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ES2670776T3 - Métodos de fabricación de derivados de ácido 15-hidroxi graso - Google Patents

Métodos de fabricación de derivados de ácido 15-hidroxi graso Download PDF

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ES2670776T3
ES2670776T3 ES14843235.4T ES14843235T ES2670776T3 ES 2670776 T3 ES2670776 T3 ES 2670776T3 ES 14843235 T ES14843235 T ES 14843235T ES 2670776 T3 ES2670776 T3 ES 2670776T3
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ES
Spain
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fatty acid
enzyme
dgla
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extract
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ES14843235.4T
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English (en)
Inventor
Mehar Manku
David Coughlan
Bill DOWNES
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DS Biopharma Ltd
Original Assignee
DS Biopharma Ltd
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Abstract

Un proceso para la producción de derivado 15-hidroxi de ácidos grasos de comprende la oxidación enzimática de ácido graso con una atmósfera de oxígeno presurizado de al menos 200 kPa (2 bar) para formar un intermediario de ácido 15-5 hidroperoxi graso; y reducir al menos una parte del intermediario de ácido 15-hidroperoxi graso usando cisteína como agente reductor.

Description

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DESCRIPCION
Métodos de fabricación de derivados de ácido 15-hidroxi graso Sumario
La presente divulgación proporciona un proceso de dos etapas para la producción de derivados de ácido 15-hidroxi graso, tales como ácido 15-(S)-hidroxieicosatrienoico (HETrE o 15-(S)-HETrE) o ácido 15(S)- hidroxieicosapentaenoico (HEPE o 15(S)-HEPE) a partir del ácido graso correspondiente (por ejemplo, ácido dihomo-Y-linolenico (DGLA) o ácido eicosapentaenoico (EPA), respectivamente). La primera etapa implica la oxidación enzimática del ácido graso a un intermediario de 15(S)-hidroperóxido de ácido graso (por ejemplo, usando una formulación de enzima líquida), seguida por la reducción del derivado de ácido 15(S)-hidroxi graso usando cisteína como agente reductor. La oxidación está a una atmósfera de oxígeno presurizado de al menos 200 kPa (2 bar). En algunas realizaciones, la etapa de oxidación enzimática incluye poner en contacto el ácido graso con enzima depoxigenasa, obtenida opcionalmente a partir de harina de soja. La etapa de reducción del intermediario de ácido 15(S)-hidroperóxi graso comprende una reducción in situ con cisteína. En algunas realizaciones, al menos una parte del proceso se lleva a cabo en la exclusión (por ejemplo, exclusión parcial) de aire. En algunas realizaciones, el proceso comprende adicionalmente el aislamiento y/o la purificación del derivado de ácido 15(S)-hidroxi graso para formar un producto con grado de ingrediente farmacéutico activo (IFA) crudo. En algunas realizaciones, la etapa de aislamiento y/o purificación comprende purificación por cromatografía y/o cristalización. En algunas realizaciones, el proceso se escala para producir cantidad de multikilogramo del IFA, ajustándose opcionalmente a cGMP.
En algunas realizaciones, el ácido graso es DGLA, el intermediario de ácido 15(S)-hidroperóxi graso es 15(S)- HPETrE y el derivado de ácido 15(S)-hidroxi graso es 15(S)-HETrE.
En otras realizaciones, el ácido graso es EPA, el intermediario de ácido 15(S)-hidroperóxi graso es 15(S)-HPEPE y el derivado de ácido 15(S)-hidroxi graso es 15(S)-HEPE.
Se muestran detalles adicionales de la invención en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la disminución en absorbancia de solución de azul de metileno (680 nm) durante el tiempo como una función de aumento de la concentración de enzima lipoxigenasa de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 2 muestra la reducción de los costes de contribución de la enzima debido a las cargas de enzima reducidas y a la fuente de enzimas más económica de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 3 muestra la comparación del coste de material de enzima liofilizado comercial y extracto de harina de soja.
La Figura 4 ilustra el tiempo que lleva blanquear la solución de azul de metileno usando extracto de harina de soja (0,1 M de acetato sódico, pH 4,5) en comparación con enzima comercial (2,06 mg/ml, 0,2 M unidades/ml ) de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 5 es una superposición del espectro de RMN 1H para 1891-029 (amarillo: después de 1 hora con O2, morado: después de 2 horas a O2, verde: después de 3 horas con O2, + 0,5 eq adicionales de cisteína), rojo: agitado en condiciones atmosféricas durante el fin de semana, con 0,5 eq adicionales de cisteína, azul: crudo aislado HETrE)
La Figura 6 es una traza de HPLC y tabla de máximos para 1822-155-4D1.
La Figura 7 es una traza de HPLC y tabla de máximos para 1891-051-7A.
La Figura 8 es una superposición del espectro RMN 1H del lote 1822-155-4D1 (rojo, método original) y el lote 1891-051-7A (azul, método de acuerdo con la presente divulgación).
La Figura 9 muestra los datos de velocidad de calentamiento para la reacción de HETrE de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 10 es un gráfico de presión frente a temperatura para una reacción de HETrE de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 11 muestra los datos de velocidad de calentamiento para una reacción HPETrE de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 12 es un gráfico de presión frente a temperatura para una reacción de HPETrE de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 13 muestra un análisis LC-MS de material sobreoxidado 1822-063-3 producido en una realización de la presente divulgación.
La Figura 14 es una superposición del espectro de RMN 1H que compara muestra sobreoxidadas ((1822-163-3, azul, 1822193-3, rojo) en reacciones de acuerdo con una realización de la presente divulgación (1891-003-3, verde, 1891-029-4, morado y lote de ampliación 1891-05, amarillo) ejecutado durante largos períodos en presencia de 02/aire.
La Figura 15 muestra los datos de pureza de UPLC para HETrE durante 4,5 días de reflujo en una mezcla de
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MtBE:ciclohexano del 40 % (75 °C de temperatura externa).
La Figura 16 es un espectro representativo que muestra una superposición entre las señales de protón de DGLA y HETrE mediante RMN 1H.
La Figura 17 es un cromatograma UV anotado de fracciones frontales (1891-051-6D) a partir de la purificación de 15-(S)-HETrE según una realización de la presente divulgación.
La Figura 18 es un cromatograma UV anotado de 15-(S)-HETrE purificado (1891-051-7A) producido según una realización de la presente divulgación.
La Figura 19 es un cromatograma UV anotado de fracciones de cola (1891-051-6E) a partir de la purificación de 15(S)-HETrE según una realización de la presente divulgación.
La Figura 20 muestra estructura químicas y otros datos característicos para DGLA e impurezas importantes.
La Figura 21 muestra datos de espectro de masas a partir del análisis de fragmentación de una impureza dimérica en HETrE72 purificado.
La Figura 22 propone una vía posible para la producción de fragmentos éster que se observa mediante MS. Descripción detallada
En Journal of Medicinal Chemistry, 242, 1967,5329-5335 se desvela un proceso similar que usa borohidruro de sodio en lugar de cisteína como agente reductor. En European Journal of Lipid Science and Technology 100,1998,246-251 se usa cisteína para preprar derivados de ácido 13-hidroxi en lugar de 15-hidroxi-graso. La presente divulgación proporciona métodos de fabricación de 15-(S)-hidroxieicosatrienoico (15-(S)-HETrE) a partís de ácido dihomo-Y- linolenico (DGLA). En una etapa, el DGLA se biooxida en la posición w6, seguido por la reducción del hidroperóxido resultante usando un agente reductor (cisteína en lugar de NaBH4 que se menciona en el dibujo). Se muestra un proceso representativo en el Esquema 1. En algunas realizaciones, el 15(S)-HETrE se forma en una única etapa (por ejemplo, sin aislar o purificar el intermediario de 15(S)-HPETrE).
imagen1
Es necesario un proceso enzimático económico para el suministro de un kilogramo y cantidades superiores de GMP 15-(S)-HETrE y 15(S)-HEPE (por ejemplo, para su uso en programas de estudio clínico). En una realización, se llevó a cabo la producción de 100, 250 y 500 kg lotes de GMP 15(S)-HETrE. El resultado de este programa de trabajo fue la preparación de 15(S)-HETrE a partir de DGLA, a través de la biooxidación con enzima P1 de lipoxigenasa de soja para proporcionar 15(S)-HPETrE, seguido por la reducción con 1,1 equivalentes de borohidruro de sodio. Después de un trabajo de acidificación y extractivo, el 15-(S)-HETrE crudo aislado se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice proporcionando un rendimiento del 50 % con una pureza >95% mediante HPLC de porcentaje de área (235 nm).
Se mostró que la reacción de biooxidación también podría realizarse usando harina de soja como fuente más barata de la enzima; sin embargo, el procesado aguas abajo no fue conveniente.
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En otra realización, se preparó un lote de 500+ g de demostración sin GMP 15(S)-HETrE (por ejemplo, para estudios toxicológicos). En esta realización, se prepararon 500+ g de 15(S)-HETrE (>95% de pureza mediante HPLC % de área, 235 nm). Los análisis LC-MS y MS-MS de las impurezas aisladas sugirieron que fueron compuestos di- y tri- oxigenados entre el ~5% de impurezas presentes en el producto final.
En algunas realizaciones, el método comprende oxidar DGLA con un oxidante para formar 15(S)-HPETrE. En algunas realizaciones, el oxidante es un oxidante enzimático, tal como lipoxigenasa. En algunas realizaciones, el oxidante es enzima de lipoxigenasa de soja (por ejemplo, enzima P1 de lipoxigenasa). En algunas realizaciones, la enzima de lipoxigenasa de soja se purifica. En otras realizaciones, la enzima de lipoxigenasa de soja se usa como componente de una mezcla, por ejemplo, harina de soja.
La etapa de oxidación puede producirse en un medio acuoso, y a un pH adecuado para permitir la actividad enzimática. Por ejemplo, cuando el oxidante es enzima de lipoxigenasa de soja, la etapa de oxidación puede producirse en un disolvente acuoso tamponado a un pH básico (por ejemplo, pH de 9 o 9,6). El oxidante y/o enzima puede estar presente en un exceso estequiométrico en comparación con la cantidad de DGLA. Por ejemplo, el oxidante y/o enzima puede estar presente en 1 equivalente, 1,1 equivalentes, 1,2 equivalentes, 1,3 equivalentes, 1,4 equivalentes, 1,5 equivalentes, 1,6 equivalentes, 1,7 equivalentes, 1,8 equivalentes, 1,9 equivalentes, 2

equivalentes, 2,1 equivalentes, 2,2 equivalentes, 2,3 equivalentes, 2,4 equivalentes, 2,5 equivalentes, 2,6

equivalentes, 2,7 equivalentes, 2,8 equivalentes, 2,9 equivalentes, 3 equivalentes, 3,1 equivalentes, 3,2

equivalentes, 3,3 equivalentes, 3,4 equivalentes, 3,5 equivalentes, 3,6 equivalentes, 3,7 equivalentes, 3,8
equivalentes, 3,9 equivalentes, 4 equivalentes o mayor que 4 equivalentes.
La etapa de oxidación requiere la adición de una fuente de oxígeno. En dichas realizaciones, la etapa de oxidación puede producirse en presencia de una fuente de oxígeno, tal como oxígeno atmosférico o oxígeno gaseoso purificado (por ejemplo, al menos parcialmente purificado). La etapa de oxidación se produce con una atmósfera de oxígeno presurizado de al menos 200 kPa (2 bar), por ejemplo a 200 kPa (2 bar), 210 kPa (2,1 bar), 220 kPa (2,2 bar), 230 kPa (2,3 bar), 240 kPa (2,4 bar), 250 kPa (2,5 bar), 260 kPa (2,6 bar), 270 kPa (2,7 bar), 280 kPa (2,8 bar), 290 kPa (2,9 bar), 300 kPa (3 bar), 310 kPa (3,1 bar), 320 kPa (3,2 bar), 330 kPa (3,3 bar), 340 kPa (3,4 bar), 350 kPa (3,5), 360 kPa (3,6 bar), 370 kPa (3,7 bar), 380 kPa (3,8 bar), 390 kPa (3,9 bar), 400 kPa (4 bar), superior a 400 kPa (4 bar).
La temperatura de la etapa de oxidación puede controlarse para evitar el exceso de generación de calor. En algunas realizaciones, por ejemplo, la etapa de oxidación puede producirse a 0-5 °C.
En algunas realizaciones, la etapa de oxidación comprende poner en contacto el DGLA con 2 equivalentes de enzima P1 de lipoxidasa de soja en presencia de tampón acuoso (por ejemplo, 0,1M de tampón de borato de sodio) a un pH de 9,6 con atmósfera de oxígeno a 250 kPa (2 bar) a 0-5 °C.
En otra realización, la etapa de oxidación comprende poner en contacto el DGLA con 2 equivalentes de enzima de lipoxidasa de soja como un extracto de harina de soja crudo en presencia de tampón acuoso (por ejemplo, 0,1M de tampón de borato de sodio) a un pH de 9,6 en una atmósfera de oxígeno presurizado a 0-5 °C.
En algunas realizaciones, la etapa de reducción del intermediario de 15(S)-HPETrE para formar 15(S)-HETrE comprende poner en contacto el intermediario de 15(S)-HETrE con un agente reductor para formar el 15(S)-HETrE. El agente reductor es cisteína que reemplaza el borohidruro. Cisteína, como un agente reductor más suave, ofrece ventajas adicionales sobre los agentes reductores del tipo de borohidruro. Por ejemplo, la cisteína no forma gas de hidrógeno como un subproducto, permitiendo, de este modo, oportunidades de escalado más seguras. Asimismo, la cisteína es un reactivo estable y no requiere la manipulación especial o técnicas de almacenamiento que se requieren para los reactivos del tipo de borohidruro. Asimismo, la forma oxidada de cisteína (cistina) es un dipéptido estable que es solo parcialmente soluble en agua, lo que ofrece oportunidades de purificación convenientes sobre algunos otros agentes reductores.
En algunas realizaciones, la etapa de oxidación del DGLA y la etapa de reducción del intermediario de 15(S)- HPETrE para formar 15(S)-HETrE se produce en un vaso de reacción único sin la etapa de aislamiento o purificación del intermediario de 15(S)-HPETrE. En dichas realizaciones, el método comprende poner en contacto el DGLA con un oxidante y/o una enzima, como se describió anteriormente, en presencia de un agente reductor. El agente reductor puede estar presente en una cantidad de exceso estequiométrico, por ejemplo, 2 equivalentes en comparación con la cantidad de DGLA.
En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto el DGLA con un oxidante y/o una enzima, como se describió anteriormente, en presencia de un agente reductor. El agente reductor puede estar inicialmente presente en una cantidad de exceso estequiométrico, por ejemplo, 2 equivalentes en comparación con la cantidad de DGLA. El método puede comprender adicionalmente la adición de una cantidad adicional del agente reductor, por ejemplo otro 1 equivalente, al vaso de reacción después de un período de tiempo. En algunas realizaciones, el agente reductor es cisteína.
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En algunas realizaciones, el método comprende oxidar EPA con un oxidante para formar 15(S)-HPEPE. En algunas realizaciones, el oxidante es un oxidante enzimático, tal como lipoxigenasa. En algunas realizaciones, el oxidante es enzima de lipoxigenasa de soja (por ejemplo, enzima P1 de lipoxigenasa). En algunas realizaciones, la enzima de lipoxigenasa de soja se purifica. En otras realizaciones, la enzima de lipoxigenasa de soja se usa como componente de una mezcla, por ejemplo, harina de soja.
En algunas realizaciones, la etapa de oxidación del EPA y la etapa de reducción del intermediario de 15(S)-HPEPE para formar 15(S)-HEPE se produce en un vaso de reacción único sin la etapa de aislamiento o purificación del intermediario de 15(S)-HPEPE. En dichas realizaciones, el método comprende poner en contacto el EPA con un oxidante y/o una enzima, como se describió anteriormente, en presencia de un agente reductor. El agente reductor puede estar presente en una cantidad de exceso estequiométrico, por ejemplo, 2 equivalentes en comparación con la cantidad de EPA. En algunas realizaciones, el agente reductor es cisteína.
En algunas realizaciones, la etapa de reducción del intermediario de 15(S)-HPEPE para formar 15(S)-HEPE comprende poner en contacto el intermediario de 15(S)-HPEPE con un agente reductor para formar el 15(S)-HEPE. El agente reductor es cisteína. Cisteína, como un agente reductor más suave, ofrece ventajas adicionales sobre los agentes reductores del tipo de borohidruro. Por ejemplo, la cisteína no forma gas de hidrógeno como un subproducto, permitiendo, de este modo, oportunidades de escalado más seguras. Asimismo, la cisteína es un reactivo estable y no requiere la manipulación especial o técnicas de almacenamiento que se requieren para los reactivos del tipo de borohidruro. Asimismo, la forma oxidada de cisteína (cistina) es un dipéptido estable que es solo parcialmente soluble en agua, lo que ofrece oportunidades de purificación convenientes sobre algunos otros agentes reductores.
En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto el EPA con un oxidante y/o una enzima, como se describió anteriormente, en presencia de un agente reductor. El agente reductor puede estar inicialmente presente en una cantidad de exceso estequiométrico, por ejemplo, 2 equivalentes en comparación con la cantidad de EPA. El método puede comprender adicionalmente la adición de una cantidad adicional del agente reductor, por ejemplo otro 1 equivalente, al vaso de reacción después de un período de tiempo. En algunas realizaciones, el 15(S)-HEPE se convierte a un éster (por ejemplo, éster de etilo) mediante tratamiento del 15(S)-HEPE con bromuro de alquilo (por ejemplo, bromuro de etilo) y carbonato potásico en acetona seca. El éster crudo formados en tales realizaciones puede purificarse de forma conveniente mediante tratamiento con carbón y gel de sílice para formar un 15(S)-HEPE de alta pureza.
En algunas realizaciones, el método proporciona composiciones que comprenden un derivado de ácido 15-hidroxi graso y una o más impurezas. En algunas realizaciones, la una o más impurezas consiste en, consiste esencialmente en o comprende un producto de sobreoxidación, un producto sobrereducido, un dímero y/o un isómero posicional del derivado de ácido 15(S)-hidroxi graso. En algunas realizaciones, el producto de sobreoxidación es un compuesto di-hidroxilado, teniendo el compuesto una o más enlaces doble C=C extra, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el producto sobrereducido es un compuesto que tiene una o más enlaces dobles C=C inferiores al derivado de ácido 15(S)-hidroxi graso. En algunas realizaciones, el dímero es un éster dímero formado entre un resto de ácido carboxílico de una primera molécula y un resto hidroxi de una segunda molécula.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona composiciones que comprenden un derivado de ácido 15(S)-hidroxi graso. En algunas realizaciones, la composición comprende además una o más impurezas. En algunas tales realizaciones, el derivado de ácido 15(S)-hidroxi graso está presente en una cantidad de al menos el 90%, en peso de todos los ácidos grasos presentes en la composición, por ejemplo, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, en peso de todos los ácidos grasos presentes en la composición. En algunas realizaciones, el derivado de ácido 15(S)-hidroxi graso se encuentra en la forma de un éster, tal como un éster de etilo. En algunas realizaciones, la composición comprende además una impureza, en la que la impureza está presente en una cantidad no superior al 10%, en peso de todos los ácidos grasos presentes, por ejemplo no más del 10%, no más del 9%, no más del 8%, no más del 7%, no más del 6%, no más del 5%, no más del 4%, no más del 3%, no más del 2%, no más del 1%, de todos los ácidos grasos presentes en la composición.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona composiciones que comprenden 15(S)-HETrE. En algunas realizaciones, la composición comprende además una o más impurezas. En algunas tales realizaciones, el 15(S)-HETrE está presente en una cantidad de al menos el 90 %, en peso de todos los ácidos grasos presentes en la composición, por ejemplo, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, en peso de todos los ácidos grasos presentes en la composición. En algunas realizaciones, el 15(S)-HETrE se encuentra en la forma de un éster, tal como un éster de etilo. En algunas realizaciones, la composición comprende además una impureza, en la que la impureza está presente en una cantidad no superior al 10%, en peso de todos los ácidos grasos presentes, por ejemplo no más del 10%, no más del 9%, no más del 8%, no más del 7%, no más del 6%, no más del 5%, no más del 4%, no más del 3%, no más del 2%, no más del 1%, de todos los ácidos grasos presentes en la composición.
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En algunas realizaciones, a presente divulgación proporciona composiciones que comprenden 15(S)-HEPE. En algunas realizaciones, la composición comprende además una o más impurezas. En algunas tales realizaciones, el 15(S)-HEPE está presente en una cantidad de al menos el 90 %, en peso de todos los ácidos grasos presentes en la composición, por ejemplo, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, en peso de todos los ácidos grasos presentes en la composición. En algunas realizaciones, el 15(S)-HEPE se encuentra en la forma de un éster, tal como un éster de etilo. En algunas realizaciones, la composición comprende además una impureza, en la que la impureza está presente en una cantidad no superior al 10%, en peso de todos los ácidos grasos presentes, por ejemplo no más del 10%, no más del 9%, no más del 8%, no más del 7%, no más del 6%, no más del 5%, no más del 4%, no más del 3%, no más del 2%, no más del 1%, de todos los ácidos grasos presentes en la composición.
Ejemplos
Ejemplo 1: Ensayo colorimétrico para evaluar la actividad de la lipoxigenasa de homogenados vegetales crudos
El hidroperóxido linoleico, la 3-metil-2-benzotiazolina (MBTH), y ácido 3-(dimetilamino)benzoico (DMAB) son conocidos porque reaccionan en presencia de hemoglobina para proporciona un tinte de indamina morado, que absorbe en 590 nm. La absorbancia en esta longitud de onda es lineal con la concentración de hidroperóxido linoleico hasta 35 uM.
se extrajo 1 g de harina de soja en 10 ml de tampón o agua ajustado a un pH apropiado (1:10 p/v) durante un período de hasta 24 horas, a 4 °C o a temperatura ambiente. Las reacciones se llevaron a cabo en un tubo de ensayo con agitación magnética (~500 rpm). Para los puntos de tiempo de 1 y 2 horas, las soluciones de extracción se dejaron reposar durante ~10 minutos antes de que 10 pl de la solución enzimática se retirara y añadiera a la solución de ensayo A(que contenía ácido linoleicos y DMAB) (1 ml) en una cubeta de 4 ml. Después de la incubación durante ~ 5 minutos a temperatura ambiente, la solución de ensayo B (MBTH y hemoglobina) (1 ml) se añadió e incubó adicionalmente durante ~ 5 minutos antes de registrar la lectura de absorbancia (Tabla 1). Se observó la formación de color azul en todas las muestras, excepto el borato de sodio, muestras de extracto con pH 10,4 y en blanco (todos los reactivos, excepto la enzima). Se observó un ligero color gris en este caso con una absorbancia de ~0,2. Se ejecutó un ensayo en blanco con todos los reactivos y enzima excepto ácido linoleico, proporcionando una absorbancia de 0,2. Se determinó que la solución enzimática estaba interfiriendo con la lectura de absorbancia.
Tabla 1. Lecturas de absorbancia a 590 nm para extractos de harina en condiciones diversas
Tampón, pH inicial
pH de extracto final Temperatura (°C) Absorbancia (590 nm) en punto de tiempo (h.)
1 h.
2 h. 5 h. 24 h.
Sodio
6,8 4 0,50 0,36 0,43 0,39 0,25 0,20 0,23 0,30
acetato, pH 10
ambiente 0,43 0,31 0,48 0,44 0,26 0,18 0,31 0,27
Acetato sódico, pH 4,5
5,2 4 0,43 0,45 0,53 0,53 0,29 0,29 0,37 0,31
ambiente
0,52 0,46 0,54 0,51 0,25 0,26 0,40 0,35
Borato de sodio, pH 10,4
10,1 4 0,20 0,21 0,21 0,16 0,06 0,02 0,00 0,04
ambiente
0,20 0,20 0,23 0,20 0,0 0,0 0,05 0,22
Borato de sodio, pH 4,5
6,1 4 0,52 0,49 0,62 0,54 0,37 0,24 0,33 0,31
ambiente
0,41 0,44 0,62 0,54 0,24 0,34 0,36 0,53
Agua, pH 7
6,8 4 0,41 0,41 0,38 0,41 0,20 0,24 0,23 0,29
ambiente
0,30 0,31 0,47 0,48 0,19 0,18 0,25 0,27
Los puntos de tiempo restantes (5 y 24 horas) se analizaron de forma distinta. Las soluciones de extracción se dejaron reposar durante ~10 minutos antes de que 10 pl de la solución enzimática se retirara y añadiera a la solución de ensayo A(que contenía ácido linoleico y DMAB) (0,5 ml) en 2 ml de tubo de Eppendorf. Después de la incubación durante ~ 5 minutos a temperatura ambiente, la solución de ensayo B (MBTH y hemoglobina) (0,5 ml) se añadió e incubó adicionalmente durante ~ 5 minutos antes. Se añadió la solución de sulfato de laurilo de sodio (1% p/v) (0,5 ml) para interrumpir la reacción y las soluciones se centrifugaron a 9,8 rcf, 4 °C durante 5 minutos. La solución se decantó a continuación en una cubeta de 4 ml y se analizó como antes. Los resultados no muestran ninguna tendencia particular.
Ejemplo 2: Condiciones de ensayo coloriométrico alternativas
Para analizar la sensibilidad de ensayo, se esbleció una serie de diluciones que usaban la enzima liofilizada en el valor de carga original (0,42 Munidades (4,11 mg)/ml basándose en el certificado del proveedor de análisis) y diluyendo por la mitad hata que no se observó más detección coloriométrica. Esto también se analizó con el método de decoloración azul de metilo (Suda y co., J. Agric. Food Chem. 43, 3, 1995, pág. 742, EP no. 2118126 A1) mediante el cual se analizó la disminución en absorbancia de una solución azul de metileno de 100 pM a 680 nm,
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durante el transcurso del tiempo cuando se incubó con solución enzimática en presencia de ácido linoleico. El ensayo de decoloración azul de metileno se llevó a cabo usando 2,1 ml de 0,2 M de tampón Tris-HCl, pH 9,0, 0,3 ml 100 |jM de solución azul de metileno, 0,3 ml 10 mM de sustrato de lineoleato de sodio y 0,3 ml de extracto de harina de soja (volumen total 3 ml).
Tabla 2. Lecturas de absorbancia a 680 nm para la serie de dilución enzimática purificada (método de decoloración azul de metileno)_______________________________________________________________________________
Carga enzimática (Munidades/ml)
Absorbancia (680 nm) en punto de tiempo t minutos)
t=0
t=1 t=2 t=3 t=4 t=5 t=6 t=7 t=8 t=9 t=10
0,420
0,34 0,00 - - - - - - - - -
0,210
0,27 0,03 - - - - - - - - -
0,105
0,33 0,03 0,01 - - - - - - - -
0,053
0,31 0,25 0,08 0,00 - - - - - - -
0,026
0,28 0,23 0,19 0,10 0,08 0,05 0,00
0,013
0,35 0,32 0,32 0,32 0,22 0,22 0,16 0,14 0,11 0,09 0,08
Carga enzimática (Munidades/ml)
0,007
0,29 027 026 027 026 026 027 026 026 028 026
Para el ensayo DMAB-MBTH, se retiraron 10 jl de la solución enzimática y se añadieron a la solución de ensayo A (que contenía ácido linoleico y DMAB) (0,5 ml) en 2 ml de Eppendorf. Después de la incubación durante ~ 5 minutos a temperatura ambiente, la solución de ensayo B (MBTH y hemoglobina) (0,5 ml) se añadió e incubó adicionalmente durante ~ 5 minutos antes. Se añadió la solución de sulfato de laurilo de sodio (1% p/v) (0,5 ml) para interrumpir la reacción y las soluciones se centrifugaron a 16,1 rcf, 4 °C durante 10 minutos. La solución se decantó a continuación en una cubeta de 4 ml y se analizó como antes. Esto se realizó en duplicado.
Tabla 3. Lecturas de absorbancia para serie de dilución enzimática purificada a 590 nm (ensayo DMAB-MBTH)
Carga enzimática (Munidades/ml]
Absorbancia (590 nm)
1
2
0,420
0,17 0,19
0,210
0,21 0,18
0,105
0,23 0,27
0,053
0,22 0,22
0,026
0,26 0,20
0,013
0,06 0,08
0,007
0,00 0,03
A partir de los resultados en la Tabla 3, pareció que las lecturas de absorbancia obtenidas usando este método, no se correspondían de modo similar con la concentración de la enzima en la solución. El método original se uso para en ensayo de lipoxigenasas vegetales crudas a un pH 6. Se informa que la hemoglobina muestra una actividad cuasi-lipoxigenasa a un pH óptimo de 8,5 y concentración de ácido linoleico de 0,5 mM. El ensayo se estuvo realizando a un pH 9, esto pudo tener alguna relación con los resultados obtenidos. Se notó, sin embargo, que no se observó formación de color en un ensayo en blanco que contenía todos los reactivos excepto la enzima. Sin embargo, sobre la base de los resultados obtenidos se decidió proceder con el método de decoloración azul de metileno. El método es simple y rápido, aunque no particularmente sensible y es difícil de cuantificar. Los niveles de actividad se determinan por el tiempo que tarda el color en desaparecer (es decir, absorbancia a 680 nm en alcanzar 0). Para distinguir entre cargas enzimáticas superiores, la serie de dilución con enzima purificada se repitió usando una concentración inferior de la solución enzimática. Se añadieron solo 30jl de solución enzimática a la solución de decoloración azul de metileno y el volumen se compensó a 3 ml con 270 jl de agua destilada. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Lecturas de absorbancia a 680 nm para la serie de dilución enzimática purificada usando una concentración enzimática inferior (método de decoloración azul de metileno)___________________________________________
Carga enzimática
Absorbancia en Tiempo t (minutos)
(Munidad/ml)
t=0 t=0,5 t=1 t=1,5 t=2,0 t=2,5 t=3,0 t=3,5 t=4,0
0,420
0,35 0,22 0,01 -0,01 - - - - -
0,210
0,35 0,35 0,27 0,16 0,08 0,03 0,01 0,00 -
0,105
0,31 0,30 0,30 0,26 0,24 0,17 0,13 0,10 0,08
0,053
0,32 - 0,31 - 0,31 - 0,25 - 0,18
0,420
- - - - - - - - -
0,210
- - - - - - - - -
0,105
0,06 0,06 0,04 0,00 - - - - -
0,053
- 0,16 - 0,06 - 0,05 0,02 0,00 -0,01
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35
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Una representación gráfica de la serie de dilución se muestra en la Figura 1. Un tiempo de inducción, (0,5 - 2 min.) para que empiece la absorbancia a disminuir, se observa para las muestras con una concentración enzimática inferior.
Se determinó que la actividad de un extracto de harina de soja podría someterse a ensayo coloriométricamente usando este método frente a una solución de la enzima comercial, proporcionan una indicación de actividad suficiente para llevar a cabo la reacción de oxidación requerida.
Ejemplo 3: Cisteína como agente reductor
Se obtuvo un suministro alternativo de enzima liofilizada. Las pruebas iniciales mostraron que la carga enzimática podría reducirse hasta la mitad. En combinación con el agente reductor alternativo (cisteína), las cargas enzimáticas se redujeron desde las iniciales 13,7 Munidades por gramo de sustrato de DGLA (preparación enzimática líquida) a
I, 8 Munidades por gramo (enzima liofilizada). Se realizó una reducción en costes, para la enzima lipoxigenasa, de
II, 37 £ por gramo de DGLA a 0,75 £ por gramo de DGLA (~15 veces de reducción, Figura 2). Esto se debió a dos factores: la carga enzimática disminuida y el suministro más económico (0,42 £/Munidad para la enzima liofilizada frente a 0,83 £ /Munidad para la preparación enzimática líquida).
También se observó que la enzima liofilizada suministrada tenía buena estabilidad. Aunque se recomendaba que fuera almacenada a -20 °C y disecada tras su uso, el lote se almacenó a temperatura ambiente, condiciones atmosféricas durante dos semanas antes de ser utilizada en una reacción que utilizaba las cargas enzimáticas optimizadas (1,8 Munidades/ g de DGLA). No se observó un deterioro en el rendimiento. La reacción se llevó a cabo en una solución tampón para mantener el pH y solubilizar los componentes de reacción. Se usó cisteína, un agente reductor más suave, en lugar de borohidruro de sodio. El uso de cisteína permitió llevar a cabo en una etapa la reacción de oxidación/reducción. Además no se generó hidrógeno inflamable durante la reacción/interrupción. Además, se produjeron menos productos de sobreoxidación, probablemente debido a las propiedades antioxidantes de la cisteína. También se cree que la adición del agente reductor al inicio del proceso ayuda a disminuir la inactivación enzimática irreversible mediante elevadas concentraciones de hidroperóxido, llevando, de este modo, a una necesidad inferior de enzimas (por ejemplo, ahorro económico) y menor potencial para la sobreoxidación.
Ejemplo 4: Carga enzimática
Se llevaron a cabo reacciones de biooxidación previas usando una preparación enzimática líquida con una carga enzimática de -13,7 Munidades de actividad por gramo de sustrato de DGLA (1 unidad definida como la enzima que causa un aumento de 0,001 UA por minuto a 234 nm cuando se incuba con 0,02% de lineolato a 25 °C en 0,1 M de tampón de borato, pH 9,0, en un volumen total de 1,0 ml). También se sometió a ensayo un suministro alternativo de lipoxigenasa como polvo liofilizado. La reacción de biooxidación se repitió con la enzima liofilizada usando -13,7 Munidades de actividad por gramo de sustrato DGLA y se obtuvo un perfil de finalización de reacción mediante espectroscopia de RMN 1H. Esta reacción se repitió otras 3 veces, disminuyendo la carga enzimática a la mitad cada vez. Los resultados se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5. Resultados de estudio de carga enzimática inicial usando enzima pura liofilizada
Experimento n.°
Munidades de carga enzimática/ g de sustrato de DGLA Finalización de reacción determinada por RMN H
1822-159
~13,7 Finalizada
1822-161
~6,87 Finalizada
1822-175
~3,4 No concluyente debido a señales que se solapan. Resto de DGLA. Confirmada por TLC.
1822-177
~5,2 No concluyente debido a señales que se solapan. Resto de DGLA. Confirmada por TLC.
Los resultados de estas pruebas muestran que la carga enzimática podría reducirse por al menos a la mitad con 1 finalización de reacción aún siendo obtenido dentro de 1 hora. Aunque los espectros RMN H obtenidos para las muestras de carga inferior fueron no concluyentes, aún era visible DGLA mediante RMN y su presencia se confirmó mediante TLC.
Ejemplo 5: Fuente enzimática
Las reacciones previas se realizaron usando una preparación líquida de lipoxigenasa, proporcionando la finalización de reacción a una carga de 13,7 Munidad por gramo de DGLA. Se obtuvo un suministro alternativo de enzima pura liofilizada usado una carga enzimática de solo 6,87 Munidades por gramo de DGLA.
Ejemplo 6: Medio de reacción
Se llevó a cabo un experimento usando agua pura en lugar de tampón. Se añadió DGLA al agua proporcionando dos
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capas inmiscibles. El pH se ajustó a 9,8 con 2M de hidróxido sódico y se agitó para proporcionar una emulsión. Se añadió la enzima liofilizada (6,87 Munidades por gramo de DGLA) y la reacción se llevó a cabo como antes. Después de 1 hora la mezcla de reacción era aún una emulsión turbia, indicativo de una conversión incompleta. La espectroscopia de RMN 1H mostró un 45% de DGLA no reaccionado y algo de impureza sobreoxidada. Esto sugiere que se requiere el tampón para mantener el requisito de pH (~9) y ayudar a solubilizar el sustrato. Se cree que el 15- (S)-HPETrE también ayuda a solubilizar el sustrato de DGLA.
Ejemplo 7: Agente reductor
El hidroperóxido intermediario se redujo limpiamente de forma previa, en una secuencia de un solo recipiente, usando 1,1 equivalentes de borohidruro de sodio. Sin embargo, esto lleva a la producción de gas de hidrógeno, especialmente durante el tratamiento y requiere una gran cantidad de volumen de 10% de solución de ácido cítrico para el ajuste de pH. En el escalado, el borohidruro de sodio se ve desfavorecido debido al problema del hidrógeno, modo de carga y tiempo largo de interrupción proyectado (~17 h.) sobre la planta.
Se llevó a cabo experimentos en los que se usó cisteína como agente reductor en lugar de borohidruro de sodio. Se realizó una cantidad de reacciones usando diversas cargas enzimáticas. Las diversas permutaciones se detallan en la Tabla 6. Las reacciones se llevaron a cabo en un reactor parr, con presión de oxígeno (250 kPa (2,5 bar)).
Parece que se requieren inicialmente dos equivalentes de cisteína. La adición de 3 equivalentes hizo que la reacción se bloqueara o al menos el progresara muy lentamente, probablemente debido a la rápida retiración del hidroperóxido activador de enzimas. Sin embargo, si se usan dos equivalentes de cisteína inicialmente, se requiere que se añada un equivalente adicional de cisteína para reducir el resto de hidroperóxido después de una hora de tiempo de reacción. Esto probablemente debido a la oxidación de cisteína en la mezcla de reacción por oxígeno, en lugar del hidroperóxido. También se encontró que l reducción de la carga enzimática a tan baja como 1,8 Munidades de actividad por gramo de DGLA se podía conseguir con las mismas condiciones, proporcionando casi el consumo total de DGLA dentro de unas pocas horas y reducir la formación de impurezas (por ejemplo, productos sobreoxidados).
Tabla 6. Resultados de reacciones usando agente reductor de cisteína y carga enzimática variada (enzima liofilizada)_____________________________________________________________________________________
Número de experimento
Punto de adición de sustrato Punto de adición de enzima Punto de adición de cisteína Resultados
1822-193
Todos añadidos al inicio Todos añadidos al inicio (~ 14 Munidades/g DGLA) Añadido después de 60 min. (2 eq.). Después de 1 hora agitando con cisteína con 02, mezcla de HPETrE, HETrE e impurezas sobreoxidadas.
1822-195
Todos añadidos al inicio Todos añadidos al inicio (~ 14 Munidades/g DGLA) Todos añadidos al inicio (2 eq.) Después de 30 min. con 02, mezcla de HPETrE y HETrE mediante RMN 1H. Una agitación adicional a temperatura atmosférica no mostró una conversión adicional. Después de dejar reposar durante la noche (4 °C), RMN mostró un pequeño cambio adicional.
1822-197
Todos añadidos al inicio Todos añadidos al inicio (~ 14 Munidades/g DGLA) Todos añadidos al inicio (3 eq.) Después de 30 min. con 02 más 15 min de reposo, la mezcla de HETrE y DGLA, sin HPETrE mediante RMN 1H. Después de dejar reposar durante la noche (4 °C) a temperatura atmosférica, se observó una conversión adicional de DGLA
1822-199
Todos añadidos al inicio Todos añadidos al inicio (~ 7 Munidades/g DGLA) 2 eq. añadidos al inicio más 1 eq. adicional después de 60 min. Después de 60 min. con 02, mezcla de H ETrE y una pequeña cantidad de HPETrE mediante RMN 1H. Se añadió 1 equivalente adicional de cisteína y se agitó durante 60 min a temperatura atmosférica. Sin HPETrE, algún resto de DGLA mediante RMN 1H. Pureza HPLC de % de área (235 nm) 96,8%. 77 % de HETrE crudo recuperado y purificado mediante cromatografía en columna para proporcionar un 45% de rendimiento de aceite claro, de color amarillo pálido (96,7% de área mediante PHLC). La recuperación total a partir de la columen incluyendo fracciones crudas 71%.
Número de experimento
Punto de adición de sustrato Punto de adición de enzima Punto de adición de cisteína Resultados
1891-001
Todos añadidos al inicio Todos añadidos al inicio (~ 3,5 Munidades/g DGLA) 2 eq. añadidos al inicio más 1 eq. adicional después de 60 min. Después de 60 min. con 02, mezcla de HETrE y una pequeña cantidad de H PETrE y DGLA mediante RMN 1H. Se añadió 1 equivalente adicional de cisteína y se agitó durante 60 min. a temperatura atmosférica. Sin HPETrE, algún resto de DGLA mediante RMN 1H. Se filtró a través de Celite para retirar la cistina precipitada y se ajustó el pH a 3 con ácido cítrico sólido. Se almacenó a 4 °C duante la noche. Se extrajo con MTBE para producir un 76% de HETrE crudo. Pureza HPLC de % de área (252 nm) 93,55%.
1891-003
Todos añadidos al inicio Todos añadidos al inicio (~ 1,8 Munidades/g DGLA) 2 eq. añadidos al inicio más 1 eq. adicional después de 60 min. Después de 60 min. con 02, mezcla de HETrE y una pequeña cantidad de HPETrE y DGLA ~ 10 % en peso) mediante RMN 1H. Se añadió 1 equivalente adicional de cisteína y se agitó durante 60 min. a 02 presión atmosférica. Sin HPETrE, DGLA residual (~ 6.5 % en peso) mediante RMN 1H. Después de permanecer a temperatura ambientes, se filtró a través de Celite para retirar la cistina precipitada y se ajustó el pH a 3 con ácido cítrico sólido. Se extrajo con MTBE para producir un 70% de HETrE crudo. Sin HPETrE, DGLA residual (~ 1 % en peso) mediante RMN 1H. Pureza HPLC de % de área (252 nm) 93,19%.
1891-005
Todos añadidos al inicio Todos añadidos al inicio (~ 0,96 Munidades/g DGLA) 2 eq. añadidos al inicio más 1 eq. adicional después de 60 min. Después de 60 min. con 02, mezcla de HETrE y una pequeña cantidad de HPETrE y DGLA significante (41 % en peso) mediante RMN 1H. Se añadió 1 equivalente adicional de cisteína y se agitó durante 60 min. a 02 presión atmosférica. Sin HPETrE, DGLA residual ( 14% en peso) mediante RMN 1H. Se agitó durante la noche a 02 de presión. Una pequeña cantidad de HPETrE, DGLA residual (3,5% en peso) mediante RMN 1H. Se añadió
un 0,25 eq. adicional de cisteína y se agitó con 02 de presión durante 1 hora. Sin HPETrE, DGLA residual (3,5% en peso) mediante RMN 1H.
1891-011
Todos añadidos al inicio Todos añadidos al inicio (~ 1,8 Munidades/g DGLA) 2 eq. añadidos al inicio más 1 eq. adicional después de 60 min. Después de 60 min con aire comprimido, principalmente DGLA mediante RMN 1H. La reacción se continuó durante la noche con aire comprimido. HETrE de RMN 1H, HPETrE, DGLA significante e impurezas.
1891-015
Todos añadidos al inicio Todos añadidos al inicio (~ 1,8 Munidades/g DGLA) 2 eq. añadidos después de 7 horas Después de 60 min con aire comprimido, principalmente DGLA mediante RMN 1H. La reacción se continuó durante 6 horas con aire comprimido. El RMN 1H mostró ~ 45% de HPETrE, 55% de DGLA. Se añadieron 2 eq. de cisteína y se reajustó el pH, a continuación se agitó durante la noche. El RMN 1H mostró ~ 45% de HETrE, 55% de DGLA. No más conversión.
Ejemplo 8: Reacción de termentador de alimentación de lote doble
Una reacción de volumen final de 1 l se llevó a cabo en un fermentador de 3l, en el que el sustrato (40 g) y la enzima 5 (1,8 Munidades/ g de DGLA) se añadieron a una velocidad constante (1,6 ml/min. y 2 ml/min.) respectivamente a un
pH 9,5 0,1M de tampón borato de sodio (850 ml). Se borboteó oxígeno a través de la solución de tampón, que se agitó a 500 rpm. La enzima se añadió como una solución en pH 4,5 0,1M de solución de acetato sódico (150 ml) y el pH de la reacción se mantuvo a ~9,5 mediante la adición de 3M de NaOH (ac.). Después de la adición de DGLA, se produjo un espumado significante y se expulsó algo de material del vaso (~10%). Se añadió polipropilenglicol 2000 10 (20 ml 1:1 v/v con tampón de borato) como un agente antiespumante, pero tuvo poco efecto. Otros 20 ml no
redujeron significativamente el espumado. La reducción del flujo de oxígeno a la configuración más baja posible redujo la espuma. Un alícuota se analizó mediante RMN 1H después de 1,5 horas, que mostró DGLA residual (6,25% en peso). La reacción se continuó durante otras 5 horas. La suspensión se filtró a continuación a través de Celite para retirar cistina y el filtrado claro se acidificó a pH 3 con ácido cítrico sólido. La suspensión resultante se 15 almacenó a 4 °C durante el fin de semana. El producto precipitado y restos de cistina adicionales se sedimentaron a partir de la solución acuosa. Estos se recogieron mediante filtración proporcionando una crema blanca. El TLC mostró la ausencia de producto en el filtrado acuoso. La «crema» recogida se suspendió en MTBE y se filtró para
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dejar un sólido blanco granular. El filtrado se concentró sobre el evaporador giratorio para dejar 44 g de aceite amarillo. El análisis RMN 1H no mostró HPETrE y menos del 1 % en peso de DGLA residual. Sin embargo, el producto también contenía PPG2000. El aceite se suspendió en 20% de MTBE: hecano (100 ml) y se aplicó a un lecho corto de sílice (400 g). El lecho corto se eluyó con hexano (1,2 l), 20% de MTBE: hexano (2 l) y 40% de MTBE: hexano (4l). El producto que contenía fracciones se identificó mediante TLC. El producto inicial que contenía fracciones contenía una traza débil de DGLA mediante TLC; estas se combinaron y concentraron de forma separada para proporcionar 13 g de producto como un aceite claro, de color amarillo pálido. RMN 1H (CDCh) -0.5% de DGLA, HETrE. El producto restante que contenía fracciones se combinó para proporcionar 14 g de producto. RMN 1H (CDCh) - HETrE. Pureza HPlC de % de área (252 nm) - 96,92%. La recuperación total del producto después de la cromatografía en columna fue del 62%. Sin embargo, se produjeron pérdidas significantes debido al problema de espumado en el reactor. Esto ha demostrado que la reacción no requiere llevarse a cabo con presión si se transfiere suficiente oxígeno en la mezcla a través de agitación y un tiempo de reacción extendido no conllevó a un aumento en productos laterales. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que esto se debe a una cantidad de razones - carga enzimática inferior, disponibilidad de oxígeno inferior y cantidad reducida de hidróxido inestable en la mezcla de reacción. Sin embargo, la reacción con una ligera presión de oxígeno ayudaría a controlar el problema del espumado de reacción.
Ejemplo 9: Harina de soja como fuente enzimática
Se desarrollaron condiciones para la extracción de suficiente actividad de lipoxigenasa de 10 g de harina de soja para convertir limpiamente 3 g de DGLA a HETrE 1:10 p/v 0,1 M de tampón de acetato sódico, pH 4,5, 3 horas, 180 rpm).
La comparación en costes basándose en los precios actuales de enzima liofilizada y harina de soja muestra un ahorro de 7 veces en los costes de material (Figura 3), sin embargo, la operación de unidad extra (extracción, filtración) se requiere a escala de planta de modo que el ahorro potencial a bajos volúmenes es insignificante.
Las reacciones de biooxidación usando harina de soja como la fuente enzimática, que se llevó a cabo con presión de oxígeno proporcionó conversiones razonables de DGLA a HPETrE (~95%). Las reacciones podrían realizarse añadiendo harin de soja directamente; sin embargo, esto produjo una mezcla de reacción viscosa. La acidificación de la mezcla de reacción causa la precipitación de proteínas, que cuando se extrajeron produjeron emulsiones espesas que fueron complicadas de filtrar. Se encontró que la separación limpia de capas podría lograrse con centrifugación, aunque esto no sería factible a gran escala, debido a los volúmenes implicados. También sería un problema la limpieza del reactor, ya que los restos de harina eran bastante complicados de retirar.
La enzima activa se extrajo, en cambio, a partir de la harina en una solución de tampón a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, la solución turbia resultante se usó para realizar la biooxidación. Esto retira los carbohidratos insolubles de la mezcla de reacción, pero se forman emulsiones durante el procedimiento de tratamiento debido a la presencia de cantidades significantes de proteínas.
Se intentó el aislamiento de enzima semi-purificada de harina de soja, aunque se encontró que era inactivo.
La determinación sistemática de las condiciones óptimas para la extracción de actividad enzimática a partir de harina de soja desengrasada (medio de tampón, pH, tiempo, temperatura).
Se consideró una investigación en la extracción de enzima a partir de harina de soja a pH y tampón de extracción (1:10 p/v carga de harina de soja) (Tabla 7) y se llevó a cabo en paralelo con las investigaciones de ensayo coloriométricas.
Tabla 7. Condiciones de extracción de lipoxigenasa iniciales (tampón, pH, temperatura=_____
Tampón, pH inicial
pH de extracto final Temperatura (°C)
Acetato sódico, pH 10
6,8 4
ambiente
Acetato sódico, pH 4,5
5,2 4
ambiente
Borato de sodio, pH 10,4
10,1 4
ambiente
Borato de sodio, pH 4,5
6,1 4
ambiente
Agua, pH 7
6,8 4
ambiente
El pH de estas soluciones de extracto se analizó y se encontró que el tampón de borato de sodio a pH 4,5 tenía un pH de 6,1 con harina de soja añadida. Tampón de acetato sódico, pH 10 tenía un pH de 6,8 con harina de soja añadida y el pH de un extracto de agua pura fue también de 6,8. Esto se corresponde con el intervalo de tampón de
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pH de los tampones de borato (8-10) y acetato (3,6-5,6). Tampón de acetato sódico, pH 4,5 se cambió a pH 5,2 con harina de soja añadida.
Las proteínas pueden dañarse por la fricción como la causada por los agitadores magnéticos. El siguiente conjunto de extracción se llevó a cabo en tubos de centrifugado de 50 ml en agitadores orbitales con temperatura controlada. Se configuró una cantidad de reacciones a diversos pH y temperaturas y se analizó en 3 puntos de tiempo; 1, 2 y 14 horas y 3 temperaturas 5, 25 y 40 °C. Los resultados de ensayo (determinados por decoloración azul de metileno en las condiciones menos discriminatorias (300 pl de solución enzimática)) se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8. Lecturas de absorbancia a 680 nm para extractos de harina de soja después de 1 hora
Tampón, pH inicial
Temperatura (°C) Absorbancia (680 nm) en punto de tiempo t (minutos)
t=0
t=1 t=2 t=3 t=4 t=5 t=6
Acetato sódico, pH 4,5
5 0,32 0,06 - - - - -
25
0,28 0,01 - - - - -
40
0,30 0,02 - - - - -
Borato de sodio, pH 9,0
5 0,26 -0,01 - - - - -
25
0,27 0,01 0,00 - - - -
40
0,28 0,04 0,01 - - - -
Fosfato de potasio monobásico pH 6,5
5 0,34 0,06 - - - - -
25
0,27 -0,01 - - - - -
40
0,25 -0,03 - - - - -
Tabla 9. Lecturas de absorbancia a 680 nm para extractos de ^ harina de soja después de 2 horas
Tampón, pH inicial
Temperatura (°C) Absorbancia (680 nm) en punto de tiempo t (minutos)
t=0
t=1 t=2 t=3 t=4 t=5 t=6
Acetato sódico, pH 4,5
5 0,23 0,01 - - - - -
25
0,26 0,02 - - - - -
40
0,21 -0,02 - - - - -
Borato de sodio, pH 9,0
5 0,26 0,02 - - - - -
25
0,27 0,07 0,02 - - - -
40
0,23 0,19 0,10 0,06 0,04 0,03 0,02
Fosfato de potasio monobásico pH 6,5
5 0,34 -0,01 - - - - -
25
0,32 0,08 - - - - -
40
0,27 0,03 - - - - -
Tabla 10. Lecturas de absorbancia a 680 nm para extractos de harina de soja después de 14 horas
Tampón, pH inicial
Temperatura (°C) Absorbancia (680 nm) en punto de tiempo t (minutos)
t=0
t=1 t=2 t=3 t=4 t=5 t=6
Acetato sódico, pH 4,5
5 0,34 0,06 - - - - -
25
0,33 0,04 - - - - -
40
0,30 -0,01 - - - - -
Borato de sodio, pH 9,0
5 0,30 0,01 0,01 - - - -
25
0,33 0,22 0,11 0,06 0,03 - -
40
0,32 0,28 0,28 0,28 0,28 0,27 -
Fosfato de potasio monobásico pH 6,5
5 0,30 0,00 - - - - -
25
0,28 0,00 - - - - -
40
0,27 -0,02 - - - - -
Mediante la comparación de estos resultados con los resultados de la serie de dilución de enzima purificada (Tabla 2) se determinó que > 0,105 Munidades de actividad enzimática/ml se extrajo a partir de la harina de soja sobre el intervalo de pH estudiado. Esto es % de la actividad enzimática (0,41 Munidades/ ml de mezcla de reacción) utilizada en la síntesis de 500 g de lote tox. Parecería que a un pH 9,0, la extracción a 25 y 40 °C reduce la actividad enzimática, volviéndose evidente después de 2 horas de tiempo de extracción. En los valores de pH inferiores de 4,5 y 6,5, la extracción a elevadas temperaturas no tiene un efecto determinable en estas condiciones.
Las muestras de extracción de 14 horas se agitaron durante un fin de semana con las condiciones apropiadas y se analizaron, como antes (Tabla 11).
Tabla 11. Lecturas de absorbancia a 680 nm para extractos de harina de soja durante fin de semana
Tampón, pH inicial
Temperatura (°C) Absorbancia (680 nm) en punto de tiempo t (minutos)
t=0
t=1 t=2 t=3 t=4 t=5 t=6
Acetato sódico, pH 4,5
5 0,36 0,00 - - - - -
25
0,37 -0,02 - - - - -
40
0,37 -0,01 - - - - -
Borato de sodio, pH 9,0
5 0,36 0,21 0,10 0,04 0,01 0,00 -
25
0,37 0,34 0,33 0,34 0,34 - -
40
0,37 0,33 0,34 0,34 0,34 0,36 -
Fosfato de potasio monobásico pH 6,5
5 0,39 0,00 - - - - -
25
0,37 -0,01 - - - - -
40
0,41 0,02 - - - - -
La única noticia evidente fue una reducción en la actividad del extracto de borato de pH 9,0 a 5 °C. También se observó que un extracto filtrado (pH 4,5) se dejó erguido a temperatura ambiente durante el fin de semana no mostró 5 una caída significante en la actividad según se determinó mediante el método de decoloración azul de metileno.
Se realizaron extracciones adicionales a pH 4,5 y 6,5 (carga de 1: 5 p/v harina de soja) y a temperatura de 30 °C (Tabla 12). Las soluciones de extracto se analizaron usando las condiciones más sensibles (30 jl de solución enzimática) (cf. Tabla 4).
10
Se observó que el sobrenadante de la solución de extracción de pH 4,5 fue menos turbio que los obtenidos en tanto pH 6,5 como 9,0.

Claims (29)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Un proceso para la producción de derivado 15-hidroxi de ácidos grasos de comprende la oxidación enzimática de ácido graso con una atmósfera de oxígeno presurizado de al menos 200 kPa (2 bar) para formar un intermediario de ácido 15-hidroperoxi graso; y reducir al menos una parte del intermediario de ácido 15-hidroperoxi graso usando cisteína como agente reductor.
  2. 2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de oxidación comprende poner el contacto el ácido graso con menos de 400 Munidades de enzima por gramo del ácido graso.
  3. 3. El proceso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el rendimiento del derivado 15-hidroxi del ácido graso es de al menos el 50 %.
  4. 4. El proceso de cualquier reivindicación anterior, en el que el derivado 15-hidroxi es 15(S)-HETrE.
  5. 5. El proceso de cualquier reivindicación anterior en el que el ácido graso comprende DGLA.
  6. 6. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el derivado 15-hidroxi es ácido 15(S)- hidroxieicosapentaenoico.
  7. 7. El proceso de cualquier reivindicación anterior que comprende no menos de 100 kg del ácido graso, preferentemente no menos de 250 kg del ácido graso y más preferentemente no menos de 500 kg del ácido graso.
  8. 8. El proceso de cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa de oxidación comprende poner en contacto al ácido graso con un extracto de harina de soja.
  9. 9. El proceso de la reivindicación 8 que comprende adicionalmente:
    poner en contacto harina de soja con una solución tampón a pH 4,5 para producir un extracto de harina de soja crudo; y filtrar el extracto de harina de soja crudo para producir el extracto de harina de soja.
  10. 10. El proceso de la reivindicación 9, en el que el extracto de harina de soja tiene una actividad comparable a 2 mg/ml de enzima lipoxigenasa liofilizada purificada.
  11. 11. El proceso de cualquier reivindicación anterior, en el que la presión de oxígeno positiva es de al menos 250 kPa (2,5 bar).
    imagen1
    Serie de dilución de ensayo de decoloración azul de metileno
    0,40
    0,35
    0,30
    0,25
    ♦ 0,42 Mumdades/ml
    0,20
    0,21 Mumdades/ml
    A 0.105 Mumdades/ml
    0,15
    •0,053 Mumdades/ml
  12. 0.10
    2 "1
    0,05
    0,00
    -0,05
    Tiempo (minutos)
    Figura 1.
    Coste enzimático por 100 kg de DGLA
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    Extracto de harina de soja frente a enzima hofihzada
    0t35
    E °,25
    Enzima liofilizada
    (2,06 mg/ml)
    pH 4,5 de extracto de harina
    Tiempo (minutos)
    Figura 4.
    pH 4,5 de extracto de harina
    imagen5
    imagen6
    i,ooh
  13. 0.80'
    0,60‘
    0,20'
    1 9 §8 SI___
    1 ¡ m i_____l _
    Minutos
    TA Área % de área Altura
    1
    4,092 14319 0,02 491
    2
    5,289 53747 0,08 2621
    3
    9,222 107649 0,15 2119
    4
    12,669 94624 0,14 3424
    5
    18,228 23069 0,03 602
    6
    18,919 12393 0,02 234
    7
    21,111 249313 0,36 6240
    8
    30,493 67406888 96,41 959958
    9
    33,883 354403 0,51 6300
    10
    35,783 715188 1,02 7234
    11
    39,384 26625 0,04 352
    12
    48,076 380127 0,54 4002
    13
    63,450 39368 0,06 4560
    14
    63,494 49344 0,07 6471
    15
    63,772 36364 0,05 8674
    16
    63,832 57090 0,08 9174
    17
    64,061 80214 0,11 14865
    18
    64,161 60291 0,09 10040
    19
    64,304 60926 0,09 6320
    20
    64,867 82115 0,12 11808
    21
    65,250 11170 0,02 1124
    Figura 6.
    imagen7
    0,30r
    0,60:
    <
    Z> 0,40'
    0,20'
    0,00:
    i IJÜ l 1
    _ ' S» i—i—■ [«S»
    iiftan n----------rt----------•
    ----^ *----------------V------*-------------------------------------------------
    10,00
    20,00
    30,00
    40,00
    50,00
    60,00
    70,00
    80,00
    Minutos
    TA Área % de área Altura
    1
    2,993 46635 0,07 1070
    2
    4,832 11147 0,02 531
    3
    5,289 97308 0,14 4943
    4
    7,750 18570 0,09 515
    5
    9,182 258621 0,38 5446
    6
    12,690 17486 0,03 633
    7
    21,123 285590 0,42 7095
    8
    30,547 65793189 96,07 926358
    9
    33,852 378341 0,55 5501
    10
    35,250 233040 0,34 2799
    11
    36,883 72403 0,11 1723
    12
    48,090 627126 0,92 6544
    13
    63,417 68262 0,10 9218
    14
    63,476 116763 0,17 10406
    15
    63,764 125990 0,18 15052
    16
    64,048 77996 0,11 13171
    17
    64,150 40038 0,06 6405
    18
    64,328 44133 0,06 4723
    19
    64,866 156552 0,23 24257
    20
    65,283 16740 0,02 1013
    Figura 7.
    imagen8
    VELOCIDAD DE AUTOCALENTAMIENTO (°C/min.)
    i r r / i------r - i i i
    1 1 1 1 f 1 1 1 T....r -r- -r-r-T-r TTTTTTTrr
    4 ----------------------------------------------------4 i
    V*...
    .............4...................
    i
    1 t-4—* _L_ 1 .1 1 1...1....LJ-.I-1
    0 30 60 90 120 150
    Figura 9.
    PRESION (psia)
    imagen9
    Figura 10.
    VELOCIDAD DE AUTOCALENTAMIENTO (°C/min.)
    imagen10
    Temperatura (°C)
    Figura 11.
    PRESION (psia)
    imagen11
    Figura 12.
    4^
    O
    imagen12
    imagen13
    Punto de tiempo
    % de área de pureza (252 nm) % de área de dímero Máximo de impureza a TA ~12,2 min.
    T=0
    97,2 0,44
    T=1 h
    97,2 0,44
    T-2 h
    97,3 0,44
    T=3 h
    97,2 0,44
    T=4 h
    97,2 0,44
    T=6 h
    97,1 0,44
    T=24 h
    97,4 0,49
    T=48 h
    97,5 0,49
    T= 66 h
    97,4 0,52
    T=112h
    97,4 0,64
    Figura 15,
    imagen14
    imagen15
    DMU * ASfcOSM RTB_18fl1_08l_6Djd
    *10*
    fljMa*
    SShmS»
    JSMltt
    10 1Ó3 1J 1Í,S 12 1ÍÍ 13 1¿5
    Unidades de respuesta {%) frente a tiempo de adquisición (min.
    Lista de máximo de integración
    A tura
    % de a rea
    Inicio
    Area
    6407
    02*
    6407
    2612,1
    529*4
    9»,$2
    6*17
    7J73
    7487
  14. 7.367
    7,«3
  15. 31.99
    7*73
    7,793
    442
    1841
    0*9
    7387
    3349
    7,933
    13*3
    9,453
  16. 19.55
    9,567
    57,11
    297,1
    WU
    34632
    9*13
    *407
    9,707
    99*9
    9,793
    9,927
    355,17
    2624,7
    9,707
    loo
    9,999
    10,087
    97,14
    597,14
    20,47
    9,927
    10*67
    10,147
    24,79
    13641
    7246
    319*5
    10467
  17. 138.75
    10417
    10,467
    96*7
    10*8
    10*6
    10*1
    11,487
    20,75
    11413
    17*6
    66,72
    12*47
    12407
    12487
    12453
    12*13
    12*33
    8,18
    16*6
    0*3
    12*67
    12,767
    12*4
    12,907
    7,39
    028
    Figura 17.
    imagen16
    i,4 mlt
    1H6404
    DAD1 - AcSig-252,4 rVTB „1891_051_7A.d
  18. 625.4 nVi
    mezcla
    311,2 m* 319,2iwfijp C40H66OS
    325,2 m/z 339,2
  19. 353.2 m/z
    mezcla 325,2 y 409,1 m/z353,2m/z
    C20H34O5
    B^/
    mezcla 325,2 y 409,1 m/z £12*/
    319,2 m/z
    j -
    p C20H3203
    Unidades de respuesta (% frente a tiempo de adquisición (min.)
    Lista de máximo de
    ntegracion
    Altura
    Area
    nicio
    % de area
    4,31
    27,01
    0,12
    4,56
    40,9
    186,89
    6,213
    2081,9
    21775,56
    6,333
    10,74
    49,57
    7,32
    7,453
  20. 7.43
  21. 53.98
    179,99
    10,133
  22. 10.253
    10,34
    6,24
    30,69
    11,347
    38,12
    135,07
    40,41
    12,147
    12,22
    Figura 18.
    imagen17
  23. 3.5 3
  24. 2.5
    2
    1.5
    1
    0,5
    0
    Unidades de respuesta (%) frente a tiempo de adquisición (min.)
    Lista de máximo de integración
    Inicio
    TA Fin Altura Área % de área
    5,373
    5,513 5,62 1,08 5,14 a04
    5,7
    5,78 5,873 3,16 13,98 0,11
    6,22
    6,3 6,393 28,16 122,96 1
    6,773
    6,88 7,127 1577,2 12310,66 loo
    7,127
    7,193 7,413 24,49 150,72 1,22
    7,56
    7,66 7,773 14,3 62,65 0,51
    10,293
    10,353 10,453 7,27 26,17 0,21
    10,487
    10,54 10,613 9,04 32,05 0,26
    11,073
    11,133 11,187 4,9 14,74 0,12
    11,207
    11,3 11,353 31,89 144,96 1,18
    11,353
    11,353
    11,46 19,22 67,5 0,55
    11,507
    11,56 11,613 12,82 43,51 0,35
    12,053
    12,2 12,247 15,64 72,73 0,59
    Figura 19.
    DAD1 - A:Siff=252,4 RTB_1891_051_6E.d
    3Z1
    nvz
    21,2
    20H
    95»,<9 mfe
  25. 583.47 mtt
    319 2 miz
    1-13403
    C4GH6807
    CI0H32O3
  26. 537.4 mít
    419,4 mil
  27. 941.48 mil
    CI7H4803
    C40HMO8
    No Mwcutóto
    TIC
  28. 48 .4 inte
    C29H5004
    _ «26,4* mk
    C40HWO8
    3232 mft
  29. 337.2 nVt
    C20H3803
    C20H34O4
    imagen18
    imagen19
    m/z
    Caíc m/z Orff {ppm) £ Abura! Fórmula
    221,1552
    1 51347
    222,1586
    1 8394
    310,2329
    1 87TtoS
    304,2371
    1 21094
    321,2444
    1 65635
    322,2475
    1 15864
    221,1552
    221,1547 ■24» 1 51347 CI4 H2I 02
    222,1586
    i 9394
    3104329
    103433 -3JI1 1 87005 C20H3I02
    304,2371
    1 21094
    3214444
    321,2435 i,73 1 65635 C20M33O3
    3224*75
    1 15864
    Figura 21.
    -ESí Escaneo <*2.340-12,438 min. 13Escena)Fi»Q»l»4V«TB22M Resta [PM* *
    *10 *
    I SI s
    i sis
    i ^ s
    700 ¿0 <¿0 1000 libo *2ÓO 1300 1400 1SOO 1¿0
    Recuentos frente a masa respecto a carga (m/z)
    Espectro MS/MS
    Cpd « C40 MM 06 -€Sl lón producto (12,442-1^570
    6 Escena) FnaQHSMV CIO03OJD (62S4l.
    K10<
    Recuentos frente a masa respecto a carga (m/z)
    Lista de máximo de espectro MS/MS
    imagen20
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1088058C (zh) * 1994-10-13 2002-07-24 肽技术有限公司 经修饰的多不饱和脂肪酸
US20040122126A1 (en) * 2002-12-20 2004-06-24 Dong Wu Free-radical initiator systems containing enzymes, compositions, and methods
US7893106B2 (en) * 2004-11-19 2011-02-22 Martek Biosciences, Corporation Oxylipins from stearidonic acid and γ-linolenic acid and methods of making and using the same
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