ES2683161T3

ES2683161T3 - Procedimientos de tratamiento de amaurosis congénita de Leber

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Publication number: ES2683161T3
Application number: ES12729421.3T
Authority: ES
Inventors: Jean-Michel Rozet; Antoine Kichler; Isabelle Perrault; Josseline Kaplan; Xavier GERARD; Daniel Scherman; Arnold Munnich
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris Descartes; Genethon; Ecole Nationale Superieure de Chimie de Paris ENSCP
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris Descartes; Genethon; Ecole Nationale Superieure de Chimie de Paris ENSCP
Priority date: 2011-06-10
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2018-09-25
Anticipated expiration: 2032-06-08
Also published as: US11492621B2; US9487782B2; US20180016579A1; US20200291402A1; US9012425B2; EP3378938A1; PL2718437T3; EP2718437B1; US10597654B2; US20170044533A1; DK2718437T3; US20140179767A1; US20150111951A1; US9777272B2; EP2718437A1; WO2012168435A1

Abstract

Un procedimiento in vitro o ex vivo para restaurar la función de CEP290 en una célula que contiene la mutación c.2991+1655 A>G presente en el gen CEP290, en el que dicho procedimiento comprende la etapa que consiste en evitar el corte y empalme del exón críptico insertado en el ARNm del CEP290 c .2991+1655 A>G mutante, en el que dicho procedimiento se lleva a cabo usando al menos un oligonucleótido antisentido que es complementario a una secuencia en el pre-ARNm del CEP290 c.2991+1655 A>G mutante que se requiere para un corte y empalme correcto de dicho exón secreto críptico diana y en el que dicha secuencia se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias exónicas que potencian el corte y empalme (ESE) de dicho exón críptico.

Description

DESCRIPCION

Procedimientos de tratamiento de amaurosis congenita de Leber 5 CAMPO DE LA INVENCION

[0001] La presente invencion se refiere al tratamiento de la amaurosis congenita de Leber. En particular, se utiliza la estrategia de la omision de exon.

10 ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0002] La amaurosis congenita de Leber (ACL, MIM204000) es una causa comun de ceguera en la infancia (10 %). Es la distrofia retiniana hereditaria mas grave, responsable de la ceguera o deficiencia visual profunda en el nacimiento o en los primeros meses de vida. En los meses siguientes, la enfermedad estara presente como una

15 enfermedad de conos y bastones considerablemente grave y estacionaria con una agudeza visual extremadamente pobre (AV < percepcion de la luz; tipo I) o una distrofia de conos y bastones progresiva, pero grave, con una agudeza visual medible en la primera decada de vida (20/200 <VA < 60/200; tipo II)2.

[0003] Hasta ahora, las alteraciones de 16 genes con patrones altamente variables de distribution tisular y 20 funciones han sido notificadas en ACL (Kaplan, J. Ophthalmic Genet. 29, 92-8 (2008); den Hollander, AI y col. Prog

Retin Eye Res. 27, 391-419 (2008).). En los palses occidentales, las mutaciones que afectan a la protelna centrosomica 290 (CEP290) son la principal causa de la enfermedad (20 %) (den Hollander, AI y col. Am J Hum Genet. 79, 556-61 (2006); Perrault, I y col. Hum Mutat. 28, 416 (2007).). Entre ellas, la mutation c.2291 + 1655 A>G representa mas del 10 % de todos los casos, por lo que este cambio supone una importante diana para la terapia. La 25 mutacion c.2291 + 1655 A>G se ubica en la parte profunda del intron 26 en el que se crea un sitio de corte y empalme donante de 5 pb aguas abajo de un fuerte sitio de corte y empalme aceptor crlptico. Como resultado, un exon crlptico de 128 pb que codifica un codon de termination se inserta en el ARNm del CEP290, entre los exones 26 y 27 (den Hollander, Al y col. Am J Hum Genet. 79, 556-61 (2006)).

30 RESUMEN DE LA INVENCION

[0004] La presente invencion se refiere a un procedimiento in vitro o ex vivo para restaurar la funcion de CEP290 en una celula que contiene la mutacion c.2991 + 1655 A>G presente en el gen CEP290, en el que dicho procedimiento comprende la etapa que consiste en prevenir el corte y empalme del exon crlptico insertado en el

35 ARNm del CEP290 c.2291 + 1655 A>G mutante, en el que dicho procedimiento se lleva a cabo usando al menos un oligonucleotido antisentido que es complementario a la secuencia en el pre-ARNm del CEP290 c.2991 + 1655 A>G mutante que se requiere para un corte y empalme correcto de dicho exon crlptico diana y en el que dicha secuencia se selecciona entre el grupo que consiste en secuencias exonicas que potencian el corte y empalme (ESE) de dicho exon crlptico.

40

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

[0005] La amaurosis congenita de Leber (ACL) es una grave distrofia retiniana hereditaria responsable de la ceguera congenita o de aparicion temprana. La mutacion causante de la enfermedad mas comun (>10 %) se ubica

45 en la parte profunda del CEP290 en el intron 26 (c.2991 + 1655 A>G), en el que se crea un sitio de corte y empalme donante fuerte y conduce a la insertion de un exon crlptico que codifica un codon de terminacion prematuro. En la presente invencion, los inventores notifican los datos que apoyan la viabilidad de una estrategia de omision de exon mediada por un oligonucleotido antisentido para corregir el corte y empalme. La invencion proporciona as! el uso de dicha estrategia de omision de exon para el tratamiento de la amaurosis congenita de Leber.

50

[0006] El termino "CEP290" tiene su significado general en la tecnica y se refiere a una protelna codificada por el gen CEP390. CEP290 es un componente integral de la puerta ciliar que une la zona de transition entre los cilios y el citoplasma. La protelna desempena un papel importante en el mantenimiento de la integridad estructural de esta puerta, y por lo tanto, tiene un papel crucial en el mantenimiento de la funcion ciliar (9. Craige, B y col. The

55 Journal of Cell Biology. 190, 927-40 (2010)). El termino puede incluir "CEP290" de origen natural y variantes y formas modificadas del mismo. El CEP290 puede proceder de cualquier fuente, pero normalmente es un CEP290 de mamlfero (por ejemplo, primate humano y no humano), en particular un CEP290 humano. Una secuencia de aminoacidos de CEP290 humano nativo a modo de ejemplo se proporciona en la base de datos GenPept con el numero de acceso [EAW97414.1] y una secuencia de acido nucleico humana nativa que codifica CEP290 a modo de

ejemplo se proporciona en la base de datos GenBank con el numero de acceso [NM_025114.3].

[0007] Un primer objeto de la presente invencion se refiere a un procedimiento in vitro o ex vivo para restaurar la funcion de CEP290 en una celula que contiene la mutacion c.2991 + 1655 A>G presente en el gen

5 CEP290, en el que dicho procedimiento comprende la etapa de prevencion de corte y empalme del exon crlptico insertado en el ARNm del CEP290 c.2291 + 1655 A>G mutante, en el que dicho procedimiento se lleva a cabo usando al menos un oligonucleotido antisentido que es complementario a la secuencia en el pre-ARNm del CEP290 c.2991 + 1655 A>G mutante que se requiere para un corte y empalme correcto de dicho exon crlptico diana y en el que dicha secuencia se selecciona entre el grupo que consiste en secuencias exonicas que potencian el corte y

10 empalme (ESE) de dicho exon crlptico.

[0008] Los expertos en la materia reconoceran que existen numerosas formas de determinar o medir un nivel de funcionalidad de una protelna, y de determinar un nivel de aumento o disminucion de la funcionalidad, por ejemplo en respuesta a un protocolo de tratamiento. Tales procedimientos incluyen, entre otros, medir o detectar una

15 actividad de la protelna, etc. Tales mediciones se realizan generalmente en comparacion con un patron o control o muestra "normal". Ademas, cuando la falta de la funcionalidad de la protelna esta implicada en un proceso de la enfermedad, los slntomas de la enfermedad pueden ser controlados y/o medidos con el fin de detectar indirectamente la presencia o ausencia de una protelna que funciona correctamente, o con el fin de medir el exito de un protocolo de tratamiento que tiene por objeto remediar la falta de funcionamiento de la protelna.

20

[0009] En particular, la funcionalidad de CEP290 puede medirse por varios procedimientos reconocidos en la tecnica. Por ejemplo, la mejora del montaje y/o mantenimiento de cilios puede determinarse como se describe en el EJEMPLO.

25 [0010] Por consiguiente, la estrategia de omision de exon como se describe anteriormente da como resultado

una mejora de los slntomas de amaurosis congenita de Leber (es decir, la restauracion de la funcion o la estabilidad de la protelna) en el intervalo de al menos aproximadamente 10 %, de manera preferente aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o incluso el 100 %, en comparacion con un caso de un paciente no tratado. Tales slntomas pueden observarse en un nivel micro (es decir, la restauracion y/o la localizacion de la

30 expresion de protelnas evaluada por inmunohistoqulmica, inmunofluorescencia, analisis de membrana Western; restauracion/mejora de la funcionalidad de la protelna evaluada por la mejora del montaje y/o mantenimiento de cilios, restauracion/mejora de la funcionalidad de conos ...) o en un nivel macro (es decir, mejora/restauracion de los slntomas cllnicos, tales como agudeza visual).

35 [0011] En general, la eliminacion del exon crlptico insertado en el ARNm del CEP290 c.2291 + 1655 A>G

mutante se lleva a cabo usando los oligonucleotidos (ONAs) antisentido.

[0012] La expresion "oligonucleotido antisentido" se refiere a una sola cadena de ADN o ARN que es complementaria a una secuencia elegida. El ARN antisentido puede ser usado para prevenir la traduccion de

40 protelnas de determinadas cadenas de ARNm mediante la union a ellos. El ADN antisentido se puede usar para dirigirse a un ARN especlfico, complementario (codificante o no codificante).

[0013] Los oligonucleotidos estan disenados para complementar secuencias adecuadas, por lo general las secuencias de ARN en la molecula pre-ARNm que son necesarias para el corte y empalme correcto del exon diana,

45 bloqueando de este modo las reacciones de corte y empalme que incorporarlan el exon diana en ARNm maduro. Un ONA se une normalmente a la secuencia que complementa e impide estericamente la reaccion de corte y empalme. Las secuencias se seleccionan de manera que sean especlficas, es decir, los ONAs son complementarios unicamente a las secuencias del pre-ARNm y no a otras secuencias de acidos nucleicos. Los ONAs usados en la practica de la invencion pueden ser de cualquier tipo adecuado, por ejemplo oligodesoxirribonucleotidos,

50 oligorribonucleotidos, morfolinos, oligonucleotidos antisentido de triciclo-ADN, ONAs mediados por U7 o U1 o productos conjugados de los mismos tales como ONAs conjugados por un peptido o complejados por nanopartlculas. Los ONAs empleados en la practica de la invencion tienen generalmente una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleotidos, y pueden tener una longitud por ejemplo, de aproximadamente 10 o menos, o aproximadamente 15, o aproximadamente 20 o aproximadamente 30 nucleotidos o

55 mas. La longitud optima de ONAs de una secuencia complementaria diana se encuentra generalmente en el intervalo de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos de longitud dependiendo de la cadena principal qulmica usada y de la secuencia diana. Normalmente, los ONAs morfolinos tienen aproximadamente una longitud de 25 nucleotidos, los ONAs basados en 2'PMO tiene una longitud de aproximadamente 20 nucleotidos, y ONAs de triciclo tienen una longitud de aproximadamente 15 nucleotidos.

[0014] En una realizacion particular, dos o incluso mas ONAs tambien pueden usarse al mismo tiempo; esto

puede ser particularmente interesante cuando el ONA se vectoriza en un casete de expresion (como por ejemplo, por casetes U7 o U1).

5 [0015] En consecuencia, un objeto adicional de la invencion se refiere a un oligonucleotido antisentido capaz

de inducir una omision de exon y restaurar la funcion de CEP290 en una celula que contiene la mutacion c.2991- 1655 A>G presente en el gen CEP290, que consiste en una secuencia complementaria a una secuencia de acido nucleico del gen CEP290 que es necesaria para el corte y empalme correcto del exon crlptico insertado en el ARNm del CEP290 c.2291 + 1655 A>G mutante, en el que dicha secuencia de acido nucleico del gen CEP290 se selecciona 10 entre el grupo que consiste en las secuencias ESE de dicho exon crlptico.

[0016] En una realizacion particular, los oligonucleotidos antisentido comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 (ESE(+90+120)) y SEQ ID NO: 2 (ESE(+50+70)). Normalmente, dichos oligonucleotidos antisentido tienen una longitud de al menos 15 nucleotidos.

15

[0017] En una realizacion mas particular, dicho oligonucleotido antisentido puede ser seleccionado entre el grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 1 (ESE(+90+120)) y SEQ ID NO: 2 (ESE(+50+70)).

[0018] Una combinacion de dichos oligonucleotidos antisentido tambien se puede usar segun la invencion 20 para un corte y empalme correcto del exon crlptico insertado en el ARNm del CEP290 c.2291 + 1655 A>G mutante.

[0019] Para su uso en la presente invencion, los ONAs de la invencion pueden ser sintetizados de novo usando cualquier serie de procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el procedimiento de b-cianoetil fosforamidita (Beaucage y col., 1981); el procedimiento del nucleosido H-fosfonato (Garegg y col., 1986; Froehler y

25 col., 1986, Garegg y col., 1986, Gaffney y col., 1988). Estas qulmicas se pueden realizar por una variedad de sintetizadores de acidos nucleicos automatizados disponibles en el mercado. Estos acidos nucleicos pueden ser referidos como acidos nucleicos sinteticos. Alternativamente, los ONAs se pueden producir a gran escala en plasmidos (vease Sambrook, y col., 1989). Los ONAs se pueden preparar a partir de secuencias de acido nucleico existentes usando tecnicas conocidas, tales como las que emplean enzimas de restriction, exonucleasas o 30 endonucleasas. Los ONAs preparados de esta manera pueden ser referidos como acidos nucleicos aislados.

[0020] Para su uso in vivo, los ONAs pueden ser estabilizados o se estabilizan. Un ONA "estabilizado" se refiere a un ONA que es relativamente resistente a la degradation in vivo (por ejemplo a traves de una exo- o endonucleasa). La estabilizacion puede ser una funcion de la longitud o estructura secundaria. Alternativamente, la

35 estabilizacion de ONA puede lograrse a traves de modificaciones de la cadena principal de fosfato. El ONA estabilizado preferente de la presente invencion tiene una cadena principal modificada, por ejemplo, tiene enlaces fosforotioato para proporcionar una actividad maxima y proteger el ONA de la degradacion por exo- y endonucleasas intracelulares. Otras posibles modificaciones de estabilizacion incluyen modificaciones de fosfodiester, combinaciones de fosfodiester y modificaciones de fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, p40 etoxi, y combinaciones de los mismos. Las versiones modificadas qulmicamente estabilizadas de ONAs tambien incluyen "morfolinos" (oligomeros morfolino fosforodiamidato, OMFs), oligomeros a base de 2’-O-met, ADNs de triciclo (tc), ARNs pequeno nuclear (pn) U7, o moleculas oligoantisentido de ADN de triciclo (solicitud de patente provisional estadounidense n.1 de serie 61/212.384 para: Tricyclo-DNA Antisense Oligonucleotides, Compositions and Methods for the Treatment of Disease, presentada el 10 de abril de 2009, cuyo contenido completo se incorpora 45 en la presente memoria por referencia).

[0021] En una realizacion particular, los oligonucleotidos antisentido de la invencion pueden ser oligonucleotidos quimera ARN/ANE a base de 2'-O-Me (Takagi M, Yagi M, Ishibashi K, Takeshima Y, Surono A, Matsuo M, Koizumi M. Design of 2’-O-Me RNA/ENA chimera oligonucleotides to induce exon skipping in dystrophin

50 pre-mRNA. Nucleic Acids Symp Ser (Oxf). 2004; (48): 297-8).

[0022] Otras formas de ONAs que pueden ser usadas para este efecto son secuencias de ONA acopladas a moleculas de ARN pequeno nuclear tal como U1 o U7 en combinacion con un procedimiento de transferencia viral basado en, pero no limitado a, lentivirus o virus adenoasociados (Denti, MA, y col., 2008; Goyenvalle, A, y col.,

55 2004).

[0023] En otra realizacion particular, los oligonucleotidos antisentido de la invencion son nucleotidos a base de 2'-O-metil-fosforotioato.

[0024] Un objeto adicional de la presente invencion se refiere a un procedimiento para tratar una amaurosis congenita de Leber en un paciente que porta la mutacion c.2991 + 1655 A>G en el gen CEP290, que comprende la etapa que consiste en administrar a dicho paciente al menos un oligonucleotido antisentido complementario a secuencias de acidos nucleicos que son necesarias para la prevencion del corte y empalme del exon crlptico

5 insertado en el ARNm del CEP290 c.2291 + 1655 A>G mutante.

[0025] En una realizacion particular, la invencion se refiere a dicho procedimiento en el que el oligonucleotido antisentido es complementario a una secuencia de acido nucleico que es necesaria para la prevencion del corte y empalme del exon crlptico insertado en el ARNm del CEP290 c.2291 + 1655 A>G mutante.

10

[0026] La invencion se refiere ademas a un oligonucleotido antisentido complementario a una secuencia de acido nucleico del gen CEP290 que es necesaria para el corte y empalme correcto del exon crlptico insertado en el ARNm del CEP290 c.2991+1655 A>G mutante, en el que dicha secuencia de acido nucleico del gen CEP290 es seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias ESE de dicho exon crlptico para su uso en un

15 procedimiento de tratamiento de una amaurosis congenita de Leber en un paciente que porta la mutacion c.2991 + 1655 A>G en el gen CEP290.

[0027] En una realizacion particular; los oligonucleotidos antisentido de la invencion se pueden administrar in vivo solo o en asociacion con un vector. En su sentido mas amplio, un "vector" es cualquier vehlculo capaz de

20 facilitar la transferencia del oligonucleotido antisentido de la invencion a las celulas. Preferentemente, el vector transporta el acido nucleico a celulas con una degradacion reducida en relacion con el grado de degradacion que resultarla en ausencia del vector. En general, los vectores utiles en la invencion incluyen, entre otros, plasmidos desnudos, sistemas de administracion no viral (electroporacion, sonoporacion, agentes de transfeccion cationicos, liposomas, etc.), fagemidos, virus, otros vehlculos derivados de fuentes virales o bacterianas que se han manipulado

25 mediante la insercion o incorporation de los oligonucleotidos antisentido complementario a secuencias de acido nucleico. Los vectores virales son un tipo preferido de vector e incluyen, entre otros, secuencias de acidos nucleicos a partir de los siguientes virus: virus de ARN tales como retrovirus (como por ejemplo virus de la leucemia murina Moloney y vectores derivados lentivirales), virus del sarcoma murino de Harvey, virus de tumor mamario murino, y virus del sarcoma de Rous; adenovirus, virus adenoasociados; virus de tipo SV40; poliomavirus; virus de Epstein-

30 Barr; virus del papiloma; virus del herpes; virus de la vacuna; virus de la polio. Uno puede emplear facilmente otros vectores no nombrados pero conocidos en la tecnica.

[0028] Los vectores virales preferidos segun la invencion incluyen adenovirus y virus adenoasociados (AAV), que son virus de ADN que ya han sido aprobados para uso humano en terapia genica. En realidad, se conocen 12

35 serotipos diferentes de AAV (AAV1 a 12), cada uno con diferentes tropismos tisulares (Wu, Z Mol Ther 2006; 14: 316-27). Los AAV recombinantes se derivan de AAV dependiente de parvovirus (Choi, VW J Virol 2005; 79: 680107). El virus adenoasociado de tipo 1 a 12 puede disenarse para ser deficiente en replication y es capaz de infectar un amplio intervalo de tipos celulares y especies (Wu, Z Mol Ther 2006; 14: 316-27). Tiene ademas ventajas tales como estabilidad en disolventes termico y lipldicos; altas frecuencias de transduction en celulas de diversos linajes,

40 incluyendo celulas hemopoyeticas; y la falta de inhibition de la superinfeccion permitiendo as! multiples series de transducciones. Ademas, las infecciones por virus adenoasociados de tipo silvestre se han seguido en cultivos tisulares durante mas de 100 pases en ausencia de presion selectiva, lo que implica que la integration genomica del virus adenoasociado es un evento relativamente estable. El virus adenoasociado tambien puede funcionar de manera extracromosomica.

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[0029] Otros vectores incluyen vectores plasmldicos. Los vectores plasmldicos se han descrito ampliamente en la tecnica y son bien conocidos por los expertos en la materia. Vease, por ejemplo Sambrook y col., 1989. En los ultimos anos, los vectores plasmldicos se han utilizado como vacunas de ADN para la administracion de genes que codifican antlgenos a las celulas in vivo. Son particularmente ventajosos para esto ya que no tienen los mismos

50 problemas de seguridad como con muchos de los vectores virales. Estos plasmidos, sin embargo, que tienen un promotor compatible con la celula huesped, pueden expresar un peptido a partir de un gen operativamente codificado en el plasmido. Algunos plasmidos usados comunmente incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40, y pBlueScript. Otros plasmidos son bien conocidos por los expertos en la materia. Adicionalmente, los plasmidos pueden ser disenados usando enzimas de restriction y reacciones de ligamiento para eliminar y anadir

55 fragmentos especlficos de ADN. Los plasmidos pueden ser administrados por una variedad de vlas parenteral, mucosal y topica. Por ejemplo, el ADN plasmldico se puede inyectar por via intramuscular, intradermica, subcutanea, o por otras vlas. Tambien se puede administrar por aerosoles o gotas intranasales, supositorio rectal y por via oral. Preferentemente, dicho ADN plasmldico se inyecta a traves de una ruta intraocular (intravltrea, subretinal, supracoroidal ...). Tambien se puede administrar en la epidermis o en una superficie mucosa usando una pistola

genica. Los plasmidos se pueden administrar en una solucion acuosa, secarse sobre partlcuias de oro o en asociacion con otro sistema de administracion de ADN incluyendo, entre otros, liposomas, dendrlmeros, cocleato y microencapsulacion.

5 [0030] En una realizacion preferida, el oligonucleotido antisentido correspondiente a una secuencia de acido

nucleico esta bajo el control de una region reguladora heterologa, por ejemplo, un promotor heterologo. El promotor tambien puede ser, por ejemplo, un promotor viral, tal como el promotor CMV o cualquier promotor sintetico.

[0031] La presente invention tambien proporciona una composition farmaceutica que contiene un 10 oligonucleotido antisentido de la invencion para el tratamiento de una amaurosis congenita de Leber en un paciente

que porta la mutation c.2991 + 1655 A>G en el gen CEP290.

[0032] Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion tambien pueden incluir un vehlculo farmaceutica o fisiologicamente aceptable, tal como solucion salina, fosfato sodico, etc. Las composiciones estaran

15 generalmente en forma de un llquido, aunque esto no siempre sera el caso. Los vehlculos, excipientes y diluyentes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arabiga, fosfatos de calcio, alginato, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, jarabe de agua, metilcelulosa, metil y propilhidroxibenzoatos, aceite mineral, etc. Las formulaciones tambien pueden incluir agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, conservantes, agentes tamponantes, etc. Los expertos 20 en la materia tambien reconoceran que los acidos nucleicos son administrados a menudo en conjunto con llpidos (por ejemplo, llpidos cationicos o llpidos neutros o mezclas de estos), frecuentemente en forma de liposomas u otros materiales micro- o nanoestructurados adecuados (por ejemplo, micelas, lipocomplejos, dendrlmeros, emulsiones, fases cubicas, etc.).

25 [0033] Normalmente, los oligonucleotidos antisentido de la invencion se pueden administrar en un vehlculo

oftalmico farmaceuticamente aceptable, de tal manera que el oligonucleotido antisentido de la invencion pueda penetrar en las regiones corneales e internas del ojo, como por ejemplo la camara anterior, la camara posterior, el cuerpo vltreo, el humor acuoso, el humor vltreo, la cornea, el iris/ciliar, el cristalino, la coroides/retina y la esclerotica. El vehlculo oftalmico farmaceuticamente aceptable puede, por ejemplo, ser una pomada, aceite vegetal o un 30 material encapsulante. Alternativamente, los oligonucleotidos antisentido de la invencion pueden ser inyectados directamente en el humor vltreo, humor acuoso, tejido(s) o celulas del cuerpo ciliar y/o los musculos extraoculares, la retina (por ejemplo, despues de un desprendimiento de retina) o incluso en el espacio supracoroideo. Los medios de electroporation o sonoporacion tambien pueden ser adecuados para la administracion de los oligonucleotidos antisentido de la invencion.

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[0034] Un experto en la materia reconocera que la cantidad de un ONA que se va a administrar sera una cantidad que es suficiente para inducir la mejora de los slntomas no deseados de enfermedades. Tal cantidad puede variar entre otras cosas dependiendo de factores tales como el sexo, edad, peso, condition flsica general, del paciente, etc., y puede determinarse sobre una base de caso por caso. La cantidad tambien puede variar segun el

40 tipo de afeccion a tratar, y los otros componentes de un protocolo de tratamiento (por ejemplo, la administracion de otros medicamentos, tales como esteroides, etc.).

[0035] Si se elige una administracion de ONAs a base de virus, las dosis adecuadas dependeran de diferentes factores, tales como la cepa viral que se emplea, la via de administracion (intramuscular, intravenosa,

45 intraarterial u otras).

[0036] Los expertos en la materia reconoceran que estos parametros son normalmente elaborados durante los ensayos cllnicos. Ademas, los expertos en la materia reconoceran que, mientras que los slntomas de la enfermedad pueden estar completamente aliviados por los tratamientos descritos en la presente memoria, esto no

50 es siempre asl. Incluso un alivio parcial o intermitente de los slntomas puede ser de gran beneficio para el receptor. Ademas, el tratamiento del paciente normalmente no es un solo evento. Mas bien, los ONAs de la invencion probablemente seran administrados en multiples ocasiones, que puede ser, dependiendo de los resultados obtenidos, varios dlas de diferencia, varias semanas de diferencia, o varios meses de diferencia, o incluso varios anos de diferencia. Esto es especialmente cierto cuando se refiere al tratamiento de la amaurosis congenita de 55 Leber ya que la enfermedad no se cura por este tratamiento, es decir, el gen que codifica la protelna aun sera defectuoso y la protelna codificada aun poseera una caracterlstica no deseada desestabilizadora tal como un sitio de reconocimiento proteolltico expuesto, a menos que se administren los ONAs de la invencion.

[0037] La invencion se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos

ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invencion. FIGURAS 5 [0038]

Figura 1 Representacion esquematica de los transcritos de CEP290 de tipo silvestre y mutante y secuencias de ONAs. Cuatro ONAs fueron disenados para dirigirse a secuencias ESE en el exon crlptico usando el programa ESEfmder 3.0 disponible en
http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/.

10

Figura 2 Efecto de la omision de exon mediada por ONA del exon CEP290 crlptico mutante en el ARN mensajero, expresion de la protelna y de cilios primarios. Todas las medidas se registraron en fibroblastos tratados (+) o sin tratar (-) derivados de biopsias cutaneas de los individuos de control (C1-C4), heterocigotos portadores no afectados (S1-S3) y/o pacientes (P1-P4). Las barras de error representan la desviacion tlpica de la media de tres experimentos 15 independientes. a) Los niveles de expresion relativa de mensajeros de c.2291 + 1655 A>G de tipo silvestre (barras lisas) y mutante (barras rayadas) se determinaron por RT-qPCR. Los resultados se normalizaron usando el software geNorm tomando como referencia los genes RPLP0 y GUSB o TBP, RPLP0 y GUSB. Los niveles de expresion basal de los mensajeros del CEP290 de tipo silvestre se redujeron notablemente en las estirpes celulares de los pacientes en comparacion con los controles. Las transfecciones con el oligonucleotido antisentido pero no con el sentido 20 complementario a ESE (+50+70) (paneles superior e inferior, respectivamente) dieron como resultado un aumento estadlsticamente significativo en la expresion del alelo de tipo silvestre en CEP290 en pacientes y heterocigotos portadores (p<0,0001). b) Correlacion entre la interferencia genica del mensajero mutante y la slntesis de la protelna de CEP290 de tipo silvestre. La expresion de las protelnas CEP290 en estirpes celulares antes (-) y despues del tratamiento (+) con el ONA complementario a ESE (+50+70) se determino por membrana Western. Las variaciones 25 relativas en concentraciones de CEP290 (panel central) se determinaron mediante un analisis por densitometrla computarizada de CEP290 y expresion de a-tubulina en cada muestra. El analisis por RT-qPCR de muestras de pacientes usadas para el analisis de membrana Western confirmo la omision eficaz de exon en todas las estirpes celulares tratadas (panel inferior). Los resultados de RT-qPCR se normalizaron por el software geNorm tomando como referencia tres genes TBP, RPLP0 y GUSB. c) Efecto de la omision de exon en la ciliogenesis. Los nucleos, 30 cilios y cuerpos basales de estirpes celulares no tratadas y fibroblastos transfectados con oligonucleotidos complementarios a ESE (+50+70) y ESE sentido (+50+70) se tineron usando DAPI (azul), anticuerpos anti-tubulina acetilada (verde) y anti-Y-tubulina (rojo), respectivamente (panel derecho). Las proporciones de los fibroblastos que presentan un cilio primario entre las celulas se calcularon mediante la numeration de al menos 200 celulas (se dan numeros individuales en cada barra; panel izquierdo). Las barras de error representan la desviacion tlpica a partir de 35 los recuentos de al menos 4 campos (media n = 9) registrados a partir de dos experimentos independientes. La omision de exon mediada por oNa del exon CEP290 crlptico mutante en los ARNs mensajeros resulto en un aumento de las proporciones de celulas que portan un cilio primario para los cuatro pacientes (estadlsticamente significativo en las estirpes celulares de 3/4 pacientes PI, P2, P3).

40 Figura 3. (a) Expresion de los transcritos de tipo silvestre y mutante (c.2991 1655 A>G) del gen CEP290 en las celulas del paciente (P2) y control (C4) despues de la transfection o no (= afeccion "sin tratar") de cinco oligonucleotidos antisentido diferentes. Los resultados de RT-qPCR se normalizaron usando el software geNorm y usando como referencia los dos siguientes genes: GUSB y RPLP0. El grafico muestra las cantidades de tipo silvestre (TS CEP290, barras negras) y mutante transcritas (CEP290 mutante, barras sombreadas). (b) Eficacia de la 45 omision de exon crlptico en los mutantes de ARN mensajero del CEP290. Todas las mediciones se realizaron en las celulas no transfectadas (-) o transfectadas (+) por oligonucleotidos antisentido HD26 (7-18) y ESE (90 120). Las celulas usadas son fibroblastos derivados de individuos sanos (C1-C4), portadores heterocigotos de no pacientes (S1-S3) e individuos con ACL (P1-P4). Las barras de error representan la desviacion tlpica de la media derivada de tres experimentos independientes. Los niveles de expresion de ARNm c.2991 1655A>G de tipo silvestre (CEP290 50 TS, barras negras) y mutante (CEP290 mutante; barras sombreadas) se determinaron mediante RT-qPCR. Los resultados se normalizaron usando un software geNorm y usando como referencia los genes RPLP0 y GUSb.

EJEMPLO 1: LA OMISION DEL EXON MEDIADA POR UN OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO PERMITE LA CORRECCION EFICAZ DEL CORTE Y EMPALME DE CEP290 ANORMAL EN AMAUROSIS CONGENITA DE 55 LEBER DEBIDO A LA MUTACION FRECUENTE C.2291+1655 A>G EN CEP290

Materiales y procedimientos: Agente de transfeccion y ONA:

[0039] El peptido de transfeccion cationica de 26 residuos de longitud LAH4-L11 se preparo mediante slntesis

en fase solida automatizada en Millipore 9050 o sintetizadores ABI 431 usando qulmica fmoc (una especie de regalo de AJ Mason y B. Bechinger). Los agentes de transfeccion Lipofectamine2000 y DOTAP se obtuvieron en 5 (Invitrogen) y (Sigma-Aldrich), respectivamente. Los oligonucleotidos a base de 2'-O-metilfosforotioato se obtuvieron en Sigma.

Cultivo celular y transfeccion de ONA:

10 [0040] Las biopsias cutaneas se obtuvieron de 4 pacientes con ACL que portan la mutacion c.2291 + 1655

A>G (3/4 de homocigotos, PI, P2, P4; 1/4 de compuestos heterocigotos con la mutacion P3 c.5850delT, p.Phel950LeuFsX14) 3 heterocigotos portadores no afectados (S1 a S3) e individuos de control (C1 a C4). Se obtuvo el consentimiento por escrito para cada individuo y la investigacion fue aprobada por el comite de revision institucional.

15

[0041] Los fibroblastos primarios se aislaron por tripsinizacion selectiva y proliferaron a 37 °C, 5 % de CO2 en medio Opti-MEM Glutamax I (Invitrogen) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (Invitrogen), 1 % de suero sustituto ultroser G (Pall Francia) y 1 % de estreptomicina/penicilina (Invitrogen). Los fibroblastos entre el pase 7 y 9 se sembraron en placas en 4x105 celulas/pocillo en placas de 6 pocillos 24 horas antes de la transfeccion. Las

20 celulas a una confluencia de 80 % se transfectaron con ONAs a base de 2'-OMePS (150 nM) en Opti-MEM usando LAH4-L1 a una relacion 1:10 (p:p) ONA:peptido. Despues de 3 horas de incubacion a 37 °C, el medio de transfeccion se reemplazo por medio de cultivo reciente.

[0042] Para la inhibicion de la degradation mediada sin sentido, se anadieron 25 pg/ml de hidrato de 25 dihidrocloruro emetina (Sigma-Aldrich) al medio durante 12 horas.

Extraccion de ARN y sfntesis de ADNc:

[0043] Veinticuatro horas despues de la transfeccion, se recuperaron las celulas transfectadas y no tratadas. 30 El ARN total se extrajo usando el Kit RNeasy Mini (Qiagen) segun el protocolo del fabricante. Todas las muestras

eran DNasa tratada por el conjunto de DNasa libre de RNasa (Qiagen). La concentration y pureza del ARN total se evaluo usando el espectrofotometro Nanodrop-8000 (NanoDrop Technologies) antes de su almacenamiento a - 80 °C. El analisis cualitativo de ARN total se realizo usando el Bioanalyzer 2220 (RNA 6000 Nano kit; Agilent) para verificar que el RIN se comprendla entre 8 y 10. La slntesis de ADNc de primera cadena se realizo a partir de 500 ng 35 de ARN total extraldo usando el kit de ADNc Verso (Thermo Fisher Scientific) con hexamero:cebadores oligo(dT) al azar a una relacion 3:1 (v:v) segun las instrucciones del fabricante. Una reaction sin RT (sin enzima) para una muestra se uso como control y tambien se analizo por qPCR.

PCR cuantitativa de transcripcion inversa (RT-qPCR):

40

[0044] Para medir el nivel de expresion de los mensajeros del CEP290, los alelos de tipo silvestre y mutante se amplificaron como fragmentos de 93 pb y 117 pb, respectivamente. Las regiones de 132 pb, 80 pb, 84 pb, 101 pb y 95 pb en el ARNm de la protelna de union a caja TATA humano (TBP, NM_003194), el ARNm de beta-2- microglobulina humano (B2M, NM_004048.2), el ARNm de beta glucuronidasa humano (GUSB, NM_000181,3), el

45 ARNm de hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 humano (HPRT1, NM_000194) y el ARNm de la gran protelna ribosomal P0 humano (RPLPO, NM_001002.3) se usaron para la normalization, respectivamente. Un fragmento de 99 pb del gen de la albumina humana (ALB, NM_000477) se uso para controlar la no contamination de los ADNc por el ADN genomico. Los cebadores fueron disenados usando el software Oligo Primer Analysis v.7 disponible en
http://oligo.net. La especificidad de los pares de cebadores con secuencias molde de PCR se comprobo contra la 50 base de datos de CNIB usando el software Primer-BLAST disponible en
www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast.

[0045] Los ADNc (5 pl de una dilution 1:25 en agua libre de nucleasa) se sometieron a amplification por PCR en tiempo real en un tampon (20 pl) que contenla Master Mix Plus qPCR de MESA BLUE para un ensayo Sybr (Eurogentec) y 300 nM de cebadores directo e inverso, en un sistema de PCR en tiempo real rapida Taqman 7900

55 HT (Applied Biosystems) en las siguientes condiciones: desnaturalizacion inicial a 95 °C durante 5 min, seguido de 50 ciclos de 15 s a 95 °C y 1 min a 65 °C. La especificidad de los productos de amplificacion se determino a partir de la fusion de analisis de la curva realizado al final de cada ensayo usando un ciclo a 95 °C durante 15 s, 65 °C durante 15 s y 95 °C durante 15 s. Los datos fueron analizados usando el software SDS 2.3 (Applied Biosystems).

[0046] Para cada muestra de ADNc, la media de los valores del ciclo de cuantificacion (Cc) se calculo a parti r de triplicados (desviacion tlpica DT < 0,5 Cc). Los niveles de expresion de CEP290 se normalizaron con el "factor de normalizacion" obtenido del software geNorm para Microsoft Excel2 que usa los genes de referencia mas estables y estimaciones de eficiencia de amplificacion calculadas para cada par de cebadores usando 4 veces curvas de

5 dilucion en serie (1:5, 1:25, 1:125, 1:625). Se usaron reacciones de transcriptasa no inversa (no RT), sin molde (NTC) y sin contamination de los ADNc por el ADN genomico (ALBh) como controles negativos en cada analisis (valores Cc NTC = no determinado, sin RT > 40 y ALBh > 40).

[0047] Los datos cuantitativos son las medias ± EEM de tres experimentos independientes y estos se 10 presentan como la relacion entre los valores de ARNm individuales. La significancia de las variaciones entre las

muestras se calculo usando la diferencia minima significativa protegida (DMSP) de Fisher segun la significancia de analisis de varianza (ensayo de ANOVA).

Analisis de membrana Western:

15

[0048] 24 h despues de la transfection, las celulas se recolectaron y se sometieron a lisis en un tampon Triton/SDS (pH 7,8 Tris-base 25 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, 15 % de glicerol, MgCl2 8 mM, 1 % de Triton y 1 % de SDS) que contiene un coctel inhibidor de la proteasa completo (Roche) en hielo durante 30 min con una mezcla repetida. El ADN liberado se fragmento durante 20 s en el homogeneizador Ultra-Turrax (Ika-Werke) y se

20 centrifugaron los lisados (15.000 g a 4 °C durante 10 min). Las concentraciones de protelna se determinaron a partir de las fracciones de detergente soluble usando el kit de ensayo de protelnas DC™ segun el protocolo del fabricante (Bio-Rad). Las protelnas (125 |jg) fueron desnaturalizadas a 90 °C durante 10 minutos en 4X de tampon de muestra de protelna premezclada (tampon de muestra XT, Biorad) y se separaron por electroforesis (50 voltios durante 30 minutos, seguido de 140 voltios durante 90 minutos a temperatura ambiente) en 3-8 % en geles de tris acetato 25 NuPAGE (Invitrogen). Las proteinas se transfirieron (100 voltios, 2 h a 4 °C) a membranas Immobilon-P PVDF (Millipore). Las membranas se bloquearon con TFS 0,5 % Tween-20/5 % de leche en polvo seca y se incubaron durante la noche a 4 °C bajo agitation con anticuerpos primarios policlonales de conejo anti-humano CEP290 (Novus Biologicals) o monoclonales de raton anti-a-tubulina (Sigma) en 1:1800 y 1:500000 diluciones, respectivamente. Las membranas se lavaron tres veces en solution de TFS 0,5 % Tween-20 (15 min) y se incubaron 30 durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios e inmunoglobulinas de burro anti-conejo y de oveja anti-raton conjugados con PRP (Amersham Ge Healthcare) en 1:10000 diluciones, respectivamente. Los reactivos de detection de membrana Western y CLP (Amersham GE Healthcare) segun las instrucciones del fabricante y la membrana se expuso a CLP Amersham Hyperfilm (Amersham GE Healthcare). La expresion relativa de la proteina CEP290 se estimo mediante densitometria usando a-tubulina como referencia en una G:Caja a partir 35 de Syngene con los software GeneSnap y GeneTool.

Citometrfa de flujo:

[0049] ONA sentido complementario a ESE (+50+70)) y antisentido complementario a ESE (+50+70) que 40 lleva un grupo fluoresceina en el extremo 3' se obtuvieron de Sigma. Los fibroblastos se transtectaron como se

describio anteriormente. Despues de 3 h de incubation, las celulas se tripsinizaron, se lavaron dos veces en TFS, y se mantuvieron en TFS que contenia 3 % de suero. Las celulas se analizaron en un citometro de flujo Facscalibur (Becton Dickinson, Grenoble, Francia) usando el software CELLQuest. Los porcentajes de celulas fluorescentes se calcularon a partir de 20.000 celulas morfologicamente intactas.

45

Microscopia de inmunofluorescencia:

[0050] Los fibroblastos se sembraron en 2,5 x 105 celulas/pocillo en cubreobjetos de vidrio en placas de 12 pocillos 24 horas antes de la transfeccion con los ONAs sentido complementarios a ESE (+50+70) y ESE (+50+70),

50 en las condiciones descritas anteriormente. Diez horas despues de la transfeccion, las celulas se lavaron con TFS y se incubaron 30 h en medio libre de suero (37 °C, 5 % de CO2). Los fibroblastos no tratados fueron procesados en las mismas condiciones. Posteriormente, las celulas se fijaron en metanol enfriado con hielo (5 minutos a -20 °C) y se lavaron dos veces en TFS. Las celulas se permeabilizaron en TFS suplementado con 3 % de ASB y 0,1 % de Triton durante 1 hora a temperatura ambiente antes de ser incubadas durante la noche a 4 °C en tampon de 55 permeabilizacion que contiene (anticuerpos primarios de conejo anti-y-tubulina (1:1.000), monoclonales de raton anti-acetilado tubulina (1:1000); Sigma-Aldrich). Despues de tres lavados con TFS, las celulas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en tampon de permeabilizacion que contiene anticuerpos secundarios (IgG de cabra anti-conejo conjugada con Alexa-Fluor 594 y Alexa-Fluor 488 (1:1000) e IgG de cabra anti-raton (1:1000); Molecular Probes), seguido de tres lavados con TFS. Un medio de montaje que contiene DAPI (DAPI Fluoromount G;

SouthernBiotech) se uso para los nucleos del marcador. Las imageries por inmunofluorescencia se obtuvieron usando un microscopio Leica DM IRBE y una camara 3.3 RTV MicroPublisher (Q-Imaging). Las imagenes finales se generaron usando la version 7.2.3 de Cartograph (Microvision Instruments) e ImageJ (National Institutes of Health). El porcentaje de celulas ciliadas se calculo a partir de dos experimentos independientes (n > 300 celulas para cada 5 estirpe celular). La significancia de variaciones entre las muestras se calculo usando DMSP de Fisher segun la significancia del ensayo de ANOVA.

Resultados

10 [0051] La amaurosis congenita de Leber (ACL, MIM204000) es una causa comun de ceguera en la infancia

(10 %)1. Es la distrofia retiniana hereditaria mas grave, responsable de la ceguera o deficiencia visual profunda en el nacimiento o en los primeros meses de vida. En los meses siguientes, la enfermedad, se presentara como una enfermedad de conos y bastones considerablemente grave y estacionaria con una agudeza visual extremadamente pobre (AV < percepcion de la luz; tipo I) o una distrofia de conos y bastones progresiva, pero grave, con una 15 agudeza visual medible en la primera decada de vida (20/200 <VA < 60/200; tipo II)2.

[0052] Hasta ahora, las alteraciones de 16 genes con patrones altamente variables de distribution tisular y funciones han sido notificadas en ACL13. En los palses occidentales, las mutaciones que afectan a la protelna centrosomica 290 (CEP290) son la principal causa de la enfermedad (20 %)45. Entre ellas, la mutation c.2291 + 1655

20 A>G representa mas del 10 % de todos los casos, por lo que este cambio supone una importante diana para la terapia.

[0053] La mutacion c.2291 + 1655 A>G se ubica en la parte profunda del intron 26 en el que se crea un sitio de corte y empalme donante de 5 pb aguas abajo de un fuerte sitio de corte y empalme aceptor crlptico (Fig. 1). Como

25 resultado, un exon crlptico de 128 pb que codifica un codon de termination se inserta en el ARNm del CEP290, entre los exones 26 y 274. Teniendo en cuenta el gran potencial de omision del exon como una terapia para derivar las lesiones genicas por truncamiento de protelnas6,7, se evaluo la posibilidad de usar oligonucleotidos antisentido (ONA) para ocultar el sitio de corte y empalme donador crlptico creado por la mutacion c.2291 + 1655 A>G de la maquinaria de corte y empalme, y corregir el corte y empalme anormal en las estirpes celulares de los pacientes 30 portadores.

[0054] Los fibroblastos se derivaron de biopsias cutaneas de los controles (C1-C4), heterocigotos portadores no afectados (S1-S3) y homocigotos (PI, P2 y P4) o pacientes heterocigotos compuestos (P3).

35 [0055] La eficacia de la estrategia de omision se evaluo despues de la optimization de las secuencias de

ONA modificadas con 2'O-metil fosforotioato (Fig. 1) y concentraciones, condiciones de transfection y tiempo de tratamiento (no mostrados). Los niveles de expresion de ARNms del CEP290 de tipo silvestre y mutante se midieron mediante PCR cuantitativa de transcription inversa (RT-qPCR) en fibroblastos sin tratar y celulas transfectadas con un ONA disenado para dirigirse a secuencias exonicas que potencian el corte y empalme (ESE) (ESE(+50+70)) o 40 una version sentido (ESE sentido (+50+70)).

[0056] Los fibroblastos del paciente no tratado expresaron niveles significativamente reducidos del alelo de CEP290 de tipo silvestre en comparacion con los controles y heterocigotos portadores (Fig. 2a). Cuando las celulas se transfectaron con el ONA complementario a ESE (+50+70), los pacientes, portadores no afectados y los controles

45 de fibroblastos expresaron los mensajeros de tipo silvestre a niveles equivalentes, lo que sugiere la omision altamente eficiente del exon crlptico mutante (Fig. 2a). El aumento de la expresion del alelo de tipo silvestre fue sorprendentemente mayor que la disminucion en la expresion del alelo mutante. Estos datos sugirieron la degradation de los mensajeros mutantes a traves de procesos de control de calidad de ARNm celular, en particular, la degradacion mediada por secuencias sin sentido (DMS). El aumento significativo de los niveles de ARNm 50 mutante, pero no de los niveles de tipo silvestre en los fibroblastos de un paciente homocigoto (P1) tratado con DMS con el inhibidor de emetina8 mostro un fuerte apoyo a esta hipotesis.

[0057] El corte y empalme se mantuvo sin cambios cuando las estirpes celulares fueron tratadas con el oligonucleotido sentido (Fig. 2a). Para cerciorarse de que la ausencia de efecto de la version sentido de ONA en el

55 corte y empalme de CEP290 no era debido a una eficiencia de administration reducida, la estirpe celular del paciente P1 se transfecto usando ONAs sentido y antisentido complementarios a ESE marcados con fluorescencia (+50+70), respectivamente. La evidencia de la eficacia de transfeccion similar con ambos ONA mostro un fuerte apoyo a la omision dependiente del exon crlptico CEP290. A este respecto, cabe destacar que se alcanzaron niveles similares de omision cuando las estirpes celulares se trataron con ONAs antisentido disenados para dirigirse a un

sitio SECE predicho aguas abajo de la secuencia 50+70+ (ESE (+90+120)) (Fig. 1). Estos datos indican que diferentes ONAs pueden permitir la omision eficaz del exon crlptico insertado en ARNm del CEP290 c.2291 + 1655 A>G mutante.

5 [0058] Se identificaron otros tres ONA (Tabla 1) que son capaces de inducir la omision del exon.

Tabla 1. Secuencia de los oligonucleotidos a base de 2'OMe-PS

ONA: Secuencia

H26D (+10-11): 5' - gguaugagauacucacaauuac - 3 (SEQ ID NO:5)

H26D (+19-11): 5'- gguaugagauacucacaauuacaacuggggc -3' (SED ID NO:6)

H26D (+7-18): 5'- gggauagguaugagauacucacaau -3 (SEQ ID NO :4)

[0059] Para determinar si la omision de exon inducida por ONA en los fibroblastos de los pacientes influyo en

10 los niveles de protelna CEP290, se realizo un analisis de membrana Western usando un anticuerpo policlonal que reconoce el extremo C-terminal de la protelna CEP290. Los niveles elevados de la protelna CEP290 de tipo silvestre se evidenciaron cuando las estirpes celulares de los pacientes y portadores no afectados se trataron con el oligonucleotido antisentido pero no con la version sentido.

15 [0060] CEP290 es un componente integral de la puerta ciliar que une la zona de transicion entre los cilios y el

citoplasma. La protelna desempena un papel importante en el mantenimiento de la integridad estructural de esta puerta, y por lo tanto tiene un papel crucial en el mantenimiento de la funcion ciliar9. Se notifico anteriormente que las celulas epiteliales nasales de pacientes con ACL que portan mutaciones de CEP290, incluyendo el cambio c.2991 + 1655 A>G, presentan cilios cortos y anomallas axonemales heterogeneas indicativos de un defecto en el 20 montaje o mantenimiento de cilios10. Aqul, se muestra que despues de la inanicion por suero, la expresion de cilios primarios se reduce significativamente en los fibroblastos de pacientes con ACL que portan el cambio c.2991 + 1655 A>G en comparacion con las estirpes celulares de control (mediaP1-P4 = 48,6 % ± 6,5 % frente a media C1, c3 = 83,6 % ± 3,2 %; p = 0,0097; Figura 2c).

25 [0061] Curiosamente, tras la transfeccion con el ONA complementario a ESE(+50+70) pero no el

oligonucleotido sentido complementario a ESE(+50+70), la proporcion de celulas ciliadas de pacientes aumento significativamente, alcanzando niveles similares a los controles: mediaP1-P4+ESE (+50+70) = 75,3 % ± 3,5 % vs media P1-P4+ESEsentido (+50+70) = 58,75 % ± 8,77 %, p <0,01; media p1-p4+ese (+50+70) vs media c1,c3+ese (+50+70) = 78,3 % ± 3,4 %; p = 0,624 (Fig. 2c). Esto sugiere que la omision de exon mediada por ONA resulto en una mejora significativa 30 de montaje y/o mantenimiento de cilios.

[0062] Las mutaciones de CEP290 son la causa mas comun de ACL, sin embargo, no existe un tratamiento curativo. Nuestros resultados actuales muestran el potencial terapeutico de la omision de exon para el tratamiento de la mutacion c.2291+1655 A>G que representa solo el 10 % de todos los casos de ACL.

35

REFERENCIAS

[0063] A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la tecnica a la que pertenece esta invencion.

40

LISTADO DE SECUENCIAS <110> INSERM GENETHON

45 <120> PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO DE AMAUROSIS CONGENITA DE LEBER

<130> 09533

<160> 6 50

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211> 31

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<212> ARN <213> Artificial

<220>

<223> ONA complementario a ESE (+90+120)

<400> 1

cuggggccag gugcgguggc ucacaucugu a 31

<210>2 <211>21 <212> ARN <213> Artificial

<220>

<223> ONA complementario a ESE (+50+70)

<400> 2

ccgaggcggg uggaucacga g 21

<210>3 <211>21 <212> ARN <213> Artificial

<220>

<223> ONA sentido complementario a ESE (+50+70) <400> 3

cucgugaucc acccgccucg g 21

<210>4 <211> 24 <212> ARN <213> Artificial

<220>

<223> ONA H26D(+7-18)

<400> 4

ggauagguau gagauacuca caau 24

<210>5 <211> 22 <212> ARN <213> Artificial

<220>

<223> ONA H26D(+10-11)

<400> 5

gguaugagau acucacaauu ac22

<210>6 <211>31 <212> ARN <213> Artificial

<220>

<223> ONA H26D(+19-11)

<400>6

5 gguaugagau acucacaauu acaacugggg c 31

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro o ex vivo para restaurar la funcion de CEP290 en una celula que contiene la mutacion c.2991+1655 A>G presente en el gen CEP290, en el que dicho procedimiento comprende la etapa que

5 consiste en evitar el corte y empalme del exon crlptico insertado en el ARNm del CEP290 c .2991 + 1655 A>G mutante, en el que dicho procedimiento se lleva a cabo usando al menos un oligonucleotido antisentido que es complementario a una secuencia en el pre-ARNm del CEP290 c.2991 + 1655 A>G mutante que se requiere para un corte y empalme correcto de dicho exon secreto crlptico diana y en el que dicha secuencia se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias exonicas que potencian el corte y empalme (ESE) de dicho exon crlptico.

10
2. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicho al menos oligonucleotido antisentido comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

15 3. El procedimiento segun la reivindicacion 2, en el que dicho oligonucleotido antisentido se selecciona

entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
4. Un oligonucleotido antisentido capaz de inducir una omision del exon y restaurar la funcion de CEP290

en una celula que contiene la mutacion c.2991 + 1655 A>G presente en el gen CEP290, que consiste en una 20 secuencia complementaria de una secuencia de acido nucleico del gen CEP290 eso es necesaria para el corte y empalme correcto del exon crlptico insertado en el ARNm del CEP290 c.2991 + 1655 A>G mutante, en el que dicha secuencia de acido nucleico del gen CEP290 se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias ESE de dicho exon crlptico.

25 5. El oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 4 que comprende una secuencia de acido

nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
6. El oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 4 o 5 que consiste en una secuencia de acido nucleico que se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias sEq ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

30
7. El oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 4 o 5, en el que dicho oligonucleotido antisentido posee una longitud comprendida entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50 nucleotidos.
8. Un oligonucleotido antisentido que consiste en una secuencia complementaria a una secuencia de 35 acido nucleico del gen CEP290 que es necesaria para el corte y empalme correcto del exon crlptico insertado en el

ARNm del CEP290 c.2991+1655 A>G mutante, en el que dicha secuencia de acido nucleico del gen CEP290 se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias ESE de dicho exon crlptico, para su uso para restaurar la funcion de CEP290 en una celula que contiene la mutacion c.2991 + 1655 A>G presente en el gen CEP290 en un paciente portador de dicha mutacion.

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9. El oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 8 para su uso segun la reivindicacion 8, en el que dicha celula que contiene la mutacion c.2991 + 1655 A>G presente en el gen CEP290 es una celula retiniana.
10. Un oligonucleotido antisentido complementario a una secuencia de acido nucleico del gen CEP290 45 que es necesaria para el corte y empalme correcto del exon crlptico insertado en el ARNm del CEP290 c.2991 + 1655

A>G mutante, en el que dicha secuencia de acido nucleico del gen CEP290 se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias ESE de dicho exon crlptico, para su uso en un procedimiento de tratamiento de una amaurosis congenita de Leber en un paciente portador de la mutacion c.2991 + 1655 A>G en el gen CEP290.

50 11. El oligonucleotido antisentido para el uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el

que dicho oligonucleotido antisentido es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
12. El oligonucleotido antisentido segun las reivindicaciones 8 a 11 para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 mediante una inyeccion intravltrea de dicho oligonucleotido antisentido.

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13. Una composicion farmaceutica que comprende al menos un oligonucleotido antisentido segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.