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ES2671002T3 - Uso de péptidos inhibidores para el tratamiento de enfermedades inflamatorias - Google Patents

Uso de péptidos inhibidores para el tratamiento de enfermedades inflamatorias Download PDF

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ES2671002T3
ES2671002T3 ES14788545.3T ES14788545T ES2671002T3 ES 2671002 T3 ES2671002 T3 ES 2671002T3 ES 14788545 T ES14788545 T ES 14788545T ES 2671002 T3 ES2671002 T3 ES 2671002T3
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autoimmune
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Rony Seger
Eldar ZEHORAI
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Yeda Research and Development Co Ltd
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Abstract

Un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos 80% a la secuencia que se expone en SEQ ID NO: 1 (PERYQNLSPV), comprendiendo el péptido una actividad de direccionamiento nuclear, no teniendo el péptido más de 20 aminoácidos de longitud, siendo el péptido ser capaz de evitar la translocación nuclear de P38α.

Description

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Preferiblemente, el péptido aislado está miristoilado.
Preferiblemente, el péptido aislado es para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio o un trastorno inmunitario.
Preferiblemente, dicho trastorno inmunitario es un trastorno autoinmunitario.
Preferiblemente, dicho trastorno inflamatorio es colitis.
Preferiblemente, dicho trastorno inflamatorio es cáncer.
La presente invención se refiere también a una composición de materia que comprende el péptido aislado y una sustancia heteróloga unida a dicha secuencia de aminoácidos a través de un conector.
La presente invención se refiere también a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido.
La presente invención se refiere también a una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido aislado.
La presente invención se refiere también a un método ex vivo de direccionamiento de una sustancia a un núcleo de una célula anfitriona, comprendiendo el método la introducción de la sustancia en la célula anfitriona, estando la sustancia unida al péptido.
La presente invención se refiere también a un método ex vivo de direccionamiento de una sustancia a un núcleo de una célula anfitriona, comprendiendo el método la introducción del péptido en la célula anfitriona, estando dicho péptido unido a un radical de afinidad capaz de unirse a la sustancia.
La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende como agente activo el péptido y un portador farmacéuticamente aceptable.
Breve descripción de los dibujos
Algunos aspectos de la descripción se describen en la presente memoria, a título de ejemplo solamente, con referencia a las imágenes adjuntas. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a título de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de los aspectos de la descripción. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente para los expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica los aspectos de la descripción.
En los dibujos:
Las FIG. 1A-B ilustran que JNK1/2 y p38α/β interactúan con Imp3, 7 y 9 en células HeLa. (A) Estudios de Co-IP. Las células HeLa se cultivaron hasta una confluencia de 70%, se privaron de suero (FBS al 0,1%, 16 horas) y a continuación se estimularon con Anisomicina (Anis; 0,5 μg/ml, 15 min) y TPA (250 nM, 15 min) o se dejaron sin tratar (NT). Los extractos celulares se sometieron después a Co-IP con Ab anti JNK1, JNK2, p38α, p38β o IgG de conejo como control negativo (Control). Las Imp que interaccionaban se detectaron mediante transferencia Western con los Ab anti-Imp indicados. La cantidad de MAPK InmunoPrecipitadas se detectó mediante los Ab anti-JNK1, JNK2, p38α y p38β o IgG de control según se indique (paneles inferiores). Las transferencias se desarrollaron con NBT/BCIP o ECL. Las flechas indican las Imp que interactúan. (B) Estudios utilizando PLA. Las células HeLa se cultivaron en portaobjetos hasta una confluencia de 70%, se privaron de suero, y a continuación se estimularon con Anisomicina (Anis) o se dejaron sin tratar (NT). Las células se fijaron, y se sometieron a un ensayo PLA de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando los Ab anti-Imp junto con anti-JNK (panel superior) o anti-p38 (panel inferior) según se indique. Los núcleos se detectaron utilizando DAPI, y los portaobjetos se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia. La cuantificación de la intensidad de la señal se realizó utilizando la herramienta de análisis ImageJ (los datos mostrados representan la media ± E.T. p <0,0001 (tratado frente a control)).
Las FIG. 2A-C ilustran que Imp3, 7 y 9 son necesarias para la translocación de JNK y p38 y la transcripción inducida.
(A) Los ARNip de Imp3, 7, 9, pero no de Imp5, inhiben la translocación nuclear de JNK y p38 estimulada. Las células HeLa se cultivaron sobre cubreobjetos hasta una confluencia del 30%. Los ARNip de las Imp indicadas y el ip de Control suministrados por la empresa (Scr ip, control negativo) se transfectaron a las células utilizando Dharmafect de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se privaron de suero, a continuación se estimularon con anisomicina (0,5 μg/ml, 15 minutos) o se dejaron sin tratar (NT) según se indique. Las células se fijaron a continuación, se tiñeron utilizando los Ab anti -MAPK indicados (izquierda) y se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia. (B) Cuantificación de la localización nuclear de JNK/p38 antes y después de la estimulación. Los datos mostrados representan la media ± E.T. La significacion de Imp3 frente a Imp7/Imp9 (*) fue p <0,0003. La significación de Imp3/7/9 estimuladas vs Scr fue p <0,00001 (C) El ARNip de Imp3, 7, 9 inhibe la activación de las dianas del factor de transcripción aguas abajo de JNKs/p38s. Las células HeLa se transfectaron con ARNip de las Imp indicadas e ip de control suministrado por el fabricante (Scr ip, control negativo) utilizando Dharmafect de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de
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Un porcentaje de homología o identidad de un polipéptido de muestra con un polipéptido de referencia, tal como el del péptido de direccionamiento nuclear de la presente descripción con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1, 2 3, 4, 5, 6, 7 u 8 se puede determinar de varias maneras. Preferiblemente, el porcentaje de homología o identidad entre polipéptidos se determina utilizando el soporte lógico de proteína-proteína convencional BLAST [blastp] del NCBI.
Los autores de la presente invención contemplan que la secuencia de aminoácidos de los péptidos descritos en la presente memoria pueda ser sustituida de forma conservativa o no conservativa.
El término "sustitución conservativa" según se utiliza en la presente memoria, se refiere al reemplazo de un aminoácido presente en la secuencia nativa en el péptido por un aminoácido natural o no natural o un peptidomimético que tiene propiedades estéricas similares. Cuando la cadena lateral del aminoácido nativo que se vaya a reemplazar sea polar o hidrófoba, la sustitución conservativa debería ser con un aminoácido natural, un aminoácido no natural o con un radical peptidomimético que también sea polar o hidrófobo (además de tener las mismas propiedades estéricas que la cadena lateral del aminoácido reemplazado).
Dado que los aminoácidos naturales se agrupan típicamente de acuerdo con sus propiedades, las sustituciones conservativas por aminoácidos naturales pueden determinarse fácilmente teniendo en cuenta el hecho de que, de acuerdo con la descripción, se considera el reemplazo de aminoácidos cargados por aminoácidos no cargados estéricamente similares como sustituciones conservativas.
Para producir sustituciones conservativas por aminoácidos no naturales, también es posible utilizar análogos de aminoácidos (aminoácidos sintéticos) bien conocidos en la técnica. Un peptidomimético del aminoácido de origen natural está bien documentado en la bibliografía conocida por el experto en la técnica.
Al afectar a las sustituciones conservativas, el aminoácido sustituyente debería tener el mismo grupo funcional o uno similar en la cadena lateral que el aminoácido original.
La expresión "sustituciones no conservativas" según se utiliza en la presente memoria se refiere al remplazo del aminoácido presente en la secuencia parental por otro aminoácido natural o no natural que tiene diferentes propiedades electroquímicas y/o estéricas. Por lo tanto, la cadena lateral del aminoácido sustituyente puede ser significativamente más grande (o más pequeña) que la cadena lateral del aminoácido nativo que está siendo sustituido y/o puede tener grupos funcionales con propiedades electrónicas significativamente diferentes que las del aminoácido que se sustituye. Los ejemplos de sustituciones no conservativas de este tipo incluyen la sustitución de fenilalanina o cicohexilmetilglicina por alanina, isoleucina por glicina o -NH-CH[(-CH2)5-COOH]-CO-por ácido aspártico. Esas sustituciones no conservativas que caen dentro del alcance de la presente descripción son las que todavía constituyen un péptido que tiene propiedades antibacterianas.
Según se utiliza en la presente memoria, la expresión "actividad de direccionamiento nuclear" se refiere a la capacidad del péptido para aumentar su razón de localización nuclear:citoplasmática, o un agente unido a éste, en al menos 10%, más preferiblemente en al menos 20% e incluso más preferiblemente por al menos 30%, 50%, 80% o más.
La actividad de direccionamiento nuclear puede detectarse por medios directos o indirectos: la observación directa mediante fluorescencia o microscopía de barrido con láser confocal es posible cuando el péptido de direccionamiento nuclear está marcado con un colorante fluorescente (los kits de marcaje están disponibles comercialmente, p.ej., de Pierce o Molecular Probes). La actividad de direccionamiento nuclear también puede evaluarse mediante microscopía electrónica si el péptido de direccionamiento nuclear está marcado con un material denso a los electrones, tal como el oro coloidal (Oliver, Methods Mol. Biol. 115 (1999), 341-345).
Se apreciará que si el péptido de direccionamiento nuclear está unido a un agente heterólogo (p.ej., un polinucleótido), en ese caso la actividad puede detectarse observando la ubicación del agente heterólogo.
La actividad de direccionamiento nuclear puede evaluarse de maneras indirectas si la molécula unida (p.ej., ácido nucleico) ejerce una función en el núcleo. Esta función puede ser, por ejemplo, la expresión de un gen codificado por el ácido nucleico unido incluyendo las consecuencias de tal expresión génica que pueden ejercerse sobre otras moléculas o procesos celulares.
El término "péptido" o "polipéptido" según se utiliza en la presente memoria se refiere a un polímero de aminoácidos naturales o sintéticos, que abarca péptidos nativos (productos de degradación, polipéptidos sintetizados sintéticamente o polipéptidos recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, péptidos sintetizados sintéticamente), así como peptoides y semipeptoides que son análogos polipeptídicos, que pueden tener, por ejemplo, modificaciones que hacen que los péptidos sean incluso más estables en un cuerpo o más capaces de penetrar en las células. Por lo tanto, por ejemplo, la presente descripción contempla la miristoilación del péptido. Preferiblemente, la miristoilación ocurre en el residuo N-terminal. La miristoilación es una modificación irreversible de la lipidación de proteínas en la que un grupo miristoilo, derivado del ácido mirístico, se une covalentemente mediante un enlace amida al grupo alfa-amino de un residuo N-terminal. Los ejemplos de péptidos miristoilados contemplados por la presente descripción incluyen SEQ ID NO: 9-16.
Tales modificaciones incluyen, pero no están limitadas a la modificación del extremo N, la modificación del extremo C, la modificación del enlace polipeptídico, incluyen, sin limitarse a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH o CF=CH, modificaciones de la cadena principal y modificación de residuos. Los métodos para preparar compuestos peptidomiméticos son bien conocidos en la técnica y se especifican, por
5 ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)). A continuación se proporcionan más detalles a este respecto.
Los enlaces polipeptídicos (-CO-NH-) dentro del polipéptido pueden estar sustituidos, por ejemplo, por enlaces Nmetilados (-N(CH3)-CO-), enlaces éster (-C(R)HCOOC(R)-N-), enlaces cetometileno (-CO-CH2-), enlaces α-aza (-NH-N(R)-CO-), en donde R es cualquier alquilo, p.ej., metilo, enlaces carba (-CH2-NH-), enlaces hidroxietileno (
10 CH(OH)-CH2-), enlaces de tioamida (-CS-NH-), dobles enlaces olefínicos (-CH=CH-), enlaces retroamida (-NH-CO-), derivados polipeptídicos (-N(R)-CH2-CO-), en donde R es la cadena lateral "normal", naturalmente presente en el átomo de carbono.
Estas modificaciones pueden aparecer en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena polipeptídica e incluso en varios (2-3) al mismo tiempo.
15 Los aminoácidos aromáticos naturales, Trp, Tyr y Phe, pueden sustituirse por ácido sintético no natural tal como fenilglicina, TIC, naftilenina (Nol), derivados metilados en el anillo de Phe, derivados halogenados de Phe u o-metil-Tyr.
Además de lo anterior, los polipéptidos de la presente descripción también pueden incluir uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros no aminoacídicos (p.ej., ácidos grasos, carbohidratos complejos, etc.).
20 Según se utiliza en la presente memoria en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones a continuación, se entiende que el término "aminoácido" o "aminoácidos" incluye los 20 aminoácidos naturales; aquellos aminoácidos a menudo modificados postraduccionalmente in vivo, incluyendo, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales que incluyen, pero no se limitan a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina y ornitina. Además, el término "aminoácido" incluye aminoácidos
25 tanto D-como L-(estereoisómeros).
Las Tablas 1 y 2 a continuación enumeran los aminoácidos naturales (Tabla 1) y los aminoácidos no convencionales
o modificados (Tabla 2) que se pueden utilizar con la presente descripción.
Tabla 1
Símbolo de una letra
Abreviatura de tres letras Aminoácido
A
Ala Alanina
R
Arg Arginina
N
Asn Asparragina
D
Asp Ácido aspártico
C
Cys Cisteína
Q
Gln Glutamina
E
Glu Ácido glutámico
G
Gly Glicina
H
His Histidina
I
Ile Isoleucina
L
Leu Leucina
K
Lys Lisina
Símbolo de una letra
Abreviatura de tres letras Aminoácido
M
Met Metionina
F
Phe Fenilalanina
P
Pro Prolina
S
Ser Serina
T
Thr Treonina
W
Trp Triptófano
Y
Tyr Tirosina
V
Val Valina
X
Xaa Cualquier aminoácido anterior
Tabla 2
Código
Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional
Hyp
Hidroxiprolina Orn ornitina
Norb
aminonorbonil-carboxilato Abu ácido α-aminobutírico
Cpro
aminociclopropano-carboxilato Dala D-alanina
Narg
N-(3-guanidinopropil)glicina Darg D-arginina
Nasn
N-(carbamilmetil)glicina Dasn D-asparragina
Nasp
N-(carboximetil)glicina Dasp Ácido D-aspártico
Ncys
N-(tiometil)glicina Dcys D-cisteína
Ngln
N-(2-carbamiletil)glicina Dgln D-glutamina
Nglu
N-(2-carboxietil)glicina Dglu Ácido D-glutámico
Nhis
N-(imidazoliletil)glicina Dhis D-histidina
Nile
N-(1-metilpropil)glicina Dile D-isoleucina
Nleu
N-(2-metilpropil)glicina Dleu D-leucina
Nlys
N-(4-aminobutil)glicina Dlys D-lisina
Nmet
N-(2-metiltioetil)glicina Dmet D-metionina
Norn
N-(3-aminopropil)glicina Dorn D-ornitina
Código
Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional
Nphe
N-bencilglicina Dphe D-fenilalanina
Nser
N-(hidroximetil)glicina Dpro D-prolina
Nthr
N-(1-hidroxietil)glicina Dser D-serina
Nhtrp
N-(3-indoliletil)glicina Dthr D-treonina
Ntyr
N-(p-hidroxifenil)glicina Dtrp D-triptófano
Nval
N-(1-metiletil)glicina Dtyr D-tirosina
Nmgly
N-metilglicina Dval D-valina
Nmala
L-N-metilalanina Dnmala D-N-metilalanina
Nmarg
L-N-metilarginina Dnmarg D-N-metilarginina
Nmasn
L-N-metilasparragina Dnmasn D-N-metilasparragina
Nmasp
ácido L-N-metilaspartic Dnmasp D-N-metilasparatato
Nmcys
L-N-metilcisteína Dnmcys D-N-metilcisteína
Nmgln
L-N-metilglutamina Dnmgln D-N-metilglutamina
Nmglu
Ácido L-N-metilglutámico Dnmglu D-N-metilglutamato
Nmhis
L-N-metilhistidina Dnmhis D-N-metilhistidina
Nmile
L-N-metilisoleucina Dnmile D-N-metilisoleucina
Nmleu
L-N-metileucina Dnmleu D-N-metileucina
Nmlys
L-N-metillisina Dnmlys D-N-metilisina
Nmmet
L-N-metilmetionina Dnmmet D-N-metilmetionina
Nmorn
L-N-metilornitina Dnmorn D-N-metilornitina
Nmphe
L-N-metilfenilalanina Dnmphe D-N-metilfenilalanina
Nmpro
L-N-metilprolina Dnmpro D-N-metilprolina
Nmser
L-N-metilserina Dnmser D-N-metilserina
Nmthr
L-N-metiltreonina Dnmthr D-N-metiltreonina
Nmtrp
L-N-metiltriptófano Dnmtrp D-N-metiltriptofano
Nmtyr
L-N-metiltirosina Dnmtyr D-N-metiltirosina
Código
Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional
Nmval
L-N-metilvalina Dnmval D-N-metilvalina
Nmnle
L-N-metilnorleucina Nle L-norleucina
Nmnva
L-N-metilnorvalina Nva L-norvalina
Nmetg
L-N-metil-etilglicina Etg L-etilglicina
Nmtbug
L-N-metil-t-butilglicina Tbug L-t-butilglicina
Nmhphe
L-N-metil-homofenilalanina Hphe L-homofenilalanina
Nmanap
N-metil-α-naftilalanina Anap α-naftilalanina,
Nmpen
N-metilpenicilamina Pen penicilamina
Nmgabu
N-metil-γ-aminobutirato Gabu ácido γ-aminobutírico
Nmchexa
N-metil-ciclohexilalanina Chexa ciclohexilalanina
Nmcpen
N-metil-ciclopentilalanina Cpen ciclopentilalanina
Nmaabu
N-metil-α-amino-α-metilbutirato Aabu α-amino-α-metilbutirato
Nmaib
N-metil-α-aminoisobutirato Aib ácido α-aminoisobutírico
Marg
L-α-metilarginina Dmarg D-α-metilarginina
Masn
L-α-metilasparragina Dmasn D-α-metilasparragina
Masp
L-α-metilaspartato Dmasp D-α-metilaspartato
Mcys
L-α-metilcisteína Dmcys D-α-metilcisteína
Mgln
L-α-metilglutamina Dmgln D-α-metilglutamina
Mglu
L-α-metilglutamato Dmglu Ácido D-α-metil glutámico
Mhis
L-α-metilhistidina Dmhis D-α-metilhistidina
Mile
L-α-metilisoleucina Dmile D-α-metilisoleucina
Mleu
L-α-metileucina Dmleu D-α-metil-leucina
Mlys
L-α-metil-lisina Dmlys D-α-metil-lisina
Mmet
L-α-metilmetionina Dmmet D-α-metilmetionina
Morn
L-α-metilornitina Dmorn D-α-metilornitina
Mphe
L-α-metilfenilalanina Dmphe D-α-metilfenilalanina
Código
Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional
Mpro
L-α-metilprolina Dmpro D-α-metilprolina
Mser
L-α-metilserina Dmser D-α-metilserina
Mthr
L-α-metiltreonina Dmthr D-α-metiltreonina
Mtrp
L-α-metiltriptófano Dmtrp D-α-metiltriptófano
Mtyr
L-α-metiltirosina Dmtyr D-α-metiltirosina
Mval
L-α-metilvalina Dmval D-α metilvalina
Mnva
L-α-metilnorvalina Ncbut N-ciclobutilglicina
Metg
L-α-metiletilglicina Nchep N-cicloheptilglicina
Mtbug
L-α-metil-t-butilglicina Nchex N-ciclohexilglicina
Mhphe
L-α-metil-homofenilalanina Ncdec N-ciclodecilglicina
Manap
α-metil-α-naftilalanina Ncdod N-ciclododecilglicina
Mpen
α-metilpenicilamina, Ncoct N-ciclooctilglicina
Mgabu
α-metil-γ-aminobutirato Ncpro N-ciclopropilglicina
Mchexa
α-metil-ciclohexilalanina Ncund N-cicloundecilglicina
Mcpen
α-metil-ciclopentilalanina Naeg N-(2-aminoetil)glicina
Nnbhm
N-(N-(2,2-difeniletil)carbamilmetil-glicina Nbhm N-(2,2-difeniletil)glicina
Nnbhe
N-(N-(3,3-difenilpropil)carbamilmetil-glicina Nbhe N-(3,3-difenilpropil)glicina
Tic
Ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico Nmbc 1-carboxi-1-(2,2-difeniletilamino)ciclopropano
pThr
Fosfotreonina pSer fosfoserina
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O-metil-tirosina pTyr fosfotirosina
imagen8
Hidroxilisina imagen9 ácido 2-aminoadípico
Los péptidos de la presente descripción pueden comprender secuencias líder para modular la secreción de los mismos en la célula. Una secuencia líder ilustrativa puede comprender la secuencia líder TAT.
Los extremos N y C de los péptidos de la presente descripción pueden estar protegidos por grupos funcionales. Los
5 grupos funcionales adecuados son descritos por Green and Wuts, en "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, capítulos 5 y 7, 1991. Los grupos protectores preferidos son aquellos que facilitan el transporte del compuesto unido al mismo en una célula, por ejemplo, reduciendo el carácter hidrófilo y aumentando el carácter lipófilo de los compuestos.
Estos radicales se pueden escindir in vivo, ya sea por hidrólisis o enzimáticamente, dentro de la célula. Los grupos
10 protectores de hidroxilo incluyen ésteres, carbonatos y grupos protectores de carbamato. Los grupos protectores de amina incluyen grupos alcoxi y ariloxicarbonilo, como se describió anteriormente para los grupos protectores N
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Los péptidos sintéticos se pueden purificar mediante cromatografía líquida preparativa de alto rendimiento [Creighton
T. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.] y cuya composición puede confirmarse mediante secuenciación de aminoácidos.
Las técnicas recombinantes también se pueden utilizar para generar los péptidos y/o polipéptidos de la presente descripción. Estas técnicas pueden preferirse cuando el péptido está unido a una proteína heteróloga (es decir, una proteína de fusión) ya que las técnicas recombinantes son más adecuadas para la generación de polipéptidos relativamente largos (p.ej., más de 20 aminoácidos) y grandes cantidades de los mismos. Tales técnicas recombinantes son descritas por Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153: 516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185: 60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310: 511-514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6: 307-311, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680 y Brogli et al., (1984) Science 224: 838-843, Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 559-565 y Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pág. 421-463. Los ejemplos de proteínas heterólogas se proporcionan a continuación.
Para producir un péptido y/o polipéptido de la presente descripción utilizando tecnología recombinante, se liga un polinucleótido que codifica el péptido de direccionamiento nuclear de la presente descripción a un vector de expresión de ácido nucleico, que comprende la secuencia de polinucleótidos bajo el control transcripcional de una secuencia reguladora en cis (p.ej., secuencia promotora) adecuada para dirigir la transcripción constitutiva, específica de tejido o inducible de los polipéptidos de la presente descripción en células anfitrionas.
La expresión "un polinucleótido aislado" se refiere a una secuencia de ácido nucleico monocatenario o bicatenario que se aísla y proporciona en forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótidos complementaria (ADNc), una secuencia de polinucleótidos genómica y/o secuencias de polinucleótidos compuestas (p.ej., una combinación de las anteriores).
Según se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia de polinucleótidos complementaria" se refiere a una secuencia, que resulta de la transcripción inversa de ARN mensajero utilizando una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. Tal secuencia puede ser posteriormente amplificada in vivo o in vitro utilizando una ADN polimerasa dependiente de ADN.
Según se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia genómica de polinucleótidos " se refiere a una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y, por lo tanto, representa una porción contigua de un cromosoma.
Según se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia de polinucleótidos compuesta" se refiere a una secuencia, que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. Una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias exónicas requeridas para codificar el polipéptido de la presente descripción, así como algunas secuencias intrónicas que se intercalan entre ellas. Las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, incluyendo otros genes, e incluirán típicamente secuencias de señales de empalme conservadas. Tales secuencias intrónicas pueden incluir adicionalmente elementos reguladores de la expresión que actúan en cis.
Como se mencionó anteriormente, las secuencias de polinucleótidos de la presente descripción se insertan en vectores de expresión (es decir, una construcción de ácido nucleico) para permitir la expresión del péptido recombinante. El vector de expresión de la presente descripción puede incluir secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación e integración en procariotas, eucariotas o preferiblemente ambos (p.ej., vectores lanzadera). Los vectores de clonación típicos contienen secuencias de inicio de la transcripción y la traducción (p.ej., promotores, potenciadores) y terminadores de la transcripción y la traducción (p.ej., señales de poliadenilación). Se apreciará que el vector de expresión también puede comprender secuencias de polinucleótidos que codifican otros polipéptidos que están unidos transcripcionalmente a los péptidos de direccionamiento nuclear de la presente descripción. Dichos polipéptidos se describen adicionalmente a continuación en la presente memoria.
Se puede utilizar una variedad de células procariotas o eucariotas como sistemas de expresión del anfitrión para expresar los péptidos de la presente descripción. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con un vector de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN cosmídico que contiene la secuencia codificante de polipéptido; levadura transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen la secuencia codificante del polipéptido; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p.ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes, tales como el plásmido Ti, que contiene la secuencia codificante del polipéptido.
Se apreciará que los polinucleótidos de la presente descripción también pueden expresarse directamente en el sujeto (es decir, terapia génica in vivo) o pueden expresarse ex vivo en un sistema celular (autólogo o no autólogo) y a continuación administrarse al sujeto. Las técnicas de terapia génica se describen más detalladamente a continuación.
Aparte de contener los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada (que codifica el polipéptido), la construcción de expresión de la presente descripción también puede incluir secuencias diseñadas para optimizar la estabilidad, producción, purificación, rendimiento o actividad del péptido
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Enfermedades inflamatorias Incluyen, pero no se limitan a, enfermedades inflamatorias crónicas y enfermedades inflamatorias agudas.
Enfermedades inflamatorias asociadas con hipersensibilidad
Los ejemplos de hipersensibilidad incluyen, pero no se limitan a, hipersensibilidad de Tipo I, hipersensibilidad de Tipo II, hipersensibilidad de Tipo III, hipersensibilidad de Tipo IV, hipersensibilidad inmediata, hipersensibilidad mediada por anticuerpos, hipersensibilidad mediada por inmunocomplejos, hipersensibilidad mediada por linfocitos T y DTH.
Hipersensibilidad de Tipo I o inmediata, tal como asma.
La hipersensibilidad de tipo II incluye, pero no se limita a, enfermedades reumatoides, enfermedades autoinmunitarias reumatoides, artritis reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol jul 2000; 15 (3):791), espondilitis, espondilitis anquilosante (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189), enfermedades sistémicas, enfermedades autoinmunitarias sistémicas, lupus eritematoso sistémico (Erikson J. et al., Immunol Res 1998; 17 (12):49), esclerosis, esclerosis sistémica (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. mar 1999; 6 (2):156); Chan OT. et al., Immunol Rev jun 1999; 169:107), enfermedades glandulares, enfermedades autoinmunitarias glandulares, enfermedades autoinmunitarias pancreáticas, diabetes, diabetes Tipo I (Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract oct 1996; 34 Supl: S125), enfermedades tiroideas, enfermedades tiroideas autoinmunitarias, enfermedad de Graves (Orgiazzi
J. Endocrinol Metab Clin North Am jun 2000; 29 (2):339), tiroiditis, tiroiditis autoinmunitaria espontánea (Braley-Mullen H. y Yu S, J Immunol 15 de diciembre de 2000; 165 (12):7262), tiroiditis de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho agosto 1999; 57 (8):1810), mixedema, mixedema idiopático (Mitsuma T. Nippon Rinsho. agosto 1999; 57 (8):1759); enfermedades autoinmunitarias reproductivas, enfermedades ováricas, autoinmunidad ovárica (Garza KM. et al., J Reprod Immunol feb 1998; 37 (2):87), infertilidad autoinmunitaria anti-esperma (Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. mar 2000; 43 (3):134), pérdida fetal repetida (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Supl 2: S107-9), enfermedades neurodegenerativas, enfermedades neurológicas, enfermedades neurológicas autoinmunitarias, esclerosis múltiple (Cruz AH. et al., J Neuroimmunol 1 de enero de 2001; 112 (1-2):1), enfermedad de Alzheimer (Oron L. et al., J Neural Transm Supl. 1997; 49:77), miastenia gravis (Infante AJ. Y Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (1-2):83), neuropatías motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. mayo 2000; 7 (3):191), síndrome de Guillain-Barre, neuropatías y neuropatías autoinmunitarias (Kusunoki S. Am J Med Sci. abr 2000; 319 (4):234), enfermedades miasténicas, síndrome miasténico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci. abr 2000; 319 (4):204), enfermedades neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelosa, atrofia cerebelosa paraneoplásica, síndrome del hombre rígido no paraneoplásico, atrofias cerebelosas, atrofias cerebelosas progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Sydeham, síndrome de Gilles de la Tourette, poliendocrinopatías, poliendocrinopatías autoinmunitarias (Antoine JC. y Honnorat J. Rev Neurol (París) enero 2000; 156 (1):23); neuropatías, neuropatías disinmunitarias (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Supl 1999; 50:419); neuromiotonía, neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple congénita (Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 13 de mayo de 1998; 841:482), enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunitarias cardiovasculares, aterosclerosis (Matsuura E. et al., Lupus. 1998; 7 Supl 2: S135), infarto de miocardio (Vaarala O. Lupus. 1998; 7 Supl 2: S132), trombosis (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Supl 2: S107-9), granulomatosis, granulomatosis de Wegener, arteritis, arteritis de Takayasu y síndrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 25 de agosto de 2000; 112 (15-16):660); enfermedad autoinmunitaria anti-factor VIII (Lacroix-Desmazes
S. et al., Semin Thromb Hemost.2000; 26 (2):157); vasculitis, vasculitis necrosante de pequeños vasos, poliangiítis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis, glomerulonefritis focal necrosante pauci-inmunitaria, glomerulonefritis en semilunas (Noel LH. Ann Med Interne (París). mayo de 2000; 151 (3):178); síndrome antifosfolípido (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14 (4):171); insuficiencia cardíaca, anticuerpos betaadrenoceptores de tipo agonista en la insuficiencia cardíaca (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 17 de junio de 1999; 83 (12A): 75H), púrpura trombocitopénica (Moccia F. Ann Ital Med Int. abril-junio de 1999; 14 (2):114); anemia hemolítica, anemia hemolítica autoinmunitaria (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma enero de 1998; 28 (3-4):285), enfermedades gastrointestinales, enfermedades autoinmunitarias del tracto gastrointestinal, enfermedades intestinales, enfermedad intestinal inflamatoria crónica (Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. enero de 2000; 23 (1):16), enfermedad celíaca (Landau YE. y Shoenfeld Y. Harefuah 16 de enero de 2000; 138 (2):122), enfermedades autoinmunitarias de la musculatura, miositis, miositis autoinmunitaria, síndrome de Sjogren (Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol sep 2000; 123 (1):92); enfermedad autoinmunitaria del músculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother jun 1999; 53 (5-6):234), enfermedades hepáticas, enfermedades autoinmunitarias hepáticas, hepatitis autoinmunitaria (Manns MP. J Hepatol agosto de 2000; 33 (2):326) y cirrosis biliar primaria (Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. jun 1999; 11 (6):595).
La hipersensibilidad de tipo IV mediada por células T incluye, entre otras, enfermedades reumáticas, artritis reumatoide (Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci USA 18 de enero de 1994; 91 (2):437), enfermedades sistémicas, enfermedades autoinmunitarias sistémicas, lupus eritematoso sistémico (Datta SK., Lupus 1998; 7 (9):591), enfermedades glandulares, enfermedades autoinmunitarias glandulares, enfermedades pancreáticas, enfermedades autoinmunitarias pancreáticas, diabetes tipo 1 (Castano L. y Eisenbarth GS. Ana. Rev. Immunol. 8:647); enfermedades tiroideas, enfermedades tiroideas autoinmunitarias, enfermedad de Graves (Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol mar 1993; 92 (1):77); enfermedades ováricas (Garza KM. et al., J Reprod Immunol feb 1998; 37 (2):87), prostatitis, prostatitis autoinmunitaria (Alexander RB. et al., Urology dic 1997; 50 (6):893), síndrome
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Los ejemplos de enfermedades gastrointestinales autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, enfermedades intestinales inflamatorias crónicas (Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. enero de 2000; 23 (1):16), enfermedad celíaca (Landau YE. y Shoenfeld Y. Harefuah 16 de enero de 2000; 138 (2):122), colitis, ileítis y enfermedad de Crohn.
De acuerdo con un aspecto concreto de la presente descripción, la enfermedad es colitis.
Los ejemplos de enfermedades cutáneas autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, enfermedades ampollosas autoinmunitarias de la piel, tales como, entre otras, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso y pénfigo foliáceo.
Los ejemplos de enfermedades hepáticas autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, hepatitis, hepatitis activa crónica autoinmunitaria (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol mar 1990; 54 (3):382), cirrosis biliar primaria (Jones DE. Clin Sci (Colch) nov 1996; 91 (5):551; Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. jun 1999; 11 (6):595) y hepatitis autoinmunitaria (Manns MP. J Hepatol ago 2000; 33 (2):326).
Los ejemplos de enfermedades neurológicas autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple (Cruz AH. et al., J Neuroimmunol 1 de enero de 2001; 112 (1-2): 1), enfermedad de Alzheimer (Oron L. et al., J Neural Transm Supl. 1997; 49:77), miastenia gravis (Infante AJ. Y Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (1-2):83; Oshima M. et al., Eur J Immunol, dic 1990; 20 (12):2563), neuropatías, neuropatías motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. mayo 2000; 7 (3):191); síndrome de Guillain-Barre y neuropatías autoinmunitarias (Kusunoki S. Am J Med Sci. abr 2000; 319 (4):234), miastenia, síndrome miasténico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci. abr 2000; 319 (4):204); enfermedades neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelosa, atrofia cerebelosa paraneoplásica y síndrome del hombre rígido (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci units S A 27 de marzo de 2001; 98 (7):3988); síndrome del hombre rígido no paraneoplásico, atrofias cerebelosas progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Sydeham, síndrome de Gilles de la Tourette y poliendocrinopatías autoinmunitarias (Antoine JC. y Honnorat J. Rev Neurol (París) enero 2000; 156 (1):23); neuropatías disinmunitarias (Nobile-Orazio E. et al., Electroencefalograma Clin Neurophysiol Supl 1999; 50:419); neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple congénita (Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 13 de mayo de 1998; 841:482), neuritis, neuritis óptica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, mayo 1994; 57 (5):544) y enfermedades neurodegenerativas.
Los ejemplos de enfermedades musculares autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, miositis, miositis autoinmunitaria y síndrome de Sjogren primario (Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol sep 2000; 123 (1):92) y enfermedad autoinmunitaria del músculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother jun 1999; 53 (5-6):234).
Los ejemplos de enfermedades nefríticas autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, nefritis y nefritis intersticial autoinmunitaria (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol agosto 1990; 1 (2):140).
Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias relacionadas con la reproducción incluyen, pero no se limitan a, pérdida fetal repetida (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Supl 2: S107-9).
Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias del tejido conjuntivo incluyen, entre otras, enfermedades del oído, enfermedades autoinmunitarias del oído (Yoo TJ. et al., Cell Immunol agosto 1994; 157 (1):249) y enfermedades autoinmunitarias del oído interno (Gloddek B. et al., Ann N Y Acad Sci, 1997, 29 de diciembre; 830:266).
Los ejemplos de enfermedades sistémicas autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, lupus eritematoso sistémico (Erikson J. et al., Immunol Res 1998; 17 (1-2):49) y esclerosis sistémica (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. mar 1999; 6 (2):156); Chan OT. et al., Immunol Rev jun 1999; 169:107).
Enfermedades infecciosas
Los ejemplos de enfermedades infecciosas incluyen, pero no se limitan a, enfermedades infecciosas crónicas, enfermedades infecciosas subagudas, enfermedades infecciosas agudas, enfermedades virales, enfermedades bacterianas, enfermedades protozoarias, enfermedades parasitarias, enfermedades fúngicas, enfermedades por micoplasmas y enfermedades por priones.
Enfermedades de rechazo de injerto
Los ejemplos de enfermedades asociadas con el trasplante de un injerto incluyen, entre otros, rechazo de injerto, rechazo de injerto crónico, rechazo de injerto subagudo, rechazo de injerto hiperagudo, rechazo de injerto agudo y enfermedad de injerto contra anfitrión.
Enfermedades alérgicas
Los ejemplos de enfermedades alérgicas incluyen, entre otros, asma, urticaria, alergia al polen, alergia a ácaros del polvo, alergia a venenos, alergia a cosméticos, alergia al látex, alergia química, alergia a los medicamentos, alergia a las picaduras de insectos, alergia a la caspa animal, alergia a plantas urticantes, alergia a la hiedra venenosa y alergia a los alimentos.
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el análisis funcional y la prueba t de Student (dos colas) para evaluar las diferencias entre el control y los resultados experimentales. Valores de p <0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.
Ejemplo 1
JNK y p38 se traslocan al núcleo utilizando un mecanismo independiente de NTS
En la búsqueda de proteínas lanzadera independientes de NLS, los autores de la presente invención han investigado la localización subcelular de JNK1/2 y p38α/β. Utilizando inmunotinción con anticuerpos específicos (Ab) se encontró que, similar a ERK1/2, JNK1/2 y p38α/β se localizan principalmente en el citoplasma de las células en reposo (Figura 7A y Figuras 8A-B). Tratando las células con estrés o estimulantes mitogénicos (anisomicina y TPA, respectivamente), se observó una translocación nuclear rápida y robusta de las cuatro isoformas de MAPK, con solo pequeñas diferencias en su cinética de translocación. Curiosamente, esta translocación no se correlacionaba con la fosforilación activadora de JNK1/2 y p38 α/β (Figura 7B), lo que indica que el mecanismo de translocación de estas cuatro MAPK es diferente del de ERK1/2. Además, ninguna de las proteínas JNK o p38 contenía una NTS, y solo dos, JNK2 y p38β, contenían una secuencia fosforilable (T-P-S) en la misma región de quinasa. Sin embargo, la secuencia pronunciada y las similitudes de conformación entre JNK1/2 y p38α/β con ERK1/2, pueden sugerir que las primeras todavía utilizan una secuencia de tipo NTS dentro de su dominio de inserción de quinasa para su translocación. Para excluir esta posibilidad, los autores de la presente invención mutaron los residuos alineados con las NTS fosforiladas en JNK1 o p38α a residuos Ala o Glu en las cuatro MAPK. A diferencia de ERK1/2, la expresión anormalmente alta de estos mutantes dio como resultado una distribución similar a la de las proteínas WT (Figura 9), lo que indica que JNK1/2 y p38α/β difieren de ERK1/2 no solo en la liberación de la proteína de anclaje, sino también en su mecanismo de translocación.
Ejemplo 2
JNK1/2 y p38α/β interactúan con Imp3, 7 y 9 después de la estimulación
La falta de NTS similar a ERK1/2, así como una NLS canónica o atípica, y la incapacidad de JNK1/2 y p38α/β para interactuar con Impα o Impβ directa o indirectamente, provocó la búsqueda de su mecanismo real de translocación. Dado que las Imp de tipo β (Tabla 3 a continuación) han sido implicadas en la translocación estimulada de las proteínas de señalización, se formuló la hipótesis de que una o más de estas Imp están implicadas en el proceso. Para examinar esto, se utilizó un escrutinio de coinmunoprecipitación (CoIP) para detectar si alguna de ellas podría interactuar con JNK1/2 y p38α/β. A pesar de la expresión de estas Imp en las células examinadas, no se detectaron interacciones Imp/MAPK significativas en las células HeLa en reposo (Figura 1A). Sin embargo, la IP de JNK1/2 y p38α/β, en extractos de células HeLa estimuladas, reveló un grado variable de interacción de las cuatro MAPK con las Imp 3, 7 y 9. Es importante destacar que el escrutinio y otros experimentos de IP demostraron solo pequeñas diferencias en asociación o sincronización de las interacciones entre los componentes, sugiriendo un modo similar de regulación entre ellos.
Tabla 3
Lista de proteínas similares a Impβ
Ejemplos de proteínas de señalización como "cargas"
Acrónimos Importina
Actuando con o sin Importina-α para inducir la translocación de varias proteínas de señalización1
Kapβ1, IMB1, IPOB, KPNB1 Importina-β
c-jun2, NPM-ALK3YBP13, EWS4
TNPO1, IMB2, MIP1, Kapβ2 Importina 2
Sin moléculas de señalización conocidas
TNPO2, KPNB2B, Tm-SR Importina 3
VitD Rec.5, HIF1-α6
IMB4, RanBP4 Importina 4
c-jun2, p60TRP7
IMB3, RANBP5, Kapβ3, KPNB3 Importina 5
ERKI/28,9, MEK18, SMAD3/48,10 Egr111, HIF1α6, c-jun2, Glucocorticoide Rec.12
RANBP7 Importina 7
SMAD1/3/410, NPM-ALK3
RANBP8 Importina 8
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