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ES2693019T3 - Derivados de bencimidazol y composiciones farmacéuticas de los mismos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias - Google Patents

Derivados de bencimidazol y composiciones farmacéuticas de los mismos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias Download PDF

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ES2693019T3
ES2693019T3 ES15701945.6T ES15701945T ES2693019T3 ES 2693019 T3 ES2693019 T3 ES 2693019T3 ES 15701945 T ES15701945 T ES 15701945T ES 2693019 T3 ES2693019 T3 ES 2693019T3
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ES
Spain
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compound
methyl
pharmaceutically acceptable
mixture
int
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Active
Application number
ES15701945.6T
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English (en)
Inventor
Christel Jeanne Marie Menet
Oscar MAMMOLITI
Javier Blanc
Mislav Orsulic
Maja Roscic
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Galapagos NV
Original Assignee
Galapagos NV
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Publication date
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Abstract

Un compuesto de acuerdo con la Fórmula I:**Fórmula** en la que, R1 es H, o Me; L1 es -NR2-; -O-, o -CH2-; Cy es fenilo, o heteroarilo monocíclico o bicíclico fusionado de 5-9 miembros que comprende de 1 a 4 heteroátomos independientemente seleccionados entre N, O, y S; R2 es H, o alquilo C1-4; R3 es H, halo, alquilo C1-4 opcionalmente sustituido con uno o más halo, o alcoxi C1-4 opcionalmente sustituido con uno o más halo; R4 es H o halo; R5 es -CN, halo o es -L2-R6 -L2 está ausente, o es -C(>=O)-, -C(>=O)NR7, -NR7C(>=O)-, -SO2-, -SO2NR7, o -NR7SO2-; R6 es H, o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con uno o más grupos R8 independientemente seleccionados; R7 es H, o alquilo C1-4; R8 es OH, CN, halo, o alcoxi C1-4, La está ausente, o es -C(>=O)-, -C(>=O)O- o -C(>=O)NH-; Ra es: * H, * alquilo C1-4 opcionalmente sustituido con uno o más Rb independientemente seleccionados, * cicloalquilo C3-7 monocíclico opcionalmente sustituido con uno o más Rc independientemente seleccionados, o * heterocicloalquilo monocíclico de 4-7 miembros que comprende uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de O, N, y S, o * heteroarilo monocíclico de 5-6 miembros que comprende uno o más heteroátomos independientemente seleccionados entre O, N, y S; Rb es * halo, * CN, * OH, * alcoxi C1-4, * cicloalquilo C3-7, * heterocicloalquilo monocíclico de 4-7 miembros que comprende uno o más heteroátomos independientemente seleccionados entre O, N, y S (heterocicloalquilo está opcionalmente sustituido con uno o más independientemente seleccionados entre halo, u oxo), * -SO2-alquilo C1-4, o * -C(>=O)NRb1Rb2 Rc es * halo, * CN, * OH, * alquilo C1-4, * -C(>=O)OH, o * -C(>=O)NRc1Rc2 ; y cada Rb1, Rb2, Rc1 y Rc2 se selecciona independientemente entre H, y alquilo C1-4, o una sal farmacéuticamente aceptable, o un solvato, o un solvato de la sal farmacéuticamente aceptable.

Description

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DESCRIPCION
Derivados de bencimidazol y composiciones farmaceuticas de los mismos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a compuestos que son inhibidores de JAK, una familia de tirosina quinasas que estan implicadas en enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambiodel cartflago, malformaciones congenitas del cartflago y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o hipersecrecion de interferones. En particular, los compuestos de la invencion inhiben JAK1 y/o TYK2, La presente invencion tambien proporciona metodos para la produccion de los compuestos de la invencion, composiciones farmaceuticas que comprenden los compuestos de la invencion, y describe metodos para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades que implican enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del carfflago, y/o enfermedades asociadas con hipersecrecion de IL6 o hipersecrecion de interferones al administrar un compuesto de la invencion.
Antecedentes de la invencion
Las janus quinasas (JAK) son tirosina quinasas citoplasmaticas que transducen la senalizacion de citoquinas desde los receptores de membrana a los factores de transcripcion STAT. Se describen cuatro miembros de la familia JAK, JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2, Despues de la union de la citoquina con su receptor, los miembros de la familia JAK se autotransfosforilan y/o transfosforilan entre sf, seguido por la fosforilacion de STAT que, a continuacion, migran al nucleo para modular la transcripcion. La transduccion de la senal intracelular JAK-STAT sirve a los interferones, la mayona interleucinas, asf como a una variedad de citoquinas y factores endocrinos, tales como EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM-CSF y PRL (Vainchenker et al., 2008).
La combinacion de modelos geneticos y la investigacion de inhibidores de JAK de molecula pequena revelaron el potencial terapeutico de varias JAK. La JAK3 es validada por la genetica del raton y del ser humano como un objetivo de inmunosupresion. (O'Shea et al., 2004). Los inhibidores de JAK3 se incorporaron con exito en el desarrollo clmico, inicialmente para el rechazo de trasplante de organos, pero tambien en otras enfermedades inmunoinflamatorias, tales como la artritis reumatoide (RA), la psoriasis y la enfermedad de Crohn (
http://clinicaltrials.gov/).
La TYK2 es un objetivo potencial para las enfermedades inmunoinflamatorias, siendo validado por la genetica humana y los estudios de inactivacion en ratones (Levy y Loomis, 2007).
La JAK1 es un objetivo en el area de las enfermedades inmunoinflamatorias. La JAK1 se heterodimeriza con las otras JAK para transducir la senalizacion proinflamatoria impulsada por citoquinas. Por lo tanto, la inhibicion de JAK1 es de interes para las enfermedades inmunoinflamatorias con citoquinas asociadas a la patologfa, que usan la senalizacion de JAK1, tal como IL-6, IL-4, IL-5, IL-13, o IFNgamma, asf como para otras enfermedades impulsadas por la transduccion de senales mediadas por JAK.
La degeneracion del cartflago es la marca distintiva de diversas enfermedades, entre las que destacan la artritis reumatoide y la osteoartritis. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad degenerativa cronica de las articulaciones, que se caracteriza por inflamacion y destruccion de las estructuras articulares. Cuando la enfermedad no se controla, produce una discapacidad y dolor sustanciales debido a la perdida de funcionalidad de las articulaciones e incluso a la muerte prematura. El objeto de una terapia de AR, por lo tanto, no es solo retrasar la enfermedad, sino lograr la remision con el fin de detener la destruccion de las articulaciones. Ademas de la gravedad del desenlace de la enfermedad, la alta prevalencia de la AR (~ 0,8% de los adultos se ven afectados en todo el mundo) significa un alto impacto socioeconomico (Choy y Panayi, 2001; Firestein, 2003; Lee y Weinblatt, 2001; O'Dell, 2004; Smolen y Steiner, 2003).
JAK1 y JAK2 estan implicadas en la transduccion de senal intracelular para muchas citoquinas y hormonas. Las patologfas asociadas con cualquiera de estas citoquinas y hormonas se pueden mejorar con los inhibidores de JAK1 y JAK2, Por lo tanto, varias afecciones alergicas o inflamatorias y enfermedades autoinmunes se podnan beneficiar del tratamiento con los compuestos descritos en esta invencion que incluyen artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, artritis idiopatica juvenil, osteoartritis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, fibrosis tisular, inflamacion eosinofflica, esofagitis, enfermedades inflamatorias del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), trasplantes, enfermedad de injerto contra huesped, psoriasis, miositis, esclerosis multiple. (Kopf et al., 2010).
La osteoartritis (tambien conocida como OA o artritis por desgaste) es la forma mas comun de artritis y se caracteriza por la perdida de cartflago articular, a menudo asociada con la hipertrofia del hueso y el dolor (Wieland et al., 2005).
La osteoartritis es diffcil de tratar. Actualmente, no hay cura disponible y el tratamiento se enfoca en aliviar el dolor y evitar que la articulacion afectada se deforme. Los tratamientos comunes incluyen el uso de medicamentos
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antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Aunque se han recomendado suplementos dieteticos tales como la condroitina y el sulfato de glucosamina como opciones seguras y eficaces para el tratamiento de la osteoartritis, un ensayo clmico reciente revelo que ninguno de los dos tratamientos redujo el dolor asociado con la osteoartritis (Clegg et al., 2006).
La estimulacion de los procesos anabolicos, el bloqueo de los procesos catabolicos, o una combinacion de estos dos, puede dar como resultado la estabilizacion del carfflago, y quizas incluso la reversion del dano y, por lo tanto, prevenir una mayor progresion de la enfermedad. Se han desarrollado metodos terapeuticos para la correccion de las lesiones del cartflago articular que aparecen durante la enfermedad osteoartntica, pero hasta ahora ninguno de ellos ha sido capaz de mediar en la regeneracion del cartflago articular in situ e in vivo. Tomados en conjunto, no hay medicamentos osteoartnticos modificadores de la enfermedad disponibles.
Vandeghinste et al. (Vandeghinste et al., 2005) descubrieron la JAK1 como un objetivo cuya inhibicion podna tener relevancia terapeutica para varias enfermedades, incluida la AO. La inactivacion del gen JAK1 en ratones demostro que la JAK1 desempena papeles esenciales y no redundantes durante el desarrollo: los ratones JAK1-/- murieron dentro de las 24 horas despues del nacimiento y el desarrollo de linfocitos se vio gravemente afectado. Ademas, las celulas JAK1-/- no fueron reactivas, o menos reactivas, a las citoquinas que usan receptores de citoquinas de clase II, receptores de citoquinas que usan la subunidad gamma-c para la senalizacion y la familia de receptores de citoquinas que usan la subunidad gp130 para la senalizacion (Rodig et al., 1998).
Varios grupos han relacionado la senalizacion de JAK-STAT con la biologfa de los condrocitos. Li et al. (Li et al., 2001) demostraron que la oncostatina M induce la expresion de los genes MMP y TIMP3 en condrocitos primarios mediante la activacion de las vfas de senalizacion JAK/STAT y MAPK. Osaki et al., (Osaki et al., 2003) mostraron que la inhibicion del colageno II mediada por interferon-gamma en los condrocitos implica la senalizacion de JAK-STAT. IL1- beta induce el catabolismo del cartflago al reducir la expresion de los componentes de la matriz, y al inducir la expresion de las colagenasas y oxido mtrico sintasa inducible (NOS2), que interviene en la produccion de oxido mtrico (NO). Otero et al., (Otero et al., 2005) mostraron que la leptina y la IL1-beta indujeron sinergicamente la produccion de NO o la expresion del ARNm de NOS2 en condrocitos, y que las mismas fueron bloqueadas por un inhibidor de JAK. Legendre et al., (Legendre et al., 2003) mostraron que IL6/receptor IL6 indujo la regulacion a la baja del colageno II en genes espedficos de la matriz de cartflago, nucleo de agrecano y protema de enlace en condrocitos articulares bovinos, y que esto estaba mediado por la senalizacion JAK/STAT. Por lo tanto, estas observaciones sugieren un papel para la actividad de la quinasa JAK en la homeostasis del cartflago y las oportunidades terapeuticas para los inhibidores de la quinasa JAK.
Los miembros de la familia JAK se han relacionado con afecciones adicionales, que incluyen trastornos mieloproliferativos (O'Sullivan et al., 2007), en donde se han identificado mutaciones en jAK2, Esto indica que los inhibidores de JAK, en particular JAK2, tambien pueden ser utiles en el tratamiento de trastornos mieloproliferativos. Ademas, la familia JAK, en particular JAK1, JAK2 y JAK3, se ha relacionado con canceres, en particular, leucemias, por ejemplo, leucemia mieloide aguda (O'Sullivan et al., 2007; Xiang et al., 2008) y leucemia linfoblastica aguda (Mullighan et al., 2009) o tumores solidos, por ejemplo, leiomiosarcoma uterino (Constantinescu et al., 2008), cancer de prostata (Tam et al., 2007). Estos resultados indican que los inhibidores de JAK, en particular de JAK1 y/o JAK2, tambien pueden tener utilidad en el tratamiento de canceres (leucemias y tumores solidos, por ejemplo, leiomiosarcoma uterino, cancer de prostata).
Ademas, la enfermedad de Castleman, el mieloma multiple, la glomerulonefritis mesangial proliferativa, la psoriasis y el sarcoma de Kaposi probablemente se deben a la hipersecrecion de la citoquina IL-6, cuyos efectos biologicos estan mediados por la senalizacion JAK-STAT intracelular (Naka et al., 2002). Este resultado muestra que los inhibidores de JAK tambien pueden encontrar utilidad en el tratamiento de dichas enfermedades.
Los documentos de patente WO 2012/044090 y EP 2226315 describen compuestos de quinazolina como inhibidores de protema quinasa.
Las terapias actuales no son satisfactorias y, por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de identificar otros compuestos que puedan ser utiles en el tratamiento de enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del cartflago, y/o enfermedades asociadas con hipersecrecion de IL6 o hipersecrecion de interferones. Por lo tanto, la presente invencion proporciona compuestos, metodos para su produccion y composiciones farmaceuticas que comprenden los compuestos de la invencion junto con un vehmulo farmaceutico adecuado. La presente invencion tambien proporciona el uso de un compuesto de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del cartflago, y/o enfermedades asociadas con hipersecrecion de IL6 o hipersecrecion de interferones.
Sumario de la invencion
La presente invencion se basa en el descubrimiento de que los compuestos de la invencion pueden actuar como inhibidores de JAK y que son utiles para el tratamiento de enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias,
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enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del cartflago y/o enfermedades asociadas con hipersecrecion de IL6 o hipersecrecion de interferones. En un aspecto espedfico, los compuestos de la invencion son inhibidores de JAK1 y/o TYK2, La presente invencion tambien proporciona metodos para la produccion de estos compuestos, composiciones farmaceuticas que comprenden estos compuestos y describe metodos para tratar enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del cartflago y/o enfermedades asociadas con hipersecrecion de IL6 o hipersecrecion de interferones al administrar un compuesto de la invencion.
Por consiguiente, en un primer aspecto de la invencion, los compuestos de la invencion se proporcionan de acuerdo con la Formula (I):
imagen1
en la que,
R1 es H, o Me;
Li es -NR2-; -O-, o -CH2-;
Cy es fenilo, o heteroarilo monodclico o bidclico fusionado de 5-9 miembros que comprende de 1 a 4 heteroatomos independientemente seleccionados entre N, O, y S;
R2 es H, o alquilo C1-4;
R3 es H, halo, alquilo C1-4 opcionalmente sustituido con uno o mas halo, o alcoxi C1-4 opcionalmente sustituido con uno o mas halo;
R4 es H o halo;
R5 es -CN, halo o es -L2-R6
-L2 esta ausente, o es -C(=O)-, -C(=O)NR7, -NR7C(=O)-, -SO2-, -SO2NR7, o -NR7SO2-;
R6 es H, o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con uno o mas grupos R8 independientemente seleccionados;
R7 es H, o alquilo C1-4;
R8 es OH, CN, halo, o alcoxi C1-4,
La esta ausente, o es -C(=O)-, -C(=O)O- o -C(=O)NH-;
Ra es:
• H,
• alquilo C1-4 opcionalmente sustituido con uno o mas Rb independientemente seleccionados,
• cicloalquilo C3-7 monodclico opcionalmente sustituido con uno o mas Rc independientemente seleccionados, o
• heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados de O, N, y S, o
• heteroarilo monodclico de 5-6 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N, y S;
Rb es
• halo,
• CN,
• OH,
• alcoxi C1-4,
• cicloalquilo C3-7,
• heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N, y S (heterocicloalquilo esta opcionalmente sustituido con uno o mas independientemente seleccionados entre halo, u oxo),
• -SO2-alquilo C1-4, o
• -C(=O)NRb1Rb2
Rc es
• halo,
• CN,
• OH,
• alquilo C1-4,
• -C(=O)OH, o
• -C(=O)NRc1Rc2; y
cada Rb1, Rb2, Rc1 y Rc2 se selecciona independientemente entre H, y alquilo C1-4,
En una realizacion particular, los compuestos de la invencion son inhibidores de JAK1 y/o TYK2,
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Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que los compuestos de la invencion pueden mostrar una actividad in vitro mejorada cuando se comparan con analogos estrechamente relacionados.
Ademas, en un aspecto particular, los compuestos de la invencion pueden mostrar una estabilidad in vitro mejorada, cuando se comparan con analogos estrechamente relacionados. Esta mejora puede dar como resultado in vivo en una dosificacion mas baja del farmaco que se requiere, y por lo tanto puede dar como resultado una menor toxicidad y/o interaccion farmaco-farmaco.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden los compuestos de la invencion, y un vetnculo, excipiente o diluyente farmaceutico. Ademas, los compuestos de la invencion, utiles en las composiciones farmaceuticas y los metodos de tratamiento descritos en la presente memoria, son farmaceuticamente aceptables como se preparan y se usan. En este aspecto de la invencion, la composicion farmaceutica puede comprender adicionalmente ingredientes activos adicionales adecuados para uso en combinacion con los compuestos de la invencion.
En un aspecto adicional, la invencion proporciona un compuesto de la invencion o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion para uso como un medicamento. En una realizacion espedfica, dicha composicion farmaceutica comprende adicionalmente un ingrediente activo adicional.
En un aspecto adicional, se describe un metodo para tratar a un marnffero susceptible a, o afectado por, una afeccion de entre las enumeradas en la presente memoria, y particularmente, una afeccion que puede estar asociada con una actividad aberrante de JAK, por ejemplo, enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican alteraciones en el recambio cartilaginoso, malformaciones congenitas del cartflago y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o hipersecrecion de interferones, cuyo metodo comprende administrar una cantidad eficaz de la composicion o compuesto farmaceutico de la invencion como se describe en la presente memoria. En un aspecto espedfico, la afeccion se asocia con una actividad aberrante de JAK1 y/o TYK2,
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion para usar en el tratamiento o la profilaxis de una afeccion seleccionada de entre las enumeradas en la presente memoria, particularmente las afecciones que se pueden asociar con la actividad aberrante de JAK, por ejemplo, enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del cartflago y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o la hipersecrecion de interferones.
En otro metodo mas del aspecto de tratamiento, se describe un metodo para tratar un marnffero susceptible a, o afectado por, una afeccion que esta causalmente relacionada con la actividad anormal de JAK como se describe en la presente memoria, y comprende administrar una cantidad eficaz de tratamiento del estado o composicion farmaceutica o un compuesto de la invencion descrito en la presente memoria. En un aspecto espedfico, la afeccion esta causalmente relacionada con la actividad anormal de JAK1 y/o TYK2,
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion, para uso como un medicamento.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion para uso en el tratamiento o la profilaxis de una afeccion que esta causalmente relacionada con la actividad anormal de JAK.
En aspectos adicionales, esta invencion proporciona metodos para sintetizar los compuestos de la invencion, con protocolos sinteticos representativos y rutas descritas mas adelante en la presente memoria.
Por consiguiente, es un objeto principal de esta invencion proporcionar nuevos compuestos, que pueden modificar la actividad de JAK y asf prevenir o tratar cualquier afeccion que pueda estar causalmente relacionada con la misma. En un aspecto espedfico, los compuestos de la invencion modulan la actividad de JAK1 y/o TYK2,
Es un objeto adicional de esta invencion proporcionar compuestos que pueden tratar o aliviar afecciones o smtomas de la misma, tales como enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del cartflago, y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o la hipersecrecion de interferones, que pueden estar causalmente relacionadas con la actividad de JAK, en particular JAK1 y/o TYK2,
Otro objeto mas de esta invencion es proporcionar una composicion farmaceutica que se puede usar en el tratamiento o profilaxis de una variedad de afecciones, que incluyen las enfermedades asociadas con la actividad de JAK tales como enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del cartflago y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o la hipersecrecion de interferones. En una realizacion espedfica, la enfermedad esta asociada con la actividad de JAK1 y/o TYK2,
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Otros objetos y ventajas seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de una consideracion de la siguiente descripcion detallada.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
Los siguientes terminos y expresiones pretenden tener los significados que se presentan a continuacion y son utiles para comprender la descripcion y el alcance previsto de la presente invencion.
Cuando se describe la invencion, que puede incluir compuestos, composiciones farmaceuticas que contienen dichos compuestos y metodos para usar dichos compuestos y composiciones, los siguientes terminos, si estan presentes, tienen los siguientes significados, a menos que se indique lo contrario. Tambien debe entenderse que cuando se describe en la presente memoria cualquiera de los restos definidos mas adelante puede estar sustituido por una variedad de sustituyentes, y que las definiciones respectivas pretenden incluir dichos restos sustituidos dentro de su alcance como se establece a continuacion. A menos que se indique lo contrario, el termino "sustituido" se debe definir como se establece a continuacion. Debe entenderse ademas que los terminos "grupos" y "radicales" se pueden considerar intercambiables cuando se usan en la presente memoria.
El termino “alquilo” significa hidrocarburo alifatico lineal o ramificado con la cantidad de atomos de carbono especificada. Particularmente, los grupos alquilo tienen de 1 a 8 atomos de carbono. Mas particularmente, es alquilo inferior el que tiene de 1 a 6 atomos de carbono. Un grupo particular adicional tiene de 1 a 4 atomos de carbono. Los ejemplos de grupos de cadena lineal incluyen metilo, etilo n-propilo, y n-butilo. Ramificado significa que uno o mas grupos alquilo inferior tales como metilo, etilo, propilo o butilo estan unidos a una cadena de alquilo lineal, los ejemplos de los grupos de cadena ramificada incluyen isopropilo, isobutilo, t-butilo e isoamilo.
El termino “alcoxi” se refiere al grupo -OR26, en donde R26 es alquilo con el numero de atomos de carbono especificado. Particularmente, los grupos alcoxi son metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, terc-butoxi, sec-butoxi, n-pentoxi, n-hexoxi y 1,2-dimetilbutoxi. Particularmente, los grupos alcoxi son alcoxilo inferior, es decir, con entre 1 y 6 atomos de carbono. Otros grupos alcoxi en particular, tienen entre 1 y 4 atomos de carbono.
El termino “alquenilo” se refiere a grupos de hidrocarburos monovalentes olefrnicamente (insaturados) con el numero de atomos de carbono especificado. Particularmente, el alquenilo tiene de 2 a 8 atomos de carbono, y mas particularmente, de 2 a 6 atomos de carbono, que puede ser de cadena lineal o ramificada y que tiene al menos 1 y particularmente de 1 a 2 sitios de insaturacion olefrnica. Los grupos alquenilo, en particular, incluyen etenilo (- CH=CH2), n-propenilo (-CH2CH=CH2), isopropenilo (-C(CH3)=CH2) y similares.
El termino “amino” se refiere al radical -NH2,
El termino "arilo" se refiere a un grupo hidrocarburo aromatico monovalente derivado por la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un unico atomo de carbono de un sistema de anillo aromatico precursor. En particular, arilo se refiere a una estructura de anillo aromatico, monodclica o polidclica fusionada, con el numero de atomos del anillo especificado. Espedficamente, el termino comprende grupos que incluyen de 6 a 10 miembros del anillo. Cuando el grupo arilo es un sistema de anillo monodclico, contiene preferiblemente 6 atomos de carbono. Particularmente, los grupos arilo incluyen fenilo y naftilo.
El termino "cicloalquilo" se refiere a una estructura de anillo hidrocardlico no aromatico, monodclica, polidclica fusionada, polidclica puenteada o espirodclica, con el numero de atomos en el anillo especificado. Un cicloalquilo puede tener de 3 a 12 atomos de carbono, en particular de 3 a 10, y mas particularmente de 3 a 7 atomos de carbono. Dichos grupos cicloalquilo incluyen, a modo de ejemplo, estructuras de anillo unico tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo.
El termino “ciano” se refiere al radical -CN.
El termino “halo” o “halogeno” se refiere a fluoro (F), cloro (Cl), bromo (Br) y yodo (I). Los grupos halo particulares son fluor o cloro.
El termino “hetero” cuando se usa para describir un compuesto o grupo presente en un compuesto significa que uno o mas atomos de carbono en el compuesto o grupo han sido reemplazados por un heteroatomo de nitrogeno, oxfgeno o azufre. El termino hetero se puede aplicar a cualquiera de los grupos hidrocarbilo descritos anteriormente, tal como alquilo, por ejemplo, heteroalquilo, cicloalquilo, por ejemplo, heterocicloalquilo, arilo, por ejemplo, heteroarilo, y similares que tienen de 1 a 4, y particularmente de 1 a 3 heteroatomos, mas tfpicamente 1 o 2 heteroatomos, por ejemplo, un solo heteroatomo.
El termino "heteroarilo" significa una estructura de anillo aromatico, monodclica o polidclica fusionada, que incluye uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N y S y el numero de atomos del anillo especificado. En particular, la estructura de anillo aromatico puede tener de 5 a 9 miembros de anillo. El grupo heteroarilo puede ser, por ejemplo, un anillo monodclico de cinco miembros o seis miembros o una estructura bidclica
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fusionada formada por anillos de cinco y seis miembros fusionados o dos anillos de seis miembros fusionados o, a modo de ejemplo adicional, dos anillos de cinco miembros fusionados. Cada anillo puede contener hasta cuatro heteroatomos tipicamente seleccionados entre nitrogeno, azufre y ox^geno. ^picamente, el anillo de heteroarilo contendra hasta 4 heteroatomos, mas tipicamente hasta 3 heteroatomos, mas habitualmente hasta 2, por ejemplo, un solo heteroatomo. En una realizacion, el anillo de heteroarilo contiene al menos un atomo de nitrogeno en el anillo. Los atomos de nitrogeno en los anillos de heteroarilo pueden ser basicos, como en el caso de un imidazol o piridina, o esencialmente no basicos como en el caso de un indol o nitrogeno de pirrol. En general, el numero de atomos de nitrogeno basicos presentes en el grupo heteroarilo, que incluye cualquier sustituyente del grupo amino del anillo, sera menor que cinco.
Los ejemplos de grupos heteroarilo monodclicos de cinco miembros incluyen, pero sin limitacion, grupos pirrolilo, furanilo, tiofenilo, imidazolilo, furazanilo, oxazolilo, oxadiazolilo, oxatriazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, pirazolilo, triazolilo y tetrazolilo.
Los ejemplos de grupos heteroarilo monodclicos de seis miembros incluyen, pero sin limitacion, piridinilo, pirazinilo, piridazinilo, pirimidinilo y triazinilo. Los ejemplos particulares de grupos heteroarilo bidclicos que contienen un anillo de cinco miembros fusionado a otro anillo de cinco miembros incluyen, pero sin limitacion, imidazotiazolilo e imidazoimidazolilo. Los ejemplos particulares de grupos heteroarilo bidclicos que contienen un anillo de seis miembros fusionado a un anillo de cinco miembros incluyen, pero sin limitacion, grupos benzfuranilo, benzotiofenilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, isobenzoxazolilo, bencisoxazolilo, benzotiazolilo, benzisotiazolilo, isobenzofuranilo, indolilo, isoindolilo, indolizinilo, purinilo (por ejemplo, adenina, guanina), indazolilo, pirazolopirimidinilo, triazolopirimidinilo y pirazolopiridinilo. Los ejemplos particulares de grupos heteroarilo bidclicos que contienen dos anillos de seis miembros fusionados incluyen, pero sin limitacion, grupos quinolinilo, isoquinolinilo, piridopiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, y pteridinilo. Los grupos heteroarilo particulares son los derivados de tiofenilo, pirrolilo, benzotiofenilo, benzofuranilo, indolilo, piridinilo, quinolinilo, imidazolilo, oxazolilo y pirazinilo. Entre los ejemplos de heteroarilos representativos se incluyen los siguientes:
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en donde cada Y se selecciona de >C(=O), NH, O y S.
El termino "heterocicloalquilo" significa una estructura de anillo no aromatico totalmente saturada, monodclica, polidclica fusionada, espirodclica, o polidclica puenteada, que incluye uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N y S y el numero de atomos en el anillo especificado. La estructura de anillo heterocicloalquilo puede tener de 4 a 12 miembros de anillo, en particular de 4 a 10 miembros de anillo y mas particularmente de 4 a 7 miembros de anillo. Cada anillo puede contener hasta cuatro heteroatomos tipicamente seleccionados entre nitrogeno, azufre y oxigeno. Tipicamente, el anillo de heterocicloalquilo contendra hasta 4 heteroatomos, mas tipicamente hasta 3 heteroatomos, mas habitualmente hasta 2, por ejemplo, un solo heteroatomo. Los ejemplos de anillos heterodclicos incluyen, pero sin limitacion, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, pirrolidinilo (por ejemplo, 1 -pirrolidinilo, 2-pirrolidinilo y 3- pirrolidinilo), morfolinilo, tiomorfolinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo, imidazolinilo, oxazolinilo, tiazolinilo, piperidinilo (por ejemplo, 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo y 4-piperidinilo), piranilo, dioxanilo, tetrahidropiranilo (por ejemplo, 4-tetrahidro-piranilo), 2-pirazolinilo, pirazolidinilo o piperazinilo.
Ejemplos particulares de grupos heterocicloalquilo monodclicos se muestran en los siguientes ejemplos ilustrativos:
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en donde cada W e Y se selecciona independientemente de CH2, NH, O y S.
Ejemplos particulares de grupos heterocicloalquilo bidclicos fusionados se muestran en los siguientes ejemplos ilustrativos:
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en donde cada W e Y se selecciona independientemente de CH2, NH, O y S.
Ejemplos particulares de grupos heterocidoalquilo bidclicos puenteados se muestran en los siguientes ejemplos ilustrativos:
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en el que cada W e Y se selecciona independientemente de CH2, NH, O y S, y Z es N o CH.
Ejemplos particulares de grupos heterocicloalquilo espirodclicos se muestran en los siguientes ejemplos ilustrativos:
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en donde cada Y se selecciona de NH, O y S.
El termino “hidroxilo” se refiere al radical -OH.
El termino “oxo” se refiere al radical =O.
El termino “sustituido” se refiere a un grupo en el que uno o mas atomos de hidrogeno son independientemente reemplazados por el mismo o diferente sustituyente(s).
El termino “sulfo” o la expresion “acido sulfonico” se refieren a un radical tal como -SO3H.
El termino “tiol” se refiere al grupo -SH.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "sustituido con uno o mas" se refiere a un numero de uno a cuatro sustituyentes. En una realizacion, se refiere a un numero de uno a tres sustituyentes. En realizaciones adicionales, se refiere a un numero de uno o dos sustituyentes. En una realizacion adicional, se refiere a un sustituyente.
El termino "tioalcoxi" se refiere al grupo -SR26, en donde R26 tiene el numero de atomos de carbono especificado y particularmente alquilo Ci-C8, Los grupos tioalcoxi particulares son tiometoxi, tioetoxi, n-tiopropoxi, isotiopropoxi, n- tiobutoxi, terc-tiobutoxi, sec-tiobutoxi, n-tiopentoxi, n-tiohexoxi y 1,2-dimetiltiobutoxi. Los grupos tioalcoxi particulares son tioalcoxi inferior, es decir, con entre 1 y 6 atomos de carbono. Otros grupos alcoxi particulares tienen entre 1 y 4 atomos de carbono.
Un experto en la tecnica de la smtesis organica reconocera que el numero maximo de heteroatomos en un anillo heterodclico estable, qmmicamente factible, ya sea aromatico o no aromatico, viene determinado por el tamano del anillo, el grado de insaturacion y la Valencia de los heteroatomos. En general, un anillo heterodclico puede tener de uno a cuatro heteroatomos siempre que el anillo heteroaromatico sea qmmicamente factible y estable.
La expresion “farmaceuticamente aceptable” significa aprobado o aprobable por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o la agencia correspondiente en paises que no sean los Estados Unidos, o que este incluido en la farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y mas particularmente, en seres humanos.
La expresion "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a una sal de un compuesto de la invencion que es farmaceuticamente aceptable y que posee la actividad farmacologica deseada del compuesto original. En particular, dichas sales no toxicas pueden ser sales de adicion de acidos inorganicos u organicos y sales de adicion de bases. Espedficamente, dichas sales incluyen: (1) sales de adicion de acido, formadas con acidos inorganicos tales como acido clorddrico, acido bromddrico, acido sulfurico, acido mtrico, acido fosforico y similares; o formadas con acidos organicos tales como acido acetico, acido propionico, acido hexanoico, acido ciclopentanopropionico, acido glicolico, acido piruvico, acido lactico, acido malonico, acido sucdnico, acido malico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido dtrico, acido benzoico, acido 3-(4-hidroxibenzoil) benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido 1,2-etano-disulfonico, acido 2-hidroxietanosulfonico, acido bencenosulfonico, acido 4-clorobencenosulfonico, acido 2-naftalenosulfonico, acido 4-toluenosulfonico, acido
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canforsulfonico, acido 4-metilbiciclo [2,2,2]-oct-2-eno-1-carboxflico, acido glucoheptonico, acido 3-fenilpropionico, acido trimetilacetico, acido terc-butilacetico, acido lauril sulfurico, acido gluconico, acido glutamico, acido hidroxinaftoico, acido salidlico, acido estearico, acido muconico y similares; o (2) sales formadas cuando un proton acido presente en el compuesto original o bien se reemplaza por un ion metalico, por ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion alcalinoterreo o un ion de aluminio; o se coordina con una base organica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina y similares. Las sales incluyen, ademas, a modo de ejemplo solamente, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, tetraalquilamonio y similares; y cuando el compuesto contiene una funcionalidad basica, sales de acidos organicos o inorganicos no toxicos, tales como hidrocloruro, hidrobromuro, tartrato, mesilato, acetato, maleato, oxalato y similares. La expresion "cation farmaceuticamente aceptable" se refiere a un contraion cationico aceptable de un grupo funcional acido. Dichos cationes se ejemplifican por cationes de sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, tetraalquilamonio y similares.
La expresion "vehmulo farmaceuticamente aceptable" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehmulo con el que se administra un compuesto de la invencion.
El termino "profarmacos" se refiere a compuestos, que incluyen derivados de los compuestos de la invencion, que tienen grupos escindibles y se convierten mediante solvolisis o en condiciones fisiologicas en los compuestos de la invencion que son farmaceuticamente activos in vivo. Dichos ejemplos incluyen, pero sin limitacion, derivados de ester de colina y similares, esteres de N-alquilmorfolina y similares.
El termino “solvato” se refiere a las formas del compuesto que estan asociadas con un solvente, generalmente mediante una reaccion de solvolisis. Esta asociacion ffsica incluye enlaces de hidrogeno. Los disolventes convencionales incluyen agua, EtOH, acido acetico y similares. Los compuestos de la invencion se pueden preparar, por ejemplo, en forma cristalina y se pueden solvatar o hidratar. Los solvatos adecuados incluyen solvatos farmaceuticamente aceptables, tal como hidratos, e incluyen ademas solvatos estequiometricos y solvatos no estequiometricos. En ciertos casos, el solvato sera capaz de aislamiento, por ejemplo, cuando una o mas moleculas de disolvente se incorporan a la red cristalina del solido cristalino. El termino “solvato” abarca tanto los solvatos en fase de disolucion como los aislables. Los solvatos representativos incluyen hidratos, etanolatos y metanolatos.
El termino “sujeto” incluye a los seres humanos. Los terminos "humano", "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente en la presente memoria.
La expresion "cantidad eficaz" significa la cantidad de un compuesto de la invencion que, cuando se administra a un sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento para la enfermedad. La "cantidad eficaz" puede variar dependiendo del compuesto, la enfermedad y su gravedad, y la edad, peso, etc., del sujeto a tratar.
Los terminos "prevenir" o "prevencion" se refieren a una reduccion en el riesgo de adquirir o desarrollar una enfermedad o trastorno (es decir, hacer posible que al menos uno de los smtomas clmicos de la enfermedad no se desarrolle en un sujeto que pudiera estar expuesto a un agente causante de la enfermedad, o predispuesto a la enfermedad antes del inicio de la enfermedad.
El termino "profilaxis" se refiere a la "prevencion", y se refiere a una medida o un procedimiento cuyo proposito es prevenir, en lugar de tratar o curar una enfermedad. Los ejemplos no limitativos de las medidas profilacticas pueden incluir la administracion de vacunas; la administracion de heparina de bajo peso molecular a pacientes hospitalizados con riesgo de trombosis debido, por ejemplo, a la inmovilizacion; y la administracion de un agente antimalaria tal como la cloroquina, antes de una visita a una region geografica donde la malaria es endemica o el riesgo de contraer malaria es alto.
Los terminos "tratar" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno se refiere, en una realizacion, a la mejora de la enfermedad o trastorno (es decir, detener la enfermedad o reducir la manifestacion, extension o gravedad de al menos uno de sus smtomas clmicos). En otra realizacion, "tratar" o "tratamiento" se refiere a mejorar al menos un parametro ffsico, que puede no ser discernible por el sujeto. En otra realizacion mas, "tratar" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o trastorno, ya sea ffsicamente, (por ejemplo, estabilizacion de un smtoma discernible), fisiologicamente (por ejemplo, estabilizacion de un parametro ffsico) o ambos. En una realizacion adicional, "tratar" o "tratamiento" se refiere a ralentizar la progresion de la enfermedad.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "enfermedad o enfermedades alergicas" se refiere al grupo de afecciones caracterizadas por un trastorno de hipersensibilidad del sistema inmunitario que incluye la enfermedad alergica de las vfas respiratorias (por ejemplo, asma, rinitis), sinusitis, eczema y urticaria, asf como alergias alimentarias o alergias al veneno de insectos.
Como se usa en la presente memoria, el termino "asma" se refiere a cualquier trastorno de los pulmones caracterizado por variaciones en el flujo de gas pulmonar asociado con la constriccion de las vfas respiratorias por cualquier causa (intrmseca, extrmseca o ambas; alergica o no alergica). El termino asma se puede usar con uno o mas adjetivos para indicar la causa.
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Como se usa en la presente memoria, la expresion "enfermedad o enfermedades inflamatorias" se refiere al grupo de afecciones que incluyen artritis reumatoide, osteoartritis, artritis idiopatica juvenil, psoriasis, artritis psoriasica, espondilitis anquilosante, enfermedad alergica de las v^as respiratorias (por ejemplo, asma, rinitis), enfermedad pulmonar obstructiva cronica, enfermedad (COPD), enfermedades inflamatorias del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), estados de enfermedad impulsados por endotoxinas (por ejemplo, complicaciones despues de la cirugfa de bypass o estados de endotoxinas cronicas que contribuyen a, por ejemplo, insuficiencia cardfaca cronica), y enfermedades que implican el cartflago, tal como la de las articulaciones. Particularmente, el termino se refiere a artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad alergica de las vfas respiratorias (por ejemplo, asma), enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) y enfermedades inflamatorias del intestino. Mas particularmente, la expresion se refiere a la artritis reumatoide, la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD) y las enfermedades inflamatorias del intestino.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "enfermedad o enfermedades autoinmunes" se refiere al grupo de enfermedades que incluyen la enfermedad obstructiva de las vfas respiratorias, que incluye enfermedades tales como COPD, asma (por ejemplo, asma intrmseca, asma extrmseca, asma por polvo, asma infantil) particularmente asma cronica o inveterada (por ejemplo asma tardfa e hiperreactividad de las vfas respiratorias), bronquitis, que incluye asma bronquial, lupus eritematoso sistemico (SLE), lupus eritematoso cutaneo, nefritis lupica, dermatomiositis, smdrome de Sjogren, esclerosis multiple, psoriasis, enfermedad del ojo seco, diabetes mellitus de tipo I y complicaciones asociadas con la misma, eccema atopico (dermatitis atopica), tiroiditis (tiroiditis de Hashimoto y autoinmune), dermatitis de contacto y otras dermatitis eccematosas, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), aterosclerosis y esclerosis lateral amiotrofica. Particularmente, el termino se refiere a COPD, asma, lupus eritematoso sistemico, diabetes mellitus de tipo I y enfermedad inflamatoria intestinal. Como se usa en la presente memoria, la expresion "enfermedad o enfermedades proliferativas" se refiere a afecciones como cancer (por ejemplo, leiomiosarcoma uterino o cancer de prostata), enfermedades mieloproliferativas (por ejemplo, policitemia vera, trombocitosis esencial y mielofibrosis), leucemia (por ejemplo, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblastica aguda y cronica), mieloma multiple, psoriasis, reestenosis, esclerodermia o fibrosis. En particular, el termino se refiere a cancer, leucemia, mieloma multiple y psoriasis.
Como se usa en la presente memoria, el termino "cancer" se refiere a un crecimiento maligno o benigno de celulas en la piel o en organos del cuerpo, por ejemplo, pero sin limitacion, mama, prostata, pulmon, rinon, pancreas, estomago o intestino. Un cancer tiende a infiltrarse en el tejido adyacente y diseminarse (metastasis) a organos distantes, por ejemplo, a los huesos, el tugado, los pulmones o el cerebro. Como se usa en la presente memoria, el termino cancer incluye tanto los tipos de celulas tumorales metastasicas (tales como, entre otros, melanoma, linfoma, leucemia, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y mastocitoma) como los tipos de carcinoma tisular (tales como cancer colorrectal, cancer de prostata, cancer de pulmon de celulas pequenas y cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de mama, cancer de pancreas, cancer de vejiga, cancer renal, cancer gastrico, glioblastoma, cancer de tugado primario, cancer de ovario, cancer de prostata y leiomiosarcoma uterino). En particular, el termino "cancer" se refiere a leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cancer anal, cancer de apendice, astrocitomas, tumor teratoideo/rabdoideo atfpico, carcinoma de celulas basales, cancer de vfas biliares, cancer de vejiga, cancer de huesos (osteosarcoma y histiocitoma fibroso maligno), glioma del tallo cerebral, tumores cerebrales, tumores cerebrales y de la medula espinal, cancer de mama, tumores bronquiales, linfoma de Burkitt, cancer de cuello uterino, leucemia linfodtica cronica, leucemia mielogena cronica, cancer de colon, cancer colorrectal, craneofaringioma, linfoma celulas de T cutaneo, tumores embrionarios, cancer de endometrio, ependimoblastoma, ependimoma, cancer de esofago, tumores de la familia del sarcoma de Ewing, cancer de ojo, retinoblastoma, cancer de vesmula biliar, cancer gastrico (estomago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de celulas estromales gastrointestinales, tumor de celulas germinales, glioma, leucemia de celulas pilosas, cancer de cabeza y cuello, cancer hepatocelular (tugado), linfoma de Hodgkin, cancer de hipofaringe, melanoma intraocular, tumores de celulas de los islotes (pancreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cancer de rinon, histiocitosis de celulas de Langerhans, cancer de laringe, leucemia, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfodtica cronica, leucemia mielogena cronica, leucemia de celulas pilosas, cancer de Idgado, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de pulmon de celulas pequenas, linfoma de Burkitt, linfoma de celulas T cutaneo, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma, macroglobulinemia de Waldenstrom, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, mesotelioma, cancer de boca, leucemia mielogena cronica, leucemia mieloide, mieloma multiple, cancer de la nasofaringe, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer oral, cancer orofarmgeo, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno oseo, cancer de ovario, cancer epitelial ovarico, tumor de celulas germinales ovaricas, tumor ovarico de bajo potencial maligno, cancer de pancreas, papilomatosis, cancer paratiroideo, cancer de pene, cancer de faringe, tumores del parenquima pineal de diferenciacion intermedia, pineoblastoma y tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, tumor pituitario, neoplasia de celulas plasmaticas/mieloma multiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cancer de prostata, cancer de recto, cancer de celulas renales (rinon), retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cancer de glandula salival, sarcoma, tumores de la familia del sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, smdrome de Sezary, cancer de piel, cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de celulas escamosas, cancer de estomago (gastrico), tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, cancer testicular, cancer de garganta, timoma y carcinoma tfmico, cancer de tiroides, cancer de uretra, cancer de utero, sarcoma uterino, cancer de vagina, cancer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, y
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tumor de Wilms. En otra realizacion particular, el termino cancer se refiere a cancer de pancreas, cancer de hngado, carcinoma hepatocelular (HCC), cancer de mama o cancer de colon.
Como se usa en la presente memoria, el termino "leucemia" se refiere a enfermedades neoplasicas de la sangre y los organos que forman la sangre. Dichas enfermedades pueden causar la disfuncion de la medula osea y del sistema inmunitario, lo que hace que el huesped sea altamente susceptible a infecciones y hemorragias. En particular, el termino leucemia se refiere a la leucemia mieloide aguda (AML) y la leucemia linfoblastica aguda (ALL) y la leucemia linfoblastica cronica (CLL). En otra realizacion particular, el termino leucemia se refiere a leucemia linfoblastica aguda de celulas T (T-ALL), leucemia linfocftica cronica (CLL), o linfoma difuso de celulas B grandes (DLBCL).
Como se usa en la presente memoria, la expresion "rechazo de trasplante" se refiere al rechazo agudo o cronico de alo- o xenoinjertos de celulas, tejidos u organos solidos, por ejemplo, islotes pancreaticos, celulas madre, medula osea, piel, musculo, tejido corneal, tejido neuronal, corazon, pulmon, corazon y pulmon combinado, rinon, tngado, intestino, pancreas, traquea o esofago, o enfermedades de injerto contra huesped.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "enfermedad o enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago" incluye afecciones tales como osteoartritis, artritis psoriasica, artritis reumatoide juvenil, artritis gotosa, artritis septica o infecciosa, artritis reactiva, distrofia simpatica refleja, algodistrofia, smdrome de Tietze o condritis costal, fibromialgia, osteocondritis, artritis neurogena o neuropatica, artropatfa, formas endemicas de artritis como osteoartritis deformante endemica, enfermedad de Mseleni y enfermedad de Handigodu; degeneracion resultante de la fibromialgia, lupus eritematoso sistemico, esclerodermia y espondilitis anquilosante.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "malformacion o malformacion congenitas del cartflago" incluye afecciones tales como condrolisis hereditaria, condrodisplasias y pseudocondrodisplasias, en particular, pero sin limitacion, microtia, anotia, condrodisplasia metafisaria y trastornos relacionados.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "enfermedad o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6” incluye afecciones tales como enfermedad de Castleman, mieloma multiple, psoriasis, sarcoma de Kaposi y/o glomerulonefritis mesangial proliferativa.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "enfermedad o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de interferones” incluye afecciones tales como lupus eritematoso sistemico y cutaneo, nefritis lupica, dermatomiositis, smdrome de Sjogren, psoriasis, artritis reumatoide.
La expresion "compuesto o compuestos de la invencion", y expresiones equivalentes, pretenden abarcar compuestos de la formula o formulas como se ha descrito anteriormente, cuya expresion incluye las sales farmaceuticamente aceptables, y los solvatos, por ejemplo, hidratos, y los solvatos de las sales farmaceuticamente aceptables, cuando el contexto asf lo permita. De forma similar, la referencia a los intermedios, se reivindiquen o no ellos mismos, pretende abarcar sus sales, y solvatos, cuando el contexto asf lo permita.
Cuando en la presente memoria se hace referencia a los intervalos, por ejemplo, pero sin limitacion, alquilo C1-8, la cita de un intervalo debe considerarse una representacion de cada miembro de dicho intervalo.
Otros derivados de los compuestos de esta invencion tienen actividad tanto en sus formas de acido como en sus formas de derivado de acido, pero en la forma sensible a los acidos a menudo ofrece ventajas de solubilidad, compatibilidad con los tejidos o liberacion retardada en el organismo de los mairnferos (Bundgaard, 1985). Los profarmacos incluyen derivados de acido bien conocidos por los expertos en la tecnica, tales como, por ejemplo, esteres preparados por reaccion del acido original con un alcohol adecuado o amidas preparadas por reaccion del compuesto acido original con una amina sustituida o no sustituida, o anhndridos de acido, o anhndridos mixtos. Los esteres, amidas y anhndridos alifaticos o aromaticos sencillos derivados de grupos acidos colgantes de los compuestos de esta invencion son profarmacos particularmente utiles. En algunos casos es deseable preparar profarmacos de tipo doble ester, como (aciloxi) alquil esteres o ((alcoxicarbonil)oxi) alquil esteres. Particularmente, dichos profarmacos son los esteres de alquilo C1-8, alquenilo C2-8, arilo C6-ioopcionalmente sustituido, y esteres (arilo C6-io)-(alquilo C1-4) de los compuestos de la invencion.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "variante isotopica" se refiere a un compuesto que contiene proporciones no naturales de isotopos en uno o mas de los atomos que constituyen dicho compuesto. Por ejemplo, una "variante isotopica" de un compuesto puede contener uno o mas isotopos no radioactivos, tales como, por ejemplo, deuterio (2H o D), carbono-13 (13C), nitro (15N) o similares. Se entendera que, en un compuesto donde se realiza dicha sustitucion isotopica, los siguientes atomos, en caso de estar presentes, pueden variar, de modo que, por ejemplo, cualquier hidrogeno puede ser 2H/D, cualquier carbono puede ser 13C, o cualquier nitrogeno puede ser 15N, y que la presencia y ubicacion de dichos atomos se puede determinar dentro de la experiencia en la tecnica. Asimismo, la invencion puede incluir la preparacion de variantes isotopicas con radioisotopos en el caso, por ejemplo, donde los compuestos resultantes se pueden usar para estudios de distribucion de tejido del farmaco y/o sustrato. Los isotopos radioactivos tritio, es decir 3H, y carbono-14, es decir 14C, son particularmente utiles para este fin en vista de su facilidad de incorporacion y de los medios listos para la deteccion. Ademas, se pueden preparar compuestos que estan sustituidos con isotopos emisores de positrones, tales como 11C, 18F, 15O y 13N, y serian utiles en estudios de tomograffa por emision de positrones (PET) para examinar la ocupacion del receptor del sustrato.
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Todas las variantes isotopicas de los compuestos proporcionados en la presente memoria, radiactivos o no, pretenden estar abarcados dentro del alcance de la invencion.
Tambien debe entenderse que los compuestos que tienen la misma formula molecular, pero difieren en la naturaleza o secuencia de union de sus atomos o la disposicion de sus atomos en el espacio se denominan "isomeros". Los isomeros que difieren en la disposicion de sus atomos en el espacio se denominan “estereoisomeros”.
Los estereoisomeros que no son imagenes especulares entre si se denominan "diastereomeros" y los que no son imagenes especulares superponibles entre si se denominan "enantiomeros". Cuando un compuesto tiene un centro asimetrico, por ejemplo, esta unido a cuatro grupos diferentes, es posible un par de enantiomeros. Un enantiomero se puede caracterizar por la configuracion absoluta de su centro asimetrico y se describe mediante las reglas de secuencia R y S de Cahn y Prelog, o por la forma en que la molecula rota el plano de luz polarizada y se designa como dextrogiro o levogiro. (es decir, como isomeros (+) o (-), respectivamente). Un compuesto quiral puede existir como enantiomero individual o como una mezcla de los mismos. Una mezcla que contiene proporciones iguales de los enantiomeros se denomina una "mezcla racemica".
Los “tautomeros” se refieren a compuestos que son formas intercambiables de una estructura de compuesto particular, y que varian en el desplazamiento de los atomos de hidrogeno y electrones. Por lo tanto, dos estructuras pueden estar en equilibrio a traves del movimiento de electrones n y un atomo (generalmente H). Por ejemplo, los enoles y las cetonas son tautomeros porque se interconvierten rapidamente mediante el tratamiento con acido o base. Otro ejemplo de tautomerismo son las formas aci y nitro de fenilnitrometano, que tambien se forman mediante el tratamiento con acido o base.
Las formas tautomericas pueden ser relevantes para el logro de la reactividad qmmica y la actividad biologica optimas de un compuesto de interes.
Los compuestos de la invencion pueden poseer uno o mas centros asimetricos; dichos compuestos pueden, por lo tanto, producirse como estereoisomeros (R) o (S) individuales o como mezclas de los mismos.
A menos que se indique lo contrario, la descripcion o la nomenclatura de un compuesto particular en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones pretende incluir tanto los enantiomeros individuales como las mezclas, racemicas o de otro tipo, de los mismos. Los metodos para la determinacion de la estereoqmmica y la separacion de estereoisomeros son bien conocidos en la tecnica.
Se apreciara que los compuestos de la invencion se pueden metabolizar para producir metabolitos biologicamente activos.
La invencion
La presente invencion se basa en la identificacion de que los compuestos de la invencion son inhibidores de JAK y que son utiles para el tratamiento de enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del cartflago, y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o la hipersecrecion de interferones. En una realizacion espedfica, los compuestos de la invencion son inhibidores de JAK1 y/o TYK2,
La presente invencion tambien proporciona metodos para la produccion de los compuestos de la invencion, composiciones farmaceuticas que comprenden un compuesto de la invencion y describe metodos para tratar enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del cartflago, y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o la hipersecrecion de interferones al administrar un compuesto de la invencion. En una realizacion espedfica, los compuestos de la invencion son inhibidores de JAK1 y/o TYK2,
Por consiguiente, en un primer aspecto de la invencion, los compuestos de la invencion se proporcionan de acuerdo con la Formula (I):
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en la que,
R1 es H, o Me;
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Li es -NR2-; -O-, o -CH2-;
Cy es fenilo, o heteroarilo monodclico o bidclico fusionado de 5-9 miembros que comprende de 1 a 4 heteroatomos independientemente seleccionados entre N, O, y S;
R2 es H, o alquilo C1-4;
R3 es H, halo, alquilo C1-4 opcionalmente sustituido con uno o mas independientemente seleccionados entre halo, o alcoxi C1-4 opcionalmente sustituido con uno o mas independientemente seleccionados de halo;
R4 es H o halo;
R5 es -CN, halo o es -L2-R6
-L2 esta ausente, o es -C(=O)-, -C(=O)NR7, -NR7C(=O)-, -SO2-, -SO2NR7, o -NR7SO2-;
R6 es H, o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con uno o mas grupos R8 independientemente seleccionados;
R7 es H, o alquilo C1-4;
R8 es OH, CN, halo, o alcoxi C1-4,
La esta ausente, o es -C(=O)-, -C(=O)O- o -C(=O)NH-;
Ra es:
• H,
• alquilo C1-4 opcionalmente sustituido con uno o mas Rb independientemente seleccionados,
• cicloalquilo C3-7 monodclico opcionalmente sustituido con uno o mas Rc independientemente seleccionados, o
• heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados de O, N, y S, o
• heteroarilo monodclico de 5-6 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N, y S;
Rb es halo,
CN,
OH,
alcoxi C1-4,
• cicloalquilo C3-7,
heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N, y S (heterocicloalquilo esta opcionalmente sustituido con uno o mas independientemente seleccionados entre halo, u oxo),
• -SO2-alquilo C1-4, o
• -C(=O)NRb1Rb2 Rc es
• halo,
• CN,
• OH,
• alquilo C1-4,
• -C(=O)OH, o
• -C(=O)NRc1Rc2; y
cada Rb1, Rb2, Rc1 y Rc2 se selecciona independientemente entre H, y alquilo C1-4,
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que R1 es Me.
En otra realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que Cy es fenilo.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que Cy es un heteroarilo monodclico o bidclico fusionado de 5-9 miembros que comprende de 1 a 4 heteroatomos independientemente seleccionados entre N, O y S. En otra realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que Cy es heteroarilo monodclico o bidclico fusionado de 5-9 miembros que comprende 1 o 2 heteroatomos independientemente seleccionados de N, O y S. En una realizacion particular, Cy es pirazolilo, pirrolilo, imidazolilo, triazolilo, tiofenilo, tiazolilo, furanilo, piridilo, pirazinilo, pirimidilo, piridazinilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzoxazolilo, indolilo o indazolilo.
En otra realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que Cy es un heteroarilo monodclico de 5-6 miembros que comprende de 1 a 4 heteroatomos independientemente seleccionados entre N, O, y S. En aun otra realizacion, se usa un compuesto de la invencion de acuerdo con la Formula I, en la que Cy es un heteroarilo monodclico de 5-6 miembros que comprende 1 o 2 heteroatomos independientemente seleccionados de N, O, y S. En una realizacion particular, Cy es pirazolilo, pirrolilo, imidazolilo, furanilo, tiofenilo, triazolilo, tetrazolilo, tiazolilo, oxazolilo, tiadiazolilo u oxadiazolilo. En otra realizacion particular, Cy es piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo o piridazolilo. En una realizacion mas particular, Cy es piridilo.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con las Formulas IIa, IIb, o IIc:
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en las que Li, R3, R4, La, Ra y R5 son como se describen en cualquiera de las realizaciones anteriores. En una realization, un compuesto de la invention es de acuerdo con las Formulas IIIa, IIIb, o IIIc:
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5 en las que L1, R3, R4, La, Ra y R5 son como se describen en cualquiera de las realizaciones anteriores.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-IIIc, en las que Li es -CH2-.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-IIIc, en las que Li es -O-.
10 En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-IIIc, en las que L1 es -NR2-, y R2 es como se describe en cualquiera de las realizaciones anteriores.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-IIIc, en las que L1 es -NR2-, en las que R2 es H.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-IIIc, en las que 15 L1 es -NR2-, en las que R2 es alquilo C1-4, En una realizacion particular, R2 es Me, Et o iPr. En una realizacion mas particular, R2 es Me. En otra realizacion mas particular, R2 es Et.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con las Formulas IVa, IVb, IVc, IVd, IVe o IVf:
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20 en las que R3, R4, R5, La, y Ra son como se describen en cualquiera de las realizaciones anteriores.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con cualquiera de las Formulas I-IVf, en las que La esta ausente.
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En una realization, un compuesto de la invention es de acuerdo con cualquiera de las Formulas I-IVf, en las que La es -C(=O)-, -C(=O)O-, o -C(=O)NH-. En una realizacion particular, La es -C(=O)-.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con las Formulas Va, Vb, Vc, Vd, Ve o Vf:
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en las que R3, R4, R5, y Ra son como se describen en cualquiera de las realizaciones anteriores.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R4 es H, o halo. En una realizacion particular, R4 es F, o Cl. En otra realizacion particular, R4 es H.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R3 es H.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R3 es halo. En una realizacion particular, R3 es F, o Cl. En una realizacion mas particular, R3 es Cl.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R3 es alquilo Ci-4, En una realizacion particular, R3 es Me, Et o n-Pr. En una realizacion mas particular, R3 es Me o Et. En una realizacion mas particular, R3 es Et. En otra realizacion mas particular, R3 es Me.
En otra realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R3 es alquilo C1-4 sustituido con uno o mas independientemente seleccionados de halo. En una realizacion particular, R3 es -CHF2, -CF3, -CH2-CHF2 o -CH2-CF3, En una realizacion mas particular, R3 es -CF3, o -CH2-CF3,
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R3 es alcoxi C1-4, En una realizacion particular, R3 es -OMe, -OEt, o -On-Pr. En una realizacion mas particular, R3 es - OMe o -OEt.
En otra realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R3 es alcoxi C1-4 sustituido con uno o mas independientemente seleccionados de halo. En una realizacion particular, R3 es -OCHF2, -OCF3, o -OCH2-CHF2, En una realizacion mas particular, R3 es -OCHF2,
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R5 es CN.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R5 es halo. En una realizacion particular, R5 es F, o Cl. En una realizacion mas particular, R5 es F.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R5 es -L2-R6, R6 es como se describio anteriormente, L2es -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2NR7, o -NR7sO2-, y R7 es como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores. En una realizacion particular, R7es H. En otra realizacion particular, R7 es alquilo C1-4, En una realizacion mas particular, R7 es Me, o Et. En una realizacion especialmente particular, R7 es Me.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R5 es -L2-R6, L2 es como se describio anteriormente, y R6 es H.
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En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R5 es -L2-R6, L2 es como se describio anteriormente, y R6 es alquilo C1.6, En una realizacion particular, R6 es Me, Et, iPr o tBu. En una realizacion mas particular, R6 es Me, o Et.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R5 es -L2-R6, L2 es como se describio anteriormente, y R6 es alquilo C1-6 sustituido con uno o mas grupos R8 independientemente seleccionados. En otra realizacion, R6 es Me, Et, iPr o tBu, cada uno de los cuales esta sustituido con uno o mas grupos R8 independientemente seleccionados. En una realizacion particular, R6es alquilo C1-6 sustituido con uno, dos o tres grupos R8 independientemente seleccionados. En otra realizacion particular, R6 es Me, Et, iPr o tBu, cada uno de los cuales esta sustituido con uno, dos o tres grupos R8 independientemente seleccionados. En una realizacion mas particular, R6 es alquilo C1-6 sustituido con un grupo R8, En otra realizacion particular, R6 es Me, Et, iPr o tBu, cada uno de los cuales esta sustituido con un grupo R8,
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R8 es OH, CN, halo o alcoxi C1-4, En una realizacion particular, R8 es OH, CN, F, Cl, -OMe, u -OEt.
En una realizacion particular, R5 es -L2-R6, L2 -C(=O)-, o -SO2-, y R6 es alquilo C1-6, En una realizacion mas particular, R5 es -L2-R6, L2 es -C(=O)-, o -SO2, y R6 es Me, Et, iPr o tBu. En una realizacion especialmente particular, R5 es - C(=O)Me, -C(=O)Et, -SO2Me o -SO2Et.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que R5 es -L2-R6, L2 es -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2NR7-, o -NR7SO2-, R6 y R7 son como se han definido en cualquiera de las realizaciones anteriores. En una realizacion particular, R7 es H, Me o Et, y R6 es como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores. En otra realizacion particular, R7 es como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores, y R6 es H. En aun otra realizacion particular, R7 es como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores, y R6 es alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con uno o mas independientemente seleccionados de OH, CN, halo, o alcoxi C1-4, En una realizacion mas particular, R7 es H, Me o Et, y R6 es H. En otra realizacion mas particular, R7 es H, Me o Et, y R6 es Me, Et, iPr o tBu, cada uno de los cuales es opcionalmente sustituido con uno o mas independientemente seleccionados de OH, CN, halo o alcoxi C1-4, En aun otra realizacion mas particular, R7 es H, Me o Et, y R6 es Me, Et, iPr o tBu, cada uno de los cuales esta opcionalmente sustituido con uno o mas independientemente seleccionados de OH, CN, F, Cl, OMe, o OEt. En una realizacion especialmente particular, R5 es -C(=O)NH2 o -SO2NH2,
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Ra es H.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Ra es alquilo C1-4, En una realizacion particular, Ra es Me, Et, iPr o tBu. En una realizacion mas particular, Ra is Me, o Et. En una realizacion mas particular, Ra es Me.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Ra es alquilo C1-4 sustituido con uno o mas Rb independientemente seleccionados. En otra realizacion, Ra es Me, Et, iPr o tBu, cada uno de los cuales esta sustituido con uno o mas Rb independientemente seleccionados. En una realizacion particular, Ra es alquilo C1-4 sustituido con uno, dos o tres Rb independientemente seleccionados. En otra realizacion particular, Ra es Me, Et, iPr o tBu, cada uno de los cuales esta sustituido con uno, dos o tres Rb independientemente seleccionados. En una realizacion mas particular, Ra es alquilo C1-4 sustituido con un Rb. En otra realizacion mas particular, Ra es Me, Et, iPr o tBu, cada uno de los cuales esta sustituido con un Rb.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Rb es halo, CN u OH. En una realizacion particular, Rb es F, Cl, CN, u OH.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Rb es alcoxi C1-4, En una realizacion particular, Rb es OMe, OEt u OiPr. En una realizacion mas particular, Rb es OMe.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Rb es cicloalquilo C3-7, En una realizacion particular, Rb es ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, o ciclohexilo. En una realizacion mas particular, Rb es ciclopropilo.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Rb es heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N y S. En una realizacion particular, Rb es oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, o tiomorfolinilo.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Rb es heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N y S, sustituido con uno o mas independientemente seleccionados de halo, u oxo. En una realizacion particular, Rb es oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo o tiomorfolinilo, cada uno de los cuales esta sustituido con uno o mas independientemente
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seleccionados de halo, u oxo. En otra realizacion particular, Rb es heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados de O, N y S, sustituido con uno o mas independientemente seleccionados de F, Cl, u oxo. En una realizacion mas particular, Rb es oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, o tiomorfolinilo, cada uno de los cuales esta sustituido con uno o mas independientemente seleccionados de F, Cl, u oxo. En una realizacion mas particular, Rb es heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N y S, sustituido con uno, dos o tres independientemente seleccionados de F, Cl, u oxo. En otra realizacion especialmente particular, Rb es oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, o tiomorfolinilo, cada uno de los cuales esta sustituido con uno, dos o tres independientemente seleccionados de F, Cl, u oxo.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Rb es -SO2-alquilo C1-4, En una realizacion particular, Rb es -SO2CH3 o -SO2CH2CH3,
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que
Rb es -C(=O)NRb1Rb2, en las que cada Rb1 o Rb2 se selecciona independientemente entre H, y alquilo C1-4, En una
realizacion particular, cada Rb1 o Rb2 se selecciona independientemente entre H, -CH3y -CH2cH3 En una realizacion mas particular, Rb es -C (=O)NH2, -C(=O)NMeH, o -C(=O)NMe2,
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Ra es cicloalquilo C3-7 monodclico. En una realizacion particular, Ra es ciclopropilo, ciclobutilo o ciclopentilo. En una realizacion mas particular, Ra es ciclopropilo.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que
Ra es cicloalquilo C3-7 monodclico sustituido con uno o mas grupos Rc independientemente seleccionados. En otra
realizacion, Ra es ciclopropilo, ciclobutilo o ciclopentilo, cada uno de los cuales esta sustituido con uno o mas grupos Rc independientemente seleccionados. En una realizacion particular, Ra es cicloalquilo C3-7 monodclico sustituido con uno, dos o tres grupos Rc independientemente seleccionados. En otra realizacion particular, Ra es ciclopropilo, ciclobutilo o ciclopentilo, cada uno de los cuales esta sustituido con uno, dos o tres grupos Rc independientemente seleccionados. En una realizacion mas particular, Ra es cicloalquilo C3-7 monodclico sustituido con un grupo Rc. En otra realizacion particular, Ra es ciclopropilo, ciclobutilo o ciclopentilo, cada uno de los cuales esta sustituido con un grupo Rc.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Rc es halo, CN, u OH. En una realizacion particular, Rc es F, Cl, CN, u OH. En una realizacion mas particular, Rc es F.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Rc es alquilo C1-4, En una realizacion particular, Rc es -Me, -Et, o -iPr.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Rc es -C(=O)OH.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Rc es -C(=O) NRc1Rc2, en las que cada Rc1 o Rc2 se selecciona independientemente entre H, y alquilo C1-4, En una realizacion particular, cada Rc1 o Rc2 se selecciona independientemente entre H, -CH3 y -CH2CH3, En una realizacion mas particular, Rc es -C(=O)NH2, -C(=O)NMeH o -C(=o) NMe2,
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Ra es:
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En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Ra es:
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En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Ra es heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N, y S. En una realizacion particular, Ra es oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, o tiomorfolinilo.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con una cualquiera de las Formulas I-Vf, en las que Ra es heteroarilo monodclico de 5-6 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N, y S. En una realizacion particular, Ra es furanilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, triazolilo, oxadiazolilo, tetrazol, piridinilo, pirazinilo, o pirimidinilo.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que el compuesto se selecciona de:
N-(6-((6-ciano-4-etilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)ciclopropanocarboxamida,
N-(6-(4-ciano-2-etil-6-fluorofenilamino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)ciclopropanocarboxamida,
N-(6-((4-ciano-2-etil-6-fluorofenil)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)ciclopropanocarboxamida,
6-((6-ciano-4-etilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-ilcarbamato de metilo,
6-((4-ciano-2-etil-6-fluorofenil)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-ilcarbamato de metilo,
(1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-4-etil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida,
N-(6-((4-ciano-2-etil-6-fluorofenil)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorociclopropanocarboxamida (iS, 2s)/(1R, 2R) mezcla racemica,
(1R,2R)-N-(6-((6-ciano-4-etilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorociclopropanocarboxa-
mida,
(1R,2R)-N-(6-((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorociclopropanocarboxa-
mida,
(1R, 2R)-N-[6-(4-ciano-2-etil-fenoxi)-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida,
(1R,2R)-N-[6-(2-cloro-4-ciano-6-fluoro-N-metil-anilino)-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida,
(1R,2R)-2-fluoro-N-[6-[(6-fluoro-4-metil-3-piridil)-metil-amino]-1-metil-bencimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida,
(1R,2R)-N-[6-[(2,6-difluoro-3-piridil)-metil-amino]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida,
(1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-2-fluoro-3-piridil)-metil-amino]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida,
(1R,2R)-N-[6-(4-ciano-2-fluoro-N-metil-anilino)-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida,
(1R,2R)-2-fluoro-N-[6-(2-fluoro-N,6-dimetil-4-metilsulfonil-anilino)-1-metil-bencimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida,
(1R,2R)-2-fluoro-N-[6-(2-fluoro-N-metil-4-metilsulfonil-anilino)-1-metil-bencimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida,
N-[6-[(4-etil-6-metilsulfonil-3-piridil)-metil-amino]-1-metil-bencimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida,
N-[6-(2-fluoro-N,6-dimetil-4-metilsulfonil-anilino)-1-metil-bencimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida,
(1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida,
(1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-2-fluoro-4-metil-3-piridil)-metil-amino]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxa-
mida,
(1R,2R)-N-[6-[(2-ciano-3-fluoro-5-metil-4-piridil)-metil-amino]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxa-
mida,
N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida, 5-((4-(ciclopropanocarboxamido)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-6-il)(metil)amino)-4-etilpicolinamida, 4-etil-5-((4-((1R,2R)-2-fluorociclopropanocarboxamido)-1-metil-1H-benzo[d] imidazol-6-il)(metil)amino)picolinamida, (1R,2R)-N-[6-(N,2-dimetil-4-metilsulfonil-anilino)-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida, (1R,2R)-N-[6-(4-etilsulfonil-N,2-dimetil-anilino)-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida,
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5-(7-amino-3-metil-bencimidazol-5-il)oxi-4-metil-piridin-2-carbonitrilo,
N-[6-[(4-etil-6-metilsulfonil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-il]cidopropanocarboxamida,
N-[6-[4-(cianometil)anilino]-1-metil-bencimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida,
N-[6-(2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-6-ilamino)-1-metil-bencimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida, y
5-[7-[[(1R,2R)-2-fluorociclopropanocarbonil]amino]-3-metil-bencimidazol-5-il]oxi-4-metilpiridin-2-carboxamida.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que el compuesto se selecciona de
1-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-il]-3-isopropil-urea,
4- metil-5- [3-metil-7- (metilamino)bencimidazol-5-il]oxi-piridin-2-carbonitrilo,
5- [7-(dimetilamino)-3-metil-bencimidazol-5-il]oxi-4-metil-piridina-2-carbonitrilo, N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-il]-3-hidroxi-azetidina-1-carboxamida, N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-il]morfolina-4-carboxamida, y 1-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-il]-3-isopropil-urea.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que el compuesto es N-[6-[(6- ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-ilo]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida. En una realizacion mas particular, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que el compuesto es (1R,2R)-N-[6-[(6- ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1 -metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que el compuesto no es N-[6- [(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida. En una realizacion mas particular, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que el compuesto no es (1R,2R)-N-[6- [(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que el compuesto es N-(6- ((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorociclopropanocarboxamida. En una realizacion mas particular, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que el compuesto es (1R,2R)-N-(6-((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorociclopropanocarboxa- mida.
En una realizacion, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que el compuesto no es N-(6- ((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorociclopropanocarboxamida. En una realizacion mas particular, un compuesto de la invencion es de acuerdo con la Formula I, en la que el compuesto no es (1R,2R)-N-(6-((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metilo)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorociclopropanocar- boxamida.
En una realizacion, un compuesto de la invencion no es una variante isotopica.
En un aspecto, un compuesto de la invencion de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria esta presente como la base libre.
En un aspecto, un compuesto de la invencion de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria es una sal farmaceuticamente aceptable.
En un aspecto, un compuesto de la invencion de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria es un solvato del compuesto.
En un aspecto, un compuesto de la invencion de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria es un solvato de una sal farmaceuticamente aceptable de un compuesto.
Aunque los grupos especificados para cada realizacion generalmente se han enumerado anteriormente por separado, un compuesto de la invencion incluye uno en el que varias o cada realizacion en la formula anterior, asf como otras formulas presentadas en la presente memoria, se seleccionan de uno o mas miembros o grupos particulares designado respectivamente, para cada variable. Por lo tanto, esta invencion pretende incluir todas las combinaciones de dichas realizaciones dentro de su alcance.
Aunque los grupos especificados para cada realizacion generalmente se han enumerado anteriormente por separado, un compuesto de la invencion puede ser uno para el que una o mas variables (por ejemplo, grupos R) se seleccionan de una o mas realizaciones de acuerdo con cualquier formula o formulas anteriormente citadas. Por lo tanto, la
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presente invencion pretende incluir todas las combinaciones de variables de cualquiera de las realizaciones descritas dentro de su alcance.
De forma alternativa, la presente invencion tambien contempla la exclusion de una o mas de las variables especificadas de un grupo o una realizacion, o combinaciones de las mismas.
En ciertos aspectos, la presente divulgacion proporciona profarmacos y derivados de los compuestos de acuerdo con las formulas anteriores. Los profarmacos son derivados de los compuestos de la invencion, que tienen grupos metabolicamente escindibles y se convierten por solvolisis o bajo condiciones fisiologicas en los compuestos de la invencion, que son farmaceuticamente activos, in vivo. Dichos ejemplos incluyen, pero sin limitacion, derivados de ester de colina y similares, esteres de N-alquilmorfolina y similares.
Otros derivados de los compuestos de esta invencion tienen actividad tanto en sus formas de acido como en sus formas de derivados de acidos, pero la forma sensible a los acidos a menudo ofrece ventajas de solubilidad, compatibilidad con los tejidos o liberacion retardada en el organismo de los mamiferos (Bundgard, H, 1985). Los profarmacos incluyen derivados de acidos bien conocidos por los expertos en la tecnica, tales como, por ejemplo, esteres preparados por reaccion del acido original con un alcohol adecuado o amidas preparadas por reaccion del compuesto acido original con una amina sustituida o no sustituida o anhidridos de acido, o anhidridos mixtos. Los esteres, amidas y anhidridos alifaticos o aromaticos sencillos derivados de grupos acidos colgantes de los compuestos de esta invencion son los profarmacos preferidos. En algunos casos es deseable preparar profarmacos de tipo doble ester, tales como (aciloxi)alquil esteres o ((alcoxicarbonil)oxi)alquil esteres. Particularmente utiles son los esteres de alquilo Ci a C8, alquenilo C2 a C8, arilo, arilo C7-Ci2 sustituido, y arilalquilo C7 a Ci2 de los compuestos de la invencion.
Clausulas
i) Un compuesto de acuerdo con la Formula I:
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en la que,
R1 es H, o Me;
Li es -NR2-; -O-, o -CH2-;
Cy es fenilo, o heteroarilo monodclico o bidclico fusionado de 5-9 miembros que comprende de 1 a 4 heteroatomos independientemente seleccionados entre N, O, y S;
R2 es H, o alquilo C1-4;
R3 es H, halo, alquilo C1-4 opcionalmente sustituido con uno o mas independientemente seleccionados entre halo, o alcoxi C1-4 opcionalmente sustituido con uno o mas independientemente seleccionados de halo;
R4 es H, o halo;
R5 es -Cn, halo o es -L2-R6
-L2 esta ausente, o es -C(=O)-, -C(=O)NR7, -NR7C(=O)-, -SO2-, -SO2NR7, o -NR7SO2-;
R6 es H, o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con uno o mas grupos R8 independientemente seleccionados;
R7 es H, o alquilo C1-4;
R8 es OH, CN, halo, o alcoxi C1-4,
La esta ausente, o es -C(=O)-, -C(=O)O- o -C(=O)NH-;
Ra es:
• H,
• alquilo C1-4 opcionalmente sustituido con uno o mas Rb independientemente seleccionados,
• cicloalquilo C3-7 monodclico opcionalmente sustituido con uno o mas Rc independientemente seleccionados, o
• heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados de O, N, y S, o
• heteroarilo monodclico de 5-6 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N, y S;
Rb es
• halo,
• CN,
• OH,
• alcoxi C1-4,
• cicloalquilo C3-7,
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• heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N, y S (heterocicloalquilo esta opcionalmente sustituido con uno o mas independientemente seleccionados entre halo, u oxo),
• -SO2-alquilo Ci-4, o
• -C(=O)NRb1Rb2 Rc es
• halo,
• CN,
• OH,
• alquilo C1-4,
• -C(=O)OH, o
• -C(=O)NRc1Rc2; y
cada Rb1, Rb2, Rc1 y Rc2 se selecciona independientemente entre H, y alquilo C1-4;
o una sal farmaceuticamente aceptable, o un solvato, o un solvato de las sales farmaceuticamente aceptables.
2) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 1, en donde R1 es Me.
3) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-2, en donde Cy es fenilo.
4) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-2, en donde Cy es un heteroarilo monodclico o bidclico fusionado de 5-9 miembros que comprende de 1 a 4 heteroatomos independientemente seleccionados entre N, O, y S.
5) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-2, en donde el heteroarilo monodclico de 5-6 miembros que comprende de 1 a 4 heteroatomos se selecciona independientemente de N, O y S.
6) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-2, en donde Cy es piridilo.
7) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1, en donde el compuesto es de acuerdo con las Formulas IIa, IIb, o IIc:
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en las que L1, R3, R4, La, Ra y R5 son como se describen en la clausula 1,
8) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1, en donde el compuesto es de acuerdo con las Formulas IIIa, IIIb, o IIIc:
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en las que L1, R3, R4, La, Ra y R5 son como se describen en la clausula 1,
9) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-8, en donde L1 es -CH2-.
10) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-8, en donde L1 es O.
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11) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-8, en donde Li es -NR2-.
12) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 11, en donde R2 es H.
13) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 11, en donde R2 es alquilo C1-
4,
14) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 11, en donde R2 es Me.
15) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1, en donde el compuesto es de acuerdo con las Formulas IVa, IVb, IVc, IVd, IVe o IVf:
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en donde R3, R4, R5, La, y Ra son como se describen en la clausula 1.
16) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-15, en donde La esta ausente.
17) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-15, en donde La es -C(=O)-.
18) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1, en donde el compuesto es de acuerdo con las Formulas Va, Vb, Vc, Vd, Ve o Vf:
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en donde R3, R4, R5, La, y Ra son como se describen en la clausula 1,
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19) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable donde R4 es H.
20) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable donde R4 es F, o Cl.
21) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable donde R3 es H.
22) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable donde R3 es alquilo C1-4.
23) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 22, en donde R3 es Me o Et.
24) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-23, en donde R5 es CN.
25) Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-23, en donde R5 es halo.
26) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 25, en donde R5 es F, o Cl.
27) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-23, en donde R5 es -L2-R6, R6 es como se describe en la clausula 1, y L2 es -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2NR7-, o -NR7SO2.
28) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 27, en donde R7 es H.
29) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-23, en donde R5 es -L2-R6, L2 es como se describe en la clausula 1, y R6 es H.
30) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-26, en donde R5 es -L2-R6, L2 es como se describe en la clausula 1, y R6 es alquilo C1-6.
31) Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 30, en donde R6 es Me.
32) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-23, en donde R5 es -L2-R6, L2 es como se describe en la clausula 1, y R6 es alquilo C1-6 sustituido con uno o mas grupos R8 independientemente seleccionados.
33) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 32, en donde R6 es Me, Et, iPr, o tBu, cada uno de los cuales esta sustituido con uno o mas grupos R8 independientemente seleccionados.
34) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 33, en la que R8 es OH, CN, F, Cl, -OMe, u -OEt.
35) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-23, en donde R5 es -L2-R6, en donde L2 es -C(=O)-, o -SO2-, y R6 es alquilo C1-6.
36) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 35, en la que R5 es -C(=O)Me, -C(=O)Et, -SO2Me o -SO2Et.
37) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-23, en donde R5 es -L2-R6, en donde L2 es -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2NR7-, o -NR7SO2-, en donde R7 es H, Me, o Et, y R6 es Me, Et, iPr, o tBu, cada uno de los cuales esta opcionalmente sustituido con uno o mas OH, CN, halo, o alcoxi C1-4 independientemente seleccionados.
38) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 37, en la que R5 es -C(=O)NH2, o -SO2NH2.
39) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-38, en donde Ra es alquilo C1-4.
40) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 39, en donde Ra es Me, o Et.
41) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-38, en donde Ra es alquilo C1-4 sustituido con uno o mas Rb independientemente seleccionados.
42) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 41, en donde Ra es Me, Et, iPr, o tBu.
de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-18, en
de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-18, en
de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-18, en
de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-18, en
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43) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 41 o 42, en donde Rb es F, Cl, CN, u OH.
44) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 41 o 42, en donde Rb es OMe, OEt, u OiPr.
45) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 41 o 42, en donde Rb es ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, o ciclohexilo.
46) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 41 o 42, en donde Rb es oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, o tiomorfolinilo.
47) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 41 o 42, en donde Rb es oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, o tiomorfolinilo, cada uno de los cuales esta sustituido con uno o mas halo, u oxo independientemente seleccionados.
48) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 41 o 42, en donde Rb es - SO2CH3, o -SO2CH2CH3.
49) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 41 o 42, en donde Rb es - C(=O)NH2, -C(=O)NMeH, o -C(=O)NMe2.
50) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-38, en donde Ra es cicloalquilo C3-7 monodclico.
51) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-38, en donde Ra es cicloalquilo C3-7 monodclico sustituido con uno o mas grupos Rc independientemente seleccionados.
52) Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 50 o 51, en donde Ra es ciclopropilo, ciclobutilo, o ciclopentilo.
53) Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 51, en donde Rc es F, Cl, CN, u OH.
54) Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 51, en donde Rc es -Me, -Et, o -iPr.
55) Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 51, en donde Rc es -C(=O)OH.
56) Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 51, en donde Rc es -C(=O)NH2, -C
(=O)NMeH, o -C(= O) NMe2.
57) Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-38, en donde Ra es:
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58) Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-38, en donde Ra es:
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59) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-38, en donde Ra es heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados de O, N, y S.
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60) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 59, en donde Ra es oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, o tiomorfolinilo.
61) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-38, en donde Ra es heteroarilo monodclico de 5-6 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N, y S.
62) Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la clausula 61, en donde Ra es furanilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, triazolilo, oxadiazolilo, tetrazol, piridinilo, pirazinilo, o pirimidinilo.
63) Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la clausula 1, en donde el compuesto se selecciona de la Tabla I.
64) Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la clausula 1, en donde el compuesto es (1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metilo-benzimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxa- mida.
65) Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la clausula 1, en donde el compuesto no es (1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxa- mida.
66) Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la clausula 1, en donde el compuesto es (1R,2R)-N-(6-((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorociclo- propanocarboxamida.
67) Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la clausula 1 en donde el compuesto no es (1R,2R)-N-(6-((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluoro- ciclopropanocarboxamida.
68) Una composicion farmaceutica que comprende un vehfculo farmaceuticamente aceptable y una cantidad farmaceuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-67.
69) La composicion farmaceutica de acuerdo con la clausula 68, que comprende un agente terapeutico adicional.
70) El compuesto o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 167, o la composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 68-69, para su uso en medicina.
71) Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-67, o la composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 68-69, para uso en el tratamiento, o profilaxis de enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del cartflago y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o la hipersecrecion de interferones.
72) Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-67, o la composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 68-69, para uso en el tratamiento, o profilaxis de enfermedades proliferativas.
73) Un compuesto de acuerdo con la clausula 72, en donde las enfermedades proliferativas se seleccionan de mielofibrosis, leucemia linfoblastica aguda de celulas T (T-ALL), mieloma multiple, leucemia linfodtica cronica (CLL), linfoma difuso de celulas B grandes (DLBCL), cancer de pancreas, cancer de fugado, carcinoma hepatocelular (HCC), cancer de pulmon, cancer de mama, y cancer de colon.
74) Un metodo para el tratamiento, o profilaxis de enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del cartflago y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o la hipersecrecion de interferones, que comprende administrar una cantidad de compuesto de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-67, o la composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 68-69, suficiente para efectuar dicho tratamiento o profilaxis.
75) Un metodo para el tratamiento, o profilaxis de enfermedades proliferativas, que comprende administrar una cantidad de compuesto de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-67, o la composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 68-69, suficiente para efectuar dicho tratamiento, o profilaxis.
76) Un metodo de tratamiento de acuerdo con la clausula 76, en donde las enfermedades proliferativas se seleccionan de mielofibrosis, leucemia linfoblastica aguda de celulas T (T-ALL), mieloma multiple, leucemia linfocftica cronica (CLL), linfoma difuso de celulas B grandes (DLBCL), cancer de pancreas, cancer de hfgado, carcinoma hepatocelular (HCC), cancer de pulmon, cancer de mama, y cancer de colon.
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77) El metodo de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 75-77, en donde el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1-67, o la composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 6869, se administra en combinacion con un agente terapeutico adicional.
78) La composicion farmaceutica de acuerdo con la clausula 69, o el metodo de acuerdo con la clausula 78, en donde el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento o profilaxis de enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del carfflago, malformaciones congenitas del cartflago y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o la hipersecrecion de interferones.
79) La composicion farmaceutica de acuerdo con la clausula 69, o el metodo de acuerdo con la clausula 78, en donde el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento, o profilaxis de la mielofibrosis, leucemia linfoblastica aguda de celulas T (T-ALL), mieloma multiple, leucemia linfocftica cronica (CLL), linfoma difuso de celulas B grandes (DLBCL), cancer de pancreas, cancer de hngado, carcinoma hepatocelular (HCC), cancer de pulmon, cancer de mama, y cancer de colon.
Composiciones farmaceuticas
Cuando se emplea como un producto farmaceutico, un compuesto de la invencion se administra tfpicamente en forma de una composicion farmaceutica. Dichas composiciones se pueden preparar de una manera bien conocida en la tecnica farmaceutica y comprenden al menos un compuesto activo de la invencion de acuerdo con la Formula I. Generalmente, un compuesto de la invencion se administra en una cantidad farmaceuticamente eficaz. La cantidad de compuesto de la invencion realmente administrada sera tfpicamente determinada por un medico, a la luz de las circunstancias relevantes, que incluyen la afeccion a tratar, la via de administracion elegida, el compuesto real de la invencion administrado, la edad, el peso, y la respuesta del paciente individual, la gravedad de los smtomas del paciente, y similares.
Las composiciones farmaceuticas de esta invencion se pueden administrar por una variedad de vfas que incluyen oral, rectal, transdermica, subcutanea, intraarticular, intravenosa, intramuscular, e intranasal. Dependiendo de la via prevista de administracion, un compuesto de la invencion se formula preferiblemente como composiciones inyectables u orales o como pomadas, como lociones o como parches, todos para administracion transdermica.
Las composiciones para administracion oral pueden estar en forma de disoluciones o suspensiones lfquidas a granel, o polvos a granel. Mas comunmente, sin embargo, las composiciones se presentan en formas de dosificacion unitarias para facilitar una dosificacion precisa. La expresion "formas de dosificacion unitarias" se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros marnfferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado, en asociacion con un excipiente, vehfculo o portador farmaceutico adecuado. Las formas de dosificacion unitaria tfpicas incluyen ampollas o jeringas precargadas, premedidas, de las composiciones lfquidas o pfldoras, comprimidos, capsulas o similares en el caso de composiciones solidas. En dichas composiciones, el compuesto activo es normalmente un componente menor (de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50% en peso o, preferiblemente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40% en peso) siendo el resto diversos vehfculos o portadores y adyuvantes de procesamiento utiles para formar la forma de dosificacion deseada.
Las formas lfquidas adecuadas para administracion oral pueden incluir un vehfculo acuoso o no acuoso adecuado con tampones, agentes de suspension y dispensacion, colorantes, aromatizantes y similares. Las formas solidas pueden incluir, por ejemplo, cualquiera de los siguientes ingredientes, o un compuesto de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidon o lactosa, un agente desintegrante tal como acido algmico, Primogel o almidon de mafz; un lubricante tal como estearato de magnesio; un deslizante tal como dioxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta o aroma de naranja.
Las composiciones inyectables se basan tfpicamente en disolucion salina esteril inyectable o disolucion salina tamponada con fosfato u otros vehfculos inyectables conocidos en la tecnica. Como antes, el compuesto activo de la invencion de acuerdo con la Formula I en dichas composiciones es tfpicamente un componente menor, que a menudo es de aproximadamente 0,05 a 10% en peso, siendo el resto el vehfculo inyectable y similares.
Las composiciones transdermicas se formulan, tfpicamente, como una pomada o crema topica que contiene el ingrediente o ingredientes activos, generalmente, en una cantidad en el intervalo de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 20% en peso, preferiblemente, de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 20% en peso, preferiblemente, de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 10% en peso y, mas preferiblemente, de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 15% en peso. Cuando se formulan como una pomada, los ingredientes activos se combinan, tfpicamente, con una base de unguento parafrnico o miscible en agua. De manera alternativa, los ingredientes activos se pueden formular en una crema con, por ejemplo, una base de crema de aceite en agua. Dichas formulaciones transdermicas son bien conocidas en la tecnica y, generalmente, incluyen ingredientes adicionales para mejorar la penetracion dermica de la estabilidad de los ingredientes activos o la formulacion. La
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totalidad de dichas formulaciones transdermicas e ingredientes conocidos estan incluidos dentro del alcance de la presente invencion.
Un compuesto de la invencion tambien se puede administrar mediante un dispositivo transdermico. Por consiguiente, la administracion transdermica se puede lograr usando un parche de tipo deposito o membrana porosa, o una variedad de matriz solida.
Los componentes descritos anteriormente para composiciones administrables por via oral, inyectables o administrables topicamente son meramente representativos. Otros materiales, asf como tecnicas de procesamiento y similares, se exponen en la Parte 8 de Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edicion, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, que se incorpora en la presente memoria como referencia.
Un compuesto de la invencion tambien se puede administrar en formas de liberacion sostenida o a partir de sistemas de administracion de farmacos de liberacion sostenida. Una descripcion de los materiales de liberacion sostenida representativos se puede encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences.
Los siguientes ejemplos de formulacion ilustran composiciones farmaceuticas representativas que se pueden preparar de acuerdo con esta invencion. La presente invencion, sin embargo, no esta limitada a las siguientes composiciones farmaceuticas.
Formulacion 1 - Comprimidos
Un compuesto de la invencion de acuerdo con la Formula I se puede mezclar como un polvo seco con un aglutinante de gelatina seco en una relacion en peso aproximada de 1:2. Se puede agregar una pequena cantidad de estearato de magnesio como lubricante. La mezcla se puede formar en comprimidos de 240-270 mg (80-90 mg de compuesto activo de la invencion de acuerdo con la Formula I por comprimido) en una prensa para comprimidos.
Formulacion 2 - Capsulas
Un compuesto de la invencion de acuerdo con la Formula I se puede mezclar como un polvo seco con un diluyente de almidon en una relacion en peso aproximada de 1:1. La mezcla se puede cargar en capsulas de 250 mg (125 mg de compuesto activo de la invencion de acuerdo con la Formula I por capsula).
Formulacion 3 - Liquido
Un compuesto de la invencion de acuerdo con la Formula I (125 mg) se puede mezclar con sacarosa (1,75 g) y goma de xantano (4 mg) y la mezcla resultante se puede mezclar, pasar a traves de un tamiz de malla n.° 10 y luego mezclar con una disolucion preparada previamente de celulosa microcristalina y carboximetilcelulosa sodica (11:89, 50 mg) en agua. El benzoato de sodio (10 mg), aroma, y colorante se pueden diluir con agua y agregar con agitacion. A continuacion, se puede agregar suficiente agua con agitacion. Luego, se puede agregar suficiente agua para producir un volumen total de 5 ml.
Formulacion 4 - Comprimidos
Un compuesto de la invencion de acuerdo con la Formula I se puede mezclar como un polvo seco con un aglutinante de gelatina seco en una relacion en peso aproximada de 1:2. Se puede agregar una pequena cantidad de estearato de magnesio como lubricante. La mezcla se puede formar en comprimidos de 450-900 mg (150-300 mg de compuesto activo de la invencion de acuerdo con la Formula I) en una prensa para comprimidos.
Formulacion 5 - Inyeccion
Un compuesto de la invencion de acuerdo con la Formula I se puede disolver o suspender en un medio acuoso, inyectable, con disolucion salina esteril tamponada a una concentracion de aproximadamente 5 mg/ml.
Formulacion 6 -topica
Se pueden fundir alcohol esteanlico (250 g) y un petrolato blanco (250 g) a aproximadamente 75°C y, a continuacion, se anade una mezcla de un compuesto de la invencion de acuerdo con la Formula I (50 g) metilparabeno (0,25 g), propilparabeno (0,15 g), lauril sulfato de sodio (10 g) y propilenglicol (120 g) disuelto en agua (aproximadamente 370 g) y la mezcla resultante se agita hasta que se congela.
Metodos de tratamiento
Un compuesto de la invencion se puede usar como un agente terapeutico para el tratamiento de afecciones en mairnferos que estan causalmente relacionadas o son atribuibles a la actividad aberrante de JAK. En particular, las afecciones relacionadas con la actividad aberrante de JAK1 y/o TYK2. Por consiguiente, los compuestos y composiciones farmaceuticas de la invencion encuentran uso como agentes terapeuticos para prevenir y/o tratar enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas
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del cardlago y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o la hipersecrecion de interferones en mai^eras, incluidos los seres humanos.
En un aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion para usar como un medicamento.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion para usar en la fabricacion de un medicamento.
En otro aspecto mas, la presente descripcion proporciona un metodo para tratar un mairnfero que padece, o esta en riesgo de padecer, una enfermedad descrita en la presente memoria, comprendiendo dicho metodo administrar una cantidad eficaz para tratar una afeccion o prevenir una afeccion de una o mas de las composiciones farmaceuticas o compuestos de la invencion descritos en la presente memoria. En un aspecto particular, la presente invencion proporciona un metodo para tratar un marnffero que padece, o esta en riesgo de padecer, enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del carfflago, malformaciones congenitas del cardlago, y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o la hipersecrecion de interferones.
En un metodo de aspectos de tratamiento, se describen metodos de tratamiento y/o profilaxis de un mamffero que padece, o esta en riesgo de padecer, una reaccion alergica, comprendiendo dicho metodo administrar una cantidad eficaz para tratar una afeccion o prevenir una afeccion de una o mas de las composiciones farmaceuticas o compuestos de la invencion descritos en la presente memoria. En una realizacion espedfica, la reaccion alergica se selecciona entre la enfermedad alergica de las vfas respiratorias, la sinusitis, el eczema y la urticaria, las alergias a los alimentos y las alergias al veneno de los insectos.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion para usar en el tratamiento, y/o profilaxis de una reaccion alergica. En una realizacion espedfica, la reaccion alergica se selecciona entre la enfermedad alergica de las vfas respiratorias, la sinusitis, el eczema y la urticaria, las alergias a los alimentos y las alergias al veneno de los insectos.
En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion para usar en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento, o profilaxis de una reaccion alergica. En una realizacion espedfica, la reaccion alergica se selecciona entre la enfermedad alergica de las vfas respiratorias, la sinusitis, el eczema y la urticaria, las alergias a los alimentos y las alergias al veneno de los insectos.
En un metodo adicional de aspectos de tratamiento, esta descripcion proporciona metodos de tratamiento y/o profilaxis de un mamffero que padece, o esta en riesgo de padecer, una afeccion inflamatoria. Los metodos comprenden administrar una cantidad eficaz para tratar una afeccion o prevenir una afeccion de una o mas de las composiciones farmaceuticas o compuestos de la invencion descritos en la presente memoria. En una realizacion espedfica, la afeccion inflamatoria se selecciona entre la artritis reumatoide, la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias (por ejemplo, asma) y las enfermedades inflamatorias del intestino.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion para usar en el tratamiento y/o profilaxis de una afeccion inflamatoria. En una realizacion espedfica, la afeccion inflamatoria se selecciona de artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad alergica de las vfas respiratorias (por ejemplo, asma) y enfermedades inflamatorias del intestino.
En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona el compuesto de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion para usar en la preparacion de un medicamento para el tratamiento, y/o profilaxis de una afeccion inflamatoria. En una realizacion espedfica, la afeccion inflamatoria se selecciona de artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad alergica de las vfas respiratorias (por ejemplo, asma) y enfermedades inflamatorias del intestino.
En un metodo adicional de aspectos de tratamiento, esta divulgacion proporciona metodos de tratamiento y/o profilaxis de un mamffero que padece, o esta en riesgo de padecer, una enfermedad autoinmune. Los metodos comprenden administrar una cantidad eficaz para tratar una afeccion o prevenir una afeccion de una o mas de las composiciones farmaceuticas o compuestos de la invencion descritos en la presente memoria. En una realizacion espedfica, la enfermedad autoinmune se selecciona de COPD, asma, lupus eritematoso sistemico, diabetes mellitus de tipo I y enfermedad inflamatoria del intestino.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion para usar en el tratamiento, y/o profilaxis de una enfermedad autoinmune. En una realizacion espedfica, la enfermedad autoinmune se selecciona de EPOC, asma, lupus eritematoso sistemico, diabetes mellitus de tipo I y enfermedad inflamatoria del intestino. En una realizacion mas espedfica, la enfermedad autoinmune es lupus eritematoso sistemico.
En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion para usar en la preparacion de un medicamento para el
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tratamiento, y/o profilaxis de una enfermedad autoinmune. En una realizacion espedfica, la enfermedad autoimmune se selecciona de EPOC, asma, lupus eritematoso sistemico, diabetes mellitus de tipo I y enfermedad inflamatoria del intestino.
En un metodo adicional de aspectos de tratamiento, esta divulgacion proporciona metodos de tratamiento y/o profilaxis de un mairnfero que padece, o esta en riesgo de padecer, una enfermedad proliferativa, comprendiendo dichos metodos administrar una cantidad eficaz para tratar una afeccion o prevenir una afeccion de una o mas de las composiciones farmaceuticas o compuestos de la invencion descritos en la presente memoria. En una realizacion espedfica, la enfermedad proliferativa se selecciona de cancer (por ejemplo, tumores solidos tales como leiomiosarcoma uterino o cancer de prostata), leucemia (por ejemplo, AML, aLl o CLL), mieloma multiple y psoriasis. En una realizacion mas espedfica, la enfermedad proliferativa se selecciona de mielofibrosis, leucemia linfoblastica aguda de celulas T (T-ALL), mieloma multiple, leucemia linfocftica cronica (CLL), linfoma difuso de celulas B grandes (DLBCL), cancer de pancreas, cancer de hugado, carcinoma hepatocelular (HCC), cancer de pulmon, cancer de mama, y cancer de colon.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion para usar en el tratamiento, y/o profilaxis de una enfermedad proliferativa. En una realizacion espedfica, la enfermedad proliferativa se selecciona de cancer (por ejemplo, tumores solidos tales como leiomiosarcoma uterino o cancer de prostata), leucemia (por ejemplo, AML, aLl o CLL), mieloma multiple y psoriasis. En una realizacion mas espedfica, la enfermedad proliferativa se selecciona de mielofibrosis, leucemia linfoblastica aguda de celulas T (T-ALL), mieloma multiple, leucemia linfodtica cronica (CLL), linfoma difuso de celulas B grandes (DLBCL), cancer de pancreas, cancer de Imgado, carcinoma hepatocelular (HCC), cancer de pulmon, cancer de mama, y cancer de colon.
En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion para usar en la preparacion de un medicamento para el tratamiento, y/o profilaxis de una enfermedad proliferativa. En una realizacion espedfica, la enfermedad proliferativa se selecciona de cancer (por ejemplo, tumores solidos tales como leiomiosarcoma uterino o cancer de prostata), leucemia (por ejemplo, AML, ALL o CLL), mieloma multiple y psoriasis. En una realizacion mas espedfica, la enfermedad proliferativa se selecciona de mielofibrosis, leucemia linfoblastica aguda de celulas T (T-ALL), mieloma multiple, leucemia linfodtica cronica (CLL), linfoma difuso de celulas B grandes (DLBCL), cancer de pancreas, cancer de Imgado, carcinoma hepatocelular (HCC), cancer de pulmon, cancer de mama y cancer de colon.
En otro metodo de aspectos de tratamiento, esta descripcion proporciona metodos de tratamiento y/o profilaxis de un mamffero que padece, o esta en riesgo de padecer, el rechazo de trasplante, comprendiendo dichos metodos administrar una cantidad eficaz para tratar una afeccion o prevenir una afeccion de una o mas de las composiciones farmaceuticas o compuestos de la invencion descritos en la presente memoria. En una realizacion espedfica, el rechazo de trasplante es rechazo de trasplante de organo.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion para usar en el tratamiento y/o profilaxis del rechazo de trasplantes. En una realizacion espedfica, el rechazo de trasplante es rechazo de trasplante de organo.
En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion para usar en la preparacion de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis del rechazo de trasplante. En una realizacion espedfica, el rechazo de trasplante es rechazo de trasplante de organo.
En un metodo de aspecto de tratamiento, esta descripcion proporciona un metodo de tratamiento, y/o profilaxis en un mamffero que padece, o esta en riesgo de padecer, enfermedades que implican el deterioro del recambio del cartflago, metodo que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la invencion, o una o mas de las composiciones farmaceuticas descritas en la presente memoria.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion para usar en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades que implican el deterioro del recambio del cartflago.
En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion para usar en la preparacion de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades que implican el deterioro del recambio del cartflago.
La presente divulgacion tambien proporciona un metodo de tratamiento y/o profilaxis de malformaciones congenitas del cartflago, metodo que comprende administrar una cantidad eficaz de una o mas de las composiciones o compuestos farmaceuticos de la invencion descritos en la presente memoria.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion para usar en el tratamiento y/o profilaxis de malformaciones congenitas del cartflago.
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En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion para usar en la preparacion de un medicamento para el tratamiento, y/o profilaxis de malformaciones congenitas del cartflago.
En otro metodo de aspectos de tratamiento, esta divulgacion proporciona metodos de tratamiento y/o profilaxis de un mairnfero que padece, o esta en riesgo de padecer, enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6, comprendiendo dichos metodos administrar una cantidad eficaz de una o mas de las composiciones o compuestos farmaceuticos de la invencion descritos en la presente memoria. En una realizacion espedfica, la enfermedad asociada con la hipersecrecion de IL6 se selecciona de la enfermedad de Castleman y la glomerulonefritis proliferativa mesangial.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion para uso en el tratamiento, y/o profilaxis de enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6. En una realizacion espedfica, la enfermedad asociada con la hipersecrecion de IL6 se selecciona de la enfermedad de Castleman y la glomerulonefritis proliferativa mesangial.
En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion para usar en la preparacion de un medicamento para el tratamiento, y/o profilaxis de enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6. En una realizacion espedfica, la enfermedad asociada con la hipersecrecion de IL6 se selecciona de la enfermedad de Castleman y la glomerulonefritis proliferativa mesangial.
En un metodo adicional de aspectos de tratamiento, esta divulgacion proporciona metodos de tratamiento y/o profilaxis de un mamffero que padece, o esta en riesgo de padecer, enfermedades asociadas con la hipersecrecion de interferones, comprendiendo dichos procedimientos administrar una cantidad eficaz de una o mas de las composiciones o compuestos farmaceuticos de la invencion descritos en la presente memoria. En una realizacion espedfica, la enfermedad asociada con la hipersecrecion de interferones se selecciona entre lupus eritematoso sistemico y cutaneo, nefritis lupica, dermatomiositis, smdrome de Sjogren, psoriasis, y artritis reumatoide.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion para usar en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades asociadas con la hipersecrecion de interferones. En una realizacion espedfica, la enfermedad asociada con la hipersecrecion de interferones se selecciona entre lupus eritematoso sistemico y cutaneo, nefritis lupica, dermatomiositis, smdrome de Sjogren, psoriasis, y artritis reumatoide.
En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un compuesto de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion para usar en la preparacion de un medicamento para el tratamiento, y/o profilaxis de enfermedades asociadas con la hipersecrecion de interferones. En una realizacion espedfica, la enfermedad asociada con la hipersecrecion de interferones se selecciona entre lupus eritematoso sistemico y cutaneo, nefritis lupica, dermatomiositis, smdrome de Sjogren, psoriasis, y artritis reumatoide.
Como un aspecto adicional de la invencion, se proporciona un compuesto de la invencion para usar como un producto farmaceutico, especialmente en el tratamiento y/o la profilaxis de las afecciones y enfermedades anteriormente mencionadas. Tambien se proporciona en la presente memoria el uso de los presentes compuestos en la preparacion de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de una de las afecciones y enfermedades antes mencionadas.
Un regimen particular del presente metodo comprende la administracion a un sujeto que padece una enfermedad que implica inflamacion, de una cantidad eficaz de un compuesto de la invencion durante un penodo de tiempo suficiente para reducir el nivel de inflamacion en el sujeto, y preferiblemente acabar con los procesos responsables de dicha inflamacion. Una realizacion especial del metodo comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de la invencion a un paciente sujeto que padece, o esta en riesgo de padecer, artritis reumatoide, durante un penodo de tiempo suficiente para reducir o prevenir, respectivamente, la inflamacion de las articulaciones de dicho paciente, y preferiblemente acabar con, los procesos responsables de dicha inflamacion.
Un regimen particular adicional del presente metodo comprende la administracion a un sujeto que padece una enfermedad caracterizada por la degradacion del cardago o la articulacion (por ejemplo, artritis reumatoide y/u osteoartritis) de una cantidad eficaz de un compuesto de la invencion durante un penodo de tiempo suficiente para reducir, y preferiblemente acabar con, los procesos autoperpetuadores responsables de dicha degradacion. Una realizacion particular del metodo comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de la invencion a un paciente sujeto que padece o es susceptible de desarrollar osteoartritis, durante un penodo de tiempo suficiente para reducir o prevenir, respectivamente, la degradacion del cardago en las articulaciones de dicho paciente, y preferiblemente acabar con, los procesos autoperpetuadores responsables de dicha degradacion. En una realizacion particular, dicho compuesto puede exhibir propiedades anabolicas y/o anticatabolicas del cardago.
Los niveles de dosis de inyeccion oscilan de aproximadamente 0,1 mg/kg/h a al menos 10 mg/kg/h, todos de aproximadamente 1 a aproximadamente 120 h y, especialmente, de 24 a 96 h. Tambien se puede administrar un bolo de precarga de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o mas, para alcanzar niveles de estado estacionario adecuados. No se espera que la dosis total maxima exceda aproximadamente los 2 g/dfa para un paciente humano de 40 a 80 kg.
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Para la profilaxis y/o el tratamiento de afecciones a largo plazo, como las afecciones degenerativas, el regimen de tratamiento generalmente se extiende durante muchos meses o anos, por lo que se prefiere la dosificacion oral para la conveniencia y tolerancia del paciente. Con la administracion oral, de una a cinco y especialmente de dos a cuatro y, tipicamente, tres dosis orales por dfa son regfmenes representativos. Usando estos patrones de dosificacion, cada dosis proporciona de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de un compuesto de la invencion, proporcionando dosis particulares cada una de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg y, especialmente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg/kg.
Las dosis transdermicas se seleccionan, generalmente, para proporcionar niveles en sangre similares o inferiores a los que se logran usando la dosis de inyeccion.
Cuando se usa para prevenir la aparicion de una afeccion, se administrara un compuesto de la invencion a un paciente con riesgo de desarrollar la afeccion, tipicamente, bajo el asesoramiento y la supervision de un medico, a los niveles de dosificacion descritos anteriormente. Los pacientes en riesgo de desarrollar una enfermedad en particular incluyen generalmente aquellos que tienen un historial familiar de la afeccion, o aquellos que han sido identificados por pruebas geneticas o deteccion como particularmente susceptibles de desarrollar la enfermedad.
Un compuesto de la invencion se puede administrar como el unico agente activo o se puede administrar en combinacion con otros agentes terapeuticos, que incluyen otros compuestos que demuestran la misma o similar actividad terapeutica y que se determina que son seguros y eficaces para dicha administracion combinada. En una realizacion espedfica, la administracion conjunta de dos (o mas) agentes permite utilizar dosis significativamente mas bajas de cada uno, reduciendo de ese modo los efectos secundarios observados.
En una realizacion, un compuesto de la invencion o una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion se administra como un medicamento. En una realizacion espedfica, dicha composicion farmaceutica comprende adicionalmente un ingrediente activo adicional.
En una realizacion, un compuesto de la invencion se administra conjuntamente con otro agente terapeutico para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad que implica inflamacion; los agentes particulares incluyen, pero no se limitan a, agentes inmunorreguladores, por ejemplo, azatioprina, corticosteroides (por ejemplo, prednisolona o dexametasona), ciclofosfamida, ciclosporina A, tacrolimus, micofenolato de mofetilo, muromonab-CD3 (OKT3, por ejemplo, Orthocolone®), ATG, aspirina, acetaminofeno, ibuprofeno, naproxeno, y piroxicam.
En una realizacion, un compuesto de la invencion se administra conjuntamente con otro agente terapeutico para el tratamiento y/o la prevencion de la artritis (por ejemplo, artritis reumatoide); los agentes particulares incluyen, pero no se limitan a, analgesicos, farmacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDS), esteroides, DMARDS sinteticos (por ejemplo, pero no se limitan a, metotrexato, leflunomida, sulfasalazina, auranofina, aurotiomalato de sodio, penicilamina, cloroquina, hidroxicloroquina, azatioprina, y ciclosporina) y DMARDS biologicos (por ejemplo, pero no se limitan a, Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Rituximab, y Abatacept).
En una realizacion, un compuesto de la invencion se administra conjuntamente con otro agente terapeutico para el tratamiento y/o la prevencion de trastornos proliferativos; agentes particulares incluyen, pero no se limitan a: metotrexato, leucovorina, adriamicina, prenisona, bleomicina, ciclofosfamida, 5-fluorouracilo, paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina, vinorelbina, doxorrubicina, tamoxifeno, toremifeno, acetato de megestrol, anastrozol, goserelina, anticuerpo monoclonal anti-HER2 (por ejemplo, Herceptin™), capecitabina, clorhidrato de raloxifeno, inhibidores de EGFR (por ejemplo, lressa®, Tarceva™, Erbitux™), inhibidores de VEGF (por ejemplo, Avastin™), inhibidores del proteosoma (por ejemplo, Velcade™), inhibidores de Glivec® y hsp90 (por ejemplo, 17-AAG). Adicionalmente, un compuesto de la invencion se puede administrar en combinacion con otras terapias que incluyen, pero no se limitan a, radioterapia o cirugfa. En una realizacion espedfica, el trastorno proliferativo se selecciona de cancer, enfermedad mieloproliferativa y leucemia.
En una realizacion, un compuesto de la invencion se administra conjuntamente con otro agente terapeutico para el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades autoinmunes, los agentes particulares incluyen, pero no se limitan a: glucocorticoides, agentes citostaticos (por ejemplo, analogos de purina), agentes alquilantes, (por ejemplo, mostazas de nitrogeno (ciclofosfamida), nitrosoureas, compuestos de platino y otros), antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, azatioprina y mercaptopurina), antibioticos citotoxicos (por ejemplo, dactinomicina, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina y mitramicina), anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-CD20, anti-CD25 o anti-CD3 (OTK3), Atgam® y Timoglobulina®), ciclosporina, tacrolimus, rapamicina (sirolimus), interferones (por ejemplo, IFN- p), protemas de union a TNF (por ejemplo, infliximab (Remicade™), etanercept (Enbrel™) o adalimumab (Humira™)), micofenolato, Fingolimod y Myriocin.
En una realizacion, un compuesto de la invencion se administra conjuntamente con otro agente terapeutico para el tratamiento y/o la prevencion del rechazo de trasplante, los agentes particulares incluyen, pero no se limitan a: inhibidores de calcineurina (por ejemplo, ciclosporina o tacrolimus (FK506)), inhibidores de mTOR (por ejemplo, sirolimus, everolimus), antiproliferativos (por ejemplo, azatioprina, acido micofenolico), corticosteroides (por ejemplo, prednisolona, hidrocortisona), anticuerpos s (por ejemplo, anticuerpos de receptor anticuerpo monoclonal anti-IL-2Ra,
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basiliximab, daclizumab), anticuerpos policlonales anti celulas T (por ejemplo, globulina antitimocito (ATG), globulina antilinfocito (ALG)).
En una realizacion, un compuesto de la invencion se administra conjuntamente con otro agente terapeutico para el tratamiento y/o la prevencion de asma y/o rinitis y/o COPD, los agentes particulares incluyen, pero no se limitan a: agonistas beta2-adrenergicos (por ejemplo, salbutamol, levalbuterol, terbutalina y bitolterol), epinefrina (inhalada o comprimidos), anticolinergicos (por ejemplo, bromuro de ipratropio), glucocorticoides (orales o inhalados) agonistas p2 de accion prolongada (por ejemplo, salmeterol, formoterol, bambuterol, y albuterol oral de liberacion sostenida), combinaciones de esteroides inhalados y broncodilatadores de accion prolongada (por ejemplo fluticasona/salmeterol, budesonida/formoterol), antagonistas de leucotrienos e inhibidores de smtesis (por ejemplo, montelukast, zafirlukast y zileuton), inhibidores de liberacion de mediadores (por ejemplo, cromoglicato y ketotifeno), reguladores biologicos de la respuesta IgE (por ejemplo omalizumab), antihistaminas (por ejemplo, ceterizina, cinarizina, fexofenadina), y vasoconstrictores (por ejemplo oximetazolina, xilometazolina, nafazolina y tramazolina).
Adicionalmente, un compuesto de la invencion se puede administrar en combinacion con terapias de emergencia para asma y/o la COPD, dichas terapias incluyen la administracion de oxfgeno o de heliox, salbutamol o terbutalina nebulizada (opcionalmente combinado con un anticolinergico (por ejemplo ipratropio), esteroides sistemicos (oral o intravenoso, por ejemplo, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona o hidrocortisona), salbutamol intravenoso, betaagonistas no espedficos, inyectados o inhalados (por ejemplo, epinefrina, isoetarina, isoproterenol, metaproterenol), anticolinergicos (IV o nebulizado, por ejemplo, glicopirrolato, atropina, ipratropio), metilxantinas (teofilina, aminofilina, bamifilina), anestesicos inhalatorios que tienen un efecto broncodilatador (por ejemplo, isoflurano, halotano, enflurano), ketamina, sulfato de magnesio intravenoso.
En una realizacion, un compuesto de la invencion se administra conjuntamente con otro agente terapeutico para el tratamiento y/o la prevencion de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), los agentes particulares incluyen, pero no se limitan a: glucocorticoides (por ejemplo, prednisona, budesonida) agentes inmunomoduladores que modifican la smtesis de la enfermedad (por ejemplo, metotrexato, leflunomida, sulfasalazina, mesalazina, azatioprina, 6- mercaptopurina y ciclosporina) y agentes inmunomoduladores que modifican una enfermedad biologica (infliximab, adalimumab, rituximab y abatacept).
En una realizacion, un compuesto de la invencion se administra conjuntamente con otro agente terapeutico para el tratamiento y/o prevencion de SLE; los agentes particulares incluyen, pero no se limitan a: farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad (DMARD) tales como los antipaludicos (por ejemplo plaquenil, hidroxicloroquina), los inmunosupresores (por ejemplo, metotrexato y azatioprina), la ciclofosfamida y el acido micofenolico; farmacos inmunosupresores y analgesicos, tales como los farmacos anti-inflamatorios no esteroideos, los opiaceos (por ejemplo, dextropropoxifeno y co-codamol), los opioides (por ejemplo, hidrocodona, oxicodona, MS Contin o metadona) y el parche transdermico de fentanilo duragesic.
En una realizacion, un compuesto de la invencion se administra conjuntamente con otro agente terapeutico para el tratamiento y/o prevencion de la psoriasis, los agentes particulares incluyen, pero no se limitan a: tratamientos topicos, como disoluciones de bano, cremas hidratantes, cremas medicadas y unguentos que contienen alquitran de hulla, ditranol (antralina), corticosteroides, tales como desoximetasona (Topicort™), fluocinonida, analogos de la vitamina D3 (por ejemplo, calcipotriol), aceite de Argan y retinoides (etretinato, acitretina, tazaroteno), tratamientos sistemicos, tales como metotrexato, ciclosporina, retinoides, tioguanina, hidroxiurea, sulfasalazina, micofenolato de mofetilo, azatioprina, tacrolimus, esteres de acido fumarico o agentes biologicos tales como Amevive™, Enbrel™, Humira™, Remicade™, Raptiva™ y ustekinumab (un bloqueador de IL-12 e IL-23). Ademas, se puede administrar un compuesto de la invencion en combinacion con otras terapias, que incluyen, pero no se limitan a, fototerapia, o fotoquimioterapia (por ejemplo, psoraleno y fototerapia ultravioleta A (PUVA)).
En una realizacion, un compuesto de la invencion se administra conjuntamente con otro agente terapeutico para el tratamiento y/o la prevencion de reaccion alergica, los agentes particulares incluyen, pero no se limitan a: antihistammicos (por ejemplo, cetirizina, difenhidramina, fexofenadina, levocetirizina), glucocorticoides (por ejemplo, prednisona, betametasona, beclometasona, dexametasona), epinefrina, teofilina o antileucotrienos (por ejemplo, montelukast o zafirlukast), anticolinergicos y descongestionantes.
Durante la administracion conjunta se incluye cualquier medio de suministro de dos o mas agentes terapeuticos al paciente como parte del mismo regimen de tratamiento, como sera evidente para el experto en la tecnica. Aunque los dos o mas agentes pueden ser administrados simultaneamente en una unica formulacion, esto no es esencial. Los agentes se pueden administrar en formulaciones diferentes y en momentos diferentes.
Procedimientos de quimica sintetica
General
Los compuestos de la invencion se pueden preparar a partir de materiales de partida facilmente disponibles usando los siguientes procedimientos y metodos generales. Se apreciara que cuando se proporcionan condiciones de procesamiento tfpicas o preferidas (es decir, temperaturas de reaccion, tiempos, relaciones en moles de reactantes, disolventes, presiones, etc.), tambien se pueden usar otras condiciones del procedimiento, a menos que se indique lo
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contrario. Las condiciones de reaccion optimas pueden variar con los reactantes o disolventes particulares usados, pero dichas condiciones pueden ser determinadas por un experto en la tecnica mediante procedimientos de optimizacion rutinarios.
Ademas, como sera evidente para el experto en la tecnica, se pueden necesitar grupos protectores convencionales para prevenir que ciertos grupos funcionales experimenten reacciones no deseadas. La eleccion de un grupo protector adecuado para un grupo funcional particular, asf como las condiciones adecuadas para la proteccion y desproteccion, son bien conocidas en la tecnica (Greene, T W; Wuts, P G M; 1991).
Los siguientes procedimientos se presentan con detalle en cuanto a la preparacion de un compuesto de la invencion como se ha descrito anteriormente en la presente memoria y los ejemplos comparativos. Un experto en la tecnica de la smtesis organica puede preparar un compuesto de la invencion a partir de materiales de partida y reactantes conocidos o disponibles comercialmente.
Todos los reactivos fueron de calidad comercial y se usaron tal como se recibieron sin purificacion adicional, a menos que se indique lo contrario. Se usaron disolventes anhidros disponibles comercialmente para reacciones llevadas a cabo en atmosfera inerte. Se usaron disolventes de calidad reactiva en todos los demas casos, a menos que se especifique lo contrario. Se realizo una cromatograffa en columna sobre gel de sflice 60 (35-70 pm). Se realizo una cromatograffa de capa fina usando placas F-254 de gel de sflice pre-revestidas (espesor 0,25 mm). Se registraron los espectros 1H RMN en un espectrometro Bruker DPX 400 NMR (400 MHz o un espectrometro Bruker Advance 300 NMR (300 MHz)). Los desplazamientos qmmicos (8) para los espectros 1H RMN se presentan en partes por millon (ppm) con relacion a tetrametilsilano (8 0,00) o el pico del disolvente residual apropiado, es decir, CHCl3 (8 7,27), como referencia interna. Las multiplicidades se dan como singlete (s), doblete (d), triplete (t), cuarteto (q), quinteto (quin), multiplete (m) y ancho (br). Los espectros de electropulverizacion MS se obtuvieron en un espectrometro Platform LC/MS o con un sistema Waters Acquity H-Class UPLC acoplado a un espectrometro detector de masas Waters 3100. Columnas utilizadas: Waters Acquity UPLC BEH C18 1,7 pm, 2,1 mm ID x 50 mm L, Waters Acquity UPLC BEH C18 1,7 pm, 2,1 mm ID x 30 mm L, o Waters Xterra MS 5 pm C18, 100 x 4,6 mm. Todos los procedimientos usan gradientes de MeCN/H2O (H2O contiene o bien 0,1% de TFA o bien 0,1% de NH3) o gradientes de MeOH4-hO (H2O contiene 0,05% de TFA). El calentamiento por microondas se realizo con un equipo Biotage Initiator.
Las purificaciones mediante HPLC preparativa se realizaron con un sistema de autopurificacion dirigido a masa acoplado con un espectrometro de masas de cuadrupolo unico ZQ. Todas las purificaciones por HPLC se realizaron con un gradiente de H2O (pH diferentes)/MeCN. Las separaciones por HPLC preparativa en condiciones basicas se llevaron a cabo usualmente usando una precolumna bEh X Brigde C18 (5 pm, 19x5 mm) y una precolumna BEH X Brigde C18 (5 pm, 19x100 mm). Las separaciones en condiciones acidas se llevaron a cabo usualmente usando una precolumna cSh Select C18 (5 pm, 19x5 mm) y una precolumna CSH Select C18 (5 pm, 19x100 mm). El gradiente objetivo fue de x% a x + 25% de acetonitrilo en agua en 5 min con un tiempo de ciclo de 10 min. El caudal de columna fue de 20 ml/min. El volumen de inyeccion vario de 200 a 750 pL. Se uso un divisor de columna capilar para desviar el flujo despues de la separacion de la columna al espectrometro de masas que se diluyo en 1 ml/min de flujo de reposicion. El flujo de reposicion es 0,1% de acido formico en metanol. Todas las muestras se purificaron mediante una coleccion de fracciones dirigidas por masa de Waters.
Tabla l. Lista de abreviaturas utilizadas en la seccion experimental:
Abreviatura
Definicion Abreviatura Definicion
AcOH
Acido acetico DCM diclorometano
ATP
Trifosfato de adenosina DMF dimetil formamida
BINAP
2,2'-bis(difenilfosfino)-1, 1 '-binaftilo DMSO dimetilsulfoxido
br s
singlete ancho DPPA difenilfosforilazida
Brettphos
2-(diciclohexilfosfino)3,6-dimetoxi- 2',4',6'-triisopropilo-1,1 '-bifenilo Dsc'd completamente descrito antes
BSA
Albumina de suero bovino TDT ditiotreitol
C'ial
disponible comercialmente EDTA acido etilendiaminotetraacetico
Conc
concentrado EGTA acido etilenglicol tetraacetico
Cpd
compuesto Et2O dietil eter
EtOH
etanol Et3B trietilborano
FACS
clasificacion de celula activada por fluorescencia Et3N trietilamina
FBS
Suero fetal bovino EtOAc acetato de etilo
g
gramo NMP N-metilpirrolidona
h
hora NMR resonancia magnetica nuclear
HEPES
acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina- etanosulfonico PBS disolucion salina tamponada con fosfato
HPLC
cromatograffa lfquida de alta presion pBSK fagemido pBluescript
Int
intermedio Pd(OAc)2 acetato de paladio(II)
iPrOH
iso-Propanol Pd(PPh3)4 tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0)
Abreviatura
Definition Abreviatura Definicion
m
multiplete Pd2(dba)3 tris(dibencilidenacetona)dipaladio(0)
M
masa PdCl2(dppf). DCM [1,1 '-bis(difenilfosfino)ferroceno] dicloro- paladio(II), complejo con diclorometano
MC
metilcelulosa PDX xenoinjertos derivados de pacientes
MeCN
acetonitrilo PET tomografia de emision de positrones
Mel
yodometano PMB para-metoxibencilo
MeNH2
metil amina ppm partes por millon
Metanol
MeOH p-TsOH.H2O monohidrato de acido para- toluensulfonico
mg
miligramo rt temperatura ambiente
mim
minuto s singlete
mililitro
ml sat saturado
mmol
milimoles SiO2 sflice
MOPS
acido 3-(N-morfolin)propano- sulfonico SM material de partida
MS Ms'd
peso molecular medido por espectrometria de masas TFA Acido trifluoroacetico
Mtd
metodo THF tetrahidrofurano
MW
peso molecular Xantphos 4,5-Bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno
NCS
N-clorosuccinimida XPhos 2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropil- bifenilo
Preparacion sintetica del compuesto de la invencion
Ejemplo 1. Sintesis de los compuestos intermedios de la invencion
5 1.1. Smtesis de bis-(4-metoxi-bencil)-amina (Int. 1)
imagen25
Se combinaron p-anisalde^do (411 mmol), 4-metoxibencilamina (411 mmol) y tolueno (500 ml) en un matraz de fondo redondo provisto de un condensador y una trampa Dean-Stark. La reaction se calento a reflujo durante 1 h, durante 10 lo cual se elimino agua de la mezcla de reaccion. Se enfrio y se concentro la reaccion. El residuo se disolvio en MeOH (120 ml). La mezcla se enfrio hasta 5°C y se anadio NaBH4 (205 mmol) en porciones durante 45 min. La reaccion se calento lentamente a reflujo. Despues de 2 ha reflujo, la reaccion se enfrio hasta la temperatura ambiente y se concentro. El residuo se disolvio en EtOAc. La capa organica se lavo (3 x H2O y salmuera), se seco (Na2SO4) y se concentro para producir el producto deseado.
15 1.2. Smtesis de (6-Bromo-1-metil-1H-benzoimidazol-4-il)-bis- (4-metoxi-bencil)-amina (lnt.2)
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1.2.1. Etapa i: 5-Bromo-1,3-difluoro-2-nitro-benceno
Se anadio gota a gota una disolucion de 4-bromo-2,6-difluoroanilina (240 mmol) en AcOH (150 ml) a una suspension 20 de NaBO3.4 H2O (325 mmol) en AcOH (450 ml) a 70°C durante 30 min. Se anadieron otros 2.080 mmol de NaBO3.4
H2O durante 5 horas a la mezcla. Durante este periodo, la mezcla se agito a 70°C. La mezcla se vertio en agua y se extrajo con Et2O. La capa organica se combino con otra disolucion de Et2O obtenida de otra reaccion usando las mismas condiciones descritas anteriormente. Se concentro la mezcla. Se formo un precipitado y se separo por
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filtration. El filtrado se concentro para proporcionar el producto deseado despues de la cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, eter de petroleo).
1.2.2. Etapa ii: (5-Bromo-3-fluoro-2-nitro-fenil)-metil-amina
Se anadio gota a gota 2 M de MeNH2 en THF (82 ml) a una disolucion de 5-bromo-1,3-difluoro-2-nitrobenceno (164 mmol) y Cs2CO3 (197 mmol) en THF (1 L). La mezcla de reaction se agito a 0°C durante 1 hora y luego a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se elimino a presion reducida. El residuo se repartio entre EtOAc y H2O. Las dos fases se separaron y la capa organica se seco (Na2SO4) y se concentro para proporcionar el producto deseado.
1.2.3. Etapa iii: 5-Bromo-N,N-bis-(4-metoxi-bencil)-N'-metil-2-nitro-benceno-1,3-diamina
Se agito una mezcla de bis-(4-metoxi-bencil)-amina (346 mmol), 5-bromo-3-fluoro-N-metil-2-nitroanilina (297 mmol) y Et3N (891 mmol) a 120°C durante 16 h. A continuation, se enfrio la mezcla. El producto bruto se combino con otro obtenido siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente. La mezcla resultante se diluyo en EtOAc y se lavo (2 x 0,2 M de HCl, H2O y NaHCO3 sat.). La fase organica se seco (Na2SO4) y se concentro para proporcionar el producto deseado.
1.2.4. Etapa iv: 5-Bromo-N,N-bis-(4-metoxi-bencil)-N"-metil-benceno-1,2,3-triamina
Se agito una mezcla de 5-Bromo-N,N-bis-(4-metoxi-bencil)-N'-metil-2-nitro-benceno-1,3-diamina (170 mmol), NH4Cl (2.038 mmol) y Zn ( 2.034 mmol) en MeoH/THF 1:1 (1 L) a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se enfrio hasta 0°C y se anadio HCOOH (20 ml) lentamente. La mezcla se dejo alcanzar la temperatura ambiente y se agito durante 1 h. La mezcla se filtro y combino con otra obtenida siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Se concentro la mezcla resultante. El residuo se disolvio en DCM. La mezcla organica se lavo (NH4Cl sat.), se seco (Na2SO4) y se concentro para proporcionar el producto deseado.
1.2.5. Etapa v: (6-Bromo-1-metil-1H-benzoimidazol-4-il)-bis-(4-metoxi-bencil)-amina
Se disolvio 5-Bromo-N,N-bis-(4-metoxi-bencil)-N"-metil-benceno-1,2,3-triamina (170 mmol) en una mezcla de HC(OEt)3 (100 mol) ) y MeCN (500 ml). La mezcla se agito a 85°C durante 0,5 h y luego a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 h. La mezcla se combino con otra obtenida siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente. La mezcla resultante se concentro y el residuo se purifico mediante cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, 15:85 a 60:40 de EtOAc/eter de petroleo) para obtener el producto deseado.
1.3. Sntesis de 5-{7-[Bis-(4-metoxi-bencil)-amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5-iloxi}-4-metil-piridin-2-carbonitrilo (Int. 3).
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1.3.1. Etapa i: Bis-(4-metoxi-bencil)-[1-metil-6-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2] dioxaborolan-2-il)-1H-benzoimidazol-4-il]- amina
Se sonico una mezcla de (6-bromo-1-metil-1H-benzoimidazol-4-il)-bis-(4-metoxi-bencil)-amina (54 mmol), bis(pinacolato)diboro (81 mmol), PdCl2(dppf).DCM (2,71 mmol) y KOAc (162,5 mmol) en DMF (150 ml) durante 5 minutos bajo una corriente de nitrogeno. La mezcla se agito despues a 110°C en un matraz de fondo redondo provisto de un condensador durante 1 h. La mezcla se filtro a traves de una almohadilla de celite y se concentro el filtrado. El residuo se disolvio en EtOAc y la capa organica se lavo (H2O), se seco (Na2SO4) y se concentro para producir el producto deseado.
1.3.2. Etapa ii: 5-{7-[Bis-(4-metoxi-bencil)-amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5-iloxi}-4-metilpiridina-2-carbonitrilo
Se anadio H2O2 al 30% en peso en H2O (20 ml) a una disolucion de N,N-bis(4-metoxibencil)-1-metil-6-(4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-4-amina (58,5 mmol) en DMF (600 ml) y la mezcla se agito durante aproximadamente 16 ha temperatura ambiente. La reaccion se inactivo con Na2SO3 acuoso al 5%. La mezcla se extrajo con EtOAc. La capa organica se lavo (H2O), se seco (Na2SO4) y se concentro para producir el producto deseado.
1.4. Metodo general: yodacion orto-dirigida
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en la que W puede ser: -N=, -CH=, -C(Cl)=; Y puede ser: -N=, -C(CN)=
1.4.1. Metodo A1
Se agito una mezcla del material de partida amino aromatico o heteroaromatico (1 eq), Ac^SO4 (1 eq) e I2 (1 eq) en EtOH, a temperaturas que varian desde la temperatura ambiente hasta 50°C durante un periodo que puede variar desde 1 h hasta aproximadamente 16 h. La mezcla se filtra, concentra y diluye en un disolvente organico. La mezcla organica se somete a un tratamiento acuoso. El disolvente se elimina a presion reducida y el residuo se purifica mediante cromatografia en columna ultrarrapida para producir el producto deseado.
1.4.2. Ejemplo ilustrativo del metodo A1: s^ntesis de 4-amino-3-fluoro-5-yodo-benzonitrilo (Int.4).
imagen29
Se agito una mezcla de 4-amino-3-fluorobenzonitrilo (147 mmol), I2 (147 mmol) y Ag2SO4 (147 mmol) en EtOH (700 ml) a temperatura ambiente durante 1,5 h. Se filtro y concentro la mezcla. El residuo se disolvio en EtOAc y se lavo (Na2S2O3 x 3 sat.). Se filtro y concentro la capa organica (Na2SO4). El residuo se purifico por cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, ciclohexano/EtOAc de 95:5 a 70:30) para producir el producto deseado.
1.4.3. Metodo A2
Se agito una mezcla del material de partida amino aromatico o heteroaromatico (1 eq), Ac£SO4 (de 3 a 4 eq) e I2 (de 3 a 4 eq) en EtOH a 70°C durante 16 h. Se podian agregar mas equivalentes de I2 y Ag2SO4 para aumentar la conversion. Se filtro y concentro la mezcla. El residuo se purifico mediante cromatografia en columna ultrarrapida para producir el producto deseado.
1.5. Ejemplo ilustrativo del metodo A2: sntesis de 5-amino-6-fluoro-4-yodo-piridina-2-carbonitrilo (Int. 5).
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Se agito una mezcla de Int.11 (3,62 mmol), I2 (14,5 mmol) y Ag2SO4 (14,5 mmol) en EtOH (200 mL) a 70°C durante 16 h. Se anadieron 5 equivalentes mas de I2 y Ag2SO4y la reaction se agito a 70°C durante otras 72 h. La mezcla se filtro, se concentro y se purifico por cromatografia en columna ultrarrapida (SiC2, de 20:80 a 40:60 de EtOAc/ciclohexano) para producir el producto deseado.
1.6. Metodo general: introduccion del grupo del nitrilo por la reaccion de Negishi
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en la que Ra puede ser arilo o heteroarilo; y X puede ser Cl, Br o I.
1.6.1. Metodo B
Se calento una mezcla de haluro de arilo/heteroarilo (1 eq), cianuro de cinc (de 1 a 3 eq), Pd (PPh3)4 (de 0,1 a 0,2 eq) en DMF, a 150°C en un aparato de microondas durante un periodo que vario de 5 min a 0,5 h. Se filtro y concentro la mezcla. El residuo se diluyo con un disolvente organico. La mezcla organica se sometio a un tratamiento y el disolvente se elimino a presion reducida. El residuo se trituro o purifico mediante cromatografia en columna ultrarrapida para producir el producto deseado.
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Se cargo un tubo de microondas con 2-doro-5-fluoro-4-metilpiridina (5,5 mmol), Zn (CN)2 (16,6 mmol), Pd (PPh3)4 (1,1 mmol) en DMF (20 ml). La mezcla se agito a 150°C durante 5 min en un reactor de microondas. La mezcla se combino con otros productos brutos obtenidos siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Se filtro la mezcla resultante. El filtrado se concentro a presion reducida. El residuo se diluyo con EtOAc, se lavo (NH4Cl sat.), se seco (Na2SO4) y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, de 5:95 a 15:85 de EtOAc/eter de petroleo) para producir el producto deseado.
1.7. Metodo general: Suzuki con acido metil boronico
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en la que W puede ser: -N=, -CH=, -C(Cl) =; e Y puede ser: -N=, -C(CN)=; y X puede ser -I o -Br.
1.7.1. Metodo C
Se agito una mezcla del haluro aromatico/heteroaromatico (1 eq), acido metil boronico (de 1,3 a 3 eq), Pd(dppf)Cl2.DCM (de 0,11 a 0,2 eq) y Cs2CO3 (de 3 a 5 eq) en 1,4-dioxano, a 100°C. La mezcla se diluyo con un disolvente organico. La mezcla organica se sometio a un tratamiento acuoso y el disolvente se elimino a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatografia en columna ultrarrapida para producir el producto deseado.
1.7.2. Ejemplo ilustrativo del metodo C: s'intesis de 5-amino-6-fluoro-4-metil-piridina-2-carbonitrilo (Int.12).
F F
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Se agito una mezcla de Int.5 (3 mmol), acido metil boronico (9,1 mmol), Pd(dppf)Cl2.DCM (0,32 mmol) y Cs2CO3 (15,2 mmol) en 1,4-dioxano (8 ml), a 105°C durante 5 h. La mezcla se diluyo (EtOAc), se lavo (NaHcO3 sat.), se seco (Na2SO4) y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, de 10:90 a 50:50 de EtOAc/eter de petroleo) para producir el producto deseado.
1.8. S^ntesis de 6-bromo-2-fluoro-piridin-3-ilamina (Int.15)
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Se agito una mezcla de 2-fluoropiridin-3-amina (44,6 mmol) y KOAc (44,6 mmol) en AcOH se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se enfrio a 0°C y se anadio Br2 (44,6 mmol) gota a gota. La mezcla se agito a 0°C durante 15 minutos. La mezcla se concentro y el residuo se disolvio en EtOAc/MeOH. La disolucion organica se lavo (NaHCO3 sat., Na2S2O3 sat.), se seco (Na2SO4) y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, de 100:0 a 80:20 de eter de petroleo/EtOAc) para producir el producto deseado.
1.9. S^ntesis de 2-bromo-6-fluoro-4-metanosulfonil-fenilamina (Int. 16).
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Se agito una mezcla de 2-fluoro-4-metilsulfonil-anilina (22,76 mmol) y KOAc (22,7 mmol) en AcOH a temperatura ambiente. La mezcla se enfrio hasta 0°C y se anadio Br2 (22,7 mmol) gota a gota. La mezcla se agito durante 30 min
a 0°C. La mezcla se concentro y el residuo se recogio en EtOAc. La mezcla organica se lavo (NaHCO3 sat., Na2S2O3 sat.), se seco (Na2SO4) y se concentro para producir el producto deseado.
1.10. Sntesis de 4-amino-3-etil-5-fluoro-benzonitrilo (Int. 17).
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Se suspendio una mezcla de Cs2CO3 (46 mmol) y Pd(dppf)Cl2.DCM (0,76 mmol) en DMF (35 ml) y se desgasifico con nitrogeno. Se anadieron H2O (400 ^L), Et3B 1 M en ThF (11,5 mL) y una disolucion de Int.4 (7,63 mmol) en DMF (5 mL) a la mezcla y la reaction se agito a 60°C durante 30 min. La mezcla se concentro y el residuo se recogio en EtOAc, se lavo (NaHCO3 sat., H2O), se seco (Na2SO4) y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia 10 ultrarrapida en columna (SiO2, de 100:0 a 95:5 de eter de petroleo/EtOAc) para producir el producto deseado.
1.11. Metodo general: conversion de NH2 en yoduro
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en la que R10 puede ser Me o Et.
15 1.11.1. Metodo D
Se agrego HCl Conc. (6 eq) gota a gota a una mezcla del compuesto amino aromatico/heteroaromatico (1 eq) en H2O a 0°C. Se agrego gota a gota una disolucion de NaNO2 (1,05 eq) en H2O. La mezcla resultante se agito a 0°C durante 15 min. Se agrego gota a gota una disolucion de KI (1,05 eq) en H2O. La mezcla se agito a 0°C durante 15 minutos y durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla se extrajo con un disolvente organico. Despues del tratamiento 20 acuoso y la elimination del disolvente a presion reducida, el residuo sometio a trituration o cromatografia para producir el producto deseado.
1.11.2. Ejemplo ilustrativo del metodo D: s'rntesis de 5-yodo-4-metil-piridina-2-carbonitrilo (Int.18).
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Se agrego HCl Conc. (0,9 ml) gota a gota a una mezcla de Int.8 (1,88 mmol) en H2O (10 ml) a 0°C, seguido de la 25 adicion gota a gota de una disolucion de NaNO2 (1,97 mmol) en H2O (0,5 ml). La mezcla resultante se agito a 0°C durante 15 minutos. Se anadio gota a gota una disolucion de KI (1,97 mmol) en H2O (1 ml). La mezcla resultante se agito a 0°C durante 15 minutos y durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla se extrajo con EtOAc. La capa organica se lavo (H2O), se seco y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, de 100:0 a 75:25 de ciclohexano/EtOAc) para producir el producto deseado.
30 1.12. Sntesis de 6-bromo-4-metil-piridin-3-ilamina (Int.20)
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Se agito una mezcla de NH4Cl (14,9 mmol) y polvo de hierro (18,4 mmol) en H2O (5 mL) a 90°C. Se anadio 2-bromo- 4-metil-5-nitropiridina (2,3 mmol) por partes. La mezcla se agito a 90°C durante 1 hora y 15 minutos. La reaccion se detuvo y se extrajo con EtOAc. La capa organica se seco (Na2SO4) y se concentro para producir el producto deseado.
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Se agito una mezcla de 4-amino-3-fluorobenzonitrilo (184 mmol) y NCS (276 mmol) en AcOH (300 ml) a 70°C durante aproximadamente 16 h. Se concentro la mezcla. Se anadio H2O al residuo y el producto solido se separo por filtration y se lavo (NaHCO3 sat. y H2O). Para eliminar H2O, se anadio THF y se elimino a presion reducida para producir el 5 producto deseado.
1.14. Sntesis de 3-etil-4-hidroxibenzonitrilo (Int.22)
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Se anadio H2SO4 concentrado (3,4 ml) gota a gota a una disolucion de 4-amino-3-etilbenzonitrilo (6,84 mmol) en H2O (12 ml) a 0°C. Se anadio una disolucion de NaNO2 (7,52 mmol) en H2O (5 ml) gota a gota a 0°C a la mezcla resultante. 10 La reaction se agito a 0°C durante 30 min y a 100°C durante 2 h. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente y se
extrajo con EtOAc. La capa organica se lavo (H2O), se seco y se concentro para producir el producto deseado.
1.15. Smtesis de 2-cloro-3-fluoro-piridin-4-ilamina (Int.23)
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1.15.1. Etapa i: N-(2-cloro-3-fluoro-4-piridil)carbamato de terc-butilo
15 Se anadio difenilfosforilazida (DPPA) (129 mmol) a una mezcla de acido 2-cloro-3-fluoropiridin-4-carboxflico (85,7 mmol), Et3N (257 mmol) en 1:1 de terc-BuOH/tolueno (200 ml). La mezcla se calento a 110°C durante 4 h. La mezcla se diluyo con H2O y se extrajo con DCM. La capa organica se seco (Na2SO4) y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia ultrarrapida en columna (SiO2, de 100:0 a 80:20 de DCM/EtOAc) para producir el producto deseado N- (2-cloro-3-fluoro-4-piridil)carbamato de terc-butilo.
20 1.15.2. Etapa ii: 2-cloro-3-fluoro-piridin-4-ilamina
Se agito una disolucion de N-(2-cloro-3-fluoro-4-piridil)carbamato de terc-butilo (20,2 mmol) en 1:2 de TFA/DCM (45 ml) a temperatura ambiente durante 6 h. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo se purifico por cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, de 100:0 a 90:10 de DCM/NH3 7N en MeOH) para producir el producto deseado.
1.16. Metodo general: acoplamiento de Buchwald con (6-Bromo-1-metil-1H-benzoimidazol-4-il) -bis-(4-metoxi-bencil) 25 -amina (Int.2).
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en la que RA puede ser arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido.
1.16.1. Metodo E1
Una mezcla de Int.2 (1 eq), la anilina correspondiente (1,1 eq), Cs2CO3 (2 eq) y XPhos (0,3 eq) en tolueno seco se 30 purgo con un gas inerte antes de anadir Pd(OAc)2 (de 0,1 a 0,15 eq). La mezcla se agito a 110°C durante aproximadamente 16 h. La mezcla se dividio entre un disolvente organico y una fase acuosa. Las dos capas se separaron y la capa organica se seco y se concentro. Alternativamente, la mezcla de reaccion se filtro y concentro. El residuo se pudo mantener como tal o purificar por cromatografia para producir el producto deseado.
1.16.2. Ejemplo ilustrativo del metodo E1: sntesis de 5-{7-[Bis-(4-metoxi-bencil)-amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5- 35 ilamino)-4-etil-piridina-2-carbonitrilo (Int.24).
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Una mezcla de Int.2 (0,75 mmol), Int.10 (0,79 mmol), Cs2CO3 (1,5 mmol) y XPhos (0,225 mmol) en tolueno seco (6,3 mL) se purgo con argon antes de anadir Pd(OAc)2 (0,075 mmol). La mezcla se agito a 110°C durante aproximadamente 16 h. La mezcla se diluyo con H2O y se extrajo con DCM. La capa organica se lavo (salmuera), se seco (Na2SO4) y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, de 100:0 a 50:50 de ciclohexano/EtOAc) para producir el producto deseado.
1.16.3. Metodo E2
Una mezcla de Int.2 (1 eq), la anilina correspondiente (1,1 eq), Cs2CO3 (de 4 a 5 eq) y XPhos (0,4 eq) en tolueno seco se purgo con un gas inerte antes de anadir Pd(OAc)2 (de 0,2 a 0,3 eq). La mezcla se agito a 110°C durante un periodo que vario de 1 h a 24 h. La mezcla se pudo dividir entre un disolvente organico y una fase acuosa. Las dos capas se separaron y la capa organica se seco y se concentro. Alternativamente, la mezcla de reaction se filtro y concentro. El residuo pudo mantenerse como tal o purificarse por cromatografia para producir el producto deseado.
1.16.4. Ejemplo ilustrativo del metodo E2: smtesis de 5-{7-[Bis-(4-metoxi-bencil)-amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5- ilamino}-4-metil-piridina-2-carbonitrilo (Int.27).
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Una mezcla de Int.2 (4 mmol), Int.8 (4,3 mmol), Cs2CO3 (20 mmol) y XPhos (1,6 mmol) en tolueno seco (35 mL) se purgo con argon durante 10 min antes de anadir Pd(OAc)2 (1,2 mmol). La mezcla se agito a 110°C durante aproximadamente 16 h. La mezcla se filtro a traves de una almohadilla de celite y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, de 98:2 a 25:75 de ciclohexano/EtOAc) para producir el producto deseado.
1.16.5. Metodo E3
Una mezcla de Int.2 (1 eq), la anilina (1,1 eq), BINAP (0,3 eq), Cs2CO3 (4 eq) y Pd(OAc)2 (0,2 eq) en 1,4-dioxano seco se desgasifico con un gas inerte. La reaccion se agito durante un periodo que vario de 4 horas a aproximadamente 16 horas a 100-110°C. La mezcla se pudo dividir entre un disolvente organico y una fase acuosa. Las dos capas se separaron y la capa organica se seco y se concentro. Alternativamente, la mezcla de reaccion se filtro y concentro. El residuo pudo mantenerse como tal o purificarse por cromatografia para producir el producto deseado.
1.16.6. Ejemplo ilustrativo del metodo E3: smtesis de N6-(2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-N4,N4-bis-(4-metoxi-bencil)- 1-metil-1H-benzoimidazol-4,6-diamina (Int. 34).
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Una mezcla de Int.2 (1,48 mmol), 2-fluoro-4-metilsulfonil-anilina (1,58 mmol), BINAP (0,47 mmol), Cs2CO3 (6,32 mmol) y Pd(OAc)2 (0,32 mmol) en 1,4-dioxano seco (15 ml) se desgasifico con nitrogeno. La reaccion se agito a 100°C durante aproximadamente 16 h. La mezcla se diluyo con EtOAc y la capa organica se lavo (H2O), se seco (Na2SO4) y se concentro para producir el producto deseado.
1.16.7. Metodo E4
Una mezcla de Int.2 (1 eq), la anilina (1,1 eq), Brettphos (0,1 eq), Cs2CO3 (5 eq) y Pd(OAc)2 (0,05 eq) en 1,4-dioxano seco se desgasifico con un gas inerte. La reaccion se agito durante un periodo que vario de 2 h a aproximadamente 8 ha 85-95°C. La mezcla se pudo dividir entre un disolvente organico y una fase acuosa. Las dos capas se separaron y la capa organica se seco y se concentro. Alternativamente, la mezcla de reaccion pudo filtrarse y concentrarse. El residuo se pudo mantener como tal o purificar por cromatografia para producir el producto deseado.
1.16.8. Ejemplo ilustrativo del metodo E4: s^ntesis de N6-(2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-6-il)-N4,N4-bis[(4- metoxifenil)metil]-1-metil-bencimidazol-4,6-diamina (Int. 78).
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Una mezcla de Int.2 (1,17 mmol), 2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-6-amina (1,29 mmol), Brettphos (0,117 mmol), CS2CO3 5 (6,32 mmol) y Pd(OAc)2 (0,058 mmol) en 1,4-dioxano seco (15 ml) se desgasifico con nitrogeno. La reaction se agito
a 90°C durante aproximadamente 5 h. La mezcla se diluyo con EtOAc y la capa organica se lavo (H2O), se seco (Na2SO4) y se concentro para producir el producto deseado.
1.17. Metodo general: metilacion del producto de Buchwald
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10 en la que RA puede ser arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido.
1.17.1. Metodo F
Se anadio NaH (60% en aceite mineral, de 1,1 a 3 eq) a una disolucion del intermedio obtenido a partir del acoplamiento de Buchwald (1 eq) en THF o DMF a 0°C. La mezcla se agito a 0°C durante 30 min. Se agrego Mel (de 1,1 a 3 eq) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante un periodo que vario de 1 hora a aproximadamente 16 horas. La 15 mezcla se repartio entre un disolvente organico y una fase acuosa. Las dos capas se separaron y la capa organica se seco y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia sobre sflice o se uso como tal sin purification adicional.
1.17.2. Ejemplo ilustrativo del metodo F: sntesis de N6-(2-Fluoro-4-metanosulfonil-6-metilfenil)-N4,N4-bis-(4-metoxi- bencil)-1,N6-dimetil-1H-benzoimidazol-4,6-diamina (Int. 37).
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20 Se anadio NaH (60% en aceite mineral, 6,76 mmol) a una disolucion de lnt.35 (2,25 mmol) en THF (10 ml) a 0°C. La mezcla se agito a 0°C durante 30 minutos. Se anadio Mel (6,76 mmol) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 h. La mezcla se diluyo con EtOAc y se lavo con H2O. La capa organica se seco (Na2SO4) y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, de 20:80 a 80:20 de EtOAc/eter de petroleo) para producir el producto deseado.
25 1.17.3. Ejemplo ilustrativo del metodo F: sntesis de N4,N4-bis[(4-metoxifenil)metil]-N6,1-dimetil-N6-(2-metil-4-
metilsulfonil-fenil)bencimidazol-4,6-diamina (Int.49A) y N6-(4-etilsulfonil-2-metilfenil)-N4,N4-bis[(4-metoxifenil)metil]- N6,1-dimetilbencimidazol-4,6-diamina (Int.49B).
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Se anadio NaH (60% en aceite mineral, 4,86 mmol) a una disolucion de lnt.36 (1,62 mmol) en THF (10 ml) a 0°C. La 30 mezcla se agito a 0°C durante 30 minutos. Se anadio Mel (4,86 mmol) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se diluyo con EtOAc y se lavo con H2O. La capa organica se seco (Na2SO4) y se concentro. La cromatografia en columna ultrarrapida (SD2, de 20:80 a 80:20 de EtOAc/eter de petroleo) dio como resultado una mezcla del producto deseado (Int.49A, producto mas importante) junto con el producto secundario (Int.49B, producto menos importante).
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Una mezcla de Int.2 (0,4 mmol), Int.22 (0,4 mmol), CuI (0,06 mmol) y CS2CO3 (1 mmol) en piridina (2 ml) se barrio con argon, se cerro hermeticamente y se calento en un reactor de microondas durante 3 h a 200°C. La mezcla se diluyo con H2O y se extrajo con EtOAc. La capa organica se seco y se concentro para producir el producto deseado.
1.19. Metodo general: acoplamiento de Ullmann entre 5- {7- [bis- (4-metoxi-bencil} -amino] -3-metil-3H-benzoimidazol- 5-iloxi} -4-metil-piridin-2-carbonitrilo (Int. 3) y haluros aromaticos o heteroaromaticos
imagen53
en la que RA puede ser arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido.
1.19.1. Metodo G
Una mezcla de Int.3 (1 eq), el haluro de arilo (de 1,2 a 1,3 eq), CuI (de 0,1 a 0,2 eq), N,N-dimetilglicina (de 0,3 a 0,5 eq) y Cs2CO3 (3 eq) en 1:1 de DMF/1,4-dioxano se barrio con un gas inerte y se agito a 110°C durante un periodo que vario de 4,5 h a 16 h. La mezcla se filtro, se repartio entre un disolvente organico y una fase acuosa. Las dos capas se separaron y la capa organica se seco y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia sobre sflice.
1.19.2. Ejemplo ilustrativo del metodo G: s'intesis de 5-{7-[bis-(4-metoxi-bencil)-amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5- iloxi}-4-metil-piridina-2-carbonitrito (Int.51).
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Una mezcla de Int.3 (0,39 mmol), Int.18 (0,47 mmol), CuI (0,08 mmol), N,N-dimetilglicina (0,2 mmol) y Cs2CO3 (1,17 mmol) en 1:1 de DMF/1,4-dioxano (4 ml) se barrio con argon y se agito a 110°C durante aproximadamente 16 h en un tubo hermeticamente cerrado. La mezcla de reaction se enfrio a temperatura ambiente y se filtro a traves de una almohadilla de Celite. El filtrado se concentro. Se anadio agua y la mezcla se extrajo con EtOAc. La capa organica se lavo con agua, se seco y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia ultrarrapida en columna (SiO2, de 100:0 a 40:60 de ciclohexano/EtOAc) para producir el producto deseado.
1.20. Metodo general: acoplamiento de SNAr entre 5-{7-[bis-(4-metoxi-bencil)-amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5- iloxi}-4-metil-piridin-2-carbonitrilo (Int.3) y haluros aromaticos o heteroaromaticos
imagen55
en la que RA puede ser arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido.
1.20.1. Metodo H
Una mezcla de Int.3 (1 eq), el haluro de arilo/heteroarilo (de 1,2 a 1,5 eq) y K2CO3 (2 eq) en DMF se agita a 100°C durante un periodo que vario de 3 h a aproximadamente 16 h. La mezcla se diluyo con EtOAc, se lavo varias veces con H2O, se seco y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografia en columna ultrarrapida.
1.20.2. Ejemplo ilustrativo del metodo H: sntesis de 5-{7-[bis-(4-metoxi-bencil)-amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5- iloxi}-4-metil-piridina-2-carbonitrilo (Int.51).
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Una mezcla de Int.3 (58 mmol), Int.7 (70 mmol) y K2CO3 (116 mmol) en DMF (160 ml) se agito a 100°C. Despues de 3 h, se anadieron otros 7,35 mmol de Int.7 a la reaction y la mezcla se agito durante 1 h adicional a 100°C. La mezcla resultante se diluyo con EtOAc, se lavo varias veces con H2O, se seco (Na2SO4) y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia ultrarrapida en columna (SiO2, de 15:85 a 35:75 de EtOAc/eter de petroleo) para producir el producto deseado.
1.21. Metodo general: desproteccion de bis-PMB
imagen57
en la que RA puede ser arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; y -L- puede ser: -NH-, -NMe- o -O-.
1.21.1. Metodo I1
Una mezcla de bis-PMB amina protegida (1 eq) en TFA se agito a temperatura ambiente durante un periodo que vario de 30 minutos a aproximadamente 16 horas. La temperatura se aumento a 50 o 60°C y la mezcla se agito adicionalmente durante un periodo que vario de 0,5 a 3 h. La mezcla se sometio a un tratamiento usando una disolucion acuosa basica y un disolvente organico. Las dos fases se separaron y la capa organica se seco y se concentro. Alternativamente, la mezcla de reaccion se concentro primero y luego el residuo se sometio al tratamiento descrito anteriormente. El residuo obtenido del tratamiento se purifico por cromatografia sobre sflice o por resina de intercambio ionico ISOLUTE® SCX-3 (Biotage) o se mantuvo como tal.
1.21.2. Ejemplo ilustrativo del metodo I1: sntesis de N6-(2-fluoro-4-metanosulfonil-6-metilfenil)-1,N6-dimetil-1H- benzoimidazol-4,6-diamina (Int. 53).
imagen58
Una mezcla de Int.37 (0,33 mmol) en TFA (5 ml) se agito a temperatura ambiente durante 1 hora y a 50°C durante 0,5 horas. Se concentro la mezcla. El residuo se dividio entre NaHCO3 sat. y DCM. Las dos fases se separaron y la capa organica se seco (Na2SO4) y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, de 20:80 a 100:0 de EtOAc/eter de petroleo) para producir el producto deseado.
1.21.3. Ejemplo ilustrativo del metodo I1: smtesis de N6,1-dimetil-N6-(2-metil-4-metilsulfonilfenil) bencimidazol-4,6- diamina (Int.56A) y N6-(4-etilsulfonil-2-metil-fenilo )-N6,1-dimetil-bencimidazol-4,6-diamina (Int.56B).
imagen59
Una mezcla de Int.49A y 49B (aproximadamente 0,61 mmol en total) en TFA (5 ml) se agito a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas y a 50°C durante 3 horas. Se concentro la mezcla. El residuo se dividio entre
NaHCO3 sat. y DCM. Las dos fases se separaron y la capa organica se seco (Na2SO4) y se concentro. La cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, de 20:80 a 100:0 de EtOAc/eter de petroleo) produjo una mezcla del producto deseado (Int.56A, producto mas importante) junto con un producto secundario (Int.56B, producto menos importante) derivado de la desproteccion de Int.49B.
5 1.21.4. Metodo I2
Una mezcla de bis-PMB amina protegida (1 eq) en DCM/TFA (relation 3:1 a 1:1) se agito a temperatura ambiente durante un periodo que vario de 20 minutos a 3 horas. La mezcla se sometio a tratamiento usando una disolucion acuosa basica y un disolvente organico. Las dos fases se separaron y la capa organica se seco y se concentro. Alternativamente, la mezcla de reaction se pudo concentrar primero y luego el residuo se sometio al tratamiento 10 descrito anteriormente. El residuo obtenido del tratamiento se purifico por cromatografia sobre sflice o por resina de intercambio ionico ISOLUTE® SCX-3 (Biotage) o se mantuvo como tal.
1.21.5. Ejemplo ilustrativo del metodo I2: smtesis de 5-(7-amino-3-metil-bencimidazol-5-il)oxi-4-metil-piridin-2- carbonitrilo (Cpd 28).
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15 Se anadio TFA (55 ml) a una disolucion de Int.51 (23,1 mmol) en DCM (55 ml) a 0°C. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 20 min. Se anadio tolueno y se concentro la mezcla. El residuo se repartio entre DCM y NaHCO3 sat., Las dos fases se separaron y la capa organica se seco (Na2SO4) y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, EtOAc/MeOH de 100:0 a 95:5). El producto obtenido de la columna se lavo con THF para producir el producto deseado (Int 79).
20 1.21.6. Metodo I3
Una mezcla de bis-PMB amina protegida (1 eq) en TFA se agito a temperatura ambiente durante un periodo que vario de 30 minutos a aproximadamente 16 horas. La mezcla se diluyo en un disolvente organico y se lavo con una disolucion acuosa basica. Las dos fases se separaron y la capa organica se seco y se concentro. Alternativamente, antes del lavado, la mezcla de reaccion se podria concentrar en primer lugar. A continuation, la capa organica se 25 concentro y el residuo o bien se purifico por cromatografia sobre sflice o por resina de intercambio ionico ISOLUTE® SCX-3 (Biotage) o bien se uso como tal sin mas purification.
1.21.7. Ejemplo ilustrativo del metodo I3: smtesis de 5 -[(7-amino-3-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-metil-amino]-4-metil- piridin-2-carbonitrilo (Int. 62)
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30 Una disolucion de Int.41 (2,4 mmol) en TFA (10 mL) se agito a temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla se diluyo (DCM), se lavo con NaHCO3 sat. y luego con NaOH 5N. Las dos capas se separaron y la capa acuosa se extrajo posteriormente con DCM. Las capas organicas se combinaron, se secaron (filtration a traves del separador de fases) y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, EtOAc/MeOH de 100:0 a 90:10) para producir el producto deseado.
35 1.22. Smtesis de 4-etil-6-metanosulfonil-piridin-3-ilamina (Int. 70).
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1.22.1. Etapa i: 4-etil-2-metilsulfonil-5-nitro-piridina
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Una mezcla de 2-bromo-4-etil-5-nitro-piridina (4,35 mmol) y metanosulfinato de sodio (4,35 mmol) en DMSO (10 ml) se agito a temperatura ambiente durante 1,5 h. La mezcla se vertio en agua helada y se agito hasta que se derritio el hielo. Se filtro la mezcla y se recogio el solido (el producto deseado).
1.22.2. Etapa ii: 4-etil-6-metilsulfonil-piridin-3-amina
Una mezcla de 4-etil-2-metilsulfonil-5-nitro-piridina (4,1 mmol), NH4Cl (26,65 mmol) y polvo de hierro (33 mmol) en H2O (10 mL) se agito a 90°C durante 1 h. La reaction se detuvo, se filtro y se extrajo con EtOAc. La capa organica se seco (Na2SO4) y se concentro para producir el producto deseado.
1.23. S^ntesis de 4-etil-5-yodo-2-metilsulfonil-piridina (Int. 74).
imagen63
Se anadio gota a gota una disolucion de KI (15 mmol) y NaNO2 (12 mmol) en H2O (1,8 ml) a una mezcla de Int.70 (6 mmol) y p-TsOH • H2O (18 mmol) en MeCN (12 ml) manteniendo la temperatura entre 10 y 15°C. La mezcla se agito durante 10 min a 10 a 15°C y luego a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se enfrio hasta 0°C, se neutralizo (NaHCO3 sat.) y se extrajo (DCM). La capa organica se seco (Na2SO4) y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia ultrarrapida en columna (SiO2, 70:30 de eter de petroleo/EtOAc) para producir el producto deseado.
Ejemplo 2. Sintesis de los compuestos de la invencion
2.1. Metodo general: acilacion del intermedio de amina con un derivado de cloruro de carbonilo para obtener un compuesto final
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en la que RA puede ser arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; L puede ser NH, NMe u O; y RB puede ser cicloalquilo, OMe.
2.1.1. Metodo J1
Se agrego RBCOCl (1 eq) a una disolucion de la amina intermedia (1 eq) en DCM/piridina (de una relation de 2:1 a 5:1) a 0°C. La mezcla se agito durante un periodo que vario de 40 minutos a 2 horas. La mezcla se repartio entre un disolvente organico y una disolucion acuosa. Las dos fases se separaron y la capa organica se seco y se concentro. Alternativamente, la mezcla de reaccion podria concentrarse sin someterse a tratamiento. El residuo se podria purificar por cromatografia sobre sflice o por HPLC preparativa o por precipitation usando la mezcla de disolventes apropiada.
2.1.2. Ejemplo ilustrativo del metodo J1: s'mtesis de N-(6-((6-ciano-4-etilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-henzo [d] imidazol-4-il)ciclopropanocarboxamida (Cpd 1).
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Se anadio cloruro de ciclopropanocarbonilo (0,39 mmol) a una disolucion de Int.63 (0,39 mmol) en piridina/DCM 1:2 (2,55 ml) a 0°C. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 40 minutos. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo se purifico por cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, DCM/MeOH de 100:0 a 97:3) para proporcionar el producto deseado.
2.1.3. Metodo J2
Se agrego RbC(=0)CI (1,5 a 3 eq) a una disolucion de la amina intermedia (1 eq) en DCM seguido de piridina (1,5 a 3 eq). La mezcla se agito durante un periodo que vario de 2 h a aproximadamente 16 h. La mezcla se repartio entre un
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disolvente organico y una disolucion acuosa. Las dos fases se separaron y la capa organica se seco y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia sobre sflice, mediante HPLC preparativa o mediante precipitation usando la mezcla de disolventes apropiada.
2.1.4. Ejemplo ilustrativo del metodo J2: sntesis de 6-((6-ciano-4-etilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo [d]imidazol-4-ilcarbamato de metilo (Cpd 4).
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Se anadio cloroformiato de metilo (0,33 mmol) a una disolucion de Int.63 (0,22 mmol) en DCM seco (2,2 ml) seguido de piridina (0,33 mmol). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se dividio entre H2O y DCM. Las dos fases se separaron y la capa organica se lavo (NaHCO3 sat.), se seco (Na2SO4) y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, DCM/MeOH de 100:0 a 95:5) para producir el producto deseado.
2.2. Metodo general: acilacion del intermedio de amina con un derivado de acido carbox^lico para obtener un compuesto final
imagen67
en la que RA puede ser arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; L puede ser: NH, NMe u O; y RC puede ser: cicloalquilo, cicloalquilo sustituido.
2.2.1. Metodo K1
Se anadio (COCl)2 (de 1,4 a 2 eq) a una disolucion del acido carboxflico (de 1,5 a 2 eq) en DCM a 0°C. Se anadio una cantidad catafltica de DMF y la reaction se agito a 0°C durante un periodo que vario de 30 min a 1 h. Se anadio a la mezcla una disolucion de la amina intermedia (1 eq) y piridina (de 2 a 4 eq) en DCM. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante un periodo que vario de 30 minutos a 2 horas. La mezcla se dividio entre un disolvente organico y una disolucion acuosa. Las dos fases se separaron y la capa organica se seco y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografia sobre sflice, mediante HPLC preparativa o mediante precipitacion usando la mezcla de disolventes apropiada.
2.2.2. Ejemplo ilustrativo del metodo K1: sntesis de (1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-4-etil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4- il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida (Cpd 6).
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Se anadio (COCl)2 (0,186 mmol) a una disolucion de acido ((1R,2R)-(-)-cis-2-fluorociclopropanocarboxflico (ChemCollect, lote n.° 1241399, 0,186 mmol) en DCM (1 ml) seguido de DMF (2 gotas). La mezcla de reaccion se dejo bajo agitation a 0°C durante 1 h. Se anadio a la mezcla una disolucion de Int.65 (0,093 mmol) y piridina (0,186 mmol) en DCM (1 mL). La reaccion se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. Se anadio NaHCO3 sat. y las dos fases se separaron. Se concentro la capa organica. El residuo se purifico por cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, DCM/MeOH de 100:0 a 95:5) para producir el producto deseado
2.2.3. Ejemplo ilustrativo del metodo K1: s^ntesis de (1R,2R)-N-[6-(N,2-dimetil-4-metilsulfonilanitino)-1-metil- bencimidazol-4-il]-2-fluoro-cidopropanocarboxamida (Cpd 26 ) y (1R,2R)-N-[6-(4-etilsulfonil-N,2-dimetil-anilino)-1- metil-bencimidazol-4-il]-2-fluorociclopropanocarboxamida (Cpd 27).
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5 Se anadio (COCl)2 (0,82 mmol) a una disolucion de acido ((1R,2R)-(-)-cis-2-fluorociclopropanocarboxflico (ABCR, lote n.° 1242863, 0,92 mmol) en DCM (1 ml) seguido de DMF (1 gota). La mezcla de reaccion se dejo bajo agitacion a 0°C durante 45 minutos. Se anadio a la mezcla una disolucion de una mezcla de Int.56A e Int.56B (aproximadamente 0,46 mmol en total) y piridina (1,85 mmol) en DCM (1 ml) y la reaccion se agito durante 2 ha temperatura ambiente. La mezcla se diluyo con DCM, se lavo (H2O) y se separaron las dos fases. La capa organica se seco (Na2SO4) y se 10 concentro. La cromatografia en columna ultrarrapida (SiO2, 20:80 de EtOAc/eter de petroleo a 90:10 de EtOAc/MeOH) dio como resultado una mezcla del Compuesto 26 y el Compuesto 27. Los dos componentes se separaron mediante HPLC preparativa.
2.2.4. Metodo K2
Se anadio (COCl)2 (de 1,35 a 2,5 eq) a una disolucion del acido carboxflico (de 1,4 a 3 eq) en DCM a 0°C. Se anadio 15 una cantidad catafltica de DMF y la reaccion se agito a 0°C durante un periodo que vario de 30 min a 1 h. Se preparo
una disolucion de la amina intermedia (1 eq) y piridina (de 1,7 a 4 eq) en NMP o NMP/DCM por separado, asegurandose de que la amina intermedia estuviera completamente disuelta. Para ayudar a la disolucion, se podia aplicar calor (temperaturas de hasta 70°C). La ultima disolucion se anadio gota a gota a la disolucion que contema el cloruro de acilo recien formado a 0°C. La mezcla resultante se dejo bajo agitacion a temperatura ambiente durante un 20 periodo que vario de 1 a 2 h. La mezcla se dividio entre un disolvente organico y una disolucion acuosa. Las dos fases
se separaron y la capa organica se seco y se concentro. El residuo se purifico mediate cromatografia sobre sflice, mediante HPLC preparativa o mediante precipitacion usando la mezcla de disolventes apropiada.
2.2.5. Ejemplo ilustrativo del metodo K2: smtesis de (1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol- 4-i]-2-fluoro-ciclopropanocarboxamida (Cpd 20).
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Se anadio (COCl)2 (16,6 mmol) a una disolucion de acido ((1R,2R)-(-)-cis-2-fluorociclopropanocarboxflico (ABCR, lote n.° 1242863, 17,5 mmol) en DCM (70 mL) seguido de DMF (200 ^L). La mezcla de reaccion se dejo bajo agitacion a 0°C durante 45 minutos. Una disolucion del Compuesto 28 (12,5 mmol) y piridina (21,3 mmol) en NMP (15 ml) se calento a 65°C, para ayudar a la disolucion, y se dejo enfriar a temperatura ambiente. La disolucion que contema el 30 Compuesto 28 y piridina se anadio a la mezcla que contema el derivado carboxflico activado a 0°C y la reaccion se agito durante 45 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se dividio entre EtOAc y NaHCO3 sat. Las dos fases se separaron y la capa organica se lavo posteriormente (NaHCO3 sat., NH4Cl, H2O), se seco (Na2SO4) y se concentro. El producto bruto se purifico por precipitacion en DCM/iPrOH y el solido resultante se lavo con Et2O y se seco a vado para proporcionar el producto deseado.
35 2.3. Metodo general: hidrolisis de un grupo nitrilo para obtener un compuesto final
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en la que L es NH, NMe u O; Rc es cicloalquilo, cicloalquilo sustituido; Z es N o CH; y R10 es Me o Et.
2.3.1. Metodo L
Se disolvio una disolucion del material de partida de nitrilo (1 eq) en una mezcla 4:1 de EtOH/DMSO. La disolucion 5 organica resultante se mezclo con H2O2/H2O al 30% y NaOH 1N con las siguientes proporciones 10:2:1 de disolucion organica /H2O2/NaOH 1N. La mezcla se agito a 50°C durante 1 h. La mezcla se dividio entre un disolvente organico y una disolucion acuosa. Las dos fases se separaron y la capa organica se seco y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografia sobre sflice, mediante HPLC preparativa o mediante precipitation usando la mezcla de disolventes apropiada.
10 2.3.2. Ejemplo ilustrativo del metodo L: smtesis de 5-((4-(ciclopropanocarboxamido)-1-metil-1H-benzo [d] imidazol-6-
il)(metil) amino)-4-etilpicolinamida (Cpd 24).
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Se disolvio una disolucion del compuesto 1 (0,19 mmol) en una mezcla 4:1 de EtOH/DMSO (2,3 ml). La disolucion organica resultante se mezclo con H2O2/H2O (0,4 ml) al 30% y NaOH 1N (0,23 ml). La mezcla se agito a 50°C durante 15 1 h. La mezcla de reaction se dividio entre diclorometano y agua. Las capas se separaron y la capa organica se filtro
a traves de un separador de fases y se concentro. El residuo se purifico por HPLC preparativa para producir el producto deseado.
2.3.3. Metodo M: metodo general de smtesis de urea
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20 Se anadio carbonilditriazol (1,5 eq.) a una mezcla de Cpd 28 (1,0 eq.) y piridina (5 eq;) en DCM. La mezcla se agito a 50°C durante 1 h. Sin ningun tratamiento adicional, la amina RaNH2 requerida se anadio a la disolucion a 50°C y se dejo bajo agitation durante otra 1 h. Una vez completada la reaccion por UPLC, la mezcla de reaccion se enfrio hasta la temperatura ambiente y se diluyo con DCM, y luego la mezcla se dividio en agua. Las dos fases se separaron y la capa organica se lavo con una disolucion de HCl 0,25 M, disolucion de bicarbonato de sodio, se seco y se concentro. 25 El residuo se purifico por cromatografia sobre sflice, por HPLC preparativa o por precipitacion usando la mezcla de disolventes apropiada
2.3.4. Ejemplo ilustrativo del Metodo M: smtesis de 1-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-i]-3- isopropil-urea (Cpd 33)
Se anadio carbonilditriazol (1,07 mmol) a una mezcla de Cpd 28 (0,71 mmol) y piridina (3,55 mmol) en DCM (3 ml) y 30 la mezcla resultante se agito a 50°C. Se formo un precipitado despues de 2 minutos y la mezcla se agito adicionalmente durante 1 h. A continuation, se anadio metil-amina (disolucion 2M en THF) (2,84 mmol) a la disolucion a 50°C y se dejo bajo agitacion durante 1 h mas. Una vez completada la reaccion por UPLC, la mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se diluyo con DCM y se dividio en agua. Las dos fases se separaron y la capa organica se
lavo con una disolucion de HCl 0,25 M, disolucion de bicarbonato de sodio, se seco y se concentro. El residuo se uso sin ninguna purificacion adicional.
2.4. Smtesis de 5-[7-[[(1R,2R)-2-fluorociclopropanocarbonil]amino]-3-metil-bencimidazol-5-il]oxi-4-metil-piridin-2- carboxamida (Cpd 32).
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Una mezcla del Compuesto 20 (0,27 mmol) y DMSO (0,5 ml) en H2O (pH 13, 10 ml) se agito a 50°C durante 72 h. Se filtro la mezcla. El solido se recogio y se purifico por HPLC preparativa para producir el producto deseado.
2.5. Smtesis de 4-metil-5-[3-metil-7-(metilamino)bencimidazol-5-il]oxi-piridin-2-carbonitrilo (Cpd 34) y 5-[7- (dimetilamino)-3-metil-bencimidazol-5-il] oxi-4-metilpiridina-2-carbonitrilo (Cpd 35)
10 Se anadio NaH a una mezcla de Cpd 28 (0,36 mmol) en THF (10 ml) a 0°C. Despues de 30 minutos, se anadio Mel (0,36 mmol) y la mezcla de reaction se dejo atemperar hasta la temperatura ambiente y se agito hasta su finalization. Una vez controlada la reaccion por UPLC, la reaccion se diluyo en acetato de etilo y se lavo con agua. La capa organica se seco sobre Na2SO4, se filtro y se evaporo. El Cpd 34 y el Cpd 35 se aislaron mediante HPLC preparativa.
Los compuestos ilustrativos de la invention enumerados en la Tabla Ill a continuation y los ejemplos comparativos se 15 han preparado de acuerdo con los metodos de smtesis descritos en la presente memoria usando los productos intermedios enumerados en la Tabla II. Los datos espectrales de NMR de los compuestos de la invencion y algunos de los ejemplos comparativos se proporcionan en la Tabla IV.
Tabla II. Intermedios ilustrativos hacia los compuestos de la invencion
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n.° Int
Estructura SM Mtd MW MS Ms'd
1
PMBx -PMB N H 4-Metoxi bencilamina Dsc'd 257,3 258,1 (M+1)
2
PMB^ .PMB N jfV"> Br^N Int.1 + 5-bromo-3-fluoro-N-metil-2- nitro-anilina Dsc'd - 466,4 465,9 / 467,9 (M+1)
3
PMB-, .PMB N jfV'v ho^n Int.2 Dsc'd - 403,5 404,4 (M+1)
4
F J^nh2 4-amino-3-fluorobenzonitrilo A1 262,0 261,5 (M-1)
n.° Int
Estructura SM Mtd MW MS Ms'd
5
F NJyNH2 N Int. 11 A2 263,0 263,9 (M+1)
6
nh2 'XT' Cl N Int.23 A1 272,4 272,8 (M+1)
7
N<fVF N 2-cloro-5-fluoro-4-metilpiridina B 136,1 137,1 (M+1)
8
J\^NH2 ^isS. ^ n^n Int.20 B 133,2 134,1 (M+1)
9
1 ^Y^yNH2 Int. 13 B 151,1 152,0 (M+1)
10
^k^NH2 N 6-bromo-4-etil-piridin-3-amina B 147,2 148,0 (M+1)
11
F Jv.NHo N n n' Int. 15 B 137,1 138,0 (M+1)
12
F n^YNH2 Int.5 C 151,1 152,0 (M+1)
13
Cl a’ y nh2 Int.6 C 160,6 161,0 (M+1)
14
J^nh2 %^F o Int. 16 C 203,2 204,0 (M+1)
n.° Int
Estructura SM Mtd MW MS Ms'd
15
F xy™2 2-fluoropiridin-3-amina Dsc'd 191,0 190,9/ 192,9 (M+1)
16
Br J^YNH2 9s^f 0 2-fluoro-4-metilsulfonil-anilina Dsc'd 268,1 267,0 / 268,9 (M+1)
17
F J"YNH2 Int.4 Dsc'd 164,2 165,5 (M+1)
18
rT' N NT Int. 8 D 244,0 245,0 (M+1)
19
rY1 u N NT Int. 10 D 258,1 259,1 (M+1)
20
A" Br N 2-bromo-4-metil-5-nitro-piridina Dsc'd 187,0 187,0/ 189,0 (M+1)
21
F XyNH, y^ci 4-amino-3-fluorobenzonitrilo Dsc'd 170,6 No se pudo determinar la masa por diversos metodos
22
,A" 4-amino-3-etilbenzonitrilo Dsc'd 147,2 146,1 (M-1)
23
Cl a' nh2 Acido 2-doro-3-fluoropiridina-4- carboxflico Dsc'd 146,6 147,0 (M+1)
n.° Int
Estructura SM Mtd MW MS Ms'd
24
PMBv .PMB Vi A 1 H \ Int.2 + Int.10 E1 532,6 533,2 (M+1)
25
PMB. .PMB 1 H \ Int.2 + Int.17 E1 549,6 550,4 (M+1)
26
PMB» ,PMB N "VA) Int.2 + 6-fluoro-4-metilpiridin-3-amina E1 511,6 512,5 (M+1)
27
PMB-s.-PMB 1 H \ Int.2 + Int. 8 E2 518,6 519,4 (M+1)
28
PMB^-PMB N 1 vrm Cl H ' Int.2 + Int.21 E2 556,0 556,3 (M+1)
29
PMB. -PMB 1 H \ Int.2 + 2,6-difluoropiridin-3-amina E2 515,6 516,4 (M+1)
30
PMB. -PMB >X XXX n^ana^n/ F H N Int.2 + Int.11 E2 522,6 523,3 (M+1)
31
PMB- -PMB xxr ix"> n-vXnA^An/ F H N Int.2 + Int.12 E2 536,6 537,0 (M+1)
32
imagen75
Int.2 + Int.9
E2
536,6
537,0 (M+1)
33
imagen76
Int.2 + 4-amino-3-fluorobenzonitrilo
E2
521,6
522,4 (M+1)
34
imagen77
Int.2 + 2-fluoro-4-metilsulfonil-anilina
E3
574,7
575,0 (M+1)
35
imagen78
Int.2 + Int.14
E3
588,7
589,2 (M+1)
36
imagen79
Int.2 + 2-fluoro-4-metilsulfonil-anilina
E3
570,7
571,4 (M+1)
37
imagen80
Int.35
602,7
603,3 (M+1)
38
imagen81
Int.24
546,7
547,2 (M+1)
39
imagen82
Int.25
563,7
564,3 (M+1)
F
F
F
40
imagen83
Int.26
525,6
526,4 (M+1)
41
imagen84
Int.27
532,6
533,5 (M+1)
42
imagen85
Int.28
570,1
570,4 (M+1)
43
imagen86
Int.29
529,6
530,5 (M+1)
44
imagen87
Int.30
536,6
536,5 (M+1)
45
imagen88
Int.31
550,6
551,0 (M+1)
46
imagen89
Int.32
550,6
551,0 (M+1)
47
imagen90
Int.33
535,6
522,4 (M+1)
F
F
F
F
F
F
F
F
n.° Int
Estructura SM Mtd MW MS Ms'd
48
PMB. „PMB 0 N AAo 1 1 ' Int.34 F 588,7 589,5 (M+1)
49A
PMB^.-PMB 0 N A A? Int.36 F 584,7 585,1 (M+1)
49B
I PMB--PMB Lp 1 A A? Int.36 F (by product) 598,8 599,1 (M+1)
50
PMB. -PMB Vi Ax> Y'o^n Int.2 + Int.22 Dsc'd 532,6 533,4 (M+1)
51
PMB^,,PMB Int.3 + Int.18 (metodo G), Int.3 + Int.7 (metodo H) GorH 519,6 520,4 (M+1)
52
PMB. .PMB "*tx A Int.3 + Int.19 G 533,6 534,4 (M+1)
53
F I"2 AA Int.37 I1 362,4 363,1 (M+1)
54
M NH2 AA 1 H \ Int.25 I1 309,3 310,3 (M+1)
n.° Int
Estructura SM Mtd MW MS Ms'd
55
Y 0~ LL Int.43 I1 289,3 290,0 (M+1)
56A
P NH2 Y' _ 1 //Sy\ YY—N\ ° I M> T Int.49A I1 344,4 344,9 (M+1)
56B
^ o nh2 /Y fY> Int.49B I1 358,5 359,0 (M+1)
57
^ F2 Ay m Nf»Y ^ 1 ' Int.45 I1 310,3 311,0 (M+1)
58
nh2 nY ^ f JL ^TY (iT^) 1 \ Int.47 I1 295,3 296,0 (M+1)
59
0 NH2 Y ^ 1 0 I 11 1 11 ) l' ' Int.48 I1 348,4 349,0 (M+1)
61
-A 1H2 n'AA'n Int.39 I2 323,4 324,3 (M+1)
62
V% A Int.41 I3 292,3 293,3 (M+1)
63
imagen91
Int.38
I3
306,4
307,1 (M+1)
64
imagen92
Int.50
I3
292,3
293,3 (M+1)
65
imagen93
Int.52
I3
293,3
294,2 (M+1)
66
imagen94
Int.42
I3
329,8
330,2 (M+1)
67
imagen95
Int.40
I3
285,3
286,2 (M+1)
68
imagen96
Int.44
I3
296,3
297,0 (M+1)
69
imagen97
Int.32
I3
310,3
311,0 (M+1)
70
imagen98
2-bromo-4-etil-5-nitro-piridina
Dsc'd
200,3
201,1 (M+1)
n.° Int
Estructura SM Mtd MW MS Ms'd
71
PMBv .PMB p ff 7r\ /n 1 H ' Int.70 + Int.2 E2 585,7 586,0 (M+1)
72
PMBv .PMB P ff >y\ /rN> Int.71 F 599,8 600,1 (M+1)
73
p nh2 >tni m Int.72 I3 359,5 360,0 (M+1)
74
N^V'1 v°S Int.70 Dsc'd 311,1 311,8 (M+1)
75
PMB. „PMB ,0 N o^Vx AN> Int.3 + Int.74 G 586,7 587,3 (M+1)
76
o nh2 >Vny rr^rN\ 0 XX XXX I u \ Int.75 I2 346,4 347,0 (M+1)
77
PMB- .PMB N sxktet H \ Int.2 + 2- (4-aminofenil) acetonitrilo E4 517,6 518,0 (M+1)
78
PMB. .PMB N OOjtXl H ' Int.2 + 2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-6- amina E4 536,6 537,33 (M+1)
n.° Int
Estructura SM Mtd MW MS Ms'd
79
nh2 H \ Int.77 I2 277,3 278,0 (M+1)
80
nh2 QaA> H ' Int. 78 I2 296,3 297,0 (M+1)
Tabla III. Compuestos ilustrativos de la invencion
n.° Cpd
Estructura Nombre SM Mtd MW MS Ms'd
1
I N-(6-((6-ciano-4-etMpiridin-3-il)(metil) amino)-1- metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il) ciclopropanocarboxamida c 00 — CD J1 374,4 375,3
2
X HN O N^ 1 ^yF/VN> 1 H ' N-(6-(4-ciano-2-etN-6-fluorofenilamino)-1-metiMH- benzo[d] imidazol-4-il)ciclopropanocarboxamida Int 54 J1 377,4 378,0
3
X F ' N-(6-((4-ciano-2-etil-6-fluorofenil)(metil) amino)-1 - metil-1H-benzo [d] imidazol-4-il) ciclopropanocarboxamida Int 61 J1 391,4 392,4
4
O ""O^NH Vi jV> 6-((6-ciano-4-etilpiridin-3-il)(metil) amino)-1-metil- 1H-benzo[d]imidazol-4-ilcarbamato de metilo c 00 — CD J2 364,4 365,1
n.° Cpd
Estructura Nombre SM Mtd MW MS Ms'd
5
O ^ A 0 r ^OcFm Y'iAAn 6-((4-ciano-2-etil-6-fluorofenil)(metil) amino)-1- metil-1H-benzo[d]imidazol-4-ilcarbamato de metilo Int 61 J2 381,4 382,1
6
r HN 0 Vi m J U \ (1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-4-etil-3-piridil)oxi]-1-metil- bencimidazol-4-il]-2- fluorociclopropanocarboxamida Int 65 K1 379,4 380,4
7
'X AViX J 1 ' N-(6-((4-ciano-2-etil-6-fluorofenil)(metil) amino)-1 - metil-1H-benzo [d] imidazol-4-il)-2- fluorociclopropanocarboxamida (1S,2S) / (1R,2R) mezcla racemica Int 61 K1 409,4 410,2
8
f O NH ‘yA: (1R,2R)-N-(6-((6-ciano-4-etilpiridin-3-il)(metil) amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2- fluorociclopropanocarboxamida Int 63 K1 392,4 393,1
9
i" HN O 1 \ (1R,2R)-N-(6-((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metil) amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2- fluorociclopropanocarboxamida Int 62 K1 378,4 378,9
10
t 1 HN O NvV/VN> u \ (1R,2R)-N-[6-(4-ciano-2-etilfenoxi)-1- metilbenzimidazol-4-il]-2- fluorociclopropanocarboxamida Int 64 K1 378,4 379,4
n.° Cpd
Estructura Nombre SM Mtd MW MS Ms'd
11
t HN 0 N*s. 1 Vrcl iTt ^ F 1 (1R,2R)-N-[6-(2-cloro-4-ciano-6-fluoro-N- metilanilino)-1-metilbenzimidazol-4-il]-2- fluorociclopropanocarboxamida Int 66 K1 415,8 416,0
12
f HN 0 fyv rV> V ' (1R,2R) -2-fluoro-N-[6-[(6-fluoro-4-metil-3-piridM)- metil-amino]-1-metil-bencimidazol-4-il] ciclopropanocarboxamida Int 67 K1 371,4 372,5
13
LL XTV. ^ ff* LL (1R,2R)-N-[6-[(2,6-difluoro-3-piridil)-metil-amino]- 1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro- ciclopropanocarboxamida Int 55 K1 375,4 376,1
14
f "Wjfc T i ' (1R, 2R)-N-[6-[(6-ciano-2-fluoro-3-piridil)-metil- amino]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro- ciclopropanocarboxamida Int 68 K1 382,4 383,0
15
X" HN 0 “V-A? F 1 (1R,2R)-N-[6-(4-ciano-2-fluoro-N-metil-anilino)-1- metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro- ciclopropanocarboxamida Int 58 K1 381,4 382,1
16
LL >Z^z- ~Vt$ LL Z— ■P- O-c/) \ (1R,2R)-2-fluoro-N-[6-(2-fluoro-N,6-dimetil-4- metilsulfonil-anilino)-1-metil-bencimidazol-4-il] ciclopropanocarboxamida Int 53 K1 448,5 448,9
n.°
Cpd
MS
Ms'd
17
imagen99
(1R,2R)-2-fluoro-N-[6-(2-fluoro-N-metil-4-
metilsulfonil-anilino)-1-metil-bencimidazol-4-il]
ciclopropanocarboxamida
Int
59
K1
434,5
435,1
18
imagen100
N-[6-[(4-etil-6-metMsulfonM-3-piridM)-metil-amino]- 1 -metil-bencimidazol-4-il] ciclopropanocarboxamida
Int
73
K1
427,5
428,2
19
imagen101
N-[6-(2-fluoro-N,6-dimetil-4-metilsulfonN-anilino)-1-
metil-bencimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida
Int
53
K1
430,5
431,0
20
imagen102
(1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1 - metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro- ciclopropanocarboxamida
Cpd
28
K2
365,4
366,0
21
imagen103
(1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-2-fluoro-4-metil-3-piridil)-
metil-amino]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-
ciclopropanocarboxamida
Int
58
57
K2
396,4
397,1
22
imagen104
(1R,2R)-N-[6-[(2-ciano-3-fluoro-5-metil-4-piridil)-
metil-amino]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-
ciclopropanocarboxamida
Int
58
69
K2
396,4
397,1
n.° Cpd
Estructura Nombre SM Mtd MW MS Ms'd
23
NH N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil- bencimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida Cpd 28 K2 347,4 348,1
24
X nh2 hn 0 0 rX rr\ 5-((4-(ciclopropanocarboxamido)-1-metil-1H- benzo[d]imidazol-6-il)(metil)amino)-4- etilpicolinamida Cpd 1 L 392,5 393,3
25
X" nh2 hn 0 jV> 4-etil-5-((4-((1R,2R)-2- fluorociclopropanocarboxamido)-1-metil-1H-benzo [d]imidazol-6-il)(metil)amino)picolinamina Cpd 8 L 410,5 411,3
26
LL Oz^z- \ (1R,2R)-N-[6-(N,2-dimetil-4-metilsulfonil-anilino)- 1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro- ciclopropanocarboxamida Int 58 56A - 430,5 431,0
27
0 JL .,F 9*0 V (1R,2R)-N-[6-(4-etilsulfonil-N,2-dimetil-anilino)-1- metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro- ciclopropanocarboxamida Int 58 56B K1 444,5 445,0
28
nh2 nc'Y'N. V'o'CC"? 5-(7-amino-3-metil-bencimidazol-5-il)oxi-4- metilpiridina-2-carbonitrilo Int 58 51 12 279,3 280,1
n.° Cpd
Estructura Nombre SM Mtd MW MS Ms'd
29
"c/k __/ "o v^pz o c> z N-[6-[(4-etM-6-metMsulfonil-3-piridil)oxi]-1-metM- bencimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida Int 58 76 K1 414,5 415,1
30
H Y ' ' CT NH xi„jio H \ N-[6-[4-(cianometil)anilino]-bencimidazol-4-il] ciclopropanocarboxamida Int 58 79 K1 345,4 346,0
31
X 0 NH COv6^ H ' N-[6-(2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-6-ilamino)-1- metil-bencimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida Int 80 K1 364,4 365,0
32
rp NH2 O NH o<::VNi fVN> 1 \ 5-[7-[[(1R,2R)-2-fluorociclopropanocarbonil] amino]-3-metil-bencimidazol-5-N]oxi-4- metilpiridina-2-carboxamida Cpd 20 Dsc' d 383,4 384,1
33
^NH \ HN ° novn /L^n Xa XXX 1 \ 1 -[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil- bencimidazol-4-il]-3-isopropil-urea Int 83 M 336,4 337,0
34
HN NCN/N. yAX? 4-metil-5-[3-metil-7-(metilamino)benzimidazol-5-il] oxipiridina-2-carbonitrilo Int 83 Dsc' d 293,3 294,0
n.° Cpd
Estructura Nombre SM Mtd MW MS Ms'd
35
\ / N 5-[7-(dimetilamino)-3-metil-bencimidazol-5-il]oxi-4- metilpiridina-2-carbonitrilo C 00 — CO Dsc' d 307,4 308,0
36
N A HN 0 NV. 1 \ N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil- bencimidazol-4-il]-3-hidroxi-azetidina-1- carboxamida c 00 — CO M 378,1 379,0
37
0 A NCTN. 1 \ N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil- bencimidazol-4-il]morfolina-4-carboxamida c 00 — CO M 392,2 393,1
38
X HN HN'X) ncTn^i fj^vNs\ 1 \ 1 -[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil- bencimidazol-4-il]-3-isopropil-urea c 00 — CO M 364,2 365,1
Tabla IV. Datos de RMN de compuestos ilustrativos de la invencion
n.° Cpd
NMR
1
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6): d = 0,69 - 0,77 (m, 4H), 1,04 (t, 3H), 2,15 - 2,24 (m, 1H), 2,34 (q, 2H), 3,34 (s, 3H), 3,74 (s, 3H), 6,72 (d, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 8,04 (s, 1H), 8,48 (s, 1H), 10,05 (s, 1H).
2
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 0,70-0,80 (m, 4H), 1,09 (t, 3H), 2,19-2,27 (m, 1H), 2,64 (q, 2H), 3,68 (s, 3H), 6,42 (t, 1H), 7,55 (d, 1H), 7,64 (dd, 1H), 7,67 (br.s, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,98 (s, 1H), 10,01 (s, 1H).
3
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): d = 9,93 (s, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,81 (dd, 1H), 7,74 (s, 1 H), 7,29 (br s, 1H), 6,47 (d, finely split, 1H), 3,73 (s, 3H), 3,21 (s, 3H), 2,54-2,48 (m, partially obscured by solvent peak, 2H), 2,17 (m, 1H), 1,09 (t, 3H), 0,71-0,69 (m, 4H).
4
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 = 1,05 (t, 3H), 2,36 (q, 2H), 3,36 (s, 3H), 3,61 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 6,72 (d, 1H), 7,06 (d, 1H), 7,97 (s, 1H), 8,00 (dd, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,91 (bs, 1H).
n.° Cpd
NMR
5
1H NMR (300 MHz, DMSO-da): 8 = 1,10 (t, 3H), 2,52 (q, 2H), 3,23 (s, 3H), 3,59 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 6,51 (d, 1H), 6,86 (d, 1H), 7,76 (bs, 1H), 7,82 (dd, 1H), 7,92 (s, 1H), 8,75 (s, 1H).
6
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): d = 1,14 (ddt, H), 1,24 (t, 3H), 1,53 - 1,67 (m, 1H), 2,51 -2,55 (m, 1H), 2,75 (q, 2H), 3,79 (s, 3H), 4,77 - 5,03 (m, 1H), 7,13 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 8,07 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 10,43 (s, 1H).
7
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 8 = 0,99 - 1,15 (m, 1H), 1,09 (t, 3H), 1,54 (m, 1H), 2,39 (m, 1H), 2,52 (q, 2H), 3,22 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 4,85 (m, 1H), 6,49 (d, 1H), 7,32 (s, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,82 (dd, 1H), 7,96 (s, 1H), 9,96 (s, 1H).
8
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 8 = 0,99 -1,18 (m, 1H), 1,05 (t, 3H), 1,56 (m, 1H), 2,29 -2,45 (m, 1H),2,35 (q, 2H), 3,35 (s, 3H), 3,74 (s, 3H), 4,88 (m, 1H), 6,72 (d, 1H), 7,51 (bs, 1H), 7,95 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 10,09 (bs, 1H).
9
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): d = 10,13 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,07 (s, 1H), 7,87 (s, 1H), 7,55 (br s, 1H), 6,79 (d, finely split, 1H), 5,0-4,7(m, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,38 (s, 3H), 2,5-2,3 (m, 1H), 1,97 (s, 3H), 1,6-1,5 (m, 1H), 1,21,0 (m, 1H).
10
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): d = 1,07 - 1,20 (m, 1H), 1,24 (t, 3H), 1,53 - 1,67 (m, 1H), 2,43 -2,48 (m, 1H), 2,75 (q, 2H), 3,80 (s, 3H), 4,78 - 5,01 (m, 1H), 6,78 (d, 1H), 7,11 (d, 1H), 7,59 (dd, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 8,22 (s, 1H), 10,40 (s, 1H).
11
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): d = 1,08 (ddt, 1H), 1,41 -1,67 (m, 1H), 2,41 (dt, 1H), 3,27 (s, 3H), 3,75 (s, 3H), 4,65 - 5,05 (m, 1H), 6,61 (d, 1H), 7,42 (s, 1H), 8,00 (s, 1H), 8,04 (dd, 1H), 8,12 (t, 1H), 10,04 (s, 1H).
12
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): 8 = 1,08 (ddt, 1H), 1,50-1,60 (m, 1H), 2,12 (s, 3H), 2,39 (dt, 1H), 3,25 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 4,76-4,96 (m, 1H), 6,49 (d, 1H), 7,19 (s, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,97 (s, 1H), 8,00 (s, 1H), 10,02 (s, 1H).
13
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 10,12 (s, 1H), 8,06-8,00 (m, 2H), 7,96 (s, 1H), 7,22-7,19 (m, 1H), 6,76 (s, 1H), 4,98-4,77 (d, 1H), 3,76 (s, 3H), 3,25 (s, 3H), 2,45-2,42 (m, 1H), 1,59-1,52 (m, 1H), 1,27-1,10 (m, 1H).
14
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 10,30 (1 H, s), 8,20 (1 H, s), 7,92 (1 H, dd), 7,85 (1 H, d), 7,63 (1 H, dd), 7,17 (1 H, d), 4,92 (1H, dF), 3,79 (3 H, s), 3,40 (3 H, s), 2,48-2,44 (1H, m), 1,64-1,53 (1H, m), 1,19-1,15 (1H, m).
15
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 10,22 (1H, s), 8,16 (1H, s), 7,80 (1H, s), 7,70-7,67 (1H, m), 7,59-7,58 (1H, d), 7,25-7,21 (1H, m), 7,07 (1H, s), 4,99-4,81 (1H, d), 3,79 (3H, s, CH3), 3,38 (3H, s, CH3), 2,46-2,42 (1H, m, CH), 1,61-1,55 (1H, m), 1,19-1,09 (1H, m)
16
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):10,30 (1 H, s), 7,95 (1 H, s), 7,78(1 H, d), 7,74 (1 H, dd), 7,36 (1 H, d), 6,49 (1 H, d), 4,87 (1H, dF), 3,78 (3 H, s), 3,28 (3 H, s), 3,21 (3 H, s), 2,43-2,38 (1H, m), 2,22 (3 H, s), 1,62-1,51 (1H, m), 1,15-1,08 (1H, m).
17
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10,84 (1 H, s), 9,21 (1 H, s), 7,79 (2 H, dt), 7,55 (1 H, t), 7,42 (1 H, s), 7,26 (1 H, d), 4,95 (1H, dF), 3,96 (3 H, s), 3,43 (3 H, s), 3,28 (3 H, s), 2,43-2,38 (1 H, m), 1,62-1,51 (1 H, m), 1,15-1,08 (1 H, m).
18
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10,08 (1 H, s), 8,53 (1 H, s), 8,05 (1 H, s), 7,93 (1 H, s), 7,48 (1 H, br s), 6,69 (1 H, d), 3,75 (3 H, s), 3,29 (3 H, s), 3,21 (3 H, s), 2,46 (2 H, q), 2,25 - 2,17 (1 H, m), 1,08 (3 H, t), 0,76-0,69 (4 H, m).
19
1H NMR (400 MHz, CDCI3): 9,55 (1 H, br s), 8,05-8,00 (2 H, m), 7,70 (1 H, d), 7,61 (1 H, dd), 6,01 (1 H, d), 3,78 (3 H, s), 3,33 (3 H, s), 3,13 (3 H, s), 2,25 (3 H, s), 1,97-1,92 (1 H, m), 0,91-0,85 (4 H, m).
n.° Cpd
NMR
20
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): d = 1,15 (ddt, 1H), 1,54 - 1,66 (m, 1H), 2,36 (s, 3H), 2,52 -2,54 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 4,77 - 5,03 (m, 1H), 7,12 (d, 1H), 7,86 (d, 1H), 8,08 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 10,44 (s, 1H).
21
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10,12 (1H, s), 8,11 (1H, s), 8,02 (1H, s), 7,41 (1H, s), 6,61 (1H, d), 4,88 (1H, m), 3,75 (3H, s), 3,26 (3H, s), 2,42 (1H, m), 2,22 (3H, s), 1,57 (1H, m), 1,09 (1H, m).
22
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10,18 (1H, s), 8,50 (1H, s), 8,06 (1H, s), 7,51 (1H, s), 6,73 (1H, d), 4,87 (1H, m), 3,75 (3H, s), 3,32 (3H, s), 2,45 (1H, m), 2,11 (3H, s), 1,60 (1H, m), 1,11 (1H, m).
23
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10,39 (1 H, s), 8,23 (1 H, s), 8,11 (1 H, s), 8,07 (1 H, s), 7,84 (1 H, d), 7,11 (1 H, d), 3,79 (3 H, s), 2,35 (3 H, s), 2,33 - 2,27 (1 H, m), 0,81-0,76 (4 H, m).
24
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6): d = 0,56 - 0,78 (m, 4H), 1,09 (t, 3H), 2,18 (br. s., 1H), 2,46 (br. s., 2H), 3,30 (br. s., 3H), 3,73 (br. s., 3H), 6,56 (br. s., 1H), 7,38 (br. s., 1H), 7,59 (br. s., 1H), 7,98 (br. s., 2H), 8,05 (br. s., 1H), 8,33 (br. s., 1H), 9,96 (br. s., 1H).
25
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6): d = 1,05 - 1,08 (m, 1H), 1,09 (t, 3H), 1,50 - 1,59 (m, 1H), 2,39 (dt, 1H), 2,45 - 2,49 (m, 2H), 3,31 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 4,70 - 4,97 (m, 1H), 6,57 (d, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,99 (s, 2H), 8,06 (d, 1H), 8,34 (s, 1H), 10,00 (s, 1H).
26
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10,10 (1 H, s), 8,04 (1 H, s), 7,78(1 H, s), 7,76 (1 H, dd), 7,51 (1 H, d), 7,35 (1 H, d), 6,68 (1 H, d), 4,90 (1H, d), 3,75 (3 H, s), 3,29 (3 H, s), 3,21 (3 H, s), 2,40 (1H, t), 2,08 (3 H, s), 1,64-1,53 (1H, m), 1,15-1,08 (1H, m).
27
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10,10 (1 H, s), 8,03 (1 H, s), 7,73-7,71 (2 H, m), 7,48 (1 H, d), 7,38 (1 H, d), 6,68 (1 H, dd), 4,90 (1H, dF), 3,74 (3 H, s), 3,29 (3 H, s), 3,23 (2 H, q), 2,40 (1H, t), 2,07 (3 H, s), 1,64-1,53 (1H, m), 1,15-1,08 (1H, m) 1,11 (3 H, t).
28
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8,09 (1 H, s), 8,05 (1 H, s), 7,95 (1 H, s), 6,53 (1 H, d), 6,11 (1 H, d), 5,60 (2 H, br s) 3,68 (3 H, s), 2,34 (3 H, s).
29
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10,42 (1 H, s), 8,23 (1 H, s), 8,13 (1 H, s), 8,03 (1 H, s), 7,86 (1 H, d), 7,13 (1 H, d), 3,80 (3 H, s), 3,24 (3 H, s), 2,83 (2 H, q), 2,33 - 2,27 (1 H, m), 1,26 (3 H, t), 0,81-0,76 (4 H, m).
30
1H NMR (400 MHz, CDCla) 8,81 (1 H, s), 8,02 (1 H, d), 7,71 (1 H, s), 7,17 (2 H, d), 7,04 (2 H, d), 6,83 (1 H, d), 6,05 (1 H, s), 3,73 (3 H, s), 3,65 (2 H, s), 1,73-1,66 (1 H, m), 1,10-1,06 (2 H, m), 0,87-0,82 (2 H, m).
31
1H NMR (400 MHz, CDCh) 8,77 (1 H, s), 7,89 (1 H, s), 7,66 (1 H, s), 6,78 (1 H, d), 6,68 (2 H, t), 6,63 (1 H, dd), 5,73 (1 H, br s), 4,25-4,21 (4 H, m), 3,69 (3 H, s), 1,73-1,66 (1 H, m), 1,11-1,06 (2 H, m), 0,87-0,82 (2 H, m).
32
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10,41 (1 H, br s), 8,20 (1 H, s), 8,07 (1 H, s), 8,03 (1 H, s), 7,98 (1 H, br s), 7,84 (1 H, d), 7,55 (1 H, br s), 7,01 (1 H, d), 5,02-4,80 (1 H, m), 3,78 (3 H, s), 2,34 (3 H, s), 1,66-1,55 (1 H, m), 1,211,02 (2 H, m).
33
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8,89 (1 H, br s), 8,23 (1 H, br s), 8,10 (2 H, m), 7,72 (1 H, br m), 6,4-6,8 (2 H, m), 3,78 (3 H, s), 2,65 (3 H, d), 2,36 (3 H, s).
34
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8,07 (1 H, s), 8,05 (1 H, s), 7,97 (1 H, s), 6,47 (1 H, d), 6,10 (1 H, m), 6,01 (1 H, d), 3,69 (3 h, s), 2,77 (3 H, d), 2,36 (3 H, s)
35
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8,07 (1 H, s), 8,05 (1 H, s), 8,01 (1 H, s), 6,63 (1 H, d), 6,16 (1 H, d), 3,70 (3 H, s), 3,19 (6H, s), 2,36 (3H, s)
36
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8,16 (1 H, s), 8,10 (1 H, s), 0,07 (1 H, s), 8,00 (1 H, s), 7,62 (1 H, d), 6,99 (1 H, d), 5,68 (1 H, m), 4,45 (1 H, m), 4,21 (2 H, m), 3,78 (4 H, m), 2,57 (3 H, s)
5
10
15
20
25
n.° Cpd
NMR
37
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):8,42 (1 H, br s), 8,16 (1 H, s), 8,10 (1 H, s), 8,07 (1 H, s), 7,56 (1 H, d), 7,02 (1 H, d), 3,78 (3 H, s), 3,61 (4 H, m), 3,44 (4 H, m), 2,36 (3 H, s)
38
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):8,68 (1 h, br, s), 8,13 (1 H, s), 8,08 (1 H, s), 8,06 (1 H, s), 7,73 (1 H, d), 6,99 (1 h, br d), 6,89 (1 H, d), 3,75 (3 H, s), 3,72 (1 H, m), 2,35 (3 H, s), 1,07 (6 H, d)
Ejemplo 3. Compuestos comparativos
3.1. Compuesto A 2-[4-[(3-metilbencimidazol-5-il)amino] fenil]acetonitrilo
imagen105
Se sonico una mezcla de Pd2(dba)3 (0,01 mmol) y Xantphos (0,01 mmol) en 1,4-dioxano (1 ml) y se anadio bajo nitrogeno a una mezcla de 6-bromo-1-metil-bencimidazol (0,45 mmol), 2-(4-aminofenil)acetonitrilo (0,58 mmol) y Cs2CO3 (0,62 mmol) en 1,4-dioxano (2 ml). La mezcla se agito a 110°C durante 12 h. La mezcla se diluyo (DCM), se lavo (H2O), se seco (separador de fases) y se concentro. El residuo se purifico por HPLC preparativa para producir el producto deseado (Compuesto A).
MW: 262,3, MS Ms'd: 263,2,
NMR: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8,13 (1 H, s), 7,68 (1 H, dd), 7,60 (1 H, dd), 7,54 (1 H, d), 7,32 (1 H, d), 7,24 (1 H, t), 6,91 (1 H, dd), 3,77 (3 H, s), 3,39 (3 H, s).
3.2. Compuesto B
imagen106
Se sonico una mezcla de Pd2(dba)3 (0,01 mmol) y Xantphos (0,01 mmol) en 1,4-dioxano (1 ml) y se anadio bajo nitrogeno a una mezcla de 6-bromo-1-metil-bencimidazol (0,45 mmol), 2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-6-amina (0,58 mmol) y Cs2CO3 (0,62 mmol) en 1,4-dioxano (2 ml). La mezcla se agito a 110°C durante 12 h. La mezcla se diluyo (DCM), se lavo (H2O), se seco (separador de fases) y se concentro. El residuo se purifico por HPLC preparativa para producir el producto deseado (Compuesto B).
MW: 281,3, MS Ms'd: 282,1,
NMR: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 7,94 (1 H, s), 7,80 (1 H, br s), 7,45 (1 H, d), 7,05 (1 H, d), 6,86 (1 H, dd), 6,73 (1 H, dd), 6,61-6,57 (2 H, m), 4,22-4,16 (4 H, m), 3,71 (3 H, s).
3.3. Compuesto C 3-fluoro-4-[metil-(3-metilbemcimidazol-5-il)amimo]bemzomitrilo
imagen107
3.3.1. Etapa i: 3-Huoro-4-[(3-metilbenamidazol-5-il)ammo]benzonitrilo
Una mezcla que contema 6-bromo-1-metil-bencimidazol (2,38 mmol), 4-amino-3-fluoro-benzonitrilo (3,57 mmol), XPhos (0,95 mmol), Cs2CO3 (7,14 mmol) y Pd(OAc)2 (0,71 mmol) en tolueno seco (8 ml) se agito a 110°C durante aproximadamente 16 h. La mezcla se diluyo (EtOAc), se lavo (H2O), se seco (Na2SO4) y se concentro para proporcionar el producto deseado 3-fluoro-4-[(3-metilbencimidazol-5-il)amino]benzonitrilo.
3.3.2. Etapa ii: 3-fluoro-4-[metil-(3-metilbencimidazol-5-il)amino]benzonitrilo (Compuesto C)
Se anadio NaH (7,14 mmol) a una disolucion de 3-fluoro-4-[(3-metilbencimidazol-5-il)amino]benzonitrilo (2,38 mmol) en THF (10 ml) a 0°C. La mezcla se agito durante 30 min. Se anadio MeI (4,76 mmol) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla se diluyo (DCM), se lavo (H2O) y se concentro. El residuo se purifico por HPLC 5 preparativa para producir el producto deseado (Compuesto C).
MW: 280,1, MS Ms'd: 281,0,
NMR: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8,13 (1 H, s), 7,68 (1 H, dd), 7,60 (1 H, dd), 7,54 (1 H, d), 7,32 (1 H, d), 7,24 (1 H, t), 6,91 (1 H, dd), 3,77 (3 H, s), 3,39 (3 H, s).
3.4. Compuesto D
10
La smtesis de este compuesto se describio en la solicitud de patente internacional PCT (2013) WO 2013117645 (Menet et al., 2013).
Ejemplos biologicos
Ejemplo 4. Ensayos in vitro
15 4.1. Ensayo de inhibicion de JAK1
4.1.1. Ensayo JAK1 con sustrato polyGT
Se adquirio un dominio catalrtico de JAK1 recombinante humana (aminoacidos 850-1.154, numero de catalogo 08144) de Carna Biosciences. Se incubaron 10 ng de JAK1 con 12,5 pg de sustrato polyGT (numero de catalogo de Sigma P0275) en tampon de reaction de quinasa (15 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM dTt, 0,01% de Tween-20, 10 mM 20 de MgCl2, 2 pM de AtP no radiactivo, 0,25 pCi 33P-gamma-ATP (GE Healthcare, numero de catalogo AH9968) concentraciones finales) con o sin 5 pl que conteman compuesto de ensayo o vehiculo (DMSO, concentration final del 1%), en un volumen total de 25 pl, en una placa de polipropileno de 96 pocillos (Greiner, con fondo en V). Despues de 45 min a 30°C, las reacciones se desactivaron mediante la adicion de 25 pl/pocillo de acido fosforico 150 mM. La totalidad de la reaccion de quinasa terminada se transfirio a placas prelavadas de filtro de 96 pocillos (acido fosforico 25 75 mM) (numero de catalogo de Perkin Elmer 6005177) usando un recolector de celulas (Perkin Elmer). Las placas
se lavaron 6 veces con 300 pl por pocillo de una disolucion de acido fosforico 75 mM y se cerro hermeticamente la parte inferior de las placas. Se anadieron 40 pl/pocillo de Microscint-20, se cerro hermeticamente la parte superior de las placas y se realizo una lectura usando el Topcount (Perkin Elmer). La actividad quinasa se calculo restando las cuentas por minuto (cpm) obtenidas en presencia de un inhibidor de control positivo (estaurosporina 10 pM) de las 30 cpm obtenidas en presencia de un vehiculo. La capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir esta actividad se determino como:
Porcentajede inhibicion = lRFU Compueato dfe enaayo-RFU control;- „ jQQ
(FtFU vehiculo - RFU control}
RFU compuesto de ensayo = RFU determinado para muestra con compuesto de ensayo presente
RFU control = RFU determinado para muestra con inhibidor de control positivo
35 RFU vehiculo = RFU determinado en presencia de vehiculo
Se prepararon diluciones en serie de dosificacion para los compuestos que permitian el ensayo de efectos dosis- respuesta en el ensayo JAK1 y el calculo del valor IC50 para cada compuesto. Cada compuesto se sometio a ensayo de manera rutinaria a una concentracion de 20 pM seguido de una dilucion 1/3 en serie, 8 puntos (20 pM - 6,67 pM - 2,22 pM - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM) en una concentracion final de DMSO al 1%. Cuando la potencia 40 de la serie de compuesto aumento, se prepararon mas diluciones y/o se redujeron las concentraciones superiores (por ejemplo, 5 pM, 1 pM).
4.1.2. Ensayo JAK1 con peptido Ulight-JAKI
Se adquirio JAK1 humano recombinante (dominio catalrtico, aminoacidos 866-1154; numero de catalogo PV4774) de Invitrogen. 1 ng de JAK1 se incubo con peptido Ulight-JAK1 (tyr1023) 20 nM (numero de catalogo TRF0121 de Perkin 45 Elmer) en tampon de reaccion de quinasa (MOPS 25 mM, pH 6,8, Brij-35 al 0,01%, MgCl2 5 mM, DTT 2 mM, ATP 7 pM) con o sin 4 pl que conteman compuesto de ensayo o vehiculo (DMSO, concentracion final del 1%), en un volumen
imagen108
total de 20 jL, en una placa 384 Opti blanca (Perkin Elmer, numero de catalogo 6007290). Despues de 60 min a temperature ambiente, las reacciones se desactivaron mediante la adicion de 20 jL/pocillo de mezcla de deteccion (1 x tampon de deteccion (Perkin Elmer, numero de catalogo CR97-100C), europio-antifosfotirosina 0,5nM (PT66) (Perkin Elmer, numero de catalogo AD0068), EDTA 10 mM). La lectura se realizo utilizando el sistema Envision con excitacion 5 a 320 nm y midiendo la emision a 615 nm (Perkin Elmer). La actividad quinasa se calculo sustrayendo las unidades de fluorescencia relativa (RFU) obtenidas en presencia de un inhibidor de control positivo (estaurosporina 10 pM) a partir de RFU obtenidas en presencia de vehfculo. La capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir esta actividad se determino como:
Porcentaje de inhibicion = ((RFU determinada para muestra con compuesto de ensayo presente - RFU determinada 10 para muestra con inhibidor de control positivo) dividida entre (RFU determinada en presencia de vehfculo - RFU determinada para muestra con inhibidor de control positivo)) * 100.
Se prepararon diluciones en serie de dosificacion para los compuestos que permitfan el ensayo de los efectos dosis- respuesta en el ensayo JAK1 y el calculo del valor IC50 para el compuesto. Cada compuesto se sometio a ensayo de manera rutinaria a una concentracion de 20 pM seguido de una dilucion 1/5 en serie, 10 puntos en una concentracion 15 final de DMSO al 1%. Cuando la potencia de la serie de compuesto aumento, se prepararon mas diluciones y/o se redujeron las concentraciones superiores (por ejemplo, 5 pM, 1 pM). Los datos se expresan como la IC50 promedio de los ensayos ± error estandar de la media.
Tabla V. JAK1 IC50 valores de compuestos ilustrativos de la invencion
n.° de Cpd
JAK1 IC50
1
CM
3
4
cn
CD
7
00
CD
10
11
12
13
***
14
15
16
17
**
n.° de Cpd
JAK1 IC50
18
19
20
****
21
****
22
****
23
****
24
****
25
****
26
****
27
****
28
***
29
****
32
***
33
****
34
**
35
*
36
*
37
*
38
****
*> 500 nM
** >100-500 nM
*** >50-100 nM
**** 0,1-50 nM
5
10
15
20
25
30
35
40
n.° de Cpd
JAK1 IC50
A
*
B
*
C
*
D
*
4.1.3. Ensayo de determinacion de Ki de JAK1
Para la determinacion del Ki, se mezclaron diferentes cantidades de compuesto con la enzima y se siguio la reaction enzimatica en funcion de la concentration de ATP. El valor Ki se determino por medio del trazado retiproco doble de Km frente a la concentracion de compuesto (trazado Lineweaver-Burk). Se uso 1 ng de JAK1 (Invitrogen, PV4774) en el ensayo. El sustrato fue peptido 50 nM de peptido Ulight-JAK-1 (Tyr1023) (Perkin Elmer, TRF0121). La reaccion se llevo a cabo en 25 mM MOPS pH 6,8, 0,01%, 2 mM DTT, 5 mM MgCl2 Brij-35 con diversas concentraciones de ATP y compuesto. El sustrato fosforilado se midio usando un anticuerpo antifosfotirosina marcado con Eu PT66 (Perkin Elmer, AD0068) como se describio en 1.1.2. Se llevo a cabo la lectura en el instrumento Envision (Perkin Elmer), con una excitation a 320 nm de emision seguida a 615 nm y 665 nm.
4.2. Ensayo de inhibicidn de JAK2
4.2.1. Ensayo JAK2 con sustrato polyGT
Se adquirio un dominio catalttico de JAK2 recombinante humana (aminoacidos 808-1.132, numero de catalogo PV4210) de Invitrogen. Se incubaron 0,025mU de JAK2 con 2,5 |jg de sustrato polyGT (numero de catalogo Sigma P0275) en tampon de reaccion de quinasa (5 mM MOPS pH 7,5, 9 mM MgAc, 0,3 mM EDTA, 0,06% Brij y 0,6 mM DTT, 1 |jM ATP no radioactivo, 0,25 jCi 33P-gamma-ATP (GE Healthcare, numero de catalogo AH9968) concentraciones finales) con o sin 5 jl que conteman compuesto de ensayo o vehfculo (DMSO, concentracion final del 1%), en un volumen total de 25 jl, en una placa de polipropileno de 96 pocillos (Greiner, con fondo en V). Despues de 90 min a 30°C, las reacciones se desactivaron mediante la adicion de 25 jl/pocillo de acido fosforico 150 mM. La totalidad de la reaccion de quinasa terminada se transfirio a placas prelavadas de filtro de 96 pocillos (acido fosforico 75 mM) (numero de catalogo de Perkin Elmer 6005177) usando un recolector de celulas (Perkin Elmer). Las placas se lavaron 6 veces con 300 jl por pocillo de una disolucion de acido fosforico 75 mM y se cerro hermeticamente la parte inferior de las placas. Se anadieron 40 jl/pocillo de Microscint-20, se cerro hermeticamente la parte superior de las placas y se realizo una lectura usando el Topcount (Perkin Elmer). La actividad quinasa se calculo restando las cuentas por minuto (cpm) obtenidas en presencia de un inhibidor de control positivo (estaurosporina 10 jM) de las cpm obtenidas en presencia de un vetuculo. La capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir esta actividad se determino como:
Porcentaje de inhibition = lRFU c°mFUHt° deenaayo - RFU control;' , jqq ’ (RFU whiculo- RFU control)
RFU compuesto de ensayo = RFU determinado para muestra con compuesto de ensayo presente RFU control = RFU determinado para muestra con inhibidor de control positivo RFU vetuculo = RFU determinado en presencia de vetuculo
Se prepararon diluciones en serie de dosificacion para los compuestos que permitfan el ensayo de efectos dosis- respuesta en el ensayo JAK2 y el calculo del valor IC50 para cada compuesto. Cada compuesto se sometio a ensayo de manera rutinaria a una concentracion de 20 jM seguido de una dilution 1/3 en serie, 8 puntos (20 jM - 6,67 jM - 2,22 jM - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM) en una concentracion final de DMSO al 1%. Cuando la potencia de la serie de compuesto aumento, se prepararon mas diluciones y/o se redujeron las concentraciones superiores (por ejemplo, 5 jM, 1 jM).
4.2.2. Ensayo JAK2 con peptido Ulight-JAKI
Se adquirio JAK2 humano recombinante (dominio catalttico, aminoacidos 866-1154; numero de catalogo PV4210) de Invitrogen. Se incubaron 0,0125 mU de jAk2 con peptido Ulight-JAK1 (tyr1023) 25 nM (numero de catalogo TRF0121 de Perkin Elmer) en tampon de reaccion de quinasa (HEPES 25 mM pH 7,0, Triton X-100 al 0,01%, MgCl2 7,5 mM,
DTT 2 mM, ATP 7,5 |jM) con o sin 4|jL que contema el compuesto de ensayo o vehuculo (DMSO, concentracion final del 1%), en un volumen total de 20 jL, en una placa Opti 384 blanca (Perkin Elmer, numero de catalogo 6007290). Despues de 60 min a temperatura ambiente, las reacciones se desactivaron mediante la adicion de 20 jL/pocillo de mezcla de deteccion (1 x tampon de deteccion (Perkin Elmer, numero de catalogo CR97-100C), europio- 5 antifosfotirosina 0,5nM (PT66) (Perkin Elmer, numero de catalogo AD0068), EDTA 10 mM). La lectura se realizo utilizando el sistema Envision con excitacion a 320 nm y midiendo la emision a 615 nm (Perkin Elmer). La actividad quinasa se calculo sustrayendo las unidades de fluorescencia relativa (RFU) obtenidas en presencia de un inhibidor de control positivo (estaurosporina 10 |jM) a partir de RFU obtenidas en presencia de vehuculo. La capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir esta actividad se determino como:
10 Porcentaje de inhibicion = ((RFU determinada para muestra con compuesto de ensayo presente - RFU determinada para muestra con inhibidor de control positivo) dividida entre (RFU determinada en presencia de vehfculo - RFU determinada para muestra con inhibidor de control positivo)) * 100.
Se prepararon diluciones en serie de dosificacion para los compuestos que permitfan el ensayo de los efectos dosis- respuesta en el ensayo JAK2 y el calculo del valor IC50 para el compuesto. Cada compuesto se sometio a ensayo de 15 manera rutinaria a una concentracion de 20 jM seguido de una dilucion 1/5 en serie, 10 puntos en una concentracion final de DMSO al 1%. Cuando la potencia de la serie de compuesto aumento, se prepararon mas diluciones y/o se redujeron las concentraciones superiores (por ejemplo, 5 jM, 1 jM). Los datos se expresan como la IC50 promedio de los ensayos ± error estandar de la media.
Los siguientes compuestos se sometieron a ensayo para determinar su actividad contra JAK2 y los valores de IC50, 20 como se determinaron usando los ensayos descritos en la presente memoria, se proporcionan a continuacion en la Tabla VII.
Tabla VII. JAK2 IC50 Valores de compuestos comparativos
n.° de Cpd
JAK2 IC50
1
CM
3
4
cn
CD
7
00
CD
10
11
12
***
13
**
14
***
15
**
n.° de Cpd
JAK2 IC50
16
17
*
18
****
19
****
20
***
21
****
22
****
23
***
24
****
25
****
26
***
27
**
28
*
29
**
32
***
33
****
34
*
35
*
36
*
38
*
38
**
n.° de Cpd
JAK2 IC50
A
*
B
*
C
*
D
*
4.2.3. Ensayo de determinacion de Kd de JAK2
5 Se uso JAK2 (Invitrogen, PV4210) a una concentracion final de 5 nM. El experimento de union se realizo en Hepes 50 mM, pH 7,5, Brij-35 al 0,01%, MgCl210 mM, EGTA 1 mM utilizando trazador de quinasa 25nM 236 (Invitrogen, PV5592) y Eu-anti-GST 2 nM (Invitrogen, PV5594) con concentraciones de compuesto variables. La deteccion del trazador se realizo de acuerdo con el procedimiento del fabricante.
4.3. Ensayo de inhibicidn de JAK3
10 4.3.1. Ensayo JAK3 con peptido Ulight-JAKI
El dominio catalftico JAK3 humano recombinante (aminoacidos 781-1124; numero de catalogo PV3855) se adquirio de Invitrogen. Se incubaron 0,5 ng de protema JAK3 con 2,5 |jg de sustrato polyGT (numero de catalogo Sigma P0275) en tampon de reaccion de quinasa (Tris 25 mM, pH 7,5, EGTA 0,5 mM, MgCh 10 mM, DTT 2,5 mM, Na3VO4 0,5 mM, b-glicerolfosfato 5 mM, 0,01% Triton X-100, ATP no radiactivo 1 jM, concentracion final de 0,25 jCi 33P-gamma-ATP 15 (GE Healthcare, numero de catalogo AH9968) con o sin 5jL que contema compuesto de ensayo o vehnculo (DMSO, concentracion final del 1%), en un volumen total de 25 jL, en una placa de 96 pocillos de polipropileno (Greiner, fondo en V). Despues de 45 minutos a 30°C, las reacciones se desactivaron mediante la adicion de 25 jL/pocillo de acido fosforico de 150 mM. Toda la reaccion de quinasa terminada se transfirio a placas de filtro de 96 pocillos prelavadas (acido fosforico 75 mM) (numero de catalogo Perkin Elmer 6005177) usando un recolector de celulas (Perkin Elmer). 20 Las placas se lavaron 6 veces con 300 jL por pocillo de una disolucion de acido fosforico 75 mM y se cerro hermeticamente el fondo de las placas. Se anadieron 40 jl/pocillo de Microscint-20, se se cerro hermeticamente la parte superior de las placas y se realizo la lectura usando Topcount (Perkin Elmer). La actividad quinasa se calculo restando las cuentas por minuto (cpm) obtenidas en presencia de un inhibidor de control positivo (estaurosporina 10 jM) a partir de las cpm obtenidas en presencia de un vehnculo. La capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir 25 esta actividad se determino como:
Porcentaje de inhibicior = lRFU Compureto de enaayo - KFU control} * jqq ’ (RFU vehlcu 10 - RFU control)
RFU compuesto de ensayo = RFU determinado para muestra con compuesto de ensayo presente
RFU control = RFU determinado para muestra con inhibidor de control positivo
30 RFU vehnculo = RFU determinado en presencia de vehnculo
Se prepararon diluciones en serie de dosificacion para los compuestos que permitfan el ensayo de efectos dosis- respuesta en el ensayo JAK3 y el calculo del valor IC50 para cada compuesto. Cada compuesto se sometio a ensayo de manera rutinaria a una concentracion de 20 pM seguido de una dilucion 1/5 en serie, 10 puntos en una concentracion final de DMSO al 1%. Cuando la potencia de la serie de compuesto aumento, se prepararon mas 35 diluciones y/o se redujeron las concentraciones superiores (por ejemplo, 5 pM, 1 pM).
Los siguientes compuestos han sido sometidos a ensayo para determinar su actividad frente a JAK3 y los valores de IC50, como se determina usando los ensayos descritos en la presente memoria, se proporcionar a continuacion en la Tabla IX.
n.° de Cpd
JAK3 IC50
1
***
2
3
4
**
5
***
6
*
7
8
**
9
**
10
**
11
**
12
**
13
*
14
**
15
*
16
***
17
*
18
**
19
***
20
*
21
***
22
**
23
*
24
**
25
**
n.° de Cpd
JAK3 IC50
26
**
27
**
28
*
29
*
32
*
33
**
34
*
35
*
36
*
37
*
38
*
*> 500 nM
** > 100- 500 nM
*** > 50- 100 nM
**** 0,1 -50 nM
Tabla X. Valores de JAK3 IC50 de compuestos comparativos
n.° de Cpd
JAK3 IC50
C
*
D
*
4.3.2. Ensayo de determinacion de Ki de JAK3
5 Para la determinacion de Ki, se mezclaron diferentes cantidades de compuesto con la enzima y se siguio la reaccion enzimatica en funcion de la concentracion de ATP. El Ki se determino por medio de un trazado redproco doble de Km versus concentracion de compuesto (trazado Lineweaver-Burk). JAK3 (Carna Biosciences, 09CBS-0625B) se uso a una concentracion final de 10 ng/ml. El sustrato fue poli(Glu,Tyr) sal sodica (4:1), MW 20.000 - 50.000 (Sigma, P0275). La reaccion se llevo a cabo en Tris 25 mM pH 7,5, Triton X-100 al 0,01%, 0,5 mM de EGTA, 2,5 mM de DTT, 0,5 mM 10 de Na3VO4, 5 mM de fosfato de b-glicerol, 10 mM de MgCh con concentraciones variables de ATP y compuesto y se desactivo mediante la adicion de 150 mM de acido fosforico. La medicion del fosfato incorporado en el sustrato polyGT se realizo cargando las muestras en una placa de filtro (utilizando un recolector de celulas, Perkin Elmer) y posterior lavado. El 33P incorporado en polyGT se midio en un contador de centelleo Topcount despues de la adicion de lfquido de centelleo a las placas de filtro (Perkin Elmer).
15 4.4. Ensayo de inhibicidn TYK2
4.4.1. Ensayo TYK2 con peptido Ulight-JAKI
5
10
15
20
25
El dominio catalttico TYK2 humano recombinante (aminoacidos 871-1187; numero de catalogo 08-147) se adquirio Carna biosciences. Se incubaron 5 ng de protema TYK2 con 12,5 |jg de sustrato polyGT (numero de catalogo Sigma P0275) en tampon de reaccion de quinasa (Hepes 25 mM, pH 7,2, NaCl 50 mM, EDTA 0,5 mM, DTT 1 mM, MnCl2 5 mM, MgCl210 mM, Brij-35 al 0,1%, ATP no radioactivo 0,1 jM, concentracion final de 0,125 jCi 33P-gamma-ATP (GE Healthcare, numero de catalogo AH9968) con o sin 5jL que contema compuesto de ensayo o vehfculo (DMSO, concentracion final del 1%), en un volumen total de 25 jL, en una placa de 96 pocillos de polipropileno (Greiner, fondo en V). Despues de 90 minutos a 30°C, las reacciones se desactivaron mediante la adicion de 25 jL/pocillo de acido fosforico de 150 mM. Toda la reaccion de quinasa terminada se transfirio a placas de filtro de 96 pocillos prelavadas (acido fosforico 75 mM) (numero de catalogo Perkin Elmer 6005177) usando un recolector de celulas (Perkin Elmer). Las placas se lavaron 6 veces con 300 jL por pocillo de una disolucion de acido fosforico 75 mM y se cerro hermeticamente el fondo de las placas. Se anadieron 40 jl/pocillo de Microscint-20, se cerro hermeticamente la parte superior de las placas y se realizo la lectura usando el Topcount (Perkin Elmer). La actividad quinasa se calculo restando las cuentas por minuto (cpm) obtenidas en presencia de un inhibidor de control positivo (estaurosporina 10 jM) a partir de las cpm obtenidas en presencia de un vetuculo. La capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir esta actividad se determino como:
Porcentaje de inhibicion = ((cpm determinado para muestra con compuesto de ensayo presente - cpm determinado para muestra con inhibidor de control positivo) dividido entre (cpm determinado en presencia de vetuculo - cpm determinado para muestra con inhibidor de control positivo)) * 100.
Se preparo una serie de diluciones de dosis para los compuestos que permitfan el ensayo de los efectos de dosis- respuesta en el ensayo de TYK2 y el calculo del valor IC50 para cada compuesto. Cada compuesto se sometio a ensayo de manera rutinaria a una concentracion de 20 pM seguido de una dilucion 1/3 en serie, 8 puntos (20 pM - 6,67 pM - 2,22 pM - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27nM - 9 nM) en una concentracion final de 1% de DMSO. Cuando la potencia de una serie de compuestos aumento, se prepararon mas diluciones y/o se redujo la concentracion superior (por ejemplo, 5 pM, 1 pM).
Los siguientes compuestos se han sometido a ensayo para determinar su actividad frente a TYK2; y los valores de CI50, segun se determinaron usando los ensayos descritos en la presente memoria, se proporciona a continuacion en la Tabla XI.
Tabla XI. TYK2 IC50 Valores de los compuestos ilustrativos de la invencion
n.° de Cpd
TYK2 IC50
1
CM
3
4
cn
CD
7
00
CD
10
11
12
13
n.° de Cpd
TYK2 IC50
14
15
16
****
17
**
18
****
19
****
20
****
21
****
22
****
23
****
24
****
25
****
26
****
27
****
28
**
29
**
32
***
33
****
34
*
35
*
36
*
37
*
38
*
*> 500 nM
** >100-500 nM
*** > 50- 100 nM
**** 0,1 -50 nM
5
10
15
20
25
30
35
40
n.° de Cpd
TYK2 IC50
C
*
D
*
4.4.2. Ensayo de determinacion de Kd de TYK2
Se uso TYK2 (Carna Biosciences, 09CBS-0983D) a una concentracion final de 5 nM. El experimento de union se realizo en Hepes 50 mM, pH 7,5, Brij-35 al 0,01%, MgCl210 mM, EGTA 1 mM utilizando trazador de quinasa 50 nM 236 (Invitrogen, PV5592) y Eu-anti-GST 2 nM (Invitrogen, PV5594) con concentraciones de compuesto variables. La deteccion del trazador se realizo de acuerdo con el procedimiento del fabricante.
Ejemplo 5. Ensayos celulares:
5.1. Ensayos celulares de selectividad JAK1, JAK2 y TYK2
5.1.1. Ensayo celular JAK1 selectivo, activacion de STAT1 por IFNa en PBMC
Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) se aislaron de las capas leucodticas en condiciones esteriles mediante centrifugacion en gradiente de densidad usando un medio LymphoPrep™ (Axis-Shield) seguido de 3 etapas de lavado posteriores en PBS sin Ca ++ Mg ++. Las PBMC se suspendieron nuevamente en un medio puro de RpMI 1640 que contema FBS inactivado por calor al 10% (v/v), Pen-Strep al 1% (100 U/ml de Penicilium y 100 pg/ml de estreptomicina) y se cultivaron en una incubadora humidificada a 37°C 5% de CO2.
Las PBMC se sembraron en placas de 24 pocillos a 5,0 1006 celulas/pocillo en un volumen de 200 pl de RPMI 1640 (Invitrogen) que contema FBS al 10% (v/v), Pen-Strep al 1% (Invitrogen).
Las PBMC se trataron con el compuesto de ensayo durante 30 minutos a 37°C con 5% de CO2. Se anadieron 25 pL de dilucion de compuesto concentrado 10x al medio. Despues de 30 minutos de pretratamiento del compuesto/veimculo de ensayo, las CMSP se estimularon durante 30 min a 37°C, 5% de CO2 con IFNa humano recombinante (PeproTech) a una concentracion final de 100 ng/ml mediante la adicion de 25 pL (concentrado 10x) de desencadenante de citoquina para obtener un volumen final de 250 pL por pocillo.
Todos los compuestos se sometieron a ensayo en un unico inicio a partir de 20 pM seguido de una dilucion en serie 1/3, 8 dosis en total (20 pM, 6,6 pM, 2,2 pM, 0,74 pM, 0,25 pM, 0,082 pM, 0,027 pM y 0,009 pM) en una concentracion final de 0,2% DMSO.
Despues de 30 minutos de estimulacion con citoquina, se transfirieron 250 pl de suspension celular a una placa con fondo en V de 96 pocillos, se centrifugaron durante 5 minutos a 1.000 rpm para sedimentar las celulas, seguido de la eliminacion del sobrenadante. El sedimento celular se reconstituyo en 100 pl de tampon de Lysis 1x suplementado con coctel inhibidor de proteasa exento de EDTA (Roche Applied Sciences, numero de producto 11836170001) seguido de congelacion y almacenamiento a -80°C. Se proporciono tampon de Lysis 1x con el kit Phospho-STAT1 Elisa que contema inhibidores de fosfatasa. Los niveles endogenos de STAT1 fosforilada se cuantificaron usando un kit Sandwich ELISA PathScan® Phospho-STAT1 (Tyr701) de 96 pocillos (senalizacion celular, numero de producto 7234) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La actividad de HRP (HRP se conjuga con el anticuerpo secundario) se midio mediante la adicion de 100 pL de sustrato de luminol recien preparado (Bm Chemiluminescence ELISA Substrate (POD), Roche, Numero de producto 11582950001), incubacion durante 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad y se midio en un luminometro de microplaca Ascent Luminoskan de Thermo Scientific (tiempo de integracion de 200 mseg).
5.1.2. Ensayo celular selectivo JAK2, activacion de STAT5 por GM-CSF en PBMC
Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) se afslan de las capas leucodticas en condiciones esteriles mediante centrifugacion en gradiente de densidad usando medio LymphoPrep™ (Axis-Shield) seguido de 3 etapas de lavado posteriores en PBS sin Ca ++ Mg ++. Las PBMC se suspendieron nuevamente en medio puro de RPMI 1640 que contema FBS inactivado por calor al 10% (v/v), Pen-Strep al 1% (100 U/ml de Penicilium y 100 pg/ml de estreptomicina) y se cultivaron en una incubadora humidificada a 37°C 5 % de CO2.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Las PBMC se sembraron en placas de 24 pocillos a 5,0E06 celulas/pocillo en un volumen de 200 pl de RPMI 1640 (Invitrogen) que contema FBS al 10% (v/v), Pen-Strep al 1% (Invitrogen).
Las PBMC se trataron con el compuesto de ensayo anadiendo 25 pl de dilucion de compuesto concentrado 10x al medio y se incubaron durante 30 min a 37°C con 5% de CO2. Posteriormente, las PBMC se estimularon con GM-CSF humano recombinante (PeproTech) a una concentracion final de 0,5 ng/ml mediante la adicion de 25 pL (concentrado 10x) de desencadenante de citoquina por pocillo para obtener un volumen final de 250 pL. Las celulas se desencadenaron durante 30 minutos a 37°C con 5% de CO2.
Todos los compuestos se sometieron a ensayo en un unico inicio a partir de 20 pM seguido de una dilucion en serie 1/3, 8 dosis en total (20 pM, 6,6 pM, 2,2 pM, 0,74 pM, 0,25 pM, 0,082 pM, 0,027 pM y 0,009 pM) en una concentracion final de 0,2% de DMSO.
Despues de 30 minutos de estimulacion con citoquina, se transfirieron 250 pl de suspension celular a una placa con fondo en V de 96 pocillos, se centrifugaron durante 5 minutos a 1.000 rpm para sedimentar las celulas. Se elimino el sobrenadante y el sedimento celular se reconstituyo en 100 pl de tampon de Lysis 1x suplementado con un coctel inhibidor de proteasa exento de EDTA (Roche Applied Sciences, numero de producto 11836170001) seguido de congelacion y almacenamiento de las muestras a -80°C. Se proporciono tampon de Lysis 1x con el kit Phospho-STAT5 Elisa que contema inhibidores de fosfatasa. Los niveles endogenos de STAT5 fosforilada se cuantificaron usando un kit Sandwich ELISA PathScan® Phospho-STAT5 (Tyr694) de 96 pocillos (senalizacion celular, numero de producto 7113) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La actividad de HRP (HRP se conjuga con el anticuerpo secundario) se midio mediante la adicion de 100 pL de sustrato de luminol recien preparado (Bm Chemiluminescence ELISA Substrate (POD), Roche, Numero de producto 11582950001), incubacion durante 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad y se midio en un luminometro de microplaca Ascent Luminoskan de Thermo Scientific (tiempo de integracion de 200 mseg).
5.1.3. Ensayo celular selectivo TYK2, activacion de STAT4 por IL-12 en celulas NK-92
Celulas NK-92 (linfoma no Hodgkin maligno humano, lmea de celulas asesinas naturales dependiente de interleucina- 2 (IL-2), ATCC n.° CRL-2407).
Las celulas NK-92 se mantuvieron en un medio esencial mmimo (MEM) medio alfa sin ribonucleosidos y desoxirribonucleosidos, 2 mM de L-glutamina, 2,2 g/l de bicarbonato de sodio (Invitrogen, numero de producto 22561021) que contema 0,2 mM de mioinositol, 0,1 mM de 2-mercapto-EtOH, 0,1 mM de acido folico, 12,5% de suero de caballo inactivado por calor (Invitrogen, Numero de producto 26050-088), FBS al 12,5% inactivado por calor, Pen- Strep al 1% (100 U/ml de Penicilium y 100 pg/mL de estreptomicina) y 10 ng/mL de IL-2 humana recombinante (R & D Systems). Se anadio IL-2 de nueva aportacion al medio con cada etapa de nueva aportacion de medio. Las celulas se cultivaron en una incubadora humidificada a 37°C con 5% de CO2.
Una fraccion subcultivada de celulas NK-92 se lavo una vez en un medio puro sin rhIL-2 y se sembro en placas de 24 pocillos a 0,5E06 celulas/pocillo en un volumen de 400 pl de medio MEM Alpha puro sin rhIL-2 que contema 0,2 mM mioinositol, 0,1 mM de 2-mercaptoetanol, 0,1 mM de acido folico, 12,5% de suero de caballo inactivado por calor (Invitrogen, numero de producto 26050-088), FBS al 12,5% inactivado por calor, Pen-Strep al 1% (Invitrogen).
Las celulas NK-92 se trataron con compuestos de ensayo durante 30 minutos antes de la estimulacion con rhIL-12 anadiendo 50 pL de dilucion de compuesto concentrado 10x e incubando a 37°C con 5% de CO2. Despues de 30 minutos de pretratamiento con compuesto/vefuculo, las celulas se estimularon con IL-12 humana recombinante (R & D Systems, Numero de producto 219-IL) a una concentracion final de 25 ng/ml mediante la adicion de 50 pL (concentrado 10x) de desencadenante de citoquina para obtener un volumen final de 500 pL por pocillo. Las celulas NK-92 se desencadenaron con rhIL-12 durante 30 min a 37°C con 5% de CO2.
Todos los compuestos se sometieron a ensayo en un unico inicio a partir de 20 pM seguido de una dilucion en serie 1/3, 8 dosis en total (20 pM, 6,6 pM, 2,2 pM, 0,74 pM, 0,25 pM, 0,082 pM, 0,027 pM y 0,009 pM) en una concentracion final de 0,2% de DMSO.
Los niveles de fosfo-STAT4 en celulas NK-92 estimuladas con rhIL-12 se cuantificaron usando un analisis de citometna de flujo en un citometro de flujo Gallios™ (Beckman Coulter). Despues de 30 minutos de estimulacion con citoquina, las celulas se fijaron al agregar 500 pL de BD Cytofix Fixation Buffer precalentado (BD Phosflow™, numero de producto 554655) inmediatamente a los pocillos (las celulas se fijaron inmediatamente para mantener el estado de fosforilacion, en lugar de que se giraran hacia abajo, se recomienda fijar las celdas agregando un volumen igual de BD Cytofix Buffer precalentado a la suspension celular). Las celulas se incubaron durante 10 min a 37°C. La fraccion celular fijada se suspendio nuevamente (1 ml) y se transfirio a tubos FACS seguido de una etapa de centrifugacion (300xg, 10 min) y la eliminacion del sobrenadante. El sedimento celular se mezclo (vortex) y las celulas se permeabilizaron anadiendo 1 ml de BD Phosflow Perm Buffer III (BD PhosflowTM, numero de producto 558050) seguido de incubacion sobre hielo durante 30 minutos. Despues de la etapa de permeabilizacion, las celulas se lavaron dos veces con BD Pharmingen™ Stain Buffer (BD Pharmingen, numero de producto 554656) con centrifugacion intermedia a 300xg durante 10 min y se elimino el sobrenadante. El sedimento (celulas 0,5E06) se suspendio nuevamente en 100 pL de BD Pharmingen™
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Stain Buffer y se tino mezclando 20 pL de PE Mouse Anti-STAT4 (pY693) a las celulas (BD Phosflow™, PE Mouse Anti-STAT4 (pY693), numero de producto 558249), luego se incubo durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Las celulas tenidas se lavaron una vez con 2 ml de tampon de tincion BD Pharmingen™ y se suspendieron nuevamente en 500 pl de tampon de tincion BD Pharmingen™ y se analizaron en un citometro de flujo Gallios™ (Beckman Coulter).
Para todos los analisis, las celulas muertas y los restos se excluyeron mediante dispersion frontal (FSC) y dispersion lateral (SSC). Los cambios en la fosforilacion de las protemas STAT4 despues de la estimulacion con citoquinas se calcularon mediante intensidad media (o mediana) de fluorescencia X (MFI) por celula en el 100% de la fraccion cerrada para todos los compuestos de ensayo estimulados con citoquina y las muestras no estimuladas.
5.1.4. Resultados de los ensayos JAK1, JAK2 y TYK2:
Las muestras no estimuladas (sin desencadenante/vehmulo (0,2% DMSO) se usan como control positivo (100% de inhibicion). Como control negativo (0% de inhibicion), se usan las muestras estimuladas (desencadenante/vehmulo (0,2% DMSO)). Los controles positivo y negativo se usan para calcular los valores Z' y los valores de “porcentaje de inhibicion (PlN)“.
El porcentaje de inhibicion se calculo a partir de
Porcentaje de inhibicion - RCLU fttesencadenante/vehlculo)- RCLII compuesta de ensayo______+ j gg
' RCLU (de-sencs denante/vehiculo)- RCLU (sir des*ntadensntw'vehiculo)
en donde
RCLU (desencadenante/vehmulo): senal quimioluminiscente relativa determinada en presencia del vehmulo y desencadenante.
RCLU (compuesto de ensayo): senal quimioluminiscente relativa determinada en presencia de compuestos de ensayo)
RCLU (sin desencadenante/vehfculo): senal quimioluminiscente relativa determinada en presencia de vehmulo sin desencadenante.
En caso de que la senal de lectura se exprese como valores de media X (analisis de citometna de flujo de los niveles de pSTAT4 en celulas NK-92 estimuladas por citoquinas), la RCLU se reemplaza por el valor de la media X.
Los valores de PIN se trazan para los compuestos sometidos a ensayo en respuesta a la dosis y los valores de EC50 se obtienen utilizando el software GraphPad Prism aplicando un ajuste de curva de regresion no lineal (sigmoidal).
5.2. Ensayo de mutaciones de JAK1 en lneas celulares de cancer de pulmon y carcinoma hepatocelular.
5.2.1. La senalizacion constitutiva inducida por mutacion de JAK1
Las lmeas celulares cancerosas con y sin mutaciones de JAK1 (Tabla I - Lmeas celulares de cancer de pulmon) se cultivaron con o sin suero durante 4-6 h, estimuladas o no con un coctel de citoquinas (INFy, IL2, IL4 e IL6) durante 5, 10, 30 y 45 min. La fosforilacion de JAK1, STAT1, STAT3 y STAT5 se evaluo mediante inmunotransferencia (anticuerpos de senalizacion celular).
5.2.2. Identificacion de mutantes de JAK1 usando inhibidores de JAK
5.2.2.1. Fosforilacion de la ruta JAK-STAT:
Las lmeas celulares cancerosas con y sin mutaciones de JAK1 se cultivaron en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de inhibidores de JAK. Las celulas se analizaron a las 24 y 48 h para la inhibicion eficaz de la ruta JAK-STAT mediante inmunotransferencia.
Tabla XIII. Tabla I: lmeas celulares ilustrativas de cancer de pulmon
Gen
Linea celular Tejido Cambio Dominio de protema Presente en tejido primario
JAK1
NCIH1915 Pulmon I62V FERM _
JAK1
SQ1 Pulmon N226S FERM _
JAK1
HCC4006 Pulmon S383G FERM _
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Gen
Lrnea celular Tejido Cambio Dominio de protema Presente en tejido primario
JAK1
NCIH2066 Pulmon L423V Interdominio (FERM y SH2) _
JAK1
NCIH1793 Pulmon H525Y SH2 _
JAK1
HCC95 Pulmon N833S Protema quinasa 1 Si
JAK1
VMRCLCD Pulmon E223 * _ _
JAK1
NCIH1563 Pulmon Q161* _ _
WT JAK1
A549 Pulmon _ _ _
JAK1 -/-
U4C Fibrosarcoma _ _ _
*: truncamiento
5.2.2.2. Viabilidad celular
Ensayo 2D: se cultivaron lmeas celulares cancerosas con y sin mutaciones JAK1 en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de inhibidores de JAK. Despues de 48-72 h, la viabilidad celular se midio usando el ensayo de viabilidad celular Cell Titer-Glo Luminiscent (Promega) o ensayo de MTT. Alternativamente, se analizaron las lmeas celulares cancerosas en diferentes momentos del cultivo con una concentracion fija de inhibidor de JAK para determinar la viabilidad celular usando el ensayo de viabilidad celular Cell Titer-Glo Luminiscent (Promega) o ensayo de MTT.
Ensayo 3D: se sembraron lmeas celulares cancerosas con y sin mutaciones JAK1 en un medio de agar semisolido. La formacion de colonias multicelulares se midio al determinar la viabilidad celular usando un colorante fluorescente en diferentes momentos del cultivo. La adicion de inhibidores potenciales despues de la siembra celular permite el analisis de los efectos antitumorales.
5.2.3. Investigando mutaciones humanas de JAK1 en celulas murinas Ba/F3 (Como se ilustra en: Kan et al., 2013; Staerk et al., 2005; Zenatti et al., 2011)
Construccion de vectores de expresion de JAK1: las secuencias de JAK1 humano de tipo salvaje y mutante se clonan en vectores retrovirales y los clones se verifican mediante secuenciacion.
Infeccion retroviral de celulas Ba/F3: las celulas Ba/F3 se infectan con sobrenadantes retrovirales producidos en celulas 293T.
Las celulas Ba/F3 que expresan WT humano o JAK1 mutado se cultivan con o sin IL-3 durante 4 h y la fosforilacion de la ruta JAK-STAT evaluada por inmunotransferencia.
El potencial de transformacion de las mutaciones de JAK1 se evalua midiendo la capacidad de cada mutacion para inducir el crecimiento autonomo cuando se expresa en celulas Ba/F3 dependientes de citoquinas. El crecimiento celular se evalua en ausencia de la citoquina IL-3.
Las lmeas celulares Ba/F3 transducidas con JAK1 mutante se evaluan para determinar su sensibilidad a los inhibidores de JAK cultivandolos en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de inhibidores de JAK. Despues de 4872 h, la viabilidad celular se midio usando el ensayo de viabilidad celular Cell Titer-Glo Luminiscent (Promega) o ensayo de MTT. Alternativamente, las lmeas celulares cancengenas en diferentes momentos del cultivo con una concentracion fija de inhibidor de JAK se analizan para determinar la viabilidad celular usando ensayo de viabilidad celular Cell Titer-Glo Luminiscent (Promega) o ensayo de MTT.
5.2.4. Potencial oncogenico in vivo de las mutaciones de JAK1
5.2.4.1. Modelo de xenoinjertos:
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Las celulas que expresan JAK1 mutante se inyectan por via subcutanea en ratones CD1 nu/nu o ratones Rag1 -/- y se evalua la progresion del tumor. Se establecen curvas de crecimiento de volumen tumoral subcutaneo. Se determina la trasplantabilidad de tumores primarios en animales receptores secundarios.
5.2.4.2. modelo PDX.
Los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) se basan en la transferencia de tumores primarios (que contienen mutaciones de JAK1) directamente del paciente a un raton inmunodeficiente. Para lograr esto, los tumores del paciente deben obtenerse frescos de la cirugfa, en dicho momento estos se digieren mecanica o qmmicamente, con una pequena porcion guardada como material primario y se establece en un raton NOD-SCID. Los modelos PDX se mantienen pasando las celulas directamente de raton a raton una vez que la carga del tumor llega a ser demasiado alta. Los tumores se pueden injertar heterotopicamente (implantar tumores en el flanco subcutaneo de un raton) u ortotopicamente (implantacion directa en el organo de raton de eleccion).
La fosforilacion de JAK1, STAT1, STAT3 y STAT5 en tumores primarios y secundarios se evalua mediante inmunotransferencia.
5.3. Ensayo de proliferacion de PBL
Los linfocitos de sangre periferica humana (PBL) se estimularon con IL-2 y la proliferacion se midio usando un ensayo de incorporacion de BrdU. Los PBL en primer lugar se estimularon durante 72 h con PHA para inducir el receptor IL- 2, luego se aceleraron durante 24 h para detener la proliferacion celular seguida de estimulacion con IL-2 durante otras 72 h (incluido el marcaje BrdU 24h). Las celulas se preincubaron con los compuestos de ensayo 1 h antes de la adicion de IL-2. Las celulas se cultivaron en RPMI 1640 que contema FBS al 10% (v/v).
5.4. Ensayo de sangre humana completa (hWBA)
5.4.1. Protocolo 1
5.4.1.1. Protocolo de estimulacion IL-6
Se realizo un analisis de citometna de flujo para establecer JAK1 sobre la selectividad del compuesto JAK2 ex vivo usando sangre humana completa. Por lo tanto, la sangre se tomo de voluntarios humanos que dieron su consentimiento informado. A continuacion, la sangre se equilibro durante 30 minutos a 37°C bajo balanceo suave, luego se dividio en alfcuotas en tubos Eppendorf. El compuesto se agrego en diferentes concentraciones y se incubo a 37°C durante 30 min bajo balanceo suave y posteriormente se estimulo durante 20 min a 37°C bajo balanceo suave con interleuquina 6 (IL-6) para la estimulacion de la ruta dependiente de JAK1 o GM-CSF para estimulacion de la ruta dependiente de JAK2. A continuacion, se evaluaron Phospho-STATI y phospho-STAT5 usando analisis FACS.
5.4.1.2. Ensayos Phospho-STAT1
5.4.1.2.1. Preparacion de reactivos
El tampon Lyse/Fix 5X (BD PhosFlow, n.° de catalogo 558049) se diluyo 5 veces con agua destilada y se precalento a 37°C. Se descarto el resto del tampon Lyse/Fix diluido.
Se disolvieron 10 |jg de rhIL-6 (R & D Systems, n.° de catalogo 206-IL) en 1 ml de PBS al 0,1% de BSA para obtener una disolucion madre de 10 jg/ml. La disolucion madre se dividio en alfcuotas y se almaceno a -80°C.
Se preparo una serie diluida 3 veces del compuesto en DMSO (disolucion madre 10 mM). Las muestras tratadas con control recibieron DMSO en lugar de compuesto. Todas las muestras se incubaron con una concentracion final de DMSO del 1%.
5.4.1.2.2. Incubacion de sangre con compuesto y estimulacion con IL-6
Se recogio sangre humana en tubos heparinizados. La sangre se dividio en alfcuotas de 148,5jL. A continuacion, se agrego 1,5 jL de la dilucion del compuesto de ensayo a cada alfcuota de sangre y las muestras de sangre se incubaron durante 30 min a 37°C bajo balanceo suave. Se anadio a las muestras de sangre 1 microlitro y medio de disolucion madre de IL-6 diluida 10 veces (concentracion final de 10 ng/ml) y las muestras se incubaron a 37°C durante 20 minutos bajo balanceo suave.
5.4.1.2.3. Preparacion de globulos blancos
Al final del penodo de estimulacion, se agregaron inmediatamente 3 ml de tampon Lyse/Fix 1X precalentado a las muestras de sangre, se agitaron brevemente en vortice y se incubaron durante 15 minutos a 37°C en un bano de agua para lisar los globulos rojos y fijar los leucocitos.
Los tubos se centrifugaron durante 5 min a 400xg a 4°C. El sedimento celular se lavo con 3 ml de 1X PBS frio, y despues de la centrifugacion, el sedimento celular se suspendio nuevamente en 100 jl de PBS 1X enfriado en hielo y
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se anadieron 900 |jl de MeOH al 100% enfriado en hielo. Las celulas se incubaron a 4°C durante 30 min para la permeabilizacion.
A continuacion, las celulas permeabilizadas se lavaron con 1X PBS que contema 3% de BSA y finalmente se suspendio nuevamente en 80 jL de 1X PBX que contema 3% de BSA.
5.4.1.2.4. Marcaje celular con anticuerpos anti Phospho-STATI y anti-CD4
Se anadieron y mezclaron 20 |jL de anticuerpo anti-STATI de raton PE (pY701) o anticuerpo de control de isotipo IgG2aK de raton PE (BD Biosciences, n.° de catalogo 612564 y 559319, respectivamente) y anticuerpo anti-CD4 conjugado con FITC o anticuerpo de isotipo conjugado con FITC de control y, a continuacion, se incubaron durante 30 min a 4°C, en la oscuridad.
Despues, las celulas se lavaron una vez con 1X PBS y se analizaron en un citometro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences).
5.4.1.2.5, Analisis de fluorescencia en FACSCanto II
Se contaron 50.000 eventos totales, y se midieron las celulas positivas para Fosfo-STATI luego de la entrada en celulas CD4+, en la entrada de linfocitos. Se analizo la informacion usando el programa informatico FACSDiva, y se calculo el porcentaje de inhibicion de la estimulacion de IL-6 sobre el porcentaje de celulas positivas para fosfo-STATI en celulas CD4+.
5.4.1.3, Ensayo de Fosfo-STAT5
Preparacion de reactivos
El tampon Lyse/Fix 5X (BD PhosFlow, n.° de catalogo 558049) se diluyo 5 veces con agua destilada y se precalento a 37°C. Se descarto el resto del tampon Lyse/Fix diluido.
Se disolvieron 10 jg de rhGM-CSF (AbCys S. A., n.° de catalogo P300-03) en 100 jm de PBS al 0,1% de BSA para obtener una disolucion madre de 100 jg/ml. La disolucion madre se dividio en alfcuotas y se almaceno a -80°C.
Se preparo una serie diluida 3 veces del compuesto en DMSO (disolucion madre 10 mM). Las muestras tratadas con control recibieron DMSO sin el compuesto de ensayo. Todas las muestras se incubaron con una concentracion final de DMSO del 1%.
5.4.1.3.1. Incubacion de sangre con compuesto y estimulacion con GM-CSF
Se recogio sangre humana en tubos heparinizados. La sangre se dividio en alfcuotas de 148,5jL. A continuacion, se agrego 1,5 jL de la dilucion del compuesto de ensayo a cada alfcuota de sangre y las muestras de sangre se incubaron durante 30 min a 37°C bajo balanceo suave. Se anadio a las muestras de sangre la disolucion madre de GM-CSF (1,5 jL) diluida 5.000 veces (concentracion final de 20 pg/mL) y las muestras se incubaron a 37°C durante 20 minutos bajo balanceo suave.
5.4.1.3.2. Preparacion de globulos blancos
Al final del penodo de estimulacion, se agregaron inmediatamente 3 ml de tampon Lyse/Fix 1X precalentado a las muestras de sangre, se agitaron brevemente en vortice y se incubaron durante 15 minutos a 37°C en un bano de agua para lisar los globulos rojos y fijar los leucocitos.
Los tubos se centrifugaron durante 5 min a 400xg a 4°C. El sedimento celular se lavo con 3 ml de 1X PBS frio, y despues de la centrifugacion, el sedimento celular se suspendio nuevamente en 100 jl de PBS 1X enfriado en hielo y se anadieron 900 jl de MeOH al 100% enfriado en hielo. Las celulas se incubaron a 4°C durante 30 min para la permeabilizacion.
5.4.1.3.3. Marcaje celular con anticuerpos anti fosfo-STAT5 y anti-CD33
Se anadieron y mezclaron 20 jL de anticuerpo anti-STAT5 de raton PE (pY694) o anticuerpo de control de isotipo IgG1k de raton PE (BD Biosciences, n.° de catalogo 612567 y 554680, respectivamente) y anticuerpo CD33 de raton APC (BD Biosciences, n.° de catalogo 345800) o anticuerpo de isotipo IgG1 de raton APC de control (BD Biosciences, n.° de catalogo 345818) y, a continuacion, se incubaron durante 30 min a 4°C, en la oscuridad.
Despues, las celulas se lavaron una vez con 1X PBS y se analizaron en un citometro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences).
5.4.1.3.4. Analisis de fluorescencia en FACSCanto II
Se contaron 50.000 eventos totales, y se midieron las celulas positivas para Fosfo-STAT5 luego de la entrada en celulas CD33+. Se analizo la informacion usando el programa informatico FACSDiva, y correspondfa con el porcentaje
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de inhibicion de la estimulacion de GM-CSF calculado a partir del porcentaje de celulas positivas para fosfo-STAT5 en celulas CD33+.
5.5. Protocolo 2
5.5.1. Protocolo de estimulacion
Se realizo un analisis de citometna de flujo para establecer JAK1 sobre la selectividad del compuesto JAK2 ex vivo usando sangre humana completa. Por lo tanto, la sangre se tomo de voluntarios humanos que dieron su consentimiento informado. A continuacion, la sangre se equilibro durante 30 minutos a 37°C bajo balanceo suave, luego se dividio en alfcuotas en tubos Eppendorf. El compuesto se agrego en diferentes concentraciones y se incubo a 37°C durante 30 min bajo balanceo suave y posteriormente se estimulo durante 20 min a 37°C bajo balanceo suave con interleuquina 6 (IL-6) para la estimulacion de la ruta dependiente de JAK1, con interferon alfa (IFN-a) para la estimulacion de la ruta JAK1/TYK2, con interleuquina 2 (IL-2) para la estimulacion de la ruta JAK1/JAK3 o con GM- CSF para la estimulacion de la ruta dependiente de JAK2. A continuacion, se evaluaron los niveles de fosfo-STATI (para celulas estimuladas con IL-6- e IFNa) y fosfo-STAT5 (para celulas estimuladas con IL-2 y GM-CSF) usando analisis FACS.
5.5.2. Ensayos fosfo-STAT
5.5.2.1. Preparacion de reactivos
El tampon Lyse/Fix 5X (BD PhosFlow, n.° de catalogo 558049) se diluyo 5 veces con agua destilada y se precalento a 37°C. Se descarto el resto del tampon Lyse/Fix diluido.
Se disolvieron 10 |jg de rhIL-6 (R & D Systems, n.° de catalogo 206-IL) en 1 ml de PBS al 0,1% de BSA para obtener una disolucion madre de 10 jg/ml. La disolucion madre se dividio en alfcuotas y se almaceno a -80°C.
Se disolvieron 10 jg de rhIL-2 (R & D Systems, n.° de catalogo 202-IL) en 1 ml de PBS al 0,1% de BSA para obtener una disolucion madre de 10 jg/ml. La disolucion madre se dividio en alfcuotas y se almaceno a -80°C.
Se disolvieron 5 jg de rhGM-CSF (AbCys S.A., Cat no P300-03) en 12,5 ml de PBS al 0,1% de BSA para obtener una disolucion madre de 400 ng/ml. La disolucion madre se dividio en alfcuotas y se almaceno a -80°C.
Se preparo una serie diluida 3 veces del compuesto en DMSO (disolucion madre 10 mM). Las muestras tratadas con control recibieron DMSO en lugar de compuesto. Todas las muestras se incubaron con una concentracion final de DMSO del 1%.
5.5.2.2. Incubacion de sangre con compuesto y estimulacion con desencadenantes
Se recogio sangre humana en tubos heparinizados. La sangre se dividio en alfcuotas de 148,5 jL. A continuacion, se agrego 1,5 jL de la dilucion del compuesto de ensayo a cada alfcuota de sangre y las muestras de sangre se incubaron durante 30 min a 37°C bajo balanceo suave. Se anadio a las muestras de sangre 1 microlitro y medio de disolucion madre de IL-6 diluida 10 veces, 1,5 jL de disolucion madre de uIFNa (PBL Biomedical, n.° de catalogo 11200-1), 1,5 jL de disolucion madre de IL-2 diluida 25 veces o 1,5 jL de dilucion madre de GM-CSF diluida 200 veces y las muestras se incubaron a 37°C durante 20 minutos bajo balanceo suave.
5.5.2.3. Preparacion de globulos blancos
Al final del penodo de estimulacion, se agregaron inmediatamente 3 ml de tampon Lyse/Fix 1X precalentado a las muestras de sangre, se agitaron brevemente en vortice y se incubaron durante 15 minutos a 37°C en un bano de agua para lisar los globulos rojos y fijar los leucocitos.
Los tubos se centrifugaron durante 5 min a 400xg a 4°C. El sedimento celular se lavo con 3 ml de 1X PBS frio, y despues de la centrifugacion, el sedimento celular se suspendio nuevamente en 100 jl de PBS 1X enfriado en hielo y se anadieron 900 jl de MeOH al 100% enfriado en hielo. Las celulas se incubaron a 4°C durante 30 min para la permeabilizacion.
A continuacion, las celulas permeabilizadas se lavaron con 1X PBS que contema 3% de BSAy finalmente se suspendio nuevamente en 80 jL de 1X PBX que contema 3% de BSA.
5.5.2.4. Marcaje celular
20 |jL de anticuerpo anti-STAT1 de raton PE (pY701) o anticuerpo de control de isotipo IgG2ak de raton PE (BD Biosciences, n.° de catalogo 612564 y 559319, respectivamente) y anticuerpo anti-CD4 conjugado con APC o anticuerpo de isotipo conjugado con APC de control (BD Biosciences, n.° de catalogo 555349 y 555751,
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respectivamente) se anadieron a tubos estimulados con IL-6 e IFN-a y, a continuacion, se incubaron durante 20 min a 4°C, en la oscuridad.
20 pL de anticuerpo anti-STAT5 de raton PE (pY694) o anticuerpo de control de isotipo IgG1k de raton PE (BD Biosciences, n.° de catalogo 612567 y 554680, respectivamente) y anticuerpo anti-CD4 conjugado con APC o anticuerpo de isotipo conjugado con APC de control (BD Biosciences, n.° de catalogo 555349 y 555751, respectivamente) se anadieron a tubos estimulados con IL-2 y, a continuacion, se incubaron durante 20 min a 4°C, en la oscuridad.
20 pL de anticuerpo anti-STAT5 de raton PE (pY694) o anticuerpo de control de isotipo IgG1k de raton PE (BD Biosciences, n.° de catalogo 612567 y 554680, respectivamente) y anticuerpo CD33 de raton APC (BD Biosciences, n.° de catalogo 345800) o anticuerpo de isotipo IgG1k de raton APC de control (BD Biosciences, n.° de catalogo 345818) se anadieron a tubos estimulados con GM-CSF y, a continuacion, se incubaron durante 20 min a 4°C, en la oscuridad.
Despues, las celulas se lavaron una vez con 1X PBS y se analizaron en un citometro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences).
5.5.2.5. Analisis de fluorescencia en FACSCanto II
Se contaron 50.000 eventos totales, y se midieron las celulas positivas para Fosfo-STAT1 luego de la entrada en celulas CD4+, en la entrada de linfocitos para celulas estimuladas con IL-6- e IFNa. Las celulas positivas para Fosfo- STAT5 se midieron despues de la entrada en celulas CD4 +, en la puerta de linfocitos para celulas estimuladas con IL-2. Las celulas positivas para Fosfo-STAT5 se midieron despues de la entrada en celulas CD33 +. Se analizo la informacion usando el programa informatico FACSDiva, y se calculo el porcentaje de inhibicion de celulas estimuladas con IL-6- e IFNa a partir del porcentaje de celulas positivas para Fosfo-STAT1 en celulas CD4+. Para las celulas estimuladas con IL-2, los resultados se analizaron usando el software FACSDiva y el porcentaje de inhibicion de la estimulacion con IL-2 se calculo a partir del porcentaje de celulas positivas para Fosfo-STAT1 en celulas CD4 +. Para las celulas estimuladas con GM-CSF, el porcentaje de inhibicion de la estimulacion con GM-CSF se calculo a partir del porcentaje de celulas positivas para el Fosfo-STAT5 en las celulas CD33 +.
Ejemplo 6. Modelos in vivo
6.1. Modelo de CIA
6.1.1. Materiales
Se adquirieron coadyuvante de Freund completo (CFA) y coadyuvante de Freund incompleto (IFA) de Difco. Se adquirieron colageno bovino tipo II (CII), lipopolisacarido (LPS), y Enbrel de Chondrex (Isle d'Abeau, Francia); Sigma (P4252, L'Isle d'Abeau, Francia), Whyett (jeringa inyectable de 25 mg, Francia) Acros Organics (Palo Alto, CA), respectivamente. Todos los otros reactivos utilizados fueron de grado reactivo, y todos los disolventes fueron de grado analttico.
6.1.2. Animales
Se adquirieron ratas Dark Agouti (macho, 7-8 semanas de edad) de Harlan Laboratories (Maison-Alfort, Francia).
Las ratas se mantuvieron en un ciclo de 12 h de luz/oscuridad (07:00 - 19:00). La temperatura se mantuvo a 22°C, y se proporcionaron alimentos y agua ad libitum.
6.1.3. Artritis inducida por colageno (CIA)
Un dfa antes del experimento, se preparo una disolucion de CII (2 mg/ml) con acido acetico, 0.05 M, y se almaceno a 4°C. Justo antes de la inmunizacion, se mezclaron volumenes equivalentes de coadyuvante (IFA) y CII con un homogeneizador, en una botella de vidrio previamente enfriada en un bano de agua helada. Pudieran ser necesarias una cantidad adicional de coadyuvante y una homogeneizacion prolongada, en caso de no formarse una emulsion. Se inyectaron 0,2 ml de la emulsion por via intradermica en la base de la cola de cada rata el dfa 1; se realizo una segunda inyeccion intradermica de refuerzo (disolucion de CII a una concentracion de 2 mg/ml en CFA, 0,1 ml disolucion salina), el dfa 9. Este metodo de inmunizacion se modifico a partir de los metodos publicados (Jou et al., 2005; Sims et al, 2004;).
6.1.4. Diseno del estudio
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Los efectos terapeuticos de los compuestos se sometieron a ensayo en el modelo de rata CIA. Las ratas se dividieron en forma aleatoria en grupos iguales, y cada grupo contema 10 ratas. Todas las ratas se inmunizaron el d^a 1 y se reforzaron el d^a 9. La dosificacion terapeutica duro desde el d^a 16 hasta el dfa 30. Se trato el grupo de control negativo con veldculo (MC 0,5%), y el grupo de control positivo, con Enbrel (10 mg/kg, 3 x semana, s. c.). Un compuesto de interes tfpicamente se sometio a ensayo en tres dosis, por ejemplo, 3, 10, 30 mg/kg, p. o.
6.1.5. Evaluacion cHnica de la artritis
La artritis se clasifico de acuerdo con el metodo de (Khachigian 2006, Lin et al., 2007, y Nishida et al., 2004). La inflamacion de cada una de las cuatro garras se clasifico con el puntaje artritico de la siguiente manera: 0: sin smtomas; 1: leve, aunque con enrojecimiento e inflamacion definidos de un tipo de articulacion, tal como el tobillo o la muneca, o enrojecimiento e inflamacion aparentes limitados a dedos individuales, independientemente del numero de dedos afectados; 2: moderado enrojecimiento e inflamacion de dos o mas tipos de articulaciones; 3: enrojecimiento e inflamacion graves de la garra entera, que incluye los dedos; 4: maxima inflamacion de la extremidad, con afectacion de multiples articulaciones (maximo puntaje de artritis clmica acumulativo de 16 por animal) (Nishida et al., 2004).
Con el fin de permitir el meta analisis de multiples estudios, los valores de puntajes clmicos se normalizaron de la siguiente manera:
AUC de puntaje clinico (puntaje AUC): Se calculo el area bajo la curva (AUC) del dfa 1 al dfa 14 para cada rata individual. El AUC de cada animal se dividio por el AUC promedio obtenido para el veldculo en el estudio del cual se obtuvo la informacion en dicho animal, y se multiplico por 100 (es decir, el AUC se expreso como un porcentaje del AUC de vetuculo promedio por estudio).
Aumento de puntaje clinico del dfa 1 al dfa 14 (puntaje de criterio de valoracion): La diferencia de puntaje clinico para cada animal se dividio por la diferencia de puntaje clinico promedio obtenida para el vetuculo en el estudio a partir del cual se obtuvo la informacion de dicho animal, y se multiplico por 100 (es decir, la diferencia se expreso como un porcentaje de la diferencia de puntaje clinico promedio para el vetuculo por estudio).
6.1.6. Cambio en el peso corporal (%) despues del inicio de la artritis
Clmicamente, el descenso de peso corporal se asocia con la artritis (Rall and Roubenoff, 2004; Shelton et al., 2005; Walsmith et al., 2004). En consecuencia, los cambios en el peso corporal luego del inicio de la artritis se pueden usar como un criterio de valoracion no espedfico con el fin de evaluar el efecto de los agentes terapeuticos en el modelo de rata. El cambio en el peso corporal (%) despues del inicio de la artritis se calculo de la siguiente manera:
Ratones- corporal tinmans) - peso corporal tfiemans) s peso corporal then;-;:}
Peso corporal tfitmaiaii - peso corporal tficmans) x peso corporal t{icuumj)
6.1.7. Radiolog^a
Se tomaron fotos de rayos X de las garras traseras de cada animal individual. Se asigno un numero de identidad aleatorio ciego a cada una de las fotos, y la severidad de la erosion osea fue clasificada por dos clasificadores independientes con el sistema de puntaje radiologico de Larsen, de la siguiente manera: 0: normal, con contornos oseos intactos y espacio articular normal; 1: leve anormalidad, con cualesquiera uno o dos de los huesos metatarsianos exteriores que muestran leve erosion osea; 2: anormalidad temprana definida con cualesquiera de tres a cinco de los huesos metatarsianos exteriores que muestran erosion osea; 3: anormalidad destructiva media, con todos los huesos metatarsianos exteriores, al igual que cualesquiera uno o dos de los huesos metatarsianos interiores que muestran erosiones oseas definidas; 4: anormalidad destructiva grave, con todos los huesos metatarsianos muestran erosion osea definida, y por lo menos una de las articulaciones metatarsianas interiores esta completamente erosionada, dejando algunos contornos articulares oseos preservados; 5: anormalidad mutilante sin contornos oseos. Este sistema de clasificacion es una modificacion del (Bush et al., 2002; Jou et al., 2005; Salvemini et al., 2001; Sims et al., 2004).
6.1.8. Histolog^a
Tras el analisis radiologico, las garras traseras de los ratones se fijaron en formalina regulada con fosfato al 10% (pH 7,4), se descalcificaron con descalificante oseo rapido para la histologfa fina (Laboratories Eurobio) y se embutieron en parafina. Con el fin de garantizar la evaluacion extensa de las articulaciones artnticas, se cortaron por lo menos cuatro secciones seriales (5 pm de espesor), y cada serie de secciones tema 100 pm, entre una y otra. Las secciones
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se tineron con hematoxilina y eosina (H&E). Las examinaciones histologicas para establecer la inflamacion sinovial y el dano oseo y de cartflago se efectuaron a doble ciego. En cada garra, se evaluaron cuatro parametros usando una escala de cuatro puntos. Los parametros fueron la infiltracion celular; la gravedad del pano sinovial; la erosion del cartflago; y la erosion osea. La clasificacion se efectuo de la siguiente manera: 1: normal; 2: leve; 3: moderado; 4: notable. Estos cuatro puntajes se sumaron, y se representaron como un puntaje adicional, es decir, el “puntaje total de AR”.
6.1.9. Analisis por tomografia computarizada (yC7) del calcaneo (hueso del talon):
La degradacion osea observada en AR se produjo especialmente en el hueso cortical, y pudo ser revelada por el analisis de pCT (Oste et al., 2007; Sims et al., 2004). Luego de la toma de imagenes y de la reconstruccion de volumen tridimensional del hueso calcaneo, se midio la degradacion osea como la cantidad de objetos separados presentes por diapositiva, aislados in sillico perpendiculares al eje longitudinal del hueso. Cuanto mayor es la cantidad de hueso degradada, se miden mas objetos separados. Se analizaron 1.000 cortes, distribuidos de forma pareja a lo largo del calcaneo (espaciadas por aproximadamente 10,8 pm).
6.1.10. PK de equilibrio
El dfa 7 u 11, se recogieron muestras de sangre en el seno retroorbital, con heparina de litio como anticoagulante, en los siguientes tiempos: predosis, 1,3 y 6 horas. Las muestras de sangre completa se centrifugaron, y las muestras de plasma resultantes se almacenaron a -20°C para posterior analisis pendiente. Se determinaron las concentraciones plasmaticas de cada compuesto de ensayo por medio de un metodo de LC-MS/MS, en el cual el espectrometro de masa se hizo funcionar en modo de electropulverizacion positivo. Los parametros farmacocineticos se calcularon usando Winnonlin® (Pharsight®, Estados Unidos), y se supuso que las concentraciones plasmaticas de predosis eran iguales a las concentraciones plasmaticas de 24 horas.
6.2. Modelos oncologicos
Se describen modelos in vivo para validar la eficacia de moleculas pequenas frente a enfermedades mieloproliferativas impulsadas por JAK2 (Geron et al., 2008; Wernig et al., 2008).
6.3. Modelo de raton IBD
Se describen modelos in vitro e in vivo para validar la eficacia de las moleculas pequenas frente a IBD (Wirtz y Neurath, 2007).
6.4. Modelo de asma de raton
Se describen modelos in vitro e in vivo para validar la eficacia de moleculas pequenas frente al asma (Ip et al., 2006; Kudlacz et al., 2008; Nials y Uddin, 2008; Pernis y Rothman, 2002).
6.5. Modelo murino de hiperplasia epidermica de tipo psoriasico inducida por inyecciones intradermicas de IL22 o IL23
6.5.1. Materiales
R&D Systems, proporciono IL22 recombinante de raton (582-ML-CF) libre de portador. La e-Bioscience proporciono IL23 recombinante de raton, libre de portador (14-8231, Cf).
6.5.2. Animales
Ratones de la lmea Balb/C (hembras, 18-20 g de peso corporal) se obtuvieron de CERJ (Francia). Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (07:00 - 19:00). La temperatura se mantuvo a 22°C, los alimentos y el agua se proporcionaron ad libitum.
6.5.3. Diseno del estudio
El diseno del estudio esta adaptado de Rizzo et al, 2011.
El primer dfa (D1), los ratones se afeitaron alrededor de las dos orejas.
Durante 4 dfas consecutivos (D1 a D4), los ratones recibieron una dosis intradermica diaria de IL22 o IL23 recombinante de raton (1 pg/20 pL en PBS/BSA al 0,1%) en el pabellon auricular derecho y 20 pL de PBS/BSA al 0,1% en el pabellon auricular izquierdo bajo anestesia inducida por inhalacion de isoflurano.
Desde el D1 hasta D5, a los ratones se les dosifico el compuesto de ensayo (10, 30 o 100 mg/kg, po, qd en MC 0,5%), 1 h antes de la inyeccion de IL23/IL22 o con vehfculo.
6.5.4. Evaluacion de la enfermedad
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El grosor de ambas orejas se midio diariamente con un calibrador automatico. El peso corporal se evaluo en la iniciacion y en el sacrificio. El quinto dfa, 2 horas despues de la ultima dosificacion, los ratones se sacrificaron. Se cortaron los pabellones de la oreja, excluyendo el cartflago. Los pabellones se pesaron y luego se colocaron en un vial que contema 1 ml de disolucion de RNAlater o en formaldel'ndo.
En D4, tambien se tomaron muestras de sangre del seno retroorbital para el perfil PK inmediatamente antes de la dosificacion (T0) y 1 h, 3 h, 6 h despues de la dosificacion.
Hubo 8 ratones por grupo. Los resultados se expresan como media ± sem y el analisis estadfstico se llevo a cabo utilizando Anova de un factor seguido por el ensayo post-hoc de Dunnett frente a grupos de vetnculos IL22 o IL23,
6.5.5. Histolog^a
Despues del sacrificio, las orejas se recogieron y se fijaron en formaldel'ndo al 3,7% antes de meterlas en parafina. Se realizaron cortes de dos pm de espesor y se tineron con hematoxilina y eosina. El grosor de la epidermis de la oreja se midio mediante el analisis de imagenes (software Sis'Ncom) con 6 imagenes por oreja capturadas con un aumento de x20. Los resultados se expresan como media ± sem y el analisis estadfstico se llevo a cabo utilizando Anova de un factor, seguido del ensayo post hoc de Dunnett frente a los grupos de vetnculos IL22 o IL23.
6.5.6. Extraccion de ARN, RT-PCR y PCR en tiempo real
Los niveles de transcripcion de IL-17a, IL-22, IL-1p, LCN2 y S100A9 en el tejido de la oreja se determinaron usando PCR cuantitativa en tiempo real.
Ejemplo 7. Ensayos de farmacocinetica, ADME y toxicidad
7.1. Solubilidad termodinamica
Se preparo una disolucion de 1 mg/ml del compuesto de ensayo en un regulador de fosfato, 0,2 M, pH 7,4, o un regulador de citrato, 0.1 M, pH 3,0, a temperatura ambiente en un vial de vidrio.
Las muestras se hicieron rotar en un instrumento Rotator drive STR 4 (Stuart Scientific, Bibby) a una velocidad de 3,0, a temperatura ambiente durante 24 h.
Despues de 24 h, se transfirieron 800 pl de la muestra a un tubo Eppendorf y se centrifugaron 5 min a 14 000 r.p.m. Luego se transfirieron 200 pl del sobrenadante de la muestra a una placa de solubilidad MultiscreenR Solubility Plate (Millipore, MSSLBPC50), y se filtro el sobrenadante (10-12" Hg) con la ayuda de un colector al vacfo, hacia una placa limpia Greiner de polipropileno con fondo en V, de 96 pocillos (n.° de catalogo 651201). Se diluyeron 5 pl del producto filtrado en 95 pl (F20) del mismo tampon utilizado para la incubacion en la placa que contema la curva estandar (Greiner, n.° de catalogo 651201).
Se preparo la curva estandar nuevamente para el compuesto en DMSO, iniciando a partir de una disolucion de carga de DMSO, 10 mM, diluida, factor 2, en DMSO (5000 pM), y luego diluida adicionalmente en DMSO hasta 19,5 pM. A continuacion, se transfirieron 3 pl de la serie de dilucion a partir de 5.000 pM, a una mezcla de 97 pl de acetonitrilo- tampon (50/50). El intervalo de concentracion final fue de 2,5 a 150 pM.
Se sello la placa con esterillas de sellado (MA96RD-04S,
www.kinesis.co.uk), y se midieron las muestras a temperatura ambiente en LCMS (ZQ 1525, de Waters) en condiciones optimizadas, usando Quanoptimize con el fin de determinar la masa apropiada de la molecula.
Las muestras se analizaron en LCMS con un caudal de 1 ml/min. El disolvente A consistfa en amoniaco, 15 mM, y el solvente B es acetonitrilo. La muestra se ejecuto en pulverizacion de ion positivo en una columna XBridge C18, de 3,5 pM (2,1 x 30 mm), de Waters. El gradiente de disolvente tuvo un tiempo de ejecucion total de 2 minutos, y oscilo de 5% B a 95% B.
Se analizaron las areas pico con la ayuda del paquete de programas informaticos Masslynx, y se trazaron las areas pico de las muestras frente a la curva estandar, con el fin de obtener la solubilidad del compuesto.
Los valores de solubilidad se proporcionan en pM o pg/ml.
7.2. Solubilidad acuosa
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Iniciando a partir de una carga de 10 mM en DMSO, se preparo una dilucion serial del compuesto en DMSO. La serie de dilucion se transfirio a una placa 96 NUNC Maxisorb de fondo F (n.° de catalogo 442404), y se agrego regulador de fosfato, 0,1 M, pH 7,4, o regulador de citrato, 0,1 M, pH 3,0, a temperatura ambiente.
La concentracion final vario de 300 |jM a 18,75 jM en 5 etapas de dilucion iguales. La concentracion final de DMSO no excedio el 3%. Se agrego pireno, 200 jM, a los rincones de cada placa de 96 pocillos, que sirvio como un punto de referencia para la calibracion del eje Z en el microscopio.
Las placas de ensayo se cerraron hermeticamente y se incubaron durante 1 h a 37°C, mientras se agitaba a 230 rpm. A continuacion, las placas se exploraron en un microscopio de luz blanca, con el fin de obtener imagenes individuales del precipitado por concentracion. Se analizo el precipitado y se convirtio en un numero, que se trazo en un grafico. La primera concentracion en la cual el compuesto aparece disuelto por completo es la concentracion presentada a continuacion; sin embargo, la concentracion verdadera se encuentra en algun punto entre esta concentracion y una etapa de dilucion mas alta.
Los valores de solubilidad se expresan en jg/ml.
7.3. Union de protema plasmatica (dialisis de equilibrio).
diluyo con un factor 5 en DMSO. Esta disolucion se recien descongelado, (BioReclamation INC), con una de 0,5% (5,5 jl en 1094,5 jl de plasma en una placa de 96 pocillos PP-Masterblock (Greiner, n.° de catalogo 780285)).
Se preparo una placa Pierce Red Device con inserciones (ThermoScientific, n.° de catalogo 89809) y se lleno con 750 jl de PBS en la camara de tampon y 500 jl del plasma espigado, en la camara de plasma. La placa se incubo durante 4 h a 37°C, mientras se agitaba a 230 rpm. Tras la incubacion, se transfirieron 120 jl de ambas camaras a 360 jl de acetonitrilo en una placa de 96 pocillos de base redonda, de pocillos profundos PP (Nunc, n.° de catalogo 278743), que se cerro hermeticamente con una tapa de papel aluminio. Las muestras se mezclaron y se colocaron en hielo durante 30 min. Esta placa luego se centrifugo 30 min a 1.200 rcf a 4°C, y el sobrenadante se transfirio a una placa de 96 pocillos de fondo en V PP (Greiner, 651201), para el analisis en LcMs.
La placa se sello con esterillas de sellado (MA96RD-04S) de
www.kinesis.co.uk, y las muestras se midieron a temperatura ambiente en LCMS (ZQ 1525, de Waters), en condiciones optimizadas, empleando Quanoptimize con el fin de determinar la masa apropiada de la molecula.
Las muestras se analizaron en LCMS con un caudal de 1 ml/min. El disolvente A fue amoniaco, 15 mM, y el disolvente B fue acetonitrilo. La muestra se ejecuto en pulverizacion de ion positivo en una columna XBridge C18, 3,5 jM (2,1 x 30 mm), de Waters. El gradiente de disolvente tuvo un tiempo de ejecucion total de 2 minutos, y oscilo de 5% B a 95% B.
El area pico del compuesto en la camara de regulador y la camara de plasma se considero 100% compuesto. El porcentaje ligado a plasma se derivo a partir de estos resultados, y se indico como porcentaje ligado a plasma.
La solubilidad del compuesto en la concentracion de ensayo final en PBS se examino por medio de un microscopio, para indicar si se observa o no precipitacion.
7.4. Estabilidad de aldeh^do oxidasa
Una disolucion de carga10 mM del compuesto de ensayo en DMSO se diluyo primero con agua (5 veces) para obtener una disolucion de trabajo 50 pM. Se preparo un inhibidor selectivo de aldetndo oxidasa (hidralazina) en agua como disolucion 5 mM.
Las mezclas de incubacion se prepararon anadiendo 10 jm de suspension de S9 de tngado (humano y rata, BD Bioscience Gentest, 20 mg/ml) a 86 jm de tampon de fosfato de potasio 50 mM, pH 7,4 a 37°C. Se anadieron 2 pL de hidralazina 5 mM (para la incubacion con la adicion de un inhibidor selectivo) o 2 pL de agua (para la incubacion sin la adicion del inhibidor).
Una disolucion de carga, 10 mM, del compuesto en DMSO se diluyo adicionalmente en plasma de perro, raton, rata o humano concentracion final de 5 jM y una concentracion final de DMSO
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Despues de 5 minutes de precalentamiento, la reaccion se inicio mediante la adicion de 2 pL de compuesto de ensayo 50 pM a las mezclas de incubacion. Despues de 0, 3, 6, 12, 18 y 30 minutes de incubacion, la reaccion (100 pL) finalizo con 300 pL de MeCN : MeOH (2:1) con una mezcla de acido acetico al 1% que contema 10 ng/mL de warfarina como estandar interno analttico.
Las muestras se mezclaron, se centrifugaron y el sobrenadante se analizo por LC-MS.
Los compuestos de ensayo se consideraron como un sustrato de aldelmdo oxidasa si el aclaramiento porS9 es inhibido por la hidralazina. El aclaramiento espedfico de la especie del compuesto de ensayo tambien puede indicar metabolismo por aldelmdo oxidasa.
La ftalazina se incluye como control positivo.
Las respuestas del instrumento (relacion de area de pico del compuesto de ensayo y el estandar interno) se referencian a las muestras de punto de tiempo cero (consideradas como 100%) con el fin de determinar el porcentaje de compuesto restante. Los diagramas del porcentaje de compuestos de ensayo restantes se usan para determinar la vida media (T1/2) y el aclaramiento intrmseco en las incubaciones S9 usando el programa informatico Graph Pad Prism.
Para calcular el aclaramiento intrmseco in vitro (CLn (pL/min/mg), se usa la siguiente formula:
CLrrtl = ti frSS . vofumer? tJe mcuiacron . j am T1/2 carKfriarf tie prole™
7.5. Estabilidad microsomal hepatica
Una solucion de carga de 10 mM de compuesto en DMSO se diluyo a 6 pM en un tampon de fosfato a 105 mM, pH 7,4 en una placa de 96 pocillos profundos (Greiner, n.° de catalogo 780285) y se precalento a 37°C.
Se diluyo una disolucion patron de trabajo de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PDH, Roche, 10127671001) de 700 U/ml con un factor 1:700 en un tampon fosfato a 105 mM, pH 7,4. Una mezcla de co-factor que contema 0,528M de MgCl2^6H2O (Sigma, M2670), 0,528M de glucosa-6-fosfato (Sigma, G-7879) y 0,208M de NADP + (Sigma, N-0505) se diluyo con un factor 1:8 en un tampon de fosfato a 105 mM, pH 7,4.
Se preparo una disolucion de trabajo que contema 1 mg/ml de microsomas hepaticos (Xenotech) de las especies de interes (humano, raton, rata, perro ...), 0,8 U/ml de G6PDH y mezcla del co-factor (6,6 mM de MgCh, 6,6 mM glucosa- 6-fosfato, 2,6 mM de NADP +). Esta mezcla se preincubo durante 15 minutos, pero nunca mas de 20 minutos, a temperatura ambiente.
Despues de la preincubacion, la dilucion del compuesto y la mezcla que contema microsomas se agregaron juntos en la misma cantidad y se incubaron durante 30 minutos a 300 rpm. Para el punto de tiempo de 0 min, se anadieron dos volumenes de MeOH a la dilucion del compuesto antes de que se agregue la mezcla de microsomas. La concentracion final durante la incubacion fue: compuesto de ensayo 3 pM o compuesto de control, microsomas de 0,5 mg/ml, G6PDH 0,4 U/ml, MgCl2 3,3 mM, glucosa-6-fosfato 3,3 mM y NaDP+ 1,3 mM.
Despues de 30 minutos de incubacion, la reaccion se desactivo con 2 volumenes de MeOH.
De ambos puntos de tiempo, las muestras se mezclaron, se centrifugaron y el sobrenadante se recogio para el analisis en LC-MS/MS. Las respuestas del instrumento (es decir, las alturas de los picos) se referencian a las muestras de punto de tiempo cero (como 100%) con el fin de determinar el porcentaje de compuesto restante. Los compuestos estandar Propanolol y Verapamil se incluyen en el diseno del ensayo.
Los datos sobre la estabilidad microsomal se expresan como un porcentaje de la cantidad total de compuesto que queda despues de 30 min.
7.6. Estabilidad de los hepatocitos
Los modelos para evaluar el aclaramiento metabolico en hepatocitos son descritos por McGinnity et al. Drug Metabolism and Disposition 2008, 32, 11, 1247.
7.7. Permeabilidad de Caco2
Se efectuaron ensayos bidireccionales de Caco-2 como se describe a continuacion. Se obtuvieron pocillos Caco-2 de la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (European Collection of Cell Cultures (ECACC, n.° de catalogo 86010202) y se usaron tras un cultivo de celulas de 21 dfas en placas de 24 pocillos Transwell (Fisher TKT-545-020B).
Se sembraron 2 x 105 celulas/pocillo en un medio de placa, que consistfa en DMEM + GlutaMAXI + 1% NEAA + 10% FBS (FetalClone II) + 1% Pen/Estrep. El medio se cambio cada 2-3 dfas.
Se prepararon compuestos de ensayo y de referencia (propranolol y rodamina 123, o vinblastina, todos obtenidos de Sigma) en disolucion salina balanceada de Hanks que contema HEPES, 25 mM (pH 7,4), y se agregaron o bien a las camaras apicales (125 |jl) o bien a basolaterales (600 |jl) del montaje de la placa Transwell a una concentracion de 10 |jM, con una concentracion final de DMSO de 0,25%.
5 Se agregaron 50 jiM de amarillo Lucifer Yellow (Sigma) al tampon donante, en todos los pocillos, con el fin de evaluar la integridad de los estratos celulares mediante el control de la penetracion de amarillo Lucifer Yellow. Debido a que Lucifer Yellow (LY) no pudo penetrar libremente las barreras lipofilas, un alto grado de transporte LY indico mala integridad del estrato celular.
Despues de 1 h de incubacion a 37°C con agitacion en una agitadora orbital a 150 rpm, se tomaron alfcuotas de 70 jil 10 tanto de las camaras apicales (A) como de las basales (B), y se agregaron a 100 jiL de disolucion 50:50 de acetonitrilo:agua que contema estandar interno analttico (carbamazepina, 0,5 jiM), en una placa de 96 pocillos.
Se midio el amarillo Lucifer con un instrumento Spectramax Gemini XS (Ex. 426 nm, y Em. 538 nm) en una placa limpia de 96 pocillos que contema 150 jl de lfquido de lateral basolateral y apical.
Se midieron las concentraciones de compuesto en las muestras por medio de la cromatograffa lfquida de alto 15 rendimiento/espectroscopia de masa (LC-MS/MS).
Los valores de permeabilidad aparente (Pap) se calcularon a partir de la relacion:
Pap = [compuesto]aceptor final X Vaceptor / ([compuesto]donante inicial X Vdonante) / Tinc X Vdonante / superficie espedfica X 60 X '10 cm/s
V = volumen de camara.
20 Tinc = tiempo de incubacion.
superficie espedfica = 0,33 cm2.
Las relaciones de Salida, como indicacion de la salida activa desde la superficie celular apical, se calcularon usando la relacion de Pap B>A/ Pap A>B.
Se usaron los siguientes criterios de aceptacion del ensayo:
25 Propranolol: Pap (A>B) valor > 20 (x 10-6 cm/s).
Rodamina 123 o Vinblastina: Pap (A>B) valor < 5 (x10-6 cm/s) con relacion de Salida > 5.
Permeabilidad de amarillo Lucifer: < 100 nm/s.
7.8. Permeabilidad MDCKII-MDR1
Las celulas MDCKII-MDR1 fueron celulas epiteliales de rinon canino Madin-Darby, que sobreexpresan el gen de 30 resistencia a multiples farmacos humanos (MDR1), que codifica la glicoprotema P (P-gp). Las celulas se obtuvieron del Netherlands Cancer Institute y se usaron despues de un cultivo celular de 3-4 dfas en placas de insercion de cultivo de celulas Millicell de 24 pocillos (Millipore, PSRP010R5). El ensayo de permeabilidad mDcKII-MDR1 bidireccional se realizo como se describe a continuacion.
Se sembraron 3x105 celulas/ml (1,2x105 celulas/pocillo) en un medio de cultivo constituido por DMEM + 1% de 35 Glutamax-100 + 1% de Antibiotico/Antimicotico + 10% de FBS (Biowest, S1810). Las celulas se dejaron en incubadora de CO2 durante 3-4 dfas. El medio se cambio 24 h despues de la siembra y el dfa del experimento.
Los compuestos de ensayo y de referencia (amprenavir y propranolol) se prepararon en disolucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS, pH 7,4) y se anadieron a las camaras apical (400 |jL) o basolateral (800 |jL) del conjunto de placas de insercion de cultivo celular Millicell a concentracion final de 10 jM (0,5 jM en el caso de 40 amprenavir) con una concentracion final de DMSO del 1%.
Se agrego 100 pM de amarillo Lucifer (Sigma) a las disoluciones de tampon de todos los donantes, con el fin de evaluar la integridad de las monocapas celulares mediante el control de la permeacion del amarillo Lucifer. El amarillo Lucifer es un marcador fluorescente para la ruta paracelular y se usa como control interno en cada monocapa para verificar la integridad de la union durante el ensayo.
5 Despues de una incubacion de 1 h a 37°C mientras se agito en un agitador orbital a 150 rpm, se tomaron alfcuotas de 75 pl de ambas camaras apical (A) y basal (B) y se agregaron a 225pL de disolucion de acetonitrilo: agua (2:1) estandar (warfarina 10 ng/ml) en una placa de 96 pocillos. Las alfcuotas tambien se realizaron al comienzo del experimento a partir de disoluciones de donantes para obtener la concentracion inicial (Co).
La concentracion del compuesto en las muestras se midio mediante cromatograffa lfquida/espectroscopia de masas 10 de alto rendimiento (LC-MS/MS).
El amarillo Lucifer se midio con un Fluoroscan Ascent FL Thermo Scientific (Ex 485nm y Em 530nm) en una placa de 96 pocillos que contema 150 pL de lfquido de todos los pocillos receptores (lado basolateral o apical).
7.9. Estudio farmacocinetico en roedores
7.9.1. Animales
15 Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley (macho, 5-6 semanas de edad) de Janvier (Francia). Las ratas se aclimataron durante al menos 7 dfas antes del tratamiento, y se mantuvieron con un ciclo de 12 h de luz/oscuridad (07:00 - 19:00). La temperatura se mantuvo a aproximadamente 22°C, y se proporcionaron alimentos y agua ad libitum. Dos dfas antes de la administracion de los compuestos de ensayo, las ratas se sometieron a la cirugfa con el fin de colocar un cateter en la vena yugular, bajo anestesia de isoflurano. Despues de la cirugfa, las ratas se albergaron en forma individual. 20 Las ratas fueron privadas de alimentos durante al menos 16 horas antes de la dosificacion oral, y 6 horas despues. Se proporciono agua ad libitum.
7.9.2. Estudio farmacocinetico
Se formularon los compuestos en PEG200/disolucion salina fisiologica (60/40) para la via intravenosa y en metilcelulosa al 0,5% e hidroxilpropil-p-ciclodextrina al 10%, pH 3 para la via oral. Los compuestos de ensayo se 25 dosificaron por via oral como una sola sonda esofagica, en una concentracion de 5 mg/kg, con un volumen de dosificacion de 5 ml/kg, y se dosificaron por via intravenosa como un bolo por medio de la vena cava en una concentracion de 1 mg/kg, con un volumen de dosificacion de 5 ml/kg. Cada grupo consistio en tres ratas. Se recogieron muestras de sangre por medio de la vena yugular con heparina de litio como anticoagulante, en los siguientes tiempos: 0,05; 0,25; 0,5; 1; 3; 5 y 8 horas (via intravenosa), y 0,25; 0,5; 1; 3; 5; 8 y 24 horas (via oral). 30 Alternativamente, se recogieron muestras de sangre en el seno retroorbital con heparina de litio como anticoagulante, en los siguientes tiempos: 0,25; 1; 3 y 6 horas (via oral). Se centrifugaron muestras de sangre completa a 5000 rpm durante 10 min, y las muestras de plasma resultantes se almacenaron a -20°C para el analisis posterior pendiente.
7.9.3. Cuantificacion de niveles compuestos en plasma
Se determinaron las concentraciones plasmaticas de cada compuesto de ensayo por medio de un metodo de LC- 35 MS/MS, en el cual el espectrometro de masa se hizo funcionar en modo de electropulverizacion positivo.
7.9.4. Determinacion de parametros farmacocineticos
Los parametros farmacocineticos se calcularon usando Winnonlin® (Pharsight®, Estados Unidos).
7.10. Estudio de toxicidad de rata de 7 d^as
Se llevo a cabo un estudio de toxicidad oral de 7 dfas con los compuestos de ensayo en ratas macho Sprague-Dawley, 40 con el fin de evaluar su potencial toxico y la toxicocinetica con dosis diarias de 100, 300 y 500 mg/kg/dfa, por medio de una sonda nasogastrica, con un volumen de dosificacion constante de 5 ml/kg/dfa.
Los compuestos de ensayo se formularon en HPpCD al 30% (v/v) en agua purificada. Cada grupo inclrna 5 ratas macho principales, al igual que 3 animales satelite, para la toxicocinetica. Se suministro a un cuarto grupo HPpCD al 30% (v/v) en agua unicamente, a la misma frecuencia, volumen de dosificacion y por la misma via de administracion, 45 que funcionaba como el grupo de control de vehfculo.
La meta del estudio consistfa en determinar la menor dosis que no produce eventos adversos identificados (concentracion de efecto adverso no observable - NOAEL, por sus siglas en ingles).
7.11. Sensibilidad de la prolongacion QT
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Se evaluo el potencial para la prolongacion QT en el ensayo de pinzamiento de parche de hERG.
Se llevaron a cabo registros de pinzamiento zonal de celula entera usando un amplificador EPC10 controlado por el programa informatico Pulse v8.77 (HEKA). La resistencia de serie fue tipicamente inferior a 10 MQ y fue compensada mas del 60%, los registros no fueron sustrafdos por filtracion. Los electrodos se fabricaron a partir de vidrio de pipeta GC150TF (Harvard).
La disolucion de bano externo contema: NaCl, 135 mM; KCl, 5 mM; CaCl2, 1.8 mM; glucosa, 5 mM; HEPES, 10 mM; pH 7,4.
La disolucion de pipeta de parche interno contema: Kgluconato, 100 mM; KCl, 20 mM; CaCl2, 1 mM; MgCh, 1 mM; Na2ATP, 5 mM; glutationa, 2 mM; EGTA, 11 mM; HEPES, 10 mM; pH 7,2.
Los farmacos se perfundieron usando un sistema de perfusion rapido Biologic MEV-9/EVH-9.
Todos los registros se efectuaron en celulas HEK293 que expresaron en forma estable canales hERG. Las celulas se cultivaron en cubiertas de portaobjetos redondas de 12 mm (German glass, Bellco) ancladas en la camara de registro usando dos varillas de platino (Goodfellow). Se provocaron corrientes de hERG usando un pulso de activacion a +40 mV durante 1.000 ms, seguido de un pulso de corriente de cola a -50 mV durante 2.000 ms, donde el potencial de mantenimiento fue de -80 mV. Los pulsos se aplicaron cada 20 s, y todos los experimentos se efectuaron a temperatura ambiente.
Observaciones finales
Los expertos en la tecnica apreciaran que las descripciones precedentes son de naturaleza ilustrativa y explicativa, y estan destinadas a ilustrar la invencion y sus realizaciones preferidas. A traves de la experimentacion rutinaria, un experto en la tecnica reconocera modificaciones aparentes y variaciones que se pueden realizar sin apartarse del espiritu de la invencion.
Debe entenderse que factores tales como la capacidad de penetracion celular diferencial de los diversos compuestos pueden contribuir a las discrepancias entre la actividad de los compuestos en los ensayos bioqmmicos y celulares in vitro.
Al menos algunos de las denominaciones qmmicas de compuestos de la invencion segun se proporcionan y se exponen en esta solicitud, pueden haberse generado de forma automatizada mediante el uso de un programa informatico de denominacion qmmica comercialmente disponible, y no se han verificado independientemente. Los programas representativos que realizan esta funcion incluyen la herramienta de denominacion Lexichem comercializada por Open Eye Software, Inc. y la herramienta de programa informatico Autonom comercializada por MDL, Inc. En el caso en que la denominacion qmmica indicada y la estructura representada difieran, regira la estructura representada.
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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15
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25
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Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    1. Un compuesto de acuerdo con la Formula I:
    imagen1
    en la que,
    R1 es H, o Me;
    Li es -NR2-; -O-, o -CH2-;
    Cy es fenilo, o heteroarilo monodclico o bidclico fusionado de 5-9 miembros que comprende de 1 a 4 heteroatomos independientemente seleccionados entre N, O, y S;
    R2 es H, o alquilo C1-4;
    R3 es H, halo, alquilo C1-4 opcionalmente sustituido con uno o mas halo, o alcoxi C1-4 opcionalmente sustituido con uno o mas halo;
    R4 es H o halo;
    R5 es -CN, halo o es -L2-R6
    -L2 esta ausente, o es -C(=O)-, -C(=O)NR7, -NR7C(=O)-, -SO2-, -SO2NR7, o -NR7SO2-;
    R6 es H, o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con uno o mas grupos R8 independientemente seleccionados;
    R7 es H, o alquilo C1-4;
    R8 es OH, CN, halo, o alcoxi C1-4,
    La esta ausente, o es -C(=O)-, -C(=O)O- o -C(=O)NH-;
    Ra es:
    • H,
    • alquilo C1-4 opcionalmente sustituido con uno o mas Rb independientemente seleccionados,
    • cicloalquilo C3-7 monodclico opcionalmente sustituido con uno o mas Rc independientemente seleccionados, o
    • heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados de O, N, y S, o
    • heteroarilo monodclico de 5-6 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N, y S;
    Rb es
    • halo,
    • CN,
    • OH,
    • alcoxi C1-4,
    • cicloalquilo C3-7,
    • heterocicloalquilo monodclico de 4-7 miembros que comprende uno o mas heteroatomos independientemente seleccionados entre O, N, y S (heterocicloalquilo esta opcionalmente sustituido con uno o mas independientemente seleccionados entre halo, u oxo),
    • -SO2-alquilo C1-4, o
    • -C(=O)NRb1Rb2
    Rc es
    • halo,
    • CN,
    • OH,
    • alquilo C1-4,
    • -C(=O)OH, o
    • -C(=O)NRc1Rc2; y
    cada Rb1, Rb2, Rc1 y Rc2 se selecciona independientemente entre H, y alquilo C1-4, o una sal farmaceuticamente aceptable, o un solvato, o un solvato de la sal farmaceuticamente aceptable.
  2. 2. Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde R1 es Me.
  3. 3. Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el compuesto es de acuerdo con las Formulas IIa, IIb, o IIc:
    5
    10
    imagen2
    en donde Li, R3, R4, La, Ra y R5 son de acuerdo como se describen en la reivindicacion 1.
  4. 4. Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el compuesto es de acuerdo con las Formulas IVa, IVb, IVc, IVd, IVe, o IVf:
    imagen3
    en donde R3, R4, R5 La, y Ra son de acuerdo como se describen en la reivindicacion 1.
  5. 5. Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el compuesto es de acuerdo con las Formulas Va, Vb, Vc, Vd, Ve, o Vf:
    imagen4
    en donde R3, R4, R5 La, y Ra son de acuerdo como se describen en la reivindicacion 1.
  6. 6. Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde R4 es H, F, o Cl.
  7. 7. Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde R3 es H, Me, o Et.
  8. 8. Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde R5 es CN, F, Cl, -SO2Me o -SO2Et.
  9. 9. Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde Ra es:
    imagen5
    5 10. Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la revindication 1, en donde
    el compuesto es (1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)oxi]-1-metil-bencimidazol-4-il]-2-fluoro-ciclopropanocarboxa- mida.
  10. 11. Una composition farmaceutica que comprende un vehiculo farmaceuticamente aceptable y una cantidad farmaceuticamente eficaz de un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con una
    10 cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
  11. 12. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 11, que comprende un agente terapeutico adicional.
  12. 13. El compuesto o sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o la composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 11 o 12, para su uso en medicina.
  13. 14. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o la composicion farmaceutica de 15 acuerdo con la reivindicacion 11 o 12, para su uso en el tratamiento, o prevention de enfermedades alergicas,
    enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio del cartflago, malformaciones congenitas del cartflago y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o la hipersecrecion de interferones.
  14. 15. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde el agente terapeutico adicional es un 20 agente para el tratamiento de enfermedades alergicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes,
    enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican deterioro del recambio de cartflago, malformaciones congenitas del cartflago y/o enfermedades asociadas con la hipersecrecion de IL6 o la hipersecrecion de interferones.
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