ES2677348T3

ES2677348T3 - Un virus del dengue quimérico recombinante rDEN3/4delta 30(ME), rDEN2/4delta30(ME) o rDEN1/4delta30(ME) que contiene una deleción de 30 nucleótidos (delta30) en una sección de la región no traducida en 3' del genoma del dengue de tipo 4, en donde dicha deleción de 30 nucleótidos se corresponde con la estructura tallo-bucle de TL2

Info

Publication number: ES2677348T3
Application number: ES10177735.7T
Authority: ES
Inventors: Stephen S. Whitehead; Brian R. Murphy; Lewis Markoff; Barry Falgout; Joseph Blaney; Kathryn Hanley; Ching-Juh Lai
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2002-05-03
Filing date: 2003-04-25
Publication date: 2018-08-01
Anticipated expiration: 2023-04-25
Also published as: BRPI0309631A2; HUE037330T2; TR201806655T4; ES2355719T3; PT1554301E; US20070009552A1; WO2003092592A3; EP2338508A1; US20180010099A1; SI2338508T1; BRPI0309631B1; USRE46641E1; EP3205352A1; EP2338508B1; US20090258036A1; EP3763382A1; AU2003231185A1; US20200392469A1; JP4977811B2; US20130011433A1

Abstract

Un virus del dengue quimérico recombinante que comprende una quimera de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural C del virus del dengue tipo 4 y las proteínas estructurales M y E del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 2 o del virus del dengue de tipo 3, en donde la región del virus del dengue de tipo 4 que codifica las proteínas estructurales M y E se sustituye por la región que codifica dichas proteínas estructurales M y E del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 2 o del virus del dengue de tipo 3, y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales del virus del dengue de tipo 4 y la región no traducida en 3' del genoma del dengue de tipo 4 que contiene una deleción de 30 nucleótidos que se corresponde con la estructura de tallo-bucle de TL2 entre los nucleótidos 10478-10507 del genoma del dengue de tipo 4.

Description

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DESCRIPCION

Un virus del dengue quimerico recombinante rDEN3/4delta 30(ME), rDEN2/4delta30(ME) o rDEN1/4delta30(ME) que contiene una delecion de 30 nucleotidos (delta30) en una seccion de la region no traducida en 3' del genoma del dengue de tipo 4, en donde dicha delecion de 30 nucleotidos se corresponde con la estructura tallo-bucle de TL2

Campo de la invencion

La divulgacion se refiere a una vacuna contra el virus del dengue que contiene virus del dengue quimericos de serotipos 1, 2, 3 y 4 y que comprende una delecion comun de 30 nucleotidos (A30) en la region no traducida en 3' del genoma del virus del dengue serotipos 1, 2, 3 y 4.

Antecedentes de la invencion

El virus del dengue es un virus de ARN de sentido positivo que pertenece al genero Flavivirus de la familia Flaviviridae. El virus del dengue esta ampliamente distribuido por todas las regiones tropicales y semitropicales del mundo y se transmite a seres humanos por vectores de mosquitos. El virus del dengue es una causa importante de hospitalizacion y muerte en ninos en al menos ocho pafses asiaticos tropicales (WHO 1997 Dengue Haemorrhagic Fever: Diagnosis, Treatment, Prevention, and Control 2a edicion, Ginebra). Hay cuatro serotipos de virus del dengue (DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4) que provocan anualmente unos 50-100 millones de casos estimados de fiebre del dengue y 500.000 casos de la forma mas grave de infeccion por virus del dengue conocida como fiebre hemorragica del dengue/smdrome de choque del dengue (FHD/SCD) (Gubler, D.J. y Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53: 35-70). Esta ultima enfermedad se observa predominantemente en ninos y adultos que experimentan una segunda infeccion por virus del dengue con un serotipo diferente del de su primera infeccion por virus del dengue y en infeccion primaria de lactantes que todavfa tienen anticuerpo materno espedfico del dengue en circulacion (Burke, D.S. et al. 1988 Am J Trop Med Hyg 38:172-180; Halstead, S.B. et al. 1969 Am J Trop Med Hyg 18:997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-575). Es necesaria una vacuna contra el dengue para atenuar la carga de la enfermedad provocada por el virus del dengue, pero no se ha autorizado ninguna. Debido a la asociacion de una enfermedad mas grave con la infeccion secundaria por virus del dengue, una vacuna satisfactoria debe inducir simultaneamente inmunidad para los cuatro serotipos. La inmunidad esta mediada principalmente por un anticuerpo neutralizante dirigido contra la glucoprotema de la envoltura (E), una protema estructural del virion. La infeccion con un serotipo induce inmunidad homotipica de larga duracion y una inmunidad heterotfpica de corta duracion (Sabin, A. 1955 Am J Trop Med Hyg 4:198-207). Por tanto, el objetivo de la inmunizacion es inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes de larga duracion contra DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4, lo que puede lograrse de la mejor manera desde el punto de vista economico usando vacunas de virus atenuados vivos. Este es un objetivo razonable puesto que ya se ha desarrollado una vacuna de virus atenuado vivo para el virus de la fiebre amarilla relacionado, otro flavivirus transmitido por mosquitos presente en regiones tropicales y semitropicales del mundo (Monath, T.P. y Heinz, F.X. 1996 en: Fields Virology, Fields, D.M et al. eds. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, pags. 9611034).

Se han desarrollado varios candidatos a vacuna contra el dengue atenuado vivo y se han evaluado en seres humanos y primates no humanos. Los primeros candidatos a vacuna contra el dengue atenuado vivo fueron mutantes de espectro de hospedadores desarrollados mediante pase en serie de virus del dengue de tipo natural en los cerebros de ratones y seleccion de mutantes atenuados para seres humanos (Kimura, R. y Hotta, S. 1944 Jpn J Bacteriol 1:96-99; Sabin, A.B. y Schlesinger, R.W. 1945 Science 101:640; Wisserman, C.L. et al. 1963 Am J Trop Med Hyg 12:620-623). Aunque estos virus candidatos a vacuna eran inmunogenicos en seres humanos, su escaso crecimiento en cultivo celular desaconsejo el desarrollo adicional. Se han desarrollado candidatos a vacuna de DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4 atenuados vivos mediante pase en serie en cultivo de tejido no humano (Angsubhakom, S. et al. 1994 Southeast Asian J Trop Med Public Health 25:554-559; Bancroft, W.H. et al. 1981 Infect Immun 31:698-703; Bhamarapravati, N. et al. 1987 Bull World Health Organ 65:189-195; Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33: 684-698; Hoke, C.H. Jr. et al. 1990 Am J Trop Med Hyg 43:219-226; Kanesa-Thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19: 3179-3188) o mediante mutagenesis qmmica (McKee, K.T. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-442). Se ha comprobado que es muy diffcil lograr un equilibrio satisfactorio entre atenuacion e inmunogenicidad para cada uno de los cuatro serotipos de virus del dengue usando estos enfoques y formular una vacuna tetravalente que sea segura e inmunogenica de manera satisfactoria contra cada uno de los cuatros virus del dengue (Kanesa-Thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-3188; Bhamarapravati, N. y Sutee, Y. 2000 Vaccine 18:4447).

Dos importantes avances usando tecnologfa de ADN recombinante han hecho posible recientemente desarrollar candidatos a vacuna contra virus del dengue atenuados vivos prometedores adicionales. En primer lugar, se han desarrollado metodos para recuperar virus del dengue infeccioso a partir de celulas transfectadas con transcritos de ARN derivados de un clon de ADNc de longitud completa del genoma del virus del dengue, haciendo asf posible derivar virus infecciosos que portan mutaciones atenuantes que se han introducido en el clon de ADNc mediante mutagenesis dirigida al sitio (Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:5139-5143). En segundo lugar, es posible producir virus quimericos antigenicos en los que la region que codifica para protemas estructurales del clon de ADNc de longitud completa del virus del dengue se reemplaza por la de un serotipo de virus del dengue diferente o de un

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flavivirus mas divergente (Bray, M. y Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-10346; Chen, W. et al. 1995 J Virol 69:5186-5190; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74: 3020-3028; Pletnev, A.G. y Men, R 1998 PNAS USA 95:17461751). Se han usado estas tecnicas para construir virus del dengue quimericos intertfpicos que han mostrado ser eficaces en la proteccion de monos frente a la exposicion a virus del dengue homologo (Bray, M. et al. 1996 J Virol 70:4162-4166). Tambien esta usandose una estrategia similar para desarrollar vacunas contra virus del dengue quimericos antigenicos atenuados basandose en la atenuacion del virus de la vacuna contra la fiebre amarilla o la atenuacion de virus del dengue sometidos a pase en cultivo celular (Monath, T.P. et al. 1999 Vacuna 17:1869-1882; Huang, C.Y. et al. 2000 J. Virol 74:3020-3028).

Otro estudio examino el nivel de atenuacion para seres humanos de un mutante de DEN4 que portaba una delecion de 30 nucleotidos (A30) introducida en su region no traducida en 3' mediante mutagenesis dirigida al sitio y que se encontro previamente que estaba atenuado para monos rhesus (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-3937). Se llevaron a cabo estudios adicionales para examinar si esta mutacion A30 presente en el candidato a vacuna de DEN4 era el determinante principal de su atenuacion para monos. Se descubrio que la mutacion A30 era de hecho el determinante principal de la atenuacion para monos, y que especificaba un equilibrio satisfactorio entre atenuacion e inmunogenicidad para seres humanos (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13).

Lai et al. (Clinical and Diagnostic Virology 10 (1998) 173-179) describe una evaluacion de determinadas estrategias moleculares para desarrollar una vacuna del dengue vivo. Construyeron ADNc quimerico intertfpico en el que los genes de C-PreM-E o solo los genes de protema estructural PreM-E del ADNc de longitud completa de dEN4 se sustituyeron con los correspondientes genes de DEN1, DEN2 o DEN3. Esto dio como resultado virus quimericos viables que expresaron las protemas estructurales protectoras de DEN1, DEN2 o DEN3 frente a un fondo de protemas no estructurales de DEN4. Se descubrio que las quimeras presentaban la antigenicidad predicha del dengue de tipo 1,2 o 3, y fueron infecciosas para los monos y capaces de inducir inmunidad protectora.

Sumario de la invencion

La mutacion atenuante A30 previamente identificada, creada en el virus del dengue tipo 4 (DEN4) mediante la eliminacion de 30 nucleotidos de la 3'-UTR, tambien puede atenuar una cepa de tipo silvestre del virus del dengue tipo 1 (DEN1). La eliminacion de 30 nucleotidos de la 3'-UTR de DEN1 en una region altamente conservada homologa a la region de DEN4 que abarca la mutacion A30 produjo un virus recombinante atenuado en monos rhesus en un nivel similar al virus recombinante DEN4A30. Esto establece la transportabilidad de la mutacion A30 y su fenotipo de atenuacion para un tipo de virus del dengue distinto de DEN4. La transferibilidad eficaz de la mutacion A30, descrita en este trabajo, establece la utilidad de la mutacion A30 para atenuar y mejorar la seguridad de vacunas contra el virus del dengue comercializables de cualquier serotipo. Los presentes inventores preven una vacuna tetravalente contra el virus del dengue que contiene virus del dengue de los tipos 1, 2, 3 y 4, cada uno atenuado mediante la mutacion A30. Los presentes inventores tambien preven una vacuna contra el virus del dengue tetravalente que contiene virus quimericos antigenicos recombinantes en los que los genes estructurales del virus del dengue tipos 1, 2 y 3 reemplazan a los de DEN4A30; 1, 2 y 4 reemplazan a los de DEN3A30; 1, 3 y 4 reemplazan a los de DEN2A30; y 2, 3 y 4 reemplazan a los de DEN1A30. En algunos casos, tales virus del dengue quimericos estan atenuados no solo mediante la mutacion A30, sino tambien por su naturaleza quimerica. La presencia de la mutacion atenuante A30 en cada componente de virus impide la reversion a un virus de tipo natural por recombinacion intertfpica. Ademas, debido a la estabilidad genetica inherente a las mutaciones de delecion, la mutacion A30 representa una excelente alternativa para el uso como una mutacion comun compartida entre cada componente de la vacuna tetravalente.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. La vacuna tetravalente contra el virus del dengue atenuado vivo contiene virus del dengue que representan cada uno de los 4 serotipos, conteniendo cada serotipo su conjunto completo de protemas estructurales y no estructurales de tipo silvestre inalteradas y una mutacion atenuante A30 compartida. La localizacion relativa de la mutacion A30 en la region no traducida (UTR) en 3' de cada componente se indica mediante una flecha.

Figura 2. A. La mutacion A30 elimina 30 nucleotidos contiguos (sombreados) de la 3'-UTR de DEN4. Los nucleotidos se numeran desde el extremo terminal 3'. B. Alineacion de la secuencia de nucleotidos de la region TL2 de DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4 y sus derivados A30. Tambien se muestra la region correspondiente para cada uno de los cuatro serotipos de DEN. Las letras mayusculas indican homologfa de secuencia entre los 4 serotipos, el subrayado indica apareamiento de nucleotidos para formar la estructura de tallo. C. Estructura secundaria pronosticada de la region TL2 de cada serotipo de DEN. Los nucleotidos que se eliminan mediante la mutacion A30 estan en un recuadro (DEN1 - entre los nucleotidos 10562 - 10591, DeN2 Tonga/74 - entre los nucleotidos 10541 - 10570, DEN3 Sleman/78 - entre los nucleotidos 10535 - 10565, y DEN4 - entre los nucleotidos 10478 - 10507).

Figura 3. Niveles de viremia en monos rhesus inoculados con candidatos a vacuna rDEN4 que portan mutaciones derivadas 5-FU. Se inocularon grupos de cuatro o dos (rDEN4 y rDEN4A30) monos con 5,0 log-10 UFP de virus por via subcutanea. Se recogio suero diariamente y se determinaron los tftulos de virus mediante ensayo de placas en

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celulas Vero. El ftmite de deteccion del virus era de 0,7 logio UFP/ml. Se indican los tftulos de virus medios para cada grupo.

Figura 4. Niveles de viremia en monos rhesus inoculados con candidates a vacuna rDEN4 que portan pares de mutaciones de carga a alanina en NS5. Se inocularon grupos de cuatro o dos (rDEN4 y rDEN4A30) monos con 5,0 logio UFP de virus por via subcutanea. Se recogio suero diariamente y se determinaron los tftulos de virus mediante ensayo de placas en celulas Vero. El ftmite de deteccion del virus era de 1,0 logio UFP/ml. Se indican los tftulos de virus medios para cada grupo. No se detecto viremia en ningun mono tras el dfa 4.

Figura 5. La mutacion A30 atenua tanto DEN1 como DEN4 para monos rhesus. Se inmunizaron grupos de 4 monos por via subcutanea con 5,0 logi0 UFP del virus indicado. Se recogio suero cada dfa tras la inmunizacion y se determinaron los tftulos de virus y se muestran como logi0 UFP/ml media.

Figura 6. A. Diagrama del plasmido de ADNc de longitud completa p2 (Tonga/74). Las regiones subclonadas se indican por encima del plasmido. La numeracion comienza en el extremo 5' de la secuencia vftica. B. La mutacion A30 elimina los 30 nucleotidos indicados de la secuencia de 3'-UTR para crear p2A30.

Figura 7. Niveles de viremia en monos rhesus inoculados con los candidatos a vacuna DEN2 (Tonga/74), rDEN2 y rDEN2A30. Se inocularon grupos de cuatro monos con 5,0 logi0 UFP de virus por via subcutanea. Se recogio suero diariamente y se determinaron los tftulos de virus mediante ensayo de placas en celulas Vero. El ftmite de deteccion del virus era de 0,7 logi0 UFP/ml. Se indican los tftulos de virus medios para cada grupo. No se detecto viremia en ningun mono tras el dfa 8.

Figura 8. A. Diagrama del plasmido de ADNc de longitud completa p3 (Sleman/78). Las regiones subclonadas se indican por encima del plasmido. La numeracion comienza en el extremo 5' de la secuencia vftica. Se muestra la secuencia y la ubicacion de la insercion del enlazador SpeI. B. La mutacion A30 elimina los 31 nucleotidos indicados de la secuencia de 3'-UTR para crear p3A30.

Figura 9. A. Se construyeron virus del dengue quimericos recombinantes introduciendo o bien las regiones CME o bien las ME de DEN2 (Tonga/74) en el fondo genetico de DEN4. La ubicacion relativa de la mutacion A30 en la 3'- UTR se indica mediante una flecha y se indican las uniones intertfpicas 1, 2 y 3. B. Secuencia de nucleotidos y aminoacidos de las regiones de uniones intertfpicas. Se indican los sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion usados en el ensamblaje de cada ADNc quimerico.

Figura 10. Cinetica de crecimiento en celulas Vero de virus rDEN2/4A30 quimericos que codifican para mutaciones de adaptacion a celulas Vero individuales o combinadas. Se infectaron celulas Vero con los virus indicados a una MOI de 0,01. En los puntos detiempotras la infeccion indicados, se extrajeron muestras de 1 ml de medio de cultivo tisular, se aclararon mediante centrifugacion y se congelaron a -80 °C. Se sometio a ensayo el nivel de replicacion del virus mediante titulacion de placas en celulas C6/36. El ftmite inferior de la deteccion era de 0,7 log10 UFP/ml. Los niveles de replicacion en el dfa 4 tras la infeccion se indican mediante la ftnea discontinua.

Figura 11. A. Se construyeron virus del dengue quimericos recombinantes introduciendo o bien las regiones CME o bien las ME de DEN3 (Sleman/78) en el fondo genetico de DEN4. La ubicacion relativa de la mutacion A30 en la 3'- UTR se indica mediante una flecha y se indican las uniones intertfpicas 1, 2 y 3. Se indican los sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion usados en el ensamblaje de cada ADNc quimerico. B. Secuencia de

nucleotidos y aminoacidos de las regiones de uniones intertfpicas. Se indican los sitios de reconocimiento de

enzimas de restriccion usados en el ensamblaje de cada ADNc quimerico.

Figura 12. A. Se construyeron virus del dengue quimericos recombinantes introduciendo o bien las regiones CME o bien las ME de DEN1 (Puerto Rico/94) en el fondo genetico de DEN4. La ubicacion relativa de la mutacion A30 en la 3'-UTR se indica mediante una flecha y se indican las uniones intertfpicas 1, 2 y 3. Se indican los sitios de

reconocimiento de enzimas de restriccion usados en el ensamblaje de cada ADNc quimerico. B. Secuencia de

enzimas de restriccion usados en el ensamblaje de cada ADNc quimerico.

Breve descripcion de las secuencias

Serotipo: Descripcion o numero de acceso de GenBank

DEN1: U88535

DEN2: Tonga/74

DEN3: Sleman/78

DEN4: AF326825

Breve descripcion de las SEQ ID NO

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Identificacion: Figura, tabla o apendice SEQ ID NO.

Region TL2 de DEN1: Figura 2 1

Region TL2 de DEN2: Figura 2 2

Region TL2 de DEN3: Figura 2 3

Region TL2 de DEN 4: Figura 2 4

Region TL2 de DEN1A30: Figura 2 5

Region TL2 de DEN2A30: Figura 2 6

Region TL2 de DEN3A30: Figura 2 7

Region TL2 de DEN4A30: Figura 2 8

Region TL2 de p2: Figura 6 9

Region TL2 de p2A30: Figura 6 10

Region TL2 de p3: Figura 8 11

Region TL2 de p3A30: Figura 8 12

Enlazador Spe1 en p3: Figura 8 13

Union 1 de rDEN2/4: Figura 9 14-nt, 15-aa

Union 2 de rDEN2/4: Figura 9 16-nt, 17-aa

Union 3 de rDEN2/4: Figura 9 18-nt, 19-aa

Union 1 de rDEN3/4: Figura 11 20-nt, 21-aa

Union 2 de rDEN3/4: Figura 11 22-nt, 23-aa

Union 3 de rDEN3/4: Figura 11 24-nt, 25-aa

Union 1 de rDEN1/4: Figura 12 26-nt, 27-aa

Union 2 de rDEN1/4: Figura 12 28-nt, 29-aa

Union 3 de rDEN1/4: Figura 12 30-nt, 31-aa

Region NS4B seleccionada de D4: Tabla 15 32-nt, 33-aa

Region NS4B seleccionada de D1: Tabla 15 34-nt, 35-aa

Region NS4B seleccionada de D2: Tabla 15 36-nt, 37-aa

Region NS4B seleccionada de D3: Tabla 15 38-nt, 39-aa

CCACGGGCGCCGT: Tabla 26 40

AAGGCCTGGA: Tabla 26 41

TATCCCCGGGAC: Tabla 26 42

AGAGCTCTCTC: Tabla 26 43

GAATCTCCACCCGGA: Tabla 26 44

CTGTCGAATC: Tabla 26 45

Plasmido p2 de ADNc de DEN2 (Tonga/74): Apendice 1 46-nt, 47-aa

Plasmido p3 de ADNc de DEN3 (Sleman/78): Apendice 2 48-nt, 49-aa

Region quimerica CME de DEN1 (Puerto Rico/94): Apendice 3 50-nt, 51-aa

Region quimerica ME de DEN1 (Puerto Rico/94): Apendice 4 52-nt, 53-aa

Descripcion detallada de la realizacion preferida Introduccion

En el presente documento, se usa un enfoque molecular para desarrollar una vacuna tetravalente contra el virus del dengue atenuado vivo geneticamente estable. Cada componente de la vacuna tetravalente, concretamente DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4, debe estar atenuado, ser geneticamente estable e inmunogenico. Es necesaria una vacuna tetravalente para garantizar proteccion simultanea frente a cada uno de los cuatro virus del dengue, impidiendo de ese modo la posibilidad de desarrollar las enfermedades mas graves fiebre hemorragica del dengue/smdrome de choque del dengue (FHD/SCD), que se producen en seres humanos durante la infeccion secundaria con un virus del dengue de tipo silvestre heterotfpico. Puesto que los virus del dengue pueden experimentar recombinacion genetica en la naturaleza (Worobey, M. et al. 1999 PNAS USA 96:7352-7), la vacuna tetravalente debena ser geneticamente incapaz de experimentar un acontecimiento de recombinacion entre sus cuatro componentes de virus que pudiese conducir a la generacion de virus que carecen de mutaciones atenuantes. Los enfoques previos para desarrollar una vacuna tetravalente contra el virus del dengue se han basado en derivar independientemente cada uno de los cuatro componentes de virus a traves de procedimientos mutagenicos separados, tales como pase en celulas de cultivo tisular derivadas de un hospedador heterologo. Esta estrategia ha producido candidatos a vacuna atenuados (Bhamarapravati, N. y Sutee, Y. 2000 Vaccine 18:44-7). Sin embargo, es posible que pudiesen producirse en las vacunas intercambios genicos entre los cuatro componentes de estas vacunas tetravalentes derivadas independientemente, creando posiblemente un virus recombinante virulento. Se han generado polivirus virulentos derivados de recombinacion en vacunas tras la administracion de una vacuna trivalente contra poliovirus (Guillot, S. et al. 2000 J Virol 74:8434-43).

La presente divulgacion tambien describe: (1) mejoras para el candidato a vacuna rDEN4A30 descrito anteriormente,

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2) virus recombinantes rDEN1A30, rDEN3A30 y rDEN3A30 atenuados que contienen una delecion de 30 nucleotidos (A30) en una seccion de la region no traducida en 3' (UTR) que es homologa a aquella en el virus recombinante rDEN4A30, (3) un metodo para generar una vacuna tetravalente contra el virus del dengue compuesta por rDEN1A30, rDEN2A30, rDEN3A30 y rDEN4A30, 4) virus quimericos antigenicos atenuados, rDEN1/4A30, rDEN2/4A30 y rDEN3/4A30, para los que se han reemplazado las regiones genicas CME, ME o E de rDEN4A30 por aquellas derivadas de DEN1, DEN2 o DEN3; como alternativa rDEN1/3A30, rDEN2/3A30 y rDEN4/3A30 para los que se han reemplazado las regiones genicas CME, ME o E de rDEN3A30 por aquellas derivadas de DEN1, 2 o 4; como alternativa rDEN2/2A30, rDEN3/2A30 y rDEN4/2A30 para los que se han reemplazado las regiones genicas CME, ME o E de rDEN2A30 por aquellas derivadas de DEN1, 3 o 4; y como alternativa rDEN2/1A30, rDEN3/1A30 y rDEN4/1A30 para los que se han reemplazado las regiones genicas CME, ME o E de rDEN1A30 por aquellas derivadas de DEN2, 3 o 4, y 5) un metodo para generar una vacuna tetravalente contra el virus del dengue compuesta por rDEN1/4A30, rDEN2/4A30, rDEN3/4A30 y rDEN4A30, como alternativa rDEN2/3A30, rDEN2A30, rDEN4/3A30 y rDEN3A30, como alternativa rDEN1/2A30, rDEN3/2A30, rDEN2A30 y rDEN2A30, y como alternativa rDEN2/1A30, rDEN3/1A30, rDEN4/1A30 y rDEN1A30. Estas vacunas tetravalentes son unicas puesto que contienen una mutacion atenuante compartida comun que elimina la posibilidad de generar un virus de tipo silvestre virulento en una vacuna puesto que cada componente de la vacuna posee la misma mutacion por delecion atenuante A30. Ademas, la vacuna tetravalente rDEN1A30, rDEN2A30, rDEN3A30, rDEN4A30 es la primera en combinar la estabilidad de la mutacion A30 con una amplia antigenicidad. Puesto que la mutacion por delecion A30 esta en la 3'- UTR de cada virus, todas las protemas de los cuatro virus componentes estan disponibles para inducir una respuesta inmunitaria protectora. Portanto, el metodo proporciona un mecanismo de atenuacion que mantiene cada una de las protemas de los virus DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4 en un estado que conserva la capacidad completa de cada una de las protemas de los cuatro virus para inducir respuestas inmunitarias humorales y celulares frente a todas las protemas estructurales y no estructurales presentes en cada serotipo de virus del dengue.

Tal como se describio anteriormente, se diseno por ingeniena genetica el virus recombinante de DEN4, rDEN4A30 (denominado anteriormente 2AA30), para que contuviese una delecion de 30 nucleotidos en la 3'-UTR del genoma vmco (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13; Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). La evaluacion en monos rhesus mostro que el virus estaba significativamente atenuado en relacion con el virus original de tipo silvestre, siendo todavfa altamente inmunogenico y completamente protector. Ademas, un ensayo clmico de fase I con voluntarios humanos adultos mostro que el virus recombinante rDEN4A30 era seguro e inmunogenico de manera satisfactoria (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13). Para desarrollar una vacuna tetravalente que porta una mutacion atenuante compartida en una region no traducida, los presentes inventores seleccionaron la mutacion A30 para atenuar virus del dengue de tipo silvestre de serotipos 1, 2 y 3 puesto que atenuaba virus DEN4 detipo silvestre para monos rhesus y era segura en seres humanos (figura 1).

La mutacion A30 se describio y caracterizo por primera vez en el virus DEN4 (Men, R. et al. 1996 J Virol 70: 3930-7). En DEN4, la mutacion consiste en la eliminacion de 30 nucleotidos contiguos que comprenden los nucleotidos 10478 - 10507 de la 3'-UTR (figura 2A) que forman una estructura de tallo-bucle supuesta denominada TL2 (Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25:1194-202). Entre los flavivirus, las porciones grandes de la UTR forman estructuras secundarias altamente conservadas (Hahn, C.S. et al. 1987 J Mol Biol 198:33-41; Proutski, V. et al. 1997 - Nucleic Acids Res 25:1194-202). Aunque los nucleotidos individuales no se conservan necesariamente en estas regiones, un apareamiento de bases adecuado conserva la estructura de tallo-bucle en cada serotipo, un hecho que no es facilmente evidente cuando solo se considera la secuencia primaria (figura 2B, C).

Quimeras del dengue inmunogenicas y metodos para su preparacion

En el presente documento se proporcionan quimeras del dengue inmunogenicas y metodos para preparar las quimeras del dengue. Las quimeras del dengue inmunogenicas son utiles, solas o en combinacion en un vehmulo farmaceuticamente aceptable, como composiciones inmunogenicas para minimizar, inhibir o inmunizar individuos y animales frente a la infeccion por virus del dengue.

Las quimeras de la divulgacion comprenden secuencias de nucleotidos que codifican para la inmunogenicidad de un virus del dengue de un serotipo y secuencias de nucleotidos adicionales seleccionadas de la estructura principal de un virus del dengue de un serotipo diferente. Estas quimeras pueden usarse para inducir una respuesta inmunogenica frente al virus del dengue.

En otro aspecto, la quimera preferida es una quimera de acido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleotidos que codifica para al menos una protema estructural de un virus del dengue de un primer serotipo, y una segunda secuencia de nucleotidos que codifica para protemas no estructurales de un virus del dengue de un segundo serotipo diferente del primero. En el ambito de la invencion, el virus del dengue del segundo serotipo es DEN4. En otro aspecto, la protema estructural puede ser la protema C de un virus del dengue del primer serotipo, la protema prM de un virus del dengue del primer serotipo, la protema E de un virus del dengue del primer serotipo, o cualquier combinacion de las mismas.

El termino “resto” se usa en el presente documento para referirse a un aminoacido (D o L) o un mimetico de aminoacido que se incorpora en un peptido mediante un enlace amida. Como tal, el aminoacido puede ser un

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aminoacido que se produce de manera natural o, a menos que se limite de otra forma, puede abarcar analogos conocidos de aminoacidos naturales que funcionan de una manera similar a los aminoacidos que se producen de manera natural (es decir, mimeticos de aminoacido). Ademas, un mimetico de enlace amida incluye modificaciones de la estructura principal del peptido bien conocidas por los expertos en la tecnica.

Ademas, un experto en la tecnica reconocera que sustituciones, deleciones o adiciones individuales en la secuencia de aminoacidos, o en la secuencia de nucleotidos que codifica para los aminoacidos, que alteran, anaden o delecionan un unico aminoacido o un pequeno porcentaje de aminoacidos (normalmente menos del 5%, mas normalmente menos del 1%) en una secuencia codificada son variaciones modificadas de manera conservativa, en las que las alteraciones dan como resultado la sustitucion de un aminoacido por un aminoacido qmmicamente similar. Se conocen bien en la tecnica tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoacidos funcionalmente similares. Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoacidos que son sustituciones conservativas de uno por otro:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Acido aspartico (D), Acido glutamico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones “quimera de virus”, “virus quimerico”, “quimera del dengue” y “virus del dengue quimerico” significan una construccion infecciosa que comprende secuencias de nucleotidos que codifican para la inmunogenicidad de un virus del dengue de un serotipo y secuencias de nucleotidos adicionales derivadas de la estructura principal de un virus del dengue de un serotipo diferente.

Tal como se usa en el presente documento, “construccion infecciosa” indica un virus, una construccion vmca, una quimera vmca, un acido nucleico derivado de un virus o cualquier porcion del mismo, que puede usarse para infectar una celula.

Tal como se usa en el presente documento, “quimera de acido nucleico” significa una construccion que comprende acido nucleico que comprende secuencias de nucleotidos que codifican para la inmunogenicidad de un virus del dengue de un serotipo y secuencias de nucleotidos adicionales derivadas de la estructura principal de un virus del dengue de un serotipo diferente. En consecuencia, cualquier virus quimerico o quimera de virus va a reconocerse como ejemplo de una quimera de acido nucleico.

Debe entenderse que las protemas estructurales y no estructurales incluyen cualquier protema que comprenda o cualquier gen que codifique para la secuencia de la protema completa, un epttopo de la protema, o cualquier fragmento que comprenda, por ejemplo, tres o mas restos de aminoacido de las mismas.

Quimeras del dengue

El virus del dengue es un patogeno de flavivirus transmitido por mosquitos. El genoma del virus del dengue contiene una region no traducida en 5' (5'-UTR), seguida por una region que codifica para una protema de la capsida (C), seguida por una region que codifica para una protema de premembrana/membrana (prM), seguida por una region que codifica para una protema de la envoltura (E), seguida por la region que codifica para las protemas no estructurales(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) y finalmente una region no traducida en 3' (3'-UTR). Las protemas estructurales vmcas son C, prM y E, y las protemas no estructurales son NS1-NS5. Las protemas estructurales y no estructurales se traducen como una unica poliprotema y se procesa por proteasas vmcas y celulares.

Las quimeras del dengue de la divulgacion son construcciones formadas fusionando genes de protemas estructurales de un virus del dengue de un serotipo, por ejemplo DEN1, DEN2, DEN3 o DEN4, con genes de protemas no estructurales de un virus del dengue de un serotipo diferente, por ejemplo, DEN1, DEN2, DEN3 o DEN4.

Las quimeras del dengue atenuadas, inmunogenicas proporcionadas en el presente documento contienen uno o mas de los genes de protemas estructurales, o partes antigenicas de las mismas, del virus del dengue de un serotipo contra el cual va a conferirse inmunogenicidad, y los genes de protemas no estructurales de un virus del dengue de un serotipo diferente.

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La quimera de la divulgacion contiene un genoma de virus del dengue de un serotipo como estructura principal, en el que el/los gen(es) de protema(s) estructural(es) que codifica(n) para protema(s) C, prM o E del genoma del dengue, o combinaciones de las mismas, se reemplaza(n) por el/los gen(es) de protema(s) estructural(es) correspondiente(s) de un virus del dengue de un serotipo diferente frente al que va a protegerse. La quimera vmca resultante tiene las propiedades de atenuacion, en virtud de estar quimerizada con un virus del dengue de otro serotipo, y tiene portanto una virulencia reducida, aunque expresa epftopos antigenicos de los productos genicos estructurales y portanto es inmunogenica.

Puede usarse el genoma de cualquier virus del dengue como estructura principal en las quimeras atenuadas descritas en el presente documento. La estructura principal puede contener mutaciones que contribuyen al fenotipo de atenuacion del virus del dengue o que facilitan su replicacion en el sustrato celular usado para su fabricacion, por ejemplo, celulas Vero. Las mutaciones pueden ser en la secuencia de nucleotidos que codifica para protemas no estructurales, la region no traducida en 5' o la region no traducida en 3'. La estructura principal tambien puede contener mutaciones adicionales para mantener la estabilidad del fenotipo de atenuacion y para reducir la posibilidad de que la quimera o el virus atenuado pudiese revertir de nuevo al virus virulento de tipo silvestre. Por ejemplo, una primera mutacion en la region no traducida en 3' y una segunda mutacion en la region no traducida en 5' proporcionaran estabilidad adicional del fenotipo de atenuacion, si se desea. En particular, una mutacion que es una delecion de 30 nucleotidos de la region no traducida en 3' del genoma de DEN4 entre los nucleotidos 10478-10507 da como resultado una atenuacion del virus DEN4 (Men et al. 1996 J. Virology 70:3930-3933; Durbin et al. 2001 Am J Trop Med 65:405-413, 2001). Por tanto, puede usarse el genoma de cualquier virus del dengue tipo 4 que contenga una mutacion de este tipo en este locus como estructura principal en las quimeras atenuadas descritas en el presente documento. Ademas, pueden usarse tambien otros genomas de virus del dengue que contengan una mutacion por delecion analoga en la region no traducida en 3' de los genomas de otros serotipos de virus del dengue como estructura principal.

Tales mutaciones pueden lograrse mediante mutagenesis dirigida al sitio usando tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica. Los expertos en la tecnica entenderan que los ensayos de seleccion de virulencia, tal como se describen en el presente documento y tal como se conocen bien en la tecnica, pueden usarse para distinguir entre estructuras principales virulentas y atenuadas.

Construccion de quimeras del dengue

Pueden producirse las quimeras del virus del dengue descritas en el presente documento sustituyendo al menos uno de los genes de protemas estructurales del virus del dengue de un serotipo frente al cual se desea inmunidad en una estructura principal de genoma de virus del dengue de un serotipo diferente, usando tecnicas de ingeniena genetica recombinante bien conocidas por los expertos en la tecnica, concretamente, eliminando un gen del virus del dengue designado de un serotipo y reemplazandolo por el gen correspondiente deseado de un virus del dengue de un serotipo diferente. Como alternativa, usando las secuencias proporcionadas en GenBank, pueden sintetizarse las moleculas de acido nucleico que codifican para las protemas del dengue usando tecnicas de smtesis de acidos nucleicos conocidas e insertarse en un vector apropiado. Por tanto, se produce un virus atenuado, inmunogenico usando tecnicas de ingeniena genetica recombinante conocidas por los expertos en la tecnica.

Tal como se menciono anteriormente, el gen que va a insertarse en la estructura principal codifica para una protema estructural del dengue de un serotipo. Preferentemente, el gen del dengue de un serotipo diferente que puede insertarse es un gen que codifica para una protema C, una protema prM y/o una protema E. La secuencia insertada en la estructura principal del virus del dengue puede codificar para las protemas estructurales tanto prM como E del otro serotipo. La secuencia insertada en la estructura principal del virus del dengue puede codificar para las protemas estructurales C, prM y E del otro serotipo. La estructura principal del virus del dengue es el genoma del virus DEN1, DEN2, DEN3 o DEN4, o un genoma de virus del dengue atenuado de cualquiera de estos serotipos, e incluye el/los gen(es) sustituido(s) que codifica(n) para la(s) protema(s) estructural(es) C, prM y/o E de un virus del dengue de un serotipo diferente, o el/los gen(es) sustituido(s) que codifica(n) para la(s) protema(s) estructural(es) prM y/o E de un virus del dengue de un serotipo diferente.

Pueden evaluarse quimeras de acido nucleico o virus quimericos adecuados que contienen secuencias de nucleotidos que codifican para protemas estructurales del virus del dengue de cualquiera de los serotipos para determinar su utilidad como vacunas examinandolos para detectar marcadores fenotfpicos de atenuacion que indiquen una reduccion en la virulencia con conservacion de la inmunogenicidad. La antigenicidad y la inmunogenicidad pueden evaluarse usando la reactividad in vitro o in vivo con anticuerpos frente al dengue o suero inmunorreactivo usando procedimientos de examen rutinarios conocidos por los expertos en la tecnica.

Vacunas contra el dengue

Los virus quimericos preferidos y las quimeras de acido nucleico proporcionan virus vivos, atenuados utiles como inmunogenos o vacunas. En una realizacion preferida, los virus presentan alta inmunogenicidad mientras que al mismo tiempo no producen efectos letales o patogenicos peligrosos.

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Los virus quimericos o las quimeras de acido nucleico de la presente divulgacion pueden comprender los genes estructurales de un virus del dengue de un serotipo en una estructura principal de virus del dengue de tipo silvestre o atenuado de un serotipo diferente. Por ejemplo, la quimera puede expresar los genes de protemas estructurales de un virus del dengue de un serotipo en cualquiera de un virus del dengue o un acervo de virus del dengue atenuado de un serotipo diferente.

La estrategia descrita en el presente documento de usar un fondo genetico que contiene regiones no estructurales de un genoma de virus del dengue de un serotipo y, mediante quimerizacion, las propiedades de atenuacion, para expresar los genes de protemas estructurales de un virus del dengue de un serotipo diferente ha conducido al desarrollo de candidatos a vacuna contra el dengue vivo, atenuado que expresan genes de protemas estructurales de inmunogenicidad deseada. Por tanto, pueden disenarse candidatos a vacuna para el control de patogenos del dengue.

Los virus usados en las quimeras descritas en el presente documento se cultivan normalmente usando tecnicas conocidas en la tecnica. Se realizan entonces titulaciones de las unidades formadoras de focos (UFF) o placas de virus y se cuentan las placas o UFF con el fin de evaluar la viabilidad, el tftulo y las caractensticas fenotfpicas de los virus cultivados en cultivo celular. Se mutagenizan virus de tipo silvestre para derivar materiales de partida de candidatos atenuados.

Se construyen clones infecciosos quimericos a partir de diversos serotipos del dengue. Si se desea, tambien puede lograrse la clonacion de fragmentos de ADNc espedficos de virus. Los fragmentos de ADNc que contienen los genes de protemas estructurales o protemas no estructurales se amplifican mediante reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) a partir de ARN del dengue con diversos cebadores. Se clonan los fragmentos amplificados en los sitios de escision de otros clones intermedios. Se secuencian entonces los clones del dengue intermedios, quimericos para verificar la secuencia del ADNc insertado espedfico del dengue.

Pueden obtenerse plasmidos quimericos de longitud de genoma completa construidos insertando la region genica de protemas estructurales o no estructurales de virus del dengue en vectores usando tecnicas recombinantes bien conocidas por los expertos en la tecnica.

Metodos de administracion

Las quimeras vmcas descritas en el presente documento se combinan individual o conjuntamente con un vehmulo o excipiente farmaceuticamente aceptable para su administracion como inmunogeno o vacuna a seres humanos o animales. Las expresiones “excipiente farmaceuticamente aceptable” o “vehmulo farmaceuticamente aceptable” se usan en el presente documento queriendo decir cualquier composicion o compuesto incluyendo, pero sin limitarse a, agua o solucion salina, un gel, unguento, disolvente, diluyente, base de pomada fluida, liposoma, micela, micela gigante, y similares, que sea adecuado para su uso en contacto con tejido humano o animal vivo sin provocar respuestas fisiologicas adversas, y que no interaccione con los otros componentes de la composicion de manera perjudicial.

Las formulaciones de vacuna o inmunogenicas pueden presentarse de manera conveniente en una forma de dosificacion de unidad formadora de placas (UFP) o unidad formadora de focos (UFF) y prepararse usando tecnicas farmaceuticas convencionales. Tales tecnicas incluyen la etapa de llevar a asociacion el principio activo y el/los veldculo(s) o excipiente(s) farmaceutico(s). En general, las formulaciones se preparan llevando a asociacion de manera uniforme e mtima el principio activo con veldculos lfquidos. Las formulaciones adecuadas para administracion parenteral incluyen disoluciones para inyeccion esteriles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostaticos y solutos que hacen que la formulacion sea isotonica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o de multiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en un estado secado por congelacion (liofilizado) que requiere solo la adicion del portador lfquido esteril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones para inyeccion extemporaneas a partir de comprimidos, granulos y polvos esteriles comunmente usados por un experto habitual en la tecnica.

Formulaciones de dosificacion unitarias preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad, o una fraccion apropiada de las mismas, del componente administrado. Debe entenderse que ademas de los componentes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones de la presente invencion pueden incluir otros agentes comunmente usados por un experto habitual en la tecnica.

La composicion de vacuna o inmunogenica puede administrarse a traves de diferentes vfas, tales como oral o parenteral, incluyendo, pero sin limitarse a, bucal y sublingual, rectal, mediante aerosol, nasal, intramuscular, subcutanea, intradermica y topica. La composicion puede administrarse en diferentes formas, incluyendo, pero sin limitarse a, disoluciones, emulsiones y suspensiones, microesferas, partmulas, micropartmulas, nanopartmulas y liposomas. Se espera que puedan requerirse desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 dosis por programa de inmunizacion. Las dosis iniciales pueden oscilar desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente

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100.000 UFP o UFF, con un intervalo de dosificacion preferido de aproximadamente 500 a aproximadamente 20.000 UFP o UFF, un intervalo de dosificacion mas preferido de desde aproximadamente 1000 hasta aproximadamente

12.000 UFP o UFF y un intervalo de dosificacion lo mas preferido de aproximadamente 1000 a aproximadamente 4000 UFP o UFF. La dosificacion de las inyecciones de refuerzo puede oscilar desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 20.000 UFP o UFF, con un intervalo de dosificacion preferido de aproximadamente 500 a aproximadamente 15.000, un intervalo de dosificacion mas preferido de aproximadamente 500 a aproximadamente

10.000 UFP o UFF y un intervalo de dosificacion lo mas preferido de aproximadamente 1000 a aproximadamente 5000 UFP o UFF. Por ejemplo, el volumen de administracion variara dependiendo de la via de administracion. El volumen de las inyecciones intramusculares puede oscilar desde aproximadamente 0,1 ml hasta 1,0 ml.

La composicion puede almacenarse a temperaturas de desde aproximadamente -100°C hasta aproximadamente 4°C. La composicion tambien puede almacenarse en un estado liofilizado a diferentes temperaturas incluyendo temperatura ambiente. La composicion puede esterilizarse a traves de medios convencionales conocidos por un experto habitual en la tecnica. Tales medios incluyen, pero no se limitan a, filtracion. La composicion tambien puede combinarse con agentes bacteriostaticos para inhibir el crecimiento bacteriano.

Pautas de administracion

La composicion de vacuna o inmunogenica descrita en el presente documento puede administrarse a seres humanos, especialmente a individuos que viajan a regiones en las que esta presente la infeccion por virus del dengue, y tambien a los habitantes de esas regiones. El momento optimo para la administracion de la composicion es aproximadamente de uno a tres meses antes de la exposicion inicial al virus del dengue. Sin embargo, la composicion tambien puede administrarse tras la infeccion inicial para mejorar la evolucion de la enfermedad, o tras la infeccion inicial para tratar la enfermedad.

Adyuvantes

Puede administrarse una variedad de adyuvantes conocidos por un experto habitual en la tecnica conjuntamente con el virus quimerico en la composicion de vacuna o inmunogenica de la presente invencion. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: polfmeros, copolfmeros tales como copolfmeros de polioxietileno- polioxipropileno, incluyendo copolfmeros de bloque, polfmero p 1005, adyuvante completo de Freund (para animales), adyuvante incompleto de Freund; monooleato de sorbitano, escualeno, adyuvante CRL-8300, alumbre, QS 21, muramil dipeptido, motivos de oligonucleotido CpG y combinaciones de motivos de oligonucleotido CpG, trehalosa, extractos bacterianos, incluyendo extractos micobacterianos, endotoxinas destoxificadas, lfpidos de membrana o combinaciones de los mismos.

Secuencias de acido nucleico

Las secuencias de acido nucleico de virus del dengue de un serotipo y virus del dengue de un serotipo diferente son utiles para disenar cebadores y sondas de acido nucleico para la deteccion de quimeras de virus del dengue en una muestra o especimen con alta sensibilidad y especificidad. Pueden usarse sondas o cebadores correspondientes a virus del dengue para detectar la presencia de un virus de vacuna. El acido nucleico y las secuencias de aminoacidos correspondientes son utiles como herramientas de laboratorio para estudiar los organismos y las enfermedades y para desarrollarterapias y tratamientos para las enfermedades.

Los cebadores y las sondas de acido nucleico se hibridan selectivamente con moleculas de acido nucleico que codifican para virus del dengue o secuencias complementarias de las mismas. Por “selectivo” o “selectivamente” quiere decirse una secuencia que no se hibrida con otros acidos nucleicos para prevenir la deteccion adecuada de la secuencia del virus del dengue. Portanto, en el diseno de los acidos nucleicos hibridantes, la selectividad dependera de los otros componentes presentes en la muestra. El acido nucleico hibridante debe tener al menos el 70% de complementariedad con el segmento del acido nucleico con el que se hibrida. Tal como se usa en el presente documento para describir acidos nucleicos, la expresion “se hibrida selectivamente” excluye los acidos nucleicos hibridantes aleatorios ocasionales, y por tanto tiene el mismo significado que “espedficamente hibridante”. Los cebadores y las sondas de acido nucleico selectivamente hibridantes descritos en el presente documento pueden tener al menos el 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% y 99% de complementariedad con el segmento de la secuencia con la que se hibridan, preferiblemente el 85% o mas.

La presente descripcion tambien contempla secuencias, sondas y cebadores que se hibridan selectivamente con el acido nucleico codificante o la hebra complementaria, u opuesta, del acido nucleico. Puede producirse hibridacion espedfica con acido nucleico con sustituciones o modificaciones minoritarias en el acido nucleico, siempre que se mantenga una capacidad de hibridacion especie-especie funcional. Por “sonda” o “cebador” quiere decirse secuencias de acido nucleico que pueden usarse como sondas o cebadores para la hibridacion selectiva con secuencias de acido nucleico complementarias para su deteccion o amplificacion, sondas o cebadores que pueden variar en longitud desde aproximadamente 5 hasta 100 nucleotidos, o preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta 50 nucleotidos, o lo mas preferiblemente de manera aproximada 18-24 nucleotidos. Se proporcionan en el presente documento acidos nucleicos aislados que se hibridan selectivamente con los acidos nucleicos espedficos

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de especie en condiciones rigurosas y deben tener al menos cinco nucleotidos complementarios a la secuencia de interes tal como se describe en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Si se usan como cebadores, la composicion puede incluir preferentemente al menos dos moleculas de acido nucleico que se hibridan con diferentes regiones de la molecula diana de modo que se amplifica una region deseada. Dependiendo de la longitud de la sonda o el cebador, la region diana puede oscilar entre el 70% bases complementarias y complementariedad completa y todavfa hibridar en condiciones rigurosas. Por ejemplo, para el fin de detectar la presencia del virus del dengue, el grado de complementariedad entre el acido nucleico hibridante (sonda o cebador) y la secuencia con la que se hibrida es al menos suficiente para distinguir la hibridacion con un acido nucleico de otros organismos.

Las secuencias de acido nucleico que codifican para el virus del dengue pueden insertarse en un vector, tal como un plasmido, y expresarse de manera recombinante en un organismo vivo para producir polipeptidos y/o peptido de virus del dengue recombinante.

Las secuencias de acido nucleico desveladas en el presente documento incluyen una sonda de diagnostico que sirve para notificar la deteccion de un amplicon de ADNc amplificado a partir del molde de ARN genomico vmco usando una reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa (RT/PCR), asf como amplfmeros directos e inversos que se disenan para amplificar el amplicon de ADNc. En ciertos casos, uno de los amplfmeros se disena para contener una mutacion espedfica de virus de vacuna en el extremo 3' terminal del amplfmero, lo que hace de manera eficaz que la prueba sea incluso mas espedfica para la cepa de vacuna debido a la extension del cebador en el sitio diana, y en consecuencia se producira amplificacion solo si el molde de ARN viral contiene esa mutacion espedfica.

Se han desarrollado recientemente sistemas de deteccion de secuencias de acido nucleico basados en PCR automatizada. Se usa ampliamente el ensayo TaqMan (Applied Biosystems). Una estrategia desarrollada mas recientemente para pruebas geneticas de diagnostico hace uso de balizas moleculares (Tyagi y Kramer, 1996 Nature Biotechnology 14:303-308). Los ensayos con balizas moleculares emplean colorantes indicadores y extintores que difieren de los usados en el ensayo TaqMan. Un experto en la tecnica puede usar estos y otros sistemas de deteccion.

EJEMPLO COMPARATIVO 1

Mejora del candidate a vacuna contra el virus del dengue rDEN4 \30

Se evaluo la seguridad del candidato a vacuna contra el dengue-4 atenuada viva recombinante, rDEN4\30, en veinte voluntarios humanos que recibieron una dosis de 5,0 log-10 unidades formadoras de placas (UFP) (Durbin A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-413). Se descubrio que el candidato a vacuna era seguro, se toleraba bien y era inmunogenico en todas las vacunas. Sin embargo, cinco de los vacunados experimentaron una elevacion transitoria en los niveles de alanina aminotransferasa, tres experimentaron neutropenia y diez vacunados desarrollaron un exantema macular asintomatico, lo que sugiere que puede ser necesario atenuar adicionalmente este candidato a vacuna.

Actualmente, esta realizandose un estudio de disminucion a escala de la dosis, controlado por placebo, de doble enmascaramiento, aleatorizado para determinar la dosis infecciosa humana 50 (DIH50) de rDEN4\30. Cada cohorte de dosis consiste en aproximadamente veinte vacunados y cuatro receptores de placebo. Hasta la fecha, se han recogido datos completos para dosis de 3,0 log-10 UFP y 2,0 log-10 UFP. rDEN4\30 infectaba al 100% de los vacunados cuando se administraron 3,0 log-10 UFP y al 95% de los vacunados cuando se administraron 2,0 log-10 UFP (tabla 1). El candidato a vacuna provoco enfermedad no sintomatica a cualquier dosis (tabla 1). Un vacunado que recibio 3,0 log-10 UFP experimento una elevacion transitoria en los niveles de alanina aminotransferasa y aproximadamente un cuarto de los vacunados experimentaron neutropenia a ambas dosis (tabla 1). La neutropenia fue transitoria y leve. Mas de la mitad de los vacunados desarrollaron un exantema macular a ambas dosis; la aparicion del exantema no estaba correlacionada con la dosis de vacunacion ni con la viremia (tabla 1 y tabla 2). Ni el tftulo pico ni la aparicion de la viremia difirieron entre las dosis de 3,0 log-10 UFP y 2,0 log-10 UFP, aunque ambas medidas de viremia eran significativamente inferiores para estas dosis que para una dosis de 5,0 log-10 UFP (tabla 3). El candidato a vacuna era inmunogenico en el 95% de los vacunados a ambas dosis y los anticuerpos neutralizantes no disminuyeron entre los dfas 28 y 42 tras la vacunacion (tabla 4). Aunque no se ha determinado todavfa la DIH50, es claramente inferior a 2,0 log-10 UFP. De manera interesante, las disminuciones en la dosis de vacuna no han tenido ningun efecto sistematico sobre la inmunogenicidad, viremia, neutropenia benigna o la aparicion de exantema. Por tanto, no sera posible necesariamente atenuar adicionalmente rDEN4\30 disminuyendo la dosis de virus administrada, y deben desarrollarse otros enfoques.

Tabla 1. Resumen clrnico de rDEN4\30

N.° de

Dosisa

N.° de

N.° con

Tftulo

N.° de voluntarios con:

sujetos: infec- tados viremia pico mediob Fiebre Exan tema Neutro- peniac tALT

20: 5,0 20 14 1,2 (0,2) 1d 10 3 5

20: 3,0 20 7 0,4 (0,0) 0 11 5 1e

20: 2,0 19 11 0,6 (0,1) 1d 16 4 0

8: 0 0 0 0 0 0 0 0

aLogio ufp bLogio ufp/ml

cNeutropenia definida como ANC < 1500/dl dT maxima en voluntarios = 100,4°F eALT d^a 0 = 78, ALT maxima = 91 (dia 14)

Tabla 2. Patron de exantema en vacunados

Dosisa: N.° con viremia N.° con exantema Viremia y exantema Viremia sin exantema Dia medio de aparicion ± DE Duracion media (dias ± DE)

5: 14/20 10/20 9/20 5/20 8,1 ± 1,3 [A]a 3,6 ±2,0 [A]

3: 7/20 11/20 6/20 1/20 12,2 ± 1,4 [B] 5,0 ±2,1 [A]

2: 11/20 16/20 9/20 2/20 11,2 ± 1,4 [B] 6,9 ± 1,7 [B]

alogio ufp

bLas medias en cada columna con diferentes letras son significativamente diferentes (a = 0,05)

Tabla 3. Resumen de viremia de rDEN4A30

Dosisa: N.° con viremia Tftulo pico medio (logio ufp/ml) Aparicion media de la viremia (dia ± DE) Duracion media de la viremia (dia ± DE)

5: 14 1,2 ± 0,2 [A] 5,8 ± 2,4 [A]b 4,4 ± 2,4 [A]

3: 7 0,4 ± 0,0 [B] 9,1 ± 2,5 [B] 1,6 ± 1,0 [B]

2: 11 0,6 ± 0,1 [B] 8,7 ± 2,4 [B] 2,6 ±2,0 [A]

alogio ufp

5 Tabla 4. Inmunogenicidad de rDEN4A30

N.° de sujetos: Dosis (logio) N.° de infectados Titulo de anticuerpos neutralizantes sericos, media geometrica (intervalo) % de seroconversion

Dia 28: Dia 42



: 567 399

20: 5,0 20 100



: (72 - 2455) (45- 1230)



: 156 158

20: 3,0 20 95



: (5 - 2365) (25- 1222)



: 163 165

20: 2,0 19 95



: (5 - 943) (5 - 764)

8: 0 0 0 0 0

Se han utilizado dos enfoques para atenuar adicionalmente rDEN4A30. El primero es la generacion y caracterizacion de mutaciones puntuales atenuantes en rDEN4 usando mutagenesis con 5'-fluorouracilo (Blaney, J.E. Jr. et al. 2002

10 Virology 300: l25-139; Blaney, J.E. Jr. et al. 2001 J. Virol. 75: 9731-9740). Este enfoque ha identificado un panel de mutaciones puntuales que confieren una gama de fenotipos de sensibilidad a la temperatura (ts) y placas pequenas (sp) en celulas Vero y HuH-7 y fenotipos de atenuacion (att) en cerebro de raton lactante y ratones SCID con injerto de celulas HuH-7 (ratones SCID-HuH-7). En este ejemplo, se ha introducido un subconjunto de estas mutaciones en rDEN4A30 y se han evaluado los fenotipos de los virus resultantes.

Un segundo enfoque fue crear una serie de mutaciones de carga a alanina apareadas en pares contiguos de restos de aminoacido con carga en el gen NS5 de rDEN4. Tal como se demostro previamente, una mutacion de 32 pares

5

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20

25

30

35

40

45

contiguos individuales de restos de aminoacido con carga en NS5 de rDEN4 confena una gama de fenotipos ts en celulas Vero y HuH-7 y una gama de fenotipos att en cerebro de raton lactante (Hanley, K.H. et al. 2002 J. Virol. 76 525-531). Tal como se demuestra a continuacion, estas mutaciones tambien confieren un fenotipo att en ratones SCID-HuH-7. Estas mutaciones se han introducido, o bien como pares individuales o bien como conjuntos de dos pares, en rDEN4A30 para determinar si son compatibles con la mutacion A30 y si potencian los fenotipos att de rDEN4A30.

Se ha caracterizado un panel de virus rDEN4 que portan mutaciones puntuales individuales que poseen fenotipos sensibles a la temperatura y/o de placas pequenas en cultivo tisular y niveles variables de replicacion atenuada en cerebro de raton lactante en comparacion con virus rDEN4 de tipo silvestre (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139; Blaney, J. E. et al. 2001 J Virol. 75:9731-9740). Se han seleccionado tres mutaciones para combinarse con la mutacion por delecion A30 para evaluar su capacidad para restringir adicionalmente la replicacion de rDEN4A30 en monos rhesus. En primer lugar, se combino previamente la mutacion de cambio de sentido en NS3 en el nucleotido 4995 (Ser > Pro) que confiere sensibilidad a la temperatura en celulas Vero y HuH-7 y replicacion restringida en cerebro de raton lactante con la mutacion A30 (Blaney, J. E. et al. 2001 J Virol. 75:9731-9740). Se descubrio que el virus resultante, rDEN4A30-4995, estaba mas restringido (1.000 veces) en la replicacion en cerebro de raton que el virus rDEN4A30 (<5 veces) en comparacion con el virus rDEN4 de tipo silvestre. En segundo lugar, se combino una mutacion de cambio de sentido en el nucleotido 8092 (Glu > Gly) que tambien confiere sensibilidad a la temperatura en celulas Vero y HuH-7 y replicacion restringida 10.000 veces en cerebro de raton lactante con la mutacion A30 en este caso. En tercer lugar, se combino una sustitucion en la 3'-UTR en el nucleotido 10634 que confiere sensibilidad a la temperatura en celulas Vero y HuH-7, tamano de placas pequeno en celulas HuH-7 y replicacion restringida aproximadamente 1.000 veces en cerebro de raton lactante y ratones SCID con trasplante de celulas HuH-7, con la mutacion A30 en este caso (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139).

Para la presente investigacion, se introdujeron fragmentos subclonados de p4 (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13) que conteman las mutaciones anteriores en el clon de ADNc p4A30. Para la transcripcion y recuperacion de virus, se linealizo el ADNc con ^cc65I (isoesquizomero de Kpnl que se escinde dejando solo un unico nucleotido en 3') y se uso como molde para la transcripcion mediante ARN polimerasa SP6 tal como se describio anteriormente (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139). Se transfectaron celulas de mosquito C6/36 usando transfeccion mediada por liposomas y se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular entre los dfas cinco y siete. Se diluyo de manera terminal dos veces en celulas Vero el virus recuperado y se paso dos (rDEN4A30-4995) o tres (rDEN4A30-8092 y rDEN4A30-10634) veces en celulas Vero.

Se determinaron las secuencias genomicas completas de los virus rDEN4A30-4995, rDEN4A30-8092 y rDEN4A30- 10634 tal como se describio anteriormente (Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:405-413). Tal como se esperaba, cada derivado de virus rDEN4A30 contema la mutacion A30. De manera inesperada, en el virus rDEN4A30-4995, los cambios de nucleotidos en el codon que contema el nucleotido 4995 dieron como resultado un cambio de aminoacido Ser > Leu en vez de un cambio Ser > Pro puesto que se diseno el ADNc de p4A30-4995 para introducir el cambio Ser > Pro (tabla 5). De hecho, se descubrio que el clon de ADNc de p4A30-4995 codificaba para un cambio Ser > Pro en el nucleotido 4995, de modo que no esta claro como la poblacion de virus adquirio la mutacion Ser > Leu. No obstante, se evaluo este virus para valorar el genotipo especificado por esta mutacion de cambio de sentido. Tambien se descubrio que el virus rDEN4A30-4995 contema una mutacion incidental en los nucleotidos 4725-6 que dio como resultado un cambio en un unico aminoacido (Ser > Asp). Los virus rDEN4A30- 8092 y rDEN4A30-10634 conteman las sustituciones de nucleotidos apropiadas asf como mutaciones imprevistas adicionales en E, NS4B y NS4B, respectivamente (tabla 5).

Tabla 5. Mutaciones de UTR y de cambio de sentido presentes en derivados de virus rDEN4A30 que portan

mutaciones puntuales introducidas

Virus: Gen Posicion de nucleotido Sustitucion de nucleotidos Posicion de aminoacido9 Cambio de aminoacidos

rDEN4A30- 4995: NS3 4725 U > G 1542 Ser > Asp

NS3: 4726 C > A 1542 Ser > Asp

NS3: 4995b U > C 1632 Ser > Leu

rDEN4A30- 8092: E 1612 A > C 504 Asp > Ala

NS4B: 7131 A > G 2344 Thr> Ala

NS5: 8092b A > G 2664 Glu > Gly

rDEN4A30- 10634: NS4B 6969 A > U 2290 Met > Leu

NS4B: 7182 G > C 2361 G) < V > (O

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: 3'- UTR 10634b U > C ninguna ninguno

a Posicion de aminoacido en la poliprotema de DEN4 que comienza con el resto de metionina de la protema C (nucleotidos 102-104) como posicion 1.

b La mutacion restringe la replicacion en modelos de raton de infeccion por DEN4 que se introdujeron por mutagenesis Kunkel.

La replicacion de los tres virus rDEN4A30 modificados se comparo con los virus rDEN4A30 y rDEN4 de tipo natural en el modelo de cerebro de raton lactante y ratones SCID con trasplante de celulas HuH-7 (ratones SCID-HuH-7). Se realizaron los experimentos tal como se describio anteriormente (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139; Blaney, J. E. et al. 2001 J Virol. 75: 9731-9740). En resumen, para la infeccion de cerebro de raton lactante, se inocularon a grupos de ratones de seis-siete dfas de edad por via intracerebral 4,0 log-10 UFP de virus y se extrajo el cerebro de cada raton cinco dfas despues. Entonces se congelaron los sobrenadantes aclarados de suspensiones de cerebro al 10% a -70 °C, y se determino el tftulo de virus mediante ensayo de placas en celulas Vero. Para el analisis de la replicacion del virus DEN4 en ratones SCID-HuH-7, se inyectaron por via intraperitoneal a ratones SCID de cuatro a seis semanas de edad 107 celulas HuH-7. De cinco a seis semanas tras el trasplante, se infectaron los ratones mediante inoculacion directa en el tumor de 4,0 log-10 UFP de virus, y se obtuvo suero para la titulacion del virus mediante puncion en la cola en el dfa 7. Se determino el tftulo de virus mediante ensayo de placas en celulas Vero.

El virus rDEN4 de tipo silvestre se replico a 6,0 log-10 UFP/g en cerebro de raton lactante, y rDEN4A30 estaba restringido en su replicacion en 0,7 log-10 UFP/g, lo que es similar a las observaciones previas (tabla 6) (Blaney, J. E. et al. 2001 J Virol. 75: 9731-9740). Se descubrio que los virus rDEN4A30-4995, rDEN4A30-8092 y rDEN4A30-10634 teman una replicacion restringida en cerebro de raton lactante en comparacion con el virus rDEN4 de 3,3, 2,8 y 2,4 log-10 UFP/g, respectivamente. Estos resultados indican que las mutaciones atenuantes adicionales sirven para restringir adicionalmente la replicacion del virus rDEN4A30 en cerebro de raton oscilando desde 50 veces (rDEN4A30-10634) hasta 400 veces (rDEN4A30-4995). En ratones SCID-HuH-7, el tftulo de virus del virus rDEN4A30 era 0,4 log-10 UFP/ml inferior al virus rDEN4, lo que tambien es similar a los estudios previos (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139). Se encontro que cada virus rDEN4A30 modificado estaba restringido adicionalmente en su replicacion en ratones SCID-HuH-7 (tabla 6). Los virus rDEN4A30-4995, rDEN4A30-8092 y rDEN4A30-1063 teman replicacion restringida en ratones SCID-HuH-7 en comparacion con el virus rDEN4 de 2,9, 1,1 y 2,3 log-10 UFP/g por debajo del nivel del virus rDEN4 de tipo silvestre, respectivamente. Se hicieron dos importantes observaciones: (1) las mutaciones 4995, 8092 y 10634 eran compatibles para su viabilidad con la mutacion A30, y (2) estos tres virus rDEN4A30 modificados teman una reduccion de entre 10 y 1.000 veces en la replicacion en comparacion con el virus rDEN4 de tipo natural, lo que permite que virus con un intervalo amplio de atenuacion en este modelo se evaluen adicionalmente en monos o seres humanos.

Tabla 6. La adicion de mutaciones puntuales en NS3, NS5 o la 3'-UTR al virus rDEN4A30 atenua adicionalmente el

Virus: Replicacion en cerebro de raton lactantea Replicacion en ratones SCID-HuH-7c

N.° de ratones: Tftulo de virus ± EE logio UFP/g de cerebro Reduccion de unidades logio media con respecto al tipo naturalb N.° de ratones Tftulo de virus ± EE logio UFP/g de suero Reduccion de unidades logio media con respecto al tipo naturalb

rDEN4: 12 6,0 ± 0,1 - 13 6,4 ± 0,2 -

rDEN4A30: 12 5,3 ± 0,1 0,7 20 6,0 ± 0,2 0,4

rDEN4A30- 4995: 6 2,7 ±0,4 3,3 5 3,5 ± 0,3 2,9

rDEN4A30- 8092: 6 3,2 ± 0,2 2,8 7 5,0 ± 0,4 1,1

rDEN4A30- 10634: 12 3,6 ± 0,1 2,4 5 4,4 ± 0,3 2,3

cerebros 5 dfas despues, se homogeneizaron y se titularon en celulas Vero. b Comparacion de los tftulos de virus medios de ratones inoculados con virus mutante y control de tipo natural de rDEN4 simultaneo.

Se inocularon a grupos de ratones HuH-7-SCID directamente en el tumor 10 UFP de virus. Se recogio suero en el dfa 6 y 7 y se titulo en celulas Vero.

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Basandose en los hallazgos en los dos modelos de raton de infeccion por virus DEN4, se evaluo cada uno de los virus rDEN4A30-4995, rDEN4A30-8092 y rDEN4A30-10634 en el modelo de macaco rhesus de infeccion por DEN4 que se ha descrito anteriormente (Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:405-413). En resumen, se inocularon a grupos de cuatro (rDEN4A30-4995, rDEN4A30-8092 y rDEN4A30-10634) o dos (rDEN4, rDEN4A30, simulado) monos con 5,0 log-10 UFP de virus por via subcutanea. Se observaron diariamente los monos y se recogio suero en los dfas de 0 a 6, 8, 10 y 12, y se determinaron los tftulos de virus mediante ensayo de placas en celulas Vero para la medicion de la viremia. En el dfa 28, se extrajo suero y se sometio a prueba el nivel de anticuerpos neutralizantes mediante ensayo de reduccion de placas en celulas Vero tal como se describio anteriormente (Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:405-413).

Se detecto la viremia comenzando en el dfa 1 tras la infeccion y terminando en el dfa 4 en todos los monos (tabla 7, figura 3). La viremia estaba presente en cada mono infectado con los virus rDEN4, rDEN4A30 o rDEN4A30-10634, pero solo 2 de 4 monos infectados con los virus rDEN4A30-4995 o rDEN4A30-8092 teman viremia detectable. Tal como se esperaba, la infeccion con virus rDEN4 dio como resultado el mayor numero medio de dfas viremicos por mono (3,0 dfas) asf como tftulo de virus pico medio (2,2 log-10 UFP/ml). Los monos infectados con el virus rDEN4A30 teman tanto un numero medio inferior de dfas viremicos por mono (2,0 dfas) como tftulo de virus pico medio (1,1 log-10 UFP/ml) en comparacion con el virus rDEN4. Grupos de monos infectados con cada uno de los virus rDEN4A30 modificados teman un numero medio adicionalmente restringido de dfas viremicos, teniendo los inoculados con el virus rDEN4A30-8092 el menor valor, 0,5 dfas, una reduccion de 4 veces en comparacion con el virus rDEN4A30. El tftulo de virus pico medio de monos infectados con rDEN4A30-4995 (0,9 log-10 UFP/ml) o rDEN4A30-8092 (0,7 log-10 UFP/ml) tambien era inferior al de los infectados con el virus rDEN4A30. Sin embargo, el tftulo de virus pico medio de monos infectados con rDEN4A30-10634 (1,3 log-10 UFP/ml) era ligeramente superior al de los infectados con rDEN4A30 particularmente en el dfa 2 (figura 3).

Tabla 7. La adicion de mutaciones puntuales a rDEN4A30 atenua adicionalmente el virus para monos Rhesus

Virus3: N.° de monos N.° de monos con viremia N.° medio de dias viremicos por monob Tftulo de virus pico medio (logio UFP/ml ± EE) Tftulo de anticuerpos neutralizantes sericos, media geometrica (dilucion redproca)

Dia 0: Dia 28

Simulado: 2 0 0 <0,7 <10 <10

rDEN4: 2 2 3,0 2,2 ± 0,6 <10 398

rDEN4A30: 2 2 2,0 1,1 ± 0,4 <10 181

rDEN4A30- 4995: 4 2 0,8 0,9 ± 0,2 <10 78

rDEN4A30- 8092: 4 2 0,5 0,7 ± 0,1 <10 61

rDEN4A30- 10634: 4 4 1,3 1,3± 0,2 <10 107

a Se inocularon por via subcutanea a grupos de monos rhesus con 105 UFP de los virus indicados en una dosis de 1 ml. Se recogio suero en los dfas de 0 a 6, 8, 10, 12 y 28. Se determino el tftulo de virus mediante ensayo de placas en celulas Vero. b No se detecto viremia en ningun mono tras el dfa 4.

Se sometio a prueba el suero recogido en el dfa 0 y 28 para determinar el nivel de anticuerpos neutralizantes contra rDEN4. No se encontro ningun anticuerpo neutralizante detectable contra DEN4 en el dfa 0, tal como se esperaba, puesto que los monos se seleccionaron previamente para que fuesen negativos para anticuerpos neutralizantes contra flavivirus (tabla 7). En el dfa 28, los monos infectados con rDEN4 teman un tftulo de anticuerpos neutralizantes sericos medio (dilucion redproca) de 398 que era aproximadamente dos veces superior al de monos infectados con el virus rDEN4A30 (1:181). Este resultado y el nivel de viremia dos veces superior en monos infectados con el virus rDEN4 son similares a los resultados obtenidos anteriormente (Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:405-413). Los monos infectados con los virus rDEN4A30-4995 (1:78), rDEN4A30-8092 (1:61) y rDEN4A30-10634 (1:107) teman cada uno un tftulo de anticuerpos neutralizantes sericos medio reducido en comparacion con monos infectados con el virus rDEN4A30. Los cuatro monos que no teman viremia detectable teman tftulos de anticuerpos neutralizantes sericos que indicaban que estaban de hecho infectados. A pesar del ligero aumento en el tftulo de virus de pico medio del virus rDEN4A30-10634 en comparacion con el virus rDEN4A30, el virus rDEN4A30-10634 tema un tftulo de anticuerpos neutralizantes sericos medio inferior en comparacion con monos infectados con el virus rDEN4A30. Esto y el numero medio inferior de dfas viremicos por mono sugieren que la mutacion 10634 puede atenuar la replicacion del virus rDEN4A30 en monos.

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En el d^a 28 tras la inoculacion, se expusieron todos los monos a 5,0 logio UFP de virus rDEN4 de tipo silvestre por via subcutanea. Se observaron los monos diariamente y se recogio suero en los dfas de 28 a 34, 36 y 38, y se determinant los tftulos de virus mediante ensayo de placas en celulas Vero para la medicion de la viremia tras la exposicion. Veintiocho dfas tras la exposicion al virus rDEN4, se extrajo suero y se sometio a prueba el nivel de anticuerpos neutralizantes mediante ensayo de reduccion de placas en celulas Vero. Los monos inoculados de manera simulada teman un tftulo de virus de pico medio de 2,3 logio UFP/ml tras la exposicion con un numero medio de dfas viremicos de 3,5 (tabla 8). Sin embargo, los monos inoculados con rDEN4, rDEN4A30 o cada uno de los virus rDEN4A30 modificados no teman viremia detectable, lo que indica que a pesar de la disminucion en la replicacion e inmunogenicidad de los virus rDEN4A30-4995, rDEN4A30-8o92 y rDEN4A30-10634, cada uno era suficientemente inmunogenico para inducir proteccion frente a rDEN4 de tipo silvestre. Los aumentos en el tftulo de anticuerpos neutralizantes medio eran mmimos (< 3 veces) tras la exposicion en todos los grupos de inoculacion excepto para el infectado de manera simulada, lo que proporciona pruebas adicionales de que los monos estaban protegidos frente a la exposicion.

Tabla 8. rDEN4A30 que contiene mutaciones puntuales adicionales protege a monos rhesus frente a la exposicion al __________________________________virus DEN4 de tipo natural ______________________________

Virus3: N.° de monos N.° medio de dias viremicos por mono tras la exposicion a rDEN4 Tftulo de virus pico medio (logio UFP/ml ± EE) Tftulo de anticuerpos neutralizantes sericos, media geometrica (dilucion reciproca)

Dia 28: Dia 56

Simulado: 2 3,5 2,3 ± 0,1 <10 358

rDEN4: 2 0,0 <0,7 398 753

rDEN4A30: 2 0,0 <0,7 181 202

rDEN4A30- 4995: 4 0,0 <0,7 78 170

rDEN4A30- 8092: 4 0,0 <0,7 61 131

rDEN4A30- 10634: 4 0,0 <0,7 107 177

a 28 dfas tras la inoculacion primaria con los virus indicados, se expusieron monos rhesus por via subcutanea a 105 UFP de virus rDEN4 en una dosis de 1 ml. Se recogio suero en los dfas de 28 a 34, 36, 38 y 56. Se determino el tftulo de virus mediante ensayo de placas en celulas Vero

En conjunto, estos resultados indican que las tres mutaciones puntuales (4995, 8092 y 10634) descritas anteriormente atenuan adicionalmente el candidato a vacuna rDEN4A30 en cerebro de raton lactante, en ratones SCID-HuH-7 y en monos rhesus. Debido a las mutaciones imprevistas adicionales (tabla 4) presentes en cada virus rDEN4A30 modificado, los fenotipos no pueden atribuirse directamente a las mutaciones puntuales 4995, 8092 y 10634 individuales. Sin embargo, la presencia de fenotipos de atenuacion en ratones similares en otros virus rDEN4 que portan una de estas tres mutaciones apoya la opinion de que las mutaciones puntuales 4995, 8092 y 10634 son responsables de los fenotipos att en los virus rDEN4A30 modificados. Puesto que los virus rDEN4A30-4995, rDEN4A30-8092 y rDEN4A30-10634 demostraron una disminucion en su replicacion en monos rhesus mientras que conservaban una inmunogenicidad suficiente para conferir inmunidad protectora, se contemplan estos virus como vacunas contra el dengue para seres humanos.

Se generaron a continuacion virus DEN4 que portaban mutaciones tanto A30 como de carga a alanina. Se identifico un subconjunto de siete grupos de mutaciones de carga a alanina descritas anteriormente que conferian una disminucion de entre 10 veces y 1.000 veces en la replicacion en ratones SCID-HuH-7 y cuya secuencia no mutada estaba bien conservada en los cuatro serotipos del dengue. Se introdujeron estas mutaciones como pares individuales y como dos conjuntos de pares en rDEN4A30 usando tecnicas de clonacion convencionales. Se realizo la transcripcion y la recuperacion de virus y la dilucion terminal de virus tal como se describio anteriormente. El ensayo del nivel de sensibilidad a la temperatura de los virus mutantes de carga-grupo a alanina en celulas Vero y HuH-7, el nivel de replicacion en el cerebro de ratones lactantes y el nivel replicacion en ratones SCID-HuH-7 se realizo tal como se describio anteriormente.

La introduccion de un par de mutaciones de carga a alanina en rDEN4 produjo virus recuperable en todos los casos (tabla 9). La introduccion de dos pares de mutaciones de carga a alanina produjo virus recuperable en dos de tres casos (no era recuperable rDEN4A30-436-437-808-809).

5

10

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25

30

rDEN4A30 no es ts en celulas Vero o HuH-7. En cambio, siete de los siete conjuntos de mutaciones de carga a alanina usados en este ejemplo confenan un fenotipo ts en celulas HuH-7 y cinco confenan tambien un fenotipo ts en celulas Vero. Los seis virus que portaban mutaciones tanto A30 como de carga a alanina mostraron un fenotipo ts tanto en celulas Vero como HuH-7 (tabla 9). rDEN4A30 no esta atenuado en cerebro de raton lactante, mientras que cinco de los siete conjuntos de mutaciones de carga a alanina confenan un fenotipo att en cerebro de raton lactante (tabla 10). Cuatro de los virus que portaban mutaciones tanto A30 como de carga a alanina estaban atenuados en cerebro de raton lactante (tabla 10). En un caso (rDEN4A30-23-24-396-397), la combinacion de dos mutaciones que no produdan atenuacion solas dio como resultado un virus atenuado. Generalmente, los virus que portaban mutaciones tanto A30 como de carga a alanina mostraron niveles de replicacion en el cerebro de raton lactante mas similares a su virus original mutante de carga a alanina que a rDEN4A30.

rDEN4A30 esta atenuado en ratones SCID-HuH-7, como lo estan seis de los siete virus mutantes de carga a alanina usados en este ejemplo. Los virus que portaban mutaciones tanto A30 como de carga a alanina tendfan a mostrar niveles similares o ligeramente inferiores de replicacion en ratones SCID-HuH-7 en comparacion con su virus original mutante de carga a alanina (tabla 10). En tres casos, los virus que portaban mutaciones tanto A30 como de carga a alanina mostraron al menos una reduccion cinco veces mayor en ratones SCID-HuH-7 que rDEN4A30.

Se determino la secuencia genomica completa de cinco virus (rDEN4-200-201, rDEN4A30-200-201, rDEN4-436-437 [clon 1], rDEN4A30-436-437 y rDEN4-23-24-200-201) que se replicaban a > 105 UFP/ml en celulas Vero a 35°C y que mostraban una reduccion de cien veces o mayor en su replicacion en ratones SCID-HuH-7 (tabla 11). Cada uno de los cinco contema una o mas mutaciones imprevistas. En un virus, rDEN4A30-436-437, la mutacion adicional se ha asociado anteriormente con adaptacion a celulas Vero (Blaney, J.E. Jr. et al. 2002 Virology 300:125-139). Cada uno de los virus restantes contema al menos una mutacion incidental cuyo efecto fenotfpico se desconoce. En consecuencia, los fenotipos descritos no pueden atribuirse directamente a las mutaciones de carga a alanina. Sin embargo, el hecho de que los virus rDEN4 y rDEN4A30 que portan las mismas mutaciones de carga a alanina compartan fenotipos similares proporciona un fuerte apoyo a la capacidad de las mutaciones de carga a alanina para potenciar la atenuacion de rDEN4A30. Debido a que rDEN4-436-437 [clon 1] contema 4 mutaciones imprevistas, se preparo un segundo clon de este virus. rDEN4-436-437 [clon 2] contema solo una mutacion incidental (tabla 11), y mostro los mismos fenotipos que rDEN4-436-437 en cultivo celular y ratones SCID-HuH-7. Se uso rDEN4-436-437 [clon 2] en el estudio con monos rhesus descrito a continuacion.

Claims

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1. Un virus del dengue quimerico recombinante que comprende una quimera de acido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleotidos que codifica la protema estructural C del virus del dengue tipo 4 y las protemas estructurales M y E del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 2 o del virus del dengue de tipo 3, en donde la region del virus del dengue de tipo 4 que codifica las protemas estructurales M y E se sustituye por la region que codifica dichas protemas estructurales M y E del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 2 o del virus del dengue de tipo 3, y una segunda secuencia de nucleotidos que codifica protemas no estructurales del virus del dengue de tipo 4 y la region no traducida en 3' del genoma del dengue de tipo 4 que contiene una delecion de 30 nucleotidos que se corresponde con la estructura de tallo-bucle de TL2 entre los nucleotidos 10478-10507 del genoma del dengue de tipo 4.
2. El virus del dengue quimerico recombinante de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente una mutacion que confiere un fenotipo en donde el fenotipo es sensible a la temperatura en celulas Vero o en la lmea celular de hngado humano HuH-7, restriccion del hospedador celular en celulas de mosquito o en la lmea celular de hngado humano HuH-7, adaptacion de celula hospedadora para una replicacion mejorada en celulas Vero o atenuacion en ratones o monos.
3. El virus del dengue quimerico recombinante de la reivindicacion 1 o 2 para su uso en la induccion de una respuesta inmunitaria protectora.
4. El virus del dengue quimerico recombinante para su uso en la induccion de una respuesta inmunitaria protectora de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde dicho virus del dengue quimerico recombinante esta comprendido en una vacuna para su administracion a un sujeto en una cantidad eficaz.
5. El virus del dengue recombinante quimerico de la reivindicacion 1 o 2 para su uso en la prevencion de una enfermedad causada por el virus del dengue.
6. El virus del dengue quimerico recombinante para su uso en la prevencion de una enfermedad causada por el virus del dengue de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde dicho virus del dengue quimerico recombinante esta comprendido en una vacuna para su administracion a un sujeto en una cantidad eficaz.
7. Una vacuna o composicion inmunogenica que comprende al menos un virus del dengue quimerico recombinante de la reivindicacion 1 o 2.
8. La vacuna o la composicion inmunogenica de la reivindicacion 7 que es una vacuna del virus del dengue o una composicion inmunogenica del virus del dengue.
9. La vacuna o la composicion inmunogenica de la reivindicacion 7 u 8 que es una vacuna tetravalente o una composicion inmunogenica tetravalente.
10. La vacuna o composicion inmunogenica de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 que comprende rDEN1/4A30 (ME), rDEN2/4A30 (ME) y rDEN3/4A30 (ME), en donde:

rDEN1/4A30 (ME) es un virus del dengue quimerico de acuerdo con la reivindicacion 1 que comprende una quimera de acido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleotidos que codifica la protema estructural C del virus del dengue de tipo 4 y las protemas estructurales M y E del virus del dengue de tipo 1, en donde la region del virus del dengue de tipo 4 que codifica las protemas estructurales M y E se sustituye por la region que codifica dichas protemas estructurales M y E del virus del dengue de tipo 1, y una segunda secuencia de nucleotidos que codifica protemas no estructurales del virus del dengue de tipo 4, y la region no traducida en 3' del genoma del dengue de tipo 4 que contiene dicha delecion de 30 nucleotidos;

rDEN2/4A30 (ME) es un virus del dengue quimerico de acuerdo con la reivindicacion 1 que comprende una quimera de acido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleotidos que codifica la protema estructural C del virus del dengue de tipo 4 y las protemas estructurales M y E del virus del dengue de tipo 2, en donde la region del virus del dengue de tipo 4 que codifica las protemas estructurales M y E se sustituye por la region que codifica dichas protemas estructurales M y E del virus del dengue de tipo 2, y una segunda secuencia de nucleotidos que codifica protemas no estructurales del virus del dengue de tipo 4, y la region no traducida en 3' del genoma del dengue de tipo 4 que contiene dicha delecion de 30 nucleotidos; y

rDEN3/4A30 (ME) es un virus del dengue quimerico de acuerdo con la reivindicacion 1 que comprende una quimera de acido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleotidos que codifica la protema estructural C del virus del dengue de tipo 4 y las protemas estructurales M y E del virus del dengue de tipo 3, en donde la region del virus del dengue de tipo 4 que codifica las protemas estructurales M y E se sustituye por la region que codifica dichas protemas estructurales M y E del virus del dengue de tipo 3, y una segunda secuencia de nucleotidos que codifica protemas no estructurales del virus del dengue de tipo 4, y la region no traducida en 3' del genoma del dengue de tipo 4 que contiene dicha delecion de 30 nucleotidos.
11. El virus del dengue quimerico recombinante para su uso en la induccion de una respuesta inmunitaria protectora

de acuerdo con la reivindicacion 3 o 4, que se administra a un sujeto humano.
12. El virus del dengue recombinante quimerico para su uso en la prevencion de una enfermedad causada por el virus del dengue de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, que se administra a un sujeto humano.

5

imagen1

Figura 1

imagen2

Titulo de virus medio (Log10UFP/ml)

imagen3

Figura 3

143

Figura 4

Dia tras la inoculacibn

Titulo de virus (log10UFP/ml)

© N* N* hi K> Ui

T/l © Ul © Irt ©

imagen4

Titulo (log10ufp/ml) Titulo (log10ufp/ml)

imagen5

imagen6

DEN4 de tipo natural

-m- rDEN4A30

Dia tras la infeccion

imagen7

01 234567

Dia tras la infecciAn

rDEN1

rDEN1A30

Figura 5

imagen8

Figura 6

Titulo de virus medio (Log10UFP/ml)

imagen9

Figura 7

imagen10

Figura 8

imagen11

No estmctura

C I p<M | E I WS1 I NS2A I NS2B \ IMS3 I NS4A f NS40 NSS

■J11 M.I-'I-JH h..—-.1™ jithr i__w-.<- .1L1...........................L__'f.w jie

DEN2 de tipo nature

rDEN4

XTiol

flgm Psfl

Quimenzacion

rDENZ/4 (CME)

A 30

rDEN2MA30 (CME)

rDEN2/4 (ME)

A3Q

rDEN2S4A30 (ME)

DEN4

DEN2

Unton 1: -cagttt'Gtttg aatagagagc AGATcrcTGftTGAAT aaccaacg aaaaaac-

Met As iiAsnGl nArgLya Lye

DEN2

DEN4

XhcA

Um6n 2 : -ATTATCACATEGATAGGAATGAA<7TC3AGG AACACTTCAATGGCTATGACG-

Hell eThrTrp 11 eGlyMe tA&nSe rArg A&iiThr Se rMet A1 aMetThr

DEN4

DEN2

Psil

Union 3 ; -ATCTTGAACGGGAGAAAAAjGGTCTGCAjGGCATGATCATTATGCTGATTCCA-

11eL a uAsnGlyArgLyeArgS erA1aGlyMe 111e11eMet Leu11e Pro

Figura 9

Tftulo de virus (log10UFP/ml)

imagen12

imagen13

NS1 NS2A

NS2B J NS3

NS4A

NS4B

rirtn-K^

DEN3 de lipo natural

Es mctui'a

rDEN4

Sfiifll Psfl

jowl

Quimerizacidn

rDEN3f4 (CME)

i3G

rOEM3/4i30 (CMEJ

rOEN3/4 (ME)

A30

rDEN3/4&30 ME

□ EN4

□EN3

Union 1: -cagtttgtttgaa'ta-gagagcaCtATCTCTGGAAAAATGAACAACCAACGG

MetAsnAsnGlnArg

DEN3

□ EM4

X^cl

U n [6 rr 2: - cttttaac ctggatagggttgaactcgag-saacacppcaatgg c tatgacg -

L euLeuTh rTrpI1e GlyLeuAsnS erATgAs nThrS erMetAlaMe tThf

DEN4

DEN3

Psfl

Union 3: -atcttgaacgggagaaaaaggtctgcagtctgtctcatcatgatgttacca-

L1e LeuAenG1yArgLysArgS erAlp ValCysLeuMetHe tMe t LeuPto

Figura 11

imagen14

No estructura

c prM E NS1 MS2A NS2B NS3 NS4A NS4B MSS

3rar

DEN1 de tipo natural

rOEN4

asm Psn

XfHJl

Quimerizacion

iDENIrt <CME)

430

rDEN1/443fi (CME)

rDEMl;4 (ME)

430

rOEN1/4430 (ME)

DEN4

□ EN1

Bg.'ll

Union 1

CAGTTTGTTTGAATaGAGAG CA3ATCT CTGGAAAAATCAACAAC CAftCGG

Me tAsnA s nGlnA rg

DENI

DEN4

Xha\ .

Union 2 : -ctgctgacatggctaggattaaactcgagg aacacttcaatggctatgacg-

LeuLeuThrTrpLeuG lyLeuAsnfi e r Ar gAs nThrSerMetA1aMe t Thr

DEN4

DENI

Union 3 : -atcttgaacgggagaaaaaggtctgcagccatgctcctcatgctgctgccc

IleLeuAsnGlyArgLysArgSerAlaAlaMetLeuLeuMetLeuLeuPro

Figura 12