ES2694328T3

ES2694328T3 - Composición acuosa líquida

Info

Publication number: ES2694328T3
Application number: ES14764228.4T
Authority: ES
Inventors: Tomomi NAKATANI; Koichi Saito
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2018-12-19
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: JP6294868B2; WO2014142102A1; AU2014231816A1; CA2905588C; CA2905588A1; JPWO2014142102A1; US20140271693A1; EP2974734A1; CN105142656A; CN105142656B; HK1218619A1; KR20150126042A; EP2974734B1; US9663563B2; AU2014231816B2; EP2974734A4

Abstract

Una composición acuosa líquida que comprende un péptido y un excipiente y que tiene un pH de 3 a 6: en donde el péptido se selecciona del grupo que consiste en los siguientes puntos (A) y (B), (A) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro- Tyr-Leu (SEQ. ID. nº: 1), y (B) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ. ID. nº: 1 en la que de 1 a 3 aminoácidos están suprimidos, sustituidos y/o añadidos, y que tiene la capacidad para producir linfocitos T citotóxicos, y el excipiente comprende tanto el punto (C) como el (E) siguientes y opcionalmente comprende el punto (D) siguiente, (C) uno o más tipos de ácidos alfa-hidroxiácidos seleccionados de entre el grupo que consiste en ácido glicólico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, y sus sales farmacológicamente aceptables, (D) uno o más tipos de ácidos dicarboxílicos seleccionados de entre el grupo que consiste en ácido malónico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido maleico y sus sales farmacológicamente aceptables, y (E) metionina, en donde el contenido por volumen de alfa-hidroxiácido es de 1-100 mM, y el contenido por volumen de metionina es de 1-300 mM.

Description

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DESCRIPCION

Composicion acuosa Ifquida Campo tecnico

La presente invencion pertenece al campo de la inmunoterapia contra el cancer y se refiere a una composicion acuosa lfquida que contiene un peptido antigenico del cancer derivado de la protema WT1 que tiene actividad productora de linfocitos T citotoxicos, y se refiere a la estabilizacion de farmacos por la composicion.

Tecnica anterior

En general, un peptido antigenico del cancer derivado de la protema WT1 es un peptido incomplete derivado de una protema WT1 humana (SEQ. ID. n°: 2) que consta de 449 aminoacidos, y espedficamente es un peptido que tiene de 8 a 12 aminoacidos o uno de sus dfmeros. Se presenta al antigeno de clase I del complejo de histocompatibilidad principal (MHC), e incluye un peptido que es antigeno reconocido por las linfocitos T citotoxicos (en lo sucesivo denominados, CTL). MHC se denomina antigeno leucocitario humano (HLA) en seres humanos.

Entre los peptidos incompletos derivados de la protema WT1, un peptido incompleto que consta de 9 aminoacidos e ilustrado por la secuencia del peptido WTI126-134 Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID n°: 1), y un peptido modificado, en donde el (los) aminoacido(s) incompleto(s) esta(n) modificado(s) (peptido modificado) se ha publicado que es util como peptidos que se unen al HLA para producir CTL (veanse los documentos de patentes 1 a 3, documentos no relacionados con patentes 1).

Una protema del antigeno del cancer y un peptido del antigeno del cancer que se utilizan generalmente para las vacunas contra el cancer, se administran con un adyuvante (potenciador inmunitario) en muchos casos con el fin de producir los CTL de manera mas eficiente.

Sin embargo, con frecuencia es difteil mantener la estabilidad, especialmente la estabilidad en agua, de las formulaciones que comprenden estas protemas y peptidos. Por lo tanto, se seleccionan generalmente las formulaciones en las que se elimina el agua por liofilizacion. No obstante, las formulaciones liofilizadas presentan desventajas en los aspectos de produccion y costo, y ademas requieren una operacion como la adicion de agua y similares.

A la vista de lo anterior, es significativo desarrollar una composicion acuosa lfquida estable que permita la combinacion facil de una protema del antfgeno del cancer o de los peptidos del antfgeno del cancer con varios adyuvantes dependiendo del objeto de uso.

En cuanto a la estabilizacion de una formulacion lfquida, se describen una formulacion liofilizada que contiene acido dtrico o metionina como estabilizador de la gonadotropina (vease documento de patente 4), una formulacion que contiene metionina como estabilizador de G-CSF (vease documento de patente 5) y una formulacion que tiene un pH de 4 o inferior y que contiene acido succmico o acido tartarico como estabilizador de G-CSF (vease documento de patente 6).

Ademas, se describe una formulacion que contiene, como estabilizadores del polipeptido del factor VIII modificado en solucion, (1) ajustador de pH para caer dentro del intervalo de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,0, (2) un antioxidante, y (3) una sal de calcio, una sal de magnesio (vease el documento de patente 7). Ademas se describe una formulacion con estabilidad mejorada, que contiene un medicamento fisiologicamente activo, metionina y una nueva protema estimulante de eritropoyesis (vease el documento de patente 8).

Sin embargo, no se ha conocido una composicion acuosa lfquida estable que contiene un peptido incompleto que tiene la secuencia representada por la SEQ. ID. n°: 1 o un peptido modificado de la misma, que es el objeto de la presente invencion.

El documento de patente 9 describe complejos del peptido MHC y su empleo en el diagnostico y tratamiento de enfermedades o en vacunacion. Mas espedficamente describe complejos de MHC que comprenden peptidos antigenicos del cancer y empleos de los mismos.

El documento de patente 10 describe una composicion de vacuna contra el cancer para personas positivas al antfgeno leucocitario humano (HLA) -A*0206 que comprende una protema que es un producto genico del gen WT1 supresor tumoral o uno de sus peptidos incompletos.

El documento de patente 11 describe composiciones acuosas para la estabilizacion de protemas con una variedad de posibles componentes. La composicion se obtiene anadiendo un amortiguador de desplazamiento y luego ajustando el pH a un pH en el que la protema tiene estabilidad a la temperatura deseada.

El documento de patente 12 describe politerapias para el tratamiento de canceres hematologicos utilizando determinados compuestos (formula A) en combinacion con agentes terapeuticos adicionales incluido el peptido WT1.

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Lista de documentos Documentos de patentes

Documento de patente 1: WO00/06602 Documento de patente 2: WO00/18795 Documento de patente 3: WO2009/072610 Documento de patente 4: JP-A-H10-203997 Documento de patente 5: JP-A-2000-247903 Documento de patente 6: WO2005/39620 Documento de patente 7: WO03/55511 Documento de patente 8: WO03/20299 Documento de patente 9: WO2010/037395 Documento de patente 10: EP 2.228.072 Documento de patente 11: WO2008/084237 Documento de patente 12: WO2012/125510 Documento no de patente

Documento no de patente 1: Opinion escrita en el examen de la patente europea EP-B-1127068 Compendio de la invencion Problemas planteados

El problema de la presente invencion es proporcionar una composicion acuosa lfquida con estabilidad mejorada de un peptido incompleto que tiene la secuencia representada por la SEQ. ID. n°: 1 o un peptido modificado de dicho peptido, que puede utilizarse para la preparacion de una formulacion de la vacuna contra el cancer que comprende el peptido mencionado anteriormente.

Medios para resolver los problemas

Los presentes inventores han dirigido estudios intensivos en un intento de resolver los problemas susodichos y han encontrado que un producto de degradacion principal en una composicion acuosa lfquida que comprende un peptido incompleto que tiene una secuencia representada por la SEQ. ID. n°: 1 o un peptido modificado de dicho peptido (en lo sucesivo, algunas veces simplemente se denomina peptido de la presente invencion) procede de la oxidacion de un resto de metionina contenido en el peptido. Ademas, han descubierto que la oxidacion del resto de metionina de dicho peptido se suprime al anadir un excipiente determinado como estabilizador, y se obtiene una composicion acuosa lfquida con estabilidad superior de la formulacion al ajustar la composicion para tener un pH espedfico, lo que da como resultado realizacion de la presente invencion.

Por consiguiente, la presente invencion se refiere a lo siguiente.

Apartado 1. Una composicion acuosa lfquida que comprende un peptido y un excipiente y que tiene un pH de 3 a 6: en donde

el peptido se selecciona del grupo que consiste en los siguientes puntos (A) y (B),

(A) un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos representada por Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr- Leu (SEQ. ID. n°: 1), y

(B) un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ. ID. n°: 1, en la que se han suprimido, sustituido y/o anadido de 1 a 3 aminoacidos, y que tiene la capacidad de producir linfocitos T citotoxicos, y

el excipiente comprende tanto el punto (C) como el (E) siguientes y opcionalmente comprende el punto (D) siguiente,

(C) uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionados de entre el grupo que consiste en acido glicolico, acido

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lactico, acido malico, acido tartarico, acido dtrico, y sus sales farmacologicamente aceptables,

(D) uno o mas tipos de acidos dicarbox^licos seleccionados de entre el grupo que consiste en acido malonico, acido succmico, acido glutarico, acido maleico y sus sales farmacologicamente aceptables, y

(E) metionina,

en donde el contenido por volumen de alfa-hidroxiacido es de 1-100 mM, y el contenido por volumen de metionina es de 1-300 mM.

Apartado 2. La composicion acuosa Kquida segun el apartado 1, en donde el peptido consiste en la secuencia de aminoacidos representada por (A) Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ. ID. n°: 1).

Apartado 3. La composicion acuosa lfquida segun el apartado 1, en donde (B) es Phe-Met-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (FMFPNAPYL) (SEQ. ID. n°: 3), Arg-Met-Met-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (RMMPNAPYL) (SEQ ID n°: 4), Arg-Met- Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Val (RMFPNAPYV) (SEQ. ID. n°: 5), Tyr-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (YMFPNAPYL) (SEQ ID n°: 6) o Ala-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (ARMFPNAPYL) (SEQ. ID. n°: 7).

Apartado 4. La composicion acuosa lfquida segun uno de los apartados 1 a 3, en donde (C) es uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionados del grupo que consiste en acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico y sus sales farmacologicamente aceptables.

Apartado 5. La composicion acuosa lfquida segun cualquiera de los apartados 1 a 4, en donde (C) es uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionados del grupo que consiste en acido glicolico y sus sales farmacologicamente aceptables.

Apartado 6. La composicion acuosa lfquida segun cualquiera de los apartados 1 a 4, en donde (C) es uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionados del grupo que consiste en acido lactico y sus sales farmacologicamente aceptables.

Apartado 7. La composicion acuosa lfquida segun cualquiera de los apartados 1 a 4, en donde (C) es uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionados del grupo que consiste en acido malico y sus sales farmacologicamente aceptables.

Apartado 8. La composicion acuosa lfquida segun cualquiera de los apartados 1 a 4, en donde (C) es uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionados del grupo que consiste en acido tartarico y sus sales farmacologicamente aceptables.

Apartado 9. La composicion acuosa lfquida segun cualquiera de los apartados 1 a 3, en donde el excipiente comprende los puntos (C), (D) y (E).

Apartado 10. La composicion acuosa lfquida segun el apartado 9, en donde el excipiente comprende los puntos (C), (D) y (E), (C) es uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionados del grupo que consiste en acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico y sus sales farmacologicamente aceptables, y (D) es uno o mas tipos de acidos dicarboxflicos seleccionados entre acido succmico, acido maleico y sus sales farmacologicamente aceptables.

Apartado 11. La composicion lfquida acuosa segun el apartado 9 o 10, en donde el contenido por volumen de acido carboxflico es de 10 a 100 mM.

Apartado 12. La composicion acuosa lfquida segun uno de los apartados 1 a 11, que tiene un pH entre 4 y 5.

Apartado 13. Un procedimiento para mejorar la estabilidad de un peptido en una composicion acuosa lfquida al anadir un excipiente:

en donde

el peptido es un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos representada por Arg-Met-Phe-Pro-Asn- Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ. ID. n°: 1), y

el excipiente comprende ambos puntos (C) y (E) siguientes y opcionalmente comprende los siguiente puntos (D),

(C) uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionados del grupo que consiste en acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico, acido dtrico y sus sales farmacologicamente aceptables,

(D) es uno o mas tipos de acidos dicarboxflicos seleccionados del grupo que consiste en acido malonico, acido succmico, acido glutarico, acido maleico y sus sales farmacologicamente aceptables, y

(E) metionina,

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en donde el contenido por volumen de alfa-hidroxiacido es de 1 a 100 mM, el contenido por volumen de metionina es de 1 a 300 mM y la composicion final tiene un pH de 3 a 6.

Apartado 14. El procedimiento segun el apartado 13, en donde el excipiente comprende:

(C) uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionados del grupo que consiste en acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico y sus sales farmacologicamente aceptables, o

(D) uno o mas tipos de acidos dicarboxflicos seleccionados del grupo que consiste en acido succmico, acido maleico y sus sales farmacologicamente aceptables.

Apartado 15. El procedimiento segun uno cualquiera de los apartados 13 o 14, en donde (C) es uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionados del grupo que consiste en acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico y sus sales farmacologicamente aceptables.

Apartado 16. El procedimiento segun uno cualquiera de los apartados 13 a 15, en donde el excipiente comprende los puntos (C), (D) y (E).

Apartado 17. El procedimiento del apartado 16, en donde el excipiente comprende los puntos (C), (D) y (E), (C) es uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionados del grupo que consiste en acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico y sus sales farmacologicamente aceptables, y (D) es uno o mas tipos de acidos dicarboxflicos seleccionados del grupo que consiste en acido succmico, acido maleico y sus sales farmacologicamente aceptables.

Efecto de la invencion

Usando la composicion acuosa lfquida de la presente invencion, se puede producir una composicion acuosa lfquida de manera estable que comprende el peptido de la presente invencion que tiene actividad productora de linfocitos T citotoxicos, y puede formularse una vacuna contra el cancer con excelente estabilidad.

Breve descripcion del dibujo

[Fig. 1] La Fig. 1 presenta los resultados de la prueba de actividad productora de CTL medida en el ejemplo experimental 5.

Descripcion de las realizaciones

A continuacion, se explican con detalle las realizaciones de la presente invencion.

En la presente memoria, una realizacion preferible de cada ejemplificacion puede combinarse con una realizacion preferible de otra ejemplificacion, o puede incorporarse en la ejemplificacion correspondiente descrita en los apartados 1 a 17 anteriores.

La "composicion acuosa lfquida" de la presente invencion es un lfquido para preparar una vacuna contra el cancer, que contiene agua como disolvente principal y puede mezclarse con varios adyuvantes. Aunque generalmente se utiliza agua como disolvente, un disolvente farmacologicamente aceptable como etanol, propilenglicol, polietilenglicol y similares, puede mezclarse parcialmente con agua siempre que no se vea afectado el efecto de la invencion. Preferiblemente, solo se usa agua como disolvente.

El "peptido" en la presente invencion es un peptido antigenico del cancer para preparar una vacuna contra el cancer y significa un peptido seleccionado del grupo que consiste en (A) "peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ. ID. n°: 1)" y (B) "peptido en donde, en la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ. ID. n°: 1, estan suprimidos, sustituidos y/o anadidos 1 a 3 aminoacidos, y que tiene capacidad de producir linfocitos T citotoxicos". Se prefiere a un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos representada por (A) Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID n°: 1).

El "peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos representada por Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID n°: 1)" es una protema que es un producto genico del gen supresor del cancer WT1 del tumor de Wilms, que es espedficamente un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de 9 aminoacidos de Arg-Met- Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID n°: 1) (peptido WT1 126-134) procedente del peptido incompleto que consta de 449 aminoacidos (SEQ ID n°: 2) procedente de la protema WT1 humana. El peptido esta presentado al antfgeno MHC de clase I y el antfgeno reconocido por CTL. El peptido puede producirse por un metodo conocido (veanse los documentos de patente 1, 2, 3, etc.).

En cuanto al "peptido consistente en la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ. ID. n°: 1 en donde estan suprimidos, sustituidos y/o anadidos 1 a 3 aminoacidos y que tienen capacidad para producir linfocitos T citotoxicos", puede mencionarse un peptido modificado que es el peptido incompleto anteriormente mencionado que consiste en la secuencia de aminoacidos en la que se eliminan, sustituyen y/o agregan de 1 a 3 aminoacidos y que se une a HLA para producir CTL. El numero de aminoacidos a sustituir es preferiblemente 1 o 2, mas

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preferiblemente 1. Las posiciones de sustitucion preferidas son la posicion 1, la posicion 3 y la posicion 9. El numero de aminoacidos a anadir (que tambien incluyen inserciones) es preferiblemente 1 o 2, mas preferiblemente 1. Una posicion de adicion preferible es la posicion 1. El numero de aminoacidos a eliminar es preferiblemente de 1. En la modificacion, el aminoacido a anadir o el aminoacido a sustituir puede ser un aminoacido artificial distinto de los 20 tipos de aminoacidos codificados por el gen.

Cuando el peptido modificado contiene al menos un resto de cistema, dos peptidos (monomeros) pueden unirse entre sf mediante un enlace disulfuro para formar un dfmero.

El peptido modificado puede prepararse por un metodo generalmente usado en el campo tecnico. Por ejemplo, puede sintetizarse por metodos de smtesis de peptidos descritos en Peptide Synthesis, Interscience, Nueva York, 1966; The Proteins, vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. 1985; Development of Pharmaceutical Product, continuacion vol. 14: Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten Ltd., 1991 y similares.

Ejemplos de peptidos modificados incluyen las siguientes formas modificadas. Phe-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr- Leu (FMFPNAPYL) (SEQ. ID. n°: 3), Arg-Met-Met-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (RMMPNAPYL) (SEQ. ID. n°: 4), Arg- Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Val (RMFPNAPYV) (SEQ ID n°: 5), Tyr- Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu

(YMFPNAPYL) (SEQ ID n°: 6) y Ala-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (ARMFPNAPYL) (SEQ ID n°: 7).

Es evidente que estas variantes son peptidos modificados que se unen a HLA para producir CTL, y pueden producirse por un metodo conocido (veanse los documentos de patente 1 a 3 y el documento no de patente 1).

En cuanto al peptido como ingrediente activo en la presente invencion, tambien se puede usar un derivado del peptido WT1-I26-134 representado por la SEQ. ID. n°: 1 o uno de sus peptidos modificados. Por ejemplo, se puede mencionar cada peptido en donde varias sustancias estan unidas al terminal N y/o al terminal C de la secuencia de aminoacidos de los mismos y similares. Por ejemplo, pueden unirse aminoacidos, peptidos, sus analogos y similares. Cuando una sustancia de este tipo esta unida a un peptido que consta de la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ. ID. n°: 1 o uno de sus peptidos modificados, la sustancia es tratada, por ejemplo, por una enzima en el cuerpo y similares o en el proceso de tratamiento intracelular y similares, para preparar finalmente un peptido que tiene capacidad para producir linfocitos T citotoxicos provocar una reaccion de CTL espedficas para WT1.

En la composicion acuosa lfquida de la presente invencion, el contenido por volumen de "peptido" no esta particularmente limitado, y puede ser un contenido con relacion a un volumen aceptable desde el aspecto de la farmacologfa o propiedades. Del "peptido", por ejemplo, el contenido preferible del peptido WT1-I26- 134 (RMFPNAPYL) representado por la SEQ. ID. n°: 1 es de 0,01 mg/ml a 200 mg/ml, mas preferiblemente de 0,1 mg/ml a 100 mg/ml en una composicion acuosa lfquida, que puede seleccionarse segun el objeto de su uso.

En la presente memoria, el peptido mencionado anteriormente tiene el terminal N en el lado izquierdo y cada sfmbolo de aminoacido es el siguiente resto de aminoacido.

Ala o A: resto de alanina

Arg o R: resto de arginina

Asn o N: resto de asparagina

Asp o D: resto de acido aspartico

Cys o C: resto de cistema

Gln o Q: resto de glutamina

Glu o E: resto de acido glutamico

Gly o G: resto de glicina

His o H: resto de histidina

Ile o I: resto de isoleucina

Leu o L: resto de leucina

Lys o K: resto de lisina

Met o M: resto de metionina

Phe o F: resto de fenilalanina

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Pro o P: resto de prolina Ser o S: resto de serina Thr o T: resto de treonina Trp o W: resto de triptofano Tyr o Y: resto de tirosina Val o V: resto de valina

Abu: resto de acido 2-aminobutftico (tambien se conoce como resto de acido a-aminobutftico)

Orn: resto de ornitina Cit: resto de citrulina

En general, "excipiente" significa un componente distinto del principio activo, que se utiliza para formulaciones. Ejemplos de "excipiente" en la presente invencion (en adelante, por conveniencia, puede ser denominado a veces como "excipiente de la presente invencion") incluyen uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionado del grupo que consiste en acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico, acido cftrico y sus sales farmacologicamente aceptables, uno o mas tipos de acidos dicarboxflicos seleccionado del grupo que consiste en acido malonico, acido succmico, acido glutarico, acido maleico, acido fumarico y sus sales farmacologicamente aceptables, y metionina.

En general, "alfa-hidroxiacido" se refiere a un acido carboxflico en el que un grupo hidroxilo tambien esta unido a un carbono al que esta unido un grupo carboxilo. Ejemplos de "alfa-hidroxiacido " en la presente invencion incluyen acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico, acido cftrico y sus sales farmacologicamente aceptables. Ejemplos de sales farmacologicamente aceptables incluyen las sales de adicion de bases. Ejemplos de sales de adicion de bases incluyen sales de aluminio, sales de calcio, sales de sodio, sales de potasio y similares. Ejemplos de las mismas incluyen, pero no se limitan a, lactato de aluminio, lactato de calcio, lactato de sodio, malato de sodio, malato disodico, bitartrato de potasio, tartrato de sodio, citrato de potasio, citrato de sodio y similares. Cuando hay dos o mas grupos carboxilo, se pueden agregar una base diferente a cada grupo carboxilo. Ejemplos de las mismas incluyen, pero no se limitan a, tartrato de sodio y potasio y similares. Ademas, puede ser un hidrato. Ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, hidrato de lactato de calcio, hemihidrato de malato de sodio, monohidrato de malato disodico, dihidrato de tartrato de sodio, tetrahidrato de tartrato de sodio y potasio, hidrato de acido cftrico, hidrato de citrato de sodio, y similares. Al usar acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico, acido cftrico, una composicion acuosa ftquida que contiene el peptido de la presente invencion puede estabilizarse. Uno o mas tipos de estos se pueden usar solos o en combinacion. El alfa- hidroxiacido utilizado en la presente invencion es preferiblemente acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico o sus sales farmacologicamente aceptables, mas preferiblemente acido tartarico o sus sales farmacologicamente aceptables. Aunque el acido lactico, el acido malico y el acido tartarico tienen isomeros opticos, una forma opticamente activa y racemato no influyen en los efectos de la invencion. El acido tartarico se utiliza frecuentemente como excipiente para productos farmaceuticos, y es preferible el acido L - (+) tartarico descrito en la Farmacopea japonesa (16a edicion).

En la composicion acuosa ftquida de la presente invencion, el contenido por volumen de "alfa-hidroxiacido" es de 1 a 100 mM, mas preferiblemente de 1 a 50 mM, aun mas preferiblemente de 1 a 25 mM.

"Acido dicarboxflico" generalmente significa un acido carboxflico que tiene dos grupos carboxilo en la molecula. Ejemplos de "acido dicarboxflico" en la presente invencion incluyen acido malonico, acido succmico, acido glutarico, acido maleico, acido fumarico y sus sales farmacologicamente aceptables. Ejemplos de sales farmacologicamente aceptables incluyen sales de adicion de bases. Los ejemplos de sales de adicion de bases incluyen sales de sodio, sales de potasio y similares. Los ejemplos de las mismas incluyen, pero no se limitan a, malonato disodico, succinato sodico, glutarato sodico, glutarato sodico, fumarato disodico y similares. Ademas, puede ser un hidrato. Ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, monohidrato de malonato disodico, 6- hidrato de succinato sodico, trihidrato de maleato monosodico y similares. Al usar acido malonico, acido succmico, acido glutarico, acido maleico o acido fumarico, puede estabilizarse una composicion acuosa ftquida que contiene el peptido de la presente invencion. Uno o mas tipos de estos se pueden usar en combinacion. El acido dicarboxflico usado en la presente invencion es preferiblemente acido succmico, acido maleico, acido fumarico o sus sales farmacologicamente aceptables.

En la composicion acuosa ftquida de la presente invencion, aunque el contenido por volumen del "acido dicarboxflico" no esta particularmente definido, es preferiblemente de 10 a 100 mM, mas preferiblemente de 25 a 100 mM, aun mas preferiblemente de 50 a 100 mM.

La "metionina" en la presente invencion es uno de los aminoacidos esenciales y es un aminoacido hidrofobo que

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contiene un atomo de azufre en la cadena lateral. Aunque la "metionina" tiene un isomero optico e incluye una forma D, una forma L y una forma DL, ninguno de estos puede usarse sin influir en el efecto de la invencion. La metionina se utiliza frecuentemente como excipiente para productos farmaceuticos, y es preferible una forma L descrita en la Farmacopea Japonesa (16a edicion). El contenido por volumen de metionina en la composicion acuosa lfquido de la presente invencion es de 1 a 300 mM.

El "alfa-hidroxiacido", el "acido dicarbox^lico" y la "metionina" pueden estabilizar cada uno la composicion acuosa lfquida de la presente invencion, incluso por un solo uso de la misma. Se puede esperar mas estabilidad utilizando "metionina" en combinacion con "alfa-hidroxiacido" y/o "acido dicarboxflico". En este caso, un acido que se combinara con "metionina" es preferiblemente acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico, acido succmico, acido maleico o acido fumarico, mas preferiblemente acido malico o acido tartarico, aun mas preferiblemente acido tartarico.

Aunque la composicion acuosa lfquida de la presente invencion tiene el pH de 3 a 6, cuando el pH deseado no se consigue durante la produccion, generalmente se utiliza un ajustador de pH para ajustar el pH. Desde el punto de vista de la estabilidad, el pH preferible es de 3 a 6, mas preferiblemente de 4 a 5. Si el pH es inferior a 3 o el pH excede de 6, sustancias analogas tales como una forma oxidada de un resto de metionina en el peptido de la presente invencion y similares tienden a aumentar durante la produccion o el almacenamiento. Como resultado, el contenido del peptido de la presente invencion en la composicion lfquida acuosa puede reducirse, lo que no es preferible.

Un ajustador de pH, se selecciona cuando proceda de los ajustadores de pH generalmente utilizados para preparaciones farmaceuticas y se utiliza. Espedficamente pueden mencionarse acido clorhndrico, acido fosforico, hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, fosfato dibasico de sodio, fosfato monobasico de sodio, fosfato monobasico de potasio, fosfato trisodico y similares.

Ademas, la composicion acuosa lfquida de la presente invencion puede contener apropiadamente, ademas de los excipientes anteriormente mencionados, excipientes generalmente utilizados para preparados farmaceuticos tales como estabilizantes, disolventes, agentes amortiguadores, agentes isotonicos, agentes disolventes y similares, siempre que el efecto de la invencion no resulte afectado.

La composicion acuosa lfquida de la presente invencion se puede producir mediante un procedimiento comunmente usado en la fabricacion de productos farmaceuticos y similares. Por ejemplo, se agrega agua para inyectables en un recipiente apropiado en un entorno mantenido a una temperatura constante de 5 a 25°C, y se anaden a esto un peptido y un excipiente previamente pesados mientras se agita suavemente la mezcla. A continuacion, la mezcla se ajusta finalmente para tener un pH deseado. La mezcla se esteriliza por filtracion con filtro o similar, y se llena en un recipiente como un vial de vidrio o similar, que se sella con un tapon de goma o similar.

Aunque el metodo de preparacion de una vacuna contra el cancer utilizando la composicion acuosa lfquida de la presente invencion no esta particularmente limitado, pueden mencionarse por ejemplo, un metodo de preparacion de una vacuna contra el cancer mezclando con un adyuvante apropiado; un metodo de preparacion de una vacuna contra el cancer mezclando previamente con un adyuvante adecuado y liofilizando la mezcla y similares; un metodo para preparar una vacuna contra el cancer mezclando la composicion acuosa lfquida de la presente invencion con diversos adyuvantes en el momento de su uso y similares. Ejemplos de adyuvantes incluyen el adyuvante de Freund; geles minerales tales como hidroxido de aluminio; sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa de ojo de cerradura y dinitrofenol; adyuvantes humanos como Bacilo de Calmette y Guerin) y Corynebacterium parvum y similares.

Una vacuna contra el cancer preparada utilizando la composicion acuosa lfquida de la presente invencion puede utilizarse para la prevencion del tratamiento del cancer relacionado con un aumento en el nivel de expresion del gen WT1, por ejemplo, cancer hematologico como leucemia, smdrome mielodisplasico, mieloma multiple, linfoma maligno y similares, y tumor solido tal como cancer gastrico, cancer colorrectal, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de celulas germinativas, cancer de hngado, cancer de piel, cancer de vejiga, cancer de prostata, cancer de utero, cancer de cuello uterino, cancer de ovario y similares.

Dado que la composicion acuosa lfquida de la presente invencion puede mantener de manera estable un peptido antigenico del cancer, que es el principio activo, se pueden seleccionar varias formas de administracion. Espedficamente, se pueden mencionar la administracion oral, nasal, pulmonar, transdermica, intradermica, subcutanea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal y similares, y se puede preparar una vacuna contra el cancer por el metodo mencionado anteriormente segun se desea. En general, como una via de administracion preferible para inmunoestimulacion con una vacuna contra el cancer, se conoce la administracion parenteral y, por ejemplo, pueden mencionarse la administracion intraperitoneal, la administracion subcutanea, la administracion intradermica, la administracion intramuscular, la administracion intravenosa, asf como la administracion nasal, la administracion transdermica y similares. Entre ellos, se pueden mencionar preferiblemente la administracion inyectable tal como la administracion subcutanea, la administracion intradermica, la administracion intraperitoneal, la administracion intramuscular y similares.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ejemplos

La presente invencion se explica con mas detalle a continuacion haciendo referencia a ejemplos, ejemplos comparativos y ejemplos experimentales. En los siguientes ejemplos y similares, "%" significa "% en peso" a menos que se especifique lo contrario.

Algunos ejemplos que no caen dentro de las reivindicaciones se describen a tftulo de referencia solamente.

Se uso "acido glicolico (cristalino) (fabricado por Nacalai Tesque)" como acido glicolico, se uso "acido lactico (fabricado por Nacalai Tesque)" como acido lactico, se uso "acido DL-malico (fabricado por Nacalai Tesque)" como acido malico, se uso "acido L(+)-tartarico, en polvo (fabricado por Merck)" como acido tartarico y se uso "acido cftrico monohidratado (fabricado por Nacalai Tesque)" como acido cftrico. Se uso "acido malonico (fabricado por Nacalai Tesque)" como acido malonico, se uso "acido succmico (fabricado por Nacalai Tesque)" como acido succmico, se uso "acido glutarico (fabricado por Nacalai Tesque)" como acido glutarico, se uso "acido maleico (fabricado por Nacalai Tesque)" como acido maleico y se uso "L-metionina (fabricado por Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.)" como metionina. Para ajustar el pH, se uso "1 mol/l de acido clorhftdrico (fabricado por Nacalai Tesque)" como acido clorhftdrico y se uso "1 mol/l de solucion de hidroxido de sodio (fabricado por Nacalai Tesque)" como hidroxido de sodio.

En los ejemplos comparativos, se uso "fosfato monobasico de sodio deshidratado (fabricado por Nacalai Tesque)" como fosfato monobasico de sodio, se uso "acetato de sodio trihidratado (fabricado por Nacalai Tesque) como acetato de sodio, se uso "tioglicolato de sodio (fabricado por Nacalai Tesque)" como tioglicolato de sodio, se uso "pirosulfito de sodio (fabricado por Nacalai Tesque) como pirosulfito de sodio", y se uso "acido L(+)-ascorbico (fabricado por Nacalai Tesque)" como acido ascorbico. Se uso "L-a-alanina (fabricada por Nacalai Tesque)" como alanina, se uso "glicina (fabricada por Nacalai Tesque)" como glicina y se uso "hidrocloruro de L-arginina (fabricado por Nacalai Tesque)" como arginina.

Se uso "IFA (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)" como adyuvante incompleto de Freund, se uso "NOFABLE EO-85S" (fabricado por NOF Corp.)" como oleato de etilo, se uso "NOFABlE SO-991 (fabricado por NOF Corp.)" como monooleato de sorbitan, se uso "NIKKOL HCO-10 (fabricado por Nikko Chemicals)" como aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 10, y se uso "glicerina concentrada de la Farmacopea japonesa (fabricada por NOF Corporation)" como glicerina concentrada. Se uso "NIKKOL ODM-100 (fabricado por Nikko Chemicals)" como miristato de octildodecilo, se uso "NOFABLE GO-991" (fabricado por NOF Corp.) como monooleato de glicerol y se uso "NIKKOL HCO-20 (fabricado por Nikko Chemicals)" como aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 20.

Preparacion de composicion acuosa ftquida Ejemplo 1

Un peptido representado por la SEQ ID n°: 1 (RMFPNAPYL) (en adelante, peptido (1)), que es el peptido (A), como peptido y acido glicolico, que es excipiente (C), como excipiente se disolvieron en agua para inyectables en las cantidades descritas en la tabla 1, y se ajusto a pH 4,5 con acido clorhfdrico y/o hidroxido de sodio. La mezcla se filtro a traves de un filtro esterilizado de 0,2 pm, se lleno en un vial de vidrio de 1 ml y se sello con un tapon de caucho de butilo, con lo que se obtuvo una composicion acuosa ftquida 1.

Ejemplos 2 a 38

De la misma manera que en el ejemplo 1, se prepararon el peptido (1) que es el peptido (A), y alfa-hidroxiacido, acido dicarboxftico y/o metionina como excipientes (C), (D) y/o (E) en las cantidades descritas en las tablas 1-9, se llenaron en viales, y los viales se sellaron con un tapon de caucho de butilo, con lo que se obtuvieron las composiciones acuosas ftquidas 2 a 38.

Ejemplos comparativos 1 a 23

De la misma manera que en el ejemplo 1, se prepararon las cantidades mostradas en las tablas 10 a 14, se llenaron en viales, y los viales se sellaron con un tapon de caucho de butilo, con lo que se obtuvieron las composiciones acuosas ftquidas 39 a 61.

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: Ejemplo


: 36 37 38

: composicion acuosa l^quida n° 36 37 38

acido tartarico [mM]: 10 - 10

metionina [mM]: 50 200 200

acido clorhndrico/hidroxido de sodio: c. s. c. s. c. s.

PH: 4,5 4,5 4,5

Tabla 10


: Ejemplo comparativo


: 1 2 3 4 5 6

: composicion acuosa Kquida n° 39 40 41 42 43 44

peptido (1) [mg/ml]: 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

fosfato monobasico de sodio [mM]: - 1 - - - -

acetato de sodio [mM]: - - 1 - - -

alanina [mM]: - - - 1 - -

glicina [mM]: - - - - 1 -

arginina [mM]: - - - - - 1

acido clorhndrico/hidroxido de sodio: c. s. c. s. c. s. c. s. c. s. c. s.

PH: 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5

Tabla 11


: Ejemplo comparativo


: 7 8 9 10 11

: composicion acuosa Kquida n° 45 46 47 48 49

peptido (1) [mg/ml]: 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

fosfato monobasico de sodio [mM]: 50 - - - -

acetato de sodio [mM]: - 50 - - -

alanina [mM]: - - 50 - -

glicina [mM]: - - - 50 -

arginina [mM]: - - - - 50


: Ejemplo comparativo


: 7 8 9 10 11

: composicion acuosa Kquida n° 45 46 47 48 49

acido clorhndrico/hidroxido de sodio: c. s. c. s. c. s. c. s. c. s.

PH: 4,5 4,5 4,5 4,5 4,6

Tabla 12


: Ejemplo comparativo


: 12 13 14

: composicion acuosa lfquida n° 50 51 52

peptido (1) [mg/ml]: 0,2 0,2 0,2

alanina [mM]: 200 - -

glicina [mM]: - 200 -

arginina [mM]: - - 200

acido clorhndrico/hidroxido de sodio: c. s. c. s. c. s.

pH: 4,5 4,5 4,5

Tabla 13


: Ejemplo comparativo


: 15 16 17 18

: composicion acuosa lfquida n° 53 54 55 56

peptido (1) [mg/ml]: 0,01 0,01 50 50

fosfato monobasico de sodio [mM]: - 1 - 10

acido clorhndrico/hidroxido de sodio: c. s. c. s. c. s. c. s.

pH: 4,5 4,5 4,5 4,5

5

Tabla 14


: Ejemplo comparativo


: 19 20 21 22 23

: composicion acuosa lfquida n° 57 58 59 60 61

peptido (1) [mg/ml]: 20 20 20 20 20

acido ascorbico [%]: - - 0,1 - -


: Ejemplo comparativo


: 19 20 21 22 23

: composicion acuosa lfquida n° 57 58 59 60 61

tioglicolato de sodio [%]: - - - 0,1 -

pirosulfito de sodio [%]: - - - - 0,1

acido clorhndrico/hidroxido de sodio: c. s. c. s. c. s. c. s. c. s.

pH: 4,5 4,6 4,7 4,7 4,6

Ejemplo experimental 1. Evaluacion de estabilidad (1)

Las composiciones acuosas Kquidas preparadas se almacenaron en una incubadora a 60°C durante 2 semanas. A continuacion el contenido de peptido oxidado, que era el peptido resultante de la oxidacion de un resto de metionina 5 contenido en el peptido (1) se midio basandose en el metodo siguiente.

Utilizando una columna C18 de fase inversa (4,6 mm x 150 mm, 3,5 pm), se midio el contenido de peptido oxidado por el metodo de cromatograffa lfquida de alto rendimiento en fase inversa utilizando agua pura, acetonitrilo, metanol y acido trifluoroacetico para la fase movil. Como peptido (1), se inyecto una cantidad equivalente a 10 |jg, y se realizo deteccion espectroscopica a una longitud de onda de 220 nm. Usando el area del pico medida por este 10 metodo, se calculo el contenido de peptido oxidado (%) por la formula siguiente.

Contenido de peptido oxidado (%) = area de pico de peptido oxidado / area de pico total de peptido que comprende sustancias relacionadas x 100

Entre las composiciones acuosas lfquidas obtenidas en los ejemplos y ejemplos comparativos, ejemplos 1 a 22 descritos en las tablas 1a 6 y ejemplos comparativos 1 a 14 descritos en las tablas 10 a 12 se almacenaron a 60°C 15 durante 2 semanas. El contenido de peptido oxidado despues del almacenamiento se muestra en las tablas 15 y 16. La relacion de inhibicion de producto oxidado en las tablas se calculo mediante la formula siguiente.

Relacion de inhibicion de producto oxidado (%) = {(contenido de peptido oxidado en muestra de referencia (Ejemplo comparativo 1)) - (contenido de peptido oxidado en ejemplos o ejemplos comparativos en tabla 15 o tabla 16)} * 100 / (contenido de 20 peptido oxidado en muestra de referencia (ejemplo comparativo 1))

Un valor numerico mayor de la relacion de inhibicion del producto oxidado significa un efecto de inhibicion mayor para la oxidacion y un efecto estabilizador del excipiente para el peptido (1).

Tabla 15

: composicion acuosa lfquida n° concentracion de peptidos excipiente 60°C, 2 semanas despues

contenido de peptido oxidado: relacion de inhibicion de producto oxidado

Ejemplo comparativo 1 (referencia): 39 0,2 mg/ml ninguno 1,39% -

Ejemplo 1: 1 0,2 mg/ml acido glicolico 10 mM 0,56% 60%

Ejemplo 2: 2 0,2 mg/ml acido lactico 10 mM 0,62% 55%

Ejemplo 3: 3 0,2 mg/ml acido malico 10 mM 0,41% 71%

Ejemplo 4: 4 0,2 mg/ml acido tartarico 10 mM 0,64% 54%

: composicion acuosa liquida n° concentracion de peptidos excipiente 60°C, 2 semanas despues

contenido de peptido oxidado: relacion de inhibicion de producto oxidado

Ejemplo 5: 5 0,2 mg/ml acido cftrico 10 mM 1,13% 19%

Ejemplo 6: 6 0,2 mg/ml acido malonico 25 mM 1,03% 26%

Ejemplo 7: 7 0,2 mg/ml acido succfnico 25 mM 0,67% 52%

Ejemplo 8: 8 0,2 mg/ml acido glutarico 25 mM 1,00% 28%

Ejemplo 9: 9 0,2 mg/ml acido maleico 25 mM 0,17% 88%

Ejemplo 10: 10 0,2 mg/ml acido malico 1 mM 0,45% 68%

Ejemplo 11: 11 0,2 mg/ml acido malico 25 mM 0,42% 70%

Ejemplo 12: 12 0,2 mg/ml acido malico 50 mM 0,55% 60%

Ejemplo 13: 13 0,2 mg/ml acido malico 100 mM 0,70% 50%

Ejemplo 14: 14 0,2 mg/ml acido succfnico 10 mM 0,96% 31%

Ejemplo 15: 15 0,2 mg/ml acido succfnico 50 mM 0,37% 73%

Ejemplo 16: 16 0,2 mg/ml acido succfnico 100 mM 0,33% 76%

Ejemplo 17: 17 0,2 mg/ml metionina 1 mM 0,39% 72%

Ejemplo 18: 18 0,2 mg/ml metionina 50 mM 0,13% 91%

Ejemplo 19: 19 0,2 mg/ml metionina 100 mM 0,13% 91%

Ejemplo 20: 20 0,2 mg/ml metionina 200 mM 0,14% 90%

Ejemplo 21: 21 0,2 mg/ml metionina 300 mM 0,15% 89%

Ejemplo 22: 22 0,2 mg/ml acido tartarico 1 mM 0,49% 65%

contenido de peptido oxidado: relacion de inhibicion de producto oxidado

Ejemplo comparativo 1 (referencia): 39 0,2 mg/ml ninguno 1,39% -

Ejemplo comparativo 2: 40 0,2 mg/ml fosfato monobasico de sodio 1 mM 1,43% -3%

Ejemplo comparativo 3: 41 0,2 mg/ml acetato de sodio 1 mM 1,43% -3%

Ejemplo comparativo 4: 42 0,2 mg/ml alanina 1 mM 1,30% 6%

Ejemplo comparativo 5: 43 0,2 mg/ml glicina 1 mM 1,27% 9%

Ejemplo comparativo 6: 44 0,2 mg/ml arginina 1 mM 1,32% 5%

Ejemplo comparativo 7: 45 0,2 mg/ml fosfato monobasico de sodio 50 mM 1,76% -27%

Ejemplo comparativo 8: 46 0,2 mg/ml acetato de sodio 50 mM 1,31% 6%

Ejemplo comparativo 9: 47 0,2 mg/ml alanina 50 mM 1,33% 4 %

Ejemplo comparativo 10: 48 0,2 mg/ml glicina 50 mM 1,83% -32%

Ejemplo comparativo 11: 49 0,2 mg/ml arginina 50 mM 1,28% 8%

Ejemplo comparativo 12: 50 0,2 mg/ml alanina 200 mM 1,30% 6%

Ejemplo comparativo 13: 51 0,2 mg/ml glicina 200 mM 2,80% -101%

Ejemplo comparativo 14: 52 0,2 mg/ml arginina 200 mM 1,94% -40%

En cuanto al ejemplo comparativo, se evaluo el efecto de inhibicion de la oxidacion del peptido (1) agregando en general acidos o aminoacidos como excipiente. En el resultado, el excipiente casi no tiene efecto de inhibicion de la 5 oxidacion (menos del 10%) o un aumento en el contenido del peptido oxidado. En cambio, cuando se anadio el excipiente en la presente invencion se observo siempre un efecto inhibidor de la oxidacion. Segun la tabla 15, se confirmo que el efecto de inhibidor de la oxidacion apenas esta influido por el contenido por volumen del excipiente de la presente invencion.

Ejemplo experimental 2. Evaluacion de estabilidad (2)

10 Las composiciones acuosas lfquidas preparadas se almacenaron en una incubadora a 60°C durante 2 semanas. A continuacion, se midio el contenido del peptido oxidado, que era el peptido resultante de la oxidacion de un resto de metionina, de la misma manera que en la evaluacion de la estabilidad (1).

Entre las composiciones acuosas Ifquidas obtenidas en los ejemplos, ejemplos 23 a 27 descritos en las tablas 6 y 7 y el ejemplo comparativo 1 descrito en la tabla 10 se almacenaron a 60°C durante 2 semanas. Los contenidos de peptidos oxidados despues del almacenamiento se muestran en la Tabla 17. La relacion de inhibicion del producto oxidado en la tabla se calculo de la misma manera que en la evaluacion de estabilidad (1).

5 Tabla 17

contenido de peptido oxidado: relacion de inhibicion de producto oxidado

Ejemplo comparativo 1 (referencia): 39 0,2 mg/ml ninguno 1,39% -

Ejemplo 23: 23 0,2 mg/ml acido tartarico 1 mM + metionina 1 mM 0,31% 78%

Ejemplo 24: 24 0,2 mg/ml acido glutarico 50 mM + metionina 1 mM 0,29% 79%

Ejemplo 25: 25 0,2 mg/ml acido succmico 50 mM + metionina 1 mM 0,2 1 % 85%

Ejemplo 26: 26 0,2 mg/ml acido tartarico 10 mM + acido succmico 25 mM + metionina 1 mM 0,28% 80%

Ejemplo 27: 27 0,2 mg/ml acido tartarico 10 mM + metionina 200 mM 0 , 1 3 % 91%

Segun la tabla 17, al usar una combinacion de dos o mas tipos del excipiente en la presente invencion, pudo confirmarse que se obtema un efecto inhibidor mayor de la oxidacion en comparacion con la referencia.

Ejemplo experimental 3. Evaluacion de estabilidad (3)

Entre las composiciones acuosas lfquidas obtenidas en los ejemplos y ejemplos comparativos, ejemplo comparativo 19 descrito en la tabla 14 y ejemplo 37 descrito en la tabla 9 se almacenaron a 60°C durante 2 semanas. Los 15 contenidos de peptidos oxidados despues del almacenamiento se muestran en la Tabla 18. La relacion de inhibicion del producto oxidado en la tabla se calculo mediante la formula siguiente.

Relacion de inhibicion del producto oxidado (%) = {(contenido de peptido oxidado en la muestra de referencia (Ejemplo comparativo 19)) - (contenido de peptido oxidado en el ejemplo 37 en la Tabla 18)} * 100 /

20 (contenido de peptido oxidado en la muestra de referencia (Ejemplo

comparativo 19))

Un valor numerico mayor de la relacion de inhibicion del producto oxidado significa un efecto de inhibicion mayor para la oxidacion y un efecto estabilizador alto del excipiente para el peptido (1).

contenido de peptido oxidado: relacion de inhibicion de producto oxidado

Ejemplo comparativo 19 (referencia): 57 20 mg/ml ninguno 1,07% -

Ejemplo 37: 37 20 mg/ml metionina 200 mM 0,23% 79%

Segun la tabla 15 y la tabla 18, pudo confirmarse que el excipiente en la presente invencion presenta un efecto inhibidor de la oxidacion independientemente de la concentracion de peptido de la composicion acuosa Uquida.

5 Ejemplo experimental 4. Evaluacion de estabilidad (4)

Las composiciones acuosas lfquidas preparadas se almacenaron en una incubadora a 40°C durante 4 semanas. A continuacion, se midio el contenido del peptido oxidado, que era el peptido resultante de la oxidacion de un resto de metionina, de la misma manera que en la evaluacion de la estabilidad (1). Se utilizo una columna C18 de fase inversa (4,6 mm x 150 mm, 5 pm), y se usaron agua pura, acetonitrilo y acido trifluoroacetico para la fase movil.

10 Entre las composiciones acuosas lfquidas obtenidas en los ejemplos comparativos, ejemplos comparativos 20 a 23 descrito en la tabla 14 se almacenaron a 40°C durante 4 semanas. Los contenidos de peptidos oxidados despues del almacenamiento se muestran en la Tabla 19. La relacion de inhibicion del producto oxidado en la tabla se calculo mediante la formula siguiente.

Relacion de inhibicion del producto oxidado (%) = {(contenido de peptido 15 oxidado en la muestra de referencia (Ejemplo comparativo 20)) -

(contenido de peptido oxidado en el ejemplo comparativo en la Tabla 19)} x 100 / (contenido de peptido oxidado en la muestra de referencia (Ejemplo comparativo 209))

Un valor numerico mayor de la relacion de inhibicion del producto oxidado significa un efecto de inhibicion mayor 20 para la oxidacion y un efecto estabilizador alto del excipiente para el peptido (1).

Tabla 19

: composicion acuosa lfquida n° concentracion de peptidos excipiente 40°C, 4 semanas despues

contenido de peptido oxidado: relacion de inhibicion de producto oxidado

Ejemplo comparativo 20 (referencia): 58 20 mg/ml ninguno 0,47% -

Ejemplo comparativo 21: 59 20 mg/ml acido ascorbico al 0,1% 3,11% -562%

Ejemplo comparativo 22: 60 20 mg/ml tioglicolato de sodio al 0,1% 0,73% -55%

Ejemplo comparativo 23: 61 20 mg/ml pirosulfito de sodio al 0,1% 8,57% -1723%

Como se muestra en la tabla 19, se confirmo que la adicion de acido ascorbico, tioglicolato de sodio o pirosulfito de sodio, que son antioxidantes generalmente utilizados para formulaciones lfquidas, desestabiliza el peptido (1) en 25 comparacion con la referencia y aumenta un producto oxidado.

Ejemplo experimental 5. Confirmacion de la actividad inductora espedfica de CTL

Las composiciones acuosas lfquidas 36, 37 y 38 se mezclaron con adyuvantes para dar composiciones de vacuna

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

contra el cancer.

1) Preparacion de composiciones a1, a2 de la vacuna contra el cancer

Se uso como adyuvante incompleto de Freund. La composicion acuosa Kquida 36 se diluyo 1,7 veces con acido tartarico 10 mM sin peptido + solucion de metionina 50 mM. Se tomaron 450 pl de la mezcla anterior en una jeringuilla de vidrio (Top Corp.), y la jeringuilla se conecto con una articulacion a otra jeringuilla de vidrio que contema 450 pl de adyuvante a. El cilindro interno de ambas jeringuillas de vidrio se presiono alternativamente en su interior 30 veces o mas para emulsionar la solucion, con lo que se obtuvo la composicion de vacuna contra el cancer a1.

De forma similar, la composicion acuosa lfquida 38 se diluyo 1,7 veces con acido tartarico 10 mM sin peptidos + solucion de metionina 200 mM, y se proceso usando adyuvante a en las mismas condiciones para dar la composicion de la vacuna contra el cancer a2.

2) Preparacion de composiciones de la vacuna contra el cancer b1, b2

Oleato de etilo (96,5 g), monooleato de sorbitan (17,5 g), aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 10 (4,5 g), glicerina concentrada (1,5 g) y solucion acuosa 25 mM de fosfato monobasico de sodio (20,0 g) se recogen previamente en un vaso de precipitados de vidrio de 300 ml. A continuacion la mezcla se agito utilizando CLEAMIX CLM-1.5 (M Technique Co., Ltd.), a 10000 rpm durante 5 minutos para dar el adyuvante b.

A continuacion, se mezclaron 400pl de la composicion acuosa lfquida 37 y 930 pl de adyuvante b con un tubo de ensayo mezclador (Touch Mixer MT-51, Yamato Scientific Co., Ltd.) para dar la composicion de vacuna contra el cancer b1.

Ademas, se procesaron la composicion acuosa lfquida 38 y el adyuvante b en las mismas condiciones para dar la composicion de vacuna contra el cancer b2.

Preparacion de las composiciones de la vacuna contra el cancer c1, c2

Oleato de etilo (49,0 g), miristato de octildodecilo (49,0 g), monooleato de sorbitan (7,0 g), monooleato de glicerol (9,8 g), aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 20 (1,4 g), glicerina concentrada (1,4 g) y solucion acuosa de fosfato monobasico de sodio 25 mM (22,4 g) se cogieron en un vaso de precipitados alto de vidrio de 300 ml. A continuacion, se agito la mezcla a 10000 rpm durante 5 minutos usando CLEAMIX CLM-1.5 (M Tecnique Co., Ltd.) para obtener adyuvante c.

Luego, se mezclaron 400 pl de la composicion acuosa lfquida 36 y 930 pl de adyuvante c con un mezclador de tubos de ensayo (Touch Mixer MT-51, Yamato Scientific Co., Ltd.) para obtener una composicion de vacuna contra el cancer c1.

Ademas, la composicion acuosa lfquida 38 y el adyuvante se trataron en las mismas condiciones, para obtener la composicion de vacuna contra el cancer c2.

4) Evaluacion de la actividad productora de CTL

Se evaluo la capacidad productora espedfica de CTL de 6 tipos de composiciones (a1 - c2) de la vacuna contra el cancer preparada en los puntos 1) a 3) mencionados anteriormente utilizando ratones transgenicos HLA-A*0201 (Eur. J. Immunol.: 34, 3060, 2004).

Se administraron por via intradermica 100 pl de cada composicion de vacuna contra el cancer (600 pg como dosis de peptido) a ratones transgenicos HLA-A*0201 en la base de la cola. Se usaron 3 ratones por grupo. El bazo se aislo 7 dfas despues de la administracion y se prepararon los esplenocitos. Una parte de los esplenocitos se pulso con 100 pmol/l de peptido (1) durante 1 hora. La pulsacion implica que el peptido (1) se anadio a los esplenocitos para permitir la union del peptido antigenico al HLA en la superficie celular. Los esplenocitos sin pulsar con el peptido (1) y los esplenocitos mencionados anteriormente pulsados con peptidos se mezclaron, se sembraron en placas de 24 pocillos a razon de 7,8 * 106 celulas/pocillo y se cultivaron. En cuanto al medio de cultivo, se uso medio RPMI1640 enriquecido con FCS al 10%, HEPES 10 mM, L-glutamina 20 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoacidos no esenciales MEM 1 mM, vitaminas MEM al 1% y 2-mercaptoetanol 55 pM, y las celulas se cultivaron durante 5 dfas. Se determino la actividad de CTL espedfico del peptido administrado de los esplenocitos cultivados mediante el ensayo de liberacion de (J. Immunol.:159, 4753,1997). Para la expresion estable de HLA-A*0201 y la molecula MHC de clase I hnbrida H-2Db, se uso la celula HHD de la estirpe celular EL4 preparada en el Institut Pasteur por transferencia genica en estirpes celulares derivadas de linfoma de ratones (J. Exp. Med.:185, 2043,1997). Las celulas destinatarias estaban marcadas con 51Cr con 3,7 MBq/5*105 celulas durante 1 hora, el peptido anteriormente mencionado se anadio a 167 pmol/l y las celulas se pulsaron mas durante 1 h. Ademas, las celulas diana no pulsadas con el peptido (no pulsado) anteriormente mencionado se marcaron con 51Cr durante 2 horas para dar celulas diana de referencia. Las celulas diana marcadas y los esplenocitos previamente preparados se mezclaron en una proporcion 1:20, se cultivaron durante 4 horas y la actividad productora de CTL (es decir, la

citotoxicidad) se determino a partir de la proporcion de celulas diana lesionadas. Los resultados se muestran en la Fig. 1. La citotoxicidad se muestra por el valor medio de tres ratones por cada grupo de tratamiento.

Como se muestra en la Fig. 1, el grupo al que se administro la composicion de vacuna contra el cancer preparada usando la composicion acuosa lfquida de la presente invencion presentaba alta citotoxicidad contra las celulas 5 diana pulsadas con el peptido anteriormente mencionado, pero presentaba baja citotoxicidad contra celulas diana de referencia no pulsadas con el peptido anteriormente mencionado, lo que ha clarificado la produccion de CTL espedfico del peptido. Los resultados demuestran que la composicion acuosa lfquida de la presente invencion combinada con diversos adyuvantes activa la induccion de CTL espedfico para antigenos del cancer.

Preparacion de la composicion acuosa lfquida

10 Ejemplos 39-44, Ejemplo comparativo 24

El peptido (1) que es el peptido (A) como peptido, el acido tartarico, que es excipiente (C) como excipiente y la metionina como excipiente es (E) se disolvieron en agua para inyectables en las cantidades descritas en la tabla 20 y se ajustaron al pH descrito en la tabla 20 con acido clorddrico e hidroxido de sodio. La mezcla se filtro a traves de un filtro esterilizado de 0,2 pm, se lleno con 1 ml en un vial de vidrio y se sello el vial con un tapon de caucho de 15 butilo, con lo que se obtuvieron las composiciones acuosas lfquidas 62 a 68.

Tabla 20

: Ejemplo Ejemplo comparativo

39: 40 41 42 43 44 24

composicion acuosa lfquida n°: 62 63 64 65 66 67 68

peptido (1) [mg/ml]: 50 50 50 50 50 50 50

acido tartarico [mM]: 10 10 10 10 10 10 10

metionina [mM]: 200 200 200 200 200 200 200

acido clorddrico/hidroxido de sodio: c. s. c. s. c. s. c. s. c. s. c. s. c. s.

pH: 3,0 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 7,1

Ejemplo experimental 6. Evaluacion de la estabilidad (5)

Las composiciones acuosas lfquidas preparadas se almacenaron en una incubadora a 40°C durante 1 mes. A 20 continuacion, se determino el contenido de peptido (1) (en adelante contenido en peptido) basandose en el siguiente metodo.

Utilizando una columna C18 de fase inversa (4,6 mm x 150 mm, 3,5 pm) se determino el contenido en peptido por el metodo de cromatograffa lfquida de alta resolucion de sistema en fase inversa utilizando agua pura, acetonitrilo, metanol y acido trifluoroacetico para la fase movil. En cuanto al peptido (1), se inyecto una cantidad equivalente a 25 10 Mg, y se llevo a cabo la deteccion espectroscopica a una longitud de onda de 220 nm. Usando el area del pico medida por este metodo, se calculo el contenido de peptido (%) mediante la formula siguiente.

Contenido de peptido (%) = area del pico de peptido (1) / area total del pico de peptido que contiene sustancias relacionadas * 100

El contenido de peptido antes del almacenamiento (inicial) (%) se midio de la misma manera, y la proporcion residual 30 de peptido (%) se calculo mediante la formula siguiente.

Proporcion residual de peptidos (%) = contenido de peptidos despues del almacenamiento (%) / contenido de peptidos (inicial) (%) x 100

Entre las composiciones acuosas lfquidas obtenidas en los ejemplos y ejemplos comparativos, ejemplos 39 a 44 descritos en la tabla 20, y el ejemplo comparativo 24 descrito en la tabla 20 se almacenaron a 40°C durante 1 mes. 35 Las relaciones residuales de peptidos (%) se muestran en la tabla 21.

: composicion acuosa lfquida n° pH 40°C, 1 mes despues

relacion residual de peptido

Ejemplo 39: 62 3,0 97,4%

Ejemplo 40: 63 4,0 99,0%

Ejemplo 41: 64 4,5 99,2%

Ejemplo 42: 65 5,0 99,0%

Ejemplo 43: 66 5,5 98,5%

Ejemplo 44: 67 6,0 97,4%

Ejemplo comparativo 24: 68 7,1 92,5%

Como se muestra en la tabla 21, las composiciones acuosas Ifquidas con alta estabilidad que presentan la relacion residual no inferior al 97% se obtuvieron cuando el pH estaba comprendido en el intervalo de 3 a 6. Por otra parte,

5 la relacion residual de peptidos disminuyo cuando el pH era 7,1.

Ejemplo experimental 7. Evaluacion de la estabilidad (6)

Las composiciones acuosas lfquidas preparadas se almacenaron en una incubadora a 40°C durante 4 semanas. El contenido de peptidos oxidados despues del almacenamiento se determino de la misma manera que en la evaluacion de la estabilidad (1).

10 Entre las composiciones acuosas lfquidas obtenidas en los ejemplos y ejemplos comparativos, el ejemplo 34 descrito en la tabla 8 y los ejemplos comparativos 15, 16 descritos en la tabla 13 se almacenaron a 40°C durante 4 semanas. Los contenidos de peptidos oxidados despues del almacenamiento se muestran en la tabla 22. La relacion de inhibicion del producto oxidado en la tabla se calculo mediante la siguiente formula.

Relacion de inhibicion de producto oxidado (%) = {(contenido de peptido oxidado 15 en muestra de referencia (Ejemplo comparativo 15)) - (contenido de peptido

oxidado en el Ejemplo 34 en la Tabla 8 o Ejemplo comparativo 16 en la Tabla 13)} x 100 / (contenido de peptido oxidado en muestra de referencia (Ejemplo comparativo 15))

El mayor valor numerico de la relacion de inhibicion del producto oxidado significa un efecto de inhibicion mayor para 20 la oxidacion, y un gran efecto estabilizador del peptido (1).

Tabla 22

contenido de peptido oxidado: relacion de inhibicion de producto oxidado

Ejemplo comparativo 15 (referencia): 53 0,01 mg/ml ninguno 2,37% -

Ejemplo 34: 34 0,01 mg/ml acido malico 1 mM 0,90% 62%

Ejemplo comparativo 16: 54 0,01 mg/ml fosfato monobasico de sodio 1 mM 2,15% 9%

Como se muestra en la Tabla 22, pudo confirmarse que el excipiente en la presente invencion presenta un efecto

inhibidor incluso cuando la concentracion de peptidos de la composicion acuosa Uquida es baja.

Preparacion de la composicion acuosa Ifquida Ejemplo 45, ejemplo comparativo 25

Como en el ejemplo 1, en las cantidades descritas en la Tabla 23 se prepararon, se llenaron en viales y los viales se 5 sellaron con un tapon de caucho de butilo, con lo que se obtuvieron las composiciones acuosas lfquidas 69 y 70.

Tabla 23

: Ejemplo Ejemplo comparativo

45: 25

composicion acuosa lfquida n°: 69 70

peptido (1) [mg/ml]: 50 50

acido tartarico [mM]: 100 -

fosfato monobasico de sodio [mM]: - 100

acido clortndrico/hidroxido de sodio: c. s. c. s.

pH: 4,5 4,5

Ejemplo de Ensayo 8. Evaluacion de estabilidad (7)

Se anadieron 100 |jl de agua oxigenada H2O2 al 0,3% a 1 ml de la composicion acuosa lfquida preparada. Despues 10 de la mezcla se agito ligeramente, el contenido de peptido oxidado que era el peptido resultante de la oxidacion de un resto de metionina, se midio inmediatamente. El contenido de peptido oxidado se midio utilizando un metodo similar al de la evaluacion de estabilidad (1).

Entre las composiciones acuosas lfquidas obtenidas en los ejemplos y ejemplos comparativos, los contenidos de peptidos oxidados (%) despues de anadir 100 ml de H2O2al 0,3% a 1 ml de cada uno de los ejemplos comparativos 15 17 y 18 descritos en la tabla 13, ejemplo 45 y ejemplo comparativo 25 descritos en la tabla 23, y ejemplo 35 descrito en la tabla 8 se muestran en la Tabla 24. La relacion de inhibicion del producto oxidado en la tabla se calculo mediante la formula siguiente.

Relacion de inhibicion del producto oxidado (%) = {(contenido de peptido oxidado en muestra de referencia (Ejemplo comparativo 17)) - (contenido de peptido 20 oxidado en el ejemplo o ejemplo comparativo en la tabla 13, tabla 23 o tabla 8)} *

100 / (contenido de peptido oxidado en muestra de referencia (Ejemplo comparativo 17))

Un valor numerico mayor de la relacion de inhibicion de producto oxidado significa un mayor efecto inhibidor de la oxidacion, y un alto efecto estabilizador del excipiente para el peptido (1).

25 Tabla 24

: composicion acuosa lfquida n° concentracion de peptidos excipiente despues de adicion de peroxido de hidrogeno

contenido de peptido oxidado: relacion de inhibicion de producto oxidado

Ejemplo comparativo 17 (referencia): 55 50 mg/ml ninguno 6,59% -

Ejemplo 35: 35 50 mg/ml acido tartarico 10 mM 5,07% 23%

contenido de peptido oxidado: relacion de inhibicion de producto oxidado

Ejemplo 45: 69 50 mg/ml acido tartarico 100 mM 5,43% 18%

Ejemplo comparativo 18: 56 50 mg/ml fosfato monobasico de sodio 10 mM 6,20% 5,9%

Ejemplo comparativo 25: 70 50 mg/ml fosfato monobasico de sodio 100 mM 6,89% -4,6%

Como se muestra en la Tabla 24, pudo confirmarse que el excipiente en la presente invencion presenta un efecto inhibidor incluso cuando la concentracion de peptidos de la composicion acuosa Uquida es alta.

Ejemplo experimental 9. Evaluacion de la estabilidad (8)

5 Entre las composiciones acuosas Kquidas preparadas, se anadieron 100 pl de H2O2 al 0,3% a 1 ml de cada una de las composiciones acuosas lfquidas del ejemplo comparativo 20 descrito en la tabla 14, y los ejemplos 36, 37 y 38 descritos en la tabla 9. Despues la mezcla se agito ligeramente, el contenido de peptido oxidado, que era el peptido resultante de la oxidacion de un resto de metionina, se midio inmediatamente. El contenido de peptido oxidado se midio utilizando un metodo similar al de la evaluacion de estabilidad (1).

10 Entre las composiciones acuosas lfquidas obtenidas en los ejemplos y ejemplos comparativos, los contenidos de peptidos oxidados (%) despues de anadir 100 pl de H2O2 al 0,3% a 1 ml de cada uno del ejemplo comparativo 20 descrito en la tabla 14, y los ejemplos 36, 37 y 38 descritos en la tabla 9 se presentan en la tabla 25. La relacion de inhibicion del producto oxidado en la tabla se calculo por la formula siguiente.

Relacion de inhibicion del producto oxidado (%) = {(contenido de peptido oxidado 15 en muestra de referencia (Ejemplo comparativo 20)) - (contenido de peptido

oxidado en el ejemplo en la tabla 9)} * 100 / (contenido de peptido oxidado en muestra de referencia (ejemplo comparativo 20))

20 Tabla 25

contenido de peptido oxidado: relacion de inhibicion de producto oxidado

Ejemplo comparativo 20 (referencia): 58 20 mg/ml ninguno 5,08% -

Ejemplo 36: 36 20 mg/ml acido tartarico 10 mM + metionina 50 mM 3,63% 29%

Ejemplo 37: 37 20 mg/ml metionina 200 mM 2,28% 55%

Ejemplo 38: 38 20 mg/ml acido tartarico 10 mM + metionina 200 mM 1,41% 72%

Como se muestra en la tabla 25, pudo confirmarse que las composiciones lfquidas acuosas de los Ejemplos 36, 37 y

5

10

15

20

25

30

35

38, que se confirmo que presentan una actividad productora de CTL en el ejemplo experimental 5, mostraron un efecto inhibidor de la oxidacion.

Aplicacion industrial

Segun la presente invencion, puede proporcionarse una composicion acuosa Ifquida que comprende un peptido antigenico del cancer derivado de la protema WT1, y el peptido puede combinarse facilmente con varios adyuvantes segun el proposito de uso.

Listado de secuencias

<110> Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.

<120> Composicion acuosa Kquida

<130> 092151

<150> US 61/777.423 <151> 2013-03-12

<160>7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5

<210>2 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>2

Claims

5

10

15

20

25

30

35

REIVINDICACIONES

1. Una composicion acuosa Ifquida que comprende un peptido y un excipiente y que tiene un pH de 3 a 6:

en donde

el peptido se selecciona del grupo que consiste en los siguientes puntos (A) y (B),

(A) un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos representada por Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro- Tyr-Leu (SEQ. ID. n°: 1), y

(B) un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por la SEQ. ID. n°: 1 en la que de 1 a 3 aminoacidos estan suprimidos, sustituidos y/o anadidos, y que tiene la capacidad para producir linfocitos T citotoxicos, y

el excipiente comprende tanto el punto (C) como el (E) siguientes y opcionalmente comprende el punto (D) siguiente,

(C) uno o mas tipos de acidos alfa-hidroxiacidos seleccionados de entre el grupo que consiste en acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico, acido dtrico, y sus sales farmacologicamente aceptables,

(D) uno o mas tipos de acidos dicarboxflicos seleccionados de entre el grupo que consiste en acido malonico, acido succmico, acido glutarico, acido maleico y sus sales farmacologicamente aceptables, y

(E) metionina,

en donde el contenido por volumen de alfa-hidroxiacido es de 1-100 mM, y el contenido por volumen de metionina es de 1-300 mM.
2. La composicion acuosa lfquida segun la reivindicacion 1, en donde el peptido consiste en la secuencia de aminoacidos representada por (A) Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ. ID. n°: 1).
3. La composicion acuosa lfquida segun la reivindicacion 1 o 2, en donde el excipiente comprende tanto (D) como (E), y (D) es uno o mas tipos de acidos dicarboxflicos seleccionados del grupo que consiste en acido succmico y sus sales farmacologicamente aceptables.
4. La composicion lfquida acuosa segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el contenido por volumen de acido carboxflico es de 10 a 100 mM.
5. Un procedimiento para mejorar la estabilidad de un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos representada por Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ. ID. n°: 1), en una composicion lfquida acuosa al anadir un excipiente:

en donde

el excipiente comprende ambos puntos (C) y (E) siguientes, y opcionalmente comprende el punto (D) siguiente,

(C) uno o mas tipos de alfa-hidroxiacidos seleccionados del grupo que consiste en acido glicolico, acido lactico, acido malico, acido tartarico, acido dtrico y sus sales farmacologicamente aceptables,

(D) uno o mas tipos de acidos dicarboxflicos seleccionados del grupo que consiste en acido malonico, acido succmico, acido glutarico, acido maleico y sus sales farmacologicamente aceptables, y

(E) metionina,

en donde el contenido por volumen de alfa-hidroxiacido es de 1 a 100 mM, el contenido por volumen de metionina es de 1 a 300 mM y la composicion final tiene un pH de 3 a 6.

cti to t oxi ai dad (%)

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