®, Genzyme/Bayer), basiliximab (Simulect®, Novartis), belatacept (Nulojix®, Bristol-Myers Squibb), belimumab (Benlysta®, GlaxoSmithKline), bevacizumab (Avastinine) Roche), canakinumab (Ilaris®, Novartis), brentuximab vedotin (Adcetris®, Seattle Genetics), certolizumab (CIMZIA®, UCB, Bruselas, Belgica), cetuximab (Erbitux®, Merck-Serono), daclizumab (Zenapax®, Hoffmann-La Roche), denileukin diftitox (Ontak®, Eisai), denosumab (Prolia®, Amgen; Xgeva®, Amgen), eculizumab (Soliris®, Alexion Pharmaceuticals), efalizumab (Raptiva®, Genentech), etanercept (Enbrel®, Amgen-Pfizer), gemtuzumab (Mylotarg®, Pfizer), golimumab (Simponi®, Janssen), ibritumomab (Zevalin®, Spectrum Pharmaceuticals), infliximab (Remicade®, Centocor), ipilimumab (YervoyTM, Bristol-Myers Squibb), muromonab (Orthoclone OKT3®, Janssen-Cilag), natalizumab (Tysabri®, Biogen Idec, Elan), ofatumumab (Arzerra®, GlaxoSmithKline, omalizumab (Xolair®, Novartis), palivizumab (Synagis®, MedImmune), panitumumab (Vectibix®, Amgen), ranibizumab (Lucentis®, Genentech), rilonacept (Arcalyst®, Regeneron Pharmaceuticals), rituximab, Mabtera tocilizumab (Actemra®, Genentech; RoActemra, Hoffman-La Roche) tositumomab (Bexxar®, GlaxoSmithKline) y trastuzumab (Herceptin®, Roche).

[0122] En algunos casos, un nivel de uno o mas glicanos (p. ej., glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados) en un producto polipeptfdico de referencia se determina analizando una o mas preparaciones (por ejemplo, uno o mas lotes) del polipeptido de referencia. En algunos casos, un nivel de uno o mas glicanos (p. ej., glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados) en un producto de polipeptidos de referencia es un rango de uno o mas glicanos en dos o mas preparaciones de el polipeptido de referencia (por ejemplo, dos o mas lotes del producto polipeptfdico de referencia). En algunos casos, un nivel de uno o mas glicanos es un rango (por ejemplo, que abarca un nivel mas bajo de uno o mas glicanos hasta un nivel mas alto de uno o mas glicanos) en dos o mas lotes del producto polipeptfdico de referencia.

Glicosilacion N-Vinculada

[0123] Las cadenas de oligosacaridos N-ligados se agregan a una protema en el lumen del retfculo endoplasmico (vease Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc. (Alberts y otros, 1994)). Espedficamente, se agrega un oligosacarido inicial (tfpicamente 14-azucar) al grupo amino en la cadena lateral de un residuo de asparagina contenido dentro de la secuencia de consenso diana de Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoacido excepto prolina. La estructura de este oligosacarido inicial es comun a la mayona de los eucariotas y contiene 3 residuos de glucosa, 9 manosa y 2 N-acetilglucosamina. Esta cadena de oligosacaridos inicial puede recortarse mediante enzimas glicosidasas espedficas en el retfculo endoplasmico, lo que da como resultado un oligosacarido de nucleo ramificado corto compuesto por dos residuos de N-acetilglucosamina y tres de manosa.

[0124] Los N-glicanos pueden subdividirse en tres grupos distintos denominados "tipo de manosa alta", "tipo dbrido" y "tipo complejo", con un nucleo de pentasacarido comun (Man(alfa1,6)-(Man(alfa1,3))-Man(beta1,4)-GlcpNAc(beta 1,4)-Glcp-NAc(beta 1, N)-Asn) en los tres grupos.

[0125] Despues del procesamiento inicial en el retfculo endoplasmatico, la glicoprotema se transporta al Golgi, donde un procesamiento adicional puede tener lugar. Si el glicano se transfiere al Golgi antes de recortarlo completamente a la estructura del pentasacarido central, se obtiene un "glicano con alto contenido de manosa".

[0126] Adicional o alternativamente, se pueden agregar una o mas unidades de monosacaridos de N-acetilglucosamina a las subunidades de manosa central para formar un "glicano complejo". La galactosa se puede agregar a las subunidades de N-acetilglucosamina, y las subunidades de acido sialico se pueden agregar a las subunidades de galactosa, dando como resultado cadenas que terminan con cualquiera de un acido sialico, una galactosa o un residuo de N-acetilglucosamina. Ademas, se puede agregar un residuo de fucosa a un residuo de N-acetilglucosamina del oligosacarido central. Cada una de estas adiciones esta catalizada por transferasas de glucosilo espedficas, conocidas en la tecnica. Los acidos sialicos son una familia de monosacaridos de 9 carbonos con estructuras de anillo heterodclico. Llevan una carga negativa a traves de un grupo de acido carboxflico unido al anillo, asf como otras decoraciones qmmicas, incluidos los grupos N-acetilo y N-glicolilo. Los dos tipos principales de residuos de sialilo encontrados en las glicoprotemas producidas en los sistemas de expresion de marnfferos son el acido N-acetilneurairnnico (NeuAc) y el acido N-glicolilneurairnnico (NeuGc). Estos ocurren generalmente como estructuras terminales unidas a residuos de galactosa (Gal) en los extremos no reductores de los glicanos unidos por N y O. La configuracion de enlace glicosfdico para estos grupos sialilo puede ser a2,3 o a2,6.

[0128] "Glicanos dbridos" comprenden caractensticas tanto de glicanos complejos como de alto contenido en manosa. Por ejemplo, una rama de un glicano dbrido puede comprender principalmente o exclusivamente residuos de manosa, mientras que otra rama puede comprender azucares N-acetilglucosamina, acido sialico y/o galactosa. Glicosilacion N-ligada en anticuerpos

[0129] Los anticuerpos son glicosiladas en sitios de glicosilacion N-ligados conservados en las regiones Fc de cadenas pesadas de inmunoglobulina. Por ejemplo, cada cadena pesada de un anticuerpo IgG tiene un solo sitio de glicosilacion unido a N en Asn297 del dominio CH2 (vease Jefferis, Nature Reviews 8: 226-234 (2009)). Los anticuerpos IgA tienen sitios de glicosilacion N-ligados dentro de los dominios CH2 y CH3, los anticuerpos IgE tienen sitios de glicosilacion N-ligados dentro del dominio CH3 y los anticuerpos IgM tienen sitios de glicosilacion N-ligados dentro de los dominios CH1, CH2, CH3 y CH4 (vease Arnold et al., J. Biol. Chem. 280: 29080-29087 (2005); Mattu et al., J. Biol. Chem. 273: 2260-2272 (1998); Nettleton et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 107: 328-329 (1995)).

[0130] Cada isotipo de anticuerpo tiene una variedad distinta de estructuras de carbohidratos N-ligados en las regiones constantes. Por ejemplo, la IgG tiene un solo carbohidrato biantenario N-ligado en Asn297 del dominio CH2 en cada polipeptido Fc de la region Fc, que tambien contiene los sitios de union para C1q y F^cyR (vease Jefferis et al., Immunol. Rev 163: 59-76 (1998) y Wright et al., Trends Biotech 15: 26-32 (1997)). Para la IgG humana, el oligosacarido central normalmente consiste en GlcNAc²Man³GlcNAc, con diferentes numeros de residuos externos. La variacion entre las IgG individuales puede ocurrir mediante la union de galactosa y/o galactosa-acido sialico en una o ambas GlcNAc terminales o mediante la union de un tercer brazo de GlcNAc (biseccion de GlcNAc), y/o la union de fucosa.

Anticuerpos

[0131] La estructura basica de un anticuerpo IgG se ilustra en la Figura 1. Como se muestra en la Figura 1, un anticuerpo IgG consiste en dos cadenas polipeptfdicas ligeras identicas y dos cadenas polipeptfdicas pesadas identicas unidas entre sf por enlaces disulfuro. El primer dominio ubicado en el extremo amino de cada cadena es variable en la secuencia de aminoacidos, proporcionando especificidades de union al anticuerpo encontradas en cada anticuerpo individual. Estas se conocen como regiones variables pesadas (VH) y variables ligeras (VL). Los otros dominios de cada cadena son relativamente invariantes en la secuencia de aminoacidos y se conocen como regiones constantes pesadas (CH) y constantes ligeras (CL). Como se muestra en la Figura 1, para un anticuerpo IgG, la cadena ligera incluye una region variable (VL) y una region constante (CL). Una cadena pesada de IgG incluye una region variable (VH), una primera region constante (CH1), una region bisagra, una segunda region constante (CH2) y una tercera region constante (CH3). En los anticuerpos IgE e IgM, la cadena pesada incluye una region constante adicional (CH4).

[0132] Los anticuerpos descritos en este documento pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales (por ejemplo, IVIG), anticuerpos multiespedficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quimericos, Fv de cadena simple (scFv), Fv unido a disulfuro (sdFv), y anticuerpos antiidiotfpicos (anti-id), y fragmentos de union a antigeno de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.

[0133] El termino "fragmento Fc", como se usa aqm, se refiere a uno o mas fragmentos de una region Fc que retiene una funcion de Fc y/o actividad descritos en el presente documento, tales como la union a un receptor Fc. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen fragmentos que incluyen un sitio de glicosilacion unido a N de una region Fc (por ejemplo, un Asn297 de una cadena pesada de IgG o sitios homologos de otros isotipos de anticuerpos), tal como un dominio CH2. El termino "fragmento de union a antigeno" de un anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse espedficamente a un antigeno. Los ejemplos de fragmentos de union abarcados dentro del termino "fragmento de union a antfgeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento F(ab')², un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento scFv, un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), y una region determinante de complementariedad aislada (CDR). Estos fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse utilizando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y los fragmentos pueden seleccionarse para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

[0134] Glicoprotemas de referencia descritas en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos de referencia) o fragmentos de los mismos pueden ser producidos por cualquier metodo conocido en la tecnica para la smtesis de glicoprotemas (por ejemplo, anticuerpos) (vease, por ejemplo, Harlow et al, Antibodies:. A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182: 41-50; WO 92/22324; WO 98/46645). Los anticuerpos quimericos se pueden producir utilizando los metodos descritos en, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229: 1202, y los anticuerpos humanizados mediante los metodos descritos en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 6.180.370.

[0135] Los anticuerpos de referencia adicionales que se describen en el presente documento son anticuerpos biespedficos y anticuerpos multivalentes, como se describe en, por ejemplo, Segal et al., J. Immunol. Methods 248: 1-6 (2001); y Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Conjugados de glicoprotemas

[0136] La divulgacion incluye glicoprotemas (o regiones Fc o fragmentos Fc que contienen uno o mas sitios de N-glicosilacion de los mismos) que se conjuga o fusiona a uno o mas restos heterologos. Los restos heterologos incluyen, pero no se limitan a, peptidos, polipeptidos, protemas, protemas de fusion, moleculas de acido nucleico, moleculas pequenas, agentes mimeticos, farmacos sinteticos, moleculas inorganicas y moleculas organicas. En algunos casos, un conjugado de glicoprotema es una protema de fusion que comprende un peptido, polipeptido, armazon proteico, scFv, dsFv, diacuerpo, Tandab o un anticuerpo mimetico fusionado a una region Fc, como una region Fc glicosilada. Una protema de fusion puede incluir una region enlazadora que conecta una region Fc a un resto heterologo (vease, por ejemplo, Hallewell y otros (1989), J. Biol. Chem. 264, 5260-5268; Alfthan y otros (1995), Protein Eng. 8, 725-731; Robinson & Sauer (1996)).

[0137] Entre los productos conjugados de glucoprotema de referencia no limitativos, se incluyen abatacept (Orencia®, Bristol-Myers Squibb), aflibercept (Eylea®, Regeneron Pharmaceuticals), alefacept (Amevive®, Astellas Pharma), belatacept (Nulo-jix®, Bristol-Myers Squibb), denileukin diftitox (Ontak®, Eisai), etanercept (Enbrel®, Amgen-Pfizer) y rilonacept (Arcalyst®, Regeneron Pharmaceuticals).

[0138] En algunos casos, un conjugado de glicoprotema incluye una region Fc (o un fragmento Fc que contiene uno o mas sitios de N-glicosilaciones del mismo) conjugada con un polipeptido heterologo de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoacidos.

[0139] En algunos casos, un conjugado de glucoprotema incluye una region Fc (o un fragmento Fc que contiene uno o mas sitios de N-glicosilacion de los mismos) conjugada con una o mas secuencias marcadoras, tales como un peptido para facilitar la purificacion. Una secuencia de aminoacidos marcadora particular es un peptido hexahistidina, como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, California, 91311). Otras etiquetas peptfdicas utiles para la purificacion incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta "HA" de hemaglutinina, que corresponde a un epftopo derivado de la protema de la hemaglutinina de la influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37: 767) y la etiqueta de "Bandera".

[0140] En otros casos, un conjugado de glucoprotema incluye una region Fc (o un fragmento Fc que contiene uno o mas sitios de N-glicosilacion de los mismos) conjugados con un agente de diagnostico o detectable. Dichas protemas de fusion pueden ser utiles para monitorear o pronosticar el desarrollo o la progresion de una enfermedad o trastorno como parte de un procedimiento de prueba cffnica, como la determinacion de la eficacia de una terapia particular. Dicho diagnostico y deteccion se puede realizar mediante el acoplamiento de una glicoprotema a sustancias detectables que incluyen, entre otras, diversas enzimas, como la peroxidasa de rabano picante, la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; grupos protesicos, tales como, pero sin limitacion, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no limitados a, umbeliferona, fluorescema, isotiocinato de fluorescema, rodamina, diclorotriazinilamina fluorescema, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero sin limitarse a, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero sin limitacion, luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radioactivos, como pero no limitado a yodo (131I, 125I, 123I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, 111In), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenon (133Xe), fluor (18F), 153Sm, 177Lu, 153Gd, 159Gd, 149Pm, 140La, 169Yb, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Sn; metales emisores de positrones que utilizan diversas tomograffas de emision de positrones, iones metalicos paramagneticos no radiactivos y moleculas que estan radiomarcadas o conjugadas con radioisotopos espedficos.

[0141] Las tecnicas para conjugar restos terapeuticos con anticuerpos son bien conocidas (vease, por ejemplo, Arnon et al., "Mono- clonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al..), pp. 243-56. (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies for Drug Delivery", en Control Drogas Drug Delivery (2a ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)).

Evaluacion de Glicano

[0142] En algunos casos, los glicanos de las glicoprotemas se analizan mediante cualquier metodo adecuado disponible. En algunos casos, la estructura y la composicion del glicano como se describe en el presente documento se analizan, por ejemplo, mediante uno o mas metodos enzimatico, cromatografico, cromatografico, de espectrometna de masas (MS), cromatografico seguido de MS, metodos electroforeticos, metodos electroforeticos seguidos de MS, metodos de resonancia magnetica nuclear (RMN), y combinaciones de los mismos. Los metodos enzimaticos ejemplares incluyen la puesta en contacto de una preparacion de glicoprotema con una o mas enzimas en condiciones y durante un tiempo suficiente para liberar uno o mas glicanos (por ejemplo, uno o mas glicanos expuestos). En algunos casos, la una o mas enzimas incluyen(s) PNGasa F. Los metodos cromatograficos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cromatograffa de intercambio anionico fuerte que utiliza deteccion amperometrica pulsada (SAX-PAD), cromatograffa ffquida (LC), cromatograffa ffquida de alto rendimiento (HPLC), cromatograffa ffquida de rendimiento ultra (UPLC), cromatograffa en capa fina (TLC), cromatograffa en columna de amida y combinaciones de las mismas. La espectrometna de masas (MS) ejemplar incluye, pero no se limita a, MS en tandem, LC-MS, LC-MS/MS, espectrometna de masas de ionizacion por desorcion laser asistida por matriz (MALDI-MS), espectrometna de masas transformada de Fourier (FTMS), separacion de movilidad de iones con espectrometna de masas (IMS-MS), disociacion de transferencia de electrones (ETD-MS) y combinaciones de los mismos. Los metodos electroforeticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, electroforesis capilar (CE), CE-MS, electroforesis en gel, electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de acrilamida, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de transferencia de Western utilizando anticuerpos que reconocen estructuras espedficas de glicanos, y combinaciones de los mismos. La resonancia magnetica nuclear (RMN) ejemplar incluye, pero no se limita a, RMN unidimensional (1D-RMN), RMN bidimensional (2D-RMN), espectroscopfa de correlacion de angulo magnetico RMN (COSY-RMN), espectroscopfa de correlacion total RMN (^tO^cSY-RMN), RMN heterogenea de coherencia cuantica monoconuclear (HSQC-RMN), coherencia cuantica multiple heteronuclear (HMQC-RMN), espectroscopia de efecto de sobrecarga nuclear RMN (ROESY-RMN), espectroscopia de efecto de sobrecarga nuclear (NOESY-RMN), y combinaciones de los mismos.

[0143] En algunos casos, las tecnicas descritas en el presente documento pueden combinarse con una o mas otras tecnologfas para la deteccion, analisis, y/o el aislamiento de glicanos o glicoprotemas. Por ejemplo, en ciertos casos, los glicanos se analizan de acuerdo con la presente divulgacion utilizando uno o mas metodos disponibles (para dar solo algunos ejemplos, vease Anumula, Anal. Biochem., 350 (1): 1, 2006; Klein y otros, Anal. Biochem., 179: 162, 1989; y/o Townsend, RR Carbohydrate Analysis" High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis., Ed. Z. El Rassi, pp 181-209, 1995; WO2008/128216; WO2008/128220; WO2008/128218; WO2008/130926; W02008/130926/W02008/130926 128225; WO2008/130924; WO2008/128221; WO2008/128228; WO2008/128227; WO2008/128230; WO2008/128219; WO2008/128222; WO2010/071817; WO2010/071824; WO2010/085251; WO2011/069056; por ejemplo, en algunos casos, los glicanos se caracterizan utilizando uno o mas de los metodos cromatograficos, metodos electroforeticos, metodos de resonancia magnetica nuclear y combinaciones de los mismos. En algunos casos, los glicanos se analizan marcando con un tinte fluorescente y midiendo los niveles de fluorescencia.

[0144] En algunos casos, los metodos para evaluar uno o mas parametros espedficos de la protema diana, por ejemplo, en una preparacion de glicoprotema, por ejemplo, uno o mas de los parametros descritos en el presente documento, puede ser realizada por uno o mas de los metodos enumerados en la Tabla 1.

Tabla 1: Metodos ejemplares de evaluacion de parametros:

[0145] La literatura indicada anteriormente puede pertenecer a uno o mas de los metodos para determinar un parametro descrito en este documento.

Composiciones farmaceuticas y administracion

[0146] Una glicoprotema descrita en este documento puede ser incorporada (por ejemplo, formulada) en una composicion farmaceutica. Dicha composicion farmaceutica es util como una composicion alternativa y/o mejorada para la prevencion y/o el tratamiento de una o mas enfermedades en relacion con una glucoprotema de referencia correspondiente. Las composiciones farmaceuticas que comprenden una glicoprotema se pueden formular mediante metodos conocidos por los expertos en la tecnica. La composicion farmaceutica se puede administrar por via parenteral en forma de una formulacion inyectable que comprende una solucion o suspension esteril en agua u otro ifquido farmaceuticamente aceptable. Por ejemplo, la composicion farmaceutica puede formularse combinando adecuadamente la glicoprotema con veldculos o medios farmaceuticamente aceptables, como agua esteril y solucion salina fisiologica, aceite vegetal, emulsionante, agente de suspension, surfactante, estabilizante, excipiente saborizante, diluyente, vedculo, conservante, aglutinante, seguido de la mezcla en una forma de dosis unitaria requerida para las practicas farmaceuticas generalmente aceptadas. La cantidad de ingrediente activo incluido en las preparaciones farmaceuticas es tal que se proporciona una dosis adecuada dentro del rango designado.

[0147] Una composicion esteril para inyeccion puede ser formulada de acuerdo con las practicas farmaceuticas convencionales utilizando agua destilada para inyeccion como vedculo. Por ejemplo, se puede usar una solucion salina fisiologica o una solucion isotonica que contenga glucosa y otros suplementos como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio como solucion acuosa para inyeccion, opcionalmente en combinacion con un agente solubilizante adecuado. Por ejemplo, alcohol tal como etanol y polialcohol tal como propilenglicol o polietilenglicol, y un tensioactivo no ionico tal como polisorbato 80TM, HCO-50 y similares.

[0148] Los ejemplos no limitativos de lfquido aceitoso incluyen aceite de sesamo y aceite de soja, y se pueden combinar con benzoato de bencilo o alcohol bendlico como agente solubilizante. Otros elementos que pueden incluirse son un tampon como un tampon de fosfato o un tampon de acetato de sodio, un agente calmante como el clorhidrato de procama, un estabilizante como alcohol bendlico o fenol y un antioxidante. Una inyeccion formulada puede envasarse en una ampolla adecuada.

[0149] En algunos casos, un nivel de uno o mas glicanos descritos en este documento puede ser comparado con un nivel predeterminado (por ejemplo, un nivel correspondiente en un patron de referencia), por ejemplo, para tomar una decision con respecto a la composicion de la preparacion de polipeptido, por ejemplo,, la decision de clasificar, seleccionar, aceptar o descartar, liberar o retener, procesar un producto farmaceutico, enviar, mudarse a una ubicacion diferente, formular, etiquetar, empaquetar, liberar para el comercio u vender u ofrecer para la venta el polipeptido, por ejemplo, un anticuerpo recombinante. En otros casos, la decision puede ser aceptar, modificar o rechazar un parametro o parametros de produccion utilizados para hacer el polipeptido, por ejemplo, un anticuerpo. Los ejemplos particulares, no limitativos, de estandares de referencia incluyen un nivel de control (por ejemplo, un polipeptido producido por un metodo diferente) o un rango o valor en una especificacion del producto (por ejemplo, una etiqueta de la FDA o un folleto del medico) o un criterio de calidad para una preparacion farmaceutica que contiene la preparacion de polipeptidos.

[0150] En algunos casos, metodos (es decir, evaluacion, identificacion y produccion) incluyen la toma de accion (por ejemplo, la accion ffsica) en respuesta a los metodos descritos en este documento. Por ejemplo, una preparacion de polipeptidos se clasifica, selecciona, acepta o desecha, libera o retiene, transformandose en un producto farmaceutico, se envfa, se traslada a una ubicacion diferente, se formula, se etiqueta, se empaqueta, se libera para el comercio o se vende o se ofrece para la venta, dependiendo de si se cumple el valor preseleccionado o el valor diana. En algunos casos, el procesamiento puede incluir la formulacion (p. ej., combinar con excipientes farmaceuticos), envasar (p. ej., en una jeringa o vial), etiquetar o enviar al menos una porcion de la preparacion del polipeptido. En algunos casos, el procesamiento incluye la formulacion (por ejemplo, la combinacion con excipientes farmaceuticos), el empaque (por ejemplo, en una jeringa o vial) y el etiquetado de al menos una porcion de la preparacion como un producto farmaceutico descrito en este documento. El procesamiento puede incluir dirigir y/o contratar a otra parte para que procese como se describe en este documento.

[0151] En algunos casos, se evalua una actividad biologica de una preparacion de polipeptido (por ejemplo, una preparacion de anticuerpos). La actividad biologica de la preparacion se puede analizar mediante cualquier metodo conocido. En algunos casos, se evalua la actividad de union de un polipeptido (por ejemplo, la union a un receptor). En algunos casos, se evalua la actividad terapeutica de un polipeptido (p. ej., una actividad de un polipeptido para disminuir la gravedad o los smtomas de una enfermedad o afeccion, o para retrasar la aparicion de un smtoma de una enfermedad o afeccion). En algunos casos, se evalua la actividad farmacologica de un polipeptido (p. ej., biodisponibilidad, farmacocinetica, farmacodinamia). Para los metodos de analisis de la biodisponibilidad, la farmacocinetica y la farmacodinamica de los agentes terapeuticos de las glucoprotemas, vease, por ejemplo, Weiner et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 15 (5): 571-9, 1997; Srinivas et al., J. Pharm. Sci. 85 (1): 1-4, 1996; y Srinivas et al., Pharm. Res. 14 (7): 911-6, 1997.

[0152] La actividad biologica particular o actividad terapeutica que puede ser probada variara dependiendo del polipeptido particular (por ejemplo, anticuerpo). La actividad adversa potencial o la toxicidad (p. ej., la propension a causar hipertension, reacciones alergicas, eventos tromboticos, convulsiones u otros eventos adversos) de las preparaciones de polipeptidos se pueden analizar mediante cualquier metodo disponible. En algunos casos, se evalua la inmunogenicidad de una preparacion de polipeptidos, por ejemplo, determinando si la preparacion provoca una respuesta de anticuerpos en un sujeto.

[0151] La ruta de administracion puede ser parenteral, por ejemplo, administracion por inyeccion, administracion transnasal, administracion transpulmonar o administracion transcutanea. La administracion puede ser sistemica o local mediante inyeccion intravenosa, inyeccion intramuscular, inyeccion intraperitoneal, inyeccion subcutanea.

[0154] Un medio de administracion adecuado puede seleccionarse en base a la edad y condicion del paciente. Una dosis unica de la composicion farmaceutica que contiene una glicoprotema modificada se puede seleccionar de un rango de 0,001 a 1.000 mg/kg de peso corporal. Por otro lado, se puede seleccionar una dosis en el intervalo de 0,001 a 100.000 mg/peso corporal, pero la presente descripcion no se limita a tales intervalos. La dosis y el metodo de administracion vanan segun el peso, la edad, el estado y similares del paciente, y los expertos en la tecnica pueden seleccionarlos adecuadamente segun sea necesario.

[0155] Los materiales, metodos, y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes. A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenece esta descripcion. Aunque los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la practica o prueba de la presente divulgacion, metodos y materiales adecuados se describen en el presente documento.

[0156] La divulgacion se ilustra adicionalmente mediante el siguiente ejemplo. El ejemplo se proporciona unicamente con fines ilustrativos. No debe interpretarse como limitador del alcance o el contenido de la divulgacion de ninguna manera.

EJEMPLO:

Efecto de la putrescina sobre la glicosilacion.

[0157] Se analizo el efecto de putrescina en glicoformas de anticuerpos de un anticuerpo modelo producido por celulas CHO. Las celulas CHO modificadas por ingeniena genetica para expresar el anticuerpo se cultivaron inicialmente en medios basicos (Power CHO2, numero de catalogo BE15-771, Lonza Inc., Allendale, NJ). A continuacion, las celulas se inocularon (a 0,55 x 106 celulas/mL) en un medio definido qmmicamente que contema 0,17 mg/L, 0,35 mg/L, o 0,52 g/L de putrescina 2HCl y se cultivaron como cultivo discontinuo en tubos de TPP durante 7 dfas.

[0158] La viabilidad celular se evaluo en el dfa 4 usando un hemocitometro usando celulas tenidas con azul de tripano. El tftulo se determino a partir de los cultivos del dfa 7 por HPLC de afinidad con protema A. La cuantificacion relativa de cada glicoforma se realizo en una protema purificada utilizando Chip ToF. Chip ToF usa espectrometna de masas para medir el area del cromatograma de iones extrafdo (XIC) para cada especie despues de la eliminacion enzimatica basada en chips y la purificacion de N-glicanos, en relacion con el XIC total para las especies detectadas (vease, por ejemplo, el kit de chips mAb-Glyco, Agilent Technologies).

Resultados

[0159] El crecimiento celular y el tftulo mostraron una respuesta a la dosis sobre 0,17 mg/L, 0,35 mg/L, y 0,52 mg/L de putrescina. Los tttulos de productos de 40 mg/L, 58 mg/L y 73 mg/L se midieron a partir de celulas cultivadas en un medio con 0,17 mg/L, 0,35 mg/L y 0,52 mg/L de putrescina, respectivamente. En el dfa 4, las celulas cultivadas en 0,17 mg/L de putrescina teman una densidad celular viable (VCD) de 1,5 x 106 celulas/mL; las celulas cultivadas en 0,35 mg/L de putrescina teman un VCD de 1,8 x 106 celulas/mL; y las celulas cultivadas en 0,52 mg/L de putrescina teman un VCD de 2,2 x 106 celulas/mL.

[0160] Como se muestra en la Figura 2, la fraccion de glicanos fucosilados aumento con el aumento de los niveles de putrescina. La relacion fue no lineal, lo que sugiere una saturacion para este efecto por encima de 0,35 mg/mL. La putrescina tambien altero la distribucion de las principales especies fucosiladas, lo que llevo a niveles reducidos de G0F y niveles aumentados de G1F y G2F (vease Figura 3). El aumento de putrescina tambien dio como resultado un aumento en el nivel de galactosilacion. Como se muestra en la Figura 3, el cambio relativo en G0F, G1F y G2F fue de alrededor del 10% cuando se compararon 0,52 mg/L de putrescina con 0,17 mg/L de putrescina. El aumento sumado en G1F y G2F fue mayor que la disminucion en G0F, lo que resulto en un aumento general en el grupo fucosilado (suma de las tres especies principales).

[0162] Los efectos que tuvo la putrescina en glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados se representan en la Figura 4. Los glicanos de alto contenido de manosa se redujeron con niveles crecientes de putrescina, mientras que se aumento el nivel de glicanos sialilados.

[0163] El hallazgo de que se redujeron los glicanos de alto contenido de manosa, mientras que los niveles de glicanos sialilados, glicanos fucosilados, y glicanos galactosilados se incrementaron, sugiere que la putrescina puede ayudar a promover la maduracion de los glicanos.

[0164] Este Ejemplo demuestra que el cultivo de celulas en putrescina se puede usar para producir polipeptidos expresados por las celulas que tienen niveles particulares de glicanos, tales como glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para producir una preparacion de protema recombinante que tiene un valor diana de uno o mas de los glicanos fucosilados, Ggicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados, comprendiendo el metodo:

(a) proporcionar una celula geneticamente disenada para expresar una protema recombinante;

(b) cultivar la celula en un medio de cultivo que comprende 0,1 mg/L a 10 mg/L de putrescina y, opcionalmente, que comprende ademas uno o mas de lisina, amonio, DMSO, cobre, glucosa, un factor de crecimiento, una vitamina, un lfpido y una peptona, en condiciones en las que la celula expresa la protema recombinante; y (c) recoger una preparacion de la protema recombinante producida por la celula que cumpla con un valor diana, en relacion con los glicanos totales, de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados, en donde

(i) el valor diana de los glicanos galactosilados y/o los glicanos sialilados es un nivel al menos un 10% mas alto que el nivel, en relacion con los glicanos totales, de los glicanos galactosilados y/o los glicanos sialilados en una preparacion de la protema recombinante producida mediante el cultivo de la celula en el medio que no comprende 0,1 mg/L a 10 mg/L de putrescina;

(ii) el valor diana de los glicanos con alto contenido de manosa es un nivel al menos 10% mas bajo que un nivel, en relacion con los glicanos totales con alto contenido de manosa en una preparacion de la protema recombinante producida mediante el cultivo de la celula en un medio que no comprende 0,1 mg/L a 10 mg/L de putrescina;

(iii) el valor diana de los glicanos fucosilados es de 70% a 100% de glicanos fucosilados;

(iv) el valor diana de los glicanos galactosilados es del 1% al 95% de glicanos galactosilados;

(v) el valor diana de los glicanos con alto contenido de manosa es del 0,1% al 20% de los glicanos con alto contenido de manosa; y/o

(vi) el valor diana de los glicanos sialilados es de 0,1% a 90% de glicanos sialilados; y, opcionalmente, (d) evaluar el nivel de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados en la preparacion de protemas recombinantes; y/o,

(e) formular la preparacion en un producto farmacologico.

2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la protema recombinante es una protema terapeutica recombinante y/o un anticuerpo terapeutico recombinante.

3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que el valor diana es:

(i) un nivel de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados en un producto terapeutico de referencia;

(ii) un nivel de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados en un producto de anticuerpo terapeutico de referencia; y/o

(iii) una especificacion de producto farmaceutico predeterminada.

4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que la protema terapeutica de referencia se selecciona del grupo que consiste en: adalimumab, abatacept, abciximab, aflibercept, alefacept, alemtuzumab, basiliximab, bevacizumab, belatacept, certolizumab, cetuximab, daclizumab, eculizigumazum, entanercept, gemtuzumab, ibritumomab, infliximab, muromonab-CD3, natalizumab, omalizumab, palivizumab; panitumumab, ranibizumab, rilonacept, rituximab, tositumomab y trastuzumab.

5. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas:

(a) proporcionar un valor diana, en relacion con el total de glicanos, de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados; y

(b) formular la preparacion en un producto farmacologico si la preparacion cumple con el valor diana de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados; en donde

(i) el valor diana de los glicanos fucosilados, los glicanos galactosilados y/o los glicanos sialilados es un nivel al menos un 10% mas alto que el nivel relativo de los glicanos fucosilados, los glicanos galactosilados y/o los glicanos sialilados en una preparacion de protema recombinante producida mediante el cultivo de la celula en el medio que no comprende 0,1 mg/L a 10 mg/L de putrescina;

(ii) el valor diana de los glicanos con alto contenido de manosa es un nivel al menos un 10% mas bajo que el nivel, en relacion con los glicanos totales, de los glicanos con alto contenido de manosa en una preparacion de la protema recombinante producida mediante el cultivo de la celula en un medio que no contenga 0,1 mg/L 10 mg/L de putrescina;

(vi) el valor diana de los glicanos sialilados es de 0,1% a 90% de glicanos sialilados.

6. El metodo de la reivindicacion 5, que comprende ademas evaluar un nivel de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos con alto contenido de manosa y glicanos sialilados en la preparacion de protema recombinante.

7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la etapa de cultivo comprende una primera etapa y una segunda etapa en la que la primera etapa comprende el cultivo de la celula en el medio de cultivo que comprende un primer nivel de putrescina, y comprendiendo la segunda etapa el cultivo de la celula en el medio de cultivo que comprende un segundo nivel de putrescina y, opcionalmente, en donde

(i) el segundo nivel se incrementa en relacion con el primer nivel;

(ii) el segundo nivel comprende 0,1 mg/L a 10 mg/L de putrescina;

(iii) la primera etapa comprende el cultivo de la celula en el primer nivel de putrescina durante 1 a 8 dfas;

(iv) la segunda etapa comprende el cultivo de la celula en el segundo nivel de putrescina durante 1 a 12 dfas; y/o (v) la segunda etapa comprende la agregacion de putrescina al medio de cultivo.

8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la celula es una celula de ovario de hamster chino (CHO) o una celula de mieloma murino.

9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que la celula es una celula CHO-K1, una celula CHO-DG44, una celula NS0 o una celula SP2/0-Ag14.

10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende ademas el registro del nivel evaluado de uno o mas de glicanos fucosilados, glicanos galactosilados, glicanos de alto contenido de manosa y glicanos sialilados en un registro de lote para la preparacion.

11. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la protema recombinante se selecciona del grupo que consiste en: adalimumab, abatacept, abciximab, aflibercept, alefacept, alemtuzumab, basiliximab, bevacizumab, belatacept, certolizumab, cetuximab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, entanercept, gemtuzumab, ibritumomab, infliximab, muromonab-CD3, natalizumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, ranibizumab, rilonacept, rituximab, tosi-tumomab, and trastuzumab.