ES2683038T3 - Calmangafodipir, una nueva entidad química, y otros complejos metálicos mixtos, métodos de preparación, composiciones y métodos de tratamiento - Google Patents

Abstract

Un complejo metálico mixto de un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo, en donde los metales mezclados comprenden calcio y manganeso, en donde la relación molar de calcio a manganeso es 1-10: **(Ver fórmula)** En donde X representa CH o N, Cada R1 representa independientemente -CH2COR5; R5 representa hidroxi; Cada R2 representa independientemente ZYR6 en donde Z representa un enlace o un grupo seleccionado de CH2, (CH2)2, CO, CH2CO, CH2CH2CO y CH2COCH2; Y representa un enlace; R6 es un grupo alquilo mono- o poli(hidroxi o alcoxilado) o de la fórmula OP(O)(OR8)R7; R7 es hidroxi, o un grupo alquilo o aminoalquilo no sustituido; R8 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente hidroxilado, opcionalmente alcoxilado; R3 representa etileno; y Cada R4 representa independientemente hidrógeno o alquilo C1-3.

Description

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DESCRIPCION

Calmangafodipir, una nueva entidad qmmica, y otros complejos metalicos mixtos, metodos de preparacion, composiciones y metodos de tratamiento

Campo de la invencion

La presente invencion esta dirigida a un complejo metalico mixto de un compuesto de dipiridoxilo, por ejemplo, acido N,N'-bis-(piridoxal-5-fosfato)-etilendiamina-N,N'-diacetico (DPDP o fodipir) u otros compuestos de Formula I (en adelante derivados de PiridoxiL EtilDiamina o derivados de PLED), en donde los metales mezclados comprenden un metal de transicion del Grupo III-XU y un metal del Grupo II. En realizaciones espedficas, el complejo metalico mixto es un complejo de calcio y manganeso. La presente invencion esta dirigida tambien a composiciones que contienen dicho complejo metalico mixto, metodos para preparar dicho complejo metalico mixto, por ejemplo, en una cristalizacion de etapa unica. Se describen metodos de tratamiento que emplean dicho complejo metalico mixto. Dichos metodos de tratamiento incluyen metodos que emplean de forma convencional complejos de manganeso- DPDP por el efecto terapeutico. En una realizacion espedfica, las composiciones pueden usarse en el tratamiento de procesos patologicos provocados por la presencia de radicales libres derivados de oxfgeno en el cuerpo, es decir, estres oxidativo. Los complejos metalicos mixtos, y particularmente el complejo mixto de calcio-manganeso calmangafodipir descrito en esta memoria, constituyen nuevas entidades qmmicas.

Antecedentes de la invencion

El estres oxidativo empieza con la generacion de especies de oxfgeno reactivo (EOR) y especies de nitrogeno reactivo (ENR) como una parte de la funcion celular normal. Hay multiples fuentes celulares de generacion de EOR aunque las mas significativas son los complejos I y III de transporte de electrones de la mitocondria, las enzimas P450 en el retfculo endoplasmatico, y NADPH oxidasa unida a la membrana. La produccion de EOR por cada una de estas fuentes puede estimularse mediante citoquinas, inflamacion, protemas vmcas y otros mecanismos, como farmacos para quimioterapia, isquemia-reperfusion y sobrecarga de hierro y cobre. De forma importante, estos procesos generan inicialmente el radical libre superoxido (•O2') que se reduce secuencialmente para formar peroxido de hidrogeno, radical hidroxilo y en ultima instancia, agua. Bajo condiciones de alto estres oxidativo y por consiguiente alta produccion de superoxido, estos intermedios reactivos, sin embargo, interactuan facilmente con otras moleculas para formar EOR nocivo secundario, tales como productos de peroxidacion de lfpidos y peroxinitrito (Singal et al., Liver Int. 2011; 31:1432-1448). Esto indica la importancia de mantener la cantidad celular de superoxido bajo un estrecho control. Bajo condiciones normales esto se consigue mediante las superoxido dismutasas (SODs). Aunque las SODs tienen la velocidad de reaccion mas rapida de las enzimas conocidas, bajo condiciones de alto estres oxidativo, estas enzimas puede ser superadas e incluso inactivadas de forma irreversible por EOR y ENR. Esto a su vez, abre el uso terapeutico de farmacos de bajo peso molecular que mimetizan las enzimas SOD, es decir, los denominados mimeticos de SOD, para combatir el estres oxidativo patologico.

Se ha sabido desde hace mucho que los radicales libres derivados de oxfgeno de vida corta pero altamente reactivos participan en el dano tisular patologico, especialmente durante el tratamiento con citotoxicos/citostaticos y radioterapia en pacientes de cancer (Towart et al., Arch Pharmacol 1998; 358 (Supl. 2):R626, Laurent et al., Cancer Res 2005; 65:948-956, Karlsson et al., Cancer Res 2006; 66:598, Alexandre et al., J Natl Cancer Inst 2006; 98:236-244, Doroshow, J Natl Cancer Inst 2006; 98:223-225, Citrin et al, Oncologist, 2010; 15:360-371, Kurz et al., Transl Oncol 2012; 5:252-259), fallo hepatico inducido por acetaminofeno (Bedda et al., J Hepatol 2003; 39:765-772; Karlsson, J Hepatol 2004; 40:872-873), en enfermedad cardiaca isquemica (Cuzzocrea et al., Pharmacol Rev 2001; 53:135-159) y en varias enfermedades neurodegenerativas, que incluyen enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica (ELA), enfermedad de Parkinson, y esclerosis multiple (Knight, Ann Clin Lab Sci. 1997; 27:11-25). La sobreproduccion de radicales libres derivados de oxfgeno tambien esta implicada en procesos patologicos de sobrecarga de hierro (Rachmilewitz et al., Ann NY Acad Sci. 2005; 1054:118-23), por ejemplo, en la talasemia, anemia de celulas falciformes y hemosiderosis transfusional. Los radicales libres derivados de oxfgeno tambien estan implicados en la cirrosis hepatica inducida por hepatitis (Farrell et al., Anat Rec 2008; 291:684-692) y en la perdida de ofdo inducida por el ruido (Wong et al., Hear Res 2010; 260:81-88).

El uso de agentes quelantes basados en dipiridoxilo y sus quelatos metalicos y ciertos compuestos que contienen manganeso, en particular quelatos de manganeso, se conoce en medicina. Veanse los documentos EP 0910360, US 6147094, EP 0936915, US 6258828, EP 1054670, US 6310051, EP 1060174 y US 6391895, por ejemplo, que describen que ciertos agentes quelantes, en particular agentes quelantes de dipiridoxilo, y sus quelatos metalicos, son efectivos en el tratamiento o prevencion de cardiotoxicidad inducida por antraciclina, toxicidad inducida por radiacion, lesiones inducidas por isquemia-reperfusion, y fallo hepatico inducido por paracetamol (acetaminofeno), o desde un punto de vista mas general, cada proceso patologico provocado por la presencia de radicales libres derivados del oxfgeno, es decir, estres oxidativo, en seres humanos y animales. Ademas, se ha encontrado que el compuesto de dipiridoxilo mangafodipir (MnDPDP) ademas y sorprendentemente posee efectos citotoxicos contra las celulas cancengenas (documento EP 16944338). Sin embargo, como se describe en el documento WO 2009/078794 Aland en Kurz et al., 2012, esta es una propiedad inherente del fodipir (DPDP) solo o su contrapartes desfosforiladas, DPMP y PLED, y no del complejo metalico MnDPDP o sus contrapartes desfosforiladas, MnDPMP y MnPLED.

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Uno de los derivados de MnPLED, espedficamente el manganeso acido N,N'-bis-(piridoxal-5-fosfato)-etilendiamina- N,N'-diacetico (Manganeso DiPiridoxil DiFosfato; MnDPDP), tambien conocido como mangafodipir, esta aprobado para usar como un agente de contraste de IRM diagnostico en seres humanos. Eriksen, documento US 2009/0155184 A1, tambien describe el uso de complejos de manganeso para IRM, especialmente para la deteccion temprana de isquemia de miocardio. Se ejemplifica TeslascanTM, un producto comercial de MnDPDP, mientras que tambien se describen otros ligandos, que incluyen PLED, DT-PABMA, EDTABMA, TPP y HPTA, y sales de calcio de complejos de manganeso con varios de estos ligandos. De forma interesante, tambien se ha mostrado que mangafodipir protege a los ratones frente a serios efectos secundarios de varios farmacos citotoxicos/citostaticos (doxorubicina, oxaliplatina, 5-fluorouracilo y paclitaxel), sin interferir de forma negativa con los efectos anti-cancengenos de estos farmacos (Towart et al., 1998, Laurent et al., 2005, Karlsson et al., 2006, Alexandre et al., 2006, Doroshow, 2006, Kurz et al., 2012). El mangafodipir se ha probado en un paciente de cancer de colon que atravesaba un tratamiento paliativo con una combinacion de folinato, 5-fluorouracilo y oxaliplatina (Yri et al., Acta Oncol. 2009; 48:633-635). Los datos preclmicos y los resultados de este unico paciente fueron tan prometedores que ha comenzado el ensayo clmico en pacientes de cancer. Cuando se llega al efecto secundario mas problematico de la oxaliplatina, espedficamente la neurotoxicidad sensorial inducida por oxaliplatina, no existen datos preclmicos, hasta donde se sabe, que muestren efectos protectores del mangafodipir (Karlsson et al, Transl Oncol. 2012; 5:32-38). Yri et al., 2009, describio que el paciente recibio 15 dosis completas de “Nordic FLOX”. En 14 de los ciclos, el paciente recibio pretratamiento con mangafodipir. El paciente recibio una dosis acumulada de 1275 mg/m2 de oxaliplatina, que es una dosis probable para dar smtomas neurotoxicos. No se detectaron smtomas neurotoxicos, excepto durante el quinto ciclo cuando el mangafodipir se abandono deliberadamente y el paciente experimento neuropatfa sensorial periferica. Esto sugiere que el mangafodipir puede proteger frente a la neurotoxicidad periferica. Despues de cinco ciclos, el estado de rendimiento para el paciente se mejoro drasticamente, y la demanda de analgesicos se redujo significativamente. La neutropenia no se dio durante ninguno de los ciclos de quimioterapia.

Un primer estudio de viabilidad (MANFOL I) se ha completado y se han presentado resultados positivos, que incluyen efectos mieloprotectores, a la Agencia Medica Sueca y se han publicado (Karlsson et al., 2012).

Tambien se ha descrito que el mangafodipir protege a los ratones contra el fallo hepatico agudo inducido por acetaminofeno en ratones (FHA) (Bedda et al., 2003; Karlsson, 2004). El FHA se caracteriza por la masiva muerte celular de hepatocitos, un proceso provocado por la disminucion de glutation, radicales libres derivados de oxfgeno y el dano mitocondrial.

El mangafodipir es un pro-farmaco en el sentido de que probablemente tiene que metabolizarse en acido N,N'- dipiridoxil-etilendiamina-N,N'-diacetico (MnPLED) antes de que pueda ejercer los efectos citoprotectores durante las condiciones in vivo (por ejemplo, vease Karlsson et al., Acta Radiol 2001; 42:540-547; Kurz et al., 2012). El manganeso es un metal esencial ademas de potencialmente neurotoxico. Se ha sabido durante muchos anos que bajo condiciones de exposicion cronica a altos niveles de manganeso, un smdrome de disfuncion extrapiramidal similar al smdrome de Parkinson, aunque clmicamente una diferente entidad de enfermedad, se da frecuentemente (vease Scheuhammer y Cherian, Arch Environm Contam Toxicol 1982; 11:515-520). Cuando una dosis de formacion de imagenes de rM diagnostica de mangafodipir se inyecta de forma intravenosa en seres humanos, aproximadamente el 80% del manganeso administrado se libera (Toft et al., Acta Radiol 1997; 38:677-689). La liberacion de manganeso paramagnetico es de hecho un prerrequisito para las propiedades de formacion de imagenes de RM diagnostica del mangafodipir (Wendland, NMR Biomed 2004; 17:581-594). Elizondo et al., 1991 (Radiology 1991; 178:73-78) afirmo que el resto fodipir se une al receptor de piridoxil 5' fosfato en los hepatocitos y asegura una alta concentracion intracelular de mangafodipir en el Idgado. Esta hipotesis se sugirio tambien recientemente en un artmulo por Coriat et al., (PLoS One 2011; 6:1-6, e27005). Esta es una bonita hipotesis pero desafortunadamente una no probada y muy improbable, que paso de moda poco despues de que se hubiera presentado. Cuando el mangafodipir se inyecta de forma intravenosa (i.v.) aproximadamente el 80% del complejo metalico se desecha (Toft et al., Radiol 1997), y a cada dosis de Mn equimolar, el MnCh tiene una eficacia de contraste de formacion de imagenes de RM del Idgado igual o mejor que el mangafodipir (Southon et al., Acta Radiol 1997). Ademas, despues de la inyeccion de mangafodipir casi todo el fodipir se recupera en la orina (la parte principal de el como PLED), mientras que la mayona de manganeso se recupera en las heces (Hustvedt et al., Acta Radiol 1997; 38:690-699). Por otro lado, los efectos terapeuticos del mangafodipir (MnDPDP) y sus contrapartes desfosforiladas MnDPMP (N,N'-dipiridoxiletilendiamina-N,N'-diacetato-5- fosfato) y MnPLED dependen del complejo metalico intacto (Brurok et al., Biochem Biophys Res Commun. 1999; 254:768-721, Karlsson et al 2001; 42:540-547).

Los derivados de PLED imitan a la enzima mitocondrial manganeso superoxido dismutasa (MnSOD) (Brurok et al., 1999). La MnSOD protege a la celula de los mairnferos del radical superoxido, un subproducto del metabolismo del oxfgeno, que se produce en cantidades mas o menos altas durante las condiciones aerobicas normales; los mamfferos no sobreviven sin una MnSOD funcional. La MnSOD tiene el numero de reemplazo mas rapido (velocidad de reaccion con su sustrato) de cualquier enzima conocida (>109 M'1 s_1) (Fridovich, J Exp Biol. 1998; 201:1203-1209). Los mimeticos de MnSOD de bajo peso molecular pueden tener velocidades de reemplazo cercanas a las de la MnSOD nativa (Cuzzocrea et al., 2001). De forma interesante, los tampones fisiologicos que contienen metales de transicion como manganeso pueden tener numeros de reemplazo altos similares (Culotta et al., Biochim Biophys Acta. 2006; 1763:747-758). Sin embargo, la importancia de las enzimas SOD nativas es coherente con un proceso de seleccion que favorece a los organismos que elaboran un medio para localizar el catalizador de metal de transicion para la

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dismutacion del superoxido a partes de la celula donde hay una alta necesidad de dicha dismutacion, por ejemplo, mitocondria. Ademas, los resultados de la isquemia de miocardio-reperfusion en cerdos anestesiados muestran de forma inevitable que el MnPLED intacto, aunque no el manganeso per se, protege frente al estres oxidativo, visto como la reduccion en el tamano del infarto (Karlsson et al., 2001). La inactivacion efectiva del superoxido es esencial en la prevencion de la generacion de radicales hidroxilo y peroxinitrito muy devastadores (Cuzzocrea et al., 2001). Durante el estres oxidativo patologico, la formacion de radicales superoxido a menudo excede la capacidad endogena para la inactivacion. Ademas, el superoxido estimula la produccion de peroxinitrito que nitra la MnSOD endogena. Esta protema se nitra mediante el peroxinitrito en Tyr-34 (Radi, Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101:4003-4008). Una vez nitrada, la MnSOD pierde su actividad enzimatica, un suceso que favorece la acumulacion de superoxido y el dano conducido por el superoxido (Muscoli et al., Br J Pharmacol 2003; 140:445-460).

Recientes resultados indican que la inactivacion de MnSOD por nitracion es un suceso temprano en la toxicidad hepatica inducida por paracetamol (Agarwal et al., J Pharmacol Exp Ther 2011; 337:110-116). Los viejos resultados, ademas, indican que la nitracion y la inactivacion de MnSOD estan implicadas en el rechazo cronico de rinones trasplantados en seres humanos (MacMillan-Crow et al., Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:11853-11858. Tambien puede ser relevante anotar que la actina, que puede constituir el 5% o mas de la protema celular, esta fuertemente nitrada en la anemia de celulas falciformes y que la extension de la nitracion observada es suficiente para inducir la polimerizacion citoesqueletica (Radi, 2004). Los niveles circulantes de 3-nitrotirosina pueden ademas servir como un biomarcador para evaluar los riesgos de aterosclerosis. Es mas, ademas de la aterosclerosis, se cree que el peroxinitrito y la 3-nitrotirosina estan implicadas en la isquemia de miocardio, pulmon septico y distresado, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis lateral amiotrofica (Beckman et al., Am J Physiol 1996; 271:C1424-C1437) y diabetes (Fonstermann et al, Br J Pharmacol. 2011; 164:213-223).

Los mecanismos de defensa antioxidante danados, que incluyen la actividad SOD reducida, y una produccion aumentada posteriormente de peroxinitrito, pueden ser un factor importante en la patogenesis de la esteatohepatitis no alcoholica (EHNA) (Koruk et al., Ann Clin Lab Sci. 2004; 34:57-62). Una asociacion epidemiologica y clmica principal entre las infecciones vmcas de hepatitis B o hepatitis C y el desarrollo de hepatitis cronica y la aparicion de carcinoma hepatocelular es evidente. De forma interesante, la nitracion de tirosina inducida por peroxinitrito se aumenta notablemente en pacientes con hepatitis vmca cronica (Garda-Monzon et al., J Hepatol. 2000; 32:331-338). Actualmente, el mecanismo citado generalmente de desarrollo de patologfa en la enfermedad de Wilson implica el dano oxidativo debido a la sobrecarga de cobre. La generacion de especies de oxfgeno reactivo (EOR) ademas de la oxidacion lipfdica y el dano de ADN se han detectado en el hfgado, particularmente en las etapas avanzadas de esta enfermedad (Burkhead et al., Biometals 2011; 24:455-466).

Los derivados de MnPLED no son objetivos para el peroxinitrito y la adicion de derivados de MnPLED exogeno puede en dichas situaciones restablecer el potencial protector. Los derivados de PLED son ademas fuertes aglutinantes de hierro, como se describe en los documentos EP 1054670, US 6310051 y por Rocklage et al., (Inorg Chem 1989; 28:477-485), y algunos derivados de MnPLED pueden tener actividades catalasa y glutation reductasa (Laurent et al., 2005), que pueden ademas aumentar su capacidad antioxidante.

Para el uso de formacion de imagenes diagnosticas y otro uso esporadico, la disociacion de manganeso a partir de mangafodipir no presenta un problema toxicologico principal. Debido a la absorcion en el SNC, sin embargo, para el uso mas frecuente, por ejemplo en metodos terapeuticos, la toxicidad del manganeso acumulado puede representar un problema neurotoxicologico serio (Crossgrove et al., NMR Biomed. 2004; 17:544-53). Por consiguiente, para el uso terapeutico mas frecuente, los compuestos que disocian manganeso facilmente debenan evitarse y hay una necesidad de desarrollar medios para obtener efectos terapeuticos deseables mientras se reducen los efectos secundarios indeseables asociados con dicho uso terapeutico. El documento WO 2011/004325 A1 de PledPharma AB demuestra que administrar fodipir (DPDP) con mangafodipir (MnDPDP) estabiliza al mangafodipir de la liberacion de manganeso despues de la administracion y reduce asf la absorcion de manganeso al cerebro y disminuye el potencial neurotoxico de mangafodipir de forma considerable.

Compendio de la invencion

El asunto de la presente invencion se define en las reivindicaciones 1-16 como estan adjuntas. Las realizaciones descritas en esta memoria que no estan cubiertas por las reivindicaciones sirven meramente para ilustrar el contexto tecnico de la presente invencion. Los complejos, composiciones y metodos de la presente invencion proporcionan mejoras en la preparacion y uso de los complejos metalicos de los derivados de PLED. En una realizacion, la invencion se dirige a un complejo metalico mixto de un compuesto de Formula I, o una sal del mismo, en donde los metales mezclados comprenden calcio y manganeso, en donde la relacion molar de calcio a manganeso es 1-10:

Formula I

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imagen1

En donde

X representa CH o N,

Cada R1 representa independientemente -CH2COR5;

R5 representa hidroxi;

Cada R2 representa independientemente ZYR6 en donde Z representa un enlace o un grupo seleccionado de CH2, (CH2)2, CO, CH2CO, CH2CH2CO y CH2COCH2;

Y representa un enlace;

R6 es un grupo alquilo mono- o poli(hidroxi o alcoxilado) o de la formula OP(O)(OR8)R7;

R7 es hidroxi, o un grupo alquilo o aminoalquilo no sustituido;

R8 es un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo, opcionalmente hidroxilado, opcionalmente alcoxilado;

R3 representa etileno; y

Cada R4 representa independientemente hidrogeno o alquilo C1-3.

En otra realizacion, la invencion esta dirigida a un complejo de calcio y manganeso de un compuesto de Formula I. Los complejos metalicos mixtos, y particularmente el complejo de calcio-manganeso mixto calmangafodipir descrito en esta memoria, constituyen nuevas entidades qmmicas.

La presente invencion esta dirigida tambien a metodos de produccion de un complejo metalico mixto que comprende una cristalizacion de una etapa a partir de una disolucion de calcio, manganeso y un compuesto de Formula I.

En otra realizacion, la invencion esta dirigida a una composicion farmaceutica para un tratamiento de un proceso patologico en un paciente.

Los complejos segun la invencion reducen los efectos toxicos asociados con el uso de complejos de metales de transicion de los Grupos III-XII anteriores, por ejemplo, derivados de MnPLED tales como mangafodipir. Los complejos de la invencion pueden mostrar tambien el tratamiento de y/o proteccion mejorados frente a procesos patologicos, particularmente los provocados por la presencia de radicales libres derivados de oxfgeno, es decir, estres oxidativo. Las mejoras y ventajas adicionales de la presente invencion seran mas evidentes en vista de la Descripcion Detallada presentada a continuacion.

Breve descripcion de los dibujos

La siguiente descripcion detallada se entendera mas completamente en vista de los dibujos, en donde:

La Fig. 1 muestra patrones de difraccion de rayos X en polvo (XRPD) para tres formas cristalinas de un complejo de calcio y manganeso de fodipir (DPDP) que tienen una relacion molar de Ca:Mn aproximado de aproximadamente 4:1, denominados en esta memoria como “calmangafodipir”, obtenidos en un metodo de cristalizacion en una etapa segun la invencion, como se describe en el Ejemplo 1.

La Fig. 2 muestra patrones de XRPD de mezclas de calcio fodipir (calfodipir) y manganeso fodipir (mangafodipir), mas que un complejo segun la invencion; estos patrones de XRPD indican que todos los productos eran amorfos y se mostro que absorben agua rapidamente, como se describe en el Ejemplo 2.

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La Fig. 3 muestra el espectro de absorcion infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR) de calmangafodipir, lote num. 7755-C-R0-01-30-01, con las bandas de absorcion infrarrojas caractensticas (numero de onda) y las correspondientes asignaciones descritas en el Ejemplo 3.

Las Figs. 4A y 4B muestran el espectro de masas (Fig. 4A) y el espectro de masas expandido (Fig. 4B) de calmangafodipir, lote num. 7755-C-R0-01-30-01 (660-850 m/z), como se describe en el Ejemplo 3.

La Fig. 5 muestra la estructura qmmica de calmangafodipir, como se describe en el Ejemplo 3.

La Fig. 6A muestra el aumento en el contenido de manganeso (Mn) en 0-24 h de orina, expresado como el contenido total de Mn menos el contenido basal de Mn, de ratas inyectadas con mangafodipir o calmangafodipir que contienen 2,59 pmoles y 2,52 pmoles de Mn, respectivamente. La Fig. 6B muestra el aumento en el contenido de orina de Mn expresado como porcentaje de la dosis inyectada. La Fig. 6C muestra el aumento en el contenido de zinc en 24 h de orina en los mismos animales. Los resultados se expresan como media ± EEM; n=4 en cada grupo. Estas figuras se describen mas completamente en el Ejemplo 4.

Las Figs. 7A-7D muestran los efectos mielosupresores en los globulos blancos (WBC), linfocitos (LYM), neutrofilos (NEU) y plaquetas (PLC), respectivamente, de una unica inyeccion intravenosa de dosis crecientes (7,5, 10,0 y 12,5 mg/kg) de oxaliplatina a los 3 y 6 dfas despues de la inyeccion. Los resultados se expresan como media ± EEM; n=5 en cada grupo, como se describe en el Ejemplo 5.

Las Figs. 8A-8D muestran WBC, LYM, NEU y PLC, respectivamente despues del tratamiento de oxaliplatina sola o en combinacion con calmangafodipir o mangafodipir en ratones balb/c. Los controles recibieron solo tratamiento de vehuculo. Los resultados se expresan como media ± EEM, n=5 en cada grupo, como se describe en el Ejemplo 5.

Las Figs. 9A-9B muestran la actividad citotoxica de varios derivados de PLED y CaCl2 a concentraciones crecientes en celulas CT26 de cancer de colon. Los resultados se expresan como media ± DE; n=3), como se describe en el Ejemplo 6.

La Fig. 10A muestra el efecto antitumoral de una alta dosis de oxaliplatina (20 mg/kg) en ratones balb/c singenicos CT26 en ausencia y presencia de una dosis relativamente alta de calmangafodipir (50 mg/kg). La Fig. 10B muestra el efecto antitumoral de una baja dosis de oxaliplatina (10 mg/kg en ausencia y presencia de una dosis relativamente baja de calmangafodipir. Los resultados se expresan como media ± EEM; n=l0 en los grupos de vehuculo y oxaliplatina 20 mg/kg en la Fig. l0A; n=5 en todos los demas grupos), como se describe en el Ejemplo 7.

Las Figs. 11A-11C muestran el contenido en Mn del cerebro, pancreas e hugado, respectivamente, despues de 39 dosis o bien de NaCl (controles), mangafodipir o calmangafodipir (que corresponde en ambos casos a una dosis acumulada de 2800 pmol/kg de manganeso). Los resultados se expresan como media ± EEM; n=17-18 en cada grupo, como se describe en el Ejemplo 8.

Las Figs. 12A-12D muestran los efectos mielosupresores en los globulos blancos (WBC), linfocitos (LYM), neutrofilos (NEU) y plaquetas (PLC), respectivamente, de una unica inyeccion intravenosa de dosis crecientes (75, 100 y 125 mg/kg) de carboplatina a 3 y 6 dfas despues de la inyeccion. Los resultados expresados como media ± EEM; n=5 en cada grupo, como se describe en el Ejemplo 9.

Las Figs. 13A-13D muestran WBC, LYM, NEU y PLC, respectivamente despues de carboplatina en combinacion con calmangafodipir en ratones balb/c. Los controles recibieron solo tratamiento con vehfculo. Los resultados se expresan como media ± EEM; n=5 en cada grupo, como se describe en el Ejemplo 9.

La Fig. 14 muestra el efecto antitumoral de una baja dosis de oxaliplatina (10 mg/kg) en ratones balb/c inmunocompetentes que portan CT26 y en ratones balb/c desnudos inmunodeficientes (nu/nu) en ausencia y presencia de una dosis relativamente baja de calmangafodipir. Los resultados se expresan como ± EEM; n=5 en cada grupo, como se describe en el Ejemplo 10.

Las Figs. 15A y 15B muestran la actividad citotoxica de calmangafodipir y mangafodipir en celulas de cancer de pulmon de celulas no pequenas U1810 y LLC1, respectivamente. Los resultados se expresan como media ± DE; n=3, como se describe en el Ejemplo 11.

Los dibujos se entenderan mas completamente en vista de los Ejemplos.

Descripcion detallada

Los complejos, composiciones y metodos de la presente invencion proporcionan mejoras en la preparacion y uso de complejos metalicos de derivados de PLED, es decir, derivados de PiridoxiL EtilDiamina, aunque se reconoce que los derivados tambien actuan como pro-farmacos de PLED ya que pueden metabolizarse para formar PLED in vivo.

El documento WO 2011/004325 A1 demuestra como un exceso anadido de fodipir (DPDP) a mangafodipir (MnDPDP) lo estabiliza de la liberacion de manganeso despues de la administracion y por consiguiente reduce la absorcion al

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SNC, y por consiguiente disminuye el potencial neurotoxico del mangafodipir considerablemente. Como es el complejo intacto que contiene manganeso el que ejerce los efectos mimeticos de SOD y citoprotectores, un exceso de fodipir no solo disminuira por tanto el potencial neurotoxico sino que tambien aumentara la eficacia citoprotectora considerablemente.

La liberacion in vivo de manganeso a partir de derivados de MnPLED, que incluyen acido manganeso N,N'-bis- (piridoxal-5-fosfato)-etilendiamina-N,N'-diacetico (mangafodipir), depende de la presencia de zinc libre o facilmente disociable en el cuerpo. El zinc tiene aproximadamente 1000 veces mayor afinidad que el manganeso por el fodipir o sus contrapartes desfosforiladas (Rocklage et al., 1989). Los estudios experimentales sugieren que la liberacion de manganeso in vivo a partir de mangafodipir satura a dosis que exceden los 5 pmol/kg (Southon et al., 1997). La formacion de imagenes cardiacas y hepaticas con mangafodipir en voluntarios sanos indica una dosis de saturacion similar en el hombre (Skjold et al., J. Magn. Reson. Imaging 2004; 20:948-952, Toft et al., 1997).

En la invencion descrita en el documento WO 2011/004325 A1, se asumio que la composicion terapeutica particular se obtuvo mezclando dos ingredientes farmaceuticos activos (IFAs), por ejemplo, mangafodipir y fodipir, en una disolucion lista para usar o administrandolas de forma separada. Se demostro que el fodipir a un nivel de dosis de alrededor de 5 a 10 pmol/kg tema un considerable efecto estabilizador in vivo en el mangafodipir. Las primeras experiencias clmicas (Yri et al., 2009 y Karlsson et al., 2011) muestran que el mangafodipir es terapeuticamente eficaz a un nivel de dosis en alguna cantidad entre 2 y 10 pmol/kg en el hombre. Tomando en consideracion la mayor eficacia de mangafodipir mas fodipir, es razonable presumir que el mangafodipir sena terapeuticamente eficaz en pacientes a un nivel de dosis cerca de 1 pmol/kg. Esto, a su vez, nos ensena que una relacion de (fodipir + mangafodipir)/mangafodipir cerca de 5, es decir, una formulacion lista para usar que contiene 4 veces mas fodipir que mangafodipir, debena ser eficaz. Esto sugiere ademas una formulacion lista para usar que contiene fodipir 40 mM y mangafodipir 10 mM - administracion de 0,1 a 0,2 ml de esta formulacion por kg de peso corporal - dana por resultado una dosis de 1 a 2 pmol/kg de mangafodipir y 4 a 8 pmol/kg de fodipir.

El calcio tiene aproximadamente 109 veces menos afinidad por el fodipir que el zinc y aproximadamente 106 veces menos afinidad por el fodipir que el manganeso. Sin embargo, teniendo en consideracion que el calcio esta presente en concentraciones extracelulares mucho mayores que el zinc y el manganeso, la administracion del bolo intravenoso rapido de fodipir puede inducir la reduccion aguda en las concentracion extracelular del calcio libre. Como el corazon es absolutamente dependiente del calcio extracelular para su actividad de bombeo de sangre, la reduccion en el contenido extracelular del calcio libre puede a su vez inducir el fallo cardiaco agudo. Sin embargo, como se trata en el documento WO 2011/004325 A1 este problema puede resolverse facilmente haciendo uso del DPDP complejado con calcio, es decir, CaDPDP.

Sorprendentemente, se ha descubierto que el CaDPDP puede emplearse en un complejo con manganeso en derivados de PLED. Ademas, sorprendentemente, los complejos de calcio y manganeso, por ejemplo, calmangafodipir, y los complejos de otros metales del Grupo II y metales de transicion de los Grupos III-XII, pueden obtenerse.

Por consiguiente, de acuerdo con un aspecto, la invencion esta dirigida a un complejo metalico mixto de un compuesto de Formula I, o una sal del mismo, en donde los metales mezclados comprenden un metal de transicion del Grupo III- XII y un metal del Grupo II:

Formula I

imagen2

En donde

X representa CH o N,

Cada R1 representa de forma independiente hidrogeno o -CH2COR5;

R5 representa hidroxi, opcionalmente alcoxi, amino o alquilamido hidroxilado;

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Cada R2 represente independientemente ZYR6 en donde Z representa un enlace o un grupo alquileno u oxoalquileno C1-3, opcionalmente sustituido por R7;

Y representa un enlace, un atomo de ox^geno o NR6;

R6 es un atomo de hidrogeno, grupo COOR8, alquilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo o aralquilo, opcionalmente sustituido por uno o mas grupos seleccionados de COOR8, CONR82, NR82, OR8, =NR8, =O, OP(O)(OR8)R7 y OSO3M;

R7 es un grupo hidroxi, alquilo o aminoalquilo opcionalmente hidroxilado, opcionalmente alcoxilado;

R8 es un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo opcionalmente hidroxilado, opcionalmente alcoxilado;

M es un atomo de hidrogeno o un equivalente de un cation fisiologicamente tolerable;

R3 representa un alquileno C1-8, un 1,2-cicloalquileno, o un grupo 1,2-arileno, opcionalmente sustituido con R7; y Cada R4 representa independientemente hidrogeno o alquilo C1-3.

Como se usan en esta memoria los terminos “alquilo” y “alquileno” incluyen hidrocarburos de cadena lineal y ramificada, saturados e insaturados. El termino “1,2-cicloalquileno” incluye grupos cicloalquileno y grupos cicloalquileno sustituidos con alquilo tanto cis como trans que tienen de 5-8 atomos de carbono. El termino “1,2-arileno” incluye grupos fenilo y naftilo y derivados sustituidos con alquilo de los mismos que tienen de 6 a 10 atomos de carbono. A menos que se especifique otra cosa, cualquier resto alquilo, alquileno o alquenilo puede contener de forma conveniente de 1 a 20, mas espedficamente 1-8, mas espedficamente 1-6, e incluso mas espedficamente, 1-4 atomos de carbono. Los restos cicloalquilo pueden contener de forma conveniente 3-18 atomos anulares, espedficamente 5-12 atomos anulares, e incluso mas espedficamente 5-8 atomos anulares. Se prefieren los restos arilo que comprenden grupos fenilo o naftilo. Como grupos aralquilo, se prefieren fenilo alquilo C1-8, especialmente bencilo. Donde los grupos pueden estar opcionalmente sustituidos por grupos hidroxilo, esto puede ser monosustitucion o polisustitucion y, en el caso de polisustitucion, los sustituyentes alcoxi y/o hidroxilo pueden portarse por sustituyentes alcoxi.

El compuesto de Formula I puede tener los mismos o diferentes grupos R2 en los dos anillos piridilo y estos pueden estar unidos a las mismas o diferentes posiciones anulares. En una realizacion espedfica, la sustitucion esta en las posiciones 5 y 6, o mas espedficamente, la posicion 6, es decir, para al grupo hidroxilo. En una realizacion espedfica, los grupos R2 son identicos y estan posicionados identicamente, y mas espedficamente estan en las posiciones 6,6'. En realizaciones aun mas espedficas, cada R6 es un grupo alquilo mono- o poli(hidroxi o alcoxilado) o un grupo de la formula OP(O)(OR8)R7.

En otra realizacion, la invencion esta dirigida a un complejo de calcio y manganeso de un compuesto de Formula I. En una realizacion, R5 es hidroxi, alcoxi C1-8, etilenglicol, glicerol, amino o alquil C1-8 amido; Z es un enlace o un grupo seleccionado de CH2, (CH2)2, CO, CH2CO, CH2CH2CO y CH2COCH2; Y es un enlace; R6 es un grupo alquilo mono- o poli(hidroxi o alcoxilado) o de la formula OP(O)(OR8)R7; y R7 es hidroxi, o un grupo alquilo o aminoalquilo no sustituido. En una realizacion mas espedfica, R3 es etileno y cada grupo R1 representa -CH2COR5 en que R5 es hidroxi. En una realizacion adicional, el compuesto de Formula I es acido N,N'-bis-(piridoxal-5-fosfato)-etilendiamina-N,N'-diacetico (DPDP), o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. En aun mas realizaciones, el material farmaceutico es un complejo mixto de manganeso y calcio de acido N,N'-bis-(piridoxal-5-fosfato)-etilendiamina-N,N'-diacetico, o una sal del mismo.

El complejo metalico mixto puede incluir cualquier combinacion de metales de los Grupos indicados. En una realizacion espedfica, el metal de transicion del Grupo III-XII es Mn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Ni2+ y el metal del Grupo II es Ca2+ y/o Mg2+. En una realizacion mas espedfica, el metal de transicion del Grupo III-XII es Mn2+ y el metal del Grupo II es Ca2+ o una mezcla de Ca2+ y Mg. En realizaciones mas espedficas, el metal del Grupo II es una mezcla de Ca2+ y Mg2+ en una relacion molar de Ca2+/Mg2+ de aproximadamente 0,1-50, mas espedficamente aproximadamente 0,1 -10.

En realizaciones adicionales, el complejo metalico mixto contiene una relacion molar de metal de Grupo II a metal de transicion del Grupo III-XII de aproximadamente 1-10. En una realizacion espedfica, el metal de transicion del Grupo III-XII es Mn2+ y el metal del Grupo II es Ca2+ y la relacion molar de Ca2+/Mn2+ es aproximadamente 4. En una realizacion mas espedfica, el metal de transicion del Grupo III-XII es Mn2+ y el metal del Grupo II es Ca2+ y la relacion molar de Ca2+/Mn2+ es aproximadamente 4, y el compuesto de Formula I es DPDP, es decir, el complejo es el compuesto calmangafodipir como se describe en esta memoria.

En otro aspecto, la invencion esta dirigida a un metodo de produccion de un complejo metalico mixto de la invencion, en una etapa de preparacion/cristalizacion. El metodo comprende una cristalizacion de una etapa desde una disolucion del metal de transicion del Grupo III-XII, el metal del Grupo II, y un compuesto de Formula I. En una realizacion espedfica, se realiza una cristalizacion de una etapa a partir de una disolucion de manganeso, calcio y un compuesto de Formula I. En una realizacion mas espedfica, la disolucion tiene una relacion de (Ca+Mn)/Mn cercana a (4+1)/1=5, es decir, con una composicion estequiometrica cercana a Ca4Mn(DPDP)5.

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La difraccion de rayos X en polvo (XRPD) es la mas ampliamente usada en la identificacion y caracterizacion de solidos cristalinos, cada uno de los cuales produce un patron de difraccion distintivo. Tanto las posiciones (que corresponden a los espaciados de la estructura) como la intensidad relativa de las lmeas son indicativas de una fase y material particulares, que proporcionan una “huella dactilar” para la comparacion. Como se muestra en los Ejemplos, un analisis de XRPD de calmangafodipir demuestra sin duda que el calmangafodipir es una entidad qmmica, es decir, un complejo, mas que una simple mezcla, vease el Ejemplo 1. La Fig. 1 muestra una representacion apilada de las tres formas cristalinas de calmangafodipir que se interconvierten segun la humedad ambiental. El analisis de XRPD a humedad variable demostro que la Forma B es estable por encima del 40% de humedad relativa (HR), la Forma A es estable a 0-10% de HR, y la Forma C es estable entre 6-36% de HR. Se observaron mezclas de Formas B y C entre 38-44% de HR, y se observo que se daban conversiones de forma dentro de las 3 horas en una escala de 10 mg.

La preparacion de una etapa puede realizarse con o sin siembra, pero la siembra (como se ejemplifica en el Ejemplo 1) permite un mejor control de la cristalizacion.

La preparacion de una etapa mencionada brevemente antes es superior a la de la mezcla de complejos metalicos individuales. Por consiguiente, en una realizacion espedfica, el complejo de calcio y manganeso es un material cristalino y facilmente distinguible de una mezcla sencilla de mangafodipir (MnDPDP) y calfodipir (CaDPDP) en las cantidades deseables, como se muestra en el Ejemplo 2.

Los Ejemplos tambien muestran mejoras y ventajas de los complejos segun la invencion, como se representa por el complejo de calcio-manganeso calmangafodipir. Respecto a la estabilidad del manganeso in vivo, el calmangafodipir es al menos tan estable como una mezcla real de mangafodipir y fodipir, como se demuestra en el Ejemplo 4. Esto dara por resultado significativamente menos retencion de manganeso en el cerebro, como se demuestra en el Ejemplo 8. Como la eficacia citoprotectora depende principalmente del complejo de manganeso intacto mangafodipir o sus contrapartes desfosforiladas, MnDPMP y MnPLED, la eficacia de calmangafodipir es superior a la de mangafodipir, como se ejemplifica en el Ejemplo 5. Ademas, se ha encontrado sorprendentemente que el mangafodipir posee efectos citotoxicos frente a las celulas cancengenas, por ejemplo, celulas CT26 (Laurent et al., 2005; Alexandre et al., 2006; documento EP 16944338). Sin embargo, como se describe en el documento WO 2009/078794 A1 y en Kurz et al., 2012, esta es una propiedad inherente al fodipir solo o de sus contrapartes desfosforiladas, DPMP y PLED, y no del complejo metalico intacto mangafodipir o sus contrapartes desfosforiladas, MnDPMP y MnPLED. En el Ejemplo 6 se muestra que el fodipir es aproximadamente 20 veces mas eficaz que el mangafodipir en matar celulas de cancer de colon CT26, y el Ejemplo 11 muestra que el calmangafodipir es aproximadamente 28 veces mas eficaz que el mangafodipir en matar celulas de cancer de pulmon de celulas no pequenas U1810. La disociacion en algun grado de manganeso del fodipir, bajo condiciones in vitro, es lo que explica mas probablemente la eficacia de matar el cancer del mangafodipir. El calmangafodipir como se describe en los Ejemplos 1, 2 y 3, en comparacion con el mangafodipir a concentraciones equimolares de manganeso, es por otro lado tan eficaz como el fodipir solo, es decir, la eficacia de matar del calmangafodipir es mucho mayor que la del mangafodipir a concentraciones de manganeso equimolar. Este descubrimiento sugiere dos propiedades importantes. En primer lugar, el PLED desfosforilado es probablemente tan eficaz como su contraparte fosforilada fodipir con respecto a su capacidad de matar celulas cancengenas, y en segundo lugar, la menor estabilidad de MnPLED en comparacion con la del mangafodipir (Rocklage et al., 1989) probablemente explica la mayor eficacia de MnPLED. La falta de cualquier actividad citotoxica de ZnDPDP y ZnPLED es debido a la estabilidad 1000 veces mayor de estos complejos en comparacion con sus contrapartes de manganeso (Rocklage et al., 1989).

Durante el desarrollo del mangafodipir como un agente de contraste de IRM, se descubrio que el MnDPDP provocaba anormalidades esqueleticas fetales en ratas pero no en conejos. De manera importante, este efecto teratogenico visto en ratas no esta provocado por el mangafodipir intacto per se sino por el manganeso disociado (Grant et al., Acta Radiol. 1997; 38:759-769). Aunque es incierto si el manganeso provocara anormalidades esqueleticas en el feto humano, es por supuesto esencial proteger a las mujeres potencialmente embarazadas de exponerse al mangafodipir. Esto representa un problema menor para la mayona de aplicaciones qrnmicas pero un problema ocupacional principal, en particular durante la produccion donde tienen que tomarse medidas de forma costosa para proteger a las mujeres fertiles y potencialmente embarazadas de la exposicion al mangafodipir. De manera importante, el hecho de que el calmangafodipir liberara el manganeso en un grado mucho menor que el mangafodipir despues de absorberse de forma accidental en el cuerpo reducira por supuesto el riesgo considerablemente de que un feto desarrolle malformaciones esqueleticas. En segundo lugar, como el calmangafodipir es significativamente mas eficaz que el mangafodipir a dosis equimolares de manganeso, la necesidad de manganeso se reduce considerablemente para cada dosis de calmangafodipir producido, que dara por resultado menos exposicion al manganeso durante la produccion.

Ademas, la preparacion de un unico ingrediente farmaceutico activo reduce el coste de fabricacion de una dosis de tratamiento. Ademas, la necesidad de dosificacion de un unico material reduce la posibilidad de errores en la formulacion del producto. En las pruebas de estabilidad, la estabilidad del producto cristalino se ha mostrado que es superior al material amorfo, tal como el formado secando por pulverizado una mezcla de los dos IFAs. Como se ilustra en el Ejemplo 2, el material amorfo obtenido a partir del secado por pulverizacion se mostro que absorbfa agua rapidamente, formando partfculas condensadas y/o solidos pegajosos en las 24 h de exposicion a 25°C/60% de HR y

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Se ha descubierto, como se describe en el documento WO 2011/004325 A1, que la adicion de exceso de derivado de PLED que no contiene manganeso, por ejemplo, DPDP, a la terapia derivada de MnPLED, protege al mangafodipir de liberar manganeso neurotoxico in vivo. Aunque el mecanismo detras de la absorcion de manganeso en el cerebro no se entiende totalmente, un exceso del derivado de PLED que no contiene manganeso tal como fodipir administrado en combinacion con el derivado de PLED que contiene manganeso tal como mangafodipir reduce significativamente la absorcion de manganeso al cerebro. Sin desear estar atado por la teona, se cree que la combinacion segun la invencion del documento WO 2011/004325 A1 mantiene la forma quelante del MnPLED, por lo que estan disponibles cantidades crecientes de quelatos para la excrecion y la cantidad de Mn libre para absorberse por el cerebro y otros organos se reduce. Los quelatos de manganeso de bajo peso molecular, como derivados de MnPLDE, y sus contrapartes de Zn se excretaran facilmente a traves del rinon, dirigido por la tasa de filtrado glomerular (TFG), mientras que el manganeso no unido a un quelante de bajo peso molecular se retendra durante bastante tiempo en el cuerpo y se excretara lentamente y principalmente por medio de la ruta biliar (Toft et al., 1997). Como se muestra en el siguiente Ejemplo 8 en esta memoria, inyecciones intravenosas repetidas (39 veces durante 3 meses) de una alta dosis (36 veces la dosis asumida clmica asumida) de calmangafodipir en ratas provoco significativamente menos retencion de manganeso en el cerebro, en comparacion con la que provoca el mangafodipir. La dosis total en ambos casos correspondio a aproximadamente 2800 pmol/kg de manganeso. Este ejemplo tambien muestra que el pancreas absorbe y retiene manganeso disociado en un grado relativamente largo, una propiedad descrita anteriormente por Ni et al. (Acta Radiol 1997; 38:700-707) y utilizada como un metodo de IRM diagnostico prometedor del pancreas (Ahlstrom et al, Acta Radiol 1997; 38:660-664). El nivel de manganeso significativamente mas bajo en el pancreas de ratas tratadas con calmangafodipir en comparacion con las tratadas con mangafodipir confirma adicionalmente el perfil toxicologico mejorado del calmangafodipir. Aunque el contenido de Mn del tngado estaba significativamente elevado en el grupo de mangafodipir, la elevacion relativa fue mucho menor que las del cerebro y el pancreas. Una unica dosis diagnostica de mangafodipir (5 pmol/kg de p.c.) se sabe que provoca un rapido aumento en el contenido de Mn tanto del pancreas como el tngado de las ratas - despues de 2 horas el contenido de Mn del pancreas fue aproximadamente 10 veces mayor que el valor basal, y el correspondiente valor del tngado se aumento aproximadamente 2 veces (Ni et al., 1997). Mientras que Ni et al encontraron el contenido de Mn aun elevado despues de 24 horas en el pancreas (aproximadamente 5 veces el valor basal), habfa vuelto a la base en el tngado a ese punto temporal. Esto refleja presumiblemente la alta capacidad del tngado para manejar el manganeso y su importante papel fisiologico en la homeostasis del manganeso. Esto esta soportado ademas por los actuales resultados que muestran solo un modesto aumento en el Mn hepatico despues de una fuerte exposicion a mangafodipir. El perfil toxicologico mejorado de calmangafodipir se ilustra claramente por el Ejemplo 8 en esta memoria.

Cuando una dosis clmica de un derivado de MnPLED tal como mangafodipir (es decir, 5-10 pmol/kg de p.c., administracion intravenosa) se usa como un agente de contraste de IRM en un ser humano, aproximadamente el 80% del manganeso unido a fodipir (DPDP) se intercambia con zinc (Toft et al., 1997). Cuando se administran dosis mas pequenas de mangafodipir, el porcentaje de manganeso que se disocia sera incluso mayor. El mangafodipir se comporta desde ese punto de vista de una manera similar en ratas y perros (Hustvedt et al., 1997); sin embargo, casi todo el manganeso en el mangafodipir se intercambia por zinc cuando el compuesto se administra en cerdos y esta por tanto sin efectos citoprotectores en los cerdos (Karlsson et al., 2001). Por otro lado, la administracion de dosis bajas de MnPLED provoca profundos efectos citoprotectores en los cerdos, visto como un tamano de infarto de miocardio significativamente reducido tras la isquemia-reperfusion. Aunque la constante estabilidad presentada entre Mn2+ y PLED es considerablemente menor que la correspondiente figura para Mn2+ y fodipir (Rocklage et al., 1989), MnPLED por alguna razon desconocida escapa del intercambio metalico. El desplazamiento del manganeso es un prerrequisito y por lo tanto es deseable para el uso como un agente de contraste de IRM, por ejemplo, por propositos diagnosticos del tngado y pancreas. Sin embargo, el efecto terapeutico mimetico de SOD frente a diversas formas de estres oxidativo depende totalmente del complejo derivado de PLED manganeso (Brurok et al., 1999; Karlsson et al., 2001). Por ejemplo, mientras la administracion in vivo del mangafodipir protege frente a diversos estresantes oxidativos, por ejemplo, isquemia-reperfusion, farmacos citotoxicos/citostaticos e intoxicacion por acetaminofeno, no protege al corazon del cerdo frente al infarto de miocardio inducido por isquemia-reperfusion (Karlsson et al., 2001), a partir de cuyos resultados puede concluirse que los efectos citoprotectores in vivo de los derivados de MnPLED son una propiedad inherente del complejo de manganeso intacto.

La presencia de Ca en un exceso de aproximadamente 4 veces al Mn, como en calmangafodipir, estabiliza profundamente el complejo o sus contrapartes desfosforiladas de la liberacion de manganeso despues de las inyecciones y por lo tanto proporciona otra ventaja importante, espedficamente eficacia terapeutica aumentada. Por ejemplo, cuando una dosis de formacion de imagen clmicamente relevante de MnDPDP (5-10 pmol/kg) se inyecta de forma intravenosa, aproximadamente el 80% del manganeso unido originalmente a DPDP se libera, contribuyendo a la eficacia de la formacion de imagen. Por consiguiente menos del 20% permanece unido al DPDP o sus contrapartes desfosforiladas, lo que contribuye a la actividad terapeutica del MnDPDP. Como la liberacion del manganeso del complejo puede reducirse de forma efectiva mediante un exceso de aproximadamente 4 veces de Ca en comparacion con el Mn, en el calmangafodipir, esto significa que el manganeso puede reducirse considerablemente para un efecto terapeutico equipotente, como claramente se ejemplifica en la presente invencion. A dosis menores y, en ciertas realizaciones, mas relevantes terapeuticamente, el efecto estabilizante del Ca estara incluso mas acentuado. Esto, a

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su vez, significa que el uso de calmangafodipir en comparacion con mangafodipir tendra profundos efectos en el potencial neurotoxico - tanto como un resultado de un efecto estabilizador in vivo como un resultado de la eficacia terapeutica aumentada de la nueva materia farmaceutica calmangafodipir, con una composicion estequiometrica cercana a Ca4Mn(DPDP)5.

El zinc esta presente en todos los tejidos y fluidos corporales. El contenido en zinc corporal total en seres humanos se ha estimado que es 2-3 g (Folin et al., BioMetals 1994; 7:75-79). El zinc en plasma representa aproximadamente el 0,1% del contenido en zinc corporal total, y es principalmente esta pequena fraccion de zinc la que compite con el manganeso para unirse al fodipir o sus contrapartes desfosforiladas, DPMP y PLED, despues de la administracion. El cuerpo humano tiene una capacidad muy alta para mantener la homeostasis del zinc a traves de ajustes sinergicos en la absorcion gastrointestinal y la excrecion (King et al., J Nutr 2000; 130:1360S-1366S).

Aunque sin desear estar atados por la teona, a partir de trabajo preclmico (Southon et al., 1997) y a partir de trabajo clmico (Skjold et al., 2004), puede ser razonable asumir que el cuerpo contiene de 5 a 10 pmol/kg de peso corporal (p.c.) de zinc que es facilmente intercambiable por manganeso en un derivado de MnPLED tal como mangafodipir. Esto corresponde esencialmente al contenido en zinc del plasma como se describe anteriormente. Los derivados de PLED tales como fodipir contienen un sitio de union para manganeso/zinc por molecula. Por consiguiente, en vista de la afinidad 1000 veces mayor por el zinc al quelante, la presencia de calcio en calmangafodipir en una relacion de alrededor de 4 en comparacion con el manganeso protegera frente a la liberacion de manganeso despues de la administracion parenteral a un paciente.

Se describen metodos para el tratamiento de un proceso patologico en un paciente, que incluyen, aunque no estan limitados a, un proceso patologico provocado por la presencia de radicales libres derivados de oxfgeno, es decir, estres oxidativo, mediante la administracion del complejo. En una realizacion espedfica, el proceso patologico esta provocado por superoxido que da por resultado la posterior peroxidacion lipfdica y/o nitracion de protema. En una realizacion espedfica, el complejo puede administrarse para el tratamiento terapeutico de dicho proceso patologico en un paciente humano u otro mairnfero. En otra realizacion espedfica, un complejo segun la invencion se administra para el tratamiento de un proceso patologico provocado por la presencia de radicales libres derivados de oxfgeno, es decir, estres oxidativo, en un mam^era.

En una realizacion, el complejo se emplea en el tratamiento con farmaco citotoxico o citostatico, en donde el complejo se administra para proporcionar proteccion de los efectos secundarios desventajosos de los farmacos citotoxicos/citostaticos, por ejemplo, uno o mas farmacos para el cancer en pacientes con cancer. En una realizacion mas espedfica, el farmaco citotoxico o citostatico comprende al menos uno de doxorubicina, epirubicina, oxaliplatina, carboplatina, cisplatina, 5-fluorouracilo, docetaxel o paclitaxel. En realizaciones adicionales, el proceso patologico es mielosupresion o neurotoxicidad, o ambas.

Los metodos pueden incluir ademas, aunque no estar limitados a, tratamiento de fallo hepatico inducido por acetaminofeno, esteatohepatitis no alcoholica (EHNA), hepatitis cronica inducida por virus, enfermedad de Wilson, diabetes, enfermedad cardiaca isquemica, que incluye lesion inducida por isquemia-reperfusion, o lesion inducida por isquemia de miocardio-reperfusion, tanto en una configuracion aguda ademas de electiva, un proceso asociado con un tratamiento trombolftico, un bypass cardiopulmonar, o angioplastia transluminal percutanea, o es un resultado de cirugfa cardiaca o de trasplante de organos o ictus. En realizaciones adicionales, los metodos pueden incluir tambien el tratamiento de procesos relacionados con hierro, que incluyen sobrecarga de hierro, por ejemplo, talasemia, anemia de celulas falciformes o hemosiderosis transfusional, cirrosis hepatica inducida por hepatitis, lesion inducida por radiacion, por ejemplo, que resulta deterapia de radiacion, diversas enfermedades neurodegenerativas, que incluyen enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica (ELA), enfermedad de Parkinson y esclerosis multiple, y similares.

En realizaciones aun adicionales, los metodos se administran como terapia de sustitucion para un proceso patologico de baja actividad de manganeso superoxido dismutasa (MnSOD), tal como se da en varias formas de cancer (Buettner, Anticancer Agents Med Chem. 2011; 11:341-346). Por consiguiente, en una realizacion, la descripcion se dirige a un metodo para el tratamiento de cancer de pulmon de celulas no pequenas administrando el complejo de la invencion, o, mas espedficamente, calmangafodipir. En realizaciones adicionales, la descripcion se dirige a un metodo para el tratamiento de cancer colorrectal, cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pancreas o melanoma maligno, administrando el complejo de la invencion, o, mas espedficamente, calmangafodipir.

Una propiedad interesante y probablemente importante para el efecto antitumoral de mangafodipir puede ser su propiedad de proteccion de linfocitos, como se muestra en el Ejemplo 5, y por Laurent et al., 2005 y Alexandre et al., 2006. Aunque los procesos inflamatorios secundarios a la tension oxidativa danan el tejido normal, pueden de hecho ser beneficiosos para el tejido tumoral creando un microentorno rico en factor de crecimiento y promoviendo el crecimiento de clones cancerosos (Anscher, Onclogist 2010; 15:350-359; Kareva, Transl Oncol 2011; 4:266-270; Kerkar et al., Cancer Res 2012; 72:3125-3130). Un sorprendente ejemplo es la existencia de macrofagos asociados con el tumor que se acumulan preferentemente en regiones pobremente vascularizadas de tumores y secretan citoquinas que realmente promueven el crecimiento tumoral. Ademas, no solo pueden estas citoquinas promover el crecimiento celular sino que tambien se ha mostrado que suprimen la activacion de los linfocitos T CD8+ que son los mas eficientes en la eliminacion tumoral. De hecho, hay un interes creciente por la importancia de la respuesta inmune

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mediada por linfocitos T para el resultado de la quimioterapia del cancer (Zitvogel et al., Nat Rev Clin Oncol 2011; 8:151-160; Kerkar et al., 2012). Se sabe que la linfopenia severa (<1000 celulas/pl) afecta de forma negativa a la respuesta a la quimioterapia. Una coleccion de canceres de raton, que incluyen cancer de colon CT26, fibrosarcomas MCA205, canceres de mama de la lmea celular TSA, osteosarcomas de la lmea celular GOS y timonas EL4, responden a la quimioterapia con doxorubicina y oxaliplatina de forma mucho mas eficiente cuando estan implantadas en ratones inmunocompetentes singenicos que en huespedes inmunodeficientes, es decir, ratones desnudos (Zitvogel et al., 2011). Esto esta en lmea con los estudios clmicos que revelan que los linfocitos T CD8+ que producen IFN-y son potentes efectores inmunes del cancer. Ademas, una alta relacion neutrofilo/linfocito esta asociada con una baja supervivencia total para pacientes con cancer colorrectal avanzado (Chua et al., Br J Cancer 2011; 104:1288-1295). Tomando en consideracion que el mangafodipir y en particular calmangafodipir son agentes protectores de linfocitos altamente eficientes durante la quimioterapia, es plausible que esta propiedad sea de particular importancia durante las condiciones in vivo.

Para ser clmicamente util, un protector de quimioterapia o un protector de radioterapia usado en pacientes de cancer debena cumplir tres criterios: (i) el agente debena proteger el tejido normal de la toxicidad inducida por quimioterapia/radioterapia pero no proteger al tejido tumoral (al menos no en un mayor grado) - de otra forma no se obtendra beneficio; (ii) el agente debena distribuirse con relativa facilidad y con minima toxicidad; y (iii) el agente debena proteger los tejidos normales frente a toxicidades que limitan la dosis o las responsables de la reduccion significativa en la calidad de vida (Citrin et al., 2010). Los compuestos de la invencion, y calmangafodipir en particular, cumplen todos estos criterios, como los ejemplos en esta memoria demuestran. La razon por la que mangafodipir y calmangafodipir protegen a las celulas no malignas pero danan a las celulas cancengenas es aparentemente una paradoja. Aunque sin desear estar atados por la teona, puede ser, sin embargo, que la proteccion de celulas no malignas y las acciones citotoxicas contra las celulas cancengenas sean solo dos lados de la misma moneda. Un estado oxidativo elevado es indispensable para la estimulacion mitogenica en las celulas transformadas (Irani et al., Science 1997; 275:1649-1652). Un numero de estudios han informado que las especies de oxfgeno reactivo (EOR) juegan un importante papel en la promocion de la metastasis tumoral (por ejemplo, Behrend et al., Mol Cell Biol 2005; 25:7758-7769). Estos datos son coherentes con una gran coleccion de bibliograffa que sugiere que el equilibrio redox de muchas celulas tumorales epiteliales favorece un punto de equilibrio oxidante elevado (Doroshow, 2006), que incluye celulas CT26 (Laurent et al., 2005; Alexandre et al., 2006). La MnSOD suprime el crecimiento celular en una variedad de lmeas celulares cancengenas y en los modelos de raton. Ademas, la sobreexpresion de MnSOD indujo la detencion del crecimiento en la lmea celular de cancer colorrectal humano HCT116 y aumento la senescencia que necesito la induccion de p53 (Behrend et al., 2005). La introduccion del gen de MnSOD normal en celulas cancengenas altera el fenotipo y las celulas pierden su capacidad para formar colonias en el cultivo y tumores en los ratones desnudos (Church et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90:3113-3117). El estado oxidativo elevado visto en celulas cancengenas lleva tfpicamente a la produccion aumentada de ^O2‘ que reacciona facilmente con •NO para formar ONOO‘ altamente toxico que da por resultado la nitracion de tirosina, el lado “feo” de •NO (Beckman et al, 1996; Radi, 2004). De forma interesante, la evidencia convincente sugiere que la nitracion de tirosina esta implicada en la supresion descrita anteriormente de la respuesta inmunologica mediada por linfocitos CD8+ en los tumores de (Bronte et al., J Exp Med 2005; 201, 1257-1268; Molon et al., J Exp Med 2011; 208:1949-1962). Puede ser que el calmangafodipir a traves de su actividad mimetica SOD inhiba la produccion de ONOO’ y por tanto la supresion inmunologica, lo que explica el efecto antitumoral aumentado visto en ratones inmunocompetentes pero no en ratones inmunoincompetentes, como se demuestra por el Ejemplo 10. El peroxinitrito no es capaz de la nitracion de protema directamente sino que necesita tfpicamente un metal de transicion activo redox como hierro o cobre (e incluso el manganeso puede cumplir esta necesidad) (Radi, 2004). El fodipir y sus metabolitos desfosforilados tienen una afinidad extremadamente alta por el Fe3+ (Rocklage et al., 1989). Esta propiedad puede, ademas de la actividad mimetica de SOD del calmangafodipir, ser de una importancia particular para la actividad antitumoral. Ademas de la accion dependiente del linfocito T, la accion inmuno-independiente directa de DPDP y PLED, puede ser debida a la inhibicion de la topoisomerasa II, como un artmulo reciente de Kurz (2012) puede sugerir.

El complejo puede administrarse en una composicion farmaceutica. Opcionalmente, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden incluir uno o mas vehmulos y/o excipientes fisiologicamente aceptables, de una manera bien conocida por los expertos en la tecnica. En una realizacion, el complejo puede suspenderse por ejemplo, o disolverse en un medio lfquido, opcionalmente con la adicion de excipientes farmaceuticamente aceptables. Excipientes adecuados para las composiciones farmaceuticas incluyen cualquier excipiente de formulacion farmaceutica o veterinaria convencional, que incluyen, aunque no estan limitados a, estabilizadores, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad, tampones, agentes de ajuste de pH, aglutinantes, cargas y similares. Las composiciones farmaceuticas pueden estar en una forma adecuada para la administracion, que incluye la administracion tanto parenteral como enteral. En una realizacion espedfica, la composicion esta en una forma adecuada por ejemplo inyeccion o infusion. Por consiguiente, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden estar en una forma de administracion farmaceutica convencional tal como un comprimido, capsula, polvo, disolucion, suspension, dispersion, jarabe, supositorio, aerosol, pomada, aposito o similares. En una realizacion adicional, el complejo esta en forma seca por congelacion y, si se desea, puede reconstituirse antes de la administracion. El complejo seco por congelacion puede estar en una composicion seca por congelacion que contiene uno o mas estabilizadores, y/u otros excipientes conocidos para usar en el secado por congelacion.

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Dichas composiciones segun la presente invencion pueden administrarse por varias rutas, por ejemplo, de forma oral, transdermica, rectal, intratecal, topica o por medio de inhalacion o inyeccion, en particular inyeccion subcutanea, intramuscular, intraperitoneal o intravascular. Otras rutas de administracion pueden usarse tambien, incluyendo intratimpanica e intranasal, y se prefieren las rutas que aumentan la efectividad, la biodisponibilidad o la tolerancia de los productos. La ruta mas apropiada puede elegirse por los expertos en la tecnica segun la formulacion particular que se use. Las dosis adecuadas seran evidentes respecto al tratamiento seleccionado. En una realizacion, el metodo de tratamiento segun la invencion comprende administrar aproximadamente 0,01 a 50 jmol/kg de peso corporal del complejo metalico mixto. En realizaciones mas espedficas, el metodo de tratamiento segun la invencion comprende administrar aproximadamente 0,1 a 10 jmol/kg, o aproximadamente 0,1 a 5 jmol/kg de peso corporal del complejo metalico mixto.

Los siguientes ejemplos demuestran varias realizaciones y aspectos de la invencion.

Ejemplo 1 Metodo

Un reactor de 100 L con camisa - soplado con N2- se cargo con fodipir (DPDP) (4,0 kg de base anhidra, 6,27 moles, 1 equiv) y agua desionizada (DI) (19,2 L, 4,88 vol). El pH de la carga se ajusto a 5,7 con NaOH diluido (8,9 L totales, 17,5 moles de NaOH, 2,8 equiv; preparado a partir de 1,41 kg de NaOH al 50% en peso y 8,0 L de agua DI) durante 35 min (21,0-23,3°C; enfriamiento externo). La lechada se agito durante 1 h a 20-25°C durante cuyo tiempo se formo una disolucion. A esta se cargo secuencialmente Ca(OH)2 (361,1 g, 4,87 moles, 0,78 equiv.), acido L-ascorbico (55,1 g, 0,313 moles, 5% en moles), y MnO (80 g, 1,13 moles, 0,18 equiv.). Despues de la adicion de cada reactivo la carga se agito durante 30-60 min a 20-25°C y el pH se midio (despues de Ca = 6,24, amarillo claro ligeramente turbio a oxido; despues de ascorbico = 6,28 oxido menos turbio; despues de Mn = 6,38, oxido turbio a amarillo verdoso). La carga turbia se agito durante 16 h a 20-25°C, el pH se midio (6,36) y la carga se filtro a traves de un filtro en lmea de 0,3 |j en un reactor de 100 L limpio. Mientras, una disolucion de etanol (EtOH) 23A se preparo con acetona (5,9 L, 1,47 vol) y EtOH (74 L, 18,5 vol). Una parte de la disolucion de EtOH 23A (8,0 L, 2 vol) se cargo a la carga durante 30 minutos a 20-25°C durante cuyo tiempo la disolucion se puso turbia. La carga se sembro con calmangafodipir (40 g, 1% en peso) y se agito durante 30 min a 20-25°C para asegurar que los solidos se mantienen.

La temperatura de la carga se ajusto a 15°C durante el curso de 1 h y despues se envejecio durante 30 min a 13,8- 15,5°C. A la carga se cargo EtOH 23A (56 L, 14 vol) durante 10 h (11-14°C). La lechada se mezclo durante 13 h a 5- 10°C y despues se filtro para recoger los solidos. El reactor y los solidos se enjuagaron con EtOH 23A (14 L, 3,5 vol) frio (0-10°C), los solidos se acondicionaron durante 2 h y despues se secaron en un horno de vacfo a 45°C durante 72 h para dar 4,819 kg (93% de rendimiento ajustado por contenido de agua) de calmangafodipir (lote num. 11AK0105B) como un solido amarillo. El analisis de HPLC mostro una pureza de 98,8%. El analisis de Karl Fisher en horno (@ 170°C) mostro 10,1% de agua. El analisis ICP indico 4,27% de Ca, 1,37% de Mn, 8,64% de Na para una relacion de Ca/Mn de 4,27, es decir, con una composicion estequiometrica cercana a Ca4Mn(DPDP)5.

Resultados

El analisis de XRPD (Difraccion de rayos X en polvo) se realizo y los patrones resultantes se muestran en la Fig. 1. Los patrones de XRPD demuestran que el calmangafodipir es una unica entidad qrnmica mas que una mezcla sencilla. La Fig. 1 muestra una representacion apilada de las tres formas cristalinas conocidas de calmangafodipir que se interconvierten segun la humedad del ambiente. El analisis de XRPD con humedad variable demostro que la Forma B es estable por encima de 40% de HR, la Forma A a 0-10% de HR y la Forma C es estable entre 6-36% de HR. Las mezclas de las Formas B y C se observaron entre 38-44% de HR, y se observo que ocunian conversiones de forma dentro de las 3 horas en una escala de 10 mg.

Conclusion

La XRPD demostro sorprendentemente que el calmangafodipir es una entidad qrnmica mas que una simple mezcla (Fig. 1).

Ejemplo 2

Metodo

En una relacion de 4:1 aproximadamente 200 mg de calfodipir (CaDPDP) y 50 mg de mangafodipir (MnDPDP) se pesaron en un vial de 40 mL y se disolvieron en 40 mL de agua DI a temperatura ambiente para generar una disolucion amarilla. La disolucion acuosa amarilla se seco por pulverizado usando un Mini-Secador por pulverizado B-290 Buchi mientras estaba unido al deshumidificador B-296 Buchi como un acondicionador de aire permitiendo la entrada de aire del laboratorio. Los experimentos de optimizacion del secado por pulverizado se realizaron a elevadas temperaturas de entrada (220°C) con velocidades de alimentacion variables (20, 30, 40, 50 y 60%). La recuperacion de producto oscilo de 180-230 mg.

Resultados

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Los materiales resultantes se analizaron por XRPD (Figura 2) que indico que todos los productos eran amorfos y se mostro que absorben agua rapidamente, formando partfculas condensadas y/o solidos pegajosos en las 24 h de exposicion a 25°C/60% de HR y 40°C/75% de HR.

Ejemplo 3

Este ejemplo elucida la estructura de la nueva entidad qmmica calmangafodipir haciendo uso de: espectroscopia de absorcion infrarroja; espectroscopia de masas; y analisis elemental. El analisis RMN no puede utilizarse para el analisis de calmangafodipir debido a la naturaleza paramagnetica del Mn.

Metodos

Los analisis descritos en este ejemplo se realizaron en un producto producido segun el metodo de una etapa descrito en esta memoria. El producto se identifica como lote num. 7755-C-R0-01-30-01, y se preparo esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Una parte de este producto se ha certificado como un patron de referencia para el calmangafodipir.

Espectroscopia de absorcion infrarroja. El espectro de absorcion infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR) del calmangafodipir, lote num. 7755-C-R0-01-30-01 se obtuvo usando reflexion total atenuada (RTA) en un espectrometro Thermo-Nicolet Avatar 370.

Espectroscopia de masas. El espectro de masas del calmangafodipir, lote num. 7755-C-R0-01-30-01, se adquirio en un sistema Micro MS/MS Q-Tof Waters. La ionizacion por electropulverizado (IEP) (modo polaridad de ion positivo) se eligio para el analisis MS. La muestra se disolvio en una disolucion de acetonitrilo/agua 50:50 + acido formico al 0,1% a una concentracion de 10 pg/mL. La disolucion se infundio directamente en la fuente a una velocidad de 10 pL/minuto.

Analisis elemental. El calmangafodipir lote num. 7755-C-R0-01-30-01 se fabrico usando una relacion molar de Ca/Mn de 4,26 y 2,8 moles de Na/mol de fodipir. El contenido de metales teorico del complejo con esta composicion es 1,41% de Mn, 4,38% de Ca y 8,69% de Na.

Resultados

El espectro de absorcion infrarroja se muestra en la Fig. 3, y las bandas de absorcion infrarroja caractensticas (numero de onda) y las asignaciones correspondientes son como sigue:

Numero de onda (cm'1)

Asignacion

3250

N-H

3027 - 2848

C-H

1581

C=O

1528

C=C

1471, 1437

CH2, CH3

1383

CH3

1277

P=O

1092

P-OH

1038, 977, 933, 913

P-O-C

827, 813, 770, 751

C-H aromatico

El espectro de masas y un espectro de masas expandido de la muestra se muestran en las Figs. 4A y 4B, respectivamente. El espectro presenta como los de calfodipir y mangafodipir superpuestos el uno con el otro. La masa exacta de calfodipir totalmente protonado es 676 y se observa una masa de 677 para [M+1]. Las masas exactas para monosodio, disodio, trisodio y tetrasodio son 698, 720, 742 y 764, respectivamente. El espectro muestra [M+1] para cada especie a 699, 721, 743 y 765, respectivamente. La masa exacta de mangafodipir totalmente protonado es 691, con las correspondientes especies de monosodio, disodio trisodio, trisodio y tetrasodio a 713, 735, 757 y 779, respectivamente. El espectro muestra masas a 692, 714, 736, 758 y 780 para [M+1] para cada especie.

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Los resultados del contenido de metales para el lote num. 7755-C-R0-01-30-01 fueron 1,48% de Mn, 4,44% de Ca y 8,56% de Na y estan de acuerdo con los valores esperados, confirmando que tanto el manganeso como el calcio estan complejados, con sodio como contraion, y que poco o nada del calcio esta presente simplemente como un contraion.

Conclusion

Estos resultados son coherentes con la estructura mostrada en la Fig. 5. La Fig. 5 muestra la relacion ideal y generica de Ca/Mn 4:1 con 3 Na como contraiones, que da el peso molecular de 745,43 mostrado en la Fig. 5. El peso molecular promedio para el material preparado como se describe y se estudia en este Ejemplo tiene una relacion de Ca/Mn de 4,26 y 2,8 Na como contraiones, que tiene un peso molecular de 740,89.

Ejemplo 4

Este ejemplo midio la excrecion de manganeso (Mn) y zinc (Zn) de orina en animales que reciben calmangafodipir o mangafodipir, a dosis equimolares de Mn.

Metodo

Ocho ratas Wistar macho (aproximadamente 250 g) se inyectaron de forma intravenosa, por medio de una de las venas de la cola, con 0,25 ml de una disolucion de calmangafodipir 50 mM (lote num. 11AK0105B), que contema aproximadamente Mn 10 mM y Ca 40 mM, o 0,25 ml de mangafodipir 10 mM (lote num. 02090106), que contema Mn 10 mM. Despues de la inyeccion, las ratas se colocaron inmediatamente en jaulas metabolicas para la recogida de orina durante un periodo de 0-24 horas. Para obtener el contenido basal de manganeso (Mn) y zinc (Zn) en la orina, dos ratas adicionales (control) recibieron 0,25 ml de solucion salina y se colocaron en jaulas metabolicas para la recogida de orina durante el mismo periodo de tiempo. Las muestras de orina se almacenaron entonces a -80°C hasta el analisis de Mn. Antes de analisis, las muestras se descongelaron y se agitaron extensamente para obtener muestras homogeneas. Una alfcuota de cinco ml se tomo de cada muestra y se anadieron 5 ml de acido mtrico concentrado. Las muestras se resolvieron despues en un horno microondas y a partir de aim se diluyeron con agua destilada a un volumen final de 50 ml. El contenido en Mn de cada muestra se analizo por ICP-MS (espectrometna de masas con plasma acoplado de forma inductiva). Muestras identicas de calmangafodipir y mangafodipir como las inyectadas en las ratas (es decir, 0,25 ml) se retiraron y se inyectaron en tubos de ensayo. Estas muestras se trataron de forma identica a las de las muestras de orina y se analizaron por su contenido en Mn. Los resultados se presentan como contenido de Mn en orina de 0-24 h total (expresado como pmol/kg ± EEM) y como porcentaje (± EEM) de la dosis inyectada. La diferencia estadfstica entre los animales que recibieron calmangafodipir y mangafodipir, con respecto a la excrecion de manganeso en la orina, se ensayo mediante un ensayo t de Student no pareado. Un valor p menor que 0,05 se considero como una diferencia estadfsticamente significativa.

Resultados

Los resultados se presentan en las Figs. 6A, 6B y 6C. Veinticuatro horas despues de la inyeccion iv de 0,25 ml de mangafodipir 10 mM que contema 2,59 pmoles de manganeso (Mn), se recuperaron 0,60±0,04 pmoles de Mn en la orina (Fig. 6A), que correspondio a 23,1±1,4% de la dosis inyectada (despues de que la excrecion basal de 0,035 pmoles se ha restado, Fig. 6B). La correspondiente figura despues de la inyeccion de 0,25 ml de calmangafodipir 50 mM que contema 2,52 pmoles de Mn fue 1,27±0,07 pmoles de Mn (Fig. 6a), que correspondfa a 50,5±2,6% de la dosis inyectada (Fig. 6B). La diferencia entre mangafodipir y calmangafodipir fue altamente significativa (p<0,0001). La diferencia en la excrecion de Mn renal se reflejo mas o menos en la diferencia en la excrecion renal de zinc (Zn); expresada como excrecion de Zn aumentada, es decir, la excrecion de 24 h basal (0,068 pmoles) se resta (Fig. 6C).

Conclusion

Por consiguiente, a una dosis equivalente de Mn, el calmangafodipir doblo la excrecion de Mn en la orina en comparacion con el mangafodipir. El porcentaje de Mn excretado en la orina durante 0-24 h despues de la inyeccion intravenosa de mangafodipir corresponde muy bien con las figuras presentadas anteriormente en ratas (Hustvedt et al., 1997) y seres humanos (Toft et al., 1997). Los presentes resultados demuestran que el calmangafodipir libera mucho menos Mn en condiciones in vivo que el mangafodipir. Esto proporciona ventajas significativas en que la cantidad de Mn libre disponible para la absorcion por el cerebro y otros organos se reduce y que el mdice terapeutico se aumenta significativamente ya que mas del mangafodipir terapeutico o sus contrapartes desfosforiladas, MnDPMP y MnPLED, estan disponibles in vivo. Por consiguiente, el calmangafodipir da un tratamiento terapeutico considerablemente menos toxico y mucho mas eficaz que el del mangafodipir.

Ejemplo 5

Este ejemplo compara el efecto citoprotector del calmangafodipir con el del mangafodipir y MnPLED con respecto a los efectos mielosupresores de la oxaliplatina en ratones balb/c.

Metodo

En una primera serie de experimentos, 3 grupos en que cada uno consistfa en 5 ratones balb/c hembras se trataron una vez de forma intraperitoneal con oxaliplatina a 7,5, 10,0 y 12,5 mg/kg de oxaliplatina, respectivamente. Un dfa antes (lmea base) ademas de 3 y 6 dfas despues del tratamiento de oxaliplatina se tomaron 50 pl de muestras de sangre EDTA desde el plexo venoso orbital con un capilar de vidrio. Las muestras de sangre se analizaron usando el 5 sistema automatizado CELL-DYN® Emerald (Abbott Diagnostics) para el contenido de globulos blancos (WBC), linfocitos (LYM), neutrofilos (NEU) y plaquetas (PLC). A partir de los resultados (Figs. 7A-7D) se concluyo que debenan realizarse experimentos adicionales que prueben los efectos mieloprotectores del calmangafodipir, mangafodipir y MnPLED a 12,5 mg/kg de oxaliplatina y que los analisis de la muestra de celulas sangumeas debena realizarse el dfa antes y 6 dfas despues de la administracion de oxaliplatina en cada raton. Treinta minutos antes de la administracion 10 de oxaliplatina (12,5 mg/kg) y 24 horas despues, los ratones recibieron solucion salina, calmangafodipir (5 mg/kg; lote num. 11AK0105B), mangafodipir (1 y 10 mg/kg; lote num. 02090106) o MnPLED (1 mg/kg), de forma intravenosa (5 ratones en cada grupo). Una dosis de 5 mg/kg de calmangafodipir contema la misma cantidad de manganeso que la de 1 mg/kg de mangafodipir, es decir, 1,3 pmoles; 1 mg/kg de MnPLED contema algo mas manganeso (aproximadamente 2 pmoles). Un grupo de control recibio en vez de oxaliplatina vehmulo (5% de glucosa) y solucion 15 salina. Los resultados se presentan en graficos como cambios relativos de la lmea base para los diversos tratamientos y celulas sangumeas (± EeM). Las diferencias estadfsticas entre los grupos de tratamiento, donde sea apropiado, se ensayaron mediante un ensayo t de Student no pareado. Un valor p menor que 0,05 se considero como una diferencia estadfsticamente significativa.

Resultados

20 Los resultados se presentan en las Figuras 8A-8D. A una dosis de manganeso equivalente, es decir, 5 mg/kg de calmangafodipir fue estadfsticamente significativa mas eficaz que 1 mg/kg de mangafodipir para proteger a los ratones de la cafda inducida por oxaliplatina en el numero total de globulos blancos (WBC) (Fig. 8A). Una unica dosis de 12,5 mg/kg de oxaliplatina provoco que los WBC cayeran mas del 80%, mientras que la cafda en animales tratados con calmangafodipir fue solo de aproximadamente 25%. La cafda correspondiente en ratones tratados con 1 o 10 mg/kg 25 de mangafodipir fue alrededor del 50%. Estos resultados presumiblemente sugieren tambien que el MnDPDP tiene que desfosforilarse en MnPLED antes de que pueda ejercer efectos mieloprotectores; 1 mg/kg de MnPLED era, como el calmangafodipir, significativamente mas eficaz que 1 y 10 mg/kg de mangafodipir protegiendo los WBC. Se vieron cafdas similares en los linfocitos (LYM; Fig. 8B) y en los neutrofilos (NEU; Fig. 8C) despues del tratamiento de oxaliplatina. Tambien se obtuvieron resultados cualitativamente similares cuando se analizaron los neutrofilos (NEU) 30 (Fig. 8C). Con relacion a las plaquetas (PLC; Figs. 7D y 8D, en comparacion con los WBC, LYM y NEU difirieron tanto en la sensibilidad hacia la oxaliplatina como en los efectos citoprotectores de las sustancias de ensayo.

Conclusion

El calmangafodipir era a una dosis de manganeso equimolar significativamente mas potente que el mangafodipir para proteger ratones balb/c frente a los efectos mielosupresores del farmaco anticancengeno oxaliplatina.

35 Ejemplo 6

La actividad citotoxica en celulas de cancer de colon murinas de calmangafodipir se comparo con la del mangafodipir, fodipir, MnPLED, ZnPLED, ZnDPDP, calfodipir (CaDPDP), PLED y CaCh.

Metodo

La viabilidad de las celulas se midio usando el ensayo MTT. Brevemente, 8.000 celulas CT26 (carcinoma de colon de 40 raton) se sembraron por pocillo en un plato de 96 pocillos y se dejaron crecer durante la noche en medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 que contema suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 Ul/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina a 37°C en aire humidificado con CO2 al 5%. Las celulas se expusieron entonces durante 48 h a calmangafodipir 1-1.000 pM (lote num. 11AK0105B), fodipir (DPDP: lote num. RDL02090206), PLED (lote num. KER-AO-122(2)), calfodipir (CaDPDP), mangafodipir (lote num. 02090106), MnPLED, ZnPLED ZnDPMP y CaCh a 45 37°C. La viabilidad de las celulas se evaluo entonces anadiendo 5 mg/ml de metiltiazoltetrazolio (MTT) a una

concentracion final de 0,5 mg/ml e incubando celulas durante unas 4 h mas a 37°C. El formazan azul que se forma mediante deshidrogenasas mitocondriales de celulas viables se disolvio entonces durante la noche a 37°C anadiendo SDS al 10% y HCl 10 mM a una concentracion final de SDS al 5% y HCl 5 mM. Finalmente, la absorbancia de la disolucion se leyo a 570 nm con una referencia a 670 nm en un lector de microplato Spectramax 340 (Molecular 50 Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) conectado a un ordenador Apple Macintosh que ejecuta el programa Softmax Pro V1.2.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).

Resultados

La actividad citotoxica de fodipir, PLED, calfodipir o calmangafodipir fue aproximadamente 20 veces mayor que la del mangafodipir (Figs. 9A y 9B). El MnPLED fue casi 10 veces mas potente que el mangafodipir en su capacidad para 55 matar celulas cancengenas CT26 (Fig. 9A). Ni ZnDPDP, ZnPLED ni CaCh presentaron ninguna actividad citotoxica en absoluto a las concentraciones usadas (Figs. 9A y 9B).

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Conclusion

Cuando se compararon calmangafodipir y mangafodipir, se encontro que el calmangafodipir era aproximadamente 20 veces mas potente que el mangafodipir para matar celulas cancengenas CT26. La disociacion de manganeso en algun grado desde fodipir probablemente explica la eficacia de la muerte del cancer del mangafodipir. El calmangafodipir como se define en los Ejemplos 1 y 3, a concentraciones equimolares de manganeso, es por otro lado tan eficaz como el fodipir solo, es decir, la eficacia de la muerte del calmangafodipir es mucho mayor que la del mangafodipir a concentraciones equimolares de manganeso. Este descubrimiento sugiere dos propiedades importantes. En primer lugar, el PLED desfosforilado es probablemente tan eficaz como su contraparte fosforilada fodipir con respecto a su capacidad de matar celulas cancengenas, y en segundo lugar, la menor estabilidad del MnPLED en comparacion con la del mangafodipir (Rocklage et al., 1989) probablemente explica la mayor eficacia de MnPLED. La falta de cualquier actividad citotoxica de ZnDPDP y ZnPLED es presumible debido a la estabilidad 1000 veces mayor de estos complejos en comparacion con sus contrapartes de manganeso (Rocklage et al., 1989).

Ejemplo 7

Este ejemplo compara la actividad antitumoral de la oxaliplatina en un modelo de raton que lleva cancer de colon murino (CT26) en presencia y ausencia de calmangafodipir.

Metodo

Las celulas CT26 se cultivaron en matraces de cultivo de 75 cm2 en medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 que contema suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 Ul/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina a 37°C en aire humidificado con CO2 al 5%. Cuando las celulas alcanzaron ~50% de confluencia se cosecharon por tripsinizacion. Brevemente, las celulas se lavaron con solucion salina basada en fosfato (PBS) (pH 7,3) y se expusieron a 0,05% de tripsina/EDTA 0,53 mM a 37°C durante ~5 min. La tripsinizacion se paro anadiendo medio de cultivo RPMI 1640. Las celulas se contaron y se centrifugaron a 200xg durante 5 min. A partir de ahn, se lavaron en PBS, se centrifugaron de nuevo y se suspendieron de nuevo en PBS a una concentracion de 2x106/350 pl por inyeccion en ratones. Se usaron ratones hembra balb/c de entre 6 y 8 semanas de edad, como se describe por Laurent et al., 2005. Brevemente, cada raton se inyecto de forma subcutanea en la parte de atras del cuello con 2 x 106 de celulas CT26 en el dfa 0. Despues de 7 dfas (dfa 7) cuando los tumores eran detectables, el tamano del tumor se determino con un calibrador y los ratones se agruparon (5 en cada grupo) de manera que los tamanos de los tumores no eran estadfsticamente diferentes por grupo. Se inyecto oxaliplatina ± calmangafodipir (lote num. 11AK0105B) y un grupo de ratones recibio solo tratamiento con vehnculo (solucion salina al 0,9% + glucosa al 5%). En una primera serie de experimentos, los ratones se inyectaron i.v. con solucion salina o 50 mg/kg de calmangafodipir 30 minutos antes de la administracion i.p. de 20 mg/kg de oxaliplatina (diluida en glucosa al 5%) o glucosa al 5%. Estos ratones recibieron ademas solucion salina o 50 mg/kg de calmangafodipir 24 horas despues (dfa 8). En otra serie de experimentos, los ratones se inyectaron i.v. con solucion salina o 5 mg/kg de calmangafodipir 30 minutos 10 mg/kg de oxaliplatina (diluida en glucosa al 5%) o glucosa al 5%, y solucion salina o 5 mg/kg de calmangafodipir 24 horas despues (dfa 8). Los ratones se sacrificaron en el dfa 10 y los tumores se extirparon y se determinaron los pesos humedos. Las diferencias estadfsticas entre grupos de tratamiento, donde sea apropiado, se ensayaron mediante un ensayo t de Student no pareado. Un valor p menor que 0,05 se considero como una diferencia estadfsticamente significativa.

Resultados

Los resultados se describen en las Figs. 10A y 10B. En la primera serie del experimento los ratones recibieron 20 mg/kg de oxaliplatina, que esta cerca de la mayor dosis tolerada. El tratamiento unico con oxaliplatina dio por resultado una reduccion estadfsticamente significativa y mayor que 50% en el peso tumoral. El tratamiento con calmangafodipir (50 mg/kg) no tuvo ninguna influencia negativa en el efecto antitumoral de la oxaliplatina a una dosis alta (Fig. 10A). Sin embargo, en una segunda serie de experimentos en que se usaron 10 mg/kg de oxaliplatina, el tratamiento con una dosis relativamente baja de calmangafodipir (5 mg/kg) dio por resultado un efecto antitumoral mejor estadfsticamente significativo (Fig. 10B); el efecto combinado de 10 mg/kg de oxaliplatina mas 5 mg/kg de calmangafodipir fue casi tan eficaz como 20 mg/kg de oxaliplatina sola.

Conclusion

El calmangafodipir no interfirio de forma negativa con la actividad antitumoral de la oxaliplatina, y, por el contrario, a una dosis relativamente baja de oxaliplatina (10 mg(kg), el calmangafodipir en realidad aumento la eficacia antitumoral.

Ejemplo 8

Este ejemplo compara los niveles de manganeso despues de repetidas inyecciones intravenosas de calmangafodipir y mangafodipir (39 veces durante 33 semanas) en el cerebro, pancreas e hngado de rata.

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Metodo

Ratas macho y hembra Wistar se inyectaron de forma intravenosa con o bien NaCI al 0,9%, 72,0 pmoles/kg de mangafodipir (lote num. 02090106; que corresponde a 72 pmoles/kg de manganeso) o 374,4 pmoles/kg de calmangafodipir (lote num. 11AK0105B; que corresponde a 72 pmoles/kg de manganeso) 3 veces a la semana durante 13 semanas (cada grupo de tratamiento consistio en 9 machos + 9 hembras). Cada dosis de calmangafodipir correspondio a aproximadamente 36 veces la dosis clmica asumida (DCA). Despues del periodo de administracion de 13 semanas, las ratas se sacrificaron y los cerebros y pancreas se diseccionaron y aproximadamente 0,5 g de muestras se almacenaron congeladas hasta el analisis de Mn. El contenido de Mn de cada muestra se analizo por ICP-MS. Los resultados se expresan como pg/g de peso humedo ± EEM. La diferencia estadfstica entre el grupo de mangafodipir y el grupo de calmangafodipir, con respecto al contenido de Mn, se ensayo mediante un ensayo de t de Student no pareado. Un valor de p menor de 0,05 se consideraba como una diferencia estadfsticamente significativa.

Resultados

Los resultados se describen en las Figs. 11A-C. El contenido en el cerebro de Mn en ratas de control tratadas con NaCl, ratas tratadas con mangafodipir y ratas tratadas con calmangafodipir fue 0,38 ± 0,01, 0,99 ± 0,02 y 0,74 ± 0,01 pg/g p.p., respectivamente. El contenido de Mn correspondiente en el pancreas fue 1,66 ± 0,06, 5,54 ± 0,45 y 3,35 ± 0,19 pmoles/kg, respectivamente. Sin embargo, el contenido en Mn del Imgado estaba significativamente elevado de forma estadfstica en el grupo (Fig. 11C), la elevacion relativa fue mucho menor que las vistas en el cerebro y el pancreas.

Conclusion

La administracion de una dosis alta acumulada de calmangafodipir en ratas da por resultado la retencion menos significativa de manganeso en el cerebro y el pancreas en comparacion con mangafodipir (la dosis total en ambos casos correspondio a aproximadamente 2800 pmoles/kg de manganeso. Estos resultados demuestran el perfil toxicologico mejorado de calmangafodipir en comparacion con el del mangafodipir.

Ejemplo 9

Este ejemplo muestra el efecto citoprotector del calmangafodipir con respecto a los efectos mielosupresores de la carboplatina en ratones balb/c.

Metodo

En una primera serie de experimentos, 3 grupos, cada uno que consiste en 5 ratones balb/c hembra, se trataron una vez de forma intraperitoneal con carboplatina a 75, 100 y 125 mg/kg de carboplatina, respectivamente. Un dfa antes (lmea base), ademas de 3 y 6 dfas despues, el tratamiento de carboplatina, se tomaron muestras de sangre 50 pl de EDTA sangre del plexo venoso orbital con un vidrio capilar. Las muestras de sangre se analizaron usando el sistema automatizado CELL-DYN® Emerald (Abbott Diagnostics) para el contenido de globulos blancos (WBC), linfocitos (LYM), neutrofilos (NEU) y plaquetas (PLC). A partir de los resultados (Figs. 12A-12D), se concluyo que debenan realizarse mas experimentos que prueben el efecto mieloprotector del calmangafodipir a 125 mg/kg de carboplatina y que, en caso de WBC, NEU y LYM, debenan realizarse analisis de celulas sangumeas el dfa antes y 3 dfas despues de la administracion de carboplatina, y, en caso de PLC, el analisis de la muestra de celulas sangumeas debena realizarse el dfa antes y 6 dfas despues de la administracion de carboplatina. Treinta minutos antes de la administracion de carboplatina (125 mg/kg) y 24 horas despues, los ratones recibieron solucion salina de calmangafodipir (1, 3, 10 o 30 mg/kg; lote num. 11AK0105B). Un grupo de control recibio vehmulo (solucion salina) y solucion salina en vez de carboplatina. Los resultados se presentan en graficos como cambios relativos desde la lmea base para los diversos tratamientos (media ± EEM). Las diferencias estadfsticas entre los grupos de tratamiento, donde sean apropiadas, se ensayaron mediante una prueba de t de Student no pareado. Un valor p menor que 0,05 se considero como una diferencia estadfsticamente significativa.

Resultados

Los resultados se describen en las Figs. 13A-13D. La carboplatina (125 mg/kg) provoco una disminucion de aproximadamente 50% en WBC, ademas de en NEU y LYM. El tratamiento con calmangafodipir a una dosis de 3 mg/kg abolio estas disminuciones. La respuesta a la dosis de calmangafodipir presento una apariencia en forma de campana en cada caso, de una forma similar a como se describio previamente para el mangafodipir con respecto a su efecto cardioprotector frente a la doxorubicina en ratones CD (Kurz et al., Transl Oncol 2012; 5:252-259).

Respecto a las plaquetas (PLC, Figs. 12D y 13D), en comparacion con WBC, LYM y NEU, difieren en la sensibilidad frente a la carboplatina.

Conclusion

El calmangafodipir protege profundamente a los ratones balb/c frente a los efectos mielosupresores del farmaco anticancengeno carboplatina.

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Ejemplo 10

Este ejemplo compara la actividad antitumoral de la oxaliplatina en ratones balb/c inmunocompetentes que portan cancer de colon (CT26) y ratones balb/c desnudos inmunodeficientes (nu/nu) en presencia y ausencia de calmangafodipir.

Metodo

Las celulas CT26 se cultivaron en matraces de cultivo de 75 cm2 en medio RPMI 1640 que contema suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 Ul/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina a 37°C en aire humidificado con CO2 al 5%. Cuando las celulas alcanzaron la confluencia al ~50% se cosecharon por tripsinizacion. Brevemente, las celulas se lavaron con PBS (pH 7,3) y se expusieron a tripsina al 0,05%/EDTA 0,53 mM a 37°C durante ~5 min. La tripsinizacion se paro anadiendo medio de cultivo RPMI 1640. Las celulas se contaron y se centrifugaron a 200xg durante 5 min. A partir de aim, se lavaron en PBS, se centrifugaron de nuevo y se suspendieron de nuevo en PBS a una concentracion de 2 x 106/350 pl para la inyeccion en el raton. Se usaron ratones hembra balb/c inmunocompetentes (balb/c) y ratones balb/c hembra desnudos inmunoincompetentes (balb/c nu/nu) de entre 6 y 8 semanas de edad, como se describe por Laurent et al., 2005. Brevemente, cada raton se inyecto de forma subcutanea en la parte trasera del cuello con 2x106 de celulas CT26 en el dfa 0. Despues de 7 dfas (dfa 7) cuando los tumores fueron detectables, el tamano del tumor se determino con un calibrador y los ratones se agruparon (5 en cada grupo) de manera que los tamanos de los tumores no eran diferentes estadfsticamente por grupo. Los grupos de ratones (5 en cada grupo, como se ilustra en la Fig. 14) se inyectaron i.v. con solucion salina o 5 mg/kg de calmangafodipir (lote num. 11AK0105B) 30 minutos antes de la administracion i.p. de 10 mg/kg de oxaliplatina (diluida en glucosa al 5%) o glucosa al 5%. Los ratones recibieron ademas solucion salina o 5 mg/kg de calmangafodipir 24 horas mas tarde (dfa 8). Los ratones se sacrificaron en el dfa 10 y los tumores se extirparon y se determinaron los pesos humedos. Los resultados se presentan en un grafico para los diversos tratamientos (media ± EEM). Las diferencias estadfsticas entre los grupos de tratamiento, donde era apropiado, se probaron mediante un ensayo de t de Student no pareado. Un valor p menor que 0,05 se considero una diferencia estadfsticamente significativa.

Resultados

Los resultados se describen en la Fig. 14. Hubo una clara tendencia a que los tumores crecieran mas grandes en los ratones balb/c inmunodeficientes que en ratones nu/nu balb/c inmunocompetentes pero esta diferencia no alcanzo significacion estadfstica (p=0,0870). Un unico tratamiento con 10 mg/kg de oxaliplatina dio por resultado una reduccion de 20 a 30% estadfsticamente insignificante en pesos tumorales en ratones balb/c inmunocompetentes e inmunodeficientes. El tratamiento con 5 mg/kg de calmangafodipir no tuvieron ninguna influencia negativa en el efecto antitumoral de oxaliplatina ni en los ratones inmunocompetentes ni en los inmunoincompetente. De hecho el peso tumoral medio se redujo estadfsticamente de forma significativa en los ratones inmunocompetentes tratados con 5 mg/kg de calmangafodipir en comparacion con los controles. Sin embargo, no se vio dicha reduccion en los ratones inmunodeficientes.

Conclusion

El calmangafodipir no interfirio de forma negativa con la actividad antitumoral de la oxaliplatina ni en los ratones inmunocompetentes ni en los inmunodeficientes pero fue solo en los ratones inmunocompetentes que el calmangafodipir aumento de hecho la eficacia antitumoral.

Ejemplo 11

La actividad citotoxica del calmangafodipir hacia las celulas U1810 de cancer de pulmon de celulas no pequenas (CPCNP) y cancer de pulmon de celulas no pequenas murina (LLC1) se comparo con la del mangafodipir.

Metodos

La viabilidad de las celulas se midio usando el ensayo MTT. Brevemente, 8.000 celulas de CPCNP U1810 o CPCNP LLC1 humanas se sembraron por pocillo en un plato de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche en medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 que contema suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 Ul/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina a 37°C en aire humidificado con CO2 al 5%. Las celulas se expusieron entonces durante 48 h a calmangafodipir 1-1.000 pM (lote num. 11AK0105B) o mangafodipir (lote num. 02090106). La viabilidad de las celulas se evaluo despues anadiendo 5 mg/ml de metiltiazoltetrazolio (MTT) a una concentracion final de 0,5 mg/ml e incubando celulas durante una 4 h mas a 37°C. El formazan azul que esta formado por deshidrogenasas mitocondriales de celulas viables se disolvio entonces toda la noche a 37°C anadiendo SDS al 10% y HCl 10 mM a una concentracion fina de SDS al 5% y HCl 5 mM. Finalmente, la absorbancia de la disolucion se leyo a 570 nm con una referencia a 670 nm en un lector de microplato Spectramax 340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) conectado con un ordenador Apple Macintosh que ejecuta el programa Softmax Pro V1.2.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). La viabilidad de las celulas U1810 o LLC1 en presencia de concentraciones crecientes de calmangafodipir o mangafodipir se presenta como curvas de respuesta a la concentracion (media ± EEM). Las curvas individuales se ajustan a la ecuacion logfstica de respuesta con pendiente variable sigmoidal

(Graphpad Prism, version 5.02). A partir de este analisis se calcularon las concentraciones que provocan una inhibicion del 50% (CI50) de las sustancias de ensayo.

Resultados

La actividad citotoxica del calmangafodipir y mangafodipir hacia celulas CPCNP U1810 y LLC1 se muestra en las Figs. 5 15A y 15B. La relacion CI50 calculada entre mangafodipir y calmangafodipir (0,0006329/0,00002274) mostro que el

calmangafodipir era aproximadamente 28 veces mas potente que el mangafodipir para matar celulas U1810 (Fig. 15A). Aunque el calmangafodipir era significativamente mas potentes que el mangafodipir para matar celulas LLC1, por la apariencia ambigua de la curva de mangafodipir (Fig. l5B) no fue significativo para calcular una relacion de CI50 entre mangafodipir y calmangafodipir.

10 Conclusiones

Los resultados demuestran que la eficacia superior del calmangafodipir en comparacion con el mangafodipir para matar celulas de cancer de pulmon de celulas no pequenas, U1810 y LLC1.

Los ejemplos y realizaciones espedficas descritas en esta memoria son ilustrativos por naturaleza solo y no se van a tomar como limitantes del alcance de la invencion definida por las siguientes reivindicaciones. Realizaciones 15 espedficas y ventajas adicionales de la presente invencion seran evidentes a partir de la presente descripcion y estan dentro del alcance de la invencion reivindicada.

Claims (16)

1. 5

   10

   15

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   30

   REIVINDICACIONES

   1. Un complejo metalico mixto de un compuesto de Formula I, o una sal del mismo, en donde los metales mezclados comprenden calcio y manganeso, en donde la relacion molar de calcio a manganeso es 1-10:

   Formula I

   imagen1

   En donde

   X representa CH o N,

   Cada R1 representa independientemente -CH2COR5;

   R5 representa hidroxi;

   Cada R2 representa independientemente ZYR6 en donde Z representa un enlace o un grupo seleccionado de CH2, (CH2)2, CO, CH2CO, CH2CH2CO y CH2COCH2;

   Y representa un enlace;

   R6 es un grupo alquilo mono- o poli(hidroxi o alcoxilado) o de la formula OP(O)(OR8)R7;

   R7 es hidroxi, o un grupo alquilo o aminoalquilo no sustituido;

   R8 es un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo opcionalmente hidroxilado, opcionalmente alcoxilado;

   R3 representa etileno; y

   Cada R4 representa independientemente hidrogeno o alquilo C1-3.
2. 2. Un complejo metalico mixto segun la reivindicacion 1, en donde el compuesto de Formula I es acido N,N'-bis- (piridoxal-5-fosfato)-etilendiamina-N,N'-diacetico (DPDP) o acido N,N'-dipiridoxiletilendiamina-N,N'-diacetico (PLED), o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
3. 3. Un complejo metalico mixto segun la reivindicacion 1 o 2, que tiene una relacion molar de Ca2+/Mn2+ de 4.
4. 4. Un complejo metalico mixto segun la reivindicacion 1, en donde el complejo metalico mixto es un complejo metalico mixto de una sal sodica de acido N,N'-bis-(piridoxal-5-fosfato)-etilendiamina-N,N'-diacetico (DPDP) y en donde la relacion molar de calcio a manganeso es 4:1.
5. 5. Una composicion farmaceutica formada suspendiendo o disolviendo un complejo metalico mixto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en un medio lfquido, opcionalmente con uno o mas excipientes fisiologicamente aceptables.
6. 6. Un metodo de produccion de un complejo metalico mixto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una cristalizacion de una etapa a partir de una disolucion de calcio, manganeso y un compuesto de Formula I, o una sal del mismo.
7. 7. Un complejo metalico mixto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para usar como un medicamento, preferiblemente para el tratamiento de un proceso patologico.
8. 8. Un complejo metalico mixto segun la reivindicacion 7, en donde el proceso patologico esta provocado por la presencia de radicales libres derivados de oxfgeno o por superoxido que da por resultado la posterior peroxidacion iipfdica y/o nitracion de protema.

   5

   10

   15

   20

   25
9. 9. Un complejo metalico mixto segun la reivindicacion 7, en donde el proceso patologico es una lesion relacionada con el tratamiento con farmaco citotoxico o citostatico, preferiblemente una lesion con farmaco para tratamiento del cancer, mas preferiblemente una lesion por farmaco de al menos uno de doxorubicina, epirubicina, oxaliplatina, carboplatina, cisplatina, 5-fluorouracilo, docetaxel o paclitaxel.
10. 10. Un complejo metalico mixto segun la reivindicacion 7, en donde el proceso patologico es mielosupresion o neurotoxicidad o ambas, una lesion inducida por isquemia-reperfusion, asociada con la aterosclerosis y/o diabetes, o asociada con un tratamiento trombolftico, un bypass cardiopulmonar, o angioplastia transluminal percutanea, o un resultado de cirugfa cardiaca o de trasplante de organos, o ictus.
11. 11. Un complejo metalico mixto segun la reivindicacion 7, en donde el proceso patologico es fallo hepatico agudo inducido por acetaminofeno, un proceso patologico de hierro o cobre, talasemia, anemia falciforme, hemosiderosis transfusional, enfermedad de Wilson, cirrosis hepatica inducida por hepatitis, esteatohepatitis no alcoholica (EHNA), hepatitis cronica inducida por virus, una lesion inducida por radiacion o baja actividad de la manganeso superoxido dismutasa (MnSOD).
12. 12. Un complejo metalico mixto segun la reivindicacion 7, en donde el proceso patologico es cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer colorrectal, cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pancreas o melanoma maligno.
13. 13. Un complejo metalico mixto segun cualquiera de las reivindicaciones 7-12, para usar como un medicamento en una cantidad de 0,01 a 50 pmol/kg de peso corporal.
14. 14. Un complejo metalico mixto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 7-12, en donde el complejo metalico mixto se seca por congelacion.
15. 15. Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 5, para usar como un medicamento, preferiblemente para el tratamiento de un proceso patologico.
16. 16. Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 15, en donde el proceso patologico es una lesion relacionada con el tratamiento con farmaco citotoxico o citostatico, preferiblemente una lesion por farmaco para el tratamiento del cancer, mas preferiblemente una lesion por farmaco de al menos uno de doxorubicina, epirubicina, oxaliplatina, carboplatina, cisplatina, 5-fluorouracilo, docetaxel o paclitaxel, o el proceso patologico es fallo hepatico agudo inducido por acetaminofeno.