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ES2677566T3 - Péptidos antiandrógenos y sus usos en la terapia del cáncer - Google Patents

Péptidos antiandrógenos y sus usos en la terapia del cáncer Download PDF

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ES2677566T3
ES2677566T3 ES08717866.1T ES08717866T ES2677566T3 ES 2677566 T3 ES2677566 T3 ES 2677566T3 ES 08717866 T ES08717866 T ES 08717866T ES 2677566 T3 ES2677566 T3 ES 2677566T3
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pro
peptide
seq
cells
lys
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Ferdinando Auricchio
Antimo Migliaccio
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Cancer Research Technology Ltd
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Cancer Research Technology Ltd
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Publication date
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Abstract

Una molécula derivada de péptido aislada o purificada o parcialmente purificada que presenta la fórmula general: X- [(Pro)n-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m- Y (S1) en la que X es H, o un grupo acetilo o cualquier aminoácido natural o secuencia de aminoácidos provista con un grupo NH2 libre o al menos derivado de acetilo; Y es un grupo OH o un grupo NH2; "n" es un número entero de 1 a 10 y "m" es un número entero de 1 a 3; y en la que la secuencia de aminoácidos de la molécula derivada de péptido se selecciona del grupo que consiste en: Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO. 1); Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO. 2); Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO. 3); y Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO. 4).

Description

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DESCRIPCION
Peptidos antiandrogenos y sus usos en la terapia del cancer Antecedentes de la invencion
La presente invencion se refiere a peptidos nativos, mutados espedficamente en sitio y sinteticos que comprenden porciones del receptor de androgenos humano y sus composiciones. La invencion tambien se refiere a anticuerpos producidos contra estos peptidos y polinucleotidos que codifican estos peptidos. Tambien se proporcionan procedimientos para sintetizar derivados de estos peptidos y su uso como composiciones antiandrogenas en el tratamiento y/o prevencion de canceres de prostata y/o mama, preparacion de composiciones farmaceuticas, kits de diagnostico y desarrollo de ensayos relacionados para su uso en terapias anticancerosas.
Estado de la tecnica
Receptor de androgenos en canceres de prostata y mama humanos
El receptor de androgenos (RA) es una protema reguladora transcripcional activada por ligandos que media la induccion del desarrollo y la funcion sexual masculina a traves de su actividad con androgenos endogenos (Roy y col., 1999). Los androgenos son generalmente conocidos como las hormonas sexuales masculinas. Las hormonas androgenicas son esteroides, que se producen en el cuerpo por los testfculos y la corteza de la glandula suprarrenal o se pueden sintetizar en el laboratorio. Los esteroides androgenicos juegan un papel importante en muchos procesos fisiologicos, que incluyen el desarrollo y el mantenimiento de las caractensticas sexuales masculinas tales como masa muscular y osea, crecimiento de la prostata, espermatogenesis y el patron del cabello masculino (Siiteri y Wilson, 1974). Los androgenos esteroideos endogenos incluyen testosterona y dihidrotestosterona (DHT). La testosterona es el principal esteroide secretado por los testfculos y es el androgeno circulante primario que se encuentra en el plasma de las parejas. La testosterona se convierte en DHT mediante la enzima 5-alfa-reductasa en muchos tejidos perifericos. Por lo tanto, se piensa que la DHT sirve como mediador intracelular para la mayona de las acciones de androgenos.
Otros androgenos esteroideos incluyen esteres de testosterona, tales como el cipionato, propionato, fenilpropionato, ciclopentilpropionato, isocarporato, enentato y esteres de decanoato y otros androgenos sinteticos tales como 7- metil-nortestosterona.
Los dos tipos principales de cancer que expresan el receptor de androgenos (RA) son el cancer de prostata y el cancer de mama. Tambien pueden ser positivos a RA otros canceres. El cancer positivo a RA mas comun es el cancer de prostata. Aproximadamente el 80-90 % de los canceres de prostata dependen de androgenos en el momento del diagnostico inicial, y la terapia endocrina del cancer de prostata se dirige hacia la reduccion de los androgenos sericos y la inhibicion de RA (Denis y Griffiths, 2000). Sin embargo, cuando finalmente falla la terapia de ablacion de androgenos, el cancer de prostata progresa a un estado hormonal refractario. RA se expresan a lo largo de la progresion del cancer de prostata y persiste en la mayona de los pacientes con enfermedad refractaria a hormonas (Mohler y col., 1996; van der Kwast y col., 1991; Sadi y col. 1991; Chodak y col. 1992; Hobisch y col., 1996). Ademas, la mayona de los mutantes RA identificados a partir de cancer de prostata refractario a hormonas son capaces de actividad transcripcional. Estas observaciones sugieren que la perdida de la funcion de RA no es una causa importante de fallo de la ablacion de androgenos y que las celulas de cancer de prostata negativas a RA no tienen un crecimiento significativo o una ventaja de supervivencia. En cambio, la evidencia clmica y experimental disponible sugiere que la progresion del cancer de prostata se produce por la alteracion del eje androgenico normal por la mala regulacion de la actividad de RA a traves de cascadas de traduccion de senales, la alteracion en la expresion de correguladores de RA y mutaciones de RA que le permiten volverse transcripcionalmente activo en respuesta a otros ligandos como testosterona y DHT. Aunque los androgenos sericos solos pueden no promover la carcinogenesis de la prostata, la accion androgenica y el estado funcional de los RA son mediadores importantes de la progresion del cancer de prostata. Se ha encontrado que niveles bajos de testosterona serica en hombres con cancer de prostata recientemente diagnosticado y no tratado se correlacionan con mayor expresion de RA, aumento de la densidad de vasos capilares dentro del tumor y mayor puntuacion de Gleason (Schatzl y col., 2002). Analisis recientes de muestras clmicas de cancer de prostata tambien recogidas de pacientes sin tratamiento preoperatorio demostraron que la expresion elevada de RA se correlacionaba con una menor supervivencia sin recidiva y progresion de la enfermedad (Lee, 2003). El tratamiento endocrinologico del cancer de prostata implica principalmente la modulacion de la actividad de RA a traves de la privacion de androgenos testiculares circulantes mediante castracion quirurgica o castracion qmmica con agonistas de estrogenos (dietilestilbestrol) y LHRH (hormona liberadora de hormona luteinizante). La actividad de RA tambien puede bloquearse mediante la administracion de antiandrogenos, ya sean solos o en combinacion con la castracion quirurgica o qmmica (denominado bloqueo combinado de androgenos). Mas del 80 % de los pacientes muestran respuesta positiva a la ablacion androgenica. Sin embargo, los pacientes con cancer de prostata metastasico finalmente experimentan progresion de la enfermedad en una media de 12 a 18 meses despues de la terapia de privacion de androgenos. Los tumores de estos pacientes se consideran refractarios a la hormona. Aunque estos tumores son refractarios en el sentido de que han progresado a pesar de la reduccion del androgeno serico y/o del tratamiento con antiandrogenos, es poco probable que la mayona de estos tumores sean completamente resistentes a los androgenos. En el 97 % de
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los pacientes con cancer de prostata metastasico refractario a hormonas, el tratamiento con androgenos exogenos da lugar a un brote de la enfermedad y una respuesta desfavorable (revisado en Fowler y Whitmore, 1982). La terapia secundaria para pacientes con cancer de prostata refractario a hormonas tambien se dirige predominantemente a la produccion de androgenos y la funcion de RA e incluye la administracion de un antiandrogeno secundario, la inhibicion de la produccion de androgenos suprarrenales y la inhibicion adicional de HL (hormona luteinizante) con progesterona o agentes estrogenicos (Dawson y Vogelzang, 2000). Otros canceres, como el cancer de mama, tambien pueden ser positivos a RA (Moinfar y col., 2003). Los receptores de androgenos se expresan comunmente en el carcinoma ductal de mama in situ, asf como en el carcinoma de mama invasivo. Un numero significativo de carcinomas de mama pobremente diferenciados, siguen siendo positivos al RA, mientras que son negativos al RE (receptor de estrogeno) y negativos al RP (receptor de progesterona). Como el cancer de prostata, el cancer de mama se trata mediante privacion de hormonas, que en este caso, se logra mediante burlando el estrogeno y el receptor de estrogeno. Con el tiempo, el cancer de mama encuentra formas de crecer sin la necesidad de estrogeno y se vuelve letal. Los canceres de mama que se vuelven refractarios a hormonas continuan expresando RA en la mayona de los casos. Aunque la terapia hormonal secundaria tambien puede fallar, la capacidad de las terapias dirigidas a RA para proporcionar un beneficio terapeutico positivo sugiere que la actividad de RA es un mediador importante del crecimiento y la supervivencia del cancer de prostata y de mama.
En este aspecto, la evidencia de que los receptores esteroideos activan las cascadas de transduccion de senales (Migliaccio y col., 1996) abrio una nueva lmea para el tratamiento de estos canceres. Se ha demostrado que los androgenos, asf como los estrogenos, requieren la activacion de la ruta Src/ras/erk para estimular la smtesis de ADN (Migliaccio y col., 2000). Dicha activacion de la ruta se produce tras una interaccion directa de receptores esteroideos con la tirosina-quinasa no receptora Src. Se han identificado los sitios cruciales para estas interacciones.
Terapias actuales
Los antiandrogenos no esteroideos como flutamida (Eulexin®), biclutamida (Casodex®) o nilutamida (Anandron®) se han utilizado en la terapia del cancer de prostata sensible a hormonas. De forma similar, la terapia antiestrogeno por tamoxifeno (Nolvadex®) o ICI 182.780 (Fulvestrant®) se utiliza comunmente en el cancer de mama sensible a hormonas.
Desafortunadamente, estos y otros enfoques similares con frecuencia se vuelven ineficaces debido al desarrollo de resistencia a los farmacos. Ademas, estos compuestos tienen algunos efectos secundarios indeseables, como un mayor riesgo de complicaciones cardiovasculares y, despues del uso cronico, una pequena incidencia incrementada de carcinoma de utero. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de tratar los canceres de prostata y de mama de una manera mas espedfica utilizando compuestos alternativos no toxicos. Recientemente se demostro que el receptor de androgenos estimulado por el factor de crecimiento o la hormona interactua con la tirosina quinasa Src, que induce la proliferacion "in vitro" de celulas de cancer de prostata y mamario (Castoria y col., 1999; Migliaccio y col., 1996; 2000; 2005).
El documento WO 98/46250 desvela peptidos antiestrogenos fosfotirosina o malonil-tirosina caracterizados principalmente por motivos Leu. La presente invencion no se refiere a dichas moleculas.
El documento WO 00/01813 desvela peptidos derivados del aa 234-391 del receptor de androgeno humano. Aunque algunos de los peptidos desvelados comparten alguna similitud de secuencia con las moleculas de la invencion, el documento de la tecnica anterior falla al desvelar la actividad antagonista de dichos peptidos con respecto a la ruta de union/activacion de RA/Src. Ademas, los peptidos desvelados en el documento WO 00/1813 no han demostrado reducir o bloquear el crecimiento de celulas tumorales de prostata o de mama. No se ha demostrado que ejerzan una actividad antitumoral real y aplicable.
Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar peptidos dirigidos a anular la asociacion del receptor de androgenos/Src y el desarrollo de una nueva clase de compuestos para la terapia del cancer de prostata y de mama.
Sumario de la invencion
La presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invencion proporciona una molecula derivada de peptido aislada o purificada o parcialmente purificada que presenta la formula general:
X- [(Pro)n-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m- Y (S1)
en la que X es H, o un grupo acetilo o cualquier aminoacido natural o secuencia de aminoacidos provista con un grupo NH2 libre o al menos derivado de acetilo; Y es un grupo OH o un grupo NH2; "n" es un numero entero de 1 a 10 y "m" es un numero entero de 1 a 3; y en la que la secuencia de aminoacidos de la molecula derivada de peptido se selecciona del grupo que consiste en:
Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO. 1);
Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO. 2);
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Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO. 3); y Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO. 4).
Preferentemente, la molecula derivada de peptido es capaz de inhibir o evitar la interaccion del receptor de androgenos (RA) con el dominio SH3 de la tirosina quinasa Src.
Preferentemente, la molecula derivada de peptido tiene actividad antitumoral in vitro o in vivo.
Preferentemente, la molecula derivada de peptido tiene la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:
Ac-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2;
Ac-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2; Ac-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2; y Ac-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2.
La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad farmaceuticamente aceptable y eficaz de la molecula derivada de peptido como se describe en las reivindicaciones.
Preferentemente, se proporciona la composicion farmaceutica en la que (i) dicho peptido puede unirse a una molecula transportadora tal como BSA o KLH y/o esta comprendido en una composicion lipfdica tal como una partfcula lipfdica, una nanocapsula, un liposoma o vesfculas lipfdicas con un excipiente farmaceutico; y/o (ii) la composicion comprende al menos un segundo agente anticanceroso.
La presente invencion tambien proporciona una molecula derivada de peptido como se describe en las reivindicaciones o una composicion farmaceutica como se describe en las reivindicaciones para su uso como un medicamento.
Preferentemente, la molecula derivada de peptido o la composicion farmaceutica es para su uso como agente antitumoral.
Preferentemente, la molecula derivada de peptido o la composicion farmaceutica es para su uso contra (i) cancer de mama o de prostata y/o (ii) otros canceres que expresan receptores de androgenos solos o junto con receptores de estradiol.
La presente invencion tambien proporciona un uso de la molecula derivada de peptido como se describe en las reivindicaciones para la preparacion de un medicamento.
La presente invencion tambien proporciona un uso de una molecula derivada de peptido como se describe en las reivindicaciones para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de cancer.
Preferentemente, el uso como se describe en las reivindicaciones es en el que el medicamento es para el tratamiento de (i) cancer de mama o de prostata y/o (ii) otros canceres que expresan receptores de androgenos solos o junto con receptores de estradiol.
La presente invencion tambien proporciona un anticuerpo capaz de reconocer espedficamente una molecula derivada de peptido como se describe en las reivindicaciones.
La presente invencion tambien proporciona un kit que comprende un anticuerpo como se describe en las reivindicaciones, unido operativamente a una etiqueta detectable y a reactivos de inmunodeteccion en recipientes unicos o multiples.
La presente invencion tambien proporciona una secuencia de acidos nucleicos que codifica un peptido o un vector recombinante que expresa un peptido como se describe en las reivindicaciones.
La presente invencion tambien proporciona celulas hospedadoras de mairnfero, de ser humano o de bacterias que contienen la secuencia de acidos nucleicos o el vector recombinante como se describe en las reivindicaciones.
La presente invencion tambien proporciona un procedimiento in vitro para matar una celula cancerosa, que incluye una celula de cancer de mama o de prostata, que comprende proporcionar a la celula una molecula derivada de peptido como se describe en las reivindicaciones.
La presente invencion supera las dificultades inherentes en la materia anterior al proporcionar nuevas composiciones y procedimientos in vitro para utilizarse en el tratamiento de canceres de prostata y de mama. La invencion proporciona peptidos sinteticos novedosos, que exhiben actividad del receptor antiandrogeno para utilizarse en terapia o prevencion del cancer de prostata y/o de mama en humanos. Estos peptidos contienen tramos de prolina, que han sido implicados para jugar un papel principal en la interaccion de Ra con el dominio SH3 de la tirosina quinasa Src (Migliaccio y col., 2000) y, potencialmente, otras quinasas de la familia Src. Los dominios SH3 tienen una longitud de 50-70 aminoacidos y se pueden reconocer a menudo en la transduccion de senal eucariota y en
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proternas del citoesqueleto (Kay y col., 2000). Se unen a peptidos ricos en prolina y, a traves de dicha interaccion, juegan un papel importante en la regulacion de la actividad de la quinasa, asf como en la localizacion y el reconocimiento del sustrato. Cada miembro de la familia quinasa Src tiene en su secuencia un dominio SH3. Los miembros de esta familia son nueve (Williams y col., 1998) y otros podnan ser identificados en el futuro. Se ha informado que los receptores de androgenos y de progesterona ocupados por agonistas son capaces de interactuar con el dominio SH3 de Src (Migliaccio y col., 2000; Boonyaratanakornkit y col., 2001). Estas asociaciones probablemente eliminan la accion inhibidora del dominio SH3 y provocan la activacion de Src. Por consiguiente, los peptidos desvelados en la presente invencion se unen al dominio SH3 de Src y evitan que los RA interaccionen con Src y activen la transduccion de senales. Se ha informado que los receptores de androgenos y de estradiol (RE) se asocian en condiciones basales (Migliaccio y col., 2005): cuando uno de los dos receptores se activa mediante un agonista esteroide o un factor de crecimiento, los dos receptores interaction con Src. Por lo tanto, la prevencion de la asociacion de RA con Src tambien evita la asociacion de RE con esta quinasa y la activacion de Src mediante RE. Como consecuencia, los peptidos desvelados en el presente documento tambien tienen una accion antiestrogenica.
Se desvela en el presente documento, pero no se reivindica, una molecula derivada de peptido aislada o purificada o parcialmente purificada que presenta la formula general:
X-[(Pro)n-His-Pro-His-Ala-Arg-IIe-Lys]m-Y (S1)
en la que X es H, o un grupo acetilo o cualquier aminoacido natural o secuencia de aminoacidos provista con un grupo NH2 libre o al menos derivado de acetilo; Y es un grupo OH o un grupo NH2 o cualquier aminoacido o secuencia de aminoacidos con un grupo carboxi-amida C terminal; "n" es un numero entero de 1 a 10 y "m" es un numero entero de 1 a 3.
La molecula derivada de peptido es capaz de inhibir o evitar la interaccion del receptor de androgenos (RA) con el dominio SH3 de la tirosina quinasa Src.
La molecula derivada de peptido tiene una actividad antitumoral in vitro o in vivo.
Las variantes adicionales de estos peptidos tambien son objeto de la presente divulgacion. De hecho, los compuestos derivados de aquellos descritos por la formula S1, y capaces de cumplir funciones biologicas similares pueden idearse (o derivarse) logrando cualquier tipo de duplicacion, triplicacion o, mas en general, multimerizacion de la secuencia de los peptidos lineales desvelados. Como ejemplo, los peptidos desvelados en el presente documento pueden modificarse de acuerdo con los procedimientos informados por Tam y colaboradores (Tam y Spetzler JC, 1997) para la preparacion de multiples peptidos antigenicos o por Mutter y colaboradores para la preparacion de proterna sintetica ensamblada a plantilla (PSEP, Tuchscherer y Mutter, 1996).
Se pueden utilizar las moleculas resultantes para los fines de la presente solicitud como sales trifluoroaceticas, sales de acetato, sales clorhudricas, sales de sulfato y cualquier otra sal derivada de la disolucion en tampones de trabajo utilizados, normalmente, por los expertos en la materia.
Los ejemplos de secuencias polipeptfdicas desveladas en la presente solicitud son las enumeradas en la tabla 1:
Tabla 1.
Secuencia
SEQ. ID NO.
Ac-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2
(SEQ. ID NO.1)
Ac-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2
(SEQ. ID NO.2)
Ac-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2
(SEQ. ID NO.3)
Ac-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2
(SEQ. ID NO.4)
Ac-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-NH2
(SEQ. ID NO.5)
Ac-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2
(SEQ. ID NO.6)
Ac-His-Pro-Lys-Pro-Ala-Arg-Ile-Pro-His-Pro-NH2*
(SEQ. ID NO.7)
* La SEQ ID NO.7 es una secuencia mezclada de SEQ. ID # NO.1
En el presente documento se desvela, pero no se reivindica, una composicion que comprende un peptido aislado entre aproximadamente cuatro y aproximadamente 30 restos de aminoacidos de longitud, en el que el peptido incluye dentro de su secuencia un peptido que tiene la formula general S1 en la que cada aminoacido se puede reemplazar por cualquier derivado o analogo del mismo.
En una realizacion, la invencion se refiere a una composicion que comprende un peptido aislado de entre diez y aproximadamente 50 o mas restos de aminoacidos de longitud, en el que el peptido incluye dentro de su secuencia
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una secuencia de aminoacidos representada por:
Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO.1)
en la que cada aminoacido puede ser reemplazado por cualquier derivado o analogo del mismo.
En una segunda realizacion, la invencion se refiere a una composicion que comprende un peptido aislado de entre veinte y aproximadamente 50 o mas restos de aminoacidos de longitud, en el que el peptido incluye dentro de su secuencia una secuencia de aminoacidos representada por:
Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO.2)
en la que cada aminoacido puede ser reemplazado por cualquier derivado o analogo del mismo.
En una tercera realizacion, la invencion se refiere a una composicion que comprende un peptido aislado de entre catorce y aproximadamente 50 o mas restos de aminoacidos de longitud, en el que el peptido incluye dentro de su secuencia una secuencia de aminoacidos representada por:
Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO.3)
en la que cada aminoacido puede ser reemplazado por cualquier derivado o analogo del mismo.
En una cuarta realizacion, la invencion se refiere a una composicion que comprende un peptido aislado de entre dieciseis y aproximadamente 50 o mas restos de aminoacidos de longitud, en el que el peptido incluye dentro de su secuencia una secuencia de aminoacidos representada por:
Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO.4)
en la que cada aminoacido puede ser reemplazado por cualquier derivado o analogo del mismo.
Las composiciones de peptidos preferidas son aquellas que reducen o inhiben la actividad del receptor de androgenos sobre el crecimiento celular. Los inventores han demostrado que esta reduccion o inhibicion se consigue mediante la reduccion o anulacion de la interaccion de RA con quinasa Src (peptido(s) SH3-aglutinante). Preferentemente, la composicion peptfdica incluye peptidos que tienen una longitud de hasta diez aminoacidos e incluyen aquellos que tienen una longitud de aproximadamente 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 14, 13 o incluso 12 u 11 o mas aminoacidos de longitud.
Se ha demostrado que los peptidos ejemplares de aproximadamente 10, 12, 14, 16 aminoacidos son particularmente eficaces para reducir la actividad de los RA y la smtesis de ADN. Dichos peptidos ejemplares se desvelan en la secuencia SEQ. ID NO.1 a SEQ. ID NO.4.
Los peptidos de la invencion pueden comprender opcionalmente ademas uno o mas aminoacidos en el extremo amino. En el presente documento se desvela, pero no se reivindica, un peptido que ademas puede comprender opcionalmente uno o mas aminoacidos en el extremo carboxi-terminal de los peptidos desvelados, o alternativamente, puede comprender ademas uno o mas aminoacidos en ambos extremos del motivo antiandrogeno desvelado. Dichos aminoacidos pueden ser aminoacidos naturales, derivados de aminoacidos o aminoacidos sustituidos. En el presente documento se desvela, pero no se reivindica, que los aminoacidos pueden extender la longitud total de la secuencia de aminoacidos primaria del peptido 5, 10, 15, 20, incluso 25 o mas aminoacidos adicionales en el extremo carboxi o en ambos extremos de los motivos de RA implicados en la interaccion RA-Src descrita en el presente documento.
En el presente documento se desvela, pero no se reivindica, que otros compuestos estericamente similares pueden formularse para imitar las porciones clave de la estructura peptfdica y que estos compuestos pueden tener el mismo uso que los peptidos de la invencion en el tratamiento del cancer y, en particular, carcinomas de celulas de prostata y de mama.
En el presente documento se desvela, pero no se reivindica, un peptido que tambien puede caracterizarse por comprender al menos 5 o mas restos e incluir dentro de su secuencia al menos dos o mas restos de prolina.
Los peptidos pueden modificarse para su uso en terapeutica, por ejemplo, mediante el empleo de uno o mas D- aminoacido(s) en lugar de L-aminoacido(s), mediante la adicion de grupos en los extremos N o C, tales como mediante acilacion, acetilacion o aminacion. Tambien pueden estar encapsulados dentro de lfpidos, nanocapsulas, complejos lipfdicos y/o liposomas. Tambien se pueden incorporar los peptidos en capsulas de recubrimiento para liberacion lenta.
La molecula derivada de peptido de la invencion puede utilizarse como agente antitumoral, preferentemente contra cancer de mama o de prostata o contra otros canceres que expresan el receptor de androgenos solo o junto con receptores de estradiol.
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La invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad farmaceuticamente aceptable y eficaz de la molecula derivada de peptido como se reivindica.
En una realizacion preferida en la composicion, el peptido, tal como se define en las reivindicaciones, se une a una molecula transportadora tal como BSA o KLH y/o comprende una composicion lipfdica tal como una partmula lipfdica, una nanocapsula, un liposoma o vesmulas lipfdicas con un excipiente farmaceutico. Preferentemente, la composicion comprende ademas al menos un segundo agente anticanceroso.
Los peptidos de la invencion tambien pueden utilizarse para la preparacion de un medicamento, tambien una vacuna. Otro objeto de la invencion es un anticuerpo capaz de reconocer espedficamente la molecula derivada de peptido, como se define en las reivindicaciones.
Un aspecto adicional de la invencion es un polinucleotido, un vector recombinante, una celula hospedadora que comprende uno o mas de las composiciones del peptido, polinucleotido o vector recombinante, como se define en las reivindicaciones. Cada uno de ellos tambien puede utilizarse en la preparacion de formulaciones anticancerosas.
La invencion proporciona un kit que comprende una o mas de las composiciones de peptidos antiestrogenos develadas como se define en las reivindicaciones adecuadas para inyeccion parenteral, intramuscular, intravenosa u administracion oral, nasal o topica. El kit puede contener uno o mas medicamentos adicionales, un peptidomimetico u otro agente. Los peptidos tal como se definen en las reivindicaciones pueden utilizarse en la preparacion de una vacuna.
En otra realizacion, la invencion proporciona un procedimiento para reducir la actividad de los receptores de androgenos en una celula que proporciona a la celula una cantidad de un peptido antiandrogeno, en el que la celula esta en un cultivo.
En el presente documento se desvela, pero no se reivindica, un procedimiento para reducir la asociacion de receptor de androgenos/Src.
En el presente documento se desvela, pero no se reivindica, un procedimiento para tratar el cancer en un animal. Este procedimiento generalmente comprende identificar un animal con cancer tal como cancer de prostata o de mama y administrar al animal una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion de peptido antiandrogeno, que puede formularse en un excipiente o un liposoma u otro vehmulo lipfdico, y puede prepararse para la administracion a traves de cualquier medio convencional de liberacion.
La invencion tambien proporciona un procedimiento in vitro para matar una celula tumoral que comprende proporcionar una cantidad terapeuticamente eficaz de un peptido antiestrogeno, como se define en las reivindicaciones. En el presente documento se desvela, pero no se reivindica, un procedimiento para matar una celula tumoral comprendida dentro de un animal; generalmente implica identificar un animal sospechoso de tener cancer y administrar al animal una cantidad terapeuticamente eficaz del peptido antiandrogeno. La formulacion de la invencion tambien puede utilizarse en la prevencion del desarrollo de celulas tumorales.
Composicion de peptidos antiandrogenicos
La presente invencion proporciona derivados de peptidos y, en realizaciones preferidas, sustancialmente purificados y ricos en prolina que tienen propiedades anticancerosas, como se define en las reivindicaciones. La expresion "peptidos purificados" como se usa en el presente documento, pretende referirse a una composicion proteica, en la que los peptidos ricos en peptidos se purifican en cualquier grado con relacion a su estado que se puede obtener de manera natural. Por lo tanto, un peptido o peptido purificado tambien se refiere a un peptido o protema libre del entorno en el que se produce de manera natural.
Generalmente, "purificado" se referira a la composicion peptfdica que se ha sometido a fraccionamiento para eliminar diversos componentes no derivados de peptidos.
Cuando se utiliza la expresion "sustancialmente purificado", se refiere a una composicion en la que el peptido forma el componente principal de la composicion, tal como que constituye aproximadamente el 50 % de las protemas en la composicion o mas. En realizaciones preferidas, una protema sustancialmente purificada constituira mas del 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o incluso 99,9 % o mas de la composicion.
Un polipeptido o protema que esta "purifica hasta la homogeneidad", tal como se aplica en la presente invencion, significa que el polipeptido o protema tiene un nivel de pureza en el que el polipeptido o protema esta sustancialmente libre de otras protemas y componentes biologicos. Por ejemplo, un polipeptido purificado a menudo estara lo suficientemente libre de otros componentes peptfdicos para que la secuenciacion degradativa se pueda llevar a cabo con exito.
La presente invencion se refiere particularmente a derivados de peptidos ricos en prolina como se define en las reivindicaciones tales como peptidos aislados de al menos cuatro o mas restos de longitud, que incluyen hasta aquellos peptidos y que incluyen aproximadamente 50 o mas aminoacidos, que comprenden las secuencias de
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aminoacidos derivados de la formula general S1. Preferentemente, estos peptidos inhiben la asociacion de RA al dominio Src-SH3 y son activos en el tratamiento de tumores y canceres de prostata y de mama en un animal afectado, tal como un ser humano. La utilizacion de peptidos pequenos en terapias se prefiere por varias razones. Estos incluyen el bajo coste y la facilidad de preparacion a gran escala, y la fiabilidad del producto. Tambien son preferibles sus propiedades biologicas, tales como la facilidad con que los peptidos pueden penetrar en los tejidos, su baja inmunogenicidad, el hecho de que presentan una diana menor para las proteasas, proporcionando asf una biodisponibilidad mas larga y, ademas, se contempla que funcionaran eficazmente en la prevencion de la interaccion RA-Src y el funcionamiento como agentes terapeuticos antiandrogenos.
Sin embargo, aunque se prefiere para su uso en ciertas realizaciones, no existe un requisito general de que los peptidos aglutinantes SH3 ricos en prolina siempre se proporcionen en su estado mas purificado. En este aspecto, cualquier procedimiento de purificacion bien conocido por los expertos en la materia se puede emplear siempre que se alcance el nivel suficiente de pureza del peptido.
Se pueden modificar peptidos sinteticos por ejemplo, mediante el empleo de uno o mas D-aminoacido(s) en lugar de L-aminoacido(s), mediante la adicion de grupos a los extremos N o C, tales como acilacion o aminacion o mediante la encapsulacion de peptidos dentro de lfpidos, nanocapsulas, complejos lipfdicos y/o liposomas o en un recubrimiento biocompatible disenado para liberacion lenta. La presente invencion contempla vacunas para su uso en inmunizacion activa y pasiva. Estas vacunas se pueden preparar mas facilmente a partir de peptidos inmunogenicos preparados de una manera desvelada en el presente documento.
Segmentos de acidos nucleicos
La presente invencion tambien se refiere a segmentos de ADN, como se definen en las reivindicaciones, que se pueden aislar a partir de practicamente cualquier fuente, que estan libres de ADN genomico total y que codifican la totalidad o una porcion de los nuevos peptidos desvelados en el presente documento. Los polinucleotidos que codifican la nueva especie peptfdica pueden sintetizarse completamente in vitro utilizando procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la materia. Incluidos dentro de la expresion "segmento de ADN", se encuentran segmentos de ADN y fragmentos mas pequenos de dichos segmentos, y tambien vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plasmidos, cosmidos, fagemidos, fagos, virus y similares.
De forma similar, un segmento de ADN que comprende un gen que codifica un peptido antiandrogeno aislado o purificado como se define en las reivindicaciones se refiere a un segmento de ADN que puede incluir ademas de secuencias codificantes de peptidos, ciertos otros elementos tales como, secuencias reguladoras, aisladas sustancialmente lejos de otros genes que se producen de manera natural o secuencias que codifican protemas. A este respecto, el termino "gen" se utiliza por simplicidad para referirse a una unidad funcional que codifica protemas, polipeptidos o peptidos. Como entenderan los expertos en la materia, este termino funcional incluye no solo secuencias genomicas, que incluyen secuencias de ADN cromosomicas adicionales, sino tambien secuencias de operones y/o segmentos de genes disenados por ingeniena genetica que expresan, o pueden adaptarse para expresar, protemas, polipeptidos o peptidos
"Aislado sustancialmente lejos de otras secuencias codificantes" significa que el gen de interes, en este caso, un gen del polipeptido antiandrogeno, forma la parte significativa de la region de codificacion del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene grandes porciones de ADN codificante de origen natural, tales como fragmentos cromosomicos grandes u otros genes funcionales o regiones codificantes de operones. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ADN como se aislo originariamente, y no excluye genes, genes recombinantes, enlazadores sinteticos o regiones codificantes que luego se anaden al segmento mediante la mano del hombre.
En realizaciones particulares, la invencion se refiere a segmentos de ADN aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican una especie de peptido antiestrogeno que incluye dentro de su secuencia de aminoacidos cualquiera de las secuencias de aminoacidos expuestas en la formula general S1 o en los ejemplos de polipeptidos de SEQ. ID NO.1 a SEQ. ID NO.6, como se define en las reivindicaciones. Mas preferentemente, la secuencia de ADN comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica una especie de peptido antiandrogeno que incluye dentro de su secuencia de aminoacidos una secuencia de al menos diez aminoacidos contigua a las expuestas en la formula general S1 o en los peptidos de SEQ. ID NO.1 a SEQ. ID NO.6, como se define en las reivindicaciones.
La expresion "una secuencia esencialmente como se expone en la formula general S1 o en los ejemplos de polipeptidos de SEQ. ID NO.1 a SEQ. ID NO.6" significa que la secuencia corresponde sustancialmente a una porcion de la secuencia de la formula general S1 o en los ejemplos de polipeptidos de SEQ. ID NO.1 a SEQ. ID NO.6 y tiene relativamente pocos aminoacidos que no son identicos a, o un equivalente biologicamente funcional de, los aminoacidos de cualquiera de estas secuencias. La expresion "equivalente biologicamente funcional" se entiende bien en la materia y se define adicionalmente en detalle en el presente documento. Por consiguiente, las secuencias que tienen entre aproximadamente 70 % y aproximadamente 80 %, o entre aproximadamente 81 % y aproximadamente 90 %, o entre aproximadamente 91 % y aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de aminoacidos o equivalencia funcional a los aminoacidos de una cualquiera de las SEQ. ID NO.1 a SEQ. ID NO.6.
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Por consiguiente, las secuencias que tienen entre aproximadamente 70 % y aproximadamente 80 %, o entre aproximadamente 81 % y aproximadamente 90 %, o entre aproximadamente 91 % y aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de aminoacidos o equivalencia funcional a los aminoacidos de una cualquiera de las SEQ. ID NO.1 a SEQ. ID NO.6, seran secuencias que son "esencialmente como se exponen en una cualquiera de las SEQ. ID NO.1 a SEQ. ID NO.6.
Tambien se entendera que las secuencias de aminoacidos y acidos nucleicos pueden incluir restos adicionales, tales como aminoacidos N- o C-terminales adicionales o secuencias 5' o 3', y todavfa ser esencialmente como se expone en una de las secuencias desveladas en el presente documento, siempre que la secuencia cumpla los criterios expuestos anteriormente, que incluyen el mantenimiento de la actividad biologica antiandrogena en lo que respecta a la expresion de peptidos. La adicion de secuencias terminales se aplica particularmente a secuencias de acidos nucleicos que pueden, por ejemplo, incluir diversas secuencias no codificantes que flanquean a cualquiera de las porciones 5' o 3' de la region codificante o pueden incluir diversas secuencias internas, es decir, intrones, que se sabe que ocurren dentro de los genes.
Los segmentos de acidos nucleicos de la presente invencion, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, senales de poliadenilacion, sitios de enzimas de restriccion adicionales, sitios de clonacion multiple, otros segmentos codificantes y similares, tales que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que se pueda emplear un fragmento de acido nucleico de casi cualquier longitud, siendo preferentemente limitada con la longitud total por la facilidad de preparacion y utilizacion en el protocolo de ADN recombinante pretendido. Por ejemplo, se pueden preparar fragmentos de acidos nucleicos que incluyen un tramo corto contiguo que codifica la totalidad de la secuencia peptfdica desvelada en la SEQ. ID. NO: 1 y/o la SEQ. ID. NO: 2 o que son identicos o complementarios a las secuencias de ADN que codifican cualquiera de los peptidos desvelados en la SEQ. ID NO: 1 y la SEQ. ID NO: 2. Por ejemplo, las secuencias de ADN tales como de aproximadamente 30 nucleotidos, y que son de hasta aproximadamente 10.000, aproximadamente 5.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente
50 y aproximadamente 30 pares de bases de longitud (que incluyen todas las longitudes intermedias) tambien se consideran utiles.
Por lo tanto, los vectores recombinantes y los segmentos de ADN aislados pueden incluir diversas regiones codificantes de peptidos, regiones codificantes que llevan alteraciones o modificaciones seleccionadas en la region codificante basica, o pueden codificar polipeptidos mas grandes que, no obstante, incluyen estas regiones codificantes de peptidos o pueden codificar protemas o peptidos equivalentes biologicamente funcionales que tienen secuencias de aminoacidos variantes.
En el presente documento se desvelan, pero no se reivindican, peptidos equivalentes biologicamente funcionales. Dichas secuencias pueden surgir como consecuencia de la redundancia de codones y la equivalencia funcional que se sabe que se producen de manera natural en las secuencias de acidos nucleicos y las protemas asf codificadas. Alternativamente, se pueden crear protemas o peptidos funcionalmente equivalentes mediante la aplicacion de tecnologfa de ADN recombinante, en la que los cambios en la estructura de la protema se pueden disenar por ingeniena genetica, basandose en consideraciones de las propiedades de los aminoacidos que se intercambian. Los cambios disenados por el hombre pueden introducirse a traves de la aplicacion de tecnicas de mutagenesis dirigida al sitio, por ejemplo, para introducir mejoras en la antigenicidad de la protema o para probar mutantes con el fin de examinar la actividad a nivel molecular.
51 se desea, tambien se pueden preparar protemas y peptidos de fusion, por ejemplo, en los que las regiones codificantes de peptidos se alinean dentro de la misma unidad de expresion con otras protemas o peptidos que tienen funciones deseadas, tales como para fines de purificacion o inmunodeteccion.
Los vectores recombinantes forman otros aspectos de la presente invencion. Se consideran vectores particularmente utiles aquellos vectores en los que la porcion de codificacion del segmento de ADN, como se define en las reivindicaciones, se coloca bajo el control de un promotor. El promotor puede estar en la forma del promotor que esta asociado de manera natural con un gen que codifica peptidos de la presente invencion, como se define en las reivindicaciones, tal como se puede obtener mediante el aislamiento de las secuencias 5' no codificantes situadas cadena arriba del segmento codificante o exon.
Segmentos de ADN como cebadores y sondas de hibridacion
Ademas de su uso para dirigir la expresion de los peptidos de la presente invencion, como se define en las reivindicaciones, las secuencias de acidos nucleicos contempladas en el presente documento tambien tienen una variedad de otros usos.
Por ejemplo, tambien tienen utilidad como sondas o cebadores en realizaciones de hibridacion de acidos nucleicos. La capacidad de dichas sondas de acidos nucleicos para hibridarse espedficamente con secuencias codificantes de peptidos antiandrogenos les permitira utilizarse para detectar la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. Sin embargo, se preven otros usos, que incluyen la utilizacion de la informacion de las secuencias
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para la preparacion de cebadores de especies mutantes, o de cebadores para su uso en la preparacion de otras construcciones geneticas.
Se contemplan particularmente moleculas de acidos nucleicos que tienen regiones de secuencias que consisten en tramos de nucleotidos contiguos de 10-14, 15-20, 30, 50 o incluso de 100-200 nucleotidos o mas, identicos o complementarios a las secuencias de ADN que codifican los polipeptidos desvelados como sondas de hibridacion para su uso en, por ejemplo, transferencias de Southern y Northern. Generalmente, fragmentos mas pequenos encontraran uso en realizaciones de hibridacion, en las que puede variarse la longitud de la region complementaria contigua, tal como entre aproximadamente 10-14 y aproximadamente 100 o 200 nucleotidos, pero pueden utilizarse tramos complementarios contiguos mas grandes, de acuerdo con la longitud de secuencias complementarias que se desean detectar.
La utilizacion de una sonda de hibridacion de aproximadamente 14 nucleotidos de longitud permite la formacion de una molecula doble que es a la vez estable y selectiva. Sin embargo, generalmente se prefieren moleculas que tienen secuencias complementarias contiguas de tramos mayores de 14 bases de longitud, con el fin de aumentar la estabilidad y la selectividad del hnbrido y, de ese modo, mejorar la calidad y el grado de las moleculas hnbridas espedficas obtenidas. Generalmente, se preferira disenar moleculas de acidos nucleicos que tengan tramos complementarios de genes de 15 a 20 nucleotidos contiguos, o incluso mas largos cuando se desee.
En determinadas realizaciones, sera ventajoso emplear secuencias de acidos nucleicos de la presente invencion, como se define en las reivindicaciones, en combinacion con un medio apropiado, tal como una etiqueta, para determinar la hibridacion. En la materia se conoce una amplia variedad de medios indicadores apropiados, que incluyen ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimaticos u otros, tales como avidina/biotina, que son capaces de proporcionar una senal detectable. En realizaciones preferidas, es probable que se desee emplear una etiqueta fluorescente o una etiqueta enzimatica, tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de reactivos radioactivos u otros medioambientalmente no deseables. En el caso de una etiqueta enzimatica, se conocen sustratos indicadores colorimetricos que se pueden emplear para proporcionar medios visibles para el ojo humano o espectrofotometricamente, para identificar la hibridacion espedfica con muestras complementarias que contienen acidos nucleicos.
En general, se preve que las sondas de hibridacion descritas en el presente documento seran utiles como reactivos en hibridacion en solucion asf como en realizaciones que emplean una fase solida. En realizaciones que implican una fase solida, el ADN (o ARN) de prueba se adsorbe o se fija de otro modo a una matriz o superficie seleccionada. Este acido nucleico fijo, monocatenario, se somete luego a hibridacion espedfica con sondas seleccionadas en las condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependeran de las circunstancias particulares en funcion de los criterios particulares requeridos (que dependen de, por ejemplo, el contenido G+C, tipo de acido nucleico diana, fuente de acido nucleico, tamano de la sonda de hibridacion, etc.).
Expresion de polipeptidos y vectores recombinantes
La invencion tambien desvela y reivindica composiciones que comprenden cualquiera de los peptidos antiandrogenos desvelados, como se define en las reivindicaciones. La composicion puede estar comprendida dentro de una o mas celulas hospedadoras que expresan un segmento de acidos nucleicos que codifica un peptido antiandrogeno, celulas hospedadoras recombinantes que expresan los peptidos o protemas de fusion que comprenden los peptidos, suspensiones celulares, extractos, cuerpos de inclusion o cultivos de tejidos o extractos de cultivos que contienen los peptidos antiandrogenos desvelados, sobrenadante de cultivo, celulas alteradas, extractos celulares, lisados, homogeneizados y similares. Las composiciones pueden estar en forma acuosa o, alternativamente, en seco, semihumedas o formas similares tales como pasta celular, granulados celulares o, alternativamente, secas por congelacion, en polvo, liofilizadas, evaporadas o preparadas de otra manera similar en forma seca. Tales medios para preparar peptidos antiandrogenos son bien conocidos por los expertos en la materia de aislamiento y purificacion de protemas. En determinadas realizaciones, los peptidos antiandrogenos pueden purificarse, concentrarse, mezclarse con otros reactivos, o procesarse hasta una forma final deseada. Preferentemente, la composicion comprendera del aproximadamente 1 % al aproximadamente 90 % en peso del peptido antiandrogeno, y mas preferentemente del aproximadamente 5 % al aproximadamente 50 % en peso.
En una realizacion preferida, las composiciones de peptidos antiandrogenos de la invencion, como se define en las reivindicaciones, pueden prepararse mediante un procedimiento que comprende las etapas de cultivar una celula hospedadora que expresa un peptido antiandrogeno en condiciones eficaces para producir dicho peptido, y luego obtener el peptido de la celula. La obtencion de dicho peptido antiandrogeno puede incluir ademas purificar, concentrar, procesar y mezclar el polipeptido dentro de uno o mas reactivos. Preferentemente, el peptido antiandrogeno se obtiene en una cantidad de entre aproximadamente el 1 % al aproximadamente 90 % en peso, y mas preferentemente del aproximadamente 5 % al aproximadamente 70 % en peso, e incluso mas preferentemente del aproximadamente 10 % al aproximadamente 20 % al aproximadamente 30 %, o incluso hasta aproximadamente el 40 % o 50 % en peso.
En el presente documento se desvela, pero no se reivindica, un procedimiento para preparar una composicion de peptido antiandrogeno. Dicho procedimiento generalmente implica las etapas de cultivar una celula hospedadora,
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que expresa un peptido antiandrogeno en condiciones eficaces para producir el peptido y, luego, obtener el polipeptido as^ producido.
Los vectores plasmndicos recombinantes de la invencion, como se define en las reivindicaciones, pueden utilizarse para transformar otras celulas bacterianas o eucariotas adecuadas para producir los polipeptidos antiandrogenos de la invencion.
Las celulas hospedadoras eucariotas que incluyen NIH3T3, COS7 y CAOV3, asf como las celulas de levadura se consideran particularmente utiles en la preparacion de las especies de peptidos. Asimismo, las celulas hospedadoras procariotas que incluyen celulas Gram-negativas tales como E. coli, Pseudomonas spp. y las Enterobacteraceae relacionadas y similares se consideran utiles en la preparacion de los peptidos antiandrogenos de la invencion, como se define en las reivindicaciones.
Se obtendran ciertas ventajas posicionando el segmento de ADN codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterologo. Como se usa en el presente documento, un promotor recombinante o heterologo pretende referirse a un promotor que normalmente no esta asociado con un segmento de ADN que codifica un peptido antiandrogeno en su entorno natural. Tales promotores pueden incluir promotores normalmente asociados con otros genes y/o promotores aislados de cualquier celula bacteriana, viral o eucariota. Las celulas eucariotas preferidas son celulas animales, siendo las mas preferidas las celulas de mairnfero, particularmente las celulas humanas. Naturalmente, sera importante emplear un promotor que dirija eficazmente la expresion del segmento de ADN en el tipo de celula, tejido, organismo, animal o celula hospedadora recombinante elegida para la expresion. La utilizacion de combinaciones de tipo promotor y celula para la expresion de protemas es generalmente conocido por los expertos en la materia de la biologfa molecular, por ejemplo, vease Sambrook y col., 1989. Los promotores empleados pueden ser constitutivos, o inducibles, y se pueden utilizar en las condiciones apropiadas para dirigir la expresion de alto nivel del segmento de ADN introducido, tal como es ventajoso en la produccion a gran escala de protemas o peptidos recombinantes.
Kits terapeuticos y de diagnostico
Los kits terapeuticos de la presente invencion son kits que comprenden la protema, peptido, inhibidor, gen, vector u otro efector de protema de union a peptido que contiene el peptido rico en prolina reivindicado. Dichos kits generalmente contendran, en medios contenedores adecuados, una formulacion farmaceuticamente aceptable de protema, peptido, inhibidor, gen, vector u otro efector o vector de protema de union a peptido que contiene el peptido rico en prolina desvelado, expresando cualquiera de los anteriores en una formulacion farmaceuticamente aceptable, que comprende opcionalmente otros agentes anticancerosos. El kit puede tener un medio contenedor individual, o puede tener un medio contenedor distinto para cada compuesto.
Cuando los componentes del kit se proporcionan en una o mas soluciones lfquidas, la solucion lfquida es una solucion acuosa, siendo particularmente preferida una solucion acuosa esteril. Las composiciones mencionadas anteriormente tambien pueden formularse en una composicion que se puede inyectar. En cuyo caso, el medio contenedor puede ser una jeringa, una pipeta u otro aparato similar, a partir del cual la formulacion puede aplicarse a un area infectada del cuerpo, inyectarse en un animal o incluso aplicarse y mezclarse con los otros componentes del kit.
Sin embargo, los componentes del kit pueden proporcionarse como polvo(s) seco(s). Cuando se proporcionan reactivos o componentes como un polvo seco, el polvo se puede reconstituir mediante la adicion de un disolvente adecuado. Se preve que el disolvente tambien pueda proporcionarse en otro medio contenedor. Cuando se proporciona un segundo agente terapeutico anticanceroso, el kit generalmente contendra un segundo recipiente. Los kits tambien pueden comprender otros recipientes para un diluyente aceptable.
Procedimientos de liberacion de acidos nucleicos y transfeccion de ADN
En determinadas realizaciones, se contempla que los segmentos de acidos nucleicos desvelados en el presente documento se utilizaran para transfectar celulas hospedadoras apropiadas, como se define en las reivindicaciones. La tecnologfa para la introduccion de ADN en las celulas es bien conocida por los expertos en la materia. Se pueden considerar cuatro procedimientos generales para liberar un segmento nucleico en las celulas:
(1) procedimientos qmmicos (Graham y VanDerEb, 1973);
(2) procedimientos ffsicos tales como microinyeccion (Capecchi, 1980), electroporacion (Wong y Neumann, 1982; Fromm y col., 1985) y la pistola de genes (Yang y col., 1990);
(3) vectores virales (Clapp, 1993; Eglitis y col., 1988; Eglitis y Anderson, 1988); y
(4) mecanismos mediados por receptores (Curiel y col., 1991; Wagner y col., 1992).
Liposomas y nanocapsulas
En determinadas realizaciones, el inventor contempla la utilizacion de liposomas y/o nanocapsulas para la introduccion de composiciones peptfdicas, como se define en las reivindicaciones, en celulas hospedadoras. Dichas formulaciones pueden preferirse para la introduccion de formulaciones farmaceuticamente aceptables de los
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polipeptidos, productos farmaceuticos y/o anticuerpos desvelados en el presente documento. La formacion y la utilizacion de liposomas es generalmente conocida por los expertos en la materia (vease, por ejemplo, Couvreur y col., 1977, que describe la utilizacion de liposomas y nanocapsulas en la terapia antibiotica dirigida de infecciones y enfermedades bacterianas intracelulares). Mas recientemente, los liposomas se desarrollaron con una estabilidad del suero y un tiempo de circulacion mejorados (Gabizon y Papahadjopoulos, 1988; Allen y Choun, 1987).
Los dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invencion. La invencion puede entenderse mejor por referencia a uno o mas de estos dibujos en combinacion con la descripcion detallada de realizaciones espedficas presentadas en el presente documento.
FIGURA 1A. Inhibicion de la smtesis de ADN de celulas de cancer de prostata humano mediante el peptido aglutinante Src-SH3 modelado a partir de RA (SEQ. ID NO.1). Se cultivaron celulas LNCaP que proceden del cancer de prostata humano en medio sin rojo fenol anadido con suero tratado con carbon como se describio anteriormente (Migliaccio y col., 2000) y se trataron durante 24 horas con androgeno sintetico R1881 10 nM solo o en presencia de un exceso de 1000 veces de Casodex antiandrogeno o del peptido aglutinante SH3 (SH3, SEQ. ID. NO.1) 1 nM o del peptido Ss (secuencia mezclada: SEQ. ID. NO.7) 1 nM. Al final del tratamiento hormonal se ensayo la incorporacion de BrdU en celulas no tratadas (control) o tratadas con R1881 solo (R1881) o en presencia de casodex (Cdx) o del peptido aglutinante SH3 (SH3, SeQ. ID NO.1) o de la secuencia de peptidos mezclada SEQ. ID NO.1 (Ss, sEq. ID NO.7) como se informo (Castoria y col., 1999). Los datos se presentan como el porcentaje de celulas que incorporan BrdU, promediadas a partir de 6 experimentos.
FIGURA 1B. Inhibicion de la smtesis de ADN de celulas de cancer de mama humano estimulado por estradiol mediante peptidos aglutinantes SH3 derivados de RA (SEQ. ID NO.1). Las celulas MCF-7 procedentes de cancer de mama humano se mantuvieron durante 3 dfas en medio sin rojo fenol que contema suero tratado con carbon como se describio previamente y se trataron durante 24 horas con 17p estradiol 10 nM solo o en presencia de un exceso de 1000 veces del antiestrogeno ICI 182.780 o de 1 nM del peptido aglutinante SH3 SEQ. ID. NO. 1 o de la secuencia mezclada (Ss, SEQ. ID NO.7) del peptido de SEQ. ID No.1. Al final del tratamiento hormonal se ensayo la incorporacion de BrdU en las celulas no tratadas (control) o tratadas con estradiol solo (E2) o en presencia de ICI 182.780 (ICI) o del peptido derivado de RA (SH3) o de Ss. Los datos se informan como el porcentaje de celulas que incorporan BrdU, promediadas a partir de 6 experimentos.
FIGURA 1C. Inhibicion de la smtesis de ADN de celulas de cancer de prostata humano estimulado por EGF mediante peptidos aglutinantes SH3 modelados a partir de RA (SEQ. ID No.1). Se cultivaron celulas LNCaP en medio sin rojo fenol anadido con suero tratado con carbon como se describio previamente y se trataron durante 24 horas con 100 ng/ml de EGF solo o en presencia de 10 pM del antiestrogeno ICI 182.780 o con 1 nM del peptido derivado de RA (SH3-aglutinante) (SEQ. ID NO.1) o con la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (SeQ. ID NO.7). Al final del tratamiento del factor de crecimiento se ensayo la incorporacion de BrdU en las celulas no tratadas (control) o tratadas con EGF solo (EGF) o en presencia de ICI 182.780 (ICI) o del SH3-aglutinante (SH3) o de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss). Los datos se informan como el porcentaje de celulas que incorporan BrdU.
FIGURA 1D. Inhibicion de la smtesis de ADN de celulas de cancer de mama humano estimulado por EGF mediante peptidos aglutinantes SH3 modelados a partir de RA (SEQ. ID NO.1). Se cultivaron celulas MCF-7 en medio sin rojo fenol anadido con suero tratado con carbon como se describio previamente y se trataron durante 24 horas con 100 ng/ml de EGF solo o en presencia de 10 pM del antiestrogeno ICI 182.780 o de 1 nM del peptido derivado de RA (SH3-aglutinante) o de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (SEQ. ID. NO.7). Al final del tratamiento del factor de crecimiento, se ensayo la incorporacion de BrdU en las celulas no tratadas (control) o tratadas con EGF solo (EGF) o en presencia de ICI 182.780 (ICI) o del SH3-aglutinante (SH3) o de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss). Los datos se informan como el porcentaje de celulas que incorporan BrdU.
FIGURA 2A. Inhibicion de la asociacion de RA estimulada por androgenos con Src mediante el peptido derivado de RA (aglutinante Src-SH3) (SEQ. ID NO.1). Celulas LNCaP de cancer de prostata humano se dejaron sin estimular o estimularon durante 2 min con R1881 10 nM solo o en presencia de un exceso de 1000 veces de Casodex o de 1 nM del peptido aglutinante SH3 o de la secuencia mezclada de peptido de SEQ. ID NO.1 ( SEQ. ID NO.7). Se incubaron los lisados celulares con anticuerpos anti-Src, y se resolvieron las protemas inmunoprecipitadas en SDS- PAGE y se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Los filtros fueron luego borrados con anticuerpos antiSrc o antiRA humanos para detectar RA asociados con Src. Se revelaron los inmunocomplejos utilizando el kit de deteccion de ECL. Carril 1: celulas no estimuladas; Carril 2: celulas tratadas con R1881; Carril 3: celulas tratadas con R1881 en presencia de Casodex (Cdx); Carril 4: celulas tratadas con R1881 en presencia del peptido aglutinante SH3 (SH3, SEQ. ID NO.1); Carril 5: celulas tratadas con R1881 en presencia de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss, SEQ. ID NO.7).
FIGURA 2B. Inhibicion de la asociacion de RA estimulada por estrogenos con Src mediante el peptido aglutinante Src-SH3 derivado de RA (SEQ. ID NO.1). Celulas MCF-7 de cancer de mama humano se dejaron sin estimular o se estimularon durante 2 min con 17p estradiol 10 nM solo o en presencia de un exceso de 1000 veces de ICI 182.780 o de 1 nM del peptido aglutinante SH3 o de la secuencia mezclada de peptido de SEQ. ID NO.1 ( SEQ. ID NO.7). Se
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incubaron los lisados celulares con anticuerpos anti-Src, se resolvieron las protemas inmunoprecipitadas en SDS- PAGE y se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Los filtros fueron luego borrados con anticuerpos antiSrc o antiRA humanos para detectar RA asociados con Src. Se revelaron los inmunocomplejos utilizando el kit de deteccion de ECL. Carril 1: celulas no estimuladas; Carril 2: celulas tratadas con estradiol (E2); Carril 3: celulas tratadas con E2 en presencia ICI 182.780 (ICI); Carril 4: celulas tratadas con E2 en presencia del peptido aglutinante SH3 (SH3); Carril 5: celulas tratadas con estradiol en presencia de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss)
FIGURA 3A. Inhibicion de la expresion de ciclina D1 inducida por androgenos mediante el peptido aglutinante Src- SH3 derivado de RA (SEQ. ID NO.1). Las celulas MCF-7 y LNCaP en reposo se dejaron sin tratar o se trataron durante 8 horas con R1881 10 nM solo o en presencia del inhibidor lY 294.002 de PI3-quinasa 5 pM o del aglutinante SH3 derivado de RA o de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (SEQ. ID. NO.7) 1 nM. Se resolvio la protema de los lisados celulares en SDS-PAGE, luego se transfirio a filtros de nitrocelulosa. La ciclina D1 endogena se revelo utilizando anticuerpos apropiados. Carril 1: celulas no estimuladas; Carril 2: celulas tratadas con R1881; Carril 3: celulas tratadas con R1881 en presencia LY 294.002 (LY); Carril 4: celulas tratadas con R1881 en presencia del peptido (aglutinante SH3) derivado de RA (SH3); Carril 5: celulas tratadas con R1881 en presencia de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss). FIGURA 3B. Inhibicion de la expresion de ciclina D1 inducida por estrogenos mediante el peptido aglutinante SH3 derivado de RA (SEQ. ID NO.1). Las celulas MCF-7 y LNCaP en reposo se dejaron sin tratar o se trataron durante 8 horas con 17p estradiol 10 nM solo o en presencia del inhibidor LY 294.002 de PI3-quinasa 5 pM o de 1 nM del aglutinante SH3 o de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (SEQ. ID NO.7). Se resolvio la protema de los lisados celulares en SDS-PAGE, luego se transfirio a filtros de nitrocelulosa. La ciclina D1 endogena se revelo utilizando anticuerpos apropiados. Carril 1: celulas no estimuladas; Carril 2: celulas tratadas con estradiol; Carril 3: celulas tratadas con estradiol en presencias de LY 294.002 (LY); Carril 4: celulas tratadas con estradiol en presencia del peptido aglutinante SH3 (SH3); Carril 5: celulas tratadas con estradiol en presencia de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss).
FIGURA 4A. Inefectividad del peptido derivado de RA (aglutinante SH3) (SEQ. ID. NO.1) en la transcripcion de genes regulados por el receptor de androgenos en el cancer de prostata (celulas LNCaP). Se transfectaron celulas LNCaP con un gen indicador que codifica el gen de luciferasa bajo el control de un elemento sensible a androgenos (ARE 3416) (Castoria y col., 2003). Seis horas despues de la transfeccion, se mantuvieron las celulas durante 24 horas mas en ausencia o en presencia de R1881 10 nM solo o con un exceso de 1000 veces de Casodex o con el peptido aglutinante SH3 1 nM (SEQ. ID NO.1) o la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 1 nM (SEQ. ID. NO.7). Luego se ensayo la actividad luciferasa en lisados celulares. Barra 1: celulas no estimuladas; Barra 2: celulas tratadas con R1881; Barra 3: celulas tratadas con R1881 en presencia de Casodex (Cdx); Barra 4: celulas tratadas con R1881 en presencia del peptido aglutinante SH3 (SH3); Barra 5: celulas tratadas con R1881 en presencia de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss).
FIGURA 4B. Inefectividad del peptido derivado de RA (aglutinante SH3) (SEQ. ID. NO.1) en la transcripcion de genes regulados por el receptor de estrogenos en el cancer de mama (celulas MCF-7). Se transfectaron celulas MCF-7 con un gen indicador que codifica el gen de luciferasa bajo el control de un elemento sensible a estrogenos (vt-tk-LUC) (Castoria y col., 2003). Seis horas despues de la transfeccion, se mantuvieron las celulas durante 24 horas mas en ausencia o en presencia de 17p estradiol (E2) 10 nM solo o con un exceso de 1000 veces de ICI 182.780 o con el peptido aglutinante SH3 1 nM (SEQ. ID nO.1) o la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 1 nM (SEQ. ID. NO.7). Luego se ensayo la actividad luciferasa en lisados celulares. Barra 1: celulas no estimuladas; Barra 2: celulas tratadas con E2; Barra 3: celulas tratadas con E2 en presencia ICI 182.780 (ICI); Barra 4: celulas tratadas con E2 en presencia del peptido aglutinante SH3 (SH3); Barra 5: celulas tratadas con E2 en presencia de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss).
FIGURA 5A Efecto del peptido aglutinante SH3 en celulas de cancer de prostata humano in vivo. Se cultivaron celulas de cancer de prostata LNCaP por via subcutanea en ratones machos desnudos. Despues de que el tumor alcanzara el tamano de 200-400 mm3, se trataron los ratones con una inyeccion intraperitoneal de 200 pl de solucion de control (control) (drculos) o la misma solucion que contema 2 pM del peptido aglutinante SH3 (SH3) de SEQ. ID NO.1 (cuadrados). El tratamiento comenzo al comienzo de la semana 0 y se administraron los peptidos en dfas alternos durante 4 semanas, utilizando 5 animales por grupo.
FIGURA 5B Efecto del peptido aglutinante SH3 en celulas de cancer de mama humano in vivo. Se cultivaron celulas de cancer de mama humano MCF-7 por via subcutanea en ratones machos desnudos. Cuando los tumores teman un tamano de aproximadamente 1000 mm3, se trataron los ratones con una inyeccion intraperitoneal de 200 pl de solucion de control (control, drculos) o 200 pl de la misma solucion que contema 2 pM del peptido aglutinante SH3 de SEQ. ID NO.1 (SH3, cuadrados). El tratamiento comenzo al comienzo de la semana 0 y se administraron los peptidos en dfas alternos durante 5 semanas, utilizando 5 animales por grupo
FIGURA 6A. Efecto del peptido aglutinante SH3 sobre la expresion del antfgeno Ki-67 y la apoptosis en celulas de cancer de prostata humano. Los xenoinjertos de celulas LNCaP en ratones desnudos macho son los mismos que los utilizados en el experimento presentado en la figura 5A. Al final del tratamiento, se analizaron las muestras tumorales para determinar la expresion del antfgeno Ki-67 y la apoptosis. El panel izquierdo muestra la expresion del antfgeno Ki-67 como el porcentaje de celulas positivas para Ki-67 en ratones no tratados (control) y tratados con el peptido de SEQ. ID NO.1 (SH3). El panel derecho muestra las celulas positivas para el ensayo TUNEL observadas en campos
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FIGURA 6B. Efecto del peptido aglutinante SH3 sobre la expresion del antigeno Ki-67 y la apoptosis en celulas de cancer de mama humano. Los xenoinjertos de celulas MCF-7 en ratones desnudos macho son los mismos que los utilizados en el experimento presentado en la figura 5B. Al final del tratamiento se analizaron las muestras tumorales para determinar la expresion del antigeno Ki-67 y la apoptosis. El panel izquierdo muestra la expresion del antigeno Ki-67 como el porcentaje de celulas positivas para Ki-67 en ratones no tratados (control) y tratados con el peptido de SEQ. ID NO.1 (SH3). El panel derecho muestra las celulas positivas para el ensayo TUNEL observadas en campos representativos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invencion.
Ejemplo 1: preparacion del peptido aglutinante Src-SH3 derivado de RA (SEQ. ID NO.1) mediante smtesis quimica.
Se pueden preparar convenientemente de manera manual los peptidos 1 a 4 mediante la aplicacion del procedimiento de fase solida (Bodansky M y Bodansky A, 1995) y la qmmica Fmoc/tBu (Fmoc: 9-fluorenil- metoxicarbonilo) que se describe ampliamente en la literatura cientffica (Carpino y Han, 1972; Fields y Noble, 1990) y es bien conocido por los expertos en la materia. Para agilizar y facilitar la preparacion, pueden utilizarse sintetizadores de peptidos multiples automaticos. Tambien se puede utilizar convenientemente cualquier tipo de procedimiento qmmico o sintetizador mecanico con canales unicos o multiples para llevar a cabo la sintesis, sin afectar a las propiedades biologicas de los compuestos finales.
La sintesis del peptido se realiza en una escala de 50 pmoles utilizando una resina derivatizada adecuadamente con un enlazador RlNK capaz de proporcionar peptidos amida C-terminales (Rink, 1987). Una de tales resinas es el producto 4-(2',4'-dimetoxil) henil-Fmoc-aminometil) -fenoxi resina, malla de 100-200; copoliestireno Di-vinilbenceno al 1 %), sustitucion 0,50 mmol/g (catalogo de Novabiochem n.° ), tambien conocida como resina RINK AMIDE para los expertos en la materia. Se utiliza una cantidad de 100 mg de resina. La resina se coloca en un recipiente de reaccion de polipropileno de 5 ml (RR) dotado de un septo de filtracion en la parte inferior (catalogo de Shimadzu Corp., n.° 292-05250-02). En un protocolo tfpico, la resina se hincha durante 10 minutos bajo agitacion y luego se enjuaga varias veces (al menos 4) con 1,0 ml de N,N-dimetilformamida seca (DMF, grado de sintesis peptfdica, catalogo de LabScan, n.° H6533) mediante la eliminacion del disolvente del fondo aplicando un ligero vacfo. La resina se trata a continuacion con 1,0 ml de una solucion al 20 % v/v de piperidina (catalogo de BIOSOLVE LTD, n.° 16183301) en DMF durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitacion para eliminar el grupo Fmoc inicial y se lava varias veces (al menos 4) con 1,0 ml de DMF seca durante 2 minutos para eliminar el exceso de reactivo.
Luego, los siguientes 6 pasos se llevan a cabo posteriormente:
1. Se disuelven 250 pmoles (117 mg) de Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (catalogo de Novabiochem, ) en 500 pl de DMF seca 2 3 4 5 6
2. El aminoacido protegido se preactiva con 400 pl de solucion A y 400 pl de solucion B durante 4 minutos bajo agitacion a temperatura ambiente, en el que:
La solucion A contiene:
tetrafluoroborato de 2-(1H-Benzotriazol-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio 0,5 M (TBTU, > 99 %, catalogo de Chem-Impex Intl, n.° 02056) y 0,5 M de 1-Hidroxibenzotriazol (HOBt, catalogo de SIGMA-ALDRICH, n.° H2006) en DMF.
La solucion B contiene:
Di-isopropil-etilamina 1 M (DIEA, catalogo de SIGMA-ALDRICH, n.° D-3887) en DMF.
3. Se transfiere la solucion en la resina y se agita durante 30 minutos.
4. Se elimina el reactivo al vacfo y se lava la resina 4 veces con 1,0 ml de DMF seca.
5. Se trata de nuevo la resina con 1,0 ml de piperidina al 20 % v/v en DMF durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitacion para eliminar el Fmoc N-terminal.
6. Se lava la resina 3 veces con 1,0 ml de DMF.
A continuacion, se repiten los pasos 1 a 6, cambiando en el paso 1 el correspondiente aminoacido protegido solicitado en la secuencia. Los derivados protegidos utilizados se informan en la siguiente Tabla II.
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Tabla II. Aminoacidos protegidos comunes utilizados para la smtesis qmmica del peptido de SEQ. ID NO.1 y _________________________________cantidades requeridas.__________________________________
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Derivado protegido. Cantidad Codigo
Ile
Fmoc-L-Ile-OH 88 mg (250 pmol) catalogo de Novabiochem, 0412-1024
Arg
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH 161 mg (250 pmol) catalogo de Novabiochem, 0412-1145
Ala
Fmoc-L-Ala-OH 78 mg (250 pmol) catalogo de Novabiochem, 0412-1006
His
Fmoc-L-His(Trt)-OH 155 mg (250 pmol) catalogo de Novabiochem, 0412-1065
Pro
Fmoc-L-Pro-OH 84 mg (250 pmol) catalogo de Novabiochem, 0412-1031
Lys
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 117 mg (250 pmol) catalogo de Novabiochem, 0412-0069
Fmoc-L-Lys (Boc) -OH indica el derivado de lisina protegido: N-a-Fmoc-N-£-t-Boc-L-lisina y el sfmbolo "t-Boc", indica el grupo protector t-butiloxicarbonilo; Fmoc-L-Ile-OH indica el derivado de isoleucina protegido: N-a-Fmoc-L- isoleucina; Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH indica el derivado de arginina protegido: N-a-Fmoc-NG-22,4,6,7- pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonil-L-arginina; Fmoc-L-Ala-OH indica el derivado de alanina protegido: N-a- Fmoc-L-alanina; Fmoc-L-His(Trt)-OH indica el derivado de histidina protegido: N-a-Fmoc-N-im-tritil-L-histidina y el sfmbolo "trityl", indica el grupo protector t-fenilmetil; Fmoc-L-Pro-OH indica el derivado de prolina protegido: N-a- Fmoc-L-prolina.
Despues de la eliminacion del ultimo grupo Fmoc, se acetila la resina mediante tratamiento con una solucion 1,0 M en DMF seca de anhudrido acetico (catalogo de Fluka, 45830), que contiene DIEA 1,0 M durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitacion. Despues de un enjuague extenso con DMF, se somete la resina a los siguientes lavados:
Disolvente
N.° de lavados Volumen (ml)
DMF
3 4,0
MeOH*
3 4,0
Et2O **
3 4,0
* Metanol (MeOH, catalogo de LabScan, n.° A3513), ** Etil Eter (Et2O, catalogo de LabScan. n.° A3509E).
Se seca la resina aplicando una corriente de Nitrogeno y luego se pesa. El peso final de la resina es 280,0 mg.
Nuevamente, se preparan y se anaden a la resina 3,0 ml de una mezcla de TFA-H2O-TIS (100:5:5, v/v/v) (TIS, tri- isopropilsilano, catalogo de SIGMA-ALDRICH n.° 23,378-1). Despues de agitar durante 3 horas, se filtra la resina y se recoge la solucion acida directamente en un tubo de polipropileno de 15 ml que contiene 15 ml de Et2O fno. Se separa el precipitado blanco por centrifugacion a 3000 rpm durante 10 minutos y se descartan los disolventes organicos. Se lava el precipitado una vez con 5,0 ml de Et2O fno y despues de centrifugar se disuelve en 2,0 ml de H2O desionizada y se liofiliza. El solido blanco se pondera: 102 mg.
El peptido liofilizado se puede purificar convenientemente mediante cromatograffa de fase inversa utilizando sistemas de cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC) disponibles en el mercado, tales como, por ejemplo, el sistema LC-8 proporcionado por Shimadzu Corp., equipado con columnas C18 de fase inversa preparativas disponibles en el mercado, tales como las columnas ID C18 Jupiter de 25x2,1 cm (catalogo Phenomenex n.° 00G- 4053-P0) proporcionadas por Phenomenex. Los gradientes tfpicos para la purificacion de peptidos hacen uso de disolventes tales como H2O desionizada, acido trifluoroacetico al 0,1 % (TFA, catalogo de Sigma-Aldrich, n.° 91700) y acetonitrilo (CH3CN, catalogo de LabScan, n.° C2503), TFA al 0,1 % y son de una concentracion tfpica de CH3CN al 5 %, de TFA del 0,1 % al 60 % durante 35 minutos con un caudal de operacion tfpico de 20 ml/min. Estos procedimientos son muy conocidos por los expertos en la materia y proporcionaran peptidos purificados con niveles de pureza de hasta 95-99 % segun se determina mediante analisis de HPLC analttica en columnas RP18 comercialmente analfticas, tales como la columna ID RP-18 Phenomenex Jupiter, de 250x4,6 mm (catalogo de
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Phenomenex n.° 00G-4053-E0). Los gradientes son desde CH3CN al 5 %, TFA del 0,1 % hasta 60 % durante 35 minutes, con un flujo tipico de 1,0 ml/min. La monitorizacion se logra tipicamente mediante la utilizacion de un detector UV-vis implementado en los sistemas de HPLC y ajustado a una longitud de onda tfpica de 214 nm.
El peptido final se caracteriza convenientemente por procedimientos de espectrometna de masas, tales como MALDI-TOF y ESI-MS. En un ejemplo tipico, el peso molecular experimental (PM) determinado con un espectrometro de masas ESI-MS es de 1189,5 unidades de masa atomica (uma), de acuerdo con el valor teorico de 1189,68 uma (especies monoisotopicas).
Ejemplo 2: efecto antitumoral "in vitro" del peptido de SEQ. ID NO.1 aglutinante Src-SH3 derivado de RA
Se ha demostrado que el tratamiento de LNCaP del cancer de prostata humano con androgeno sintetico R1881 10 nM estimula fuertemente la smtesis de ADN. Por lo tanto, se cultivan rutinariamente celulas LNCaP en CO2 al 5 % en aire en medio RPMI 1640 (GIBCO) complementado con rojo fenol, L-glutamina 2 mM (GIBCO), penicilina (100 U/ml), gentamicina (50 pl/ml), insulina (Humulin 10,2 U.I/ml, Roche) y suero de ternera fetal al 10 %. Se siembran las celulas en cubreobjetos prerrecubiertos con gelatina a aproximadamente el 40 % de confluencia y se mantienen en RPMI-1640 sin rojo fenol que contiene insulina y suero de ternera despojado de carbon para asegurar una contaminacion esteroide minima o nula (Shi y col., 1994) durante 3 dfas. Despues, se tratan las celulas LNCaP durante 24 horas con 10 nM del androgeno sintetico R1881 (Astra-Zeneca) solo o en presencia de un exceso molar de 1000 veces de Casodex antiandrogeno (Astra-Zeneca) o con los peptidos indicados.
Los resultados presentados en la figura 1A, promediados a partir de seis ensayos diferentes, muestran que el androgeno aumenta de 20 a 54 % la tasa de incorporacion de BrdU. La incorporacion estimulada por la hormona se reduce fuertemente (25 % de la incorporacion de BrdU residual) por el peptido aglutinante SH3 a una concentracion de 1 nM (SH3). El efecto del peptido SH3 se comparo con el de Casodex antiandrogeno puro, que redujo en una extension similar la smtesis de ADN (21 % de la incorporacion residual de BrdU). Tambien se utilizo un peptido sintetico que corresponde a la secuencia mezclada de SEQ. ID NO.1 (SEQ. ID NO.7) (Ss). La adicion de este peptido durante la estimulacion androgenica de las celulas tiene solo un efecto inhibidor insignificante sobre la smtesis de ADN dependiente de hormonas (48 % de la incorporacion de BrdU residual). Ademas de los peptidos mencionados anteriormente, se probaron peptidos de SEQ. ID NO.2-SEQ. ID NO.4. El efecto inhibidor no fue mas fuerte que el del peptido de SEQ. ID NO.1.
El efecto del peptido de SEQ. ID NO.1 tambien se probo en la smtesis de ADN estimulada por estradiol de celulas MCF-7 de cancer de mama humano. Se cultivaron rutinariamente celulas MCF-7 en CO2 al 5 % en aire en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM,GIBCO) complementado con rojo fenol, L-glutamina 2 mM (GIBCO), penicilina (100 U/ml), gentamicina (50 pl/ml), hidrocortisona 3,75 ng/ml, insulina (Humulin 10,2 U.I/1, Roche) y suero de ternera fetal al 5 %. A continuacion, se siembran las celulas en cubreobjetos prerrecubiertos con gelatina a aproximadamente el 40 % de confluencia y se mantienen en DMEM sin rojo fenol que contiene insulina y suero de ternera despojado de carbon durante 3 dfas. Despues, se tratan las celulas MCF-7 durante 24 horas con 17p estradiol 10 nM (SIGMA, Mo) solo o en presencia de un exceso molar de 1000 veces del antiestrogeno ICI 182.780 (Astra-Zeneca) o con los peptidos indicados.
Los resultados presentados en la figura 1B, promediados a partir de seis ensayos diferentes, muestran que el estradiol (E2) aumenta de 8 a 61 % la tasa de incorporacion de BrdU. La incorporacion estimulada por la hormona se reduce significativamente (23 % de la incorporacion de BrdU residual) por el peptido aglutinante SH3 (SH3) a una concentracion de 1 nM. El efecto del peptido SH3 es comparable con el del antiestrogeno puro ICI 182.780 que anulo la smtesis de ADN inducida por estrogenos (7 % de la incorporacion residual de BrdU). La secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss) no tiene un efecto significativo sobre la smtesis de ADN inducida por estrogenos.
El peptido de SEQ. ID NO.1 finalmente se analiza en cuanto a su capacidad para reducir o inhibir la smtesis de ADN inducida por EGF en celulas LNCaP de cancer de prostata humano (1C) y MCF-7 (1D). Se cultivan las celulas LNCaP y MCF-7 como se describio anteriormente, luego se siembran en cubreobjetos. Despues, se estimulan las celulas con 100 ng/ml de EGF altamente purificado (Boheringer, CA) en ausencia o en presencia del peptido de SEQ. ID NO.1 1 nM.
En la figura 1C, se puede observar que el EGF estimula la incorporacion de BrdU del 8 al 21 %. La adicion del peptido reduce a 5,8 % la incorporacion de BrdU, similar al antiestrogeno puro, ICI 182.780 (7 % de incorporacion residual). La secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss) tiene un pequeno efecto sobre la incorporacion de BdrU (15 % de incorporacion residual). En celulas MCF-7, como se muestra en la figura 1D, EGF tambien estimula la incorporacion de BrdU (de 6 a 36 %); la adicion del peptido reduce al 13 % la incorporacion de BrdU, e ICI 182.780 al 9 % de la incorporacion residual. Por el contrario, la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss) no reduce la incorporacion de BdrU (48 % de la incorporacion)
PROCEDIMIENTOS
La smtesis de ADN se ensaya en celulas individuales mediante un pulso de 6 h con BrdU (Boeheringer) 100 pM (concentracion final). Se fijan las celulas en cubreobjetos y se incuban con mAbs anti-BrdU de raton conjugados con
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fluorescema (1:1 en PBS) diluidos (clon BMC9318 de Boheringer Mannheim Co., IN), luego se lavan tres veces con PBS. Los anticuerpos de raton se revelan utilizando anticuerpos anti-raton de cabra conjugados con rojo Texas diluidos (1:200 en PBS) (Calbiochem, CA). Todos los cubreobjetos se lavan tres veces en PBS, se invierten y se montan en Moviol (Calbiochem, CA) sobre portaobjetos de vidrio. Se analizan las diapositivas utilizando un microscopio de fluorescencia Axiophot (Zeiss).
Ejemplo 3: inhibicion de la asociacion de RA estimulada por androgenos con Src mediante el peptido derivado de RA (aglutinante Src-SH3) (SEQ. ID NO.1)
Se ha demostrado que RA unidos a hormonas interactuan con el dominio SH3 de quinasa Src probablemente a traves de un estiramiento con prolina (Migliaccio y col., 2000). Como consecuencia de esta interaccion, se activan la quinasa y las rutas de senalizacion cadena abajo y, finalmente, se activa la smtesis de ADN. La utilizacion de secuencias peptidicas pequenas que imitan el dominio de RA implicado en esta interaccion debena ser capaz de inhibir por competencia la asociacion RA-Src y bloquear la smtesis de ADN. Para probar esta hipotesis se cultivan rutinariamente celulas LNCaP en CO2 al 5 % en aire en medio RPMI 1640 (GIBCO) complementado con rojo fenol, L-glutamina 2 mM (GIBCO), penicilina (100 U/ml), gentamicina (50 pl/ml), insulina ( 0,2 U.I./ml) y suero de ternera fetal al 10 %. Las celulas se mantienen en RPMI 1640 sin rojo fenol y se complementan con glutamina, penicilina, gentamicina e insulina como se indica anteriormente y que contiene suero de ternera fetal despojado de carbon al 10 % durante 4 dfas mas. Despues, se estimulan las celulas con R1881 10 nM solo o en presencia de un exceso de 1000 veces de Casodex anti-androgeno o de 1 nM del peptido de SEQ. ID NO.1 o de 1 nM de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (SEQ. ID NO.7) durante 2 minutos, y se lisan. Los lisados celulares se someten a inmunoprecipitacion utilizando anticuerpos monoclonales de raton anti-Src (Clon 327, Oncogene Science, Manhasset, NY). Las protemas inmunoprecipitadas se resuelven en un gel de SDS-poliacrilamida al 12 % y, a continuacion, se transfieren a filtros de nitrocelulosa. Se incuban los filtros con anticuerpos anti-Src o anticuerpos monoclonales antiRA de raton. Se revelan los inmunocomplejos en los filtros de nitrocelulosa utilizando anticuerpos anti-raton unidos a peroxidasa con un sustrato quimioluminiscente (Pierce Chemicals, IL). Como era de esperar, en celulas tratadas con hormonas, el RA es coinmunoprecipitado por anticuerpos anti-Src (Figura 2A, Carril 2). La asociacion entre RA y Src se anula cuando las celulas LNCaP se estimulan con hormona en presencia de Casodex (Carril 3). De forma similar, el RA no es coinmunoprecipitado por anticuerpos anti-Src en celulas tratadas con androgenos y el peptido aglutinante SH3. Por el contrario, la asociacion de Src-RA estimulada por la hormona solo se ve afectada ligeramente por el tratamiento con la misma concentracion de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss, SEQ. ID NO.7).
PROCEDIMIENTOS
Preparacion de lisados de celulas. Se suspenden las celulas en 1 ml de tampon de lisis: Tris-HCl 50 mM, pH 7,40, que contiene MgC12 5 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,5 % y se deja en agitacion suave durante 2 minutos, a 4 °C. Luego, se centrifugan las suspensiones a aproximadamente 800 g durante 30 minutos y se recoge el sobrenadante y se utiliza para inmunoprecipitacion.
Ejemplo 4: inhibicion de la asociacion de RE estimulada por estrogenos con Src mediante el peptido (aglutinante Src-SH3) derivado de RA (SEQ. ID NO.1).
Se ha demostrado previamente que RE junto con RA forman un complejo ternario con Src (Migliaccio y col., 2000). La inhibicion de la interaccion de RE o RA con Src conduce a la interrupcion de este complejo ternario y la inhibicion de la senalizacion mediada por Src. Por lo tanto, la inhibicion de la interaccion RA-Src por el peptido(s) aglutinante(s) SH3 tambien debena suprimir la asociacion de REa con Src y la transduccion de senal inducida por estradiol. Para abordar este punto, se cultivan celulas MCF-7 que proceden de cancer de mama en CO2 al 5 % en aire en medio DMEM (GIBCO) complementado con rojo fenol, L-glutamina 2 mM (GIBCO), penicilina (100 U/ml), gentamicina (50 pl/ml), hidrocortisona (3,75 ng/ml), insulina (0,2 U.I./ml) y suero de ternera fetal al 5 %. Luego las celulas se mantienen en DMEM sin rojo fenol y se complementan con glutamina, penicilina, gentamicina e insulina como se indica anteriormente y que contiene suero de ternera fetal despojado de carbon al 5 % durante 4 dfas mas. Despues, se estimulan las celulas con 17p estradiol 10 nM solo o en presencia de un exceso de 1000 veces del antiestrogeno ICI 182.780 o de 1 nM del peptido de SEQ. ID NO.1 o de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO. 1 durante 3 minutos y se lisan. Los lisados celulares se someten a inmunoprecipitacion utilizando anticuerpos monoclonales de raton anti-Src (Oncogene Science, Manhasset, NY). Las protemas inmunoprecipitadas se resuelven en un gel de SDS-poliacrilamida al 12 % y, a continuacion, se transfieren a filtros de nitrocelulosa. Se incuban los filtros con anticuerpos anti-Src o anticuerpos monoclonales antiRA de raton. Se revelan los inmunocomplejos en los filtros de nitrocelulosa utilizando anticuerpos anti-raton unidos a peroxidasa con un sustrato quimioluminiscente como se describe anteriormente.
Como era de esperar, en celulas tratadas con hormonas, el RE se coinmunoprecipita con anticuerpos anti-Src (Figura 2B, Carril 2). La asociacion entre el RE y Src se anula cuando las celulas MCF-7 se estimulan con hormona en presencia de ICI 182.780 (Carril 3). El RE no es coinmunoprecipitado por anticuerpos anti-Src en celulas tratadas con androgenos y el peptido aglutinante SH3 a una concentracion de 1 nM. La asociacion de Src-RE solo se ve afectada ligeramente por el tratamiento con la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 a 1 nM (Ss).
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Ejemplo 5: inhibicion de la expresion de ciclina-d estimulada por androgenos por el peptido AR-Y (aglutinante Src-SH3) (SEQ. ID NO.1) en celulas de cancer de prostata (LNCAP) y de cancer de mama (MCF- 7).
Los receptores de estrogenos y androgenos estimulan Src, que a su vez activa las vfas de la fosfatidil-3-quinasa (PI3-K) (Castoria y col., 2000). La activacion de PI3-K conduce a la fosforilacion de PKB/quinasa Akt que da como resultado una expresion aumentada de Ciclina D1. Esto impulsa a las celulas dependientes de hormonas hacia la transicion G1/S del ciclo celular (Castoria y col., 2000). La inhibicion de Src o PI3-K causa la acumulacion de celulas en la fase G1 y el bloqueo de la smtesis de ADN. Por lo tanto, los peptidos aglutinantes SH3 podnan utilizarse para inhibir la expresion de la ciclina D1 dependiente de quinasa Src y PI-3K. Para verificar esta posibilidad, se agrega el peptido aglutinante SH3 (SEQ. ID NO.1) a las celulas MCF-7 y LNCaP estimuladas con el androgeno. Se cultivan rutinariamente las celulas MCF-7 y LNCaP como se describio anteriormente. Despues, se mantienen las celulas durante al menos 4 dfas en medio sin rojo fenol complementado como se describio anteriormente y se anade suero de ternera fetal tratado con carbon revestido con dextrano para minimizar la concentracion de esteroides. Luego, se tratan las celulas con R1881 10 nM solo o en presencia del peptido aglutinante SH3 1 nM (SH3, SEQ. ID NO. 1) o 1 nM de la secuencia modificada del peptido de SEQ. ID NO.1 (SEQ. ID NO.7) (Ss) durante 6 horas, luego, se lisan y se someten a western blot utilizando anticuerpos anticiclina D1 (Figura 3A, panel superior e inferior). Como era de esperar, el androgeno estimula la expresion de ciclina D1 en celulas MCF-7 y LNCaP. El inhibidor de PI3-K, LY 294.002, a una concentracion de 5 pM y el inhibidor de Src, PP2 (no mostrado), anulan la expresion de ciclina estimulada por hormona. La adicion del peptido aglutinante SH3 1 nM (SEQ. ID NO.1) (SH3) tambien suprime la induccion de ciclina D mediante R1881 mientras que la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss) solo reduce parcialmente este efecto.
Ejemplo 6: inhibicion de la expresion de ciclina-dl estimulada por estrogenos por el peptido (aglutinante Src-SH3) (SEQ. ID NO.1) derivado de RA en celulas de cancer de prostata (LNCAP) y de mama (mCf-7).
Para probar el efecto del peptido aglutinante SH3 (SEQ. ID NO.1) sobre la expresion de ciclina D1 estimulada por estrogenos, se anade este peptido a celulas LNCaP y MCF-7 estimuladas con 17p-estradiol 10 nM (Figura 3B). Se cultivan rutinariamente las celulas MCF-7 y LNCaP como se describio anteriormente. Despues, se mantienen las celulas durante al menos 4 dfas en medio sin rojo fenol complementado como se describio anteriormente y se anade suero de ternera fetal tratado con carbon revestido con dextrano para minimizar la contaminacion de esteroides. Luego, se tratan las celulas con 17p estradiol 10 nM solo o en presencia del inhibidor de PI-3K LY 294.002 (5 pM) o del peptido aglutinante SH3 1 nM (SEQ. ID NO.1) o de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (SEQ. ID No.7) 1 nM durante 6 horas (Figura 3B, paneles superior e inferior), luego, se lisan y se someten a western blot utilizando anticuerpos anticiclina D1 como se describio anteriormente. Como el androgeno, 17p estradiol estimula la expresion de ciclina D1. El inhibidor de PI3-K, LY 294.002, tambien anula, en este caso, la expresion de ciclina estimulada por hormona. El peptido aglutinante SH3 1 nM (SEQ. ID NO.1) (SH3) suprime completamente la induccion de ciclina D mediante estrogeno mientras que el peptido mezclado de SEQ. ID NO.1 (Ss) tiene un pequeno efecto.
Ejemplo 7. Inefectividad en la transcripcion genica dependiente del receptor de androgenos del peptido (aglutinante Src-sh3) derivado de RA (SEQ. ID NO.1) en celulas de cancer de prostata (LNCaP) y cancer de mama (MCF-7).
Los receptores esteroidales generalmente se conocen como factores de transcripcion activados por ligandos. Por lo tanto, es importante evaluar si el efecto antiandrogeno del peptido aglutinante SH3 implica la actividad transcripcional del receptor de androgenos. Se transfectan celulas LNCaP, mantenidas en CO2 al 5 % en aire en medio RPMI 1640 (GIBCO) complementado con rojo fenol, L-glutamina 2 mM (GIBCO), penicilina (100 U/ml), gentamicina (50 pl/ml), insulina y suero de ternera fetal al 10 %, con un gen indicador disenado mediante ingeniena genetica en un vector de expresion pSG5 con el gen luciferasa bajo el control de un elemento sensible a androgenos (ARE3416) (Verrijdt y col., 2000). Seis horas despues de la transfeccion, se reemplazo el medio por medio fresco y se dejaron las celulas durante 24 horas mas en ausencia o en presencia de R1881 10 nM solo o con un exceso de 1000 veces de Casodex o con el peptido aglutinante SH3 1 nM (SEQ. ID NO.1) o con la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 1 nM (sEq. ID. NO.7). Se evaluan los lisados de celulas para la actividad de luciferasa. El mismo experimento se repite para analizar el efecto del peptido antiandrogeno en la actividad transcripcional del receptor de estrogenos en celulas de cancer de mama humano. Se transfectan celulas MCF-7, mantenidas en CO2 al 5 % en aire en medio DMEM (GIBCO) complementado con rojo fenol, L-glutamina 2 mM (GIBCO), penicilina (100 U/ml), gentamicina (50 pl/ml), hidrocortisona (3,75 ng/ml), insulina ( 0,2 U.I./ml) y suero de ternera fetal al 5 %, con un gen indicador QUALE clonado en un vector de expresion pSG5 con el gen luciferasa bajo el control de un elemento sensible a estrogenos. Finalmente, se evaluan los lisados de celulas para la actividad de luciferasa.
La figura 4A muestra la actividad de luciferasa en celulas LNCaP no tratadas (barra 1), en celulas estimuladas con R1881 solo (barra 2) o en presencia de exceso de Casodex (barra 3), o del peptido SH3 (SH3) (barra 4) o del peptido mezclado de SEQ. iD NO.1 (Ss) (barra 5).
La figura 4B muestra la actividad de luciferasa en celulas MCF-7 no tratadas (barra 1), en celulas estimuladas con 17p estradiol solo (barra 2) o en presencia de exceso de ICI 182.780 (barra 3), o del peptido de SEQ. ID NO. 1
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(SH3) (barra 4) o de la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 (Ss) (barra 5).
Se puede observar que mientras que el antiandrogeno convencional inhibe completamente la transcripcion inducida por androgenos del gen indicador, ni el peptido SH3 ni la secuencia mezclada del peptido de SEQ. ID NO.1 afectan la actividad transcripcional de los RA.
Ejemplo 8. Efectos antitumorales "in vivo" del peptido aglutinante Src-SH3 derivado de RA (SEQ. ID NO. 1)
Dado que los resultados de los estudios de crecimiento tumoral in vitro e in vivo pueden ser divergentes, se ha estudiado la respuesta del crecimiento de las celulas LNCaP y MCF-7 al peptido antiandrogeno in vivo. Se suspenden celulas LNCaP, cultivadas en condiciones rutinarias descritas anteriormente, en solucion de Matrigel al 50 % (vol/vol) en PBS esteril (pH 7,4) y se inyectan por via subcutanea en la region dorsal posterior a 2,5 x 106 celulas/ratones atfmicos masculinos (ratones CD, Charles-River) sin cebado hormonal.
Despues de 14-21 dfas, se distribuyen aleatoriamente animales con tumores de tamano similar para el tratamiento con el peptido aglutinante SH3, SEQ. ID NO.1, o con vehfculo solo durante 5 semanas adicionales. El tratamiento se inicia con tumores de aproximadamente 200-400 mm3 de tamano. Se miden los volumenes tumorales de los xenoinjertos de celulas LNCaP con o sin tratamiento mediante una pinza y se registran de acuerdo con la formula D x d2 x 0,5, en la que D es la longitud y d es el ancho del tumor.
Para el tratamiento de cada animal con el peptido, se administran intraperitonealmente a los ratones 200 pl del peptido de SEQ. ID NO.1 aglutinante SH3 20 nM disuelto en DMSO al 0,1 % o la misma cantidad de vehfculo solo en dfas alternos. Dichos estudios son especialmente importantes para evaluar la eficacia de los peptidos como posibles agentes terapeuticos en las celulas de cancer de prostata y de mama humano, que expresan los niveles de receptores de androgenos que se encuentran comunmente en malignicencias humanas. La dosis, el tipo y el tamano de estos peptidos (formula general S1 y SEQ. ID NO.1 a SEQ. ID NO.6) y la ruta de liberacion de los peptidos son factores que pueden determinarse utilizando una habilidad normal en la materia.
La figura 5A muestra la tasa de crecimiento de los xenoinjertos de las celulas LNCaP en ratones macho desnudos tratados con el peptido aglutinante SH3 (SH3) o con vehfculo solo (control).
Los autores observaron que en este modelo, la masa tumoral fue significativamente menor en el grupo tratado con SH3 en comparacion con el grupo control. No se encuentra diferencia entre el peso de los ratones tratados con la solucion del vehfculo o el peptido (datos no mostrados). El efecto de los peptidos antiandrogenicos tambien se analiza en los xenoinjertos de las celulas MCF-7 de cancer de mama establecidos en ratones desnudos (figura 5B). En este caso, se suspenden celulas MCF-7, cultivadas previamente como se describio anteriormente, en solucion de Matrigel al 50 % (vol/vol) en PBS esteril y se inyectan por via subcutanea a 2,5 x 106 celulas/animal en ratones machos atfmicos. Despues de 14-21 dfas, se distribuyen aleatoriamente animales con tumores de tamano similar para el tratamiento con el peptido aglutinante SH3, SEQ. ID. NO.1, o con vehfculo solo durante 5 semanas adicionales. Los tumores al comienzo del tratamiento miden aproximadamente 1000 mm3. Se administran intraperitonealmente a los ratones 200 pl del peptido aglutinante SH3 20 nM en DMSO al 0,1 % o el mismo volumen de vehfculo solo en dfas alternos. Los volumenes tumorales del xenoinjerto de celulas cancerosas MCF-7 con o sin tratamiento se miden y registran como se informo anteriormente. No se encuentra diferencia de peso corporal entre los ratones control o los ratones tratados con el peptido.
De forma similar a lo que se observo para el modelo de los xenoinjertos de las celulas LNCaP, los autores tambien encontraron en el modelo de los xenoinjertos de las celulas MCF-7 que la masa tumoral era menor en el grupo tratado con SH3 en comparacion con el grupo control. No se encuentra diferencia entre el peso de los ratones tratados con la solucion del vehfculo o el peptido (datos no mostrados).
Al final del tratamiento, se sacrifican los animales y se analizan las muestras tumorales para determinar el anrtgeno Ki67 y las celulas apoptoticas. En resumen, se cortan las secciones de cada muestra a 3-5 micras, montado sobre vidrio y secado durante la noche a 37 °C. Todas las secciones se desparafinizan en xileno, se rehidratan a traves de una serie graduada de alcohol y se lavan en PBS. Este tampon se utiliza para todos los lavados posteriores y para la dilucion de anticuerpos. Se realiza un examen con microscopio de luz despues de tenir con hematoxilina/eosina y hematoxilina/Van Gieson. Para inmunohistoqmmica, las secciones de tejido se calientan dos veces en un horno de microondas durante 5 minutos cada una a 700 W en tampon de citrato (pH 6) y luego se procesan con el procedimiento estandar de estreptavidina-biotina-inmunoperoxidasa (DAKO Universal Kit, DAKO Corporation, Carpinteria, California, USA). El Ki67 antihumano de conejo de DAKO se utiliza a una dilucion 1:100. Se incubo el anticuerpo primario durante 1 hora a temperatura ambiente. La diaminobenzidina se utiliza como el cromogeno final y la hematoxilina como la contratincion nuclear. Se realizan controles negativos para cada seccion de tejido omitiendo el anticuerpo primario. Los controles positivos incluidos en cada experimento consisten en tejido que previamente se ha demostrado que expresa el antfgeno de interes. Dos observadores evaluan el patron de tincion de las dos protemas por separado y puntuan la expresion de la protema en cada muestra escaneando toda la seccion y estimando el numero de celulas positivas visibles para el campo de alta potencia 10X20. El nivel de concordancia, expresado como porcentaje, de acuerdo entre los observadores, es del 92 %. En las muestras restantes, se obtiene la puntuacion despues de la revision y el acuerdo colegial. Se realiza la reaccion de TUNEL
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Los autores observaron en muestras de xenoinjerto tumoral de LNCaP una reduccion significativa en el porcentaje de celulas positivas al anrtgeno Ki-67 (P < 0,002, figura 6A, panel izquierdo) y un aumento significativo en el numero de celulas positivas para TUNEL (P < 0,009, figura 6A, panel derecho) en el grupo tratado con SH3 en comparacion con el grupo control. Se encontro un resultado similar para las muestras de xenoinjerto tumoral de MCF-7 (figura 6B panel izquierdo y derecho).
Ejemplo 9: preparacion de composiciones de anticuerpos
Los peptidos sinteticos y peptidos recombinantes descritos anteriormente pueden utilizarse en la generacion de una respuesta inmune en un animal o un ser humano y para la preparacion de anticuerpos espedficos para estos epftopos. La preparacion de vacunas y anticuerpos es bien conocida por los expertos en la materia como se describio en el presente documento anteriormente. En resumen, los nuevos peptidos de la presente invencion pueden utilizarse como anrtgenos en animales de la siguiente manera:
Cada peptido puede estar acoplado a la hemocianina de lapa californiana (KLH, del ingles keyhole limpet hemocyanin) y utilizarse para inmunizar subcutaneamente ratones BALB/c. Las inyecciones iniciales contienen 250 pg de protema y se refuerzan los ratones 7 semanas mas tarde con 250 |jg del respectivo peptido acoplado a la KLH y luego se sangran 1 semana despues. Se prueban los anticuerpos policlonales producidos por los ratones inyectados por su capacidad para reconocer el anrtgeno peprtdico en un ensayo ELISA. Los Abs tambien se analizan en cuanto a su capacidad para inhibir la smtesis de ADN inducida por RA.
Referencias
Allen, Choun 1987 FEBS Lett. 223: 42-46
Bodansky M, Bodansky A 1995 The practice of peptide synthesis (2a ed.), Springer Verlag, Berlin Boonyaratanakornkit V. y col., 2001 Mol Cell, 8: 269-280 Capecchi C 1980 Cell, 22(2):479-488,.
Carpino LA, Han GY 1972 J. Org. Chem. 37: 3404-3409
Castoria G, Barone MV, D1 Domenico M, Bilancio A, Ametrano D, Migliaccio A y Auricchio F 1999 EMBO J. 18: 2500-2510
Chodak GW, y col., 1992 J Urol 147:798-803 Clapp 1993 Clin. Perinatol., 20(1): 155-168
Couvreur, Tulkens, Roland, Trouet, Speiser 1977 FEBS Lett. 84(2):323-326 Couvreur 1988 Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5:1-20 Curiel, y col., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(19):8850-8854
Dawson NA, Vogelzang NJ 2000 Secondary hormonal therapy. In: Resnick MI, Thompson MI, eds. Advanced therapy of prostate disease. Hamilton, Ontario: BC Decker; 378-384 Denis LJ, Griffiths K 2000 Sem Surg Oncol 18:52-74 Eglitis, Anderson 1988 6(7): 608-614,.
Eglitis, y col., 1988 Avd. Exp. Med. Biol. 241:19-27,.
Fields GB, Noble RL 1990 Int. J. Pep Prot Res 35: 161-214
Fowler JE, Whitmore WF 1982 Cancer 49:1373-1377
Fromm, Taylor, Walbot, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82(1 7):5824-5828
Gabizon, Papahadjopoulos 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6949-6953
Graham FL y van der Eb AJ, 1973 Virology 54(2): 536-539
Hobisch A, y col., 1996 Prostate 28:129-135
Kay BK y col., 2000 FASEB J: 14, 231-235
Lee D 2003 Clin Prostate Cancer 2: 13-14
Migliaccio A, y col., 2000 EMBO J, 19: 5406-5417
Migliaccio A, y col., 1996 EMBO J. 15: 1292-1300
Migliaccio A, y col., 2005 Cancer Res, 65: 10585-10593.
Mohler JL, y col., 1996 Clin Cancer Res 2:889-895
Moinfar F, y col., 2003 Cancer 98: 703-711
Moss GP 1996 Pure and Applied Chemistry 68: 2193-2222
Rink H 1987 Tetrahedron Lett. 28: 3787-3790
Roy AK, y col., 1999 Vit. Horm. 55:309-352
Sadi MV, Walsh PC, Barrack ER 1991 Cancer 67: 3057-3064
Schatzl G, Madersbacher S, Gsur A, Preyer M, Haidinger G, Haitel A, Vutuc C, Micksche M, Marberger M 2002 Prostate 52:130-138
Shi,Liu, Lippman, Dickson, 1994 Human Reprod., 9: 162-173 Siiteri PK, Wilson JD 1974 J Clin. Endocrinol. Metab 38:113-125
Tam JP, Spetzler JC, 1997 Methods Enzymol. 289: 612-37 Tuchscherer G y Mutter M, 1996 Pure&App/. Chem.; 68, 11: 2153-2162
van der Kwast Th, Schalken J, Ruizeveld de Winter JA, van Vroonhoven CCJ, Mulder E, Boersma W, Trapman J 1991 Int J Cancer 48:189-193
5 Verrijdt y col. 2000 J. Biol. Chem 275: 12298-12305
Wagner E., y col., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 Williams JC y col. 1998 TIBS: 23, 179-184
Wong y Neumann 1982 Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2): 584-587 Yang y col. 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 9568-9572,
10

Claims (18)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Una molecula derivada de peptido aislada o purificada o parcialmente purificada que presenta la formula general:
    X- [(Pro)n-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m- Y (S1)
    en la que X es H, o un grupo acetilo o cualquier aminoacido natural o secuencia de aminoacidos provista con un grupo NH2 libre o al menos derivado de acetilo; Y es un grupo OH o un grupo NH2; "n" es un numero entero de 1 a 10 y "m" es un numero entero de 1 a 3; y en la que la secuencia de aminoacidos de la molecula derivada de peptido se selecciona del grupo que consiste en:
    Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO. 1);
    Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO. 2); Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO. 3); y Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys (SEQ. ID NO. 4).
  2. 2. La molecula derivada de peptido, de acuerdo con la reivindicacion 1, capaz de inhibir o evitar la interaccion del receptor de androgenos (RA) con el dominio SH3 de la tirosina quinasa Src.
  3. 3. La molecula derivada de peptido, de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que tiene actividad antitumoral in vitro o in vivo.
  4. 4. La molecula derivada de peptido, de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, que tiene la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:
    Ac-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2;
    Ac-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2; Ac-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2; y Ac-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2.
  5. 5. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad farmaceuticamente aceptable y eficaz de la molecula derivada de peptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  6. 6. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que (i) dicho peptido puede unirse a una molecula transportadora y/o estar comprendido en una composicion lipfdica con un excipiente farmaceutico; y/o (ii) la composicion comprende al menos un segundo agente anticanceroso.
  7. 7. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que la molecula transportadora es BSA o KLH.
  8. 8. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que la composicion lipfdica es una partfcula lipfdica, una nanocapsula, un liposoma o vesfculas lipfdicas.
  9. 9. Una molecula derivada de peptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 o una composicion farmaceutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para su uso como un medicamento.
  10. 10. La molecula derivada de peptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 o la composicion farmaceutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para su uso como un agente antitumoral.
  11. 11. La molecula derivada de peptido de acuerdo con la reivindicacion 10 o la composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 10 para su uso contra (i) cancer de mama o de prostata y/o (ii) otros canceres que expresan receptores de androgenos solos o junto con receptores de estradiol.
  12. 12. Uso de la molecula derivada de peptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 para la preparacion de un medicamento.
  13. 13. Uso de una molecula derivada de peptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de cancer.
  14. 14. El uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que el medicamento es para el tratamiento de (i) cancer de mama o de prostata y/o (ii) otros canceres que expresan receptores de androgenos solos o junto con receptores de estradiol.
  15. 15. Un anticuerpo capaz de reconocer espedficamente una molecula derivada de peptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  16. 16. Un kit que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 15, unido operativamente a una etiqueta detectable y a reactivos de inmunodeteccion en recipientes unicos o multiples.
  17. 17. Una secuencia de acidos nucleicos que codifica un peptido o un vector recombinante que expresa un peptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  18. 18. Celulas hospedadoras de mairnfero, de ser humano o de bacterias que contienen la secuencia de acidos nucleicos o el vector recombinante de acuerdo con la reivindicacion 17.
    5 19. Un procedimiento in vitro para matar una celula cancerosa, que incluye una celula de cancer de mama o de
    prostata, que comprende proporcionar a la celula una molecula derivada de peptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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GB2496135B (en) * 2011-11-01 2015-03-18 Valirx Plc Inhibitors of the interaction between a Src family kinase and an androgen receptor or estradiol receptor for treatment of endometriosis
GB2513615A (en) * 2013-05-01 2014-11-05 Cancer Rec Tech Ltd Medical use
WO2014188775A1 (ja) * 2013-05-23 2014-11-27 国立大学法人東北大学 アンドロゲンレセプター活性依存性乳癌細胞株の作製方法、当該細胞株を用いたスクリーニング方法、ならびに乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター活性依存性獲得の判定方法、キット及びマーカー
KR102417496B1 (ko) * 2019-11-29 2022-07-06 (주)수파드엘릭사 안드로겐 수용체의 활성을 억제하는 폡타이드 및 이를 이용하는 화장료 조성물
EP4157309A1 (en) 2020-06-01 2023-04-05 Black Cat Bio Limited Compositions and methods for treating infections and netopathy
AU2023215340A1 (en) * 2022-02-04 2024-09-19 AecorBio Inc. Medicinal uses of oligopeptides in combination with an antiandrogen

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1005357A1 (en) * 1997-04-14 2000-06-07 The Regents Of The University Of California Peptide antiestrogen compositions and methods for treating breast cancer
WO2000001813A2 (en) 1998-06-30 2000-01-13 The University Of British Columbia Peptide inhibitors of androgen-independent activation of androgen receptor
WO2002060935A2 (en) * 2000-12-21 2002-08-08 The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services A chimeric protein comprising non-toxic pseudomonas exotoxin a and type iv pilin sequences
CA2446819A1 (en) * 2001-05-08 2002-11-14 Merck & Co., Inc. Dna molecules encoding macaca mulatta androgen receptor
US7160989B2 (en) * 2003-05-30 2007-01-09 New York University Antibodies that recognize and bind phosphorylated human androgen receptor and methods of using same
WO2007041497A2 (en) * 2005-09-30 2007-04-12 Cleveland Biolabs, Inc. Modulation of androgen receptor
US20100189776A1 (en) * 2007-03-16 2010-07-29 Cancer Research Technology Ltd Anti-androgen peptides and uses thereof in cancer therapy

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