ES2666204T3

ES2666204T3 - Terapia génica

Info

Publication number: ES2666204T3
Application number: ES16788764.5T
Authority: ES
Inventors: Christian Groendahl; Tim FUNNELL; Chris HOLLOWOOD
Original assignee: Syncona Investment Management Ltd
Current assignee: Syncona Investment Management Ltd
Priority date: 2015-10-28
Filing date: 2016-10-27
Publication date: 2018-05-03
Anticipated expiration: 2036-10-27
Also published as: JP7126944B2; AU2022203675B2; DK3360890T3; IL284577B2; RU2740038C2; DK3262066T4; GB201519086D0; MX366343B; EP3262066B1; JP2022141670A; RU2018118954A; NO3262066T3; EP3262066A1; EP3262066B2; US20250319210A1; US20230277689A1; PL3262066T3; ZA201802462B; IL258806B; EP3786176A1

Abstract

Un vector de virus adenoasociado (VAA) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el Factor I o un fragmento del mismo, en donde el fragmento es capaz de escindir C3b en iC3b.

Description

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Figura 11

Localización de hFCI en ojos inyectados con simulación (A-C) VAA.FCI (D-F): mayor aumento de capas de fotorreceptores. Las secciones retinianas se marcaron doblemente con fibronectina (A y D) y hFCI (B y E). Los núcleos se tiñeron con DAPI y se muestran en superposición (C y F). MFI: Matriz de fotorreceptor interna, SE: Segmento externo, SI: Segmento interno, CNE: Capa nuclear externa. Aumento: 189X, Barra de escala: 10 µm.

Figura 12

Localización de hFCI en ojos inyectados con simulación (A-C) VAA.FCI (D-F): mayor aumento de la capa plexiforme externa (CPE). Las secciones retinianas se marcaron doblemente con fibronectina (A y D) y hFCI (B y E). Los núcleos se tiñeron con DAPI y se muestran en superposición (C y F). CNE: Capa nuclear externa, CNI: Capa nuclear interna. Aumento: 189X, Barra de escala: 10 µm. La tinción de células horizontales se representa con flechas.

Figura 13

Localización de hFCI en ojos inyectados con simulación (A-C) VAA.FCI (D-F): mayor aumento de la capa de células ganglionares (CCG). Las secciones retinianas se marcaron doblemente con fibronectina (A y D) y hFCI (B y E). Los núcleos se tiñeron con DAPI y se muestran en superposición (C y F). CPI: Capa plexiforme interna, CFN: Capa de fibra nerviosa. Aumento: 189X, Barra de escala: 10 µm.

Figura 14

Localización de hFCI en ojos inyectados con simulación (A-C), VAA.FCI (D-F) y VAA.FCIoc (G-H). El epitelio pigmentario retinal completo se marcó doblemente con fibronectina (A, D y G) y hFCI (B, E y H). Aumento: 40X, Barra de escala: 30 µm.

Descripción detallada de la invención

Sistema del complemento

El sistema del complemento es una parte integral del sistema inmunológico humoral y está implicado en la inflamación de tejidos, la opsonización celular y la citolisis. Proporciona protección frente a microorganismos y media la eliminación de restos celulares exógenos y endógenos de los tejidos del hospedador.

La cascada del sistema del complemento está comprendida por cuatro rutas de activación. Todas las rutas finalmente terminan en la escisión central del factor C3 y en la generación de sus fragmentos activos C3a y C3b. C3a es la anafilotoxina que desencadena un intervalo de respuestas quimiotácticas y proinflamatorias, tales como el reclutamiento de células inflamatorias y el aumento de la permeabilidad de la microvasculatura, mientras que C3b es responsable de la opsonización de superficies extrañas unidas covalentemente a C3b. La opsonización con los fragmentos activados de C3 (C3b e iC3b) realiza tres funciones principales: (i) la eliminación de restos celulares mediante células fagocíticas (por ejemplo, macrófagos o células de la microglía) y la estimulación del sistema inmunológico adaptativo (linfocitos B y linfocitos T); (ii) la amplificación de la activación del complemento mediante la formación de C3 convertasa unida a la superficie; y (iii) el ensamblaje de C5 convertasa.

El ensamblaje de C5 convertasa es responsable de la escisión de C5, lo que da como resultado la formación del complejo de ataque citolítico a la membrana (MAC, del inglés membrane attack complex) capaz de generar perforaciones en la membrana celular, promoviendo así la lisis celular y la eliminación de células innecesarias. A través de todas estas actividades, la cascada innata del complemento mantiene y promueve la función de mecanismos de aguas abajo del sistema inmunológico que protege la integridad del tejido del hospedador. En su conjunto, la activación de la ruta del sistema del complemento da como resultado una respuesta proinflamatoria, incluyendo la generación de MAC, que media la lisis celular, la liberación de quimiocinas para atraer células inflamatorias al sitio del daño y la mejora de la permeabilidad capilar para promover la extravasación de leucocitos infiltrantes. En condiciones fisiológicas, la activación del complemento se controla de forma eficaz por la acción coordinada de moléculas reguladoras del complemento (MRC) solubles y asociadas a la membrana. Los reguladores solubles del complemento, tales como el inhibidor de C1, el inhibidor de anafilotoxinas, la proteína de unión a C4b (C4BP, del inglés C4b binding protein), el factor del complemento H(FCH), el factor del complemento I (FCI), la clusterina y la vitronectina, restringen la acción del complemento en tejidos humanos en diferentes sitios de la reacción en cascada. Además, cada célula individual se protege frente al ataque del complemento homólogo mediante proteínas de la superficie, tales como el receptor del complemento 1 (RC1, CD35), la proteína del cofactor de membrana (CD46) y las proteínas ancladas por glucosilfosfatidilinositol, tales como el factor de aceleración de la desintegración (CD55) o la molécula CD59. Cabe destacar que, las células hospedadoras y los tejidos protegidos inadecuadamente del ataque del complemento se pueden someter a lisis celular por vecindad.

La presente divulgación se refiere al tratamiento o a la prevención de un trastorno ocular mediado por el complemento. Por ejemplo, el trastorno mediado por el complemento puede ser un trastorno asociado a un defecto

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Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica el Factor H es la secuencia de nucleótidos que tiene el número de registro del NCBI NM_000186. En una realización de la divulgación, la secuencia de nucleótidos que codifica el Factor H es la secuencia de nucleótidos que tiene el número de registro del NCBI NM_000186.

En una realización de la divulgación, la secuencia de nucleótidos que codifica el Factor H es la secuencia de nucleótidos mostrada como la SEQ ID NO: 4.

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durante los 12 meses tras la administración a un ojo tratado de un sujeto, en relación con un ojo sin tratar durante el mismo período. En otra realización, el tratamiento o la prevención de DMAE da como resultado el tratamiento de atrofia geográfica, por ejemplo, una reducción en la cantidad de atrofia geográfica.

En una realización, el tratamiento o la prevención de DMAE da como resultado una prevención de o la reducción en la formación de drusas. En otra realización, el tratamiento o la prevención de DMAE da como resultado una reducción de las drusas existentes, por ejemplo, una reducción en el tamaño y/o en el número de drusas existentes.

En una realización, el tratamiento o la prevención de DMAE da como resultado una prevención de o la reducción en la deposición del complemento. En otra realización, el tratamiento o la prevención de DMAE da como resultado una reducción de la deposición del complemento existente.

En una realización, el tratamiento o la prevención de DMAE da como resultado una mejora en o la restauración de la visión o de la agudeza visual. En otra realización, el tratamiento o la prevención de DMAE mitiga la pérdida de visión

o de agudeza visual.

En una realización, el tratamiento o la prevención de DMAE da como resultado una mejora en o la restauración de la velocidad de lectura en un sujeto. En otra realización, el tratamiento o la prevención de DMAE mitiga la reducción en la velocidad de lectura en un sujeto.

En una realización, el tratamiento o la prevención de DMAE da como resultado una reducción o la prevención de pérdida de fotorreceptores y/o del epitelio pigmentario retinal (EPR).

Retinopatía diabética

La retinopatía diabética es una afección caracterizada por un daño a los vasos sanguíneos de la retina, que es causado por los altos niveles de azúcar en sangre asociados a la diabetes. Si no se trata, la retinopatía diabética puede provocar ceguera.

Aunque los sujetos con retinopatía diabética leve pueden tener buena visión, dos tipos de retinopatía diabética, llamados edema macular diabético (EMD) y retinopatía diabética proliferativa (RDP) pueden poner en riesgo la visión del sujeto.

El edema macular diabético se caracteriza por la filtración de líquido de los vasos sanguíneos dañados en la parte posterior del ojo. El líquido filtrado se acumula en la mácula, lo que lleva a inflamación y a visión borrosa. Esto puede ocasionalmente dar lugar a una mala visión y a una incapacidad para leer o conducir. La visión lateral normalmente permanece normal.

La retinopatía diabética proliferativa se caracteriza por el cierre de los vasos sanguíneos retinianos, lo que lleva al crecimiento de vasos sanguíneos frágiles y anómalos sobre la superficie de la retina. Esto puede dar como resultado una pérdida de visión permanente debido a la hemorragia en el ojo, esclerosis retiniana y desprendimiento de retina.

Estructura del ojo

Los medicamentos desvelados en el presente documento se pueden administrar a un ojo de mamífero, preferentemente de ser humano en relación al tratamiento o la prevención de degeneración macular asociada a la edad (DMAE).

El experto en el tratamiento de oftalmopatías tendrá un entendimiento detallado y completo de la estructura del ojo. Sin embargo, se describen las siguientes estructuras de particular relevancia para la invención.

Retina

La retina es la membrana multilaminar, que recubre la cámara posterior interna del ojo y detecta una imagen del mundo visual que se comunica al cerebro a través del nervio óptico. En orden desde el interior hasta el exterior del ojo, la retina comprende las capas de retina neurosensorial y epitelio pigmentario retinal, con la coroides que yace fuera del epitelio pigmentario retinal.

Retina neurosensorial y células fotorreceptoras

La retina neurosensorial alberga las células fotorreceptoras que detectan directamente la luz. Comprende las siguientes capas: membrana limitante interna (MLI); capa de fibra nerviosa; capa de células ganglionares; capa plexiforme interna; capa nuclear interna; capa plexiforme externa; capa nuclear externa (núcleos de los fotorreceptores); membrana limitante externa (MLE); y fotorreceptores (segmentos internos y externos de los bastones y conos).

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Los promotores preferidos, que son específicos de células no retinianas, incluyen el promotor de actina beta de pollo (ABP), opcionalmente en combinación con un elemento potenciador de citomegalovirus (CMV). Un ejemplo de promotor para su uso en la invención es un promotor de CAG, por ejemplo, el promotor usado en el casete de expresión rAVE (GeneDetect.com). Un ejemplo adicional de promotor para su uso en la invención tiene la secuencia:

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En una realización, el vector de VAA comprende un promotor con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.

10 En otra realización, el vector de VAA comprende un promotor con una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 5, en donde la secuencia de nucleótidos mantiene sustancialmente la actividad funcional del promotor representado por la SEQ ID NO: 5.

15 Los ejemplos de promotores basados en las secuencias humanas que inducirían la expresión génica específica de la retina incluyen rodopsina cinasa para bastones y conos (Alloca et al. (2007) J. Virol. 81: 11372-80), PR2.1 solo para conos (Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7) y/o RPE65 (Bainbridge et al. (2008) N. Engl. J. Med. 358: 2231-9) o VMD2 (Esumi et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 19064-73) para el epitelio pigmentario retinal.

20 El vector de VAA de la invención también puede comprender uno o más secuencias reguladoras adicionales que puedan actuar antes o después de la transcripción. La secuencia reguladora puede ser parte del locus natural del transgén o puede ser una secuencia reguladora heteróloga. El vector de VAA de la invención puede comprender partes de la 5'-UTR o de la 3'-UTR del tránscrito natural del transgén.

25 Las secuencias reguladoras son cualquier secuencia que facilite la expresión del transgén, es decir, que actúa para aumentar la expresión de un transcrito, mejora la exportación nuclear de ARNm o mejora su estabilidad. Tales secuencias reguladoras incluyen, por ejemplo, elementos potenciadores, elementos reguladores postranscripcionales y sitios de poliadenilación. Un sitio de poliadenilación preferido es la señal poli-A de hormona de crecimiento bovino que puede ser como se muestra a continuación:

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En una realización, el vector de VAA comprende un sitio de poliadenilación con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6. En otra realización, el vector de VAA comprende un sitio de poliadenilación con una secuencia de

35 nucleótidos quetieneal menos un 70 %, un80 %, un 90 %, un 95%, un96 %, un97%, un 98 %, un 99 % o un 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 6, en donde la secuencia de nucleótidos mantiene sustancialmente la actividad funcional del sitio de poliadenilación representado por la SEQ ID NO: 6.

En el contexto del vector de VAA de la invención, tales secuencias reguladoras estarán actuando en cis. Sin 40 embargo, la invención también abarca el uso de secuencias reguladoras que actúan en trans localizadas sobre construcciones genéticas adicionales.

Un elemento regulador postranscripcional preferido para su uso en un vector de VAA de la invención es el elemento regulador postranscripcional de hepatitis de marmota (WPRE) o una variante del mismo. A continuación, se muestra 45 una secuencia de ejemplo del WPRE:

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La Figura 7 muestra la expresión de la proteína del FCI de las muestras agrupadas analizada mediante inmunotransferencia. El FCI se expresa a niveles detectables a todas las dosis y a partir de VAA.IFC y VAA.IFCoc. La actina β se cargó como un control de la carga. 7A: se cargaron 40 µg de lisado de proteína en condiciones reductoras y se detectó el FCI con un antisuero policlonal de cabra para el FCI humano. El FCI se detectó como 80 kDa (proenzima), 50 kDa (procesado; cadena pesada) y 35 kDa (procesado; cadena ligera). Estas bandas se corresponden con el tamaño esperado de FCI y confirman el procesamiento, es decir, la presencia de las cadenas pesada y ligera. 7B: También se cargó la misma cantidad de lisado de proteína para muestras de lisado de ojos inyectados con 109cg/ojo de VAA.FCIoc u ojos no inyectados. El FCI se detectó con un monoclonal de ratón para FCI (izquierda, gel no reductor) y antisuero de cabra para FCI (derecha, gel reductor). El gel no reductor (izquierda) detecta FCI como una banda a 75 kDa en animales inyectados y no se detectan bandas en los animales no inyectados. En el gel reductor (derecha), el FCI aparece como 80 kDa (proenzima), 50 kDa (procesado; cadena pesada) y 35 kDa (procesado; cadena ligera).

Preparación de muestras del tejido para análisis de expresión génica

Los ratones se sacrificaron tal como se describe anteriormente y se dejaron intactas las cúpulas ópticas posteriores

o se separó la retina y el EPR tal como se describe anteriormente. Las muestras de tejido se pusieron inmediatamente en tubos estériles que contienen RNALater (Thermo Fisher Scientific). Las muestras se mantuvieron a 4 °C hasta el procesamiento posterior. El ARN se aisló usando el mini kit RNeasy (Qiagen) y se homogeneizó el tejido usando el mortero en tampón RLT (proporcionado con el kit). Se añadió un tratamiento complementario con DNasa sin RNasa (Qiagen) para asegurar la ausencia de ADN genómico. Se retrotranscribieron 100 ng de ARN a ADNc usando el kit de síntesis de primera hebra Superscript III (Thermo Fisher Scientific). Tras la retrotranscripción, la reacción se lavó usando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen). Se llevó a cabo una PCRq sobre ADNc de un ojo por condición (simulación, FCI a 107cg/ojo, FCI a 10 8cg/ojo, FCIoc a 107cg/ojo y FCIoc a 108cg/ojo) usando un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX Connect™ (Bio-Rad). Se usaron 1,25 ng de ADNc por pocillo como molde para las reacciones de PCRq con una mezcla de SYBR green master (iTaq Universal SYBR Green Supermix, Bio Rad). Cada condición se realizó por triplicado; los valores de Ct se obtuvieron usando el programa informático proporcionado. El análisis comparativo de ΔΔCt con actina beta de ratón como gen constitutivo se usó para determinar la expresión relativa de FCI para controles de simulación.

La Figura 8 muestra el análisis de expresión génica mediante PCRq. Tal como se esperaba, no hubo expresión de FCI o FCIoc de humano en ratones con inyección de simulación. Dado que solo se analizó un ojo por condición, no se pudieron realizar análisis estadísticos. FCI se expresa a partir de ambas construcciones de VAA y la expresión aparentemente tiene lugar predominantemente en el EPR, sin embargo, la inyección de 108cg/ojo lleva a una elevada expresión de ARNm del FCI en el tejido retiniano. En la muestra de la cúpula óptica, la cantidad de ARNm del IFC para el ARNm total de la cúpula óptica se espera que sea más pequeña que en solo EPR, porque muchas áreas del ojo no tendrán expresión de FCI; esto se refleja mediante los resultados.

Preparación de secciones retinianas para inmunohistoquímica

Los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical (4 semanas después de la inyección). Los ojos se extirparon y se prepararon tal como sigue. Se hizo un orificio justo detrás de la ora serrata y el globo ocular se colocó en paraformaldehído al 4 % en tampón fosfato 0,12 M, a pH 7,2 durante 1 hora a temperatura ambiente. Los inventores entonces retiraron el segmento anterior y la lente y prepararon el ojo para secciones o montaje completo. Las cúpulas ópticas usadas para secciones se crioconservaron con concentraciones en aumento de sacarosa en tampón fosfato 0,12 M, a pH 7,2 (10 % durante 1 hora a temperatura ambiente y el 30 % durante toda la noche a +4 °C), introducidas den OCT (Tissue-tek, Sakura Finetek USA inc, Ca, EEUU) y se congelaron en un molde a -80 °C. Las secciones se cortaron a un espesor de 10 µm sobre un criostato y se montaron en portaobjetos de cristal (Super-Frost, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos). Los portaobjetos se secaron al aire durante 2 horas a temperatura ambiente y se almacenaron a -80 °C. Para las cúpulas ópticas usadas para los montajes completos, la retina y el EPR/coroides se separaron retirando suavemente la retina del EPR y almacenándolos por separado en PBS a +4 °C.

Inmunotinción

Las secciones se bloquearon y se impermeabilizaron mediante incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos en solución PBSGT(gelatina al 0,2 % (p/v), Triton X-100 al 0,25 % (v/v) en PBS). Los montajes completos se bloquearon y se impermeabilizaron mediante incubación a temperatura ambiente durante 2 horas en gelatina al 0,2 % (p/v), Triton X-100 al 1,5% (v/v) en PBS. Posteriormente, las secciones y los montajes completos se incubaron con anticuerpos primarios (véase la Tabla 1) diluidos en solución PBSGT toda la noche a temperatura ambiente. Tras el lavado en solución de PBST (Triton X-100 al 0,1 % (v/v) en PBS), las secciones y los montajes completos se incubaron con anticuerpos secundarios acoplados a Alexa Fluor594 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EEUU) a una dilución de 1:5000 y se tiñeron con DAPI en solución PBSGT durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron con solución PBST y posteriormente se recubrieron con medio de montaje (Mowiol, Merck Millipore).

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