ES2677020T3

ES2677020T3 - Clonación de alérgeno de abeja melífera

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Publication number: ES2677020T3
Application number: ES05815149.9T
Authority: ES
Inventors: Thomas Grunwald
Original assignee: PLS-Design GmbH
Current assignee: PLS-Design GmbH
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2005-12-13
Publication date: 2018-07-27
Anticipated expiration: 2025-12-13
Also published as: DK1846556T3; US20060127394A1; US7846690B2; EP1846556B1; WO2006063800A8; EP1846556A1; WO2006063800A1

Abstract

Ácido nucleico que codifica un polipéptido capaz de unirse a IgE de sujetos alérgicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, en el que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Description

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DESCRIPCION

Clonacion de alergeno de abeja meKfera

La presente invencion se refiere a un acido nucleico que codifica un polipeptido capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2, que es el alergeno de abeja melffera Api m3 (fosfatasa acida). La invencion se refiere ademas a vectores de expresion, celulas hospedadoras y polipeptidos codificados por el acido nucleico, ademas de usos de diagnostico y farmaceuticos de los mismos.

Se ha reconocido desde hace tiempo que las alergias a venenos de insecto son relativamente comunes. El 4-5 % de la poblacion alemana tienen alergia a los venenos de insecto. En Europa, los insectos picadores relevantes son abejas melfferas (Apis mellifera), avispas (Vespula spp.), abejorros (Bombus spp.), avispones (Vespa crabo), jejenes y tabanos (Ref. 1,2). Abejas, abejorros, avispas y avispones pertenecen al orden Hymenoptera.

Estos insectos sociales normalmente no atacan a las personas, pero las picaran en autodefensa si son molestados. Una vez han picado, si el aguijon sigue en la piel, una abeja melffera es responsable, mientras que si ya no esta presente, es probable que una avispa sea la culpable. La abeja melffera obrera hembra lleva el aguijon y muere poco despues de descargar un aguijon.

Si una abeja pica a un vertebrado, el aguijon se desprendera del insecto, pero el saco de veneno todavfa estara unido al aguijon y si no se quita, se inyectara todo el volumen de veneno (hasta 50 jl) en la vfctima. Las avispas pueden retraer el aguijon, y solo inyectar aproximadamente 20 jl de veneno.

Las diferencias en el comportamiento de picar se basan en la evolucion natural. Las abejas recolectan nectar, mientras que las avispas y avispones son cazadores de insectos. Por tanto, las abejas necesitan proteger la colmena, incluso contra vertebrados como ratones o animales mayores. El insecto muere despues de la picadura, pero inyectara el maximo volumen de veneno, si el aguijon no se saca. Las avispas y avispones no tienen tales enemigos naturales.

Como es facil de obtener cantidades suficientes de material, el veneno de abeja melffera ha sido bien estudiado. El veneno de abeja melffera contiene al menos 18 sustancias activas. La melitina, la sustancia mas predominante, es uno de los agentes antiinflamatorios mas potentes conocidos (100 veces mas potente que la hidrocortisona). La adolapina es otra sustancia antiinflamatoria fuerte, e inhibe la ciclooxigenasa; asf, tambien tiene actividad analgesica. La apamina inhibe la actividad del complemento C3, y bloquea los canales de potasio dependientes de calcio, potenciando asf la transmision nerviosa. Otras sustancias, tales como el compuesto X, hialuronidasa, fosfolipasa A2, histamina y protema desgranuladora de mastocitos (MSDP), participan en la respuesta inflamatoria al veneno, con el ablandamiento de tejido y la facilitacion de flujo de las otras sustancias. Finalmente, existen cantidades medibles de los neurotransmisores dopamina, norepinefrina y serotonina. El contenido de agua vana entre el 55-70 %. El intervalo de pH es entre 4,5-5,5. Un resumen de los componentes del veneno de abeja se da en la Tabla 1 (Ref. 3,4).

Tabla 1) Componentes del veneno de abeja

Tipo de componente: nombre % en peso de masa seca

Protemas: Fosfolipasa A2 (Api m 1) 10-12

: Hialuronidasa (Api m 2) 1-3

: Fosfatasa, glucosidasa 1-2

Peptidos: Melitina (Api m 4) 50-55

: Secapina, peptido MCD 1,5-4

: Tertiapamina, apamina, procamina 2-5

: Otros peptidos pequenos 13-15

Aminas biogenas: Histamina 0,5-2

: Dopamina 0,2-1

: Norepinefrina 0,1-0,5

: Azucares (glucosa, fructosa) 2

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Tipo de componente: nombre % en peso de masa seca

Fosfolfpidos: 5

Aminoacidos: -

Sustancias volatiles: Feromonas 4-8

Minerales: 3-4

La dosis DL50, es dedr, la cantidad de veneno de abeja que hace que muera el 50 % de los individuos probados, es 6 mg de veneno/kg de peso corporal para ratones y ratas. Esto es igual a 40 picaduras/kg de peso corporal. Para avispones, este factor es aproximadamente 154-180 picaduras/kg de peso corporal. El veneno de abeja es 1,7-1,5 mas eficaz que el de los avispones (Ref. 5,6).

Las abejas melfferas y avispas del orden Hymenoptera son con creces las causas mas frecuentes de reacciones alergicas graves. Normalmente, al menos mas de 50 picaduras de una abeja por nino o 100 por adulto son necesarias para inducir condiciones potencialmente mortales (vease anteriormente). En caso de personas alergicas, una picadura puede ser suficiente para producir la muerte por reacciones inmunologicas adversas.

Este tipo de alergia esta mediada por anticuerpos IgE que reaccionan a los componentes del veneno. Por tanto, existe la posibilidad de que la terapia de desensibilizacion por dosis repetidas y progresivamente elevadas de componentes del veneno de abeja fuera satisfactoria. Han sido clonados y expresados varios polipeptidos de veneno de abeja como moleculas recombinantes (Ref. 7-16). Un componente de veneno de abeja, la fosfatasa acida, es una de las protemas alergicas mas potentes (Ref. 17). Hasta ahora, no se ha publicado informacion sobre la secuencia completa de genes y solo se han hecho estudios iniciales sobre el nivel de protema (Ref. 18-20, 27).

Barboni et al. (Ref. 19) describen dos protemas diferentes con actividad de fosfatasa acida de veneno de abeja melffera, que tienen un peso molecular de 45 y 96 kDa. La actividad enzimatica se pierde parcialmente durante la purificacion en la etapa de filtracion en gel. Otras publicaciones (Ref. 18, 20, 27) informan de datos opuestos, que ensenan diferentes fragmentos de la protema y el acido nucleico correspondiente, y que conducen a diferentes conclusiones sobre la familia de fosfatasas a la que la fosfatasa acida del veneno de abeja melffera podna pertenecer, ya sean fosfatasas prostaticas o fosfatasas lisosomales. Soldatova et al. (Ref. 18) describen la clonacion incompleta de un ADNc parcial que posiblemente codifica una fosfatasa acida de veneno de abeja melffera. Informan de dificultades en la clonacion y obtencion de la secuencia de longitud completa y no ensenan la secuencia que parece que han clonado.

En vista del estado de la tecnica, el experto en la materia se enfrenta, por tanto, al problema de proporcionar un acido nucleico adecuado para la produccion recombinante de fosfatasa acida (api m3) del veneno de un insecto del orden Hymenoptera, en particular de abeja melffera, que pueda usarse en tal terapia de desensibilizacion, ademas de en pruebas de diagnostico para la deteccion de alergia.

Este problema se resuelve por la materia de las reivindicaciones.

En particular, la presente invencion proporciona un acido nucleico que codifica un polipeptido capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, en el que el polipeptido tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 (nota: "SEQ ID NO" se refiere al codigo <400> en el listado de secuencias adjunto en la norma de WIPO ST.25).

Este polipeptido se designa Api m 3. En particular, el acido nucleico comprende o tiene la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 1.

En el contexto de la presente invencion, los terminos "polipeptido" y "protema" se usan indistintamente, sin ninguna limitacion en cuanto al numero de aminoacidos unidos. Los polipeptidos tambien pueden comprender aminoacidos que no existen de forma natural.

En toda esta memoria descriptiva, los polipeptidos codificados por el acido nucleico de la invencion tienen que ser capaces de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera.

Tras los fallidos intentos por clonar la secuencia de longitud completa de Api m 3 siguiendo la estrategia de cebadores deducida comun (vease Soldatova et al., 2000) basada en los fragmentos de peptido encontrados por Hoffmann, 1996, y su secuencia postulada (Hoffmann, 1996). Se eligio un enfoque completamente diferente en la presente invencion. Usando secuencias de acidos nucleicos derivadas de las secuencias de peptidos publicadas por Hoffman, se construyeron sondas virtuales pequenas de secuencias deducidas parciales, que se usaron para barrer el genoma de abeja publicado para dianas. Dos regiones en las secuencias del cromosoma 16 truncado diferentes coincidieron con las sondas. El barrido de estas regiones con herramientas bioinformaticas revelo posibles marcos

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de lectura abiertos y secuencias de genes. El barrido de un posible sitio de escision de secuencias condujo al supuesto extremo N del gen de Api m 3. Entonces se disenaron cebadores segun el extremo N y C de protema propuesto. Estos cebadores se usaron para amplificar el gen de ADNc de la glandula de veneno de abeja sintetizado a partir de ARN total con cebadores oligodT(20). La amplificacion fue satisfactoria y produjo un fragmento de ADN del tamano esperado. La identidad del ADN se verifico por secuenciacion, calculo de peso molecular y alineamiento con las fosfatasas acidas homologas de secuencias humanas, ademas de rata, y los fragmentos de peptido propuestos. Tambien se verifico la identidad de protemas.

A partir de la secuencia de ADNc de longitud completa resultante, es evidente que ha fallado el enfoque clasico, ya que Hoffman se equivoco en varios puntos. Por ejemplo, eligio un alineamiento incorrecto de los fragmentos de peptido (vease la Fig. 5), penso erroneamente que varios peptidos que estaban de hecho separados por otros peptidos eran contiguos, y postulo la existencia de un fragmento que no pertenece a la fosfatasa acida. En realidad, usando cebadores basados en los peptidos 1 y 7, como se propuso por Hoffman, cabna esperar que se amplificara un fragmento mas corto que cubre solo la secuencia de peptidos alrededor de los aminoacidos 200 y 230 de la secuencia consenso.

Los insectos sociales del orden Hymenoptera que comunmente interaccionan con el hombre son miembros de las superfamilias Apoidea y Vespoidea, abejas y avispas (Ref. 20). Los Vespoidea incluyen las avispas y avispones sociales, Vespidae, ademas de hormigas, Formicidae. Avispas importantes comprenden avispas germanicas del genero Vespula, avispones de los generos Dolichovespula y Vespa y avispas cartoneras del genero Polistes. Las abejas comprenden, por ejemplo, abejas melfferas, Apis mellifera, y abejorros de la especie Bombus terrestris. En el contexto de la presente invencion, un insecto del orden Hymenoptera puede ser de cualquiera de estas especies, pero segun una realizacion particular, el insecto es una abeja del genero Apis. Lo mas preferentemente, la abeja es la abeja melffera, Apis mellifera.

Otras especies del orden Hymenoptera producen alergenos similares con reactividad cruzada antigenica y un alto grado de homologfa de aminoacidos (Ref. 24-26). Asf, la presente invencion no solo se extiende al alergeno Api m3 de Apis mellifera, sino tambien a alergenos de Hymenoptera homologos.

En particular, los polipeptidos codificados por los acidos nucleicos de la invencion tienen que ser capaces de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de Apis mellifera. Los sujetos son comunmente reactivos al antfgeno de Api m3, fosfatasa acida de veneno de abeja. Con el fin de probar, se ponen en contacto suero o IgE purificada de tales sujetos alergicos con el polipeptido, y se detecta la union espedfica del polipeptido a los anticuerpos. Una prueba tal puede, por ejemplo, ser un ELISA. Para verificar la reactividad de los polipeptidos con anticuerpos IgE, se reunen suero o IgE de varios sujetos, preferencialmente, de 5 a 20 sujetos.

Los acidos nucleicos de la invencion puede ser o bien ADN o ARN.

En una realizacion, la invencion tambien proporciona un acido nucleico, que es un fragmento que tiene una longitud superior a 255 nucleotidos de un acido nucleico que codifica un polipeptido de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2, en la que el fragmento codifica un polipeptido capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera. Preferentemente, el acido nucleico es un fragmento que tiene una longitud superior a 255, mas preferentemente superior a 600, superior a 700 o superior a 800 nucleotidos de un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2.

En otra realizacion, se proporciona un fragmento de acido nucleico (polinucleotido) que comprende al menos 15 nucleotidos contiguos del acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2, en la que el polinucleotido esta seleccionado del grupo que consiste en los nucleotidos 78 a 299, 348 a 437, 459 a 476, 555 a 671, 696 a 830 o 1086 a 1121 de dicho acido nucleico, en la que la numeracion se corresponde con la region que codifica dicho polipeptido. Espedficamente, dicho acido nucleico tiene la secuencia de nucleotidos mostrada en SEQ ID NO: 1.

Preferencialmente, los nucleotidos son de la region de nucleotidos 555 a 671 o 696 a 830.

Ademas, se proporcionan tales acidos nucleicos que consisten en los nucleotidos 1 a 77, 438 a 458, 477 a 494, 504 a 554, 672 a 695, y 831 a 1085 del acido nucleico mostrado en SEQ ID NO: 1.

Preferencialmente, el acido nucleico comprende 15 a 240, 15 a 90, 18 a 60, 21 a 30, mas preferentemente al menos 18, 21, 24, 27, 30, 60, 90 o mas nucleotidos contiguos de las regiones anteriores.

La invencion tambien proporciona variantes de polipeptido adicionales y secuencias de acidos nucleicos como se indica en las reivindicaciones.

En una realizacion, la invencion tambien proporciona un polipeptido codificado por un acido nucleico de la invencion. Preferencialmente, el polipeptido es una fosfatasa acida de longitud completa del veneno de un insecto del orden Hymenoptera. En particular, el polipeptido tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2. Aunque no es esencial, se prefiere que el polipeptido tenga actividad de fosfatasa acida. Esta actividad puede probarse, por ejemplo, segun el metodo descrito en Ref. 19.

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Alternativamente, el polipeptido es un fragmento de la protema de longitud completa capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera que tiene una longitud superior a 85, superior a 200 o superior a 250 aminoacidos. Se proporcionan otros fragmentos, en los que los polipeptidos son capaces de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, y comprenden al menos 5, preferentemente al menos 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o mas aminoacidos de un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en el aminoacido 26 a 99, 116 a 145, 153 a 158, 185 a 223, 232 a 276 o 362 a 373 del polipeptido mostrado en SEQ ID NO: 2. Alternativamente, los polipeptidos son capaces de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, y comprenden al menos 5, preferentemente al menos 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o mas aminoacidos del polipeptido mostrado en SEQ ID NO: 2, excepto los polipeptidos del grupo que consiste en los aminoacidos 1 a 34, 63 a 80, 100 a 115, 142 a 149, 168 a 176, 224-239 y 258 a 343 del polipeptido mostrado en SEQ ID NO: 2, o excepto los polipeptidos mostrados en la Fig. 5. Ademas, se proporcionan tales polipeptidos que consisten en los aminoacidos 1 a 25, 146 a 152, 159 a 164, 168 a 184, 224 a 231, y 277 a 361.

Preferentemente, el polipeptido de la invencion se expresa recombinantemente. Esto tiene la ventaja, por ejemplo, de que el polipeptido puede expresarse como una protema de fusion unida a un polipeptido adicional. Por ejemplo, el polipeptido o protema de fusion esta unido a una secuencia senal que asegura su secrecion en el espacio extracelular o sobrenadante de las celulas cultivadas, cuando corresponda. Debido a las novedosas tecnicas en la biologfa molecular, se espera que el uso de protemas recombinantes en terapia y diagnosticos aumente la eficiencia y el valor de diagnostico en estas aplicaciones medicas (Ref. 21-23).

Dependiendo de la celula hospedadora que produce la protema recombinante, la protema esta glucosilada (despues de la expresion en las celulas de mairnfero o de levadura) o no glucosilada (despues de la expresion en celulas bacterianas). El patron de glucosilacion puede variar dependiendo de la celula hospedadora usada, y puede asf diferenciarse en el patron de glucosilacion de fosfatasa acida natural aislada del veneno de abeja. En una alternativa, el patron de glucosilacion es identico al patron de glucosilacion de la fosfatasa acida aislada de veneno de abeja. La glucosilacion puede tener profundos efectos sobre la union de anticuerpos espedficos.

Cuando se expresa en celulas bacterianas, el polipeptido de la invencion carece de glucosilacion. La protema asf se diferencia de la protema nativa respecto a la presentacion de epitope, y potencialidad para el plegamiento y funcionalidad. Se mostro que los hidratos de carbono pueden representan epitopes de IgE y contribuir a una reactividad cruzada no espedfica observada de alergenos, por ejemplo, entre protemas de abeja y avispa, debido a caractensticas similares de las cadenas de hidrato de carbono (Huby et al., ToxSci 55: 235-246, 2000; Tretter et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 102: 259-266, 1993; Hemmer et al., Cli. Exp. Allergy 34: 460-460, 2004). La reactividad cruzada es un motivo de resultados positivos falsos en pruebas inmunologicas in vitro (Petersen A., Mundt C., J Chromat B 756, 141-150, 2001). La expresion del polipeptido no glucosilado elimina estos positivos falsos, y puede, por tanto, ser aprovechado en aplicaciones de diagnostico y terapeuticas.

El patron de glucosilacion en celulas eucariotas distintas de celulas de insecto, por ejemplo, en celulas de mai^ero, tambien vana del patron de glucosilacion de la protema nativa (Jenkins et al., Nat. Biotech. 14: 975-981, 1996). Incluso en celulas de insecto, es probable que el patron de glucosilacion sea diferente, debido a la expresion en exceso de la protema.

El analisis de secuencias de Api m 3 muestra que la protema comprende tres supuestos sitios de glucosilacion de la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr. En una realizacion, los polipeptidos de la invencion comprenden sitios de glucosilacion mutados en lugar de sitios de glucosilacion. En particular, en un sitio de glucosilacion mutado, la asparagina (Asn) en el (los) sitio(s) de glucosilacion puede intercambiarse con cualquier otro aminoacido, preferentemente con glutamina (Gln) (Elbein A.D. et al., 1991, Trends Biotechnol. 9(10):346-352). Alternativamente, en un sitio de glucosilacion mutado, la serina (Ser) puede intercambiarse con otro aminoacido o delecionarse. Por consiguiente, la invencion tambien proporciona un acido nucleico que codifica un polipeptido de la invencion que comprende al menos uno, preferentemente 2, o 3 sitios de glucosilacion mutados, en lugar de sitios de glucosilacion. Lo mas preferentemente, todos los sitios de glucosilacion estan mutados.

La presente invencion tambien se refiere a un vector de expresion que comprende un acido nucleico de la invencion operativamente unido a una secuencia de control de la expresion. En una alternativa, el acido nucleico esta unido en marco a un acido nucleico que codifica un polipeptido adicional, de manera que el vector de expresion puede usarse para la expresion de una protema de fusion. El polipeptido adicional puede seleccionarse del grupo que comprende una marca de poli-histidina (marca His), glutation-S-transferasa, p-galactosidasa, una citocina y un IgG-Fc. En particular, se emplean marcas que simplifican la purificacion de la protema recombinante, por ejemplo, una marca His. Una marca tal puede escindirse despues de la purificacion de la protema.

Alternativamente, puede ser beneficioso para aplicaciones terapeuticas expresar el polipeptido de la invencion unido a un polipeptido terapeutico, por ejemplo una citocina. Por ejemplo, una protema de fusion con una citocina que potencia respuestas Th1 y regula por disminucion Th2 o que induce cambio de clase a IgG, tal como IFN-y, IL-10, IL- 12 o TGF-p, puede mejorar la eficiencia de desensibilizacion. Si el vector de expresion se usa para terapia genica, se preve que use secuencias ricas en CpG (dinucleotidos de citosina-guanidina no metilados), que promueven respuestas Th1. Ademas o alternativamente, el polipeptido de la invencion puede unirse a otro polipeptido o protema, tal como en forma de una protema de fusion o como protemas separadas expresadas por el mismo vector.

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Preferentemente, los polipeptidos o protemas adicionales son otras protemas de veneno de Hymenoptera o fragmentos antigenicos de las mismas.

El vector de expresion puede ser adecuado para la expresion en diferentes tipos de celulas, tales como celulas bacterianas, de levadura o de mairnfero. Preferencialmente, el vector es adecuado para la expresion en celulas de insecto, por ejemplo, celulas de insecto HighFive (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Alternativamente, especialmente para aplicaciones de terapia genica, el vector es adecuado para la expresion en celulas humanas. En este contexto, la expresion del polipeptido codificado puede ser dirigida por la eleccion de una secuencia de control de la expresion adecuada, por ejemplo, una secuencia de control de la expresion principalmente o espedficamente operacional en diferentes tipos de celulas, tales como celulas linfoides, por ejemplo celulas dendnticas, linfocitos B o macrofagos.

En una realizacion de la invencion, el vector de expresion es pIB/V5-His (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, Invitrogen Manual: InsectSelect BSD System with pIB/V5-His, Version G, 30 de mayo de 2003).

En particular, el vector puede ser pIB/Mel opt-H10-Api m3, que comprende la secuencia de ADNc de Api m3 (SEQ ID NO: 1), que se modifico para facilitar el aislamiento y la purificacion. Se anadio una secuencia senal de melitina para la secrecion de la protema recombinante y se optimizo la secuencia de Kozak para tasas de expresion mas altas en celulas de insecto (vease la Fig. 4 y Ejemplo 2). Alternativamente, pueden usarse otras secuencias senal para la secrecion de la protema. El vector de expresion tambien puede ser un vector de plasmido o viral diferente, por ejemplo, baculoviral o adenoviral. El vector de expresion comprende ademas un codon de terminacion y una senal de poliadenilacion.

La presente invencion se refiere ademas a una celula hospedadora que comprende dicho vector de expresion. Esta celula hospedadora puede ser una celula bacteriana, de levadura o de mam^era, en particular una celula de insecto.

Se proporciona un metodo de produccion de un polipeptido codificado por un acido nucleico de la invencion, en el que la celula hospedadora se cultiva en condiciones apropiadas para la expresion de dicho polipeptido y dicho polipeptido se purifica. Si el polipeptido es una protema de fusion con un componente de fusion que facilita la purificacion, por ejemplo, una marca His o una marca GST, puede usarse una columna de afinidad correspondiente para la purificacion, por ejemplo, una columna de afinidad por Ni2+ o glutation. Para la purificacion de una protema de fusion de IgG, es adecuada una columna de protema A o protema G.

El vector de expresion de la invencion puede usarse para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera. Pautas de tratamiento que usan enfoques de terapia genica para la desensibilizacion son conocidas en el estado de la tecnica (por ejemplo, Ref. 28).

Asf, la invencion tambien proporciona un metodo de tratamiento de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera que comprende administrar a un sujeto con una alergia tal un vector de expresion de la invencion. El vector de expresion puede administrarse directamente, por ejemplo, por inyeccion intravenosa, intramuscular o subcutanea, pistola de genes o junto con celulas tomadas del sujeto que se transfectaron ex vivo.

Como se usa en el presente documento, "sujeto" engloba sujetos humanos (pacientes), adultos, ademas de ninos, y animales.

Una composicion farmaceutica que comprende un vector de expresion de la invencion, y, opcionalmente, que comprende un adyuvante o recurso adecuado, puede emplearse para este fin. En particular, este vector de expresion es rico en secuencias de CpG y/o codifica una citocina que desplaza el equilibrio entre respuestas inmunitarias Th1 y Th2.

Alternativamente, el polipeptido de la invencion se usa para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera. As^ la invencion proporciona un metodo de tratamiento de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, que comprende administrar un polipeptido de la invencion a un sujeto que tiene una alergia tal.

Los enfoques de desensibilizacion son muy conocidos en el estado de la tecnica. En principio, tratamientos repetidos de individuos alergicos con dosis adecuadas, normalmente progresivamente elevadas, de alergeno desvfan la respuesta inmunitaria a una dominada por linfocitos T que favorecen la produccion de anticuerpos IgG e IgA con respecto a la produccion de anticuerpos IgE. Se cree que los anticuerpos IgG e IgA desensibilizan al sujeto uniendose a las pequenas cantidades de alergeno normalmente encontradas, y previniendo que el alergeno se una a IgE. La desensibilizacion a veneno de insecto o de abeja es casi universalmente satisfactoria (Ref. 29). Pueden usarse diferentes protocolos y programas de tiempo, desde protocolos tradicionales, protocolos rapidos a protocolos ultrarrapidos (por ejemplo, Ref. 30), todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. La eficacia de tales protocolos puede evaluarse probando el ajuste de niveles de IgE e IgG (diferentes isotipos) y/o IgA en la sangre del sujeto o exponiendo el sujeto de una manera controlada y determinando la respuesta alergica.

El polipeptido de la invencion puede administrarse solo o en combinacion con otros alergenos, por ejemplo, otras protemas de veneno de Hymenoptera o fragmentos de las mismas. En particular, son adecuadas combinaciones con fosfolipasa A2, hialuronidasa, glucosidasa y/o melitina de veneno de abeja o Hymenoptera, ya que esta terapia

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induce la generacion de anticuerpos IgG/IgA a varios alergenos de veneno y puede asf conducir a proteccion completa. Los alergenos de abeja identificados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Alergenos de abeja identificados

Alergeno: Nombre comun Tamano (procesado) Peso SwissProt Referencia

Api m 1: Fosfolipasa A2 134 aa 15,2 kDa P00630 Kuchler et al. 1989

Api m 2: Hialuronidasa 349 aa 40,7 kDa Q08169 Gmachl y Kreil 1993

Api m 3: Fosfatasa acida nd 45 kDa - Barboni et al. 1987

Api m 4: Melitina 26 aa 2,8 kDa P01501 Vlasaket al. 1983

Api m 5: Alergeno C nd 105 kDa - Hoffman et al. 1977

Api m 6: - 71 aa 7,5 kDa P83563 Kettner et al. 2001

El polipeptido de la invencion tambien puede usarse para la preparacion de una composicion de diagnostico para diagnosticar o identificar sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera. As^ se proporciona un metodo de diagnostico de una alergia al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, que comprende las etapas de

a) poner en contacto un sujeto con un polipeptido de la invencion y

b) detectar una reaccion alergica, en el que detectar una reaccion alergica indica dicha alergia.

Pruebas in vivo para diagnosticar una alergia pueden ser facilmente adaptadas al polipeptido de la invencion. Normalmente, se inyecta una cantidad adecuada de alergeno por via subcutanea en la extremidad de un sujeto y, despues de una cierta cantidad de tiempo, se determina el grado de inflamacion localizada en comparacion con controles (prueba de puncion). Tales pruebas son muy conocidas en la tecnica (Hamilton RG, Diagnosis of hymenoptera venom sensitivity, Current Opinion in Allergy Clin Immunol 2(4) (2002) 347-351; Poulsen LK, In vivo and in vitro techniques to determine the biological activity of food allergens, J Chromat B 756 (2001) 41-55; Schmid- Grendelmeier P, Crameri R, Recombinant allergens for skin testing, Int Arch Allergy Immunol 125 (2001) 96-111; Williams LW, Bock SA, Skin testing and food challenges in allergy and immunology practice, Clin Rev Allergy Immunol 17(3) (1999) 323-38; Barbee RA, Lebowitz MD, Thompson HC, Burrows B, Immediate skin-test reactivity in a general population sample, Ann Intern Med 84(2) (1976) 129-33).

Una alergia al veneno de un insecto del orden Hymenoptera tambien puede diagnosticarse por un metodo in vitro que comprende las etapas de

a) poner en contacto in vitro una muestra de sangre de un sujeto con un polipeptido de la invencion y

b) detectar la union de anticuerpos IgE al polipeptido, en el que detectar la union de anticuerpos IgE al polipeptido indica dicha alergia.

La union de anticuerpos IgE al polipeptido puede, por ejemplo, detectarse en un ELISA o por un ensayo de liberacion in vitro empleando mastocitos raspados y midiendo la cantidad de mediador liberado, por ejemplo, histamina. Para determinar la union espedfica, los resultados se comparan con un control de especificidad, por ejemplo, con un anticuerpo no relacionado. Las pruebas de diagnostico pueden llevarse a cabo en paralelo para determinar los niveles de IgG espedfica (en particular IgG1 y/o IgG4) y/o IgA. Para esto, puede emplearse un ELISA con anticuerpos secundarios espedficos que reconocen los diferentes isotipos. La prueba en paralelo es particularmente util para seguir y evaluar una evolucion de la inmunoterapia espedfica.

Para los usos terapeuticos y de diagnostico y metodos, se prefiere emplear los polipeptidos de fusion de la invencion, protemas o polipeptidos no glucosilados que son capaces de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, y comprenden al menos 5, preferentemente al menos 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o mas aminoacidos de un polipeptido segun la invencion seleccionados del grupo que consiste en el aminoacido 26 a 99, 116 a 145, 153 a 158, 185 a 223, 232 a 276 o 362 a 373 del polipeptido mostrado en SEQ ID NO: 2. Alternativamente, los polipeptidos empleados son capaces de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, y comprenden al menos 5, preferentemente al menos 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o mas aminoacidos de un polipeptido mostrado en SEQ ID NO: 2, excepto los polipeptidos del grupo que consiste en los aminoacidos 1 a 34, 63 a 80, 100 a 115, 142 a 149, 168 a 176, 224-239 y 258 a 343 del polipeptido mostrado en SEQ ID NO: 2 o excepto los polipeptidos mostrados en la Fig. 5. Ademas, pueden usarse tales polipeptidos que consisten en los aminoacidos 1 a 25, 146 a 152, 159 a 164, 168 a 184, 224 a 231, y 277 a 361.

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As^ la invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica o de diagnostico que comprende el polipeptido de la invencion. Preferencialmente, la composicion comprende ademas un adyuvante y/o recurso adecuado. Opcionalmente, la composicion comprende ademas otros polipeptidos de veneno de abeja o Hymenoptera, tales como fosfolipasa A2, hialuronidasa, glucosidasa y/o melitina.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo de diagnostico de una alergia al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, que comprende las etapas de

a) realizar el metodo de produccion de un polipeptido codificado por el acido nucleico de la invencion, en el que la celula hospedadora que comprende el vector de expresion de la invencion se cultiva en condiciones apropiadas para la expresion de dicho polipeptido, y en el que dicho polipeptido se purifica,

b) poner en contacto el polipeptido obtenido por el metodo de etapa a) in vitro con una muestra de sangre,

c) y detectar la union de anticuerpos IgE al polipeptido, en el que detectar anticuerpos IgE que se unen al polipeptido indica dicha alergia.

Ademas, se proporciona un metodo de diagnostico de una alergia al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, que comprende las etapas de

b) poner en contacto un sujeto con el polipeptido obtenido por el metodo de etapa a) y detectar una reaccion alergica, y

c) detectar una reaccion alergica, que es indicativo de la alergia.

La invencion tambien proporciona un metodo de preparacion de una composicion para diagnosticar una alergia al veneno de un insecto del orden Hymenoptera que comprende la etapa de producir un polipeptido codificado por el acido nucleico de la invencion, en el que la celula hospedadora que comprende el vector de expresion de la invencion se cultiva en condiciones apropiadas para la expresion de dicho polipeptido y dicho polipeptido se purifica y puede usarse como tal para diagnostico. Opcionalmente, el polipeptido se formula ademas con estabilizadores, tales como una protema neutra (por ejemplo, BSA) o detergentes para dar dicha composicion.

En otra realizacion, la invencion ensena un metodo de preparacion de una composicion para tratar sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, que comprende la etapa de realizar el metodo de produccion de un polipeptido codificado por el acido nucleico de la invencion, en el que la celula hospedadora que comprende el vector de expresion de la invencion se cultiva en condiciones apropiadas para la expresion de dicho polipeptido y dicho polipeptido se purifica y puede usarse como tal para terapia. Opcionalmente, el polipeptido se formula ademas con excipiente apropiado y/o vehfculos con el fin de proporcionar dicha composicion. Correspondientemente, se desvela un metodo de tratamiento de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, que comprende las etapas de

a) realizar el metodo de produccion de un polipeptido codificado por el acido nucleico de la invencion, en el que la celula hospedadora que comprende el vector de expresion de la invencion se cultiva en condiciones apropiadas para la expresion de dicho polipeptido y dicho polipeptido se purifica, y

b) administrar el polipeptido obtenido por el metodo de etapa a) a un sujeto que tiene una alergia tal.

Asf, la presente invencion satisface por primera vez la necesidad de una fosfatasa acida de veneno de Hymenoptera recombinantemente producido o el ADNc que codifica este polipeptido, que puede usarse para aplicaciones de diagnostico y terapeuticas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Clonacion de ADNc

1.1 Aislamiento de ARN total

Se aislo ARN total del aguijon separado de una abeja melffera con saco de veneno unido y glandulas adicionales. El aislamiento de ARN total se realizo usando un kit segun el manual (peqGoldTriFast™, Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemania). El organo se peso y homogeneizo en una disolucion que contema isotiocianato de guanidinio y fenol. Se indujo la separacion de fases mediante la adicion de cloroformo. La fase acuosa se separo despues de centrifugacion, y el aRn contenido se precipito con alcohol isopropflico. Despues de lavar con etanol diluido, el ARN se disolvio en agua esteril sin RNasa y se uso directamente en experimentos de RT-PCR. Para preparar agua esteril sin RNasa, se trato agua adecuada para el cultivo de celulas con 0,1 % (v/v) de pirocarbonato de dietilo (DEPC)

durante la noche, y entonces se esterilizo en autoclave durante 20 minutos para destruir el DEPC, produciendo la hidrolisis de DEPC.

1.2 Sntesis de la primera cadena de ADNc

Se uso transcriptasa inversa para sintetizar ADNc de la primera cadena a partir del ARN aislado. Para esto, se 5 mezclaron 5 jl de ARN de abeja total con 2 jl (20 pmoles) de cebador de oligonucleotidos y 4 jl de DEPC-agua. Se uso un oligo-dT universal de 20 pares de bases de longitud con el fin de transcribir la porcion poli-adenilada de ARNm en la muestra de ARN total. La mezcla de reaccion se incubo a 70 °C durante 5 minutos para romper las estructuras secundarias. Despues de esto, la reaccion se enfrio sobre hielo. Posteriormente, se anadieron 1,5 jl de DEPC-agua, 4 jl de 5x tampon de reaccion, 2 jl de mezcla de dNTP (10 mM) y 0,5 jl de inhibidor de ribonucleasa 10 recombinante RNaseOut™ (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania). La mezcla de reaccion se incubo a 37 °C durante 5 minutos. Entonces se anadieron 1 jl (200 unidades) de transcriptasa inversa RevertAid™ M-MuLV (RT, Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemania) y la reaccion se incubo a 42 °C durante 60 minutos. Despues de esto, la reaccion se detuvo calentando a 70 °C durante 10 minutos y se enfrio sobre hielo.

1.3 RT-PCR

15 Se uso ADNc de la primera cadena de tejido de la glandula de veneno de abeja como molde para la amplificacion por PCR de secuencias de ADN de Api m3.

Se usaron fragmentos de peptido conocidos, bases de datos publicas y bioinformatica para disenar los cebadores espedficos para Api m3. Estos cebadores han sido disenados para permitir la subclonacion roma de extremos 5' para la expresion del extremo N nativa y subclonacion del sitio de restriccion Sac II dirigido al extremo 3'. Las 20 secuencias de nucleotidos de los oligonucleotidos son:

Api m3 for, 21mero, extremo romo (SEQ ID NO: 3):

5' -GAA CTT AAA CAA ATA AAT GTG

Api m3 back 32mero, sitio Sac II (SEQ ID NO: 4):

5' -AAC CGC GGT TAC TTA CTT ATT CTC AGT ACC CG.

25 La reaccion de PCR contuvo 41 jl de DEPC-agua, 5 jl de 10x tampon de PCR de Pfu completo, 1 jl de cebador directo de Api m3 (100 pmoles), 1 jl de cebador inverso de Api m3 (100 pmoles), 1 jl de mezcla de dNTP (10 mM), 0,5 jl de ADNc de tejido de glandula de veneno de abeja y 0,5 jl de ADN polimerasa Pfu recombinante (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemania), dando un volumen de reaccion total de 50 jl.

El programa de temperatura de PCR para la amplificacion fue:

Etapa 1:: 96 °C, 1 minuto

Etapa 2:: 95 °C, 30 segundos

Etapa 3:: cn cn o p 30 segundos

Etapa 4:: 72 °C, 2 minutos

30 Repetir las etapas 2-4 x 29 veces

Etapa 5: 72 °C, 10 minutos

Etapa 6: 4 °C, hasta el fin

Parte de la reaccion de PCR se realizo en un gel al 1 % de agarosa (peqGOLD universal agarose, Peqlab GmbH, Erlangen, Alemania) en 0,5x de tampon TAE y los productos de ADN amplificados se visualizaron con bromuro de etidio e iluminacion UV. Fue visible una banda al tamano esperado.

1.4 Subclonacion para secuenciacion

35 Se aislo ADN de la reaccion de PCR usando el kit de extraccion en gel QIAEX II (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). La subclonacion para la secuenciacion se hizo usando el kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) con el vector pCR®2.1-TOPO® segun el manual. Debido al uso de ADN polimerasa Pfu, se introdujo una etapa de reaccion de extension de TA inicial con ADN polimerasa AGS Gold Taq (AGS Hybaid, Heidelberg). El ADN unido se transformo en E. coli de la cepa TG1 por electroporacion (cubetas de 2 mm, EasyJect+, Hybaid, 40 Heidelberg, Alemania) y se selecciono en placas de ampicilina-agar.

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1.5 Secuenciacion

La reaccion de secuenciacion se hizo con el kit BigDye® Terminator Cycle Sequencing de ABI (Applied Biosystems Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemania) segun el manual. Se realizaron 25 ciclos con una etapa de desnaturalizacion de 30 segundos a 96 °C, etapa de hibridacion de 15 segundos a 50 °C y etapa de extension de 4 minutos a 57 °C. Los cebadores de secuenciacion fueron:

M13/Uni directo (SEQ ID NO: 5): 5' -GTA AAA CGA CGG CCA GTG CCA A

M13/Uni inverso (SEQ ID NO: 6): 5' -CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG A

La secuencia resultante se muestra en la Fig. 1.

Ejemplo 2: Construccion de vector de expresion

2.1 Modificacion del vector de expresion de insecto

Para la expresion de Api m 3 recombinante con posibilidades de plegamiento nativo y modificacion postraduccional, se eligio la expresion en celulas de insecto. Se modifico el vector de expresion pIB/V5-His. (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) para facilitar el aislamiento y la purificacion. Se anadio una secuencia senal de melitina para la secrecion de la protema recombinante y se optimizo la secuencia de Kozak para tasas de expresion mas altas en celulas de insecto. La secuencia senal de melitina se amplifico a partir de ARN de abeja total, sintetizado como se ha descrito anteriormente, usando los cebadores:

melt leader directo (SEQ ID NO: 7):

5' -GGA AAG CTT TCC GCC ATG GCG AAA TTC TTA GTC

melt leader inverso (SEQ ID NO: 8):

5' -CGG GAT CCC GCA TAG ATG TAA GAA ATG.

Estan subrayados los sitios de restriccion Hind III y, respectivamente, BamH I, en el cebador correspondiente. La secuencia que contiene 10x marca de histidina y sitio de escision de factor Xa ha sido clonada entre el sitio BamH I y EcoR V del vector parental. Como primer molde, se uso un vector que contema marca con los siguientes cebadores:

10xHis directo (SEQ ID NO: 9):

5' -CTG AAT AGC GCC GGA TCC GAC CAT

10xHis inverso (SEQ ID NO: 10):

5' -CCC TCT AGA CTC GAG CCA ATG ATG

Estan subrayadas las bases para la introduccion del sitio de restriccion BamH I. Se uso el fragmento resultante como segundo molde y se modifico adicionalmente para contener un sitio EcoR V en el extremo 3' por uso de cebadores de solapamiento y extension por PCR de la secuencia (corte y empalme-solapamiento-extension, SOE). El cebador de extension usado fue:

SOE Xa (SEQ ID NO: 11):

5'-GGG ATA TCC CTT CCC TCG ATC CCT CTA GAC TC

Esta subrayado el sitio de restriccion EcoR V recientemente introducido para la clonacion y generacion de la construccion de vector de expresion. Para todas las etapas de PCR se uso ADN polimerasa Pfu (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemania) con condiciones de reaccion normales. La temperatura de hibridacion fue 55 °C para la amplificacion 10x fragmento de histidina y 45 °C para la reaccion de SOE.

2.2 Re-PCR y subclonacion

Despues de la secuenciacion de clones de ADNc subclonados seleccionados, se uso el clon para la amplificacion secundaria con ADN polimerasa Pfu. El producto de PCR se subclono en el vector de expresion digerido con EcoR V / Sac II despues de la digestion con restriccion con Sac II.

2.3 Modificacion del vector de expresion bacteriano

Se uso el vector de expresion de mairnfero verificado pIB/Mel opt-H10 como molde para la construccion de la insercion para la subclonacion en el vector de expresion procariota pET26(+) (Novagen). El programa de PCR se hizo segun el gradiente de temperatura dado en 1.3. Se uso Pfu polimerasa con los cebadores:

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Api 3 directo pro-his (SEQ ID NO: 12) AGAATTTCATATGAAATTCTTAGTCAACG

Api 3 inverso pro (SEQ ID NO: 13) AAGAGCTCTTACTTACTTATTCTCAG

Se digirio el amplicon con Sac I y Nde I. Se aislo el fragmento parcialmente digerido del tamano correcto y se unio al vector previamente digerido.

Ejemplo 3: Expresion de protema recombinante

3.1 Transfeccion

Se usaron celulas de insecto HighFive (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) como hospedadores para la expresion recombinante de Api m 3. Se purifico ADN de cultivos bacterianos usando E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit II (Peqlab GmbH, Erlangen, Alemania) segun el manual. Para la transfeccion de ADN purificado en celulas se uso el reactivo Cellfectin® (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) segun el manual.

3.2 Transformacion

Los vectores han sido transformados en celula procariota por electroporacion. Las celulas han sido preparadas mediante procedimientos convencionales. Se hizo electroporacion con un instrumento EasyJecT+ (EquiBio, Maidstone, RU) con parametros estandar segun el manual del fabricante.

3.3 Aislamiento de protena recombinante

La protema se purifico segun procedimientos convencionales.

En resumen, se rompieron celulas por sonicacion. Se sedimentaron membranas celulares, etc., por ultracentrifugacion. Se precipito protema, que incluye fosfatasa acida, por sulfato de amonio a una concentracion de 45 %. Entonces se purifico la protema marcada con His del extracto por cromatograffa de afinidad por Ni2+ siguiendo las recomendaciones del fabricante (por ejemplo, His Trap™ HP Kit, Amersham Biosciences). La purificacion se controlo por SDS-PAGE.

3.4 Prueba de la actividad de fosfatasa acida.

Se confirmo la actividad enzimatica de la enzima segun el metodo descrito en Ref. 19.

Leyendas de las figuras

La Fig. 1 muestra la secuencia de nucleotidos del ADNc aislado para Api m 3 en formato de FASTA (SEQ ID NO: 1).

La Fig. 2 muestra el patron de enzima de restriccion predicho de ADNc aislado para Api m 3.

La Fig. 3 muestra la secuencia de aminoacidos traducida predicha del ADNc aislado para Api m 3 (SEQ ID NO: 2). Los peptidos subrayados pueden alinearse con los fragmentos publicados previos. Veanse las Figuras 5 y 6.

La Fig. 4A muestra un mapa de vector de un vector de expresion de celula de insecto preferido, pIB/Mel opt- H10 api m 3. El vector se modifico para incluir una marca 10x histidina de extremo N, escindible con proteasa de factor Xa, ademas de la secuencia senal de melitina de abeja para la expresion secretada. El gen de interes se clono entre el sitio EcoR V y Sac II. El gen comprende un codon de terminacion en el extremo 3'. La protema expresada debe secretarse y tendra una marca 10x histidina escindible por factor Xa en el extremo N.

La Fig. 4B muestra la optimizacion de la secuencia de Kozak para la expresion de celulas de insecto. La primera secuencia a) se cambio a b) para ser segun la secuencia inicial de traduccion preferida (G/A)NNATGG anadiendo una alanina a la secuencia del extremo N.

La Fig. 4C muestra un mapa de vector de un vector de expresion bacteriano preferido, pET26(+) api 3 pro. El vector se modifico para contener el gen de interes entre el sitio Sac I y Nde I. Se tomo la secuencia de protemas del vector de expresion de mairnfero verificado pIB/Mel opt-H10 api m 3.

La Fig. 5A muestra la informacion de secuencia de posibles fragmentos de peptido de fosfatasa acida publicamente conocidos antes de la presente invencion. Los fragmentos de peptido se enumeran con el fin de alineamiento con fosfatasa de prostata humana y de rata como se publico en Ref. 20. El orden de alineamiento de los fragmentos con respecto a la secuencia derivada se da en la segunda columna. Posiciones de segmentos de peptidos alineados pueden ser todas de la Fig. 3 y Fig. 5B, ademas de la Fig. 6. Segmentos de secuencia marcados en la tercera columna muestran aminoacidos presentes en la secuencia de Api m 3. La cuarta columna muestra la longitud de los fragmentos de peptido publicados.

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La Fig. 5B muestra el alineamiento de peptidos corregido originalmente postulado por Hoffmann et al. (Ref. 20) para Api m 3.

La Fig. 6 muestra un alineamiento esquematico de peptidos postulado por Hoffman et al. (Ref. 20) (A), en comparacion con el orden corregido despues de la clonacion y secuenciacion del gen de Api m 3 (B). Es obvio que el alineamiento se diferencia del alineamiento publicado con fosfatasa de prostata humana y de rata (Ref. 20). Los fragmentos de peptido publicados pueden no alinearse para corresponderse con la secuencia como cabna esperar. En primer lugar, el orden de las posiciones de alineamiento es diferente de la publicacion. En segundo lugar, algunos fragmentos, como los fragmentos 1 y 7, se alinean parcialmente en diferentes sitios en la secuencia y, por tanto, no son peptidos continuos derivados de una secuencia de ADNc. Ademas, algunas secuencias de fragmentos publicadas, como el fragmento 5, no pueden alinearse en absoluto. El esquema tambien muestra el peptido conductor y no es exacto con respecto al numero de aminoacidos.

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> PLS-Design GmbH

<120> Clonacion de alergeno de abeja melffera

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5

10

gaacttaaac aaataaatgt gatattccgg cacggcgata ggatacccga tgagaaaaac 60 gaaatgtatc cgaaagatcc ttatttgtat tatgattttt atccactgga gcgtggcgaa 120 ttgactaact caggtaaaat gcgagaatat caattggggc aattcttgag agagagatat lao ggtgactttt tgggagacat ttacacggaa gaatccgtct cggctctcag ctcgttctac 240 gataggacga aaatgtctct gcaactcgta ctcgcggcgc tctatccgcc aaataaattg 300 caacaatgga acgaagatct gaactggcaa ccgatcgcca cgaaatattt gcgccgctac 360 gaggacaata tctttttgcc agaagattgt ttgttattta ccatcgaact tgatagagta 420 ttggaatcac cgcgtggaaa gtatgaattc tcgaaatatg acaaattgaa gaaaaaattg 480 gaagaatgga ccggaaaaaa tatcactacg ccatgggatt attattacat atatcataca 540 ctggtggctg aacaatcgta cggtcttact ctgccatcut ggacaaataa tatattcccg 600 agaggagaat tgttcgatgc gacggtattt acgtacaaca taaccaattc gactcctttg 660 ttgaaaaaac tttatggagg tccgcttctt cgaatattca ccaagcatat gttagacgtg 720 gtatcgggta cgcaaaagaa aaagcgaaag atatacttgt tcagtggaca tgaaagtaat 780 atcgcctctg tgttgcacgc tcttcaactt tattatcctc acgttcctga atattccagt 840 tctattataa tggagcttca caatatcgaa ggcactcact acgtaaagat cgtttactac 900 ttgggtatcc cgtctgaagc gagagaactt caattacccg gctgcgaggt actttgccct 960 ttgtacaaat atttacaatt gatagagaac gtgataccat cgaacgaaga gttgatctgc 1020 gataaaagat tcgtcgacga atcggcaaac aatttgtcga tcgaagaatt agatttcgtg 1080 aaattgaacc taataaggat agcgggtact gagaataagt aa 1122

<210>2 <211> 373 <212> PRT <213> Apis mellifera

<400>2

Glu 1: Leu Lys Gin He 5 Asn Val lie

Asp: Glu Lys Asn 20 Glu Met Tyr Pro

Phe: Tyr Pro 35 Leu Glu Arg Gly Glu 40

Glu: Tyr 50 Gin Leu Gly Gin Phe 55 Leu

Gly 65: Asp lie Tyr Thr Glu 70 Glu Ser

Asp: Arg Thr Lys Met 85 Ser Leu Gin

Pro: Asn Lys Leu 100 Gin Gin Trp Asn

Ala: Thr Lys 115 Tyr Leu Arg Arg Tyr 120

Asp: Cys Leu Leu Phe Thr lie Glu

Phe: Arg 10 His Gly Asp Arg lie 15 Pro

Lys 25: Asp Pro Tyr Leu Tyr 30 Tyr Asp

Leu: Thr Asn Ser Gly Lys 45 Met Arg

Arg: Glu Arg Tyr 60 Gly Asp Phe Leu

Val: Ser Ala 75 Leu Ser Ser Phe Tyr 80

Leu: Val 90 Leu Ala Ala Leu Tyr 95 Pro

Glu Asp 105: Leu Asn Trp Gin 110 Pro lie

Glu Asp: Asn lie Phe 125 Leu Pro Glu

Leu Asp: Arg Val Leu Glu Ser Pro

130 135 140

Arg Gly Lys Tyr Glu Phe Ser Lya Tyr Aap Lys Leu Lys Lys Lys Leu

145 150 15S 160

Glu Glu Trp Thr Gly Lys Asn lie Thr Thr Pro Trp Asp Tyr Tyr Tyr

165 170 175

lie Tyr His Thr Leu Val Ala Glu Gin Ser Tyr Gly Leu Thr Leu Pro 180 185 190

Ser Trp Thr Asn Asn He Phe Pro Arg Gly Glu Leu Phe Asp Ala Thr 195 200 205

Val Phe Thr Tyr Asn lie Thr Asn Ser Thr Pro Leu Leu Lys Lys Leu 210 215 220

Tyr Gly Gly Pro Leu Leu Arg lie Phe Thr Lys His Met Leu Asp Val

225 230 235 240

Val Ser Gly Thr Gin Lys Lys Lys Arg Lys lie Tyr Leu Phe Ser Gly

245 250 255

His Glu Ser Asn lie Ala Ser Val Leu His Ala Leu Gin Leu Tyr Tyr 260 265 270

Pro His Val Pro Glu Tyr Ser Ser Ser lie lie Met Glu Leu His Asn 275 280 285

lie Glu Gly Thr His Tyr Val Lys lie Val Tyr Tyr Leu Gly lie Pro 290 295 300

Ser Glu Ala Arg Glu Leu Gin Leu Pro Gly Cys Glu Val Leu Cys Pro

305 310 315 320

Leu Tyr Lys Tyr Leu Gin Leu lie Glu Asn Val lie Pro Ser Asn Glu

325 330 335

Glu Leu lie Cys Asp Lys Arg Phe Val Asp Glu Ser Ala Asn Asn Leu 340 345 350

Ser lie Glu Glu Leu Asp Phe Val Lys Leu Asn Leu lie Arg lie Ala 355 360 365

Gly Thr Glu Asn Ly3 370

<210>3 <211> 21

5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleotidos

10

<400>3

gaacttaaacaaataaatgt g 21

<210> 4

15 <211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

20 <223> cebador de oligonucleotidos

5

10

15

20

25

30

35

<400>4

aaccgcggttacttacttattctcagtacceg 32

<210>5 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de oligonucleotidos <400> 5

gtaaaacgacggccagtgccaa 22

<210>6 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de oligonucleotidos <400> 6

caggaaacagctatgaccatga 22

<210>7 <211> 33 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de oligonucleotidos <400> 7

ggaaagctttccgccatggcgaaattcttagtc 33 <210>8 <211> 27

5

10

15

20

25

30

35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de oligonucleotidos <400>8

cgggatcccgcatagatgtaagaaatg 27

<210>9 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de oligonucleotidos <400> 9

ctgaatagcgccggatccgaccat 24

<210> 10 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de oligonucleotidos

<400> 10

ccctctagactcgagccaatgatg 24

<210> 11 <211> 32 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de oligonucleotidos

<400> 11

gggatatcccttccctcgatccctctagactc

5

<210> 12 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial

10

<400> 12

agaatttcatatgaaattcttagtcaacg 29

<210> 13 15 <211> 26

<212> ADN <213> Artificial

<400> 13

20 aagagctcttacttacttatteteag 26

32

Claims

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10

15

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REIVINDICACIONES

1. Acido nucleico que codifica un polipeptido capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, en el que el polipeptido tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2.
2. Acido nucleico de la reivindicacion 1 que tiene la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 1.
3. Acido nucleico que codifica un polipeptido capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, en el que el polipeptido codificado tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 en la que los sitios de glucosilacion estan mutados.
4. Acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el insecto es una abeja del genero Apis.
5. Acido nucleico de la reivindicacion 4, en el que la abeja es Apis mellifera.
6. Polipeptido que comprende el polipeptido codificado por un acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3 unido a un polipeptido adicional como una protema de fusion.
7. Polipeptido de la reivindicacion 6, en el que la protema esta no glucosilada.
8. Polipeptido codificado por un acido nucleico de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la protema se expresa en celulas de insecto.
9. Polipeptido de las reivindicaciones 6 a 8 que tiene actividad de fosfatasa acida.
10. Polipeptido de SEQ ID NO: 2, que comprende sitios de glucosilacion mutados en lugar de sitios de glucosilacion.
11. Polipeptido de la reivindicacion 6, en el que el polipeptido adicional esta seleccionado del grupo que comprende una marca de poli-histidina, glutation-S-transferasa, p-galactosidasa, una citocina, una IgG-Fc u otra protema de veneno de Hymenoptera o fragmento antigenico de las mismas.
12. Vector de expresion que comprende un acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3 operativamente unido a una secuencia de control de la expresion.
13. Vector de expresion de la reivindicacion 12, en el que el acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3 esta unido en marco a un acido nucleico que codifica un polipeptido adicional.
14. Vector de expresion de la reivindicacion 12, en el que el polipeptido adicional esta seleccionado del grupo que comprende una marca de poli-histidina, glutation-S-transferasa, p-galactosidasa, una citocina, una IgG-Fc u otra protema de veneno de Hymenoptera o fragmento antigenico de las mismas.
15. Vector de expresion de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el vector es adecuado para la expresion en celulas bacterianas o de insecto.
16. Celula hospedadora que comprende el vector de expresion de las reivindicaciones 12 a 15.
17. Celula hospedadora de la reivindicacion 16, en la que la celula es una celula de insecto o una celula bacteriana.
18. Metodo de produccion de un polipeptido codificado por el acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la celula hospedadora de las reivindicaciones 16 o 17 se cultiva en condiciones apropiadas para la expresion de dicho polipeptido y dicho polipeptido se purifica.
19. Vector de expresion de las reivindicaciones 11 a 15 para su uso en el tratamiento de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera.
20. Composicion farmaceutica que comprende un vector de expresion de las reivindicaciones 11 a 15.
21. Polipeptido de las reivindicaciones 6 a 11 o

polipeptido codificado por un acido nucleico, que es un fragmento que tiene una longitud superior a 255 nucleotidos del acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 5, y que codifica un polipeptido capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera,

o

polipeptido codificado por un acido nucleico que comprende al menos 15 nucleotidos contiguos de los nucleotidos 78 a 299, 348 a 437, 459 a 476, 555 a 671, 696 a 830 o 1086 a 1121 del acido nucleico de las reivindicaciones 1 o 2, en

5

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40

45

el que el polipeptido codificado por el acido nucleico es capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera,

o

polipeptido codificado por un acido nucleico que comprende al menos 15 nucleotidos contiguos del acido nucleico de las reivindicaciones 1 o 2, excepto los nucleotidos que codifican polipeptidos del grupo que consiste en los aminoacidos 1 a 34, 63 a 80, 100 a 115, 142 a 149, 168 a 176, 224-239 y 258 a 343 del polipeptido mostrado en SEQ ID NO: 2, en el que el polipeptido codificado por el acido nucleico es capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera,

para su uso en el tratamiento de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera.
22. Polipeptido de las reivindicaciones 6 a 11 o

polipeptido codificado por un acido nucleico, que es un fragmento que tiene una longitud superior a 255 nucleotidos del acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 5, y que codifica un polipeptido capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera,

o

polipeptido codificado por un acido nucleico que comprende al menos 15 nucleotidos contiguos de los nucleotidos 78 a 299, 348 a 437, 459 a 476, 555 a 671, 696 a 830 o 1086 a 1121 del acido nucleico de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el polipeptido codificado por el acido nucleico es capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera,

o

polipeptido codificado por un acido nucleico que comprende al menos 15 nucleotidos contiguos del acido nucleico de las reivindicaciones 1 o 2, excepto los nucleotidos que codifican polipeptidos del grupo que consiste en los aminoacidos 1 a 34, 63 a 80, 100 a 115, 142 a 149, 168 a 176, 224-239 y 258 a 343 del polipeptido mostrado en SEQ ID NO: 2, en el que el polipeptido codificado por el acido nucleico es capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera,

para su uso en diagnostico in vivo de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera.
23. Uso de un polipeptido de las reivindicaciones 6 a 11 o

de un polipeptido codificado por un acido nucleico, que es un fragmento que tiene una longitud superior a 255 nucleotidos del acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 5, y que codifica un polipeptido capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera,

o

de un polipeptido codificado por un acido nucleico que comprende al menos 15 nucleotidos contiguos de nucleotidos 78 a 299, 348 a 437, 459 a 476, 555 a 671, 696 a 830 o 1086 a 1121 del acido nucleico de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el polipeptido codificado por el acido nucleico es capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera,

o

of un polipeptido codificado por un acido nucleico que comprende al menos 15 nucleotidos contiguos del acido nucleico de las reivindicaciones 1 o 2, excepto los nucleotidos que codifican polipeptidos del grupo que consiste en los aminoacidos 1 a 34, 63 a 80, 100 a 115, 142 a 149, 168 a 176, 224-239 y 258 a 343 del polipeptido mostrado en SEQ ID NO: 2, en el que el polipeptido codificado por el acido nucleico es capaz de unirse a IgE de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera,

para el diagnostico ex vivo de sujetos alergicos al veneno de un insecto del orden Hymenoptera.
24. Metodo de diagnostico de una alergia al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, que comprende las etapas de

a) poner en contacto in vitro una muestra de sangre de un sujeto con un polipeptido de las reivindicaciones 6 a 11, y

10

15

b) detectar la union de anticuerpos IgE al polipeptido, en el que detectar anticuerpos IgE que se unen al polipeptido indica dicha alergia.
25. Composicion farmaceutica o de diagnostico que comprende un polipeptido de las reivindicaciones 6 a 11.
26. Composicion de las reivindicaciones 20 o 25, que comprende ademas un adyuvante y/o recurso adecuado y/o ademas polipeptidos del veneno de un insecto del orden Hymenoptera.
27. Metodo de diagnostico de una alergia al veneno de un insecto del orden Hymenoptera, que comprende las etapas de

a) poner en contacto un polipeptido de las reivindicaciones 6 a 11 in vitro con una muestra de sangre de un sujeto, y

c) detectar la union de anticuerpos IgE al polipeptido, en el que detectar anticuerpos IgE que se unen al polipeptido indica dicha alergia.
28. Metodo de preparacion de la composicion de la reivindicacion 25 que comprende la etapa de producir un polipeptido codificado por los acidos nucleicos de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la celula hospedadora de las reivindicaciones 16 o 17 se cultiva en condiciones apropiadas para la expresion de dicho polipeptido y dicho polipeptido se purifica.