ES2666132T3 - Medio de detección de microorganismos que comprende al menos un alquil(tio)glucósido - Google Patents
Medio de detección de microorganismos que comprende al menos un alquil(tio)glucósido Download PDFInfo
- Publication number
- ES2666132T3 ES2666132T3 ES13824628.5T ES13824628T ES2666132T3 ES 2666132 T3 ES2666132 T3 ES 2666132T3 ES 13824628 T ES13824628 T ES 13824628T ES 2666132 T3 ES2666132 T3 ES 2666132T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- medium
- microorganisms
- activity
- esterase
- medium according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 78
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 title claims abstract description 44
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 title description 37
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 title description 35
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 title description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 79
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 78
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 41
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims abstract description 25
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 20
- 102000005262 Sulfatase Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims abstract description 8
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 5
- 235000019830 sodium polyphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 80
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 40
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 40
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 32
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 27
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- PCKPVGOLPKLUHR-UHFFFAOYSA-N indoxyl Chemical group C1=CC=C2C(O)=CNC2=C1 PCKPVGOLPKLUHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 16
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 15
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 claims description 11
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 claims description 3
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 claims description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 3
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 claims description 3
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 2
- 241000501667 Etroplus Species 0.000 claims 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims 1
- 229910001179 chromel Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 claims 1
- HEGSGKPQLMEBJL-UHFFFAOYSA-N n-octyl beta-D-glucopyranoside Natural products CCCCCCCCOC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HEGSGKPQLMEBJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 abstract 1
- -1 osidases Proteins 0.000 description 26
- HSJKGGMUJITCBW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutanal Chemical class CC(O)CC=O HSJKGGMUJITCBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N (2r,3s,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-octoxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound CCCCCCCCOC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N 0.000 description 17
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 14
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 12
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 12
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 12
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 11
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 11
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 10
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 10
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 244000034356 Aframomum angustifolium Species 0.000 description 7
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N Alizarin Natural products C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000392514 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin Species 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 5
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 5
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 4
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 4
- 241000607128 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis Species 0.000 description 4
- 241001282571 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Tennessee Species 0.000 description 4
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 4
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RUFPHBVGCFYCNW-UHFFFAOYSA-N 1-naphthylamine Chemical compound C1=CC=C2C(N)=CC=CC2=C1 RUFPHBVGCFYCNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 3
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000004781 supercooling Methods 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 2
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 2
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 2
- 241000592155 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Agona Species 0.000 description 2
- 108010058834 acylcarnitine hydrolase Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 150000004056 anthraquinones Chemical class 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006149 azo coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- BGHCVCJVXZWKCC-UHFFFAOYSA-N tetradecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC BGHCVCJVXZWKCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- CUNWUEBNSZSNRX-RKGWDQTMSA-N (2r,3r,4r,5s)-hexane-1,2,3,4,5,6-hexol;(z)-octadec-9-enoic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O CUNWUEBNSZSNRX-RKGWDQTMSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical class OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- KWRFASVVDCCIEJ-UHFFFAOYSA-N (5-bromo-1h-indol-3-yl) nonanoate Chemical compound C1=C(Br)C=C2C(OC(=O)CCCCCCCC)=CNC2=C1 KWRFASVVDCCIEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FREDWHLFBOAXBQ-UHFFFAOYSA-N (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) hexadecanoate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)=CNC2=C1 FREDWHLFBOAXBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STALAAUKINVVQO-UHFFFAOYSA-N (6-chloro-1h-indol-3-yl) nonanoate Chemical compound ClC1=CC=C2C(OC(=O)CCCCCCCC)=CNC2=C1 STALAAUKINVVQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWZHDKGQKYEBKK-UHFFFAOYSA-N 3-aminochromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(N)=CC2=C1 QWZHDKGQKYEBKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTWMXGHFXBQNEJ-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl octanoate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OC(=O)CCCCCCC)=CNC2=C1 QTWMXGHFXBQNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQKHERPPDYPMNX-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-3,4-dihydro-2h-naphthalen-1-one Chemical compound O=C1CCCC2=CC(Cl)=CC=C21 WQKHERPPDYPMNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229930182475 S-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 239000004147 Sorbitan trioleate Substances 0.000 description 1
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 125000002015 acyclic group Chemical group 0.000 description 1
- QNHQEUFMIKRNTB-UHFFFAOYSA-N aesculetin Natural products C1CC(=O)OC2=C1C=C(O)C(O)=C2 QNHQEUFMIKRNTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUAFOGOEJLSQBT-UHFFFAOYSA-N aesculetin dimethyl ether Natural products C1=CC(=O)OC2=C1C=C(OC)C(OC)=C2 GUAFOGOEJLSQBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004414 alkyl thio group Chemical group 0.000 description 1
- PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N anthraquinone Natural products CCC(=O)c1c(O)c2C(=O)C3C(C=CC=C3O)C(=O)c2cc1CC(=O)OC PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 description 1
- LBJNMUFDOHXDFG-UHFFFAOYSA-N copper;hydrate Chemical compound O.[Cu].[Cu] LBJNMUFDOHXDFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 239000012954 diazonium Substances 0.000 description 1
- 150000001989 diazonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- ILEDWLMCKZNDJK-UHFFFAOYSA-N esculetin Chemical compound C1=CC(=O)OC2=C1C=C(O)C(O)=C2 ILEDWLMCKZNDJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N ferricyanide Chemical compound [Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 125000004464 hydroxyphenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012543 microbiological analysis Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 150000005002 naphthylamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000249 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Substances 0.000 description 1
- 235000010483 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001818 polyoxyethylene sorbitan monostearate Substances 0.000 description 1
- 235000010989 polyoxyethylene sorbitan monostearate Nutrition 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- AKABMDSULDRXEO-UHFFFAOYSA-N propan-2-yl 2-(4-chlorophenoxy)-2-methylpropanoate Chemical compound CC(C)OC(=O)C(C)(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 AKABMDSULDRXEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N quinolin-8-ol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=CC2=C1 MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229940080237 sodium caseinate Drugs 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- FVEFRICMTUKAML-UHFFFAOYSA-M sodium tetradecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCC(CC)CCC(CC(C)C)OS([O-])(=O)=O FVEFRICMTUKAML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 229960005078 sorbitan sesquioleate Drugs 0.000 description 1
- 235000019337 sorbitan trioleate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000391 sorbitan trioleate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000012747 synergistic agent Substances 0.000 description 1
- GROJOWHVXQYQGN-UHFFFAOYSA-N tetradecyl sulfonic acid Chemical compound CCCCC(CC)CCC(CC(C)C)OS(O)(=O)=O GROJOWHVXQYQGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical class C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/045—Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/255—Salmonella (G)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Medio de detección de microorganismos, estando basada dicha detección en la identificación de una actividad enzimática microbiana seleccionada de actividades de esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas de microorganismos, siendo preferentemente dicha actividad enzimática microbiana una actividad esterasa, comprendiendo dicho medio: - al menos un sustrato cromógeno y/o fluorógeno específico de la actividad enzimática buscada, preferentemente específica de una actividad esterasa, - al menos un compuesto de tipo alquilglucósido o alquiltioglucósido, en el que la parte alquilo es un radical alifático lineal, preferentemente saturado, - al menos un disolvente (S); en el que, cuando dicho medio comprende n-octil-ß-D-glucopiranósido, dicho medio no comprende compuesto(s) incluidos en el grupo constituido por polifosfatos de sodio (HMP), cloruro de rubidio (RbCl) y cloruro de litio (LiCl).
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
DESCRIPCION
Medio de detección de microorganismos que comprende al menos un alquil(tio)glucósido Campo técnico
La presente invención se refiere al análisis microbiológico por vía bioquímica, y más concretamente por vía enzimática. De manera más específica, la presente invención se refiere a la detección de microorganismos (por ejemplo de cepas bacterianas) por siembra de medios de reacción, especialmente con fines de caracterización (identificación de dichos microorganismos, determinación de las propiedades de resistencia potencial de estos últimos en al menos un agente antimicrobiano, etc.) y/o recuento de dichos microorganismos. Estos medios de reacción comprenden sustratos cromógenos y/o fluorógenos susceptibles de reaccionar con las enzimas microbianas específicas de los microorganismos buscados.
Estado de la técnica
En el ámbito de la presente invención, uno se interesa más especialmente en la detección de microorganismos patógenos o indicadores de calidad (especialmente para su caracterización y/o recuento), ya sea en el medio médico o en el medio industrial, y más especialmente de microorganismos con actividad enzimática de tipo esterasa (que comprende especialmente las actividades carboxilesterasa, lipasa y fosfolipasa), osidasa, peptidasa, sulfatasa o fosfatasa, por ejemplo las bacterias o levaduras de los géneros Salmonella, Escherichia, Pseudomonas, Listeria, Staphylococcus, Enterococcus, Candida, y, más específicamente, a la detección de bacterias del género Salmonella basándose en la identificación/detección de una actividad enzimática esterasa.
Las cepas de Escherichia coli se ponen a menudo de manifiesto por la revelación de una actividad enzimática de tipo osidasa tal como la actividad p-glucuronidasa o p-galactosidasa.
De la misma manera, el género Listeria se detecta mediante la identificación de la actividad p-glucosidasa.
Una actividad aminopeptidasa también puede usarse para revelar un grupo, un género o una especie de microorganismo. Por ejemplo, la actividad L-alanina-aminopeptidasa permite diferenciar las bacterias Gram- negativas de bacterias Gram-positivas.
El género Salmonella, responsable en personas de diversas infecciones graves (fiebre tifoidea, intoxicación alimentaria), posee esterasas no específicas capaces de hidrolizar sustratos sintéticos cromógenos, por ejemplo indigógenos.
La detección y la caracterización de las salmonelas - y más generalmente de bacterias con actividad esterasa - se realizan habitualmente en caldo de cultivo o en medios de agar-agar que permiten la detección y caracterización de las colonias sospechosas de bacterias con actividad esterasa, incluidas las salmonelas. La siembra de dichos medios tiene lugar al poner en contacto la muestra biológica con el medio.
Las bacterias con actividades esterasas, osidasas peptidasas, sulfatasas o fosfatasas poseen en su patrimonio enzimático esterasas, osidasas, peptidasas, sulfatasas o fosfatasas que escinden enlaces diana sustratos enzimáticos sintéticos presentes en el medio y liberando de este modo el resto cromóforo o fluoróforo activado de dichos sustratos. Esto da como resultado una coloración o una fluorescencia que revela hidrólisis y, por lo tanto, la presencia de bacterias o colonias de bacterias diana.
Para poder realizar pruebas de rutina de gran envergadura, es necesario que los medios de detección y/o caracterización y/o áreas de recuento sean estables y permitan simplificar al máximo los procedimientos de detección y/o de caracterización y/o de recuento correspondientes, limitando las manipulaciones. Además, es importante que los procedimientos proporcionan muy buena sensibilidad (intensidad de color o fluorescencia) así como una especificidad de detección de primer orden (para limitar o evitar la detección de "falsos positivos"). La velocidad de desarrollo de colonias sospechosas es también un parámetro fundamental de estos tipos de medios y procedimientos de detección de bacterias que presentan las actividades enzimáticas mencionadas anteriormente.
Sin embargo, se sabe que los sustratos sintéticos de enzimas tales como las esterasas, osidasas, peptidasas, sulfatasas o fosfatasas plantean problemas de compatibilidad con los medios de cultivo para microorganismos, y en particular para las bacterias que tienen estos actividades. Además, dichos sustratos no son estables en el tiempo, lo que indica una disminución la sensibilidad frente a la actividad enzimática correspondiente con el aumento del tiempo de almacenamiento.
En este contexto, se sabe a través del artículo científico titulado "Synthése de substrats indigogéniques. Mise en évidence de l'activité estérasique des salmonelles" A. Agban et al., Eur. J. Med. Chem. (1990) 25, 697-699, medios de cultivo de agar-agar que comprende sustratos indigógenos, a saber, especialmente, el pelargonato (C9) de 5- bromo-indoxilo y una sal biliar, a saber, desoxicolato de sodio. Dichos medios de cultivo adolecen de los mismos inconvenientes que los mencionados más adelante en referencia al documento FR-A-2697028.
La solicitud de patente FR-A-2697028 da a conocer un medio de cultivo para la puesta de manifiesto de salmonelas que comprende un sustrato de esterasa cromógeno constituido por un éster del ácido caprílico con un resto indol (5- bromo-4-cloro-3-indolil-caprilato), así como un detergente seleccionado de entre las sales biliares (desoxicolato de sodio). Este cromógeno y esta sal biliar están contenidos en un medio nutriente que permite el crecimiento de 5 salmonelas. Según la enseñanza de la solicitud de patente FR-A-2697028, se añade la sal de bilis directamente al medio selectivo en el que ya está incluido el sustrato de esterasa. Sin embargo, este medio de cultivo no ofrece todas las garantías deseables en términos de estabilidad del sustrato de esterasa. Además, resulta que este último no es completamente miscible con el medio de cultivo. Esto obviamente afecta la calidad de los resultados obtenidos en términos de sensibilidad (intensidad de la coloración obtenida), velocidad y estabilidad. También debe observarse 10 que el medio de cultivo según el documento FR-A-2697028 está en forma de polvo. Esto obliga al usuario a realizar una operación de redisolución previa del medio líquido o gelificado. Esta restricción resulta de la falta de estabilidad de los sustratos de esterasa usados.
Otro inconveniente del empleo de sales biliares - tales como desoxicolato de sodio - es que éstas son materias primas de origen animal, lo que favorece cierta variabilidad en la calidad.
15 Además, los resultados obtenidos con el medio de cultivo según el documento FR-A-2697028 son perfectibles en términos de actividad biológica.
La patente EP-B-1334206 en nombre del solicitante, describe un medio de detección/identificación de microorganismos (y principalmente bacterias y/o levaduras) con actividad enzimática seleccionado entre las actividades esterasas y/o osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas. Este medio, en forma líquida o 20 gelatinosa, listo para usar y estable al almacenamiento, comprende especialmente:
- al menos un sustrato de esterasas, de osidasas y/o de peptidasas y/o de sulfatasas y/o de fosfatasas, cromógeno o fluorógeno, y
- al menos un éster de sorbitán de ácido(s) graso(s) (ESAG), o al menos un ácido graso (AG) o una mezcla de ESAG/AG, como agente estabilizante emulsionante (en un determinado porcentaje en peso),
25 - y opcionalmente al menos un disolvente (S).
Siempre según la patente EP-B-1334206, el ESAG se selecciona preferiblemente del grupo que comprende:
- monolaurato de sorbitán polioxietilenado que comprende 20 motivos de óxido de etileno (O.E), -TWEEN® 20-;
- monopalmitato de sorbitán polioxietilenado (20 O.E), -TWEEN® 40-;
- monoestearato de sorbitán polioxietilenado (20 O.E), -TWEEN® 60-;
30 - triestearato de sorbitán polioxietilenado (20 O.E), -TWEEN® 65-;
- monooleato de sorbitán polioxietilenado (20 O.E), -TWEEN® 80-;
- sesquioleato de sorbitán polioxietilenado (20 O.E), -TWEEN® 83-;
- trioleato de sorbitán polioxietilenado (20 O.E), -TWEEN® 85-; y sus mezclas.
35 Los ésteres de sorbitán y ácidos grasos (ESAG) son tensioactivos conocidos, ampliamente utilizados en preparaciones alimentarias y farmacéuticas. A título ilustrativo, se puede citar el artículo de DICKINSON et al. "J. Coloid Interface Sci. 15 de abril 1999; 212 (2): 466-473" en relación con la estabilización de emulsiones que contienen caseinato de sodio y un monolaurato de sorbitán polioxietilenado que comprende 20 motivos de óxido de etileno (TWEEN® 20). Las emulsiones consideradas son emulsiones de aceite en agua (30% en volumen de n- 40 tetradecano a pH 6,8).
Aunque la sensibilidad de detección del medio de reacción según la patente EP-B-1334206 sea relativamente satisfactoria, existe la necesidad de desarrollar un medio de detección de microorganismos basado en la identificación de una actividad enzimática microbiana seleccionada entre las actividades esterasas y/o osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas de microorganismos y que ofrece rendimientos superiores a los obtenidos 45 aplicando los medios de la técnica anterior, y principalmente el objeto de la patente EP B-1334206. Por rendimientos superiores se entiende, especialmente, una sensibilidad de detección aumentada, es decir, las intensidades de coloración y/o de fluorescencia más altas posibles para las colonias de los microorganismos diana. Esto demuestra ser especialmente deseable en lo que se refiere a la detección de salmonelas mediante la identificación de una actividad de esterasa. Además, y aparte del criterio de sensibilidad requerido, también es importante que el medio 50 de detección de microorganismos antes mencionado sea fiable, específico y reproducible.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La solicitud de patente EP-A1-2107119 da a conocer una composición para la permeabilización celular, útil para inducir la penetración de marcadores fluorógenos en el interior de una célula diana conservando la viabilidad de esta última, comprendiendo esta composición:
- una concentración final (peso volumen) de al menos 0,01% de N-octil-p-D-glucopiranósido (NOG);
- una concentración final (peso volumen) de al menos 0,1% de polifosfatos de sodio (HMP); y
- una concentración final (moles/litro) de al menos 1 mmol/l de cloruro de rubidio (RbCl) y/o cloruro de litio (LiCl).
Además, la composición según este documento puede comprender al menos un marcador fluorógeno, que puede estar comprendido directamente en el seno de dicha composición o almacenado por separado o aplicado directamente, en la etapa de detección de células permeabilizadas por la susodicha composición.
Un objetivo de la presente invención es desarrollar un medio de detección de microorganismos (especialmente con el fin de su caracterización y/o recuento) basado en la identificación de una actividad enzimática microbiana seleccionada entre las actividades de esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas de microorganismos que conlleva al menos un sustrato enzimático seleccionado a partir de sustratos de esterasas y/o sustratos de osidasas y/o sustratos de peptidasas y/o sustratos de sulfatasas y/o sustratos de fosfatasas, cromógeno y/o fluorógeno y que sea estable a la conservación (intensidad de la coloración o fluorescencia del revelado mantenido a un nivel máximo durante al menos varias semanas). Otro objetivo de la invención es obtener un medio de detección de microorganismos en base a la detección de una actividad enzimática microbiana seleccionada entre la actividades esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas de microorganismos, que no se presenta en forma de un polvo seco para regenerarse con un líquido para redisolver un medio líquido o gelificado, pero que existe directamente en formas listas para usar.
Otro objetivo de la invención tiene por objeto reducir las cantidades de sustrato(s) enzimático(s) cromógeno(s) y/o fluorógeno(s) utilizados, que es/son conocido(s) por los expertos en la técnica por ser particularmente costoso(s).
Otro objetivo más de la invención consiste en desarrollar un procedimiento de obtención el medio de detección mencionado anteriormente que sea sencillo de realizar y que permita en particular caracterizar los microorganismos buscados (en particular mediante su identificación y/o la determinación de sus propiedades de resistencia potencial a al menos un agente antimicrobiano) y/o efectuar su recuento sin excesiva dificultad.
Otros objetivos aparecerán al leer la presente solicitud.
Presentación de la invención
La presente invención tiene como objetivo satisfacer la necesidad mencionada anteriormente y alcanzar todos o parte de los objetivos mencionados anteriormente.
Por consiguiente, un primer objeto de la presente invención se refiere a un medio de detección de microorganismos, basándose dicha detección en la identificación de una actividad enzimática microbiana seleccionada a partir de actividades esterasas y/o osidasas y/o peptidasas y/o o sulfatasas y/o fosfatasas de microorganismos, preferentemente dicha actividad enzimática microbiana es una actividad esterasa, comprendiendo dicho medio:
- al menos un sustrato cromógeno y/o fluorógeno específico de la actividad enzimática buscada, preferentemente específico de una actividad esterasa,
- al menos un compuesto de tipo alquilglucósido o alquil(tio)glucósido en el que el resto alquilo es un radical alifático lineal,
al menos un disolvente (S); en el que
Según una realización preferida, cuando el medio de detección de microorganismos según la invención comprende n-octil-p-D-glucopiranósido como alquilglucósido, dicho medio no comprende ningún compuesto(s) comprendido(s) en el grupo constituido por polifosfatos de sodio (HMP), cloruro de rubidio (RbCl) y cloruro de litio (LiCl).
Otro objeto de la presente invención se refiere a un medio de detección de microorganismos, estando basada dicha detección en la detección de una actividad enzimática microbiana seleccionada entre las actividades de esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas de microorganismos, siendo preferentemente dicha actividad enzimática microbiana una actividad esterasa, consistiendo dicho medio esencialmente en:
- al menos un sustrato cromógeno y/o fluorógeno específico de la actividad enzimática buscada, preferentemente específico de una actividad esterasa,
- al menos un alquil(tio)glucósido,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
- al menos un disolvente (S), y opcionalmente un medio de cultivo adaptado para permitir el crecimiento de los microorganismos buscados (microorganismos diana).
La invención también se refiere a un medio de detección de microorganismos, basándose dicha detección en la detección de una actividad enzimática microbiana seleccionada entre las actividades esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas de microorganismos, siendo preferentemente dicha actividad enzimática microbiana una actividad esterasa, consistiendo dicho medio en:
- al menos un sustrato cromógeno y/o fluorógeno específico de la actividad enzimática buscada, preferentemente específico de una actividad esterasa,
- al menos un alquil(tio)glucósido,
- al menos un disolvente (S),
- un medio de cultivo adaptado para permitir el crecimiento de microorganismos buscados (microorganismo diana).
En la práctica, el experto en la técnica seleccionará el medio de cultivo en función de los microorganismos diana (y en especial en función de las bacterias diana), según criterios perfectamente conocidos y dentro del alcance de este experto en la técnica. Este medio de cultivo no comprende compuesto(s) comprendido(s) en el grupo que constituido por polifosfatos de sodio (HMP), cloruro de rubidio (RbCl) y cloruro de litio (LiCl).
El término alquil(tio)glucósido debe entenderse en el sentido de la presente invención, como que puede diseñarse un compuesto de tipo alquilglucósido (es decir, en el que el resto alquilo está conectado al resto glucídico mediante un enlace éter -O-) o de tipo alquiltioglucósido (es decir, en el que el resto alquilo está conectado al resto glucídico mediante un enlace tioéter -S-), razón por lo que la raíz "tio" aparece entre paréntesis en este término.
Dicho resto alquilo es generalmente alifático, lineal o ramificado, saturado o insaturado. Por resto alquilo "alifático" se entiende, en el sentido de la presente invención, un resto alquilo lineal o ramificado abierto o lineal (acíclico). Según una realización preferida, el resto alquilo del compuesto de alquil(tio)glucósido es un radical alifático lineal (no ramificado), preferiblemente saturado.
El resto glucídico, por su parte, puede ser un resto de osa (monosacárido) o de ósido (sacárido). El terminología alquil(tio)glucósido abarca por lo tanto, en el sentido de la presente invención, a la vez los alquil(tio)glucósidos y alquil(tio)poliglucósidos que pueden utilizarse solos u opcionalmente en combinación con otros tensioactivos, tales como uno o varios tensioactivos aniónicos.
Estos alquil(tio)glucósidos son tensioactivos no iónicos utilizados habitualmente en una amplia gama de aplicaciones industriales y especialmente en detergencia o en cosmética.
Sin estar ligado a la teoría sigue, el o los alquil(tio)glucósido(s) de alquilo utilizado(s) para los fines de la presente invención parece(n) actuar como agente(s) estabilizante(s)-emulsionante(s). Pueden estar asociados, según una realización concreta, a al menos un agente sinérgico conjunto, preferentemente, a al menos un tensioactivo aniónico, preferentemente el 7-etil-2-metil-4-undecilbisulfato o al menos a una de sus sales y más especialmente a sus sales de sodio (TERGITOL-4®).
Los diversos procedimientos para obtener alquil(tio)glucósidos según la presente invención son bien conocidos por un experto en la técnica. Por lo tanto, este último puede, opcionalmente, adquirirlos en el comercio o sintetizarlos utilizando sus conocimientos generales o basándose en las publicaciones existentes sobre este tema.
Preferiblemente, se usa como alquil(tio)glucósido, al menos un alquilglucósido.
El "medio de detección" según la invención se debe entender que puede consistir en:
- un medio que permite detectar/determinar la presencia o ausencia de microorganismos, en particular microorganismos buscados (microorganismos diana), y/o
- un medio que permite caracterizar dichos microorganismos, a saber, en particular, identificarlos y/o determinar sus propiedades de resistencia potencial a al menos un agente antimicrobiano (agente antibiótico en el caso de las bacterias), y/o
- un medio que permita efectuar el recuento de dichos microorganismos; consistiendo este recuento en contabilizar el número de colonias de microorganismos que han crecido en el medio de reacción según la invención, empleando técnicas de microbiología bien conocidas por los expertos en la técnica.
La invención también se refiere por tanto a un medio de caracterización (por ejemplo de identificación) y/o de recuento de microorganismos, basándose dicha caracterización y/o dicho recuento en poner de manifiesto una actividad enzimática microbiana seleccionada entre las actividades esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
sulfatasas y/o fosfatasas de microorganismos, siendo preferentemente dicha actividad enzimática microbiana una actividad esterasa, comprendiendo dicho medio:
- al menos un sustrato cromógeno y/o fluorógeno específico de la actividad enzimática buscada, preferentemente específico de una actividad esterasa,
- al menos un alquil(tio)glucósido, preferentemente al menos un alquilglucósido, y
- al menos un disolvente (S).
Según una realización preferida, la actividad enzimática puesta de manifiesto (buscada) es una actividad esterasa de tipo hidrolasa de éster carboxílico ("carboxylic-ester hydrolase" en lengua inglesa) tal como una actividad carboxilesterasa, lipasa o fosfolipasa.
Los microorganismos detectados utilizando el medio de cultivo según la invención son preferentemente bacterias y/o levaduras, preferiblemente bacterias.
Según una realización especialmente preferida, el medio de reacción según la invención se utiliza para detectar microorganismos (tales como bacterias y/o levaduras) con actividad esterasa y, preferentemente, bacterias con actividad esterasa tales como las salmonelas (por ejemplo, para su caracterización y/o recuento). Como saben los expertos en la técnica, la actividad enzimática esterasa está muy extendida en el campo de la microbiología. En efecto, se sabe que muchas bacterias poseen una actividad esterasa y, por lo tanto, son capaces de escindir los sustratos sintéticos (cromógenos y/o fluorógenos) específicos de dicha actividad enzimática. Además de las salmonelas mencionadas anteriormente, se pueden citar también las bacterias pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Acinetobacter, Listeria, etc...
La detección de los microorganismos anteriores consiste en detectar (visualizar) su presencia en/sobre un medio de cultivo, mediante una detección visual u óptica de coloración o coloraciones y/o fluorescencia(s) aparecido(s) en el medio líquido, o en las colonias formadas por estos microorganismos en un medio de agar-agar. En el caso de la detección óptica, esta última se puede realizarse mediante lectura óptica de todo o parte de dicho medio, con la ayuda de dispositivos tales como una cámara. La detección de la coloración o coloraciones y/o fluorescencia(s) por lectura óptica permite una automatización parcial o total del procedimiento de detección correspondiente.
Los sustratos enzimáticos fluorógenos pueden ser de diferente naturaleza. En primer lugar, los sustratos a base de umbeliferona o aminocumarina y sus derivados sustituidos en la posición 3, 4 o 6, permiten la liberación de un compuesto fluorescente de color que varía de azul a verde bajo una lámpara ultravioleta (UV). (Aex = 365 nm).
A continuación, existen sustratos a base de resorufina (y sus derivados) que producen la liberación de un compuesto fluorescente rosa bajo luz natural (Aex= 530 nm).
También se pueden citar los sustratos a base de fluoresceína (y sus derivados) que, después de la degradación, liberan un compuesto fluorescente amarillo a la luz natural (Aex = 485 nm). Estos sustratos enzimáticos fluorógenos generalmente están poco adaptados a su utilización en medios de agar-agar, y se utilizan preferentemente en medio líquido.
Los sustratos enzimáticos cromógenos utilizables en el sentido de la presente invención pueden ser de diferente naturaleza.
En primer lugar, conviene mencionar los sustratos a base de indoxilo y sus derivados, que, en presencia de oxígeno, producen un precipitado que va del azul al rosa, así como derivados de ALDOL™ (BlOSYNTH AG) - mencionados en la solicitud internacional WO 2010/128120 - que producen una precipitado coloreado que varía del amarillo al rojo, incluso en ausencia de oxígeno. Estos sustratos a base de indoxilo y sus derivados son especialmente preferidos en el sentido de la presente invención debido a su aplicación relativamente fácil y a su buena sensibilidad de detección. Sus aplicaciones se refieren esencialmente a actividades enzimáticas de tipo osidasa, esterasa y fosfatasa. Muy adaptados para su utilización sobre soporte sólido o semisólido (filtro, agar-agar, gel de electroforesis, etc.), son menos adecuados a una utilización en un medio líquido (formación de un precipitado).
En segundo lugar, existen sustratos enzimáticos a base de hidroxiquinolina, dihidroxiflavona, dihidroxiantraquinona, catecol o de esculetina y sus derivados que en presencia de sales de hierro, producen un precipitado coloreado. Una vez más, sus aplicaciones se refieren esencialmente a actividades enzimáticas de tipo osidasa y esterasa.
En tercer lugar, se pueden mencionar los sustratos enzimáticos a base de nitrofenol y nitroanilina y sus derivados, que dan como resultado la formación de un compuesto de color amarillo. Permiten detectar actividades osidasas y esterasas en el caso de sustratos a base de nitrofenol y actividades peptidasas en el caso de sustratos a base de nitroanilina. Sin embargo, en el caso de la detección de actividades peptidasas, la nitroanilina liberada es tóxica para las bacterias que se desea identificar o caracterizar, lo cual puede ser perjudicial para los análisis en curso o posteriores. Por otra parte, generalmente están poco adaptados para su utilización en un soporte sólido y mejor adaptados a una utilización en un medio líquido.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
En cuarto lugar, hay sustratos enzimáticos a base de naftol y naftilamina y sus derivados. En este caso, la reacción enzima-sustrato se lleva a cabo en dos etapas, naftol o naftilamina liberado mediante la actividad enzimática sufre un "azo-acoplamiento" en presencia de una sal de diazonio que se añade en el momento de la revelación, lo que conduce a la formación de un compuesto insoluble coloreado. Permiten detectar las actividades osidasas y esterasas por el intermediario del naftol y las actividades de peptidasa por el intermediario de la naftilamina. La reacción de "azo-acoplamiento" se lleva a cabo en un medio a menudo químicamente agresivo, tóxico para las bacterias y que hace a la muestra inutilizable para su posterior análisis, además las naftilaminas son cancerígenas.
En el sentido de la presente invención, los microorganismos que han crecido sobre o en el medio de detección según la invención se detectan y/o recuentan - visualmente o por medio de un dispositivo óptico electrónico de tipo cámara o aparato fotográfico - por aparición de reacciones coloreadas y/o fluorescentes (según que se utilice un sustrato cromógeno o fluorógeno) o que presenta las dos características a la vez, produciéndose dichas reacciones coloreadas y/o fluorescentes por la actividad enzimática microbiana específica.
Con respecto más específicamente a los sustratos enzimáticos de esterasas, estos últimos comprenden, según una realización preferida, 2 a 16 átomos de carbono, definiendo la longitud de la cadena la aplicación prevista. Por lo tanto, para detectar un máximo de gérmenes "sustrato universal", es adecuada la utilización de sustratos C2 o C4. Para aplicaciones más específicas, como especialmente la detección de Salmonella, los sustratos en C7-C10 son particularmente adecuados. Entre los cromógenos capaces de estar unidos a una cadena de carbono C2-C12, se puede mencionar, por ejemplo, sustratos a base de indoxilo tales como 5-bromo-4-cloro-3-indoxilo, 5-bromo 6-cloro- 3-indoxilo, 6-cloro-3-indoxilo, 5-bromo-3-indoxilo, 5-yodo-3-indoxilo, 6-bromo-3-indoxilo, 5,6-dibromo-3-indoxilo, los sustratos a base de dihidroxiantraquinona tal como alizarina; sustratos a base de ALDOL™ (desarrollados por la compañía Biosynth AG, Rietlisstrasse 4, 9422 Staad, Suiza, mencionados en particular en la solicitud de patente internacional WO 2010/128120); siendo los fluoróforos, por ejemplo, de la 4-metilumbeliferona y otros derivados de 7-hidroxicumarina.
Dichos sustratos enzimáticos de esterasas pueden ser, por ejemplo, sustratos de ésteres cromógenos derivados de indoxilo y, en particular, el caprilato de 5-bromo-4-cloro-3-indoxilo, caprilato de 5-bromo-6-cloro-3-indoxilo, nonanoato de 5-bromo-3-indoxilo, nonanoato de 6-cloro-3-indoxilo o decanoato de 5-bromo-3-indoxilo. A este respecto, conviene también mencionar los sustratos de esterasas cromógenos derivados de la antraquinona, tal como el octanoato de 2-alizarina.
En cualquier caso, estos sustratos sintéticos cromógenos y/o fluorógenos son bien conocidos por los expertos en la técnica, que sabrán seleccionar el o los sustrato(s) enzimático(s) a utilizar en función de la actividad o actividades enzimáticas(s) buscada(s).
Según una realización particularmente preferida de la presente invención, el alquil(tio)glucósido responde la fórmula general (I):
R-X-(G)n (I)
en la que :
- R representa un radical alifático, lineal o ramificado, saturado o insaturado, preferentemente lineal, preferiblemente lineal y saturado, que tiene de 2 a 12 átomos de carbono, preferentemente de 6 a 12 átomos de carbono, y preferiblemente de 8 a 12 de carbono,
- X es -O- o -S-, preferentemente -O-,
- G representa un resto glucídico,
- es un número entero comprendido entre 1 y 10, preferiblemente comprendido entre 1 y 3, preferiblemente n es el número entero 1 o 2.
Dicha definición del o de los alquil(tio)glucósido(s) según la invención permite obtener el nivel deseado de sensibilidad de detección, es decir, permite obtener muy buenas intensidades de coloración y/o fluorescencia a partir de sustratos enzimáticos cromógenos y/o fluorógenos utilizados. Sin estar ligado por la teoría, es probable que este o estos alquil(tio)glucósido(s) - en especial los de fórmula general (I) - mejoran la detección de expresiones enzimáticas específicas, a saber, las actividades esterasas y/o osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas microbianas.
El medio de detección según la presente invención puede comprender un alquil(tio)glucósido o una variedad de alquil(tio)glucósidos (es decir, al menos dos alquil(tio)glucósidos), que responden, preferentemente, a la fórmula general (I) mencionada anteriormente. Cuando el medio de detección comprende al menos dos alquiltiltioglucósidos, estos últimos pueden ser idénticos o diferentes, todos los cuales responden preferentemente a la fórmula general (I).
Los alquil(tio)glucósidos preferidos, en el sentido de la presente invención son los alquilglucósidos siguientes: el n- octil-p-D-glucopiranósido y el n-dodecil-p-D-maltósido (siendo este último especialmente preferido).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
El medio de detección de microorganismos según la presente invención se puede obtener mezclando al menos un sustrato cromógeno y/o fluorógeno específico de la actividad enzimática buscada (preferentemente específico de una actividad de esterasa) y al menos un alquil(tio)glucósido tal como se definió anteriormente en el disolvente (S).
De manera muy interesante y especialmente con respecto a los problemas mencionados en el preámbulo de la presente solicitud, el medio de detección de microorganismos según la invención está en forma lista para el empleo (líquido o gel de agar-agar) y estable al almacenamiento, lo que significa que la intensidad de la coloración y/o de la fluorescencia se mantiene estable durante al menos varias semanas, preferiblemente durante al menos tres semanas.
Preferentemente, la concentración del o de los alquil(tio)glucósido(s) en el medio está comprendida entre 0,5 g/l y 8 g/l, preferentemente entre 0,5 g/l y 6 g/l, en función del alquil(tio)glucósido o de los alquiltiltioglucosido(s) utilizado(s).
El disolvente (S) es un auxiliar de disolución del sustrato enzimático cromógeno y/o fluorógeno de interés, en particular en lo que se refiere a un sustrato enzimático cromógeno. También completa la acción del o de los alquil(tio)glucósido(s) que actúa como agente(s) estabilizante(s)-emulsionante(s).
Según una realización preferente de la presente invención, el disolvente (S) se selecciona del grupo que comprende:
- alcoholes, preferentemente metanol, etanol, metoxietanol,
- disolventes apróticos polares, preferentemente dimetilformamida (DMF), sulfóxido de dimetilo (DMSO),
- disolventes acuosos, preferentemente agua o agua tamponada,
- y sus mezclas;
preferentemente dicho disolvente (S) es sulfóxido de dimetilo (DMSO).
En la práctica, los disolventes utilizados preferentemente son el metanol o un disolvente aprótico polar, preferentemente DMF y DMSO (preferentemente DMSO). En especial, cuando se utilizan sustratos de esterasa, estos últimos se disuelven en un disolvente orgánico del tipo DMSO, al que se añaden el o los alquil(tio)glucósido(s) de interés.
Tratándose del sustrato cromógeno y/o fluorógeno, este último comprende una parte específica diana de la enzima a poner de manifiesto, preferiblemente una parte específica diana de una actividad esterasa, y un resto marcador cromóforo y/o fluoróforo, dicho resto marcador que emite luz y/o fluorescencia cuando ya no está asociado a dicha parte diana, es decir después de la escisión por dicha enzima.
Según una realización preferida, el sustrato enzimático es un sustrato cromógeno o fluorógeno, constituido por una parte diana de la enzima a detectar y una parte cromófora o fluorófora, seleccionándose la parte diana, preferentemente, del grupo que comprende especialmente:
- glucósidos, constituidos por unidades mono-, di- y/o polisacáridos, unidos en a o en p a la función hidroxilo de la parte fluorófora o cromófora;
- a-aminoácidos o péptidos;
- ácidos orgánicos, tales como -O-CO(CH2)n-CH3, estando n comprendido entre 0 y 20;
- ácidos inorgánicos, tales como sulfato, fosfato, pirosulfato, pirofosfato o fosfodiéster;
- quinonas/antraquinonas y derivados, especialmente dihidroxiantraquinona (alizarina);
- amino- o hidroxi-cumarinas y derivados;
- fluoresceínas y derivados;
- indoxilos o ALDOL™ y derivados;
- aminofenoles y derivados;
- nitrofenoles y derivados;
- amino- o hidroxi-fenilos y derivados;
- fenoxazinonas y derivados;
- catecoles y derivados;
- quinazolinonas y derivados (entre ellas ELF®97);
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
- dihidroxiflavona y derivados;
- 3-hidroxiflavona (3-HF) y derivados;
- esculetina y derivados.
Preferiblemente, el sustrato enzimático es un sustrato a base de indoxilo o uno de sus derivados. En este caso, la invención también se refiere a un medio de detección adaptado para su utilización en condiciones anaeróbicas y/o microaerófilas (concentración de oxígeno molecular en el medio de reacción inferiores a la concentración atmosférica), comprendiendo dicho medio un agente que favorece la polimerización oxidativa del derivado indoxilo, tal como un complejo de citrato de hierro amoniacal.
Como "agentes que favorecen la polimerización oxidativa del derivado de indoxilo" se puede citar también: permanganato, ferricianato/ferricianuro de potasio.
El agente que favorece la polimerización oxidativa del derivado de indoxilo (por ejemplo, un complejo metálico de tipo citrato de hierro de amoniacal) se utiliza preferentemente a una concentración comprendida entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 2 mg/ml (preferentemente del orden de 0,6 mg/ml).
La concentración a la que el sustrato enzimático debe utilizarse en el medio de reacción según la invención es fácilmente determinable por un experto en la materia en base a sus conocimientos generales y, dado el caso, a pruebas de rutina. Esta concentración debe ser suficiente para alcanzar el nivel de sensibilidad de detección requerido, pero no debe ser demasiado grande para no correr el riesgo de inhibir el crecimiento de microorganismos.
A modo de ejemplo, la concentración en sustrato cromógeno y/o fluorógeno está comprendida entre 1 mg/l y 10 g/l, preferentemente entre 5 mg/l y 6 g/l, preferentemente entre 25 mg/l y 2 g/l.
Preferentemente, el medio de reacción según la invención comprende un medio de cultivo adecuado y conocido por los expertos en la técnica, tal como un medio descrito en el "Handbook of culture media" (CRC Press), siendo seleccionado dicho medio de cultivo entre:
- los medios selectivos de tipo MacConkey, Hektoen, medios cromógenos selectivos destinados a detectar selectivamente las salmonelas de tipo chromlD® Salmonella, Columbia ANC, PALCAM, Sabouraud gentamicina- cloranfenicol, preferentemente el medio MacConkey o un medio cromógeno selectivo destinado a detectar selectivamente las salmonelas tipo chromlD® Salmonella,
- los medios no selectivos de tipo Columbia +/- sangre, Trypticase Soja (GTS), Agar-agar nutritivo, Sabouraud, preferentemente el medio Columbia.
En la práctica, la técnica experto en la técnica seleccionará el medio de cultivo en función de los microorganismos diana (y en especial en función de bacterias diana), según criterios perfectamente conocidos y al alcance de este experto en la técnica.
Sin que esto sea restrictivo de ninguna manera, resulta que el medio según la invención es particularmente adecuado para la detección (especialmente para la caracterización y/o recuento) de microorganismos de interés médico o industrial, y especialmente entre bacterias gram-negativas, más particularmente las del género Salmonella y Pseudomonas.
Como se indica a lo largo de la presente solicitud, unos de los objetivos principaesl es desarrollar un medio que permita detectar microorganismos (y en especial bacterias) que poseen una actividad esterasa (en especial para la caracterización y/o recuento), tales como bacterias de los géneros Salmonella, Pseudomonas, Acinetobacter, etc.
En lo que se refiere a la detección de salmonelas, se seleccionará por ejemplo, como medio de cultivo, el medio de MacConkey, el medio Hektoen medio o el medio chromlD® Salmonella.
Además, el medio según la invención puede contener otros aditivos opcionales tales como, por ejemplo: uno o varios otros sustrato(s) enzimático(s), por ejemplo de cromógeno(s) y/o fluoróforo(s), peptonas, uno o varios factor(es) de crecimiento, hidratos de carbono, uno o varios agente(s) selectivo(s), tampones, uno o varios gelificante(s), etc.
El medio de reacción según la presente invención está en una forma lista para su empleo, preferentemente en forma líquida o en forma de gel. Por forma lista para su empleo, se entiende una forma lista para ser sembrada en un tubo, frasco o en placas de Petri.
Una de las ventajas del medio de reacción según la invención es que se puede conservar durante varias semanas a 4°C en forma líquida o de gel.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un medio según la invención, método procedimiento que comprende las etapas siguientes:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
a) preparar al menos una disolución madre de al menos un sustrato cromógeno y/o fluorógeno tal como se definió anteriormente y al menos un alquil(tio)glucósido en el disolvente (S),
b) añadir opcionalmente al menos un aditivo en dicho medio, y
c) homogeneizar el conjunto.
En cuanto a la etapa a) mencionada anteriormente, conviene señalar que dicho sustrato y dicho al menos un alquilo(tio)glucósido pueden añadirse durante una misma etapa en el disolvente (S) o, como alternativa, se introduce en un primer momento, dicho sustrato en el disolvente (S) y luego se recoge al menos dicho alquil(tio)glucósido con la solución obtenida anteriormente (que comprende dicho sustrato disuelto por dicho disolvente (S)).
Preferentemente, la preparación de la solución madre se efectúa por separado incorporando sucesivamente el sustrato enzimático, el disolvente (S) y al menos un alquil(tio)glucósido tal como se definió anteriormente, opcionalmente coaditivado. Los productos y las cantidades utilizadas son tales como se definieron anteriormente. Después de la homogeneización, la solución madre se agrega al medio de cultivo gelificado en sobrefusión y regenerado previamente en agua. También puede tratarse de un medio líquido no gelificado, como un caldo nutritivo.
Después de la mezcla del medio de cultivo y la solución madre, se obtiene el medio de detección líquido o gelificado listo para sembrarse.
La presente invención tiene por objeto también la utilización de un medio según la invención para la detección (especialmente para la caracterización y/o recuento) de microorganismos con actividad esterasa y/u osidasa y/o peptidasa y/o sulfatasa y y/o fosfatasa, preferentemente para la detección de microorganismos con actividad esterasa tales como las bacterias del género Salmonella.
El medio de detección según la invención se puede utilizar para:
- detectar/determinar la presencia o ausencia de microorganismos, en particular de los microorganismos buscados (microorganismos objetivo), y/o
- caracterizar dichos microorganismos, es decir especialmente identificarlos y/o determinar sus propiedades de resistencia potencial a al menos un agente antimicrobiano (agente antibiótico en el caso de bacterias), y/o
- llevar a cabo el recuento de dichos microorganismos.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento de detección de microorganismos con actividad esterasa y/o osidasa y/o peptidasa y/o sulfatasa y/o fosfatasa en una muestra, preferentemente de microorganismos con actividad de esterasa, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
i) sembrar el medio según la invención (como se ha definido anteriormente) con una muestra a analizar,
ii) incubar el medio sembrado en condiciones apropiadas (por ejemplo a 37°C en condiciones aeróbicas),
iii) detectar e interpretar las coloraciones y/o fluorescencias en las colonias formadas por los microorganismos, revelando dichas coloraciones y/o fluorescencias la reacción de al menos un sustrato cromógeno y/o fluorógeno con actividad de la enzima microbiana que le es específico, siendo preferentemente dicha actividad enzimática una actividad esterasa.
Dicho procedimiento puede aplicarse, por ejemplo, para detectar la presencia o ausencia de dichos microorganismos dentro de dicha muestra y/o para caracterizarlos (por ejemplo, para identificarlos) y/o contarlos.
Se describe asimismo la utilización de al menos un alquil(tio)glucósido para mejorar la detección de una actividad enzimática seleccionada entre las actividades esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas de microorganismos, preferentemente dicha actividad enzimática es una actividad esterasa.
La muestra a analizar puede ser de diversos orígenes, por ejemplo, de origen alimentario, ambiental, veterinario o clínico.
Entre las muestras de origen alimentario, puede mencionarse, de forma no exhaustiva, una muestra de productos lácteos (yogures, quesos...), carne, pescado, huevos, fruta, verdura, agua, bebidas (leche, zumo de frutas, refrescos, etc.). Por supuesto, estas muestras de origen alimentario también pueden provenir de salsas o platos más elaborados o materias primas no (o parcialmente) procesadas. Una muestra alimentaria puede finalmente proceder de un alimento destinado a animales, como tortas, harina de animales.
A modo de ejemplos de muestras de origen ambiental, conviene asimismo mencionar muestras de superficie, agua, aire, etc.
5
10
15
20
25
30
35
40
Las muestras biológicas de origen clínico pueden corresponder a muestras de fluidos biológicos (sangre completa, suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, etc.), heces, muestras nasales, de garganta, de piel, de heridas, de órganos, de tejidos o de células aisladas. Esta lista obviamente no es exhaustiva.
En general, el término "muestra" se refiere a una parte o a una cantidad (más especialmente una pequeña parte o una pequeña cantidad) tomada de una o más entidades para su análisis. Esta muestra posiblemente puede haberse sometido a un tratamiento previo, que implica, por ejemplo, etapas de mezclado, dilución o incluso de molienda, en especial si la entidad de partida está en estado sólido.
La muestra biológica analizada es, en general, susceptible - o sospechosa - de contener al menos un microorganismo diana. En la mayoría de los casos, este último es un microorganismo patógeno (tal como Salmonella) que conviene detectarse con fines sanitarios.
El término "microorganismo" tiene el mismo significado que el generalmente aceptado en microbiología y comprende bacterias Gram positivas y Gram negativas, levaduras, mohos y más generalmente, organismos unicelulares, invisibles a simple vista, lo que pueden manipularse y multiplicarse en el laboratorio.
El o los alquil(tio)glucósido(s) utilizado(s) para los fines de la presente invención es/son como se ha(n) definido anteriormente. Se utiliza un alquil(tio)glucósido o una variedad de alquilo(tio)glucósidos (es decir, al menos dos alquil(tio)glucósidos), que corresponden, preferentemente, a la fórmula general (I) mencionada anteriormente. Cuando se usan al menos dos alquil(tio)glucósidos, estos últimos pueden ser idénticos o diferentes, correspondiendo todos preferentemente a la fórmula general (I).
Descripción detallada
Ejemplo 1: Medio de detección de salmonelas - mejora de la sensibilidad de detección
1.1 Preparación de los medios - disolución de sustratos enzimáticos
Se produce una solución madre del sustrato enzimático caprilato de 5-bromo-6-cloro-3-indoxilo (magenta-C8) en un disolvente tipo DMSO. Un volumen de esta solución madre que permite obtener una concentración final en sustrato de 360 mg/l se agrega a continuación en matraces que contienen respectivamente Tween 20 (concentración final de 6 g/l), n-octil-D-glucopiranósido (OG) en concentraciones finales de 0,7, 2 y 6 g/l, y n-dodecil-D-maltósido (DM) a las mismas concentraciones. Las diversas soluciones se agitan y los volúmenes se introducen en medios de agar-agar en superenfriamiento (medios ChromlD® Salmonella). El protocolo se presenta en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1
- Medio de referencia
- T 1 2 3 4 5 6
- Concentración final en sustrato en el medio (g/l)
- 0,36 0,36 0,36 0,36 0,36 0,36 0,36
- Concentración final en Tweet 20 en el medio (g/l)
- 6 0 0 0 0 0 0
- Concentración final en OG en el medio (g/l)
- 0 0,7 2 6 0 0 0
- Concentración final en DM en el medio (g/l)
- 0 0 0 0 0,7 2 6
La concentración final en Tween 20 de 6 g/l se eligió como óptima en este contexto de disolución/actividad microbiológica.
1.2 Preparación de los medios
Los microorganismos del género Salmonella, de la colección del Solicitante, se sembraron en cada uno de los medios mencionados anteriormente utilizando la técnica de 3 cuadrantes a partir de suspensiones bacterianas calibradas de 0,5 McF. Las cepas se seleccionaron por su débil expresión a media de la actividad esterasa, dando intensidades de color violeta, bajo a media en el medio de chromlD® Salmonella comercializado por bioMérieux (con las referencias 43621 y 43629).
Las placas se incubaron 24 horas a 37°C. Después, las colonias formadas se examinaron visualmente después de 24 horas de incubación. Se anotaron las intensidades de coloración. Los resultados se muestran en la tabla 2 a continuación.
Tabla 2
- T 1 2 3 4 5 6
- S. enteridis 0107018
- 2 1,5 3 4 4 4 3
- S. agona 0008024
- 2 1,5 3 4 4 4 3
- S. dublin 0008035
- 0 1 2 2 1 1 0,1
- S. infantis 0904097
- 2 1,5 3 4 4 4 3
- S. Tennessee 0904084
- 1,5 1,5 3 4 4 4 3
- S. typhimurium 0011049
- 2 1,5 3 4 4 4 3
- S. typhimurium 0107036
- 2 1,5 2,5 4 4 4 3
- S. Tennessee 0111019
- 2 2 3 4 4 3 2,5
- S. enteridis 0107020
- 2 2 3 4 4 4 3
- S. infantis 0008041
- 2 1,5 2,5 4 4 4 3
- S. panamá 0008050
- 2 1,5 3 4 4 4 3
- S. enteridis 0107017
- 1,5 1,5 2,5 3 4 4 3
- S. panamá 9009020
- 2,5 1,5 3,5 4 4 4 2,5
Intensidades de coloración: escala de 0 a 4, respectivamente, ausencia de coloración a coloración muy intensa;
0 = sin coloración
0,1 = rastro de coloración 0,5 = coloración muy pálida
1 = coloración pura de baja intensidad
2 = coloración nítida de intensidad media
3 = coloración intensa
4 = coloración muy intensa
Nota: Las n,5 (p. ej. 1,5, 2,5, 3,5) corresponden a intensidades de coloración intermedias
1.3 Conclusión
Los medios 2 (OG 2 g/l), 3 (OG 6 g/l), 4 (DM 0,7 g/l), 5 (DM 2 g/l) y 6 (DM 6 g/l ) permiten obtener intensidades de 5 coloración más altas que el medio de referencia T (Tween 20,6 g/l) para todas las cepas. Los medios 1 (OG 0,7 g/l), 2 (OG 2 g/l), 3 (OG 6 g/l), 4 (DM 0,7 g/l) y 5 (DM 2 g/l) permiten detectar todas las salmonelas probadas, incluida S. dublin. Los medios que ofrecen los mejores rendimientos son los medios 2 (OG 2 g/l), 3 (OG 6 g/l), 4 (DM 0,7 g/l) y 5 (DM 2 g/l).
OG y DM permiten por lo tanto mejorar la sensibilidad de detección de la actividad esterasa en Salmonella, 10 presumiblemente mediante una mejora de esta expresión enzimática. Además, estos alquil glucósidos también permiten detectar todas las cepas de salmonella analizadas, incluida S. dublin.
Ejemplo 2: Detección de P. aeruginosa y A. baumannii a través de la expresión de una actividad esterasa en C9
2.1 Preparación de medios - disolución de sustratos enzimáticos
Dos soluciones madre a 25 g/l de ALDOL™ 470-nonanoato (ALDOL 470-C9, desarrollada por la sociedad Biosynth AG Rietlisstrasse 4, 9422 Staad, Suiza) y en ALDOL™ 495-nonanoato (ALDOL 495-C9, también desarrollado por la sociedad Biosynth AG, Rietlisstrasse 4, 9422 Staad, Suiza) se realizan en un disolvente orgánico tipo DMSo. A continuación, un volumen correspondiente a una concentración final en sustratos enzimáticos de 200 mg/l se añade 5 a frascos que contienen, respectivamente: Tween 20 (concentración final en el medio de 6 g/l), y DM (concentraciones finales de 0,7, 2 y 6 g/l). Los diferentes matraces se agitan intensamente y luego se agrega todo el contenido en los medios de agar-agar en superenfriamiento: base GTS (agar-agar Trypticase Soja).
La composición de los diversos medios se presenta en la tabla 3 a continuación:
Tabla 3
- Medio
- 1 2 3 4 5 6 7 8
- ALDOL 470-C9 g/l
- 0,2 0,2 0,2 0,2 0 0 0 0
- ALDOL 495-C9 g/l
- 0 0 0 0 0,2 0,2 0,2 0,2
- Tween 20 g/l
- 6 0 0 0 6 0 0 0
- DM g/l
- 0 0,7 2 6 0 0,7 2 6
10
2.2 Actividad biológica
Las bacterias resultantes de la colección del solicitante se sembraron en cada uno de los medios mencionados anteriormente usando la técnica de 3 cuadrantes a partir de suspensiones bacterianas calibradas de 0,5 McF. Las placas se incubaron durante 24 h a 37°C y las colonias formadas se analizaron visualmente. De este modo, se 15 anotaron coloraciones e intensidades de color. Los resultados se detallan en la tabla 4 a continuación.
Tabla 4
- 1 2 3 4 5 6 7 8
- P. aeruginosa 0001001
- 0 1,5 1,5 2 0 0,5 1,5 1,5
- P. aeruginosa 0002019
- 0,5 0,5 0,5 1,5 0 0 0 0,5
- P. aeruginosa 0110078
- 0,5 1 1,5 1,5 0,5 1 1 1,5
- A. baumannii 0509060
- 0 1,5 1,5 2 0 1 2 2
- A. baumannii 0202018
- 0 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0,5
- A. baumannii 0409007
- 0,5 2 2 2 0 1,5 2 2,5
- A. baumannii 9811074
- 0 1 1,5 1,5 0 1 2 2,5
- A. baumannii 9809057
- 0 0,5 0,5 0,5 0 0,5 1 1
Intensidades de coloración: escala de 0 a 4, respectivamente, ausencia de coloración A coloración muy intensa;
0 = sin coloración
0,1 = rastro de coloración 0,5 = coloración muy pálida
1 = coloración pura de baja intensidad
2 = coloración nítida de intensidad media
3 = coloración intensa
4 = coloración muy intensa
Nota: Las n,5 (por ejemplo 1,5, 2,5, 3,5) corresponden a intensidades de coloración intermedias
5
10
15
20
25
30
35
2.3 Conclusión
P. aeruginosa y A. baumannii son bacterias que se sabe que son positivas a la esterasa. Los medios de referencia 1 y 5 no permiten informar acerca de esta característica. En efecto, las intensidades de coloración son bajas (0,5) o nulas para la mayoría de las cepas analizadas - con estos 2 sustratos enzimáticos a base de en ALDOL™ (y que contienen Tween 20 como tensioactivo).
El reemplazo de Tween 20 a 6 g/l por la DM a la misma concentración permite, inesperadamente mejorar la expresión de la actividad esterasa. En efecto, esta sustitución permite detectar todas las cepas probadas, con intensidades de coloración correctas, cualquiera que sea el sustrato enzimático probado. Se nota un impacto muy fuerte de DM en la expresión de la actividad esterasa cuando el sustrato es a base de ALDOL™.
La sustitución de Tween 20 por n-dodecil-p-D-maltósido (DM) mejora la detección de la actividad esterasa de los microorganismos, posiblemente debido a una mejor actividad biológica de los sustratos de esterasa, resultando una coloración más intensa de las colonias del microorganismo diana.
El alquilglucósido según la invención ofrece una sensibilidad de detección mejorada e incluso permite detectar determinadas cepas incoloras en presencia de Tween.
Además, siendo superiores las intensidades de coloración o fluorescencia (gracias a dichos alquilglucósidos), la concentración en sustrato enzimático puede así reducirse, lo que representa una ventaja de orden económico.
Ejemplo 3: Medio de detección de salmonelas mediante la utilización de un substrato de esterasa (lipasa) con 16 átomos de carbono - mejora de la sensibilidad de detección
3.1 Preparación de medios - disolución del sustrato enzimático
Se lleva a cabo una solución madre del sustrato enzimático palmitato de 5-bromo-4-cloro-3-indoxilo (X-C16) en un disolvente tipo DMSO. Se agrega a continuación un volumen de esta solución madre que permite obtener una concentración final de sustrato de 100 mg/l en frascos que contienen respectivamente Tween 20 (concentraciones finales de 0,1%, 0,2% y 0,6% en volumen) de n-octil-p-D-glucopiranósido (OG) a concentraciones finales de 2 g/l, una mezcla OG (2 g/l) y Tween 20 (volumen 0,1%), y n-octil p -D-tioglucopiranósido (OTG) a la concentración final en el medio de 2 g/l. Las diversas soluciones se agitan y los volúmenes se introducen en medios de agar-agar en sobreenfriamiento (medios ChromlD® Salmonella). Un resumen de la composición de los diversos medios se da en la tabla 5 a continuación.
Tabla 5
- Medio de referencia
- 1 2 3 4 5
- Concentración final en X-C16 en el medio (g/l)
- 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
- Concentración final en Tweet 20 en el medio (% vol.)
- 0,1 0,2 0 0,1 0
- Concentración final en OG en el medio (g/l)
- 0 2 2 2 0
- Concentración final en OTG en el medio (g/l)
- 0 0 0 0 2
3.2 Siembra de los medios
Los microorganismos del género Salmonella, de la colección del Solicitante se han sembrado en cada uno de los medios mencionados anteriormente utilizando la técnica de 3 cuadrantes a partir de suspensiones bacterianas calibradas de 0,5 McF. Las cepas se han seleccionado por su diferente nivel de expresión de la actividad esterasa. Una cepa correspondiente a la cepa de la colección ATCC 25922 de E. coli sirve de referencia negativa para la expresión de dicha actividad enzimática.
Los placas se incubaron 24 horas a 37°C. Las colonias formadas se examinaron luego visualmente después de 24 horas de incubación. Se anotaron las intensidades de coloración. Los resultados se muestran en la tabla 6 a continuación.
Tabla 6
- 1 2 3 4 5
- S. infantis 0904097
- 1 1,5 2,5 2,5 2,5
- S. enteritidis 0107017
- 1 1 2,5 2,5 2
- S. typhimurium 0011049
- 1 1 2,5 2 2
- S. panamá 0008050
- 1,5 1,5 2,5 2 2
- S. panamá 9009020
- 1 1,5 2,5 2 2,5
- S.typhimurium 0107036
- 1,5 1,5 2,5 2,5 2
- S. enteritidis 0107020
- 1 1 2,5 2 2
- S. enteritidis 0107018
- 1 1,5 2,5 2 2
- S. Tennessee 0904084
- 1 1,5 2,5 2 2
- S. infantis 0008041
- 1,5 1,5 2,5 2,5 2,5
- S. dublin 0008035
- 0 0 2 1,5 0,1
- S. agona 0008024
- 1 1 2,5 2 2
- S. dublin 0204046
- 0 0 2,5 1,5 0
- S. Tennessee 0111019
- 1 1,5 2,5 2 2
- E. coli 1105059
- 0 0 0 0 0
Intensidades de coloración: escala de 0 a 4, respectivamente, ausencia de coloración a coloración muy intensa;
0 = sin color
0,1 = rastro de color 0,5 = coloración muy pálida
1 = coloración pura de baja intensidad
2 = coloración nítida de intensidad media
3 = coloración intensa
4 = coloración muy intensa
Nota: las intensidades indicadas n,5 (por ejemplo, 1,5 y 2,5) representan intensidades intermedias.
3.3 Conclusión
Los medios 3, 4 y 5 permiten obtener intensidades de color mayores que en el medio de referencia (medio 1), que 5 no comprendiendo ni OG ni OTG.
Se observa además que los medios que contienen OG, solo o mezclado con Tween 20 (en particular cuando OG se utiliza solo como en el medio 3), permiten obtener los mejores rendimientos: sensibilidad de detección de 100% en estos medios con intensidades de coloración elevadas para todas las cepas, incluida S. dublin.
La cepa de E. coli, esterasa negativa, no parece ser positiva, lo que indica que se conserva la especificidad de 10 detección.
Claims (14)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Medio de detección de microorganismos, estando basada dicha detección en la identificación de una actividad enzimática microbiana seleccionada de actividades de esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas de microorganismos, siendo preferentemente dicha actividad enzimática microbiana una actividad esterasa, comprendiendo dicho medio:- al menos un sustrato cromógeno y/o fluorógeno específico de la actividad enzimática buscada, preferentemente específica de una actividad esterasa,- al menos un compuesto de tipo alquilglucósido o alquiltioglucósido, en el que la parte alquilo es un radical alifático lineal, preferentemente saturado,- al menos un disolvente (S);en el que, cuando dicho medio comprende n-octil-p-D-glucopiranósido, dicho medio no comprende compuesto(s) incluidos en el grupo constituido por polifosfatos de sodio (HMP), cloruro de rubidio (RbCl) y cloruro de litio (LiCl).
- 2. El medio según la reivindicación 1, en el que al menos dicho compuesto de tipo alquilglucósido o alquiltioglucosido corresponde a la fórmula general (I):R-X-(G)n (I)en la que:- R representa un radical alifático, lineal, saturado o insaturado, preferentemente lineal y saturado, que comprende de 2 a 12 átomos de carbono, preferentemente de 6 a 12 átomos de carbono, y preferentemente de 8 a 12 átomos de carbono,- X es -O- o -S-, preferentemente -O-,- G representa un resto de carbohidrato,- n es un número entero entre 1 y 10, preferentemente entre 1 y 3, preferentemente n es el número entero 1 o 2.
- 3. Medio según la reivindicación 1 o 2, en el que al menos dicho compuesto de tipo alquilglucósido o alquiltioglucosido es un alquilglucósido seleccionado entre n-octil-p-D-glucopiranósido y n-dodecil-p-D-maltosido, preferentemente dicho alquilglucósido consiste en n-dodecil-p-D-maltósido.
- 4. Medio según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la concentración de al menos dicho compuesto del tipo alquilglucósido o alquiltioglucósido en el medio está comprendida entre 0,5 g/l y 8 g/l, preferentemente entre 0,5 g/l y 6 g/l.
- 5. Medio según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el disolvente (S) se selecciona del grupo que comprende:- alcoholes, preferentemente metanol, etanol, metoxietanol,- disolventes apróticos polares, preferentemente dimetilformamida (DMF), sulfóxido de dimetilo (DMSO),- disolventes acuosos, preferentemente agua o agua tamponada,- y sus mezclas;preferentemente dicho disolvente (S) es sulfóxido de dimetilo (DMSO).
- 6. Medio según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el sustrato cromógeno y/o fluorógeno comprende una parte diana específica de la enzima a identificar, preferentemente una parte diana específica de una actividad esterasa, y un resto marcador cromóforo y/o fluoróforo, emitiendo dicho resto marcador una luz y/o una fluorescencia cuando ya no está asociado a dicha parte diana, es decir después de la escisión por dicha enzima.
- 7. Medio según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sustrato enzimático es un sustrato a base de indoxilo o de uno de sus derivados.
- 8. Medio según la reivindicación 7, adaptado para su uso en condiciones anaeróbicas y/o microaerófilas, comprendiendo dicho medio un agente que favorece la polimerización oxidativa del derivado indoxilo, tal como un complejo de citrato de hierro amoniacal.51015202530
- 9. Medio según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la concentración de sustrato cromógeno y/o fluorógeno está comprendida entre 1 mg/l y 10 g/l, preferentemente entre 5 mg/l y 6 g/l, preferentemente entre 25 mg/l y 2 g/l.
- 10. Medio según una de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicho medio un medio de cultivo adecuado, seleccionándose dicho medio de cultivo entre:- medios selectivos de MacConkey, Hektoen, medios cromógenos selectivos destinados a detectar selectivamente salmonellas de tipo chromID® Salmonella, Columbia ANC, PALCAM, Sabouraud gentamicina-cloranfenicol, preferentemente el medio MacConkey o un medio cromógeno selectivo destinado a detectar selectivamente salmonellas de tipo chromID® Salmonella,- medios no selectivos de Columbia +/- sangre, Trypticase Soja (GTS), agar-agar nutritivo, Sabouraud, preferentemente el medio Columbia.
- 11. Procedimiento de obtención de un medio según una de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:a) preparar al menos una solución madre de al menos un sustrato cromógeno y/o fluorógeno tal como se define en una de las reivindicaciones 1 a 10 y al menos dicho compuesto de tipo alquilglucósido o alquiltioglucósido en el disolvente (S),b) añadir opcionalmente al menos un aditivo en dicho medio, yc) homogeneizar el conjunto.
- 12. Utilización de un medio según una de las reivindicaciones 1 a 10 para la detección de microorganismos con actividad esterasa y/u osidasa y/o peptidasa y/o sulfatasa y/o fosfatasa, preferentemente para la detección de microorganismos con actividad esterasa, tales como bacterias o levaduras con actividad esterasa.
- 13. Utilización según la reivindicación 12, siendo dichos microorganismos bacterias Gram-negativas, preferentemente bacterias del género Salmonella.
- 14. Procedimiento de detección de microorganismos con actividad esterasa y/u osidasa y/o peptidasa y/o sulfatasa y/o fosfatasa en una muestra, preferentemente de microorganismos con actividad esterasa, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:i) sembrar el medio según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 con una muestra a analizar,ii) incubar el medio sembrado en condiciones apropiadas,iii) detectar e interpretar las coloraciones y/o fluorescencias en las colonias formadas por los microorganismos, revelando dichas coloraciones y/o fluorescencias la reacción de al menos un sustrato cromógeno y/o fluorógeno con actividad enzimática microbiana que le es específica, siendo preferentemente dicha actividad enzimática una actividad esterasa.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1262965A FR3000501B1 (fr) | 2012-12-28 | 2012-12-28 | Milieu de detection de micro-organismes comprenant au moins un alkyl(thio)glycoside |
| FR1262965 | 2012-12-28 | ||
| PCT/FR2013/053259 WO2014102503A1 (fr) | 2012-12-28 | 2013-12-24 | Milieu de détection de micro-organismes comprenant au moins un alkyl(thio)glycoside |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2666132T3 true ES2666132T3 (es) | 2018-05-03 |
Family
ID=47989207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES13824628.5T Active ES2666132T3 (es) | 2012-12-28 | 2013-12-24 | Medio de detección de microorganismos que comprende al menos un alquil(tio)glucósido |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10077464B2 (es) |
| EP (1) | EP2938741B1 (es) |
| CN (1) | CN104870651B (es) |
| ES (1) | ES2666132T3 (es) |
| FR (1) | FR3000501B1 (es) |
| WO (1) | WO2014102503A1 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3000501B1 (fr) | 2012-12-28 | 2015-08-14 | Biomerieux Sa | Milieu de detection de micro-organismes comprenant au moins un alkyl(thio)glycoside |
| CN114134198B (zh) * | 2021-11-30 | 2024-01-26 | 国家粮食和物资储备局科学研究院 | 用于真核微生物快速计数的试剂、装置及方法 |
| US20240132931A1 (en) * | 2022-09-30 | 2024-04-25 | O&M Halyard, Inc. | Biological Indicator with Enhanced Volatile Organic Compound Detection |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4892817A (en) | 1987-09-21 | 1990-01-09 | Biogenex Laboratories | Stable phosphatase substrate composition |
| US4893817A (en) | 1988-10-17 | 1990-01-16 | Ronen Shilo | Musical jigsaw-type puzzle |
| US5210022A (en) | 1990-04-20 | 1993-05-11 | Rcr Scientific, Inc. | Method test media and chromogenic compounds for identifying and differentiating general coliforms and Escherichia coli bacteria |
| FR2697028B1 (fr) | 1992-10-20 | 1995-01-06 | Alain Rambach | Milieu de culture pour la mise en évidence de Salmonella et procédé pour son utilisation. |
| FR2789086B1 (fr) * | 1999-02-03 | 2003-01-31 | Alain Rambach | Procede de detection de bacteries cultivees en condition anaerobie |
| FR2790765B1 (fr) | 1999-03-11 | 2003-01-31 | Alain Rambach | Milieu chromogene de detection de staphylococcus aureus. |
| FR2816956B1 (fr) * | 2000-11-17 | 2004-08-20 | Bio Merieux | Procede et milieu de detection/identification de bacteries a activite esterasique |
| FR2844807B1 (fr) | 2002-09-23 | 2005-11-11 | Rambach Alain | Procede de detection de microorganismes resistants a la meticilline |
| AU2003275882A1 (en) * | 2002-11-01 | 2004-05-25 | Mirador Dna Design Inc. | Solvent for chromogenic substrate solution |
| FR2881755B1 (fr) | 2005-02-10 | 2012-11-30 | Biomerieux Sa | Milieux pour la detection specifique de micro-organismes resistants |
| EP1790734A1 (en) | 2005-11-25 | 2007-05-30 | Biosynth AG | Microbial assay |
| FR2897874B1 (fr) | 2006-02-28 | 2013-11-15 | Biomerieux Sa | Procede pour l'identification d'au moins deux groupes de microorganismes |
| FR2912423B1 (fr) | 2007-02-08 | 2009-03-20 | Biomerieux Sa | Milieu de detection et/ou d'identification de bacteries |
| FR2912425B1 (fr) * | 2007-02-08 | 2012-08-31 | Biomerieux Sa | Milieu de detection et/ou d'identification de bacteries |
| PL2181330T5 (pl) | 2007-08-31 | 2017-07-31 | Ssi Diagnostica As | Kompozycje i środki do diagnozowania infekcji drobnoustrojowych |
| FR2929291B1 (fr) * | 2008-04-01 | 2010-04-23 | Millipore Corp | Composition de permeabilisation cellulaire comprenant nog, hmp, chlorure de rubidium et/ou chlorure de lithium pour la detection sur membrane de cellules vivantes. |
| EP2256103A1 (en) | 2009-05-07 | 2010-12-01 | Biosynth AG | Novel indicator platform |
| US8497086B2 (en) | 2009-08-13 | 2013-07-30 | Biomereux | Reaction medium for methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) bacteria |
| WO2011080305A1 (en) | 2009-12-31 | 2011-07-07 | Bio-Rad Pasteur | A culture medium for screening or enrichment of methicillin-resistant s. aureus |
| FR2956868B1 (fr) * | 2010-03-01 | 2014-01-10 | Bio Rad Pasteur | Procede rapide de detection d'enzymes et de microorganismes |
| EP3399049B1 (en) * | 2011-05-20 | 2020-03-11 | 3M Innovative Properties Company | Methods of using salmonella detection articles |
| LT2895595T (lt) * | 2012-09-14 | 2019-03-12 | Charm Sciences, Inc. | Mitybos terpės būdas ir įtaisas |
| FR3000501B1 (fr) | 2012-12-28 | 2015-08-14 | Biomerieux Sa | Milieu de detection de micro-organismes comprenant au moins un alkyl(thio)glycoside |
| FR3004195B1 (fr) | 2013-04-03 | 2017-10-06 | Biomerieux Sa | Utilisation d'au moins un substrat de phosphatase chromogene et/ou fluorogene pour la detection et/ou le denombrement d'enterobacteries dans un echantillon biologique. |
-
2012
- 2012-12-28 FR FR1262965A patent/FR3000501B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-12-24 ES ES13824628.5T patent/ES2666132T3/es active Active
- 2013-12-24 EP EP13824628.5A patent/EP2938741B1/fr active Active
- 2013-12-24 CN CN201380068254.0A patent/CN104870651B/zh active Active
- 2013-12-24 US US14/655,224 patent/US10077464B2/en active Active
- 2013-12-24 WO PCT/FR2013/053259 patent/WO2014102503A1/fr not_active Ceased
-
2018
- 2018-08-28 US US16/114,826 patent/US11001873B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2938741A1 (fr) | 2015-11-04 |
| CN104870651A (zh) | 2015-08-26 |
| EP2938741B1 (fr) | 2018-02-14 |
| US10077464B2 (en) | 2018-09-18 |
| CN104870651B (zh) | 2018-04-03 |
| FR3000501A1 (fr) | 2014-07-04 |
| US11001873B2 (en) | 2021-05-11 |
| FR3000501B1 (fr) | 2015-08-14 |
| WO2014102503A1 (fr) | 2014-07-03 |
| US20150329897A1 (en) | 2015-11-19 |
| US20190136291A1 (en) | 2019-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2200346T3 (es) | Identificacion de salmonela. | |
| US20100255530A1 (en) | Bacteria detection and/or identification medium | |
| US8216802B2 (en) | Detection medium for gram negative bacteria | |
| ES2266309T3 (es) | Procedimiento y medio de deteccion/identificacion de microorganismos con actividad esterasa y/u osidasa y/o peptidasa y/o sulfatasa y/o fosfatasa. | |
| US11001873B2 (en) | Microorganism detection method comprising at least one alkyl(thio)glycoside | |
| ES2428076T3 (es) | Procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus | |
| WO2004063392A2 (es) | Medio de cultivo selectivo para el aislamiento y deteccion de especies del genero streptococcus | |
| CN101970682A (zh) | 检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法 | |
| ES2295241T3 (es) | Procedimiento y medio de deteccion/identificacion de microorganismos con actividad esterasica. | |
| US20100291539A1 (en) | Methodology for detection, enumeration, propagation and manipulation of bacteriophages | |
| ES2647451T3 (es) | Medio de reacción para las bacterias Vibrio | |
| EP3094738B1 (fr) | Utilisation d'au moins un substrat de carboxylestérase et/ou de triacylglycérol-lipase pour la détection des bactéries du groupe bacillus cereus | |
| US8846336B2 (en) | Test mixtures for detecting the presence or absence of target microbes | |
| JP2013031456A (ja) | エステラーゼ活性を用いたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅの検出方法 | |
| EP2981619A1 (fr) | Utilisation d'au moins un substrat de phosphatase chromogène et/ou fluorogène pour la détection et/ou le dénombrement d'entérobactéries dans un échantillon | |
| ES2529132T3 (es) | Medio de cultivo de microorganismos que comprende el ácido para-aminobenzoico como agente selectivo | |
| JP5823390B2 (ja) | 新規ニトロレダクターゼ酵素基質 | |
| JP2015504684A (ja) | アゾレダクターゼ活性による微生物のインビトロ検出 | |
| JP5639791B2 (ja) | β−グルクロニダーゼ含有飲食品中の大腸菌検出用培地 | |
| JP7503384B2 (ja) | レジオネラ属菌鑑別用発色培地 | |
| JP5757549B2 (ja) | 卵黄液による発色反応および／または蛍光発色反応増強作用 | |
| JP2013500039A (ja) | 新規ニトロレダクターゼ酵素基質 | |
| JP2015126756A (ja) | 卵黄液による発色反応および／または蛍光発色反応増強作用 |