ES2689308T3

ES2689308T3 - Cebadores para detección y tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas, método y kit de detección

Info

Publication number: ES2689308T3
Application number: ES14718156.4T
Authority: ES
Inventors: Gloria ROYO GARCÍA; Juan Carlos RODRÍGUEZ DÍAZ; Antonio José GALIANA CABRERA
Original assignee: Fundacion para el Fomento de la Investigacion Sanitaria y Biomedica de la Comunitat Valenciana FISABIO
Current assignee: Fundacion para el Fomento de la Investigacion Sanitaria y Biomedica de la Comunitat Valenciana FISABIO
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2018-11-13
Anticipated expiration: 2034-02-28
Also published as: EP2940152B1; WO2014102761A8; US20180179583A1; EP3392350A1; EP3392346A1; US9914980B2; EP2940152A2; WO2014102761A3; US20180230520A1; WO2014102761A2; US20160122805A1

Abstract

Se proponen unas parejas de cebadores, su uso para detección de genes de carbapenemasas y cepas bacterianas productoras de carbapenemasas, y un método de diagnóstico empleando dicho conjunto de cebadores. Se propone además, preferiblemente, el uso de un grupo de sondas dentro de cada reacción de amplificación, más preferiblemente PCR multiplex, para la identificación selectiva y detección de genes de carbapenemasas a partir de una muestra biológica. Los cebadores objeto de esta invención pueden ser utilizados para la preparación de un kit para identificación y detección de genes de carbapenemasas, preferiblemente de genes de carbapenemasas contenidos en cepas bacterianas productoras de dichas enzimas.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Cebadores para detección y tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas, método y kit de detección

Descripción

La presente invención se refiere a unos cebadores para una rápida detección y/o tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas. A partir de los citados cebadores, la invención propone igualmente un kit de detección rápida de carbapenemasas para la identificación de organismos multirresistentes productores de dichas enzimas, con aplicación en la práctica clínica para una prevención y control epidemiológico de brotes de infecciones, por ejemplo, intrahospitalarias, con particular aplicación en Unidades de Cuidados Intensivos y UCIs de Neonatos. Por último, la invención concierne igualmente a un método para detección y/o tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas empleando dichos cebadores.

ESTADO DE LA TÉCNICA

En epidemiología se utilizan técnicas de biología molecular para analizar ciertas características bacterianas válidas como marcadores epidemiológicos. Se incluyen técnicas que derivan de la bioquímica, la inmunología y la genética.

Los métodos de tipado genotípicos se basan en el estudio del ADN cromosómico o extra cromosómico. Los principales métodos incluyen el análisis de plásmidos, el análisis de restricción con endonucleasas, huellas digitales con sondas de ADN y huellas digitales por PCR. En lo que concierne a las técnicas de reacción en cadena de polimerasa o PCR, existen diversas variaciones de la PCR que pueden utilizarse. Una de ellas usa cebadores complementarios a regiones repetitivas encontradas en el genoma bacteriano de la cual existen dos modalidades (la REP-PCR y la ERIC-PCR). Otra variación es la PCR que utiliza cebadores arbitrarios (AP-PCR). De todas ellas la REP-PCR es la que presenta mayor poder de discriminación y reproducibilidad y además puede ser usada tanto en bacterias gram-negativas como gram- positivas. La técnica PCR se puede también combinar con la técnica de endonucleasas de restricción, obteniendo fragmentos que luego son analizados electroforéticamente (PCR-RFLP).

La técnica PCR y otras técnicas de amplificación pueden tener un efecto importante en el acortamiento de los tiempos y en el incremento de la certeza del diagnóstico de una variedad de infecciones por microorganismos. Su uso es interesante, principalmente, en aquellas infecciones para las cuales los métodos alternativos resultan costosos y engorrosos o en los que la demora en el diagnóstico es causada por el lento crecimiento de los microorganismos en los medios de cultivo convencionales.

Actualmente se está trabajando intensamente en el diseño de métodos fiables de detección de estas cepas multirresistentes. Una revisión bibliográfica realizada por los inventores muestra que hay diversos grupos de investigadores trabajando en este importante problema clínico.

Como consecuencia de estas investigaciones, se ha desarrollado un método de vigilancia para identificar la presencia en el recto de enterobacterias resistentes a carbapenem productoras de KPC, basado en la detección mediante PCR del gen blaKPC (Schechner V. Evaluation of PCR-based testing for surveillance of KPC-producing carbapenem-resistant members of the Enterobacteriaceae family. J Clin Microbiol. 2009T; 47:3261-5.). El estudio en cuestión desarrolla un sistema rápido de identificación, sin embargo, detecta exclusivamente el gen blaKPC, lo cual representa una limitación en aquellos medios en los que prevalecen otras carbapenemasas. Por otro lado, el estudio carece de un estándar reconocido para la comparación del método, por lo que los valores de sensibilidad reales podrían ser inferiores a los obtenidos experimentalmente.

Existen, asimismo, sistemas homólogos para la detección del gen blaNDM-1 (Danny C. T. Ong. Rapid detection of the blaNDM-1 gene by real-time PCR. J. Antimicrob. Chemother. (2011) doi: 10.1093/jac/dkr184 y Kruttgen A. et al. Real- time PCR assay and a synthetic positive control for the rapid and sensitive detection of the emerging resistance gene New Delhi metallo-p-lactamase-1 (blaNDM-1). Med Microbiol Immunol 2011;200:137-41.).

Por último, existen metodologías de cribado que permiten detectar, mediante el uso de derivados del ácido borónico, bacterias productoras de carbapenemasas tipo A, incluyendo KPC, SME, IMI, NMC-A y GES. Este sistema, que es capaz de reconocer diferentes tipos de carbapenemasas, se basa, sin embargo, en técnicas microbiológicas fenotípicas y no en técnicas moleculares, que son generalmente mucho más rápidas que las anteriores.

Pueden citarse diversas patentes relacionadas con el objeto de la invención:

RU 2415932-A describe un método para la identificación de genes de p-lactamasas tipo A de amplio espectro. El método se basa en la técnica PCR y utiliza un microchip de ADN marcado con biotina; esta molécula es detectada por un conjugado de estreptavidina-peroxidasa, reconocido posteriormente mediante detección colorimétrica de peroxidasa.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

WO2008124670-A hace referencia a un método de identificación de todas las isotermas conocidas del gen KPC, que incluye un nuevo par de cebadores y una nueva sonda para detección de la enzima mediante métodos de amplificación como la técnica PCR. Este sistema puede ser presentado en forma de kit para detección de carbapenemasas en muestras de pacientes. El sistema aquí descrito es el más próximo al propuesto en la presente invención, pero es mucho más limitado, ya que detecta únicamente las carbapenemasas KPC.

El documento Iwaya A. et al. 2005 (Iwaya A et al., Rapid and quantitative detection of blood Serratia marcescens by a real-time PCR assay: its clinical application and evaluation in a mouse infection model. FEMS Microbiology letters, 2005; 248(2):163-70) divulga un ensayo para el diagnóstico de Serratia marcescens en sangre de ratones, que simultáneamente detecta Serratia marcescens y el gen de resistencia a carbapenem.

Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar sistemas que permitan una sencilla, rápida y fiable detección de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas en muestras biológicas, lo cual sería interesante desde el punto de vista del diagnóstico clínico. Sería deseable, además, que este sistema no solo permitiera el tipado de las carbapenemasas detectadas, sino también la detección del mayor número posible de éstas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a los cebadores y sondas identificados en las reivindicaciones adjuntas. Los cebadores y sondas objeto de esta invención pueden ser utilizados para la preparación de un kit para identificación y detección de genes de carbapenemasas, preferiblemente genes de carbapenemasas contenidos y producidos por cepas bacterianas productoras de carbapenemasas. La invención aporta, asimismo, un método de diagnóstico empleando dichos cebadores y sondas.

Otro objeto descrito en la presente invención concierne a un kit para identificación y detección de genes de carbapenemasas, preferiblemente genes de carbapenemasas contenidos y producidos por cepas bacterianas productoras de carbapenemasas, que comprende los cebadores y las sondas según esta invención.

En una realización preferida de la invención, el kit comprende unos cebadores y sondas específicas para el reconocimiento de diferentes genes de carbapenemasas, por ejemplo aquellos indicados en la Tabla 1, que se incluye más adelante.

La invención comprende, asimismo, un método para detección y tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas que comprende unir o hibridar los cebadores de la invención en una secuencia específica de ADN del gen a ensayar, realizar una amplificación específica selectiva de los genes de carbapenemasas e identificar el producto de amplificación con la sonda específica de la secuencia genética o fragmento genético de interés diagnóstico.

El método de identificación de genes de carbapenemasas propuesto en esta invención se caracteriza porque preferiblemente utiliza reacciones multiplex donde, por ejemplo, dos o tres reacciones de cebadores-sonda trabajan en conjunto para detectar distintos tipos de genes de carbapenemasas. Las reacciones que pueden trabajar juntas se muestran en la Tabla 1.

En particular, el método para identificación de genes de carbapenemasas de esta invención se caracteriza porque cada uno de los cebadores sentido y antisentido de una reacción multiplex se unen a secuencias específicas de ADN para poder amplificarlas por PCR y, preferiblemente, al mismo tiempo cada sonda específica marcada con un fluoróforo determinado se une a estos amplicones que se forman en el caso de presencia de genes de carbapenemasas.

Así las secuencias de ADN están sometidas preferiblemente a PCR (técnica de reacción en cadena de polimerasa) que es, más preferiblemente, PCR en tiempo real Multiplex.

El método permite detectar diferentes dianas (carbapenemasas) en una única reacción y hace posible detectar un número superior a 170 enzimas carbapenemasas comprendidas, aunque sin limitarnos, en los siguientes tipos:

- Carbapenemasas de la clase A: NMC, IMI, SME, KPC y GES.

- Carbapenemasas de la Clase B1: IMP, VIM, GIM, SPM, NDM y SIM.

- Carbapenemasas de la Clase D: OXA tipo 23, tipo 51, tipo 58, tipo 60a, tipo 50a, tipo 55, tipo 62, tipo 54, tipo

24, tipo 48, tipo 133, tipo 182, tipo 98, tipo 60c y tipo 60d.

La principal aportación de la invención radica en las secuencias de los oligonucleótidos de los cebadores propuestos, los cuales pueden ser empleados conjuntamente en una única reacción de amplificación permitiendo detectar un elevado número de genes de carbapenemasas potencialmente presentes en una muestra biológica.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

El método no comparte la misma tecnología de otros sistemas comerciales que son capaces de detectar carbapenemasas (por ejemplo, los productos de la línea puntos de chequeo) y preferiblemente se basa en la tecnología Taqman, es decir, que se trata preferiblemente de un método de detección de carbapenemasas por tecnología Taqman.

La innovación radica así en utilizar una serie de oligonucleótidos diseñados por los inventores que, combinados entre sí y preferiblemente junto con la tecnología Taqman, son capaces de detectar la mayoría de las carbapenemasas descritas en la bibliografía, superando cualquier sistema descrito hasta el momento.

La técnica, además de los beneficios ya comentados, presenta otras ventajas adicionales como la de ser un ensayo con capacidad de adaptarse a cualquier laboratorio que disponga de un termociclador de PCR, preferiblemente a tiempo real, sin necesidad de un aparataje ni software exclusivo, reduciendo así costes y aumentando la accesibilidad de la técnica a cualquier laboratorio.

Los oligonucleótidos propuestos son específicos para cada grupo de carbapenemasas y han sido diseñados para hibridar con regiones de ADN conservadas para cada grupo, de modo que, con una sonda, se pueden detectar y clasificar todas las variantes distintas que pertenecen a un mismo grupo.

La técnica empleada es, preferiblemente, PCR Multiplex a tiempo real que, como es sabido, es una técnica que tiene la capacidad de detectar más de una diana al mismo tiempo en una reacción de amplificación de ADN (PCR). Más preferiblemente, cada amplicón formado por la reacción de amplificación con dos oligonucleótidos específicos se distingue del otro gracias a un tercer oligonucleótido que se marca con un fluoróforo determinado de modo que, dependiendo de qué fluoróforo detecte el aparato de PCR a tiempo real en una muestra, estará presente una diana u otra.

El número de dianas que se pueden detectar al mismo tiempo está limitado por dos factores:

1. Por el número de fluoróforos (indicadores de color) comerciales disponibles espectralmente distintos.

2. Por el número de fluoróforos (indicadores de color) que pueden ser excitados y detectados por el aparato utilizado.

Las ventajas asociadas a la invención descrita son:

1. Detección de la diana: se detectan distintos genes de carbapenemasas a partir del ADN de la cepa que se sospecha que pueda ser productora de carbapenemasas. Se puede detectar tanto genes que se encuentren en plásmidos como genes que se encuentren en el cromosoma de la bacteria.

2. Tipo de muestra: aunque en una realización preferida la técnica está pensada para hacer la PCR a tiempo real con ADN extraído de una cepa previamente aislada por cultivo, también se puede hacer a partir de ADN extraído de una muestra biológica de cualquier tipo, por ej. un hemocultivo.

3. Rapidez: disminuye el tiempo del diagnóstico a aproximadamente 2 horas una vez que se tiene la muestra que se quiere ensayar/testar (por ejemplo, 35 min de extracción del ADN comprendido en la muestra y 1h 20 minutos de PCR). Además, aumenta considerablemente la sensibilidad y especificidad (coeficientes muy próximos a 1).

4. El método aquí descrito se puede utilizar para la detección de cualquier microorganismo (gram positivo o gram negativo) productor de carbapenemasas durante, por ejemplo, un proceso infeccioso, pudiendo hacer que el médico haga una mejor elección del tratamiento antibiótico (disminuyendo la tasa de fracaso terapéutico).

5. Respecto al control de brotes infecciosos intrahospitalarios se considera que, en el supuesto de sospecha de brote hospitalario, aplicar este sistema podría ser fundamental para el ahorro de dinero y tiempo a la hora de detectar de dónde procede dicho brote. Al ser capaz de detectar y clasificar por clases las cepas productoras de carbapenemasas se podría localizar de dónde procede el brote y tomar medidas de forma rápida, disminuyendo el peligro potencial que ocasiona dicho brote.

En cuanto al conocimiento de la epidemiología de la región donde se haga un estudio de cepas productoras de carbapenemasas, ha de indicarse que actualmente, como no existen métodos de detección de calidad, se desconoce la distribución y el tipo de carbapenemasas en nuestro medio.

Por todo ello, un primer aspecto de la invención se refiere a una pareja de cebadores, de ahora en adelante “pareja de cebadores de la invención”, para detección y tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas, que consiste en SEQ ID NO: 67-SEQ ID NO: 68.

En la Tabla 1 mostrada más abajo se indica qué tipo de carbapenemasa es capaz de amplificar cada una de estas parejas de cebadores.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit, de ahora en adelante “kit de la invención”, para ser utilizado en la detección de genes que codifican carbapenemasas, que comprende al menos una pareja de cebadores de la invención y reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación. Preferiblemente, dicho kit comprende además al menos una sonda capaz de hibridar con el producto de amplificación de dicha pareja de cebadores.

Se entiende por “reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación”, sin ningún tipo de limitación, el uso de tampones, enzimas, enzimas polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado, el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. El kit puede contener, además, otras moléculas, genes, proteínas o sondas de interés, que sirvan como controles positivos y negativos. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención descrito posteriormente.

La expresión “sonda”, “cebador” y “fragmento genético de diagnóstico” indican en el presente texto la secuencia de nucleótidos específica capaz de reconocer o detectar selectivamente genes que codifican carbapenemasas, preferiblemente genes de carbapenemasas contenidos y producidos por cepas bacterianas. Los cebadores son utilizados para activar una reacción de amplificación de un fragmento de ADN, preferiblemente mediante reacción en cadena de polimerasa o PCR. La sonda se emplea para la detección específica de la diana de interés formada por dicha reacción de amplificación, preferiblemente PCR, y su secuencia será complementaria a la de dicha diana de interés o producto de amplificación producido por las parejas de cebadores de la invención.

Los cebadores, de acuerdo con esta invención, son secuencias de oligonucleótidos utilizados como cebador sentido o cebador antisentido para activar la reacción de amplificación, preferiblemente PCR, con la característica de unirse a regiones específicas de genes de carbapenemasas.

El término "hibrida" o “hibridación”, como se usa aquí, se refiere a un proceso en el que dos hebras complementarias de ácido nucleico se reconocen entre sí y se unen en condiciones apropiadas de rigurosidad. Las hibridaciones a las que se refiere la presente invención se llevan a cabo típica y preferiblemente con secuencias de ácidos nucleicos de una longitud de entre 10-100 nucleótidos, más preferiblemente de entre 10-50 nucleótidos, más preferiblemente aún, de entre 10-30 nucleótidos. Las técnicas y condiciones de la hibridación de ácidos nucleicos son bien conocidas en la técnica. El experto medio en la materia es capaz de estimar y ajustar la rigurosidad de las condiciones de hibridación.

En una realización preferida del kit de la invención, la pareja de cebadores de la invención o la sonda está marcada con un fluoróforo.

Se entiende por “fluoróforo” cualquier compuesto que puede emitir una señal luminosa o coloreada tras su excitación. Ejemplos de fluoróforos son, aunque sin limitarnos: fluoresceína, rodamina, cumarina, cianina, y sus derivados, GFP, YFP y RFP, Oregón verde, eosina, rojo Texas, derivados de naftaleno, derivados de la cumarina, derivados de oxadiazol, derivados de pireno, derivados de oxacina (como rojo Nilo o azul Nilo), derivados de acridina, derivados de tetrapirrol, Alexa Flúor, DyLight Flúor, CY5, TAMRA, JOE o biotina. En una realización más preferida, la sonda está marcada con CY5, TAMRa o JOE. En otra realización preferida, al menos uno de los cebadores de la pareja de cebadores de la invención está marcado con biotina.

En otra realización preferida del kit de la invención, la sonda comprende, más preferiblemente consiste, en la secuencia:

a. SEQ ID NO: 3, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2,

b. SEQ ID NO: 6, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 5,

c. SEQ ID NO: 9, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 8,

d.: SEQ ID NO: 12, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 10-SEQ ID NO: 11

e.: SEQ ID NO: 15, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO: 14

f.: SEQ ID NO: 18, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 16-SEQ ID NO: 17

g.: SEQ ID NO: 21, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 19-SEQ ID NO: 20

h.: SEQ ID NO: 24, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 22-SEQ ID NO: 23

i.: SEQ ID NO: 27, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 25-SEQ ID NO: 26

j.: SEQ ID NO: 30, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 28-SEQ ID NO: 29

k.: SEQ ID NO: 33, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 31-SEQ ID NO: 32

l.: SEQ ID NO: 36, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 34-SEQ ID NO: 35

m.: SEQ ID NO: 39, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 37-SEQ ID NO: 38

n.: SEQ ID NO: 42, cuando la pareja de cebadores es SEQ 5 ID NO: 40-SEQ ID NO: 41

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

o.: SEQ ID NO: 45, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 43-SEQ ID NO: 44,

p.: SEQ ID NO: 48, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 46-SEQ ID NO: 47,

q.: SEQ ID NO: 51, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 49-SEQ ID NO: 50,

r.: SEQ ID NO: 54, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 52-SEQ ID NO: 53,

s.: SEQ ID NO: 57, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 55-SEQ ID NO: 56,

t.: SEQ ID NO: 60, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 58-SEQ ID NO: 59,

u.: SEQ ID NO: 63, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 61-SEQ ID NO: 62,

v.: SEQ ID NO: 66, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 64-SEQ ID NO: 65,

w.: SEQ ID NO: 68, NO: 69, SEQ ID NO: 70 y/o SEQ ID NO : 71, cuando la pareja de cebadores

x.: SEQ ID NO: 74, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 72-SEQ ID NO: 73,

y.: SEQ ID NO: 77, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 75-SEQ ID NO: 76.

En otra realización preferida, el kit de la invención comprende la pareja de cebadores SEQ ID NO: 67-SEQ ID NO: 68 y sondas capaces de hibridar con los productos de amplificación de dicha pareja de cebadores, más preferiblemente las sondas sEq ID NO: 69, SEQ ID nO: 70, SEQ ID nO: 71. Estas parejas de cebadores son capaces de amplificar las carbapenemasas tipo IMP (clase B) (ver Tabla 1).

En una realización aún más preferida, el kit de la invención comprende todas las parejas de cebadores de la invención, es decir, las parejas de cebadores SEQ ID NO: 67-SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10-SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16- SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19-SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22-SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25-SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28-SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31-SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34-SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37-SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40-SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43-SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46-SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49-SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52-SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55-SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58-SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61-SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64-SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 72-SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 75-SEQ ID NO: 76, y sondas capaces de hibridar con los productos de amplificación de dichas parejas de cebadores, preferiblemente las sondas descritas anteriormente en los puntos (a) a (y).

Las parejas de cebadores de la invención y el kit de la invención son de utilidad para la detección y/o tipado de genes de carbapenemasas en muestras biológicas, de manera que pueden ser empleados en un método de diagnóstico in vitro donde, si se detecta la presencia de dichos genes se puede afirmar que la muestra testada se encuentra infectada con bacterias productoras de los mismos. Así, otro aspecto de la invención se refiere al uso in vitro, es decir, en una muestra biológica aislada o en muestras tomadas de un cultivo in vitro, de la pareja de cebadores de la invención o del kit de la invención para la detección y/o tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas. Ejemplos de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas son, aunque sin limitarnos, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas sp., aquellas bacterias que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae (en adelante Enterobaterias Productoras de Carbapenemasas, EPC), de entre las que podemos citar Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter spp., Serratia marcescens, Morganella morganii, o Citrobacter spp.

La infección causada por las bacterias productoras de carbapenemasas puede ser tratada con agentes antimicrobianos específicos o por cualquier combinación de los mismos. Los agentes antimicrobianos preferibles para el tratamiento de infecciones por EPC se seleccionan de la lista que comprende: Carbapenems (preferiblemente meropenem y doripenem), Aztreonam, Colistina, aminoglucósidos (preferiblemente amikacina), Fosfomicina, Tigeciclina, quinolonas (preferiblemente ciprofloxacino) o Trimetroprim/Sulfametoxazol.

Para la elección de los agentes antimicrobianos a utilizar es necesario considerar el tipado de la bacteria o bacterias causantes de la infección, y alternativamente determinar la actividad microbiológica de la misma ante el agente antimicrobiano (por ejemplo, determinando la concentración mínima inhibitoria, CMI). La elección del tratamiento con el agente antimicrobiano mencionado, o con cualquiera de las combinaciones de agentes antimicrobianos mencionados, así como sus concentraciones, podrían ser determinadas por el experto en la materia una vez identificadas las especies bacterianas productoras de carbapenemasas y/o la cepa concreta presente en la muestra analizada tal como se describe en la presente invención.

En una realización preferida, las carbapenemasas se seleccionan de la lista que consiste en:

- Carbapenemasas de la clase A, preferiblemente NMC, IMI, SME, KPC y/o GES,

- Carbapenemasas de la Clase B1, preferiblemente IMP, VIM, GIM, SPM, NDM y/o SIM, y/o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

- Carbapenemasas de la Clase D, preferiblemente OXA tipo 23, tipo 51, tipo 58, tipo 60a, tipo 50a, tipo 55, tipo 62, tipo 54, tipo 24, tipo 48, tipo 133, tipo 182, tipo 98, tipo 60c y/o tipo 60d.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para la detección y/o tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas en una muestra biológica aislada caracterizado porque comprende:

. poner en contacto una muestra biológica aislada que comprende ADN con la pareja de cebadores de la invención,

i. amplificar el ADN comprendido en dicha muestra biológica aislada con la pareja de cebadores, y

ii. detectar la presencia del producto de amplificación obtenido en el paso (ii).

De ahora en adelante se hará referencia a este método como “método de la invención”.

En una realización preferida del método de la invención, la detección del paso (iii) comprende la hibridación del producto de amplificación obtenido en el paso (ii) con al menos una sonda capaz de hibridar con el producto de amplificación de la pareja de cebadores empleada en el paso (i).

En otra realización preferida, la sonda empleada en el método de la invención o presente en el kit de la invención puede estar inmovilizada en un soporte, de manera que el producto resultante de la amplificación del paso (ii) se pasa posteriormente por dicho soporte en el que la sonda se encuentra inmovilizada para su detección. El término “inmovilizada”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a que la sonda puede ser unida a un soporte sin perder su actividad. Preferiblemente, el soporte puede ser la superficie de una matriz, (por ejemplo, una matriz de nylon), de una membrana, una placa de microvaloración (por ejemplo, de 96 pocillos) o soporte de plástico similar, o bien cuentas (esferas, por ejemplo, esferas de agarosa o microesferas pequeñas superparamagnéticas compuestas de matrices biodegradables).

En otra realización preferida del método de la invención, la pareja de cebadores empleada en el paso (i) o la sonda empleada en la detección del paso (iii) se encuentra marcada con un fluoróforo. En una realización más preferida, el fluoróforo se selecciona de la lista que consiste en: CY5, TAMRA, JOE y biotina. En una realización aún más preferida, la sonda está marcada con CY5, TAMRA o JOE. En otra realización preferida, al menos uno de los cebadores de la pareja de cebadores de la invención está marcado con biotina.

En otra realización preferida del método de la invención, la sonda comprende, más preferiblemente consiste, en la secuencia:

a. SEQ ID NO: 3, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2,

b. SEQ ID NO: 6, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 5,

c. SEQ ID NO: 9, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 8,

n.: SEQ ID NO: 42, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 40-SEQ ID NO: 41

o.: SEQ ID NO: 45, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 43-SEQ ID NO: 44

p.: SEQ ID NO: 48, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 46-SEQ ID NO: 47

q.: SEQ ID NO: 51, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 49-SEQ ID NO: 50

r.: SEQ ID NO: 54, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 52-SEQ ID NO: 53

s.: SEQ ID NO: 57, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 55-SEQ ID NO: 56

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

t.: SEQ ID NO: 60, cuando

u.: SEQ ID NO: 63, cuando

v.: SEQ ID NO: 66, cuando

w.: SEQ ID NO: 69, SEQ ID

: NO: 68,

x.: SEQ ID NO: 74, cuando

y.: SEQ ID NO: 77, cuando

la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 58-SEQ ID NO: 59,

la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 61-SEQ ID NO: 62,

la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 64-SEQ ID NO: 65,

NO: 70 y/o SEQ ID NO: 71, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 67-SEQ ID

la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 72-SEQ ID NO: 73, o

la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 75-SEQ ID NO: 76.

En otra realización preferida del método de la invención, en el paso (i) se pone en contacto la muestra biológica aislada con las parejas de cebadores SEQ ID NO: 28-SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 46-SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55-SEQ ID NO: 56, SeQ ID NO: 67-SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 72-SEQ ID NO: 73. En una realización más preferida, en el paso (i) se pone en contacto la muestra biológica aislada con todas las parejas de cebadores de la invención.

En otra realización preferida, la amplificación del paso (ii) se lleva a cabo mediante PCR, más preferiblemente PCR en tiempo real y aún más preferiblemente PCR Multiplex en tiempo real.

De acuerdo con la presente invención, el término “multiplex” indica una constitución de mezcla capaz de detectar diferentes clases de carbapenemasas en una única reacción (por ejemplo “cualquier tipo Oxa”, “VIM-GIM-SPM, “KPC- SME-NMC”).

El término “muestra biológica aislada que comprende ADN”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biológicos de cualquier procedencia obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biológica puede proceder de una muestra de suelo, agua, tejido (como por ejemplo, aunque sin limitarnos, a piel), por ejemplo, pero sin limitarse, de una biopsia o de un aspirado por aguja fina, o puede ser un fluido biológico, por ejemplo, pero sin limitarse, sangre, esputo, plasma, suero, orina o exudado (por ejemplo, rectal, pus). La muestra puede proceder también de un cultivo in vitro, como por ejemplo pero sin limitarnos, de un hemocultivo inoculado previamente con sangre de un individuo, preferiblemente con bacteriemia. La muestra puede ser tomada de un humano, pero también de mamíferos no humanos, como por ejemplo, pero sin limitarse, roedores, rumiantes, felinos o cánidos. Por ello, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica procede de un individuo, más preferiblemente de un individuo humano. En otra realización preferida, la muestra biológica es sangre, esputo, exudado, piel o hemocultivo previamente inoculado con sangre de un individuo que preferiblemente presenta bacteriemia.

En otra realización preferida, el método de la invención es un método de diagnóstico in vitro que además comprende:

(iv) asignar al individuo al grupo de pacientes infectados con cepas bacterianas productoras de carbapenemasas cuando en el paso (iii) se detecta la presencia de producto de amplificación.

Los pasos del método de la invención pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un equipo robótico para la detección, en el paso (iii), del producto de amplificación.

Además de los pasos especificados anteriormente, el método de la invención puede comprender otros pasos adicionales, por ejemplo, aunque sin limitarnos, relacionados con el pre-tratamiento de la muestra biológica aislada previamente a su análisis, por ejemplo, con objeto de extraer de dicha muestra el material genético.

Además, el método de la invención, así como el kit de la invención, puede comprender adicionalmente cebadores y sondas capaces de hibridar, y amplificar en el caso de los cebadores, una secuencia de ADN presente en la muestra a testar que actúe como control.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Muestra la detección de los grupos de carbapenemasas OXA-23, 51 y 58 en muestras conteniendo tres cepas distintas de Acinetobacter baumanii.

Fig. 2. Representa la visualización en un gel de agarosa de los resultados de amplificación de diferentes genes de carbapanemasas tras las reacciones de amplificación con las parejas de cebadores de la invención.

EJEMPLOS

5

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de las parejas de cebadores de la invención en la detección y/o tipado de distintos grupos de carbapenemasas.

10

Ejemplo 1

Los cebadores y sondas de esta invención tienen las siguientes secuencias seleccionadas del grupo de: SEQ ID NOs: 1-77 descritas en la Tabla 1 que sigue a continuación. En las dos primeras columnas se indican los cebadores y en la 15 tercera la sonda. Se emplearon en cada caso, para la detección, un triplete de dos cebadores y una sonda.

TABLA 1

Multiplex 1: Secuencia Sentido (F) Secuencia Antisentido Secuencia Taqman

OXA tipo 23: TCGGT AATGCT GAAATT G (SEQ ID NO: 1) CTGTGTATGTGCTAATT GG (SEQ ID NO: 2) AACTCTACCTCTTGA ATAGGCGTAACC (SEQ ID NO: 3)

OXA tipo 51: CCTT CAAAATGCTTAAT GC (SEQ ID NO: 4) TAGGGTCAT GTCCTTTT C (SEQ ID NO: 5) CACCATAAGGCAAC CACCACAG (SEQ ID NO: 6)

OXA tipo 58: TGAGCATAGTATGAGTC G (SEQ ID NO: 7) TGACCAT CATATGT GAC A (SEQ ID NO: 8) TTCCACAAGTGAATA ACTCAATCATCG (SEQ ID NO: 9)

Multiplex 2: Secuencia F Secuencia R Secuencia Taqman

OXA tipo 60a: TGCAGGCTTATGTCGAT G (SEQ ID NO: 10) CTTCGAAAGCGGAAAT CTC (SEQ ID NO: 11) CGCAGCCAGAACTG GTCGATC (SEQ ID NO: 12)

OXA tipo 50a: CCTGATCGGCTTATCCA C (SEQ ID NO: 13) GT ACGTT CGAT GCCTT G A (SEQ ID NO: 14) TAGATCCGCCGACG AGGTTCT (SEQ ID NO: 15)

OXA tipo 55: AAGCGAGTACTGACTAT ATYATTC (SEQ ID NO: J6)___________________ CAGGTT AACGGCGAAA TAG (SEQ ID NO: 17) CGTCCAACTCCAAC CAACCGA (SEQ ID NO: 18)

Multiplex 3: Secuencia F Secuencia R Secuencia Taqman

OXA tipo 62: CGATCATTCCCTGGGAT G (SEQ ID NO: 19) GAGACGACCTGAT AGC AG (SEQ ID NO: 20) CCGCGACGCATCAA GAACTG (SEQ ID NO: 21)

OXA tipo 54: GCTGTAT CAT AACAAGT TGC (SEQ ID NO: 22) CGAT CT GAGGCT CAATT C (SEQ ID NO: 23) CAGTCAGCGTATCG TCAAGCAAG (SEQ ID NO: 24)

OXA tipo 24: GTGGGAGAAAGATATG ACTTTA (SEQ ID NO: 25) T CGACCT GTGTT CCAAT A (SEQ ID NO: 26) TGTCAGCAGTTCCA GT AT AT CAAGAGC (SEQ ID NO: 27)

Multiplex 4: Secuencia F Secuencia R Secuencia Taqman

OXA tipo 48: GTT GGAAT GCT CACTTT AC (SEQ ID NO: 28) TTCGCCCGTTTAAGATT A (SEQ ID NO: 29) AATCCTTGCTGCTTA TTCTCATTCCA (SEQ ID NO: 30)

OXA tipo 133: GAACGTATTGATTT CGG TAA (SEQ ID NO: 31) CT GT GT AT GTGCCAATT G (SEQ ID NO: 32) AACTCTACCTCTTGA AT AGGCGT GAC ( SEQ ID NO: 33)

OXA tipo 182: CCACAAGT AGGTTGGTT AA (SEQ ID NO: 34) CCCTAAATTTTCTAACG ACTTA (SEQ ID NO: 35) AGAACCAGACATTC CTTGCTTCATT (SEQ ID NO: 36)

Multiplex 5: Secuencia F Secuencia R Secuencia Taqman

OXA tipo 98: TAGGCGAYGCTATGAA AG (SEQ ID NO: 37) CTTGGGTACCGATATCT G (SEQ ID NO: 38) AACCAACACGCTTC ACTT CATTAGAC (SEQ ID NO: 39)

OXA tipo 60c: CATCGACGTT CAAGATT CC (SEQ ID NO: 40) CT CCCACT GCTTGT AAG G (SEQ ID NO: 41) AACAGCCTGATCGC CTTCGA (SEQ ID NO: 42)

OXA tipo 60d: GT GCCGAT AT ACCAGG AG (SEQ ID NO: 43) CTTCGAATGCGGAAATC TC (SEQ ID NO: 44) CCACGCAGCCAGAA TTGATCG (SEQ ID NO: 45)

Multiplex 6: Secuencia F Secuencia R Secuencia Taqman

VIM: TCCGRCTTTACCAGATT G (SEQ ID NO: 46) CACGCT GT AT CAAT CAA A (SEQ ID NO: 47) CAACTCATCACCATC ACGGACAA (SEQ ID NO: 48

GIM: TGGAGTATATCTTCATA CCTC (SEQ ID NO: 49) CTTCGT GT CTT CTT CAG A (SEQ ID NO: 50) AGGCTTGATTATTAT CCAGAACT ACCA (SEQ ID NO: 51)

SPM: CTTCGAATGTCTT AGT A GC (SEQ ID NO: 52) TCGGCTTCAT AGTCTT A G (SEQ ID NO: 53) ACCGTTGTCATTGTC TCTTCGC (SEQ ID NO: 54)

Multiplex 7: Secuencia F Secuencia R Secuencia Taqman

KPC: TTGGCT AAAGGGAAAC AC (SEQ ID NO: 55) CGACGGCATAGTCATTT G (SEQ ID NO: 56) CATACVCTCCGCAG GTTCCG (SEQ ID NO: 57)

SME: GGGAAT GTTCT CAAT GC TA (SEQ ID NO: 58) CACCT ACAACCCAAT CA G (SEQ ID NO: 59) CGAGCATCACCAGT TGTATTACCTT (SEQ ID NO: 60)

NMC: ACCCATCACAACTAAAT ATAAAG (SEQ ID NO: _61___________________ CGTT CAAGRAT AATATT AGTAGCA (SEQ ID NO: 62) AGCDGCAGCAGCCA TATCAC (SEQ ID NO: 63)

Multiplex 8: Secuencia F Secuencia R Secuencia Taqman

GES CARB: CTCTGTGAGTCGGCTA GA (SEQ ID NO: 64) GGCGT AGTT GT AT CT CT GA (SEQ ID NO: 65) AGYCGGAGATGAIC GACAACAC (SEQ ID NO: 66)

Multiplex 9: Secuencia F Secuencia R Secuencia Taqman

IMP tipo 3: GCAT CT GWATTAACAA ATG (SEQ ID NO: 67) CCACT ACGTT AT CTKG AG (SEQ ID NO: 68) TGTGGCTTGAACCT TACCGTCT (SEQ ID NO: 69)

IMP tipo 15: AGCCAATAGCTAVC TCCGCT (SEQ ID NO: 70)

IMP tipo 19: TTAACTAGCCAATA RCTAACTCCGC (SEQ ID NO: 71)

5

Multiplex 10: Secuencia F Secuencia R Secuencia Taqman

NDM: GCCCAATATTATGCAC CC (SEQ ID NO: 72) GTCGCCAGTTTCCATT TG (SEQ ID NO: 73) CTGAGCACCGCATT AGCCGC (SEQ ID NO: 74)

SIM: GGCTTAGTAGTTCTTG ACA (SEQ ID NO: 75) CTTCCATTGACAGTGA AATC (SEQ ID NO: 76) ATCTCATCGACACT CCAGCTTCC (SEQ ID NO: 77)

Se emplearon oligonucleótidos específicos para genes que codifican carbapenemasas. Dos oligonucleótidos actúan de cebador sentido y de cebador antisentido y se empleó un tercero marcado con un indicador de color o fluoróforo, el cual se sitúa en medio del amplicón que se está sintetizando por PCR y cuando la taq polimerasa pasa por él corta el 10 indicador de color que se libera al medio emitiendo su fluorescencia típica.

10

El perfil de amplificación de la PCR fue: pre PCR: 2 min a 50°C, 2 min a 94°C PCR: (15 segundos a 94°C, 50 segundos a 60°C)x40 reps. La lectura de la fluorescencia se hizo en el paso de 50 segundos a 60°C.

En esta invención se pueden detectar dianas distintas en una sola reacción. Los experimentos realizados (entiéndase 5 por experimento cada una de las 10 reacciones distintas de detección de dianas que se realizaron en distintas multiplex en reacciones que utilizaban 2 o 3 sondas distintas en cada pocillo de la placa de PCR a tiempo real) han sido diseñados por el programa Beacon Designer v8 en el perfil de experimento Taqman, que tiene la capacidad de generar reacciones multiplex a partir de introducirle las secuencias distintas de los genes que quieres amplificar al mismo tiempo.

10

En esta invención, para aumentar el número de dianas capaces de ser detectadas con el menor número de sondas posibles, lo que se hizo fue estudiar las regiones de ADN conservadas entre carbapenemasas del mismo grupo (ej. KPC, Oxa_23 etc.), de modo que tomando una representativa de cada grupo y centrándonos en dichas regiones genómicas altamente conservada, se diseñaron sondas capaces de detectar la mayoría de variantes dentro del mismo 15 grupo con una sola reacción de PCR.

A continuación, se muestra una segunda tabla (Tabla 2) con todas las carbapenemasas detectadas por el método propuesto. Hay que tener en cuenta qué estas son las carbapenemasas que como mínimo detecta el sistema, ya que al estar diseñado el experimento hacia regiones conservadas del ADN seguramente conforme se vayan encontrando 20 nuevas carbapenemasas aún no descritas en la bibliografía mientras pertenezcan a algún grupo de los detectados por el sistema, probablemente también se puedan detectar.

TABLA 2

Listado de carbapenemasas detectadas y sus fluoróforos

Clase: Tipo Subtipo Marcaje

A: GES 2, 4, 5, 13, 16, 14, 18, 15, 20 CY5

A: SME 1, 2, 3 TAMRA

A: KPC 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 CY5

A: NMC/IMI 1, 2, 3 JOE



: CY5

B: IMP 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 15, 19, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 30 TAMRA



: JOE

B: SIM 1 TAMRA

B: NDM 1, 2, 5 CY5

B: VIM 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ,21, 22, 23, 24, 25 ,26, 27, 28, 29, 30, 31 CY5

B: GIM 1 TAMRA

B: SPM 1 JOE

D: OXA tipo 23 23, 27, 49, 146, 73, 133, 168, 167, 166, 165, 170, 169, 171,225 CY5


: 77, 112, 110, 107, 51, 94, 92, 95, 88, 69, 65, 60, 70,


: 78, 66, 76, 68, 75, 67, 82, 90, 89, 91, 93, 84, 98, 108, 110, 99, 107, 106, 109, 80, 79, 83, 113, 111,

D: OXA tipo 51 115, 116, 117, 128, 132, 130, 131, 138, 150, 149, 148, 144, 180, 179, 177, 178, 176, 175, 174, 173, 172, 208, 223, 203, 195, 200, 206, 202, 196, 201, TAMRA


: 197, 194

D: OXA tipo 58 58, 97, 96, 164 JOE

D: OXA 48 48 CYS

D: OXA 133 133 TAMRA

D: OXA 182 182 JOE

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Ejemplo 2. Sistema de detección y tipado de carbapenemasas utilizando la técnica de PCR a Tiempo Real en combinación con la tecnología Taqman.

El sistema diseñado consta de 25 sondas Taqman que, agrupadas en reacciones multiplex de 3 ó 2 dianas, formaba 8 reacciones multiplex. En cada reacción multiplex cada sonda estaba marcada con un fluoróforo distinto de modo que se pudieran detectar al mismo tiempo las 3 dianas si se encontraban presentes en la muestra. Todas las reacciones multiplex que se incluyeron en este ensayo funcionaban en las mismas condiciones de temperatura y tenían una valoración mínima de 8 sobre 10 según el software empleado para su diseño, por lo que todas las combinaciones funcionaban igual de bien.

Cada sonda fue diseñada para hibridar en la reacción de PCR contra regiones altamente conservadas dentro de una clase de carbapenemasas. De modo que el sistema tiene capacidad para detectar todas las variantes dentro de un mismo grupo de carbapenemasas. En principio el sistema tiene capacidad para detectar más de 200 variantes conocidas.

Resultados obtenidos:

Como muestran los resultados, el sistema tiene capacidad para detectar más de una carbapenemasa por reacción. La figura 3 muestra los resultados obtenidos a partir de 3 cepas distintas de Acinetobacter baumannii de cepario perfectamente caracterizadas previamente.

En la primera cepa encontramos 2 tipos de carbapenemasas; la oxa-23 y la oxa-51. En la segunda cepa encontramos solo la carbapenemasa oxa-51. En la tercera cepa encontramos la oxa-58 y la oxa-51 (Fig. 1).

Además de la puesta a punto del sistema utilizando cepas comerciales de las que se conocían sus mecanismos de resistencia, también se realizaron experimentos adicionales para evaluar el sistema mediante 2 ensayos ciegos. Cada ensayo tenía un tamaño de 65 y 53 aislados clínicos respectivamente (compuestos por Enterobacterias, Pseudomonas sp. y Acinetobacter sp.) previamente caracterizados en los distintos hospitales de origen y totalmente desconocidos para nosotros. Los resultados obtenidos por nuestro sistema coincidieron al 100% con los obtenidos previamente por dichos centros.

Además, el sistema se aplicó a una colección de 600 cepas bacterianas aisladas consecutivamente donde previamente se había realizado un cribado de sensibilidad disminuida a carbapenems, con el objetivo de poder conocer las carbapenemasas más frecuentes encontradas en nuestro medio.

Ejemplo 3. Sistema de detección y tipado de carbapenemasas utilizando la técnica de PCR sin sondas Taqman

Los cebadores aquí descritos también pueden utilizarse en una tecnología de amplificación por PCR donde dichos cebadores estén marcados con biotina y una posterior hibridación contra una membrana portadora de un fragmento de ADN complementario al amplicón de interés. Después de la hibridación, mediante una reacción química la biotina oscurece la membrana en la zona de hibridación y un software, dependiendo del grado de oscurecimiento de la zona, da la reacción como positiva o negativa.

De este modo, se juntarían todos los cebadores aquí descritos (sin sondas en la reacción, únicamente con el marcaje de biotina de dichos cebadores) en una reacción de PCR para amplificar las dianas de interés. Es decir, en lugar de hacer 8 reacciones distintas de 3 o 2 multiplex cada una se realizaría una única reacción multiplex con todos los cebadores como se describe a continuación.

3.1. Adaptación de la amplificación por tiempo real a la amplificación por PCR convencional y posterior detección del producto por hibridación en membrana de amplicones marcados con biotina.

Se diseñó un sistema de PCR en tiempo real para detectar genéticamente cepas productoras de carbapenemasas. Se adaptaron las reacciones multiplex de tiempo real (que estaban agrupadas de 3 en 3) en una única reacción de PCR convencional donde en vez de hacer reacciones multiplex de 3 en 3 dianas se juntaran todas esas reacciones en una única reacción donde estuvieran presentes todos los cebadores diseñados para el sistema PCR en tiempo real. De modo que cuando una cepa sometida al ensayo y que sea portadora de un gen que el sistema sea capaz de detectar, se amplifique y mediante el análisis en un gel de agarosa se determine si es portadora o no de carbapenemasas y posteriormente se hibride en una membrana (los amplicones estarían marcados con biotina) para identificar qué tipo de carbapenemasa porta.

El programa de PCR convencional empleado para la amplificación fue el siguiente:

1 ciclo de 4 min a 94°C seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 94°C, 45 segundos a 50°C y 45 segundos a 68°C, y 1 ciclo adicional de 7 min a 68 °C.

El punto más importante del programa es el de 45 segundos a 50°C. Los cebadores fueron diseñados para funcionar de 50 a 52 grados (datos teóricos obtenidos por los programas de simulación). Sin embargo, inesperadamente dichos cebadores fueron capaces de funcionar de manera óptima en ensayos a rangos de temperaturas de entre 57°C a 60°C. Los programas de simulación no predijeron que los cebadores pudieran funcionar a temperaturas superiores a 52°C. 5 Por otro lado, según estos programas tampoco era esperable que en una reacción multiplex con todos los cebadores de la invención, juntos, se obtuviesen resultados fiables de amplificación, ya que lo esperable era la obtención de amplificaciones inespecíficas por incompatibilidad entre cebadores, sin embargo, según los datos experimentales mostrados, la combinación de todos los cebadores en una reacción multiplex funciona bastante bien sin dar resultados inespecíficos (Fig. 2).

10

Las concentraciones de los cebadores utilizadas fueron las siguientes:

Para la amplificación y detección de los genes de carbapenemasas KPC, GES, IMP, OXA-51 y SME se utilizó una concentración de al menos 0,5 pmol/^l para ambos cebadores (sentido y antisentido) y para el resto de los genes (SPM, 15 SIM, OXA-48, OXA-24, NDM, NMC, VIM, OXA-23, OXA-58) se utilizó una concentración de al menos 0,25 pmol/^l, para ambos cebadores (sentido y antisentido)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Fundación para el Fomento de la Investigación Sanitaria y Biomédica de la Comunitat Valenciana

<120> Cebadores para detección y tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas, método y kit de detección

<130> PCT3136.1

<150> P201232077 <151> 2012-12-31

<160> 77

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_23_like <400> 1

tcggtaatgc tgaaattg 18

<210>2 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_23_like <400> 2

ctgtgtatgt gctaattgg 19

<210>3 <211> 27 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_23_like

<400> 3

aactctacct cttgaatagg cgtaacc 27

<210>4 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador directo para amplificación de of Oxa_51_like

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

ccttcaaaat gcttaatgc

19

<210>5 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_51_like <400> 5

tagggtcatg tccttttc 18

<210> 6 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_51_like <400> 6

caccataagg caaccaccac ag 22

<210>7 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_58_like <400> 7

tgagcatagt atgagtcg 18

<210> 8 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_58_like <400> 8

tgaccatcat atgtgaca 18

<210> 9 <211> 27 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_58_like <400> 9

ttccacaagt gaataactca atcatcg 27

<210> 10 <211> 18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_60a_like <400> 10

tgcaggctta tgtcgatg 18

<210> 11 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_60a_like <400> 11

cttcgaaagc ggaaatctc 19

<210> 12 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_60a_like <400> 12

cgcagccaga actggtcgat c 21

<210> 13 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_50a_like <400> 13

cctgatcggc ttatccac 18

<210> 14 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_50a_like

<400> 14

gtacgttcga tgccttga 18

<210> 15 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_50a_like

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<400> 15

tagatccgcc gacgaggttc t 21

<210> 16 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_55_like <400> 16

aagcgagtac tgactataty attc 24

<210> 17 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_55_like <400> 17

caggttaacg gcgaaatag 19

<210> 18 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_55_like <400> 18

cgtccaactc caaccaaccg a 21

<210> 19 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_62_like <400> 19

cgatcattcc ctgggatg 18

<210> 20 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_62_like <400> 20

gagacgacct gatagcag 18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210> 21 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_62_like <400> 21

ccgcgacgca tcaagaactg 20

<210> 22 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_54_like <400> 22

gctgtatcat aacaagttgc 20

<210> 23 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_54_like <400> 23

cgatctgagg ctcaattc 18

<210> 24 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_54_like <400> 24

cagtcagcgt atcgtcaagc aag 23

<210> 25 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_24_like <400> 25

gtgggagaaa gatatgactt ta 22

<210> 26 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_24_like <400> 26

tcgacctgtg ttccaata 18

<210> 27 <211> 27 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Taqman probe for detection of Oxa_24_like <400> 27

tgtcagcagt tccagtatat caagagc 27

<210> 28 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_48_like <400> 28

gttggaatgc tcactttac 19

<210> 29 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_48_like <400> 29

ttcgcccgtt taagatta 18

<210> 30 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_48_like <400> 30

aatccttgct gcttattctc attcca 26

<210> 31 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_133_like <400> 31

gaacgtattg atttcggtaa 20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210> 32 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_133_like <400> 32

ctgtgtatgt gccaattg 18

<210> 33 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_133_like <400> 33

aactctacct cttgaatagg cgtgac 26

<210> 34 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_182_like <400> 34

ccacaagtag gttggttaa 19

<210> 35 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_182_like <400> 35

ccctaaattt tctaacgact ta 22

<210> 36 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_182_like <400> 36

agaaccagac attccttgct tcatt 25

<210> 37 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_98_like <400> 37

taggcgaygc tatgaaag 18

<210> 38 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_98_like <400> 38

cttgggtacc gatatctg 18

<210> 39 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_98_like <400> 39

aaccaacacg cttcacttca ttagac 26

<210> 40 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para amplificación de Oxa_60c_like <400> 40

catcgacgtt caagattcc 19

<210> 41 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_60c_like <400> 41

ctcccactgc ttgtaagg 18

<210> 42 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de Oxa_60c_like

<400> 42

aacagcctga tcgccttcga 20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210> 43 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sentido para amplificación de Oxa_60d_like <400> 43

gtgccgatat accaggag 18

<210> 44 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de Oxa_60d_like <400> 44

cttcgaatgc ggaaatctc 19

<210> 45 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de _60d_like <400> 45

ccacgcagcc agaattgatc g 21

<210> 46 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sentido para amplificación de VIM <400> 46

tccgrcttta ccagattg 18

<210> 47 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de VIM <400> 47

cacgctgtat caatcaaa 18

<210> 48 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de of VIM <400> 48

caactcatca ccatcacgga caa

<210> 49 <211>21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador sentido para amplificación de GIM <400> 49

tggagtatat cttcatacct c 21

<210> 50 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación de GIM <400> 50

cttcgtgtct tcttcaga 18

<210> 51 <211> 27 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de of GIM <400> 51

aggcttgatt attatccaga actacca

<210> 52 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sentido para amplificación de SPM <400> 52

cttcgaatgt cttagtagc 19

<210> 53 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador antisentido para amplificación SPM <400> 53

23

27

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

tcggcttcat agtcttag

18

<210> 54 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de SPM <400> 54

accgttgtca ttgtctcttc gc 22

<210> 55 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sentido para amplificación de KPC <400> 55

ttggctaaag ggaaacac 18

<210> 56 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación KPC <400> 56

cgacggcata gtcatttg 18

<210> 57 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de KPC <400> 57

catacvctcc gcaggttccg 20

<210> 58 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sentido para amplificación de SME <400> 58

gggaatgttc tcaatgcta 19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador antisentido para amplificación SME <400> 59

cacctacaac ccaatcag 18

<210> 60 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de SME <400> 60

cgagcatcac cagttgtatt acctt 25

<210> 61 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador sentido para amplificación de NMC <400> 61

acccatcaca actaaatata aag 23

<210> 62 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación NMC <400> 62

cgttcaagra taatattagt agca 24

<210> 63 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de NMC <400> 63

agcdgcagca gccatatcac 20

<210> 64 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<220>

<223> Cebador sentido para amplificación de GES_CARB <400> 64

ctctgtgagt cggctaga 18

<210> 65 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación GES_CARB <400> 65

ggcgtagttg tatctctga 19

<210> 66 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de GES_CARB <220>

<221> misc_feature <222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 66

agycggagat gancgacaac ac 22

<210> 67 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador sentido para amplificación de IMP_3_like, IMP_15_like o IMP_19_like

<400> 67

gcatctgwat taacaaatg 19

<210> 68 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador antisentido para amplificación IMP_3_like, IMP_15_like o IMP_19_like

<400> 68

ccactacgtt atctkgag 18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de IMP_3_like <400> 69

tgtggcttga accttaccgt ct 22

<210> 70 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de IMP_15_like <400> 70

agccaatagc tavctccgct 20

<210> 71 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sonda Taqman para detección de IMP_19_like <400> 71

ttaactagcc aatarctaac tccgc 25

<210> 72 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sentido para amplificación de NDM <400> 72

gcccaatatt atgcaccc 18

<210> 73 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación NDM <400> 73

gtcgccagtt tccatttg 18

<210> 74 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de NDM <400> 74

ctgagcaccg cattagccgc 20

<210> 75 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sentido para amplificación de SIM <400> 75

ggcttagtag ttcttgaca 19

<210> 76 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido para amplificación of SIM <400> 76

cttccattga cagtgaaatc 20

<210> 77 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda Taqman para detección de SIM <400> 77

atctcatcga cactccagct tcc 23

Claims

REIVINDICACIONES

1. Pareja de cebadores que consiste en SEQ ID NO: 67-SEQ ID NO: 68.
2. Kit que comprende la pareja de cebadores según la reivindicación 1, y reactivos requeridos para llevar a cabo una reacción de amplificación.
3. Kit según la reivindicación 2, que adicionalmente comprende al menos un pareja de cebadores seleccionados de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10-SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16-SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19-SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22-SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25-SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28-SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31- SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34-SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37-SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40-SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43-SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46-SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49-SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52-SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55-SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58-SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61-SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64-SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 72-SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 75-SEQ ID NO: 76.
4. Kit de acuerdo con la reivindicación 3, donde la pareja de cebadores adicional se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 28-SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 46-SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 55-SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 72- SEQ ID NO: 73.
5. Kit según las reivindicaciones 2 a 4 que además comprende al menos una sonda capaz de hibridar con el producto de amplificación de dicha pareja de cebadores.
6. Kit según la reivindicación 5, donde la al menos una sonda comprende la secuencia

a. SEQ ID NO: 3, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2,

b. SEQ ID NO: 6, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 5,

c. SEQ ID NO: 9, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 8,

d.

SEQ ID NO: 12, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO 10-SEQ ID NO 11

e.

SEQ ID NO: 15, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO 13-SEQ ID NO 14

f.

SEQ ID NO: 18, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 16-SEQ ID NO 17

g.

SEQ ID NO: 21, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO 19-SEQ ID NO : 20

h.

SEQ ID NO: 24, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 22-SEQ ID NO : 23

i.

SEQ ID NO: 27, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 25-SEQ ID NO : 26

j.

SEQ ID NO: 30, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 28-SEQ ID NO : 29

k.

SEQ ID NO: 33, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO 31-SEQ ID NO 32

l.

SEQ ID NO: 36, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 34-SEQ ID NO 35

m.

SEQ ID NO: 39, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 37-SEQ ID NO 38

n.

SEQ ID NO: 42, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 40-SEQ ID NO : 41

o.

SEQ ID NO: 45, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 43-SEQ ID NO : 44

p.

SEQ ID NO: 48, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 46-SEQ ID NO : 47

q.

SEQ ID NO: 51, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 49-SEQ ID NO 50

r.

SEQ ID NO: 54, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 52-SEQ ID NO 53

s.

SEQ ID NO: 57, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 55-SEQ ID NO 56

t.

SEQ ID NO: 60, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 58-SEQ ID NO 59

u.

SEQ ID NO: 63, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO 61-SEQ ID NO : 62

v.

SEQ ID NO: 66, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 64-SEQ ID NO : 65

w. SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 y/o SEQ ID NO: 71, para la pareja de cebadores SEQ ID NO: 67-SEQ ID NO: 68,

x. SEQ ID NO: 74, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 72-SEQ ID NO: 73, o

y. SEQ ID NO: 77, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 75-SEQ ID NO: 76.
7. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, que comprende todas las parejas de cebadores según la reivindicación 1.
8. Uso in vitro de la pareja de cebadores según la reivindicación 1 o del kit según cualquiera de las reivindicaciones 2 a

7 para la detección y/o tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas, donde las carbapenemasas se

seleccionan de la lista que consiste en:

- Carbapenemasas de la clase A, preferiblemente NMC, IMI, SME, KPC y/o GES,

- Carbapenemasas de la clase B1, preferiblemente IMP, VIM, GIM, SPM, NDM y/o SIM, y/o

- Carbapenemasas de la clase D, preferiblemente OXA tipo 23, tipo 51, tipo 58, tipo 60a, tipo 50a, tipo 55, tipo 62, tipo 54, tipo 24, tipo 48, tipo 133, tipo 182, tipo 98, tipo 60c y/o tipo 60d.
9. Uso según la reivindicación 8 de la pareja de cebadores de la reivindicación 1 o del kit según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde la pareja de cebadores SEQ ID NO: 67-SEQ ID NO: 68 se utiliza para la detección y/o tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas de la clase B1, donde las carbapenemasas se seleccionan de la lista que consiste en IMP tipo 3, IMP tipo 15 e IMP tipo 19; la pareja de cebadores SEQ ID NO: 28- SEQ ID NO: 29 se utiliza para la detección y/o tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas de la clase D, donde la carbapenemasa es OXA-48; la pareja de cebadores SEQ ID NO: 46-SEQ ID NO: 47 se utiliza para la detección y/o tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas de clase B1, donde la carbapenemasa es VIM; la pareja de cebadores SEQ ID NO: 55-SEQ ID NO: 56 se utiliza para la detección y/o tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas de clase A, donde la carbapenemasa es KPC y la pareja de cebadores SEQ ID NO: 72-SEQ ID NO: 73 se utiliza para la detección y/o tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas de clase B1, donde la carbapenemasa es NDM.
10. Un método in vitro para la detección y/o tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas en una muestra biológica aislada caracterizado porque comprende:

i. poner en contacto una muestra biológica aislada que comprende ADN con la pareja de cebadores según la reivindicación 1,
11. amplificar el ADN comprendido en dicha muestra biológica aislada con dicha pareja de cebadores, y iii. detectar la presencia del producto de amplificación obtenido en el paso (ii).
11. Método según la reivindicación 10, donde la detección del paso (iii) comprende la hibridación del producto de amplificación obtenido en el paso (ii) con al menos una sonda capaz de hibridar con el producto de amplificación de la pareja de cebadores empleada en el paso (i).
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, donde en el paso (i) se pone en contacto la muestra biológica aislada con al menos una pareja de cebadores seleccionados de la lista que consiste en SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10-SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13- SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16-SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19-SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22-SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25-SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28-SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31-SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34-SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37-SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40-SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43-SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46-SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49-SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52-SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55-SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58-SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61-SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64-SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 72-SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 75-SEQ ID NO: 76.
13. Método según la reivindicación 12, donde la pareja de cebadores adicional se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 28-SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 46-SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 55-SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 72-SEQ ID NO: 73.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, donde la sonda comprende la secuencia:

a. SEQ ID NO: 3, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2,

b. SEQ ID NO: 6, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 5,

c. SEQ ID NO: 9, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 8,

d.

SEQ ID NO: 12, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO 10-SEQ ID NO 11,

e.

SEQ ID NO: 15, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO 13-SEQ ID NO 14,

f.

SEQ ID NO: 18, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 16-SEQ ID NO 17,

g.

SEQ ID NO: 21, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO 19-SEQ ID NO : 20,

h.

SEQ ID NO: 24, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 22-SEQ ID NO : 23,

i.

SEQ ID NO: 27, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 25-SEQ ID NO : 26,

j.

SEQ ID NO: 30, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 28-SEQ ID NO : 29,

k.

SEQ ID NO: 33, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO 31-SEQ ID NO : 32,

l.

SEQ ID NO: 36, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 34-SEQ ID NO 35,

m.

SEQ ID NO: 39, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 37-SEQ ID NO 38,

n.

SEQ ID NO: 42, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 40-SEQ ID NO 41,

o.

SEQ ID NO: 45, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 43-SEQ ID NO : 44,

p.

SEQ ID NO: 48, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 46-SEQ ID NO : 47,

q.

SEQ ID NO: 51, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 49-SEQ ID NO 50,

r.

SEQ ID NO: 54, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 52-SEQ ID NO 53,

s.

SEQ ID NO: 57, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 55-SEQ ID NO : 56,

t.

SEQ ID NO: 60, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 58-SEQ ID NO 59,

u.

SEQ ID NO: 63, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO 61-SEQ ID NO : 62,

v.

SEQ ID NO: 66, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO : 64-SEQ ID NO : 65,

w.

SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 y/o SEQ ID NO: 71, para la pareja de cebadores SEQ ID NO: 67-SEQ ID NO

x. SEQ ID NO: 74, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 72-SEQ ID NO: 73, o

y. SEQ ID NO: 77, cuando la pareja de cebadores es SEQ ID NO: 75-SEQ ID NO: 76.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, donde en el paso (i) se pone en contacto la muestra biológica aislada con todas las parejas de cebadores de las reivindicaciones 1 y 12.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, donde el paso (ii) de amplificación se lleva a cabo mediante PCR.
17. Método según la reivindicación 16, donde la PCR es PCR Multiplex en tiempo real.
18. Método según la reivindicación 10, donde la muestra biológica procede de un humano.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 18, donde la muestra biológica es sangre, esputo, exudado o piel.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, que además comprende:

(iv) asignar al individuo al grupo de pacientes infectados con cepas bacterianas productoras de carbapenemasas cuando en el paso (iii) se detecta la presencia del producto de amplificación.